Дрожжевые штаммы для ферментированных напитков, в частности вина - RU2736098C2

Чертежи

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к дрожжевым штаммам для ферментированных напитков, а также к методам отбора таких штаммов. Кроме того, данная заявка касается применения дрожжей из этих штаммов для производства вина.

Уровень техники

Ферментация (брожение) – это один из основных этапов производства вина, на котором присутствующие в виноградном сусле сахара превращаются в спирт под воздействием микроорганизмов, таких, как дрожжи.

В зависимости от вида производимого вина применяются разные штаммы дрожжей. Полученный заявителем штамм дрожжей Saccharomyces S1 обладает способностью вызывать равномерное, но очень медленное брожение, следовательно, этот штамм особо пригоден для красных вин высокого качества, получаемых при длительном процессе мацерации/экстракции с целью наилучшего использования высокого содержания полифенолов (антоцианов, танинов) в чёрных сортах винограда с очень интенсивной окраской и очень терпких.

К сожалению, данный штамм испытывает затруднения при сбраживании видов сусла со спиртовым потенциалом выше 14 об.% в присутствии нормального и даже повышенного содержания доступного азота в сусле. Однако эти условия являются обычными для красных вин, предназначенных стать винами reserve и по своей природе обладающих высоким спиртовым потенциалом, которые получают из перезревших сортов винограда, сусло которых имеет низкое содержание доступного азота. Следовательно, при таких условиях присутствует высокий риск преждевременного прекращения брожения, что пагубно для производимого вина.

Поэтому было бы чрезвычайно полезным разработать средства, улучшающие сбраживающую способность штамма дрожжей S1, чтобы он стал более интересным с точки зрения виноделия.

Повышение эффективности дрожжей может достигаться посредством либо традиционных генетических приёмов, либо приёмов молекулярной генетики. Между тем рынок виноделия очень сопротивляется применению генетически модифицированных микроорганизмов (ГМО).

Сущность изобретения

Таким образом авторы изобретения установили, что возможно получить чрезвычайно интересный штамм для винификации чёрных сортов винограда с высоким содержанием танина путём гибридизации штамма S1 с дрожжевым штаммом, обладающим способностью к быстрому сбраживанию большого количества сахаров в присутствии незначительного количества азота при низкой температуре, которым является штамм дрожжей вида Saccharomyces bayanus S2, принадлежащий заявителю.

Благодаря такому процессу гибридизации авторы изобретения получили и отобрали несколько штаммов, обладающих очень высокой кинетикой ферментации, устойчивостью к спирту в количестве выше 15 об.% и способностью к сбраживанию в присутствии малого количества доступного азота. Эти штаммы представляют особый интерес, в частности, в винификации сусла, обеднённого доступным азотом и требующим длительного брожения, которое характерно для вин reserve, например, великих вин Бордо.

Таким образом, согласно первому аспекту изобретение относится к дрожжевому штамму, который может быть получен гибридизацией штамма S1 со штаммом S2, причём этот штамм дрожжей обладает, согласно результатам описываемого ниже теста А, следующими свойствами:

- кинетика брожения от 15 до 22 суток при температуре 24°С,

- стойкость к содержанию спирта, составляющему более или равному 15 об.%,

- необходимое содержание азота менее или равное 200 ч./млн.

Также авторами изобретения был разработан способ получения и отбора штаммов винных дрожжей, получаемых гибридизацией штамма S1 со штаммом S2.

Таким образом согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения штамма винных дрожжей, включающему в себя следующие этапы:

а) гибридизация штамма дрожжей S1 с штаммом дрожжей S2;

б) выделение полученных на этапе (а) штаммов;

в) засев в сусло выделенных на этапе (б) штаммов;

г) исследование кинетики брожения, вызванного указанными штаммами;

д) отбор штаммов с кинетикой брожения, выше, по меньшей мере, на 15%, предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, той же кинетики родительского штамма S1, и ниже, по меньшей мере, на 15%, предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, той же кинетики родительского штамма S2 в том же сусле, что и сусло на этапе (в).

Также изобретение относится к применению штамма дрожжей, описанного выше и предназначенного для производства ферментированных напитков, в частности, вина.

Подробное описание изобретения

В целях улучшения винодельческих свойств штамма дрожжей S1, в частности, его характеристик сбраживания, авторами изобретения были созданы новые штаммы, специально приспособленные к применению в виноделии.

Под «улучшенными характеристиками сбраживания» здесь подразумеваются свойства дрожжевых штаммов, обладающих одновременно преимуществами, присущими штамму S1, в частности, способностью сбраживать сусло со средней и постоянной скоростью без аналитических ошибок, таких как типичное образование летучих кислот и слабое образование SO₄, при обеспечении необходимых органолептических свойств, таких как повышенная экстракция полифенолов и стимулирование фруктовых ароматов, которые однако могут также быстро сбраживать при необходимости в присутствии умеренного количества доступного азота в течение длительного времени (даже тогда, когда содержание спирта в сусле превышает 15 об.%).

Критериями отбора, использованными в данном случае, были:

- более высокая кинетика сбраживания, чем у родительского штамма S1, но столь же постоянная, что и у последнего,

- способность вызывать брожение в присутствии умеренного количества доступного азота,

- стойкость к повышенному содержанию спирта (т.е. выше или равному 15%).

Таким образом первый аспект изобретения касается штамма дрожжей, получаемого гибридизацией штамма S1 со штаммом S2, при этом штамм дрожжей обладает, согласно результатам теста А, следующими свойствами:

i) кинетика брожения от 15 до 22 суток при температуре 24°С,

ii) устойчивость к содержанию спирта выше или равному 15 об.%,

iii) необходимое содержание азота: менее или равно 200 ч./млн.

Согласно настоящему изобретению «тест А» представляет собой тест, где исследуется сбраживающая активность дрожжевых штаммов, высеянных в количестве 2.10⁶ колониеобразующих единиц/мл на искусственное сусло, стандартизированное Международной организацией виноградников и вин (OIV) (Резолюция OIV-OENO 370-2012) и приведённое к содержанию сбраживаемых сахаров 250 г/л (для получения алкогольного потенциала в количестве 15 об.%) при начальной концентрации азота 200 ч./млн. при сбраживании при постоянной температуре 24°С.

Выражение «штамм дрожжей» означает относительно однородную популяцию дрожжевых клеток. Штамм дрожжей получают из клона, причём клоном является популяция клеток, полученная из одной дрожжевой клетки.

Под «штаммом винных дрожжей» понимается штамм, используемый для сбраживания вина.

Штамм дрожжей S1 или штамм S1 здесь означает принадлежащий заявителю штамм дрожжей, который был задепонирован 9 сентября 2015 года в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) при Институте Пастера, Франция, F75724, г. Париж, ул. доктора Ру, 25, под номером I-5011.

Штамм дрожжей S2 или штамм S2 здесь означает штамм дрожжей, также принадлежащий заявителю, который был задепонирован 9 сентября 2015 года в CNCM под номером I-5012.

«Устойчивость к содержанию спирта выше или равному Х об.%» означает, что штамм дрожжей способен выживать и продолжать сбраживание в том случае, когда концентрация спирта на объемную единицу среды превышает или равна Х об.%.

«Необходимое содержание азота» для штамма дрожжей определяется минимальным количеством доступного азота, которое должно присутствовать в данном сусле для завершения брожения (присутствие, по меньшей мере, 2 г/л остаточных, сбраживаемых сахаров).

Кинетика брожения может быть легко замерена разными, известными специалисту приёмами. Так, например, кинетика брожения может измеряться посредством отслеживания за брожением путём взвешивания в разное время.

В частности, изобретение относится к двум новым дрожжевым штаммам, описанным выше, а именно штаммам 51-062 и 51-135, задепонированным 5 мая 2015 года в CNCM согласно Будапештскому договору под номерами соответственно I-4975 и I-4977.

Также изобретение относится к дрожжам, выделенным из описанного выше штамма дрожжей.

Авторами изобретения был также разработан способ гибридизации штамма S1 со штаммом Saccharomyces bayanus S2, обладающим способностью быстрого сбраживания большого количества сахаров в присутствии малого количества азота при низкой температуре. Также они создали способ отбора, позволяющий идентифицировать среди разных штаммов, полученных упомянутой гибридизацией, штаммы с улучшенными свойствами сбраживания и, следовательно, представляющие собой интерес для виноделия.

Таким образом согласно другому аспекту изобретение относится к способу получения штамма винных дрожжей, включающему в себя следующие этапы:

а) гибридизация штамма дрожжей S1 со штаммом дрожжей S2;

б) выделение полученных на этапе (а) штаммов;

в) засев сусла штаммами, выделенными на этапе (б);

г) исследование кинетики сбраживания указанными штаммами;

д) отбор штаммов с кинетикой сбраживания, выше, по меньшей мере, на 15% предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, той же кинетики родительского штамма S1, и ниже, по меньшей мере, на 15%, предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, той же кинетики родительского штамма S2, на том же сусле, что и сусло на этапе (в).

Специалисту известны несколько способов гибридизации штаммов дрожжей и он может использовать наиболее подходящий для гибридизации штамма дрожжей S1 с штаммом дрожжей S2. В данном случае авторами изобретения было открыто, что штамм S1 не может производить споры дифференцированного типа спаривания а или альфа; следовательно этот штамм является гомоталлическим. Таким образом пути гибридизации штамма S1 со штаммом S2 будут состоять в гибридизации спор из этих двух штаммов, после рассечения тетрад каждого штамма. Следовательно, новый гибрид может быть результатом скрещивания споры штамма S1 со спорой штамма S2 или скорее результатом скрещивания споры S1 со спорой S2, где половой тип изменился в процессе репликации. Гибриды, образующиеся при скрещивании споры S1 со спорой S2, впоследствии отбирают путём анализа генетических профилей образовавшихся гибридов (например, посредством ПЦР Ty) и путём сравнения этих профилей с генетическими профилями родительских штаммов.

Под «суслом» понимается в данном случае виноградное сусло, т.е. смесь, получаемая после прессования винограда, или искусственное сусло, т.е. искусственно воссозданное с обеспечением максимального подражания составу натурального виноградного сусла.

Для целей настоящего изобретения может применяться несколько видов сусла. В качестве примера искусственное сусло «Lesaffre wine», можно использовать для предварительного отбора дрожжей, где данное искусственное сусло стандартизовано Международной организацией виноградников и вин (Резолюция OIV-OENO 370-2012) для отбора дрожжей или виноградного сусла из сортов чёрного винограда с концентрацией полифенолов, образующихся или не образующихся при горячей мацерации перед брожением, для помещения дрожжей в среду, для которой они предназначены, с целью их отбора.

Согласно варианту осуществления, тест на брожение проводится на искусственном сусле OIV.

«Искусственное сусло OIV» означает искусственное сусло, стандартизированное Международной организацией виноградников и вин (Резолюция OIV-OENO 370-2012) и приведённое к содержанию 250 г/л способных к брожению сахаров (для получения алкогольного потенциала в 15 об.%) при исходной концентрации азота 200 ч./млн.

Таким образом, согласно другому варианту осуществления настоящая заявка относится к способу получения штамма винных дрожжей, причём этот способ включает в себя следующие этапы:

а) гибридизация штамма дрожжей S1 с штаммом дрожжей S2;

б) выделение полученных на этапе (а) штаммов;

в) засев искусственного сусла OIV штаммами этапа (б);

г) исследование кинетики брожения упомянутых штаммов;

д) отбор штаммов, обладающих тремя следующими свойствами:

i) кинетика сбраживания от 15 до 22 суток при температуре 24°С,

ii) устойчивость к содержанию спирта выше или равном 15 об.%;

iii) необходимое содержание азота менее или равное 200 ч./млн.

Отобранные при этом дрожжи способны сбраживать большое количество сахаров при использовании малого количества азота, и это при высоком содержании спирта.

Кроме того, согласно другому аспекту изобретение относится к применению штамма дрожжей или же дрожжей, таких, как описанные выше, в производстве вина, в частности, красного вина, а именно вина из сортов черного и очень терпкого винограда. Согласно ещё одному варианту осуществления штаммы дрожжей и дрожжи, полученные/отобранные согласно настоящему изобретению, применяются для сбраживания красных вин reserve.

Вином «reserve» (вино резерва) считается вино, которое может храниться несколько лет в подвале и становится лучше за счёт старения, к этим случаям относятся великие вина Бордо. Вино «reserve» может храниться в подвале, по меньшей мере, пять лет.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 – это график кинетики сбраживания штаммами 51-062 (Н), 51-135 (F), S1 (D) и S2 (Е), построенный на основе измерения соотношения вес/исходный вес в зависимости от времени.

Примеры

Пример 1. Гибридизация штаммов S1 со штаммами S2

- Споруляция двух родительских штаммов и создание подходящих условий для споруляции штамма S1.

Условия споруляции были применены для обоих штаммов S1 и S2. Показатели споруляции рассчитали и представили в таблице 1.

Таблица 1

- Выделение спор посредством микроманипуляции и исследование само-диплоидизации спор штаммов S2 и S1.

Условия спорулизации были применены к обоим винным штаммам уже в большем масштабе исследования. После обработки сумок и визуализирования тетрад под микроскопом, проводилось рассечение для разрушения тетрад, удаление спор и их размещения в определенных точках на агаре. Подсчёт размещенных спор и проросших спор приведён в нижеследующей таблице 2.

Таблица 2

Для проведения гибридизации между штаммами S2 и S1 необходимо получить для каждого штамма споры хорошо дифференцированного типа спаривания а или альфа. Признаки типа спаривания для каждой, предварительно полученной споры исследовался посредством ПЦР «тип спаривания» (таблица 3).

Таблица 3

В таблице 3 показано, что нельзя получить для штамма S1 споры дифференцированного типа спаривания а или альфа. Поэтому вероятно, что штамм S1 является гомоталличным. При таких условиях не было возможным осуществить обычную гибридизацию между штаммами S2 и S1.

- Разработка эффективных условий гибридизации специально для скрещивания штаммов S1 и S2, выделения новых штаммов и исследование их генетического профиля с целью отбора гибридов от скрещивания штаммов S1 и S2.

Поскольку авторы изобретения не располагают коллекцией спор типа спаривания а или альфа для штамма S1, они осуществили гибридизацию спор штамма S1 и штамма S2, полученных из рассеченных тетрад каждого штамма, посредством микроманипулятора. Образовавшийся гибрид может быть следовательно плодом скрещивания споры штамма S1 со спорой штамма S2 или же плодом скрещивания споры штамма S1 со спорой штамма S1, половой тип которой изменился в процессе репликации. В целях отбора гибридов, образовавшихся при скрещивании между спорой S1 и спорой S2, провели анализ генетических профилей образовавшихся гибридов посредством ПЦР Ту, затем эти профили сравнили с профилем родительских штаммов. В конечном итого выбрали 68 гибридов, содержавших смешанные профили разной степени по сравнению с профилем родительских штаммов. После этого произвели оценку винодельческих качеств упомянутых 68 гибридов. Были отобраны штаммы 51-062 и 51-135, как показано ниже.

Пример 2. Разработка приёмов отбора гибридов.

Применялось несколько приёмов отбора:

а) отбор в искусственных условиях посредством исследования дегидратации способных к брожению сахаров, кинетики брожения и производства интересующих продуктов ферментации для гибридов и родительских штаммов на искусственном винодельческом сусле Lesaffre (250 г/л сахаров и 250 ч./млн. доступного азота) = тест А и искусственное сусло OIV.

Первый отбор, произведённый с учётом критерия кинетики, позволил отобрать 11 гибридов, обладавших наилучшими свойствами с точки зрения дегидратации фруктозы по сравнению с S1.

Затем из этих гибридов отобрали штаммы 51-062 и 51-135, так как они обладали средней кинетикой между S1 и S2, и в конце брожения эти штаммы произвели промежуточные продукты ферментации, которые отличаются от обоих родительских штаммов;

б) отбор в реальных условиях путём исследования кинетики брожения и производства сложных эфиров гибридами и родительскими штаммами на естественных видах сусла:

Критерием отбора служил анализ кинетики сбраживания, контроль за винодельческими параметрами и анализы основных сложных эфиров во время микровиноделия с применением натурального сусла из винограда Каберне совиньон. Имеется в виду сусло, полученное посредством горячей, предварительно сбраживающей мацерации совершенно спелого винограда Каберне совиньон. Сусло хранилось при -60°С в морозильной камере с момента сбора винограда текущего года.

Перед сбраживанием сусло обработали следующим образом: 1) разморозили до комнатной температуры; 2) осветлили центрифугированием; 3) разделили сусло на 5 однородных частей.

Перед сбраживанием сусло анализировали посредством инфракрасной спектроскопии с фурье-преобразованием + SO₂ посредством колориметрии. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4

В результате анализа сусла было также установлено отсутствие спирта и уксусной кислоты до начала брожения. 246 г глюкозы и фруктозы соответствуют вероятному содержанию 14,6 об.% (выход 16,83).

- Приготовление дрожжей в пробирке с агаром: штаммы 51-135 (F) и 51-062 (Н).

Приготовление инкубируемой среды в нулевые сутки: дрожжевой экстракт 20 г, сахароза 100 г, минеральный раствор (100 г MgSO₄ + 100 г KH₂PO₄ + деминерализованная вода в количестве, для доведения до 1 л) 10 мл, водопроводная вода в количестве, для доведения до 1 л.

На третьи сутки: инокуляция тестовых пробирок «А» (по каждому испытуемому штамму): одну спору удалили из агара и поместили в инкубационную среду объёмом 10 мл для выдержки в течение 24 часов при 26°С.

На четвёртые сутки: приготовление тестовых пробирок «В», 1 мл из пробирки А поместили в 9 мл среды для инкубации в течение 24 часов при 26°С.

На пятые сутки: содержимое каждой пробирки В перелили в среду в объёме 90 мл для инкубации в течение 16 часов ±2 ч при 26°С при хорошем перемешивании.

На шестые сутки: измерение заселённости с помощью счетной камеры Тома.

Посев в чашках (таблица 5).

Таблица 5

Контроль за заселённостью в чашках (таблица 6):

Таблица 6

- Приготовление сухих дрожжей: штаммы D (штамм S1) и Е (штамм S2):

На шестые сутки: увлажнение дрожжей стерильной водой: 1 г в 10 мл, перемешивание в течение 10 мин ультразвуком, инкубация при 30°С в течение 20 мин, перемешивание в течение 15 мин ультразвуком, выдержка в течение 20 мин при комнатной температуре.

Произвели посев в чашках при 2 мл препарата в 1 л сусла. Заселённость проверялась с помощью счётной камеры Тома: 10¹⁰ (таблица 7):

Таблица 7

- Анализ брожения

Процессы брожения проводились в кондиционируемом помещении, в котором температура поддерживалась равной 18°С. Слежение за кинетикой брожения осуществлялось путём взвешиваний чашек при ± 0,1 г приблизительно дважды в сутки. Брожение начиналось на 7-е сутки и прекращалось на 19-е.

Результаты представлены на фиг. 1.

В конце процесса брожения: сцеживание и сульфитация приблизительно 60 мг/л, помещение в бутылку и хранение при 8°С.

- Анализы готовых вин.

Комплексный анализ посредством инфракрасной спектроскопии с фурье-преобразованием и SO₂ посредством колориметрии при J20:

В зависимости от штамма дрожжей было установлено, что:

- отклонение общей концентрации спирта на объем составило 0,5 об.%,

- через 19 суток остаточные сахара присутствовали у всех штаммов,

- общая кислотность варьировалась от 4,69 до 5,12 г экв. H₂SO₄/л,

- содержание летучих кислот варьировалось от 0,48 до 0,71 г экв. H₂SO₄/л,

- яблочно-молочное брожение не началось.

Цветовой анализ полифенолов (таблица 9).

Таблица 9

Анализ сложных эфиров.

Таблица 10

Вывод:

В целом нами не установлена существенная разница между результатами использования сухих дрожжей D и дрожжей из пробирок с агаром.

Таблица 11

Для гибридов подтвердилась более высокая кинетика по сравнению с S1, однако образовалось две следующих группы:

- штамм 51-135 проявлял промежуточную кинетику брожения по сравнению с S2 и S1, содержание остаточных сахаров и общее содержание SO₂ (повышенное, следовательно, отрицательное) и влияние на окраску близкое к S2, и образование сложных эфиров в несколько большем количестве, но близком к родительским дрожжам;

- штамм 51-062 проявлял более быструю кинетику, чем S2, но с эквивалентной крутизной, содержание остаточных сахаров, содержание летучих кислот и SO₂ более слабое, чем у S2, и более значительное образование сложных эфиров, чем у родительских штаммов. Представляется, что эти дрожжи не соответствуют кинетическому критерию, но обладают очень интересными свойствами, способными стать предметом дальнейшего исследования.

Реферат

Группа изобретений относится к способу получения штамма винных дрожжей, вариантам штамма винных дрожжей и способу получения вина с использованием указанных штаммов дрожжей. Предложен способ получения штамма винных дрожжей, включающий гибридизацию штамма дрожжей S1, являющегося штаммом, депонированным в CNCM под номером I-5011, с дрожжевым штаммом S2, являющимся штаммом, депонированным в CNCM под номером I-5012, с последующим выделением штаммов. Осуществляют засев искусственного сусла, стандартизированного Международной организацией виноградников и вин (Organisme International de la Vigne et du Vin – OIV), приведённого к содержанию сбраживаемых сахаров 250 г/л при начальной концентрации азота 200 ч./млн, выделенными штаммами и исследуют кинетику брожения, производимого указанными штаммами. Осуществляют отбор штаммов, обладающих тремя следующими свойствами: кинетикой сбраживания от 15 до 22 суток при 24°С, устойчивостью к содержанию спирта выше или равному 15 об.%, потребностью в азоте менее или равной 200 ч./млн. Предложены также штамм винных дрожжей, депонированный в CNCM под номером I-4975 и штамм винных дрожжей, депонированный в CNCM под номером I-4977, обладающие вышеуказанными свойствами. Данные штаммы используют в способе получения вина. Группа изобретений позволяет получить штаммы винных дрожжей с высокой кинетикой ферментации, устойчивостью к спирту в количестве выше 15 об.% и способностью к сбраживанию в присутствии малого количества доступного азота. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 11 табл., 2 пр., 1 ил.

Формула