Аденоассоциированные вирусные векторы для лечения лизосомных болезней накопления - RU2718248C2

Код документа: RU2718248C2

Чертежи

Показать все 24 чертежа(ей)

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к векторам, пригодным для экспрессии представляющих интерес белков, и их применению в генной терапии. Настоящее изобретение также относится к векторам и последовательностям нуклеиновых кислот, способствующих лечению мукополисахаридозов (MPS) и, в частности, лечению мукополисахаридозов типа III-B или синдрома Санфилиппо-В.

Предпосылки создания изобретения

Лизосома представляет собой органеллу, находящуюся в цитоплазме клеток животных, которая содержит более 50 гидролаз, которые расщепляют биомолекулы во время рециклинга отработавших свое клеточных компонентов или после поглощения вирусов и бактерий. Эта органелла содержит несколько типов гидролитических ферментов, включая протеазы, нуклеазы, гликозидазы, липазы, фосфолипазы, фосфатазы и сульфатазы. Все ферменты представляют собой кислые гидролазы.

Лизосомные болезни накопления (LSD) вызваны генетическими дефектами, которые затрагивают один или более лизосомальных ферментов. Эти генетические заболевания возникают обычно в результате недостаточной активности конкретного фермента, присутствующего в лизосоме. В меньшей степени эти заболевания могут быть обусловлены нехваткой белков, вовлеченных в биогенез лизосом.

Отдельно взятые лизосомные болезни накопления (LSD) являются редкими, хотя как группа эти нарушения сравнительно широко распространены среди населения в целом. Общая заболеваемость LSD составляет приблизительно 1 случай на 5000 живорожденных. Смотри Meikle Р, et al., JAMA 1999; 281:249-254. Однако в некоторых группах в пределах общей популяции наблюдается особенно высокая частота возникновения LSD. Например, распространенность болезней Гоше и Тея-Сакса у потомков, происходящих от евреев Центральной и Восточной Европы (ашкенази), составляет 1 случай на 600 и 1 случай на 3900 живорожденных, соответственно.

Мукополисахаридозы типа III (MPSIII), известные в целом как синдром Санфилиппо, представляют собой лизосомные болезни накопления (LSD), вызванные недостаточностью одного из ферментов, участвующих в поэтапной деградации гликозаминогликана (GAG) гепарансульфата (HS), что приводит к его патологическому накоплению. MPSIII делятся на четыре подтипа в зависимости от недостаточности определенного фермента. Утрата ферментативной активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы вызывает подтип IIIB. Возникшее заболевание характеризуется клинически как прогрессирующая невропатия центральной нервной системы (CNS) с началом в детском возрасте. Клиническое течение заболевания можно в целом разделить на три фазы. В первой фазе заболевания, после периода отсутствия симптомов, который продолжается в течение первых месяцев жизни, обнаруживается замедление психического развития. Затем возникают серьезные поведенческие проблемы и прогрессирующее ухудшение умственного развития во время второй фазы заболевания. И наконец, с началом тяжелой деменции поведенческие проблемы медленно исчезают и все моторные функции начинают ухудшаться, что в конечном итоге приводит к дисфагии, полной потере локомоции и поражениям пирамидного пути. В дополнение к неврологическим симптомам пациенты с MPSIIIB страдают от неневрологических изменений, включая повторно возникающие инфекции уха, носа, гортани и дыхательных путей, частую диарею и констипацию, прогрессирующую дегенерацию суставов и пороки развития скелета, которые нарушают подвижность, а также гепато- и спленомегалию. Смотри Cleary and Wraith, Arch Dis Child. 1993; 69 (3):403-6, Neufeld and Muenzer, "The Mucopolysaccharidoses" in Scriver C, et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease", McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452, van de Kamp et al., Clin Genet. 1981; 20(2): 152-60, Moog et al., Am J Med Genet С Semin Med Genet. 2007; 145C(3):293-301. Как правило, пациенты умирают в конце второго или в начале третьего десятка лет жизни. Смотри Neufeld and Muenzer, supra. Более медленно прогрессирующая форма заболевания с более поздним началом и более длительной выживаемостью, известная как аттенуированный фенотип, описана для группы пациентов с MPSIIIB. Смотри Moog et al., supra and Valstar et al., Ann Neurol. 2010; 68(6):876-87.

В настоящее время не существует метода лечения MPSIIIB. Таким образом, контроль над заболеванием является симптоматическим и направлен на улучшение качества жизни пациентов и их семей. Это особенно важно для тех симптомов, которые возникают в результате изменений CNS. Например, периодически повышенное внутричерепное давление является признанной причиной нарушения поведения и является нередким для MPS. Смотри Muenzer et al., Genet Med. 2006; 8(8):465-73. Утолщение оболочек головного мозга вследствие осаждения мукополисахаридов будет являться основной причиной повышения давления спинномозговой жидкости (CSF). Таким образом, когда поведенческие изменения являются рефракторными к традиционной терапии, для снижения давления проводят шунтирование для обеспечения оттока спинномозговой жидкости. Неврологические симптомы улучшились значительно у шести пациентов с синдромом Санфилиппо, которым были вставлены спинномозговые шунты. Смотри Robertson et al., Eur J Pediatr. 1998; 157(8):653-5. С другой стороны, введение мелатонина считается наилучшим лечением для расстройств сна, характерных для заболевания, хотя не является полностью эффективным. Смотри Fraser et al., Arch Dis Child. 2005; 90(12): 1239-42. Для соматической патологии не существует конкретного лечения, и только паллиативные терапии можно применять для каждого индивидуального симптома.

Новые терапевтические подходы к лечению MPSIIIB проходят испытания с различной степенью успеха. Субстрат-депривационная терапия (substrate deprivation therapy, SDT) нацелена на снижение скорости синтеза гликозаминогликана (GAG), таким образом, что если сохраняется какая-либо остаточная ферментативная активность, избыточное накопление GAG предотвращается или по меньшей мере замедляется скорость накопления. Было высказано предположение о том, что генистеин, изофлавон сои, действует в качестве ингибитора продукции герапансульфата (HS) путем понижения киназной активности рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Смотри Jakobkiewicz-Banecka et al., J Biomed Sci. 2009; 16:26, Piotrowska et al., Eur J Hum Genet. 2006; 14(7):846-52. Результаты недавних исследований указывают на то, что генистеин ингибирует синтез GAG в фибробластах пациентов, страдающих различными мукополисахаридозами (типов I, II, III-А и III-В). Смотри Piotrowska et al., supra. Кратковременное и длительное пероральное введение генистеина мышиной модели болезни MPSIIIB привело к сокращению накопления и лучшим результатам выполнения тестов на двигательные навыки. Смотри Malinowska et al., Mol Genet Metab. 2009; 98(3):235-42, Malinowska et al., PLoS One. 2010; 5(12):e14192. Полагают, что при внутривенном введении генистеин способен проходить через гематоэнцефалический барьер (ВВВ), что позволяет осуществлять лечение патологии центральной нервной системы (CNS). В подтверждение этого, открытое пилотное исследование, в котором обогащенный генистеином экстракт сои вводили 5 пациентам с MPSIIIA и 5 пациентам с MPSIIIB в течение 12 месяцев, показало значительное улучшение как соматических, так и неврологических параметров. Смотри Piotrowska et al., Current Therapeutic Research. 2008; 69(2):166-179. Однако последующие исследования не показали улучшения ни по шкалам оценки инвалидности, ни по оценкам поведения у пациентов с MPSIIIA, MPSIIIB или MPSIIIC, получавших лечение генистеином в течение 12 месяцев. Смотри Delgadillo et al., J Inherit Metab Dis. 2011; 34(5):1039-44, исследование NTR #1826, зарегистрированное в Голландском национальном реестре исследований (The Netherlands National Trial Register), и de Ruijter et al., Ann Neurol. 2012; 71(1):110-20. Другая молекула, родамин В, также доказала свою эффективность в доклинических исследованиях в отношении понижения накопления GAG, причем эффективность была сходной с эффективностью, наблюдаемой при использовании генистеина. Смотри работу Hendriksz et al., "Guidelines for the investigation and Management of Mucopolysaccharidosis type III", 2012, доступную на www.mpssociety.co.uk. Полагают, что родамин В подавляет синтез цепей GAG путем ингибирования образования предшественников сахаров и/или активности гликозилтрансфераз. Смотри Roberts et al., Mol Genet Metab. 2007; 92(1-2):115-21.

Нормальные клетки секретируют значительные количества лизосомных ферментов, несущих маркер манноза-6-фосфат (М6Р), которые могут в дальнейшем поглощаться другими клетками через рецепторы М6Р на плазматической мембране. Это открывает возможность лечения LSD, вызванных недостатком растворимых гидролаз, путем инфузии правильной версии недостающего фермента. Несмотря на то, что для пациентов с синдромом Санфилиппо-В пока еще не существует заместительной ферментной терапии (ERT), внутривенное введение рекомбинантной альфа-N-ацетилглюкозаминидазы 3-х месячным мышам с MPSIIIB показало распределение рекомбинантного фермента в несколько органов, в основном в печень. Незначительное количество фермента было обнаружено в головном мозге, что объясняется присутствием гематоэнцефалического барьера (ВВВ), который ограничивает поступление экзогенно введенных белков в паренхиму головного мозга. Смотри Yu et al., Mol Genet Metab. 2000;71(4):573-80 и Hendriksz et al., supra. Существует программа начальной разработки продукта ERT для лечения неврологического заболевания у пациентов с MPSIIIB. Программа HGT-3010 (Shire) представляет собой ERT на основе интратекальной доставки рекомбинантного фермента и в настоящее время находится на доклинической стадии разработки. Прямая доставка ERT в CNS уменьшила неврологическую патологию у мышей с MPSIIIA и в настоящее время проходит испытание на пациентах с MPSIIIA. Смотри Hemsley К, et al., Genes Brain Behav. 2008; 53(2):161-8, Savas P, et al., Mol Genet Metab. 2004; 82:273-285, NCT01155778 и NCT01299727 на www.clinicaltrials.gov. Однако требуемая для терапии имплантация временного устройства для интратекальной доставки связана с существенными рисками и недостатками, а сама терапия является экономически нецелесообразной с точки зрения затрат, приходящихся на пациента в год.

Трансплантация гематопоэтических стволовых клеток (HSCT) с использованием стволовых клеток, выделенных из костного мозга (трансплантация костного мозга, ВМТ), доказала свою эффективность в лечении как соматической, так и неврологической патологии у пациентов с другими MPS. Смотри Peters et al., Blood 1996; 87(11):4894-902, Peters and Steward, Bone Marrow Transplant 2003; 31(4):229-39 и Yamada et al., Bone Marrow Transplant 1998; 21(6):629-34. Полученные от доноров миелоидные клетки способны проходить через ВВВ, поступать в паренхиму головного мозга и дифференцироваться в микроглиальные клетки, которые секретируют недостающий лизосомный фермент, который затем поглощается окружающими клетками, что приводит к коррекции накопления GAG в головном мозге. Смотри Krivit et al., Cell Transplant. 1995; 4(4):385-92. Однако явного благоприятного эффекта не наблюдалось у пациентов с синдромом Санфилиппо А или В, которые подвергались ВМТ. Смотри Hoogerbrugge et al., Lancet 1995; 345(8962): 1398-402, Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1992; 15(6):911-8,

and Tuncbilek, Turk J Pediatr. 1995; 37(2):157-63, Sivakumur and Wraith, J Inherit Metab Dis. 1999; 22(7):849-50 и Lange et al., Arq Neuropsiquiatr. 2006; 64(1):1-4. Основной причиной неудачи ВМТ, по-видимому, является медленная скорость замещения микроглиальной популяции потомством гематопоэтических клеток по сравнению с быстрым прогрессированием первичного заболевания. Смотри Rovelli, Bone Marrow Transplant 2008; 41Suppl2:S87-9. Таким образом, HSCT с использованием ВМТ в настоящее время не рассматривается в качестве способа лечения пациентов с MPSIII. Смотри Boelens et al., Pediatr Clin North Am. 2010; 57(1):123-145. Трансплантация HSCT с использованием стволовых клеток, полученных из пуповинной крови, улучшила показатели когнитивных функций у мышей с MPSIIIB, но требовалось повторное введение клеток. Смотри Willing et al., Cell Transplantation 2013; epub ahead of print. Этот подход недавно использовали для трансплантации нескольким детям с MPSIIIA и MPSIIIB; до сих пор остается неясным, приводит ли это к защите CNS от дегенерации. Смотри de Ruijter et al., Curr Pharm Biotechnol. 2011; 12(6):923-30.

Требуются альтернативные подходы, учитывая ограничения существующих возможных методов лечения MPSIII и, в частности, MPSIIIB. Генная терапия in vivo позволяет одновременно лечить MPSIIIB и другие наследственные заболевания с возможностью длительного благотворного воздействия. На животных моделях болезни MPSIIIB было протестировано несколько подходов к генной терапии, основанных на использовании различных вирусных векторов в сочетании с различными путями введения.

Лентивирусные векторы, кодирующие ген человеческой альфа-N-ацетилглюкозаминидазы, вводили внутривенно молодым мышам с MPSIIIB, что привело к низким уровням экспрессии трансгена в печени, селезенке, легких и сердце, что снизило, но не нормализовало накопление GAG в этих тканях. Смотри Di Natale et al., Biochem J. 2005; 388(2):639-46. Терапевтический потенциал лентивирусных векторов также был протестирован путем прямой доставки векторов в паренхиму головного мозга путем интракраниального введения. Смотри Di Domenico et al., Am J Med Genet A. 2009; 149A(6): 1209-18. Мыши с MPSIIIB, которым осуществляли введение в один участок мозга, показали повышенную активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы вплоть до 6 месяцев после лечения, которое лишь частично скорректировало патологические изменения, вызванные лизосомной болезнью накопления.

Опосредованный аденоассоциированным вирусным (AAV) вектором перенос генов, в частности, стремительно становится лучшим подходом для многих применений генной терапии in vivo благодаря высокой эффективности трансдукции и отсутствию патогенности этих векторов. AAV-векторы могут трансдуцировать постмитотические клетки, и некоторые доклинические и клинические исследования продемонстрировали возможность опосредованного AAV-векторами переноса генов эффективно управлять длительной экспрессией терапевтических трансгенов при различных заболеваниях. Смотри Bainbridge et al., N Engl J Med. 2008; 358(21):2231-9, Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008; 19(10):979-90, Maguire et al., N Engl J Med. 2008; 358(21):2240-8, Niemeyer et al., Blood 2009; 113(4):797-806, Rivera et al., Blood 2005; 105(4):1424-30, Nathawani et al., N Engl J Med. 2011; 365(25):2357-65 и Buchlis et al., Blood 2012; 119(13):3038-41.

При доставке AAV-векторов серотипа 2, кодирующих человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, в один участок паренхимы головного мозга мышей с MPSIIIB, экспрессия и активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы ограничивалась участком инъекции и достигалось лишь частичное ослабление фенотипа заболевания. Смотри Fu et al., Mol Ther. 2002; 5(1):42-9, Cressant et al., J Neurosci. 2004; 24(45): 10229-39. Внутривенная доставка AAV2-векторов мышам с MPSIIIB после предварительного лечения маннитолом для прохождения через ВВВ привела к значительно продленной выживаемости, улучшенной поведенческой активности и снижению лизосомной патологии головного мозга, хотя была достигнута лишь частичная коррекция соматического заболевания. Смотри McCarty et al., Gene Ther. 2009; 16(11):1340-52. С другой стороны, однократное введение AAV2-векторов в спинномозговую жидкость (CSF) путем интрацистернальной инъекции привело к восстановлению активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы и снижению GAG в головном мозге мышей с MPSIIIB, хотя в соматических тканях не наблюдалось детектируемой активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы. Смотри Fu et al., J Gene Med. 2010; 12(7):624-33. Комбинированная терапия, включающая интрацистернальную и внутривенную доставку AAV2, продемонстрировала значительную длительную терапевтическую эффективность в CNS, а также частичную соматическую коррекцию. Смотри Fu et al., Gene Ther. 2007; 14(14): 1065-77.

В других исследованиях были использованы преимущества высокого тропизма в отношении нейрональных клеток, продемонстрированного AAV-векторами серотипа 5 после интрапаренхимального введения. Однако эти векторы имеют слабое распределение в пределах паренхимы головного мозга, и данный подход требует множественных инъекций. Доставка AAV5-векторов во множество участков головного мозга новорожденных мышей с MPSIIIB в сочетании с трансплантацией костного мозга показала терапевтическую эффективность, сходную с эффективностью, полученной при использовании векторов серотипа 2. Смотри Heldermon et al., Mol Ther. 2010; 18(5):873-80. В животных моделях с более крупным размером головного мозга стереотаксическое введение AAV5-векторов в четыре различных участка головного мозга собак с MPSIIIB привело к детекции активной альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в обширных областях головного мозга. Однако ферментативная активность оставалась низкой или недетектируемой в наиболее ростральных и наиболее каудальных областях, особенно в мозжечке. Смотри Ellinwood et al., Mol Ther. 2011; 19(2):251-9. Лизосомная патология улучшилась, но полностью не была скорректирована у получавших лечение собак с MPSIIIB, что указывало на то, что уровни ферментативной активности, достигнутые с использованием данного подхода, были недостаточными, чтобы справиться с накоплением GAG. Несмотря на эту частичную эффективность, недавно было инициировано клиническое исследование, основанное на этом подходе. Смотри ISRCTN19853672 в реестре ISRCTN. Чем крупнее головной мозг, тем труднее становится охватить весь объем органа с помощью интрапаренхимальных инъекций, и доставка человеку требует введения вектора в несколько участков, что делает доставку технически проблематичной и требующей разработки специальных хирургических процедур. Смотри Souweidane et al., J Neurosurg Pediatr. 2010; 6(2):115-122.

На сегодняшний день опубликовано только одно исследование, в котором для лечения MPSIIIB используют AAV-векторы серотипа 9. В этом подходе используется способность AAV9-векторов трандуцировать CNS при системном введении. Смотри Foust et al., Nat Biotechnol. 2009; 27(1):59-65 and Duque, et al., Mol Ther. 2009; 17(7): 1187-1196. Внутривенная доставка AAV9-векторов, содержащих альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, мышам с MPSIIIB привела к коррекции лизосомной патологии накопления в CNS и соматических органах, улучшению поведенческой активности и продлению жизни. Смотри Fu et al., Mol Ther. 2011; 19(6): 1025-33. Однако этот предполагаемый способ действия имеет несколько недостатков. Во-первых, используемый промотор CMV, как сообщалось, подавляется. Смотри Loser et al., J Virol. 1998 Jan; 72(1): 180-90. Во-вторых, терапевтическая эффективность достигалась при очень высокой дозе вектора (≥1×10¹³ vg/кг). Применение таких высоких доз будет вызывать трудности для перехода к клиническому применению с точки зрения изготовления и безопасности.

Ни один из вышеуказанных подходов не восстанавливал полностью активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы, не достигал полной эрадикации внутрицитоплазматических включений в CNS и соматических тканях или не корректировал все клинические признаки MPSIIIB. Таким образом, существует потребность в новых подходах к лечению MPSIIIB, которые обладают лучшими профилями эффективности и безопасности.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предлагаются новые рекомбинантные векторы для лечения заболеваний, в частности, для лечения мукополисахаридозов типа III (MPSIII), в особенности MPSIIIB.

Первый аспект изобретения относится к аденоассоциированным вирусным векторам (AAV), содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu), SEQ ID NO: 1. AAV-векторы в соответствии с настоящим изобретением относятся к серотипу 9 (AAV9). Была доказана эффективность этих векторов в отношении полного возвращения к исходному состоянию уровня патологического накопления GAG во всех областях головного мозга и соматических тканях.

AAV9-векторы согласно изобретению содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую Naglu, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 2, и предпочтительно по меньшей мере на 84% идентична SEQ ID NO: 2.

Кроме того, AAV9-векторы согласно изобретению содержат промотор, связанный с кодирующей нуклеотидной последовательностью, для контроля экспрессии Naglu. Подходящий промотор представляет собой промотор CAG, SEQ ID NO: 4.

Другой аспект изобретения относится к плазмидам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу (Naglu), и, в частности, нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 2 или предпочтительно по меньшей мере на 84% идентичную SEQ ID NO: 2.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество AAV9-векторов согласно изобретению или плазмиды, описанной в нем.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются способы, полезные для доставки полинуклеотидов, в частности, полинуклеотидов Naglu.

Еще один аспект изобретения относится к AAV9-векторам согласно изобретению или плазмиде, описанной в нем, для применения в качестве лекарственного средства, в частности, для лечения мукополисахаридозов типа III (MPSIII), в частности, MPSIIIB.

В настоящем изобретении предлагается также способ получения AAV9-векторов согласно изобретению.

В следующем аспекте изобретение относится к выделенным клеткам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, и, в частности, нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 2 или предпочтительно по меньшей мере на 84% идентичную SEQ ID NO: 2.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Гидродинамическая доставка плазмид (pAAV-CAG-hNaglu), кодирующих человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. Двухмесячным мышам с MPSIIIB гидродинамически инъецировали 50 мкг плазмиды pAAV-CAG-hNaglu. На гистограммах изображена активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (NAGLU), измеренная в печени (А) и сыворотке (В) через 1 неделю после введения плазмиды. Активность NAGLU у мышей дикого типа (WT), которым инъецировали солевой раствор, была принята за 100%. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 3-4 мышей на группу. ***р<0,001 относительно WT.

Фигура 2. Внутривенная (IV) доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-hNaglu), кодирующих человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в печени (А) и сыворотке (В) (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB и мышей с MPSIIIB, получавших лечение путем IV инъекции 5×10¹¹ vg AAV9-CAG-hNaglu. (С) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в соматических органах. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 5-8 мышей на группу. Р<0,001 относительно WT, **Р<0,01, ***Р<0,001 относительно не получавших лечение мышей с MPSIIIB. nd: не обнаружено.

Фигура 3. Внутривенная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-hNaglu), кодирующих человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. (А) Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в различных отделах головного мозга (I-IV) (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB и мышей с MPSIIIB, получавших лечение путем IV инъекции 5×10¹¹ vg AAV9-CAG-hNaglu. (В) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в этих же отделах головного мозга. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 5-8 мышей на группу. *** р<0,001 относительно не получавших лечение мышей с MPSIIIB. nd: не обнаружено.

Фигура 4. Внутривенная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-cohNaglu), кодирующих оптимизированную человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в печени (А) и сыворотке (В) (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB и мышей с MPSIIIB, получавших лечение путем IV инъекции 5×10¹¹ vg AAV9-CAG-cohNaglu. (С) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в соматических органах. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 5-8 мышей на группу. Р<0,001 относительно WT, ** Р<0,01, *** Р<0,001 относительно не получавших лечение мышей с MPSIIIB. nd: не обнаружено.

Фигура 5. Внутривенная доставка AAV9-векторов, кодирующих оптимизированную альфа-N-ацетилглюкозаминидазу человека (AAV9-CAG-cohNaglu). (A) Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в различных отделах головного мозга (I-IV) (здоровых) мышей дикого типа, не подвергнутых лечению мышей с MPSIIIB и мышей с MPSIIIB, подвергнутых лечению путем IV инъекции 5×10¹¹ vg AAV9-CAG-cohNaglu. (В) Количественное определение глюкозаминогликана (GAG) в тех же самых отделах головного мозга. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 5-8 мышей на группу. *** Р<0,001 в сравнении с не подвергнутыми лечению мышами с MPSIIIB. nd: не обнаружено.

Фигура 6. Интрацистернальная доставка (IC) AAV9-векторов (AAV9-CAG-hNaglu), кодирующих человеческую альфа-V-ацетилглюкозаминидазу. (А) Активность альфа-V-ацетилглюкозаминидазы в разных отделах головного мозга (I-IV) (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB и мышей с MPSIIIB, получавших лечение путем интрацистернальной инъекции 9,3×10⁹ vg AAV9-CAG-hNaglu. (B) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в тех же самых отделах головного мозга. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 5-8 мышей на группу. *** Р<0,001 относительно не получавших лечение мышей с MPSIIIB. nd: не обнаружено.

Фигура 7. Интрацистернальная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-hNaglu), кодирующих человеческую альфа-V-ацетилглюкозаминидазу. (А) Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в печени (здоровых) мышей дикого типа и не получавших лечение мышей с MPSIIIB, и мышей с MPSIIIB, получавших лечение путем интрацистернальной инъекции 9,3×10⁹ vg AAV9-CAG-hNaglu. (В) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в соматических органах. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 5-8 мышей на группу. Р<0,001 относительно WT, ** Р<0,01, *** Р<0,001 относительно не получавших лечение мышей с MPSIIIB. nd: не обнаружено.

Фигура 8. Интрацистернальная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-cohNaglu), кодирующих оптимизированную человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. (А) Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в разных отделах головного мозга (I-IV) (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB, и мышей с MPSIIIB, получавших лечение путем интрацистернальной инъекции 9,3×10⁹ vg AAV9-CAG-cohNaglu. (В) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в тех же самых отделах головного мозга. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 5-8 мышей на группу. *** Р<0,001 относительно не получавших лечение мышей с MPSIIIB. nd: не обнаружено.

Фигура 9. Интрацистернальная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-cohNaglu), кодирующих оптимизированную человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. (А) Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в печени (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB, и мышей с MPSIIIB, получавших лечению путем интрацистернальной инъекции 9,3×10⁹ vg AAV9-CAG-cohNaglu. (В) Количественное определение гликозаминогликана (GAG) в соматических органах. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 5-8 мышей на группу. Р<0,001 относительно WT, ** Р<0,01, *** Р<0,001 относительно не получавших лечение мышей с MPSIIIB. nd: не обнаружено.

Фигура 10. Гидродинамическая доставка плазмиды (pAAV-CAG-cohNaglu-версия2), кодирующей оптимизированную человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу версии 2. Двухмесячным мышам с MPSIIIB гидродинамически инъецировали 50 мкг плазмиды pAAV-CAG-cohNaglu-версия2. На гистограммах изображена активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (NAGLU) в печени (А) и сыворотке (В), измеренная через 1 неделю после введения плазмиды. Активность NAGLU у мышей дикого типа (WT), которым инъецировали солевой раствор, была принята за 100%. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 3-4 мышей на группу. *** р<0,001 относительно WT.

Фигура 11. Гидродинамическая доставка плазмиды (pAAV-CAG-cohNaglu-версия3), кодирующей оптимизированную человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу версии 3. Двухмесячным мышам с MPSIIIB гидродинамически инъецировали 50 мкг плазмиды pAAV-CAG-cohNaglu-версия3. На гистограммах изображена активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (NAGLU) в печени (А) и сыворотке (В), измеренная через 1 неделю после введения плазмиды. Активность NAGLU у мышей дикого типа (WT), которым инъецировали солевой раствор, была принята за 100%. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 3-4 мышей на группу. *** р<0,001 относительно WT.

Фигура 12. Интрацистернальная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-comNaglu), кодирующих оптимизированную мышиную альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. Биораспределение векторных геномов после введения в мостомозжечковую цистерну мышей с MPSIIIB 3×10¹⁰ vg AAV9-CAG-comNaglu. Векторные геномы количественно определяли в головном мозге (А) и соматических тканях (В) путем количественной PCR и относили к количеству ДНК, содержащейся в диплоидном геноме. ND: не обнаружено.

Фигура 13. Интрацистернальная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-comNaglu), кодирующих оптимизированную мышиную альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. (А) Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в разных отделах головного мозга (I-V) (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB и мышей с MPSIIIB, которым вводили в мостомозжечковую цистерну 3,9×10¹⁰ vg контрольного вектора (AAV9-Null) или 3×10¹⁰ vg AAV9-CAG- comNaglu. (В) Количественное определение глюкозаминогликанов (GAG) в тех же самых участках головного мозга. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 4 мышей на группу. ** Р<0,01, *** Р<0,001 относительно MPSIIIB-null. nd: не обнаружено.

Фигура 14. Интрацистернальная доставка AAN9-векторов (AAV9-CAG-comNaglu), кодирующих оптимизированную мышиную альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. (А) Количественное определение интенсивности сигнала, полученного в различных областях головного мозга после окрашивания на маркер лизосом LIMP-2, что дает информацию о размере лизосомального компартмента, у (здоровых) мышей дикого типа, мышей с MPSIIIB, которым вводили в мостомозжечковую цистерну 3,9×10¹⁰ vg контрольного вектора (AAV9-Null) или 3×10¹⁰ vg AAV9-CAG-comNaglu. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 4 мышей на группу. * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001 относительно MPSIIIB-null. (В) Анализ при помощи электронной микроскопии коры головного мозга и мозжечка мышей дикого типа (левая панель), не получавших лечение мышей с MPSIIIB (средняя панель) и мышей с MPSIIIB, которым вводили в мостомозжечковую цистерну AAV9-CAG-comNaglu (правая панель). 1. нейроны; 2. периневральные глиальные клетки; 3. нейроны Пуркинье. (С) Активность других лизосомальных ферментов в экстрактах головного мозга, полученных от мышей дикого типа (WT), не получавших лечение мышей с MPSIIIB (MPSIIIB) и мышей с MPSIIIB, которым вводили в мостомозжечковую цистерну 3,9×10¹⁰ vg контрольного вектора (AAV9-Null) или 3×10¹⁰ vg AAV9-CAG-comNaglu. SGSH, N-сулъфоглюкозамин-сульфогидролаза, GUSB, бета-глюкуронидаза, HEXB, гексозаминидаза В. Активности ферментов дикого типа (WT) принимали за 100%. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 4 мышей на группу. *** Р<0,001 относительно MPSIIIB-Null.

Фигура 15. Интрацистернальная доставка ААV9-векторов (AAV9-CAG-comNaglu), кодирующих оптимизированную мышиную альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. На гистограммах изображена интенсивность сигнала, измеренного после иммуноокрашивания на маркер астроцитов GFAP (А) и маркер микроглии BSI-B4 (В) в участках лобной, теменной и затылочной коры головного мозга, верхнем двухолмии и таламусе от (здоровых) мышей дикого типа и мышей с MPSIIIB, которым вводили в мостомозжечковую цистерну 3,9×10¹⁰ vg контрольного вектора (AAV9-Null) или 3×10¹⁰ vg AAV9-CAG-comNaglu. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 2-3 мышей на группу. * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001 относительно MPSIIIB-null. (С) Функциональная категоризация на основе аннотации согласно «Генной онтологии» (Gene Ontology, GO). На секторной диаграмме показаны фракции транскриптов, связанных с каждым биологическим процессом. Очевидно, что большинство терминов представляют категории, связанные с воспалением/иммунитетом. (D) Иерархическая кластеризация всех экспериментальных групп на основе набора генов, которые программное обеспечение CTEN рассматривает как характерные для микроглии. Каждый столбец представляет ген, и каждая строка представляет животное. Уровень экспрессии каждого гена указан относительно среднего содержания этого гена по всем образцам в серой шкале, показанной в нижней части. Древовидная схема образцов, показанная над матрицей, представляет общее сходство в уровнях транскриптов. Очевидно, что все мыши с MPSIIIB, получавшие лечение AAV9-CAG-comNaglu, имеют профиль генной экспрессии, близкий к профилю здоровых подобранных по возрасту однопометных животных дикого типа WT.

Фигура 16. Интрацистернальная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-comNaglu), кодирующих оптимизированную мышиную альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в печени (А) и сыворотке (В) (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB и мышей с MPSIIIB, которым вводили в мостомозжечковую цистерну 3,9×10¹⁰ vg контрольного вектора (AAV9-Null) или 3×10¹⁰ vg AAV9-CAG-comNaglu. (С) Количественное определение глюкозаминогликана (GAG) в соматических органах. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 4-8 мышей на группу. Р<0,05 относительно WT, ** Р<0,01, ** Р<0,001 относительно не получавших лечение мышей с MPSIIIB. nd: не обнаружено. (D) Анализ методом электронной микроскопии печени. Множественные электронно-светлые вакуоли (стрелки) наблюдаются в цитоплазме гепатоцитов от мышей с MPSIIIB, получавших лечению null-вектором, и эти везикулы исчезают у животных, получавших лечение AAV9-CAG-mNaglu. (Е) Активность других лизосомальных ферментов в экстрактах печени, полученных от тех же самых когорт животных, как в (А и В). IDS, идуронат-2-сульфатаза, IDUA, алъфа-L-идуронидаза, SGSH, N-сулъфоглюкузамин-сульфогидролаза, GUSB, бета-глюкуронидаза, НЕХВ, гексозаминидаза В. Активности ферментов WT были приняты за 100%. Величины представляют собой средние значения ± SEM для 4 мышей на группу. ** Р<0,01 и *** Р<0,001 относительно MPSIIIB-Null.

Фигура 17. Интрацистернальная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-comNaglu), кодирующих оптимизированную мышиную альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. Поведенческая оценка ранее не подвергавшихся тестированию (здоровых) мышей дикого типа, не получавших лечение мышей с MPSIIIB и мышей с MPSIIIB, которым вводили в мостомозжечковую цистерну 3,9×10¹⁰ vg контрольного вектора (AAV9-Null) или 3×10¹⁰ vg AAV9-CAG-comNaglu. Данные, относящиеся к двигательной и исследовательской активности, регистрировали в течение первых 2 минут и представляли в виде среднего значения±SEM для 10-15 животных на группу. (А) Время оживания до вхождения в центр, (В) Время, проведенное на границе, (С) Число вхождений в центр, (D) Время отсутствия движения, (Е) Общее пройденное расстояние, (F) Общее число пересеченных линий. * Р<0,05 и ** Р<0,01 относительно MPSIIIB-null. (G) Анализ выживаемости Каплана-Мейера у диких (WT) мышей (n=23), не получавших лечение мышей с MPSIIIB (n=12), мышей с MPSIIIB, которым инъецировали 3,9×10¹⁰ vg AAV9-Null (n=5) или 3×10⁹ vg AAV9-CAG-comNaglu (n=8). Лечение с помощью генной терапии AAV9-CAG-comNaglu значительно увеличило продолжительность жизни животных с MPSIIIB. Р=0,0007 для мышей с MPSIIIB, получавших лечение AAV9-CAG-comNaglu, относительно MPSIIIB-null.

Фигура 18. Интрацистернальная доставка AAV9-векторов (AAV9-CAG-comNaglu), кодирующих оптимизированную собачью альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, собакам породы бигль. (А) Наблюдение в динамике по времени за титрами анти-AAV9 нейтрализующих антител (Nab) в парных образцах сыворотки и спинномозговой жидкости (CSF) до и после интра-CSF доставки векторов AAV9-CAG-cocNaglu здоровым собакам породы бигль. Собак 3 и 4 предварительно иммунизировали путем внутривенной доставки 1×10¹¹ vg/кг AAV9-null-векторов за месяц до интрацистернального введения. (В) Наблюдение в динамике по времени за активностью альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в CSF здоровых взрослых собак породы бигль после интра-CSF введения 6,5×10¹² vg AAV9-векторов, кодирующих собачью альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. Собаки 1 и 2 (незаштрихованное изображение) были нативными на момент введения, тогда как собаки 3 и 4 (заштрихованные изображения) имели предсуществующий иммунитет против AAV9-вектора. Количество лейкоцитов (WBC) в CSF в каждый момент времени для всех собак показано на том же самом графике (пунктирные линии).

Фигура 19. Схематическое изображение плазмиды pAAV-CAG-hNaglu (А) и схематическое изображение генома рекомбинантного AAV-вектора AAV9-CAG-hNaglu (В).

Фигура 20. Схематическое изображение плазмиды pAAV-CAG-cohNaglu (А) и схематическое изображение генома рекомбинантного AAV-вектора AAV9-CAG-cohNaglu (В).

Фигура 21. Схематическое изображение плазмиды pAAV-CAG-cohNaglu-версия2 (А) и схематическое изображение генома рекомбинантного AAV-вектора AAV9-CAG-cohNaglu-версия2 (В).

Фигура 22. Схематическое изображение плазмиды pAAV-CAG-cohNaglu-версия3 (A) и схематическое изображение генома рекомбинантного AAV-вектора AAV9-CAG-cohNaglu-версия3 (В).

Фигура 23. Схематическое изображение плазмиды pAAV-CAG-comNaglu (А) и схематическое изображение генома рекомбинантного AAV-вектора AAV9-CAG-comNaglu (В).

Фигура 24. Схематическое изображение плазмиды pAAV-CAG-cocNaglu (А) и схематическое изображение генома рекомбинантного AAV-вектора AAV9-CAG- cocNaglu (B).

Депонирование микроорганизмов

Плазмида pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6) была депонирована 13 ноября 2012 года под номером доступа DSM 26626 на DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная республика Германия.

Плазмида pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 5) была депонирована 13 марта 2014 года под номером доступа DSM 28568 на DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная республика Германия.

Плазмида pAAV-CAG-cohNaglu-версия 2 (SEQ ID NO: 20) была депонирована 29 апреля 2015 года под номером доступа DSM 32042 на DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная республика Германия.

Плазмида pAAV-CAG-cohNaglu-версия 3 (SEQ ID NO: 23) была депонирована 29 апреля 2015 года под номером доступа DSM 32043 на DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная республика Германия.

Определения

Термин «нуклеотидная последовательность» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, либо ДНК, либо РНК, содержащей дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды, соответственно. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной, одноцепочечной или содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности.

Термин «% идентичности последовательностей» относится к процентному содержанию нуклеотидов кандидатной последовательности, которые идентичны нуклеотидам в контрольной последовательности после выравнивания последовательностей с достижением максимального % идентичности последовательностей. % Идентичности последовательностей может быть определен с помощью любых методов или алгоритмов, установленных в данной области, таких как алгоритмы ALIGN, BLAST и BLAST 2.0. Смотри Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977;25:3389-3402 и Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990; 215:403-410.

В настоящем документе % идентичности последовательностей рассчитывается путем деления количества нуклеотидов, которые после выравнивания идентичны контрольной последовательности и кандидатной последовательности, на общее количество нуклеотидов в контрольной последовательности и умножения результата на 100.

Термин «кодировать» или «кодирующая» относится к генетическому коду, который определяет, как транслируется нуклеотидная последовательность в полипептид или белок. Порядок нуклеотидов в последовательность определяет порядок аминокислот в полипептиде или белке.

Термин «белок» относится к макромолекуле, состоящей из одной или нескольких линейных цепей аминокислот или полипептидов. Белки могут претерпевать посттрансляционные модификации, такие как превращение цистеинового остатка в 3-оксоаланин, гликозилирование или связывание металла. Гликозилирование белка представляет собой добавление различных углеводов, которые ковалентно связываются с аминокислотной цепью.

Термин «эффективное количество» относится к количеству вещества, достаточному для достижения предназначенной цели. Например, эффективное количество AAV9-вектора для повышения активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (Naglu) представляет собой количество, достаточное для снижения накопления гликозаминогликана. «Терапевтически эффективное количество» экспрессионного вектора для лечения заболевания или нарушения представляет собой количество экспрессионного вектора, достаточное для уменьшения или устранения признаков и симптомов заболевания или нарушения. Эффективное количество данного вещества будет различаться в зависимости от таких факторов, как природа вещества, путь введения, размер и вид животного, получающего вещество, и цель назначения вещества. Эффективное количество в каждом индивидуальном случае может быть определено эмпирически специалистом в данной области в соответствии с методами, принятыми в данной области.

Термин «индивидуум» относится к млекопитающему, предпочтительно человеку или млекопитающему, не являющемуся человеком, более предпочтительно к мыши, крысе, другим грызунам, кролику, собаке, кошке, свинье, корове, лошади или примату, еще более предпочтительно к человеку.

Термин «функционально связанный» относится к функциональному отношению и локализации промоторной последовательности по отношению к целевому гену (например, промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он воздействует транскрипцию последовательности). Обычно функционально связанный промотор примыкает к представляющей интерес последовательности. Однако энхансер может быть не примыкающим к представляющей интерес последовательности для контроля ее экспрессии.

Термин «тропизм» относится к пути, в котором различные вирусы эволюционировали до предпочтительной направленности на конкретные виды хозяев или конкретные типы клеток в пределах этих видов.

Термин «генная терапия» относится к переносу представляющего интерес генетического материала (например, ДНК или РНК) в организм хозяина для лечения или предупреждения генетического или приобретенного заболевания или состояния. Представляющий интерес генетический материал кодирует продукт (например, белок, полипептид, пептид или функциональную РНК), продукция которого in vivo желательна. Например, представляющий интерес генетический материал может кодировать фермент, гормон, рецептор или полипептид, имеющий терапевтическую ценность.

Термины «рекомбинантный вирусный вектор», «вирусный вектор», «рекомбинантный вектор» или «вектор» относятся к агенту, полученному из природного вируса с помощью методов генной инженерии, способному переносить представляющий интерес генетический материал (например, ДНК или РНК) в клетку, что приводит к получению продукта, кодируемого этим указанным генетическим материалом (например, белка, полипептида, пептида или функциональной РНК) в клетке-мишени. В контексте настоящего изобретения «рекомбинантный вектор» или «вектор» следует понимать как капсидный белок, а также содержащийся в нем генетический материал, используемый для переноса указанного генетического материала в клетку. При ссылке на «рекомбинантный вектор» или «вектор» посредством нуклеотидной последовательности это означает, что он относится к «рекомбинантному вектору» или «вектору», геном которого является таким, как указано в соответствующем списке последовательностей (SEQ ID).

Термин «рекомбинантная плазмида» или «плазмида» относится к малой кольцевой двухцепочечной самореплицирующейся молекуле ДНК, полученной с помощью методов генной инженерии, способной переносить представляющий интерес генетический материал в клетку, что приводит к получению продукта, кодируемого этим указанным генетическим материалом (например, белка, полипептида, пептида или функциональной РНК) в клетке-мишени. Кроме того, термин «рекомбинантная плазмида» или «плазмида» также относится к малой кольцевой двухцепочечной самореплицирующейся молекуле ДНК, полученной с помощью методов генной инженерии, используемой во время изготовления вирусных векторов в качестве носителей рекомбинантного векторного генома.

Подробное описание изобретения

Помимо генетического материала рекомбинантный вектор может также содержать различные функциональные элементы, которые включают элементы, контролирующие транскрипцию, такие как промоторы или операторы, области связывания транскрипционных факторов или энхансеры, и контролирующие элементы для инициации или терминации трансляции.

Векторы в соответствии с изобретением представляют собой аденоассоциированные векторы (AAV), которые используют для переноса представляющего интерес гена. Было доказано, что они обладают высокой эффективностью в отношении трансдукции постмитотических клеток в разнообразные ткани. В контексте настоящего изобретения векторы используют для доставки человеческого полинуклеотида альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (hNaglu) (SEQ ID NO: 2) или кодон-оптимизированного человеческого полинуклеотида альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (cohNaglu) (SEQ ID NO: 3). Аденоассоциированный вектор представляет собой вектор, полученный из генома аденоассоциированного вируса семейства Parvoviridae. Геном аденоассоциированного вируса построен из одноцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ssDNA). Эти векторы инфицируют млекопитающих, но являются непатогенными (то есть не вызывают заболевания). Они могут инфицировать делящиеся или неделящиеся клетки, и их тропизм изменяется в зависимости от серотипа. Под серотипом понимается подразделение вирусов на группы в зависимости от их капсидных антигенов. Серотип аденоассоциированного вируса, определенный по его капсидному белку, ограничивает тропизм вируса и позволяет ему входить в конкретный тип клеток. В контексте настоящего изобретения серотип 9 аденоассоциированных вирусных векторов (AAV9) показывает наилучшую способность доставлять генетический материал в головной мозг, а также в периферические органы после однократного введения.

Удивительным образом авторы изобретения обнаружили, что ассоциация в одной и той же структурной единице капсида AAV9 с нуклеотидной последовательностью, кодирующей альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, вместе со специфическим промотором CAG обеспечивают длительную экспрессию недостающего фермента во всех областях головного мозга. В результате корректируется лизосомное накопление гликозаминогликана (GAG), предотвращая тем самым неврологические изменения, характерные для болезней MSPIII и, в частности, MPSIIIB. Этот эффект был получен даже в обонятельной луковице, которая находится на удалении от точки введения векторов. Кроме того, AAV9-векторы в соответствии с изобретением, доставленные в спинномозговую жидкость, были способны достигать большого круга кровообращения для трансдукции печени. Продукция и секреция фермента клетками печени приводит к повышению активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в сыворотке, в конечном итоге приводя к уменьшению лизосомной патологии во многих соматических тканях. Это является очевидным преимуществом векторов согласно изобретению по сравнению с существующими подходами, которые только частично корректируют клинические признаки заболевания и обычно проявляют свой эффект либо в головном мозге, либо в большом круге кровообращения, но не в обоих одновременно.

Таким образом, настоящее изобретение относится к рекомбинантным AAV9-векторам, содержащим промотор CAG (SEQ ID NO: 4), связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1.

В частности, рекомбинантные AAV9-векторы по настоящему изобретению содержат промотор CAG (SEQ ID NO: 4), связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 2. Более предпочтительно рекомбинантные AAV9-векторы по настоящему изобретению содержат промотор CAG (SEQ ID NO: 4), связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, которая по меньшей мере на 84% идентична последовательности SEQ ID NO: 2. В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 84%, 87%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 2.

В другом конкретном варианте осуществления рекомбинантные AAV9-векторы согласно настоящему изобретению содержат промотор CAG (SEQ ID NO: 4), связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, которая по меньшей мере на 85% идентична SEQ ID NO: 3. В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 85%, 87%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 3.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, представляет собой SEQ ID NO: 2.

В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, представляет собой SEQ ID NO: 3. Последовательность, представленная в SEQ ID NO: 3, идентична последовательности SEQ ID NO: 2 на 84%.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, представляет собой SEQ ID NO: 19.

AAV9-векторы согласно настоящему изобретению содержат промотор, который контролирует трансляцию и транскрипцию представляющего интерес гена. Промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, функционально связанную с указанным представляющим интерес геном. Промотор, используемый в настоящем изобретении, представляет собой промотор CAG, который относится к комбинации, содержащей ранний энхансерный элемент цитомегаловируса и промотор β-актина цыпленка. Кроме того, он включает часть интрона β-глобулина, которая наделяет стабильностью мРНК, полученную из представляющего интерес гена. Смотри Alexopoulou A, et al., ВМС Cell Biology 2008; 9(2): 1-11. Промотор CAG, включенный в AAV9-векторы согласно настоящему изобретению, имеет последовательность SEQ ID NO: 4. В частности, доказано, что этот промотор CAG является более эффективным, чем промотор CMV, обычно используемый в данной области.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантный AAV9-вектор выбран из AAV9-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 9), AAV9-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 10) и AAV9-CAG-cohNaglu-версия2 (SEQ ID NO: 21) и AAV9-CAG-cohNaglu-версия3 (SEQ ID NO: 24). Предпочтительно рекомбинантный AAV9-вектор выбран из AAV9-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 9), AAV9-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 10). В частности, рекомбинантные AAV9-векторы согласно настоящему изобретению состоят из вирусного капсида серотипа 9 человеческого аденоассоциированного вируса и модифицированного генома, содержащего инвертированные концевые повторы (ITR) человеческого аденоассоциированного вируса серотипа 2, промотор CAG, кодирующую последовательность (CDS) гена человеческой альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (Naglu) и полиА из гена кроличьего бета-глобина.

Настоящее изобретение также относится к плазмидам, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1. В частности, плазмиды в соответствии с настоящим изобретением содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности SEQ ID NO: 2. Предпочтительно плазмиды в соответствии с настоящим изобретением содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 84% идентичную последовательности SEQ ID NO: 2. В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 84%, 87%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 2.

В предпочтительном варианте осуществления плазмиды в соответствии с настоящим изобретением содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 85% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 85%, 87%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 3.

Эти плазмиды являются полезными для получения рекомбинантных AAV9-векторов согласно настоящему изобретению путем трансфекции клеток HEK293 с использованием известных из уровня техники способов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, содержащаяся в плазмидах согласно изобретению и кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, представляет собой SEQ ID NO: 2.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, содержащаяся в плазмидах согласно изобретению и кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, представляет собой SEQ ID NO: 3.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, содержащаяся в плазмидах согласно изобретению и кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, представляет собой SEQ ID NO: 19.

В более предпочтительном варианте осуществления плазмиды согласно изобретению выбраны из pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 5), pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6), pAAV-CAG-cohNaglu-версия 2 (SEQ ID NO: 20) и pAAV-CAG-cohNaglu-версия 3 (SEQ ID NO: 23), и в частности выбраны из pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 5) и pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6), и предпочтительно плазмида представляет собой pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6).

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ получения рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов AAV9 в соответствии с изобретением. Способ включает стадии:

i) предоставления первого вектора, содержащего последовательность, кодирующую представляющий интерес белок, вставленную между первым концевым повтором AAV и вторым концевым повтором AAV, промотора CAG, функционально связанного с последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок; второго вектора, содержащего ген AAV rep и ген AAV cap серотипа 9; и третьего вектора, содержащего ген с хелперной аденовирусной функцией;

ii) совместного трансфицирования компетентных клеток векторами стадии i);

iii) культивирования трансфицированных клеток стадии ii); и

iv) очистки экспрессионньгх векторов из культуры стадии iii).

В предпочтительном варианте осуществления первый и второй концевые повторы AAV первого вектора представляют собой инвертированные концевые повторы (ITR) от AAV серотипа 2. В другом предпочтительном варианте осуществления гены AAV rep второго вектора взяты от AAV серотипа 2. В другом предпочтительном варианте осуществления компетентные клетки представляют собой клетки HEK293.

В изобретении также предлагается способ получения плазмид в соответствии с изобретением, включающий стадии:

i) вырезания последовательности, кодирующей представляющей интерес белок, из исходной плазмиды путем расщепления, в частности, с использованием MIuI/EcoRI,

ii) клонирования последовательности, кодирующей представляющий интерес белок, между двумя сайтами рестрикции основной плазмиды AAV pAAV-CAG, с получением тем самым соответствующей плазмиды, включающей последовательность, кодирующую представляющий интерес белок.

В настоящем изобретении в дополнительном аспекте рассматриваются фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективное количество описанных здесь AAV9-векторов или терапевтически эффективное количество описанных здесь плазмид.

Фармацевтические композиции согласно изобретению содержат рекомбинантные AAV9-векторы в фармацевтически приемлемом носителе. Композиция может также содержать по меньшей мере одно вспомогательное вещество. Вспомогательные вещества могут быть выбраны из носителей, эксципиентов, растворителей, разбавителей или адъювантов. Приемлемые носители, разбавитель или адьюванты являются нетоксичными и предпочтительно инертными в используемых дозах и концентрациях, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат или другие органические кислоты; антиоксиданты; низкомолекулярные полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры; аминокислоты; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как блоксополимер полиэтилена-полиоксипропилена (Pluronic F68®), полиэтиленгликоль (PEG).

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтические композиции в соответствии с изобретением являются подходящими для парентерального введения. Примерами парентерального введения являются внутривенные, подкожные, интрацистернальные и внутримышечные инъекции. Предпочтительно фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением является подходящей для внутривенного или интрацистернального введения. Композиции, подходящие для такого парентерального введения, включают стерильные водные растворы или дисперсии, стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий. Предпочтительно фармацевтические композиции в соответствии с изобретением защищены от заражающего действия бактерий и грибов.

Суточная доза для человека и животных может варьировать в зависимости от факторов, которые основаны на соответствующих видах, или других факторов, таких как возраст, пол, масса или стадии заболевания и т.д.

Другой аспект настоящего изобретения относится к терапевтическому применению описанных здесь ранее AAV9-векторов или плазмид. Как указано выше, рекомбинантные AAV9-векторы в соответствии с изобретением обеспечивают экспрессию недостающего фермента Naglu, корректируя тем самым лизосомное накопление GAG. Это дает возможность скорректировать все клинические признаки мукополисахаридозов типа III (MPSIII) и, в частности, MPSIIIB. В связи с этим, настоящее изобретение также относится к применению рекомбинантных AAV9-векторов, описанных здесь выше, или плазмид, описанных здесь выше, в качестве лекарственного средства.

В частности, изобретение относится к применению рекомбинантных AAV9-векторов, описанных здесь выше, или плазмид, описанных здесь выше, для повышения активности альфа-N-глюкозаминидазы в организме.

В следующем предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к применению рекомбинантных AAV9-векторов, описанных здесь выше, или плазмид, описанных здесь выше, для лечения мукополисахаридозов типа III (MPSIII) и, в частности, MPSIIIB.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению рекомбинантных AAV9-векторов, описанных здесь выше, или плазмид, описанных здесь выше, для изготовления лекарственного средства, полезного для лечения мукополисахаридозов типа III (MPSIII) и, в частности, MPSIIIB.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения мукополисахаридозов типа III (MPSIII) и, в частности, MPSIIIB, включающему стадию введения по меньшей мере одного рекомбинантного вектора AAV9, описанного здесь выше, или по меньшей мере одной плазмиды, описанной здесь выше, субъекту, нуждающемуся в этом.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает выделенную клетку, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1. В частности, клетка в соответствии с изобретением содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID NO: 2. Предпочтительно нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 84% идентична SEQ ID NO: 2. В частности, нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 84%, 87%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 2. В следующем конкретном аспекте нуклеотидная последовательность, кодирующая альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 85% идентична SEQ ID NO: 3, и предпочтительно на 85%, 87%, 90%, 95%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 3.

В предпочтительном варианте осуществления клетки согласно изобретению содержат нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1.

В другом предпочтительном варианте осуществления клетки согласно изобретению содержат нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1.

В другом предпочтительном варианте осуществления клетки согласно изобретению содержат нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 19, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1.

В другом предпочтительном варианте осуществления клетки согласно изобретению содержат нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 22, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, SEQ ID NO: 1.

Следующие примеры представлены только с целью иллюстрации определенных вариантов осуществления и их не следует рассматривать как ограничивающие каким-либо образом настоящее изобретение.

Общие процедуры

1. Рекомбинантные AAV-векторы

Описанные здесь AAV-векторы получали посредством тройной трансфекции. Материалы, необходимые для конструирования векторов, включали: клетки HEK293 (экспрессирующие гены Е1), хелперную плазмиду с функцией аденовируса, плазмиду, содержащую гены AAV rep от серотипа 2 и гены cap от серотипа 9 (AAV9), и, наконец, основную плазмиду с ITR AAV2 и представляющий интерес конструкт.

Для создания AAV-векторов, экспрессирующих альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, неоптимизированную или оптимизированную кодирующую последовательность (CDS) человеческой, мышиной или собачьей альфа-N-ацетилглюкозаминидазы клонировали в основную плазмиду AAV под контролем универсального гибридного промотора CAG.

Векторы получали путем трансфекции без использования хелперного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. Смотри Matsushita Т, et al., Gene Ther. 1998; 5:938-945 и Wright J, et al., Mol. Ther. 2005; 12:171-178. Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в среде DMEM, дополненной 10% FBS, и затем котранфицировали: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную вирусными ITR AAV серотипа 2 (описанными выше); 2) плазмидой, несущей гены AAV rep2 и сар9; и 3) плазмидой, несущей хелперные функции аденовируса. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием оптимизированного протокола, как описано ранее. Смотри Ayuso Е, et al., Gene Ther. 2010; 17:503-510. Векторы диализировали против PBS, фильтровали, титровали с помощью qPCR (количественной полимеразной цепной реакции) и хранили при -80°С до использования.

Векторы согласно настоящему изобретению конструировали в соответствии с методами молекулярной биологии, хорошо известными в данной области.

2. Животные

Модель конгенных мутантных, дефицитных по альфа-N-ацетилглюкозаминидазе мышей C57B1/6J (MPSIIIB) получали из лаборатории Джексона (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA. Stock 003827). Смотри Li et al., Proc Natl Acad Sci. 1999; 96(25): 14505-10. Мышей с повреждением MPSIIIB и контрольных здоровых мышей получали близкородственным скрещиванием потомков гетерозиготных основателей рода. Генотип определяли с помощью анализа PCR на геномной ДНК из образцов, полученных при надрезе хвостов, с амплификацией последовательности, включающей направленную мутацию. Последовательности соответствующих смысловых и антисмысловых праймеров представляли собой: прямой праймер:

(SEQ ID NO: 13), обратный праймер:

(SEQ ID NO: 14), мутация обратного праймера:

(SEQ ID NO: 15). Мышей кормили без ограничения стандартным кормом (Harlan, Tekland)) и содержали в условиях 12-часового светового цикла освещение-темнота (освещение с 9:00 утра).

3. Гидродинамическая доставка hNAGLU-кодирующих плазмид мышам

Для гидродинамической доставки плазмид pAAV-CAG-hNaglu, pAAV-CAG-cohNaglu-версия 2 и pAAV-CAG-cohNaglu-версия 3 2-х месячные животные с MPSIIIB и дикого типа получали через хвостовую вену инъекцию в течение <5 секунд суммарной дозы 50 мкг плазмиды в объеме, равном 10% от веса животного. Этот метод привел к экспрессии кодируемых плазмидами трангенов, главным образом, в печени. Смотри Liu et al., Gene Ther. 1990; 6(7):1258-66. В качестве контроля когорта мышей получала и равный объем солевого раствора. Мышей умерщвляли через 1 неделю после гидродинамической инъекции плазмид. Органы извлекали, как описано в следующем разделе.

4. Введение векторов и сбор образцов

Для интрацистернальной доставки векторов AAV9-CAG-comNaglu мышам суммарную дозу 3×10¹⁰ vg инъецировали в мостомозжечковую цистерну 2-хмесячным животным с MPSIIIB. Аналогичной когорте животных инъецировали 3,9×10¹⁰ vg контрольного некодирующего (AAV9-Null) вектора. В возрасте 5 месяцев, то есть через 3 месяца после введения вектора мышей анестезировали и затем транскардиально перфузировали 10 мл PBS для полного очищения крови от тканей. Весь головной мозг и множественные соматические ткани (включая печень, селезенку, поджелудочную железу, почки, легкие, сердце, скелетные мышцы и семенники) собирали и либо замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С, либо погружали в формалин для последующих гистологических анализов.

Для внутривенной доставки векторов AAV9-CAG-hNaglu и AAV9-CAG-cohNaglu 2-месячные животные с MPSIIIB получали суммарную дозу 5×10¹¹ vg путем инъекции в хвостовую вену. В возрасте 4 месяцев, то есть через 2 месяца после введения векторов, мышей умерщвляли и органы извлекали, как описано в предыдущем параграфе.

Для интрацистернальной доставки векторов AAV9-CAG-hNaglu и AAV9-CAG-cohNaglu суммарную дозу 9,3×10⁹ vg инъецировали в мостомозжечковую цистерну 2-х месячных животных с MPSIIIB. В возрасте 4 месяцев, то есть через 2 месяца после введения векторов, мышей умерщвляли и органы извлекали, как описано в предыдущем параграфе.

Для интрацистернальной доставки векторов AAV9-CAG-cocNaglu собакам суммарную дозу 6,5×10¹² vg вводили здоровым взрослым собакам породы бигль путем инъекции в мостомозжечковую цистерну. Двое животных получали внутривенную инъекцию 1×10¹¹ vg/кг AAV9-Null-векторов за 6 недель до введения векторов Naglu для предварительной иммунизации их против AAV9. Образцы CSF и сыворотки собирали в первую неделю и затем ежемесячно, и хранили при -80°С.

5. Количественное определение числа копий вектора в геноме

Ткани (≈100 мг) разлагали в течение ночи (ON) при 56°С в 400 мкл раствора протеиназы К (0,2 мг/мл). Тотальную ДНК выделяли из супернатантов путем экстракции с использованием стандартных методов. ДНК повторно суспендировали в дистиллированной воде и количественно определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, DE, USA). Число копий вектора в геноме в 20 нг тотальной ДНК определяли с помощью количественной PCR в режиме реального времени с использованием праймеров и зонда, специфических для мышиного трансгена альфа-N-ацетилглюкозаминидазы, которые не амплифицируют эндогенный локус генома. Прямой праймер:

(SEQ ID NO: 16); обратный праймер:

(SEQ ID NO: 17); зонд:

(SEQ ID NO: 18). Конечные величины определяли путем сравнения с референсной стандартной кривой, для построения которой использовали серию последовательных разведений линеаризованной плазмиды, используемой для получения AAV-вектора, введенной в 20 нг нетрансдуцированной геномной ДНК.

6. Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы и количественное определение гликозаминогликана

Образцы печени и головного мозга обрабатывали ультразвуком в воде Mili-Q. Сыворотку анализировали необработанной. Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы определяли с помощью флуорогенного субстрата, производного 4-метилумбеллиферона (Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL), как описано ранее. Смотри Marsh and Fensom, Clin Genet. 1985; 27(3):258-262. Уровни активности в головном мозге и печени нормализовали по суммарному белку, измеренному с помощью анализа белка по Брэдфорду (Bio-Rad, Hercules, СА, US). Активность в сыворотке нормализовали по объему.

Для количественного определения гликозаминогликана (GAG) образцы тканей взвешивали и затем разлагали протеиназой К, и экстракты осветляли центрифугированием и фильтрованием. Уровни GAG в экстрактах тканей определяли с помощью набора для сульфированных гликозминогликанов Blyscan (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB) с использованием в качестве стандарта хондроитин-4-сульфата. Уровни GAG нормализовали по сырой массе ткани.

7. Активность других лизосомальных ферментов

Активность альфа-L-идуронидазы (IDUA) измеряли в 15 мкг белка, инкубированного в течение 1 ч при 37°С с 4-метилумбеллиферил-α-N-идуронидом (Glycosynth). Для измерения активности идуронат-2-сульфатаз (IDS) 15 мкг белка сначала инкубировали с 4-метилумбеллиферил-α-L-идуронид-2-сульфатом (Moscerdam Substrates) в течение 4 ч при 37°С, а затем в течение 24 ч при 37°С с пулом лизосомальных ферментов из семенника быка (LEBT-M2, Moscerdam Substrates). Активность гепаран-N-сульфатазы (SGSH) измеряли, как описано ранее. Смотри Haurigot et al., J Clin Invest 2013; 123(8):3254-71. Для измерения активности бета-D-глюкуронидазы (GUSB) 10 мкг белка инкубировали с 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронидом (Sigma) при 37°С в течение 1 ч. Активность гексозаминидазы В (НЕХВ) определяли путем инкубации 0,1 мкг белка с 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкоаминидом (Sigma) в течение 1 ч при 37°С. После остановки реакций путем повышения рН измеряли испускаемую флуоресценцию с помощью флуориметра FLx800 (BioTek Instruments). Все активности ферментов нормализовали по суммарному белку, измеренному с помощью анализа белка по Брэдфорду (Bio-Rad).

8. Гистологические анализы

Ткани фиксировали в течение 12-24 ч в формалине, заключали в парафин и получали срезы. Для иммуногистохимического определения LAMP1 в соматических тканях парафиновые срезы подвергали демаскировке эпитопов нагреванием в цитратном буфере при рН 6 и затем инкубировали в течение ночи при 4°С с антителом крысы против LAMP1 (1D4B; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, US), разбавленным 1:100, и затем инкубировали с биотинилированным кроличьим анти-крысиным антителом (Dako, Glostrup, DK), разведенном 1:300. Для иммунологического обнаружения LIMP2 в головном мозге парафиновые срезы инкубировали в течение ночи при 4°С с антителом кролика против LIMP2 (NB400; Novus Biologicals, Littleton, СО, USA), разбавленным 1:100, и затем инкубировали с биотинилированным козьим анти-кроличьим антителом (31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), разведенным 1:300. Для иммунологического окрашивания GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) в образцах головного мозга парафиновые срезы инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьим анти-GFAP антителом (Ab6673; Abeam, Cambridge, UK), разбавленным 1:1000, и затем инкубировали с биотинилированным козьим анти-кроличьим антителом (31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), разбавленным 1:300. Сигналы LAMP1, LIMP2 и GFAP усиливали путем инкубации срезов с набором для окрашивания АВС-пероксидаза (Thermo Scientific, Waltham, MA, US), разведенным 1:100, и визуализировали с использованием 3,3-диаминобензидина (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, US) в качестве хромогена. Изображения в светлом поле получали на оптическом микроскопе (Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP).

Для окрашивания микроглиальных клеток в образцах головного мозга парафиновые срезы инкубировали в течение ночи при 4°С с лектином Bsi-B4 (L5391; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), разбавленным 1:100. Сигнал Bsi-B4 визуализировали с использованием 3,3-диаминобензидина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US) в качестве хромогена. Изображения в светлом поле получали на оптическом микроскопе (Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP).

Программное обеспечение NIS Elements Advanced Research 2.20 использовали для количественного определения сигналов LIMP2, GFAP и Bsi-B4 на 3-5 изображениях каждого отдела головного мозга (исходное увеличение, х20) на животное с использованием одинаковых настроек порога различимости сигнала для всех животных. Затем рассчитывали процентное содержание положительной области, то есть области в пикселях с положительным сигналом по всей площади ткани на изображении.

9. Анализ трансмиссионной электронной микроскопией

Мышей умерщвляли сверхдозой изофлуорана (Isofluo, Labs. Esteve, Barcelona, ES) и перфузировали через нижнюю полую вену 1 мл 2,5% глутаральдегида и 2% параформальдегида. Из небольшой части (приблизительно 1 мм³) боковой доли печени и вершины червя мозжечка готовили срезы и инкубировали в течение 2 часов при 4°С в том же фиксаторе. После промывки в холодном какодилатном буфере образцы дополнительно фиксировали в 1% тетроксиде осмия, окрашивали в водном уранилацетате, затем дегидратировали проводкой через последовательные разведения этанола и заключали в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы (600-800

) блоков со смолой окрашивали цитратом свинца и анализировали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (Н-7000; Hitachi, Tokyo, JP).

10. Транскриптомный анализ

Половину мышиного головного мозга (~250 мг) механически гомогенизировали и тотальную РНК выделяли с помощью набора реагентов mirVana™ (Ambion, Life Technologies). Синтезировали кДНК и затем гибридизовали на чипах GeneChip Mouse Gene 2.1 ST 16 array plate (Affymetrix) фирмы Progenika Biopharma (Испания); обработку, гибридазацию и сканирование образцов проводили, следуя рекомендуемым протоколам и оборудованию Affymetrix. Нормализацию данных выполняли методом RMA (Robust Multiarray averaging) с использованием инструмента Affymetrix® Expression Console™ с получением log2 трансформированных нормализованных величин. Данные фильтровали для нацеливания анализа на известные кодирующие последовательности с получением исходного списка из 26688 измененных генов, которые затем повторно фильтровали для удаления генов с отклонением ниже 75-го процентиля. В результате этого процесса был получен рабочий список из 6672 генов. Для дифференциально экспрессирующихся генов был установлен критерий FDR (степень ложных оценок, False Discovery Rate) <0,1 с достоверностью 80%. Для кластерного анализа данные стандартизировали и представляли в виде тепловой карты с использованием программного обеспечения J-Express Pro (jexpress.bioinfo.no). Функциональный анализ выполняли с использованием инструмента Genecodis Tool 2.0 (genecodis2.dacya.ucm.es). Массив данных направляли в базу данных ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/; accession code: E-MTAB-2984).

11. Поведенческая оценка

Изменения поведения оценивали с помощью теста открытого поля (Open-field). Животных помещали в нижний левый угол ярко освещенной камеры (41×41×30 см). Поверхность арены разделяли на три концентрические площади: центральную (14×14 см), периферическую (27×27 см) и пограничную (41×41 см). Исследовательское поведение и общую активность регистрировали в течение первых двух минут с использованием системы видеонаблюдения (Smart Junior, Panlab). Тест всегда выполняли в одно и то же время (с 9:00 до 1:00 ч) для сведения к минимуму влияния сердечных циклов.

12. Статистический анализ

Все результаты представляли в виде среднего значения ± SEM. Статистические сравнения проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA, и множественные сравнения между контрольной и лечебными группами выполняли с использованием апостериорного критерия Даннетта. Статистически значимым считали различие при Р<0,05. Метод Каплана-Мейера использовали для анализа выживаемости и логарифмический ранговый критерий для сравнений.

Примеры

Пример 1: Конструирование pAAV-CAG-hNaglu

Кодирующую последовательность (CDS) человеческой альфа-N-ацетилглюкозаминидазы использовали в качестве исходного материала (NCBI Reference Sequence: NM_000263) и химически синтезировали для этой цели (GeneArt; Life Technologies). CDS получали, то есть клонировали в плазмиду рМА (AmpR), фланкированную сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3' концах, соответственно. Последовательность, кодирующую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу, вырезали путем расщепления с помощью MluI/EcoRI и затем клонировали между сайтами рестрикции MluI и EcoRI основной плазмиды pAAV-CAG (AmpR) AAV. Полученная плазмида была названа pAAV-CAG-hNaglu (номер доступа DSM 28568). Смотри SEQ ID NO: 5 и фигуру 19 А.

Плазмида pAAV-CAG была создана ранее и содержала обе ITR из генома AAV2, промотор CAG и сигнал polyA β-глобина кролика, а также сайт мультиклонирования для клонирования представляющих интерес CDS. Промотор CAG представляет собой гибридный промотор, состоящий из раннего/промежуточного энхансера CMV и промотора β-актина цыпленка. Этот промотор способен стимулировать высокую экспрессию повсеместно. Смотри Sawicki J et al., Exper Cell Res. 1998; 244:367-369, Huang J et al., J Gene Med. 2003; 5:900-908, Liu Y et al., Exp Mol Med. 2007; 39(2): 170-175.

Пример 2. Конструирование AAV9-CAG-hNaglu

Векторы AAV9-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 9 и фигура 19 В)) получали путем трансфекции без использования хелперного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. Смотри Matsushita, 1998, supra и Wright, 2005, supra. Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в среде DMEM, дополненной 10% FBS, и затем совместно трансфицировали: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-hNaglu); 2) плазмидой, несущей гены AAV2 rep и AAV9 cap (pREP2CAP9); и 3) плазмидой, обеспечивающей хелперные функции аденовируса. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием либо стандартного протокола, либо оптимизированного протокола, как описано ранее. Смотри Ayuso, 2010, supra. Векторы диализировали против PBS, фильтровали, титровали с помощью qPCR и хранили при -80°С до использования.

Пример 3: Конструирование pAAV-CAG-cohNaglu

Разрабатывали и получали экспрессионные кассеты, включая оптимизированную версию CDS альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (cohNaglu). Оптимизацию последовательности (GeneArt®) выполняли для максимального повышения эффективности продукции белка альфа-N-ацетилглюкозаминидазы у человека посредством удаления скрытых сайтов сплайсинга и дестабилизирующих РНК элементов последовательности для повышения стабильности РНК, добавления стабилизирующих РНК элементов последовательности, оптимизации кодонов и адаптации содержания G/C, исключения стабильных вторичных структур РНК, помимо прочих изменений. Оптимизированную CDS получали, то есть клонировали в плазмиду pMA-RQ (AmpR), фланкированную сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3' концах, соответственно.

Плазмиду pMA-RQ-cohNaglu расщепляли с помощью MluI и EcoRI для вырезания оптимизированной CDS альфа-N-ацетилглюкозаминидазы. Затем этот фрагмент клонировали между этими же сайтами рестрикции основной плазмиды pAAV-CAG для получения плазмиды pAAV-CAG-cohNaglu (номер доступа DSM 26626). Смотри SEQ ID NO: 6 и фигуру 20А.

Пример 4: Конструирование AAV9-CAG-cohNaglu

Векторы AAV9-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 10 и фигура 20 В) получали путем трансфекции без использования хелперного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. Смотри Matsushita, 1998, supra и Wright, 2005, supra. Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в среде DMEM, дополненной 10% FBS и затем совместно трансфицировали: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-cohNaglu); 2) плазмиду, несущую гены AAV2 rep и AAV9 cap (pREP2CAP9); и 3) плазмиду, несущую хелперные функции аденовируса. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием либо стандартного протокола, либо оптимизированного протокола, как описано ранее. Смотри Ayuso, 2010, supra. Векторы легализировали против PBS, фильтровали, титровали qPCR и хранили при -80°С до использования.

Пример 5. Конструирование pAAV-CAG-cohNaglu-версия 2

Разрабатывали и получали экспрессионные кассеты, включая вторую оптимизированную версию CDS альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (cohNaglu-версия 2). Оптимизированную CDS (DNA 2.0®) получали, то есть клонировали в плазмиду pJ208 (AmpR), фланкированную сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3' концах, соответственно.

Плазмиду pJ208-cohNaglu-версия 2 расщепляли с помощью MluI и EcoRI для вырезания оптимизированной CDS версии 2 альфа-N-ацетилглюкозаминидазы. Затем этот фрагмент клонировали между этими же сайтами рестрикции основной плазмиды pAAV-CAG для получения плазмиды pAAV-CAG-cohNaglu-версия 2 (номер доступа DSM 32042). Смотри SEQ ID NO: 20 и фигуру 21А.

Пример 6: Конструирование AAV9-CAG-cohNaglu-version2

Векторы AAV9-CAG-cohNaglu-версия2 (SEQ ID NO: 21 и фигура 21В) получали путем трансфекции без использования хелперного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. Смотри Matsushita, 1998, supra и Wright, 2005, supra. Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в среде DMEM, дополненной 10% FBS и затем совместно трансфицировали: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-cohNaglu-версия 2); 2) плазмиду, несущую гены AAV2 rep и AAV9 cap (pREP2CAP9); и 3) плазмиду, несущую хелперные функции аденовируса. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием либо стандартного протокола, либо оптимизированного протокола, как описано ранее. Смотри Ayuso, 2010, supra. Векторы диализировали против PBS, фильтровали, титровали qPCR и хранили при -80°С до использования.

Пример 7: Конструирование pAAV-CAG-cohNaglu-version3

Разрабатывали и получали экспрессионные кассеты, включая третью оптимизированную версию CDS альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (cohNaglu-версия 2). Оптимизированную CDS (GenScript, Inc) получали, то есть клонировали в плазмиду pUC57 (AmpR), фланкированную сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3' концах, соответственно.

Плазмиду pUC57-cohNaglu-версия 3 расщепляли с помощью MluI и EcoRI для вырезания оптимизированной CDS версии 3 альфа-N-ацетилглюкозаминидазы. Затем этот фрагмент клонировали между этими же сайтами рестрикции основной плазмиды pAAV-CAG для получения плазмиды pAAV-CAG-cohNaglu-версия 3 (номер доступа DSM 32043). Смотри SEQ ID N0:23 и фигуру 22А.

Пример 8: Получение AAV9-CAG-cohNaglu-версия3

Векторы AAV9-CAG-cohNaglu-версия3 (SEQ ID NO: 24 и фигура 22В) получали путем трансфекции без использования хелперного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. Смотри Matsushita, 1998, supra и Wright, 2005, supra. Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в среде DMEM, дополненной 10% FBS и затем совместно трансфицировали: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-cohNaglu-версия 3); 2) плазмиду, несущую гены AAV2 rep и AAV9 cap (pREP2CAP9); и 3) плазмиду, несущую хелперные функции аденовируса. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием либо стандартного протокола, либо оптимизированного протокола, как описано ранее. Смотри Ayuso, 2010, supra. Векторы диализировали против PBS, фильтровали, титровали qPCR и хранили при -80°С до использования.

Пример 9. Конструирование pAAV-CAG-comNaglu

CDS для мышиной альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (референсная последовательность NCBI: NM_013792) подвергали оптимизации последовательности (GeneArt; Life Technologies). Оптимизированную CDS получали, то есть клонировали в плазмиду pMA-RQ (AmpR), фланкированную сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3' концах, соответственно.

Фрагмент CDS оптимизированной по MluI/EcoRI мышиной альфа-N-ацетилглюкозаминидазы вырезали из плазмиды pMA-RQ и затем клонировали между сайтами рестрикции MluI и EcoRI основной плазмиды pAAV-CAG AAV. Полученная плазмида была названа pAAV-CAG-comNaglu. Смотри SEQ ID NO: 7 и фигуру 23А.

Пример 10. Получение AAV9-CAG-comNaglu

Векторы AAV9-CAG-comNaglu (SEQ ID NO: 11 и фигура 23 В) получали путем трансфекции без использования хелперного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. Смотри Matsushita, 1998, supra и Wright, 2005, supra. Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в среде DMEM, дополненной 10% FBS и затем совместно трансфицировали: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-comNaglu); 2) плазмиду, несущую гены AAV2 rep и AAV9 cap (pREP2CAP9); и 3) плазмиду, несущую хелперные функции аденовируса. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием либо стандартного протокола, либо оптимизированного протокола, как описано ранее. Смотри Ayuso, 2010, supra. Векторы диализировали против PBS, фильтровали, титровали qPCR и хранили при -80°С до использования.

Пример 11. Конструирование pAAV-CAG-cocNaglu

CDS для собачьей альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (референсная последовательность NCBI: ХМ_548088.4) подвергали оптимизации последовательности (GeneArt; Life Technologies). Оптимизированную CDS получали, то есть клонировали в плазмиду pMA-RQ (AmpR), фланкированную сайтами рестрикции MluI и EcoRI на 5' и 3' концах, соответственно.

Фрагмент CDS оптимизированной по MluI/EcoRI собачьей альфа-N-ацетилглюкозаминидазы вырезали из плазмиды pMA-RQ и затем клонировали между сайтами рестрикции MluI и EcoRI основной плазмиды pAAV-CAG AAV. Полученная плазмида была названа pAAV-CAG-cocNaglu. Смотри SEQ ID NO: 8 и фигуру 24А.

Пример 12: Получение AAV9-CAG-cocNaglu

Векторы AAV9-CAG-cocNaglu (SEQ ID NO: 12 и фигура 24В) получали путем трансфекции без использования хелперного вируса клеток HEK293 с использованием трех плазмид с модификациями. Смотри Matsushita, 1998, supra и Wright, 2005, supra. Клетки культивировали до 70% конфлюэнтности в роллерных флаконах (RB) (Corning, Corning, NY, US) в среде DMEM, дополненной 10% FBS и затем совместно трансфицировали: 1) плазмидой, несущей экспрессионную кассету, фланкированную ITR AAV2 (pAAV-CAG-cocNaglu); 2) плазмиду, несущую гены AAV2 rep и AAV9 cap (pREP2CAP9); и 3) плазмиду, несущую хелперные функции аденовируса. Векторы очищали посредством двух последовательных градиентов хлорида цезия с использованием либо стандартного протокола, либо оптимизированного протокола, как описано ранее. Смотри Ayuso, 2010, supra. Векторы диализировали против PBS, фильтровали, титровали qPCR и хранили при -80°С до использования.

Пример 13: Гидродинамическая доставка плазмиды pAAV9-CAG-hNaglu

Плазмиду pAAV-CAG-hNaglu, содержащую кассету, экспрессирующую человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу дикого типа, в суммарной дозе 50 мкг вводили 2-х месячным мышам с MPSIIIB путем гидродинамической инъекции в хвостовую вену (HDTV). Этот метод направляет экспрессию доставленной плазмиды в печень. Смотри Liu et al., Gene Ther. 1990; 6(7): 1258-66.

Через неделю после доставки плазмиды фиксировалось значительное повышение активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в печени и сыворотке всех животных, которым вводили плазмиды, кодирующие человеческую альфа-N-ацетилглюкозаминидазу дикого типа по сравнению с уровнями до лечения. Смотри фигуры 1А и 1В. Активности не было обнаружено у животных с MPSIIIB, которым инъецировали солевой раствор. Уровни активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы, наблюдаемые в печени и сыворотке подвергнутых лечению животных соответствовали 150% и 1700%, соответственно, от среднего значения активности, измеренной в печени и сыворотке животных дикого типа (WT), которая была принята за 100%. Смотри фигуры 1А и 1В.

Пример 14: Внутривенная доставка AAV9-CAG-hNaglu

2-х месячным мышам с MPSIIIB через хвостовую вену инъецировали векторы AAV9-CAG-hNaglu в суммарной дозе 5-1011 геномов вектора.

В соответствии с высоким тропизмом векторов AAV9 к печени, через два месяца после введения подвергнутые лечению животные показали высокие уровни активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в этом органе (700% от уровней активности, наблюдаемых у здоровых животных), что полностью устранило или значительно снизило патологическое накопление GAG, наблюдаемое в соматических тканях не получавших лечение мышей с MPSIIIB. Смотри фигуру 2А-С. Кроме того, благодаря высокой эффективности, с которой векторы AAV серотипа 9 трансдуцируют головной мозг после системного введения, подвергнутые лечению животные показали значительные уровни активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (20-30% от уровней, наблюдаемых у здоровых мышей) во всех анализируемых участках головного мозга. Смотри фигуру 3А. Это частичное восстановление активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы было достаточным для очистки накоплений GAG из всех областей головного мозга. Смотри фигуру 3В.

Пример 15: Внутривенная доставка AAV9-CAG-cohNaglu

2-х месячным мышам с MPSIIIB через хвостовую вену инъецировали векторы AAV9-CAG-cohNaglu в суммарной дозе 5-10¹¹ геномов вектора.

Через два месяца после введения подвергнутые лечению животные показали высокие уровни активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в печени (600% от уровней активности, наблюдаемых у здоровых животных), и умеренное увеличение (7% от уровней, наблюдаемых у здоровых животных) активности в сыворотке. Смотри фигуру 4А и 4В. Продуцирование альфа-N-ацетилглюкозаминидазы полностью устранило или значительно снизило патологическое накопление GAG, наблюдаемое в соматических тканях не получавших лечение мышей с MPSIIIB. Смотри фигуру 4С. Кроме того, получавшие лечение животные показали значительные уровни активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы (18-27% от активности, наблюдаемой у здоровых мышей) во всех анализируемых областях головного мозга. Смотри фигуру 5А. Это частичное восстановление активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы было достаточным для очистки накопления GAG из всех областей головного мозга. Смотри фигуру 5В.

Пример 16. Интрацистернальная доставка AAV9-CAG-hNaglu

2-месячным животным с MPSIIIB в мостомозжечковую цистерну инъецировали вектор AAV9-CAG-hNaglu в суммарной дозе 9,3×10⁹ геномов вектора в суммарном объеме 5 мкл.

Интра-CSF введение векторов AAV9-CAG-hNaglu привело к высоким уровням активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы во всех анализируемых областях головного мозга (50-100% от активности, наблюдаемой у здоровых мышей); в наиболее передних частях головного мозга активность достигала уровней, наблюдаемых у здоровых животных. Смотри фигуру 6А. Избыточное накопление GAG было полностью устранено в головном мозге получавших лечение мышей с MPSIIIB. Смотри фигуру 6 В. При доставке в CSF AAV-векторы серотипа 9 поступают в кровоток и трансдуцируют печень. Смотри Haurigot et al., J Clin Invest 2013; 123(8):3254-71. В соответствии с этим результатом активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы была обнаружена в печени получавших лечение мышей с MPSIIIB на уровне 32% от уровня, наблюдаемого у здоровых животных. Смотри фигуру 7А. Это увеличение активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы содействовало коррекции накопления GAG в печени, селезенке, сердце, легких, семеннике и мочевом пузыре, а также значительно снизило накопление GAG в почках. Смотри фигуру 7В.

Пример 17. Интрацистернальная доставка AAV9-CAG-cohNaglu

2-месячным животным с MPSIIIB инъецировали в мостомозжечковую цистерну векторы AAV9-CAG-cohNaglu в суммарной дозе 9,3×10⁹ геномов вектора в суммарном объеме 5 мкл.

Интрацистернальное введение векторов AAV9-CAG-cohNaglu привело к значительному увеличению уровней активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы во всех анализируемых областях головного мозга, которые варьировали от 22 до 45% от уровней активности у здоровых мышей. Смотри фигуру 8А. Таким образом, патологическое накопление GAG было полностью устранено во всех областях головного мозга получавших лечение мышей с MPSIIIB. Смотри фигуру 8В. Активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы также повысилась в печени получавших лечение мышей с MPSIIIB до 25% от активности, наблюдаемой у здоровых животных. Смотри фигуру 9А. Это повышение активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы содействовало коррекции накопления GAG в печени, сердце, легких и мочевом пузыре, а также значительно снизило накопление GAG в селезенке, семеннике и почках. Смотри фигуру 9В.

Пример 18. Гидродинамическая доставка плазмиды pAAV9-CAG-cohNaglu-версия 2

Суммарную дозу 50 мкг плазмиды pAAV9-CAG-cohNaglu-версия2, несущей экспрессионную кассету, содержащую оптимизированную версию (версию 2) человеческой альфа-N-ацетилглюкозаминидазы, вводили 2-х месячным мышам с MPSIIIB путем гидродинамической инъекции через хвостовую вену. Как указано выше, этот метод направляет экспрессию доставленной плазмиды в печень. Смотри Liu et al., supra.

Через неделю после доставки плазмиды активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы повысилась по сравнению с уровнями до лечения в печени и сыворотке всех животных, которые получали гидродинамическую инъекцию плазмиды, содержащей оптимизированную версию 2 кодирующей альфа-N-ацетилглюкозаминидазу последовательности. Смотри фигуры 10А и 10В. Активности не было обнаружено у животных с MPSIIIB, инъецированных солевым раствором. У получавших лечение животных активность альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в печени и сыворотке достигала уровней, которые составили 150% и 1500%, соответственно, от средней величины активности, наблюдаемой у животных дикого типа (WT) (принята за 100%). Смотри фигуры 10А и 10В.

Пример 19: Гидродинамическая доставка плазмиды pAAV9-CAG-cohNaglu-версия 3

Суммарную дозу 50 мкг плазмиды pAAV9-CAG-cohNaglu-версия 3, содержащей кодон-оптимизированную версию (версию 3) экспрессирующей альфа-N-ацетилглюкозаминидазу человека кассеты, вводили 2-х месячным мышам с MPSIIIB путем гидродинамической инъекции через хвостовую вену. Как указано выше, этот метод направляет экспрессию доставленной плазмиды в печень. Смотри Liu et al., supra.

Через неделю после доставки плазмиды было зафиксировано значительное увеличение активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы по сравнению с уровнями до лечения в печени и сыворотке у всех животных, которым вводили плазмиду, несущую экспрессионную кассету, которая содержала версию 3 кодон-оптимизированной последовательности, кодирующей альфа-N-ацетилглюкозаминидазу. Смотри фигуры 11А и 11В. Активности не было обнаружено у животных с MPSIIIB, инъецированных солевым раствором. Уровни активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы, наблюдаемые в печени и сыворотке получавших лечение животных соответствовали 170% и 1100%, соответственно, от средней величины активности, определенной в печени и сыворотке животных дикого типа (WT), которая была принята за 100%. Смотри фигуры 11А и 11В.

Пример 20. Интрацистернальная доставка AAV9-CAG-comNaglu

2-х месячным животным с MPSIIIB инъецировали в мостомозжечковую цистерну вектор AAV9-CAG-comNaglu в суммарной дозе 3×10¹⁰ геномов вектора в суммарном объеме 10 мкл.

Геномы AAV9-векторов могут быть обнаружены во всех анализируемых областях головного мозга, а также в спинном мозге. В периферических тканях геномы векторов могут быть обнаружены при значительных количествах копий генов только в печени и при более низких количествах копий генов в лимфоузлах, которые дренируют голову (подчелюстные лимфатические узлы). Смотри фигуру 12А-В.

Интра-CSF введение векторов AAV9-CAG-comNaglu приводит к очень высоким уровням активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы во всех анализируемых областях головного мозга, достигая уровней, которые в несколько раз превышают уровни, наблюдаемые у здоровых животных во всех областях. Смотри фигуру 13А. Через три месяца после доставки векторов лизосомная патология, характерная для заболевания, была полностью купирована в головном мозге получавших лечение мышей с MPSIIIB, на что указывала нормализация накопления GAG и интенсивности сигнала для маркера лизосом LIMP-2+ во всех анализируемых областях головного мозга. Смотри фигуры 13В и 14А. Ультраструктурный анализ затылочной области коры и мозжечка с помощью трансмиссионной электронной микроскопии подтвердил уменьшение лизосомной патологии, которая была вполне очевидной в кортикальных перинейрональных глиальных клетках, имевших растянутый вид и заполненных крупными накопительными везикулами у получавших контрольный вектор животных с MPSIIIB, в то время как они имели нормальный вид у животных, получавших лечение AAV9-CAG-comNaglu. Смотри фигуру 14В. В LSD активность некоторых лизосомальных ферментов, за исключением тех, которые были непосредственно поражены врожденной мутацией, может быть изменена после нарушения нормального лизосомального гомеостаза. Смотри Sardiello et al., Science. 2009; 325:473-477. В головном мозге не получавших лечение или мышиных самцов с Null-лечением с MPSIIIB в возрасте 5 месяцев активности идуронат-2-сульфатазы (IDS), N-сульфоглюкозамин-сульфогидролазы (SGSH), β-глюкуронидазы (GUSB) и β-гексозаминидазы (НЕХВ) были значительно повышенными. Смотри фигуру 14С. В соответствии с уменьшением накопления GAG, наблюдаемым через 3 месяца после интра-CSF доставки векторов AAV9-CAG-comNaglu, активность SGSH, GUSB и НЕХВ в головном мозге подвергнутых лечению животных возвращалась к уровням, наблюдаемым у здоровых мышей дикого типа. Смотри фигуру 14С.

Одновременно с коррекцией лизосомальной патологии исчезали все признаки воспаления в головном мозге подвергнутых лечению мышей с MPSIIIB. Интенсивности сигналов на окрашивания, используемых для обнаружения астроцитоза (GFAP) и микроглиоза (BSI-B4), были сходными у подвергнутых лечению мышей с MPSIIIB и здоровых животных, в противоположность сигналу, зафиксированному у не получавших лечение мышей с MPSIIIB, которые показали выраженную повышенную экспрессию этих маркеров нейровоспаления. Смотри фигуры 15А и 15В. Для дополнительной оценки эффективности генной терапии, состоящей в интра-CSF введении AAV9-CAG-comNaglu, в отношении воспаления CNS, исследовали профиль генной экспрессии с использованием системы микрочипов Affimetrix® с использованием тотальной РНК, выделенной из головного мозга дикого типа (WT) и головного мозга с MPSIIIB, подвергнутого лечению AAV9-CAG-comNaglu или AAV9-Null. После обработки данных или фильтрации было обнаружено, что 94 гена дифференциально экспрессируются в трех группах. При использовании анализа категорий генной онтологии (Gene Ontology, GO) и представленности генов (enrichment analysis) для классификации дифференциально экспрессирующихся генов в биологическом процессе, 67 из 94 генов было аннотировано соответствующими онтологиями. Смотри фигуру 15С. Среди них большинство было связано с воспалением и врожденным иммунитетом или функциями, которые могут быть обусловлены клетками, вовлеченными в эти процессы. Смотри фигуру 15С. Для подтверждения этого наблюдения использовали анализ представленности типов клеток (Cell Type Enrichment, CTEN) для оценки вклада различных типов клеток в наблюдаемые изменения в уровнях транскриптов. Это программное обеспечение предполагает, что имеется представленность определенного клеточного типа, если определенный программным обеспечением балл составляет больше 2. Самый высокий балл для набора данных в данном изобретении был получен для микроглиальных клеток (балл = 60), результат, согласующийся с важной ролью, которую играет микроглия в нейродегенеративных заболеваниях и в MPSIII. Смотри Ohmi et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100:1902-1907, McGeer et al. Alzheimer Dis Assoc Disord. 1998; 12 (Suppl. 2):S1-E16, Derecki et al., Nature. 2012;484: 105-109, DiRosario et al., J Neurosci Res. 2009; 87:978-990, Archer, et al., J Inherit Metab Dis. 2014; 37:1-12. При оценке эффекта интра-CSF доставки AAV9-CAG-comNaglu наблюдалось радикальное изменение профиля генной экспрессии у AAV9-Null-инъецированных животных. Через три месяца после введения вектора большинство генов у получавших лечение мышей с MPSIIIB имели уровни транскриптов, которые были сходными с уровнями, наблюдаемыми у здоровых однопометных животных. Почти 90% генов, дифференциально экспрессирующихся у не получавших лечение мышей с MPSIIIB, показали коррекцию их уровней транскриптов по меньшей мере на 50% после лечения AAV9-CAG-comNaglu и у 60% из них коррекция составила 75%. Сходные или немного более высокие степени нормализации уровней транскриптов наблюдались при отдельном анализе набор генов, которые программное обеспечение CTEN приписало микроглии. Смотри фигуру 15D. Это наблюдение подтверждает идею о том, что микроглия в значительной степени отвечает за профиль генной экспрессии, наблюдаемой в MPSIIIB, и согласуется с полным изменением микроглиоза, зафиксированным у получавших лечение животных.

AAV9-векторы вводили для истечения цереброспинальной жидкости (ликвора) (CSF leak) к периферии и трансдукции печени. Смотри фигуру 9 и Haurigot et al., supra. Таким образом, увеличение активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы было зафиксировано в печени и сыворотке мышей с MPSIIIB, подвергнутых лечению AAV9-CAG-comNaglu, с достижением уровней, составляющих приблизительно 800% от уровней, наблюдаемых у здоровых животных. Смотри фигуры 16А и 16В. Уровни ферментативной активности в сыворотке хорошо согласовывались с уровнями активности в печени не получавших лечение мышей, на основании чего можно предположить, что печень была основным источником циркулирующего фермента. При оценке соматической эффективности терапии посредством количественного определения содержания GAG в различных органах, полная нормализация наблюдалась в большинстве тканей, включая печень, селезенку, сердце и легкие, за исключением почек, в которых наблюдалось >50% сокращение GAG. Смотри фигуру 16С. Ультраструктурный анализ печени в различных экспериментальных группах показал полное исчезновение накопительных вакуолей, характерных для болезни MPSIIIB, из гепатоцитов мышей с MPSIIIB, получавших лечение AAV9-CAG-comNaglu. Смотри фигуру 16D. Как наблюдается в CNS, очистка накопительного материала из лисосомального компартмента привела к восстановлению активности других лизосомальных ферментов. В печени не получавших лечение или получавших Null-терапию мышей с MPSIIIB изменялись активности α-идуронидазы (IDUA), идуронат-2-сульфатазы (IDS), SGSH, GUSB и НЕХВ. Смотри фигуру 16Е. Через три месяца после AAV9-опосредованного генного переноса NAGLU активность всех этих ферментов вернулась к нормальным уровням, что дополнительно подтверждает правильность концепции, в соответствии с которой генный перенос CSF NAGLU посредством AAV9-CAG-comNaglu может изменить фенотип заболевания также в периферических органах. Смотри фигуру 16Е.

Воздействие интра-CSF введения AAV9-CAG-comNaglu на поведение оценивали с помощью теста «открытое поле», который оценивает общую двигательную и исследовательскую активность мышей в неизвестной окружающей обстановке. Не получавшие лечение и получавшие AAV9-null-лечение мыши с MPSIIIB проявили пониженную исследовательскую активность по сравнению со здоровыми мышами в отношении латентности вхождения в центр, времени, проведенном на границе, количества вхождений в центр, времени, проведенном без движения, общего пройденного расстояния и количества пересеченных линий. Интрацистернальное введение AAV9-CAG-comNaglu полностью скорректировало поведенческие дефициты. Смотри фигуры 17A-F.

Кроме того, лечение с помощью AAV9-CAG-comNaglu значительно увеличило продолжительность жизни мышей с MPSIIIB. По достижении возраста 15 месяцев все не получавшие лечение мыши с MPSIIIB умирали, тогда как 100% животных, получавших интрацистернально AAV9-CAG-comNaglu, все еще оставались живыми в возрасте 18 месяцев. Смотри фигуры 17G. Получавшие лечение самцы с MPSIIIB показали медиану выживаемости, которая составила 21 месяц, в сравнении с медианой выживаемости, которая составила 13,8 месяцев для AAV9-Null самцов с MPSIIIB; Р=0,0007. Медиана выживаемости для здоровых мышей составила 26,6 месяцев. Нормализация поведенческих реакций и более высокая выживаемость получавших лечение мышей с MPSIIIB дополнительно иллюстрирует терапевтическую эффективность AAV9-CAG-comNaglu.

Пример 21: Интрацистернальная доставка AAV9-CAG-cocNaglu собакам

В качестве первого шага в направлении возможного клинического применения подхода генной терапии, требуется демонстрация его осуществимости в модели крупного животного. Ранее было продемонстрировано, что распределение AAV9-векторов после интрацереброспинального введения собакам породы бигль, животной модели с размером головного мозга, близким по размеру мозгу человека, является сходным с распределением, наблюдаемым у мышей, получающих эквивалентную дозу вектора посредством такого же пути введения. Смотри Haurigot et al., supra. Вкратце, введение 2×10¹³ vg AAV9-векторов, кодирующих репортерный белок GFP, показало большую трансдукцию клеток в головном мозге, мозжечке, оболочках головного мозга, спинном мозге и дорсальных корешковых ганглиях. Аналогично наблюдениям, сделанным на мышах, GFP также детектировали в печени собак породы бигль, где в среднем было трансдуцировано 3,7% гепатоцитов. Смотри Haurigot et al., supra. Важно, что интра-CSF введение AAV9-векторов, кодирующих лизосомальный фермент сульфамидазу, дефицит которого вызывает MPSIIIA, приводит к устойчивым уровням фермента в CSF подвергнутых лечению собак. CSF омывает CNS, делая фермент доступным различным структурам CNS. Разумеется, периодическая доставка рекомбинантного фермента в CSF представляет терапевтическую стратегию, проходящую в настоящее время клиническое испытание в отношении MPSIIIA. Смотри NCT01155778 и NCT01299727, clinicaltrials.gov.

Такой же подход был использован для иллюстрации возможной эффективности AAV9-векторов в соответствии с настоящим изобретением.

Общую дозу 6,5×10¹² vg векторов AAV9-CAG-cocNaglu вводили в мостомозжечковую цистерну 4 взрослым собакам породы бигль (собаки 1-4). Для оценки воздействия конституционального иммунитета на уровни активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в CSF, которые могут быть достигнуты с помощью лечения, двух из этих собак (собаки 3 и 4) иммунизировали путем системного введения 1×10¹¹ vg/кг некодирующих AAV9-null-векторов за 6 недель до доставки CSF. До начала выполнения интрацистернального введения векторов нативные собаки имели низкие титры анти-AAV9 нейтрализующих антител (NAb) в циркуляции и CSF, как это следовало ожидать для животных, которые ранее не подвергались воздействию вируса дикого типа или рекомбинантного вируса. Напротив, предварительно иммунизированные собаки имели высокие титры NAb в циркуляции, но низкие уровни в CSF, наблюдение, совместимое с асимметричным распределением NAb по гематоэнцефалическому барьеру. Смотри фигуру 18А и Haurigot et al., supra. Введение векторов AAV9-CAG-cocNaglu в мостомозжечковую цистерну привело к значительному повышению активности фермента, измеренной в образцах CSF от всех 4 собак, без значительных различий в отношении присутствия или отсутствия конституционального иммунитета. Смотри фигуру 18В. Уровни ферментативной активности достигали максимума между 2-ой и 3-ей неделями и затем достигали устойчивого состояния. Важно, что это повышение активности альфа-N-ацетилглюкозаминидазы в CSF было длительным (>4 месяцев). Смотри фигуру 18В.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЛАБОРАТОРИОС ДЕЛЬ ДР. ЭСТЕВ С.A.

УНИВЕРСИТАТ АУТОНОМА ДE БАРСЕЛОНА

<120> АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫЕ ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЛИЗОСОМНЫХ

БОЛЕЗНЕЙ НАКОПЛЕНИЯ

<130> PCT2212.5

<150> EP14382171

<151> 2014-05-14

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 743

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Ala Val Ala Val Ala Ala Ala Val Gly Val Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Asp Glu Ala Arg Glu Ala Ala Ala Val

20 25 30

Arg Ala Leu Val Ala Arg Leu Leu Gly Pro Gly Pro Ala Ala Asp Phe

35 40 45

Ser Val Ser Val Glu Arg Ala Leu Ala Ala Lys Pro Gly Leu Asp Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Arg Val Arg Val Arg Gly Ser

65 70 75 80

Thr Gly Val Ala Ala Ala Ala Gly Leu His Arg Tyr Leu Arg Asp Phe

85 90 95

Cys Gly Cys His Val Ala Trp Ser Gly Ser Gln Leu Arg Leu Pro Arg

100 105 110

Pro Leu Pro Ala Val Pro Gly Glu Leu Thr Glu Ala Thr Pro Asn Arg

115 120 125

Tyr Arg Tyr Tyr Gln Asn Val Cys Thr Gln Ser Tyr Ser Phe Val Trp

130 135 140

Trp Asp Trp Ala Arg Trp Glu Arg Glu Ile Asp Trp Met Ala Leu Asn

145 150 155 160

Gly Ile Asn Leu Ala Leu Ala Trp Ser Gly Gln Glu Ala Ile Trp Gln

165 170 175

Arg Val Tyr Leu Ala Leu Gly Leu Thr Gln Ala Glu Ile Asn Glu Phe

180 185 190

Phe Thr Gly Pro Ala Phe Leu Ala Trp Gly Arg Met Gly Asn Leu His

195 200 205

Thr Trp Asp Gly Pro Leu Pro Pro Ser Trp His Ile Lys Gln Leu Tyr

210 215 220

Leu Gln His Arg Val Leu Asp Gln Met Arg Ser Phe Gly Met Thr Pro

225 230 235 240

Val Leu Pro Ala Phe Ala Gly His Val Pro Glu Ala Val Thr Arg Val

245 250 255

Phe Pro Gln Val Asn Val Thr Lys Met Gly Ser Trp Gly His Phe Asn

260 265 270

Cys Ser Tyr Ser Cys Ser Phe Leu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Ile Phe

275 280 285

Pro Ile Ile Gly Ser Leu Phe Leu Arg Glu Leu Ile Lys Glu Phe Gly

290 295 300

Thr Asp His Ile Tyr Gly Ala Asp Thr Phe Asn Glu Met Gln Pro Pro

305 310 315 320

Ser Ser Glu Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Thr Thr Ala Val Tyr Glu

325 330 335

Ala Met Thr Ala Val Asp Thr Glu Ala Val Trp Leu Leu Gln Gly Trp

340 345 350

Leu Phe Gln His Gln Pro Gln Phe Trp Gly Pro Ala Gln Ile Arg Ala

355 360 365

Val Leu Gly Ala Val Pro Arg Gly Arg Leu Leu Val Leu Asp Leu Phe

370 375 380

Ala Glu Ser Gln Pro Val Tyr Thr Arg Thr Ala Ser Phe Gln Gly Gln

385 390 395 400

Pro Phe Ile Trp Cys Met Leu His Asn Phe Gly Gly Asn His Gly Leu

405 410 415

Phe Gly Ala Leu Glu Ala Val Asn Gly Gly Pro Glu Ala Ala Arg Leu

420 425 430

Phe Pro Asn Ser Thr Met Val Gly Thr Gly Met Ala Pro Glu Gly Ile

435 440 445

Ser Gln Asn Glu Val Val Tyr Ser Leu Met Ala Glu Leu Gly Trp Arg

450 455 460

Lys Asp Pro Val Pro Asp Leu Ala Ala Trp Val Thr Ser Phe Ala Ala

465 470 475 480

Arg Arg Tyr Gly Val Ser His Pro Asp Ala Gly Ala Ala Trp Arg Leu

485 490 495

Leu Leu Arg Ser Val Tyr Asn Cys Ser Gly Glu Ala Cys Arg Gly His

500 505 510

Asn Arg Ser Pro Leu Val Arg Arg Pro Ser Leu Gln Met Asn Thr Ser

515 520 525

Ile Trp Tyr Asn Arg Ser Asp Val Phe Glu Ala Trp Arg Leu Leu Leu

530 535 540

Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu

545 550 555 560

Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Val Gln Glu Leu Val Ser Leu Tyr Tyr

565 570 575

Glu Glu Ala Arg Ser Ala Tyr Leu Ser Lys Glu Leu Ala Ser Leu Leu

580 585 590

Arg Ala Gly Gly Val Leu Ala Tyr Glu Leu Leu Pro Ala Leu Asp Glu

595 600 605

Val Leu Ala Ser Asp Ser Arg Phe Leu Leu Gly Ser Trp Leu Glu Gln

610 615 620

Ala Arg Ala Ala Ala Val Ser Glu Ala Glu Ala Asp Phe Tyr Glu Gln

625 630 635 640

Asn Ser Arg Tyr Gln Leu Thr Leu Trp Gly Pro Glu Gly Asn Ile Leu

645 650 655

Asp Tyr Ala Asn Lys Gln Leu Ala Gly Leu Val Ala Asn Tyr Tyr Thr

660 665 670

Pro Arg Trp Arg Leu Phe Leu Glu Ala Leu Val Asp Ser Val Ala Gln

675 680 685

Gly Ile Pro Phe Gln Gln His Gln Phe Asp Lys Asn Val Phe Gln Leu

690 695 700

Glu Gln Ala Phe Val Leu Ser Lys Gln Arg Tyr Pro Ser Gln Pro Arg

705 710 715 720

Gly Asp Thr Val Asp Leu Ala Lys Lys Ile Phe Leu Lys Tyr Tyr Pro

725 730 735

Arg Trp Val Ala Gly Ser Trp

740

<210> 2

<211> 2232

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggaggcgg tggcggtggc cgcggcggtg ggggtccttc tcctggccgg ggccgggggc 60

gcggcaggcg acgaggcccg ggaggcggcg gccgtgcggg cgctcgtggc ccggctgctg 120

gggccaggcc ccgcggccga cttctccgtg tcggtggagc gcgctctggc tgccaagccg 180

ggcttggaca cctacagcct gggcggcggc ggcgcggcgc gcgtgcgggt gcgcggctcc 240

acgggcgtgg cggccgccgc ggggctgcac cgctacctgc gcgacttctg tggctgccac 300

gtggcctggt ccggctctca gctgcgcctg ccgcggccac tgccagccgt gccgggggag 360

ctgaccgagg ccacgcccaa caggtaccgc tattaccaga atgtgtgcac gcaaagctac 420

tctttcgtgt ggtgggactg ggcccgctgg gagcgagaga tagactggat ggcgctgaat 480

ggcatcaacc tggcactggc ctggagcggc caggaggcca tctggcagcg ggtgtacctg 540

gccttgggcc tgacccaggc agagatcaat gagttcttta ctggtcctgc cttcctggcc 600

tgggggcgaa tgggcaacct gcacacctgg gatggccccc tgcccccctc ctggcacatc 660

aagcagcttt acctgcagca ccgggtcctg gaccagatgc gctccttcgg catgacccca 720

gtgctgcctg cattcgcggg gcatgttccc gaggctgtca ccagggtgtt ccctcaggtc 780

aatgtcacga agatgggcag ttggggccac tttaactgtt cctactcctg ctccttcctt 840

ctggctccgg aagaccccat attccccatc atcgggagcc tcttcctgcg agagctgatc 900

aaagagtttg gcacagacca catctatggg gccgacactt tcaatgagat gcagccacct 960

tcctcagagc cctcctacct tgccgcagcc accactgccg tctatgaggc catgactgca 1020

gtggatactg aggctgtgtg gctgctccaa ggctggctct tccagcacca gccgcagttc 1080

tgggggcccg cccagatcag ggctgtgctg ggagctgtgc cccgtggccg cctcctggtt 1140

ctggacctgt ttgctgagag ccagcctgtg tatacccgca ctgcctcctt ccagggccag 1200

cccttcatct ggtgcatgct gcacaacttt gggggaaacc atggtctttt tggagcccta 1260

gaggctgtga acggaggccc agaagctgcc cgcctcttcc ccaactccac catggtaggc 1320

acgggcatgg cccccgaggg catcagccag aacgaagtgg tctattccct catggctgag 1380

ctgggctggc gaaaggaccc agtgccagat ttggcagcct gggtgaccag ctttgccgcc 1440

cggcggtatg gggtctccca cccggacgca ggggcagcgt ggaggctact gctccggagt 1500

gtgtacaact gctccgggga ggcctgcagg ggccacaatc gtagcccgct ggtcaggcgg 1560

ccgtccctac agatgaatac cagcatctgg tacaaccgat ctgatgtgtt tgaggcctgg 1620

cggctgctgc tcacatctgc tccctccctg gccaccagcc ccgccttccg ctacgacctg 1680

ctggacctca ctcggcaggc agtgcaggag ctggtcagct tgtactatga ggaggcaaga 1740

agcgcctacc tgagcaagga gctggcctcc ctgttgaggg ctggaggcgt cctggcctat 1800

gagctgctgc cggcactgga cgaggtgctg gctagtgaca gccgcttctt gctgggcagc 1860

tggctagagc aggcccgagc agcggcagtc agtgaggccg aggccgattt ctacgagcag 1920

aacagccgct accagctgac cttgtggggg ccagaaggca acatcctgga ctatgccaac 1980

aagcagctgg cggggttggt ggccaactac tacacccctc gctggcggct tttcctggag 2040

gcgctggttg acagtgtggc ccagggcatc cctttccaac agcaccagtt tgacaaaaat 2100

gtcttccaac tggagcaggc cttcgttctc agcaagcaga ggtaccccag ccagccgcga 2160

ggagacactg tggacctggc caagaagatc ttcctcaaat attacccccg ctgggtggcc 2220

ggctcttggt ga 2232

<210> 3

<211> 2232

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cohNaGlu nucleotide sequence

<400> 3

atggaagctg tggctgtggc agctgctgtg ggcgtgctgc tgctggcagg cgctggcgga 60

gctgctgggg atgaagctag agaagctgcc gctgtgcggg ccctggtggc tagactgctg 120

ggacctggac ctgccgccga cttctccgtg tctgtggaaa gagccctggc cgccaagcct 180

ggcctggaca catattctct gggcggaggc ggcgctgctc gcgtcagagt gcgaggatct 240

acaggcgtgg ccgctgctgc cggactgcac agatacctga gagacttctg cggctgccat 300

gtggcttgga gcggcagcca gctgagactg cctagacctc tgcctgctgt gcctggcgag 360

ctgacagagg ccacccctaa cagataccgg tactaccaga acgtgtgcac ccagagctac 420

agcttcgtgt ggtgggactg ggccagatgg gagcgcgaga tcgattggat ggccctgaac 480

ggcatcaacc tggccctggc ttggagtggc caggaagcca tctggcagag agtgtacctg 540

gctctgggcc tgacccaggc cgagatcaac gagttcttta ccggccctgc ctttctggcc 600

tggggcagaa tgggcaacct gcacacatgg gacggccccc tgcctcctag ctggcacatc 660

aagcagctgt acctgcagca cagagtgctg gaccagatga gaagcttcgg catgaccccc 720

gtgctgcctg cttttgctgg acacgtgcca gaggccgtga ccagagtgtt cccccaagtg 780

aacgtgacca agatgggcag ctggggccac ttcaactgca gctactcctg cagcttcctg 840

ctggcccccg aggaccccat cttccctatt atcggcagcc tgttcctgcg ggaactgatc 900

aaagagttcg gcaccgacca catctacggc gccgacacct tcaacgagat gcagccccct 960

agcagcgagc cctcttacct ggctgctgcc accacagccg tgtacgaggc catgacagcc 1020

gtggataccg aggccgtgtg gctgctgcag ggatggctgt ttcagcacca gccccagttc 1080

tggggccctg cccagattag agcagtgctg ggcgctgtgc ccagaggcag gctgctggtg 1140

ctggatctgt tcgccgagag ccagcccgtg tacaccagaa ccgctagctt ccagggacag 1200

cccttcatct ggtgcatgct gcacaacttc ggcggcaacc acggcctgtt cggcgctctg 1260

gaagcagtga atggcggccc tgaggccgcc agactgttcc ctaacagcac aatggtggga 1320

accggcatgg cccctgaggg catctctcag aacgaggtgg tgtacagcct gatggccgag 1380

ctgggctggc ggaaggatcc tgtgcctgat ctggccgcct gggtcacaag cttcgccgct 1440

agaagatacg gcgtgtccca ccctgatgct ggcgccgctt ggagactgct gctgagaagc 1500

gtgtacaact gctccggcga ggcctgcagg ggccacaaca gatctccact cgtgcggagg 1560

cccagcctgc agatgaacac cagcatctgg tacaatcgga gcgacgtgtt cgaggcctgg 1620

cgcctgctgc tgacatctgc tcctagcctg gccacctccc ccgccttcag atacgatctg 1680

ctggacctga ccaggcaggc cgtgcaggaa ctggtgtccc tgtactacga ggaagccaga 1740

agcgcctacc tgagcaaaga gctggcctcc ctgctgagag cagggggagt gctggcttac 1800

gaactgctgc cagccctgga tgaggtgctg gctagcgact ccagatttct gctgggctcc 1860

tggctggaac aggccagagc tgccgcagtg tctgaggccg aggccgattt ctacgagcag 1920

aacagcagat accagctgac cctgtggggc ccagagggca acatcctgga ctacgccaac 1980

aaacagctgg ccggcctggt ggccaactac tacacaccta gatggcggct gtttctggaa 2040

gctctggtgg actctgtggc ccagggcatc ccattccagc agcaccagtt cgacaagaac 2100

gtgttccagc tggaacaggc tttcgtgctg agcaagcaga gataccccag ccagcctaga 2160

ggcgacacag tggacctggc caagaagatc tttctgaagt actaccccag atgggtggcc 2220

ggctcttggt ga 2232

<210> 4

<211> 646

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CAG nucleotide sequence

<400> 4

actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60

cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120

ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180

caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300

tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360

accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420

cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480

gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540

agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600

cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgg 646

<210> 5

<211> 8461

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-hNaGlu Nucleotide sequence

<400> 5

attacgccag ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120

ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactcg 180

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 240

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 300

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 360

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 420

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 480

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 540

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 600

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 660

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 720

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 780

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 840

agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900

ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960

gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020

ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt 1080

gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg 1140

ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg 1200

gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1260

tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc 1320

ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg 1380

cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1440

cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1500

gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1560

gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1620

ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1680

ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1740

gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1800

gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1860

gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg 1920

aacgcgtatg gaggcggtgg cggtggccgc ggcggtgggg gtccttctcc tggccggggc 1980

cgggggcgcg gcaggcgacg aggcccggga ggcggcggcc gtgcgggcgc tcgtggcccg 2040

gctgctgggg ccaggccccg cggccgactt ctccgtgtcg gtggagcgcg ctctggctgc 2100

caagccgggc ttggacacct acagcctggg cggcggcggc gcggcgcgcg tgcgggtgcg 2160

cggctccacg ggcgtggcgg ccgccgcggg gctgcaccgc tacctgcgcg acttctgtgg 2220

ctgccacgtg gcctggtccg gctctcagct gcgcctgccg cggccactgc cagccgtgcc 2280

gggggagctg accgaggcca cgcccaacag gtaccgctat taccagaatg tgtgcacgca 2340

aagctactct ttcgtgtggt gggactgggc ccgctgggag cgagagatag actggatggc 2400

gctgaatggc atcaacctgg cactggcctg gagcggccag gaggccatct ggcagcgggt 2460

gtacctggcc ttgggcctga cccaggcaga gatcaatgag ttctttactg gtcctgcctt 2520

cctggcctgg gggcgaatgg gcaacctgca cacctgggat ggccccctgc ccccctcctg 2580

gcacatcaag cagctttacc tgcagcaccg ggtcctggac cagatgcgct ccttcggcat 2640

gaccccagtg ctgcctgcat tcgcggggca tgttcccgag gctgtcacca gggtgttccc 2700

tcaggtcaat gtcacgaaga tgggcagttg gggccacttt aactgttcct actcctgctc 2760

cttccttctg gctccggaag accccatatt ccccatcatc gggagcctct tcctgcgaga 2820

gctgatcaaa gagtttggca cagaccacat ctatggggcc gacactttca atgagatgca 2880

gccaccttcc tcagagccct cctaccttgc cgcagccacc actgccgtct atgaggccat 2940

gactgcagtg gatactgagg ctgtgtggct gctccaaggc tggctcttcc agcaccagcc 3000

gcagttctgg gggcccgccc agatcagggc tgtgctggga gctgtgcccc gtggccgcct 3060

cctggttctg gacctgtttg ctgagagcca gcctgtgtat acccgcactg cctccttcca 3120

gggccagccc ttcatctggt gcatgctgca caactttggg ggaaaccatg gtctttttgg 3180

agccctagag gctgtgaacg gaggcccaga agctgcccgc ctcttcccca actccaccat 3240

ggtaggcacg ggcatggccc ccgagggcat cagccagaac gaagtggtct attccctcat 3300

ggctgagctg ggctggcgaa aggacccagt gccagatttg gcagcctggg tgaccagctt 3360

tgccgcccgg cggtatgggg tctcccaccc ggacgcaggg gcagcgtgga ggctactgct 3420

ccggagtgtg tacaactgct ccggggaggc ctgcaggggc cacaatcgta gcccgctggt 3480

caggcggccg tccctacaga tgaataccag catctggtac aaccgatctg atgtgtttga 3540

ggcctggcgg ctgctgctca catctgctcc ctccctggcc accagccccg ccttccgcta 3600

cgacctgctg gacctcactc ggcaggcagt gcaggagctg gtcagcttgt actatgagga 3660

ggcaagaagc gcctacctga gcaaggagct ggcctccctg ttgagggctg gaggcgtcct 3720

ggcctatgag ctgctgccgg cactggacga ggtgctggct agtgacagcc gcttcttgct 3780

gggcagctgg ctagagcagg cccgagcagc ggcagtcagt gaggccgagg ccgatttcta 3840

cgagcagaac agccgctacc agctgacctt gtgggggcca gaaggcaaca tcctggacta 3900

tgccaacaag cagctggcgg ggttggtggc caactactac acccctcgct ggcggctttt 3960

cctggaggcg ctggttgaca gtgtggccca gggcatccct ttccaacagc accagtttga 4020

caaaaatgtc ttccaactgg agcaggcctt cgttctcagc aagcagaggt accccagcca 4080

gccgcgagga gacactgtgg acctggccaa gaagatcttc ctcaaatatt acccccgctg 4140

ggtggccggc tcttggtgag aattcgagct cggtacccgg gaatcaattc actcctcagg 4200

tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct cacaaatacc 4260

actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc 4320

tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt 4380

gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt aaaacatcag aatgagtatt 4440

tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc catgaacaaa ggttggctat 4500

aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca ttccttattc catagaaaag 4560

ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt gttatttttt tctttaacat 4620

ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc tgactactcc 4680

cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga cctgcagccc aagctgtaga 4740

taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 4800

tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gctttgcccg ggcggcctca 4860

gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 4920

tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 4980

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 5040

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 5100

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 5160

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 5220

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 5280

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 5340

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 5400

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 5460

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 5520

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 5580

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 5640

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 5700

ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 5760

gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 5820

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 5880

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 5940

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 6000

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 6060

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 6120

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 6180

ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 6240

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 6300

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 6360

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 6420

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 6480

gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 6540

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 6600

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 6660

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 6720

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 6780

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 6840

gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 6900

cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 6960

aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 7020

ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta 7080

actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc 7140

acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgattcca acatccaata aatcatacag 7200

gcaaggcaaa gaattagcaa aattaagcaa taaagcctca gagcataaag ctaaatcggt 7260

tgtaccaaaa acattatgac cctgtaatac ttttgcggga gaagccttta tttcaacgca 7320

aggataaaaa tttttagaac cctcatatat tttaaatgca atgcctgagt aatgtgtagg 7380

taaagattca aacgggtgag aaaggccgga gacagtcaaa tcaccatcaa tatgatattc 7440

aaccgttcta gctgataaat tcatgccgga gagggtagct atttttgaga ggtctctaca 7500

aaggctatca ggtcattgcc tgagagtctg gagcaaacaa gagaatcgat gaacggtaat 7560

cgtaaaacta gcatgtcaat catatgtacc ccggttgata atcagaaaag ccccaaaaac 7620

aggaagattg tataagcaaa tatttaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg 7680

ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct 7740

tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt 7800

ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat 7860

ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca 7920

ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac 7980

gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta 8040

gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg 8100

tactatggtt gctttgacga gcacgtataa cgtgctttcc tcgttagaat cagagcggga 8160

gctaaacagg aggccgatta aagggatttt agacaggaac ggtacgccag aatcctgaga 8220

agtgttttta taatcagtga ggccaccgag taaaagagtc tgtccatcac gcaaattaac 8280

cgttgtcgca atacttcttt gattagtaat aacatcactt gcctgagtag aagaactcaa 8340

actatcggcc ttgctggtaa tatccagaac aatattaccg ccagccattg caacggaatc 8400

gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 8460

t 8461

<210> 6

<211> 8467

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pAAV-CAG-cohNaGlu Nucleotide sequence

<400> 6