Высушенные распылением микрочастицы как терапевтические носители - RU2147226C1

Чертежи

Описание

Изобретение относится к высушенным распылением микрочастицам и их применению как терапевтических носителей. Конкретнее, настоящее изобретение относится к средствам доставки диагностических и терапевтических агентов и продуктов биотехнологии, включая лекарственные средства, полученные с помощью технологии рДНК.

Наиболее распространенные пути введения терапевтических агентов, пероральный или желудочно-кишечный, в значительной степени неприменимы к пептидам и белкам, полученным с помощью технологии рДНК. Чувствительность нормальных пептидов и белков крови к кислой/протеолитической среде кишечника в значительной степени препятствует этому пути введения. Логичным средством введения является внутривенное вливание, но это представляет определенные трудности, связанные с плохим соблюдением пациентом режима и схемы лечения при длительном введении и, очень часто, с быстрым клиренсом после первого же прохождения через печень, что выражается в коротком периоде в/в жизни.

Недавно изучалась возможность доставки путем переноса через слизистые оболочки. В то время, как назальная доставка широко изучалась, возможная доставка пептидов через легочные пути остается в значительной степени не исследованной.

Альвеолярные клетки по своей природе являются эффективным барьером. Однако даже проведение материала в район альвеол представляет значительное препятствие для этого способа введения. Существует оптимальный размер частиц, который позволяет им достичь самых нижних отделов легочных путей, т.е. аэродинамический диаметр < 5 мкм. Частицы, превышающие этот размер, задерживаются в верхних отделах дыхательных путей так, что в стандартных коммерческих суспензионных препаратах только 10 - 30% частиц, нормально полидиспергированных суспензией, достигают нижних отделов дыхательных путей.

Современные способы аэрозолированных лекарств для ингаляции включают распыление, дозирующие ингаляторы и системы с сухим порошком. Распыление водных растворов требует больших объемов лекарств и применения громоздких и непереносных устройств.

Наиболее распространенным способом введения лекарств в легкие является использование устройств с летучими пропеллентами, которые обычно называют дозирующими ингаляторами. Их основным конструкционным признаком является раствор пропеллента, обычно CFC 11, 12 или 114, содержащий растворенное лекарство или суспензию лекарства в емкости, находящейся под давлением. Дозирование осуществляется путем нажатия на исполнительный механизм, который высвобождает пропеллентный аэрозоль лекарственной суспензии или раствора, который доставляется в дыхательные пути. Во время прохождения через легкие пропеллент испаряется, образуя микроскопические осадки из раствора или свободные частицы из суспензии. Это дозирование легко воспроизводимо и дешево, однако растущее загрязнение окружающей среды вынуждает сокращать использование CFC. Более того, использование растворителей CFC остается в значительной степени несовместимым со многими современными лекарствами, полученными средствами биотехнологии, в силу их склонности к денатурации и низкой стабильности.

Одновременно, существует тенденция к использованию устройств с сухим порошком, в которых применяются сухие порошки лекарств, обычно в смеси с наполнителями, такими как лактоза или глюкоза, что облегчает аэрозолизацию и дисперсию частиц лекарства. Энергию для дезагрегации часто обеспечивает дыхание или вдыхание воздуха через устройство.

В настоящее время лекарства измельчают для уменьшения размера частиц. Этот подход неприменим для продуктов, полученных средствами биотехнологии. В целом, продукты, полученные средствами биотехнологии, доступны в малых количествах и, более того, они чувствительны к методикам, применяемым в настоящее время для сушки и измельчения, предшествующих смешиванию с наполнителем. Далее, особенно трудно изготавливать смеси лекарства и наполнителя достаточно текучими, чтобы они текли и дозировались воспроизводимым образом в современных многодозовых ингаляторах, таких как Turbohaler (Astra) и Diskhaler (Glaxo). Исследования показали, что вопреки ожиданиям, высушенные распылением (сферические) микрочастицы сальбутамола, обладали силами когезии и адгезии большей величины, чем частицы измельченного лекарства такого же размера. Фотографии высушенного распылением материала, полученные с помощью электронного микроскопа, показали, что эти частицы имеют выщербленную, шероховатую поверхность.

Haghpanah et al. в 1994 году на Британской фармацевтической конференции докладывали о получении высушенных распылением микрочастиц альбумина с инкорпорированным сальбутамолом, которые имели размеры, подходящие для респираторной доставки лекарства, т.е. 1 - 5 мкм. Целью являлось инкапсулирование сальбутамола для медленного его высвобождения. Из этого не становится очевидным, что продукт состоит из в значительной степени однородных сферических или гладких микрочастиц, имеющих характеристики текучести, удовлетворительные для использования в многодозовых ингаляторах с сухим порошком.

Диагностические агенты, включающие полые микрокапсулы, используются для усиления изображения при ультразвуковом исследовании. Например, EP-A-458745 (Sintetica) раскрывает способ изготовления наполненных воздухом или газом микробаллонов путем полимеризации на поверхности раздела синтетических полимеров, таких как полилактиды и полигликолиды. WO-A-9112823 (Delta) раскрывает сходный способ, применяющий альбумин. Wheatley et al. (1990) Biomaterials 11: 713-717 раскрывают ионотропную желатинизацию альгината для получения микропузырьков, диаметром свыше 30 мкм. WO-A-9109629 раскрывает липосомы для применения в качестве контрастных агентов для ультразвукового исследования.

Przyborоwski et al., Eur. J. Nucl. Med. 7:71-72 (1982) раскрывают приготовление микросфер из сывороточного альбумина человека (ЧСА) с помощью сушки распылением для целей радиоактивного лечения и их последующее применение для сцинтиграфии легких. Об этих микросферах не говорилось, что они были полыми и, в результате нашего повторения этой работы получались преимущественно плохо оформленные твердые микросферы. Если частицы не полые, они не подходят для эхокардиографии.

Кроме того, эти микросферы изготавливались с помощью одноэтапного процесса, который, как мы установили, не подходит для изготовления микрокапсул, пригодных для эхокардиографии; в этом процессе было необходимо удалять из микросфер неденатурированный альбумин, а также явно получались микросферы, сильно различавшиеся по размерам, что требовало дополнительного этапа просеивания.

Przyborowski et al. ссылаются на два более ранних описания способов получения частиц альбумина для сцинтиграфии легких. Aldrich и Johnston (1974), Int. J. Appl. Rad. Isot., 25:15-18 раскрывают применение быстро вращающегося диска для получения частиц, диаметром 3 - 70 мкм, которые затем денатурируют в горячем масле. Масло удаляют, а частицы метят радиоактивными изотопами. Raju et al., (1978), Isotopenpraxis 14(2):57-61 использовали ту же технологию с быстро вращающимся диском, но альбумин денатурировали простым нагреванием частиц. Ни в одном из этих случаев не упоминались полые микрокапсулы, а изготовленные частицы не были удобными для эхокардиографии.

EP-A-0606486 (Teijin) описывает производство порошков, в которых активный агент инкорпорирован в маленькие частицы, с носителями, состоящими из целлюлозы или производных целлюлозы. Целью являлось предотвращение прилипания частиц лекарства к желатиновым капсулам, применявшихся в дозирующем ингаляторе с сухим порошком. Страница 12 этой публикации упоминает сушку распылением "лекарства и основы" для получения частиц, из которых 80% и более имеют размер 0,5 - 10 мкм. Не дается никаких указаний на то, какие условия должны использоваться для получения такого продукта.

EP-A-0611567 (Teijin), более конкретно, относится к производству порошков для ингаляций с помощью сушки распылением. Носителем является целлюлоза, выбранная в силу ее устойчивости к влажности среды. Условия, приведенные в примере 1 (этанол в качестве растворителя, 2 - 5% (вес/объем) растворенного вещества), означают, что строение поверхности не регулируется, а пример 4 сообщает о фракции, плохо проникающей в нижние дыхательные пути при вдыхании (12%), что говорит о плохих дисперсионных свойствах. Сферические частицы получают явно при высоком содержании лекарства, что указывает на зависимость строения частицы от соответственного содержания лекарства и носителя.

Conte et al. (1994), Eur. J. Pharm. Biopharm. 40(4): 203 - 208 описывают сушку распылением из водного раствора с минимальным содержанием растворенного вещества 1,5%. Чтобы получить большинство частиц почти сферической формы, требуется высокое содержание лекарства. Это влечет за собой образование частиц сморщенной и складчатой структуры. Помимо этого, после суспендирования в бутаноле, чтобы облегчить анализ Coulter, является необходимой обработка ультразвуком, подразумевающая, что частицы не являются полностью сухими.

Целью настоящего изобретения является создание носителя для доставки лекарственных средств и композиции, которые были бы лучше приспособлены, чем ранее известные продукты, для доставки, в частности, в альвеолы.

Сущность изобретения
Согласно настоящему изобретению неожиданно было обнаружено, что в микрочастицах (а также в микрокапсулах и микросферах), которые также удобны как промежуточный продукт, т.е. перед фиксированием, в случае производства содержащих воздух микрокапсул для диагностических целей, например, которые описаны в WO-A-9218164 как "промежуточные микрокапсулы", на формирующий стенку материал сушка распылением практически не влияет. Таким образом, можно изготавливать и представлять в форме сухих порошков для лечебного и диагностического применения в высокой степени однородные микрочастицы, микросферы или микрокапсулы из термолабильных материалов, таких как ферменты, пептиды и белки, например ЧСА, и другие полимеры.

В противоположность ранее известному состоянию данной области, в настоящее время также обнаружено, что эффективные растворимые носители для лечебных и диагностических агентов можно изготовить путем сушки распылением, которые представляют собой гладкие сферические микрочастицы с хорошей текучестью из водорастворимого материала, например сывороточного альбумина человека (ЧСА), имеющего среднемассовый размер частиц от 1 до 10 мкм. В более общем смысле, процесс изготовления микрокапсул настоящего изобретения включает атомизацию раствора (или дисперсии) материала, формирующего стенку. Лекарственный или диагностический агент может быть атомизирован немедленно или присоединен к микрокапсулам, полученным таким способом. Альтернативно, этот материал сам может представлять активный агент. В частности, было обнаружено, что при условиях, приведенных в настоящем документе и в более общей форме, описанных Sutton et al. (1992), например с использованием подходящей комбинации более высоких концентраций растворенных веществ и более высоких соотношений потоков воздух/жидкость, чем у Haghpanah et al., и усилителей образования оболочки, можно изготавливать исключительно гладкие сферические микрочастицы из различных материалов. Сферическую природу микрочастиц можно установить не только простым определением максимального размера, т.е. с помощью методики дифракции лазерного луча, описанной Haghpanah et al. Более того, размер частиц и распределение по размерам в продукте можно контролировать в более узких пределах и с большей воспроизводимостью. Например, по анализу Coulter, 98% частиц могут быть меньше 6 мкм на численной основе, в пределах межквартильного размаха - 2 мкм, и со средним размером вариации между партиями менее 0,5 мкм. Далее, при тестировании в ингаляторе с сухим порошком на стадии разработки было достигнуто воспроизводимое дозирование, и последующая аэрозолизация при нормальных условиях потока (30 л/мин) демонстрировала отличное отделение частиц от наполнителя.

Нефиксированные капсулы настоящего изобретения, полученные из неденатурированного ЧСА или другого материала, способного высушиваться распылением, имеют очень гладкую поверхность и могут производиться с относительно низким содержанием наполнителей для получения высокотекучих порошков, идеальных для использования в ингаляторах с сухим порошком. Применяя этот подход, можно производить гетерогенные микрокапсулы, состоящие из суспендированных наполнителей и активного ингредиента. Этот способ имеет то преимущество, что можно получать высокотекучий порошок активных ингредиентов, которые можно подвергать дальнейшей обработке для получения порошков, которые дозируются и образуют аэрозоль с отличной воспроизводимостью и точностью.

Помимо этого, способ сушки распылением, в его современной форме, вызывает относительно мало денатурации и превращения в полимеры при производстве высокотекучего порошка. Во всех случаях размер суспензии микрокапсул может быть таким, чтобы 90% массы находилось в пределах желаемых размеров, например размеров, удобных для вдыхания, 1-5 мкм.

Таким образом, по существу мы описали, как можно производить микрочастицы, которые имеют размеры преимущественно 1-5 мкм, являются гладкими и сферическими, содержат газ и состоят из неповрежденных белковых молекул и которые можно хранить и перевозить перед остальными этапами производства. Для изготовления промежуточных микрокапсул для ультразвуковых исследований мы привели те характеристики процесса и получающегося в результате порошка, которые являются существенными для производства превосходных порошков для ингаляторов, распыляющих сухой порошок (ИСП). Мы обнаружили, что множество анализов, которые разработаны для эхоконтрастных агентов, удобны для определения тех параметров частиц, которые являются полезными для используемых в ИСП порошков, а именно эхогенность и устойчивость к давлению поперечно-связанных частиц, определяющие хорошо изготовленные микрочастицы; микроскопическая оценка в DPX или растворителях, определяющая сферичность и содержание глаза в растворимых промежуточных капсулах, анализ размера частиц и распределения по размерам, а также проба на мономерный белок для определения конечного уровня фиксирования продукта.

Значительное внимание необходимо уделять для контроля размеров частиц и распределения по размерам, особенно в продуктах, которые используются в терапии. Мы выбрали биологически совместимый полимер, который при поперечном связывании остается безвредным, а также выяснили, каким образом можно воспроизводимо осуществлять поперечное связывание этой молекулы. Для того чтобы добиться контролируемого связывания, мы разобщили процессы формирования микрочастиц и поперечного связывания, что не делалось в других процессах выпаривания эмульсии и растворителя. Это означает, что начальный этап процесса не повреждает материал, образующий стенку. Мы определили конкретные параметры, имеющие значение для полного формирования частиц, а также дополнительно определили более выгодные условия, при которых выход интактных частиц получается больше. Выбирается ЧСА как особенно подходящий полимер, мы также выбирали потенциальную молекулу-носитель, которая может защищать лабильные молекулы, усиливать поглощение пептидов в легких, связывать низкомолекулярные лекарства за счет естественного сродства и ковалентно модифицироваться для переноса лекарств через клеточные барьеры в системную циркуляцию и далее.

При использовании для производства микрочастиц малых размеров сушки распылением, исследователи были склонны применять летучие растворители, которые вызывают быстрое сморщивание капелек. Альтернативно, исследователи использовали сырьевой раствор с низким содержанием растворенных веществ для поддержания его малой вязкости, чтобы облегчить получение капелек меньшего размера. В обоих случаях, при производстве микрочастиц способ мало влияет на конечную структуру; скорее это диктуется компонентами, которые использовали для формирования частиц. Мы предприняли обширные исследования, касающиеся того, каким образом можно изготавливать частицы из ЧСА с контролируемым размером, и применили это ко многим другим материалам, включая активные лекарства. Мы можем использовать относительно высокое содержание растворенных веществ, например, 10-30% (вес/объем), в противоположность 0.5-2%, для изготовления микрочастиц, включающих низкомолекулярный активный агент и лактозу; только низкомолекулярный активный агент; пептиды с ЧСА и модифицированные полимерные носители с активным агентом. Мы обнаружили, что способ определяет конечную структуру частицы в большей степени, чем состав растворенных веществ. Далее, мы можем использовать комбинации водных и смешивающихся с водой растворителей для улучшения структуры частиц. Таким образом, мы имели методологию, главной для которой является способ, которая дает возможность изготавливать гладкие сферические частицы с контролируемым размером, удобные для доставки в легкие.

Мы обнаружили, что способ настоящего изобретения можно изменять для того, чтобы получать микросферы с желаемыми характеристиками. Так, давление, под которым белковый раствор подается на форсунку распылителя, можно варьировать, например, в пределах 1.0-10.0 • 10⁵Па, предпочтительно, 2.8•10⁵ Па и, наиболее предпочтительно, около 7.5 • 10⁵ Па. Остальные параметры можно изменять, как описано ниже. Таким способом можно получать новые микросферы.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения обеспечены полые микросферы, из которых более 30%, предпочтительно, более 40%, 50% или 60% микросфер имеют диаметр в пределах размаха 2 мкм, а, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95% или 99% имеют диаметр в пределах размаха 1.0-8.0 мкм.

Межквартильный размах может составлять 2 мкм при среднем диаметре 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 или 6.5 мкм.

Таким образом, по меньшей мере, 30%, 40%, 50% или 60% микросфер могут иметь диаметр в диапазонах 1.5-3.5 мкм, 2.0-4.0 мкм, 3.0-5.0 мкм, 4.0-6.0 мкм, 5.0-7.0 мкм или 6.0-8.0 мкм. Предпочтительно, указанное процентное количество микросфер имеет диаметры в диапазонах с размахом 1.0 мкм, таких как 1.5-2.0 мкм, 2.0-3.0 мкм, 3.0-4.0 мкм, 4.0-5.0 мкм, 5.0-6.0 мкм, 6.0-7.0 мкм или 7.0-8.0 мкм.

Еще один аспект настоящего изобретения создает полые микросферы с белковыми стенками, из которых более 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95% или 99% микросфер имеют диаметр в диапазоне 1.0-8.0 мкм; по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95% или 99% микросфер имеют толщину стенки 40-500 нм, предпочтительно, 100-500 нм.

Образующий стенку материал и технологические условия должны подбираться таким образом, чтобы продукт был достаточно нетоксичным и неиммуногенным при условиях, в которых он будет использоваться, которые совершенно очевидно зависят от вводимой дозы и продолжительности лечения. Образующим стенку материалом может являться производное крахмала, синтетический полимер, такой как трет-бутилоксикарбонилметилполиглутамат (US-A-4888398) или полисахарид, такой как полидекстроза.

В общем, образующий стенку материал можно выбирать из наиболее гидрофильных, биоразлагаемых, физиологически совместимых полимеров, как описано более подробно в WO-A-9218164.

Предпочтительно, образующий стенку материал имеет белковую природу. Например, он может представлять собой коллаген, желатин или (сывороточный) альбумин, в каждом случае, предпочтительно, человеческий (т.е. полученный от человека или по строению соответствующий белку). Наиболее предпочтительно, это человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), полученный из донорской крови, или, в идеале, от микроорганизмов (включая клеточные линии), которые были трансформированы или трансфектировали для экспрессии ЧСА. Дополнительные подробности указаны в WO-A-9218164.

Белковый раствор или дисперсия имеет концентрацию белка, предпочтительно, от 0.1 до 50% (вес/объем), более предпочтительно, около 5.0-25%, особенно, когда белком является альбумин. Величина около 20% является оптимальной. Можно использовать смеси образующих стенку материалов; в этом случае указанные в последних двух предложениях проценты относятся к общему содержанию образующего стенку материала.

Препарат, предназначенный для распыления, может содержать, помимо образующего стенку материала и жидкого растворителя или носителя, и другие вещества. Здесь снова можно сослаться на WO-A-9218164.

Белковый раствор или дисперсия (предпочтительно, раствор), в дальнейшем упоминаемый как "белковый препарат", атомизируют и высушивают распылением любым удобным способом, в результате чего получают дискретные микросферы или микрокапсулы диаметром от 1 до 10 мкм. Эти цифры относятся, по меньшей мере, к 90% всех микрокапсул, диаметр измерен с помощью Coulter Master Sizer II. Термин "микрокапсулы" обозначает полые частицы, имеющие внутри пространство, заполненное газом или паром, но не каким-либо твердыми материалами. Частицы типа медовых сот, напоминающие кондитерские изделия, продаваемые в СК под торговым наименованием Maltesers^®, при этом не образуются.

Атоматизация включает образование аэрозоля белкового препарата путем, например, пропускания препарата под давлением через, по меньшей мере, одно отверстие, или путем использования центрифужного атомизатора в камере с теплым воздухом или другим инертным газом. Камера должна быть достаточно большой для того, чтобы самые большие из выброшенных капель не ударялись о стенки перед сушкой. Газ или пар в камере является чистым (т.е., предпочтительно, стерильным и не содержащим пирогенов) и нетоксичным при введении в кровяное русло в количествах, сопутствующих введению в организм микрокапсул при их использовании. Скорость испарения жидкости из белкового препарата должна быть достаточно высокой для того, чтобы микрокапсулы получались полыми, но не настолько высокой, чтобы они взрывались. Скорость испарения можно регулировать, изменяя скорость потока газа, концентрацию белка в белковом препарате, природу жидкого носителя, скорость подачи раствора и, что более важно, температуру газа, с которым сталкивается аэрозоль. При концентрации альбумина в воде 15 - 25% температура газа при впуске, по меньшей мере, около 100^oC, предпочтительно, по меньшей мере, 110^oC, обычно достаточна для того, чтобы гарантировать получение малых капсул, и может быть выше, до 250^o C, без риска их разрыва. Температура около 180 - 240^oC, предпочтительно, около 210 - 230^oC и, наиболее предпочтительно, около 220^oC, является оптимальной, по меньшей мере, для альбумина. Поскольку температура газа, с которым сталкивается аэрозоль, зависит также от скорости доставки аэрозоля и от содержания жидкости в белковом препарате, температуру при выпуске можно отслеживать для того, чтобы гарантировать адекватную температуру в камере. Было установлено, что подходящая температура при выпуске составляет 40 - 150^oC. Было также установлено, что регулирование скорости потока пригодно для регулирования других параметров, таких как количество интактных полых частиц.

Микрокапсулы обычно включают 96 - 98% мономерного ЧСА.

Более конкретно, микрочастицы настоящего изобретения, предпочтительно, имеют максимальный межквартильный размах 3 мкм, более предпочтительно, 2 мкм, и, наиболее предпочтительно, 1,5 мкм, соответственно их среднемассовому размеру частиц. Среднемассовый диаметр частиц определяли с помощью счетчика Coulter с конверсией в распределение по объемам-размерам. Это достигается путем сушки распылением, при котором существует сочетание низкой скорости потока сырьевого раствора с высокими уровнями автоматизации и высушивающего воздуха. Эффект заключается в выработке микрокапсул весьма определенного размера и узкого распределения по размерам.

Несколько сотрудников вывели уравнение для определения среднего размера клеток при использовании пневматических форсунок; простая версия различных параметров, которые влияют на средний размер капелек, выглядит следующим образом:
D = A/(V² • d)^a + B • (M_воздух/M_{жидкость} )^-b,
где D - средний размер капелек;
A - константа, связанная с конструкцией форсунки;
B - константа, связанная с вязкостью жидкости;
V - относительная скорость воздуха между жидкостью и форсункой;
d - плотность воздуха;
M_воздух и M_{жидкость} = масса потока воздуха и жидкости;
a и b - константы, связанные с конструкцией форсунки.

Очевидно, при любой конструкции форсунки на размер капелек в наибольшей степени влияет относительная скорость на форсунке и одновременно соотношение масс воздуха и жидкости. Для наиболее общего применения с целью сушки, отношение воздуха к жидкости находится в пределах 0,1 - 10, и при этих соотношениях средний размер капелек оказывается равным 15 - 20 мкм. Для изготовления микрочастиц в диапазоне размеров, указанном в настоящем документе, мы использовали соотношение воздуха и жидкости в пределах 20 - 1000 : 1. Эффект заключается в изготовлении частиц при высоких соотношениях, которые являются крайне малыми в сравнительных стандартах, с очень узкими распределениями по размерам. Для микрочастиц, изготовленных при более низких соотношениях воздуха и жидкости, их размер получается немного больше, но они все же, тем не менее, имеют узкие распределения по размерам, превосходящие таковые у микрочастиц, изготовленных посредством эмульсионных технологий.

Количество добавленного активного компонента не является важным; микрочастицы могут включать, по меньшей мере, 50, более предпочтительно, 70 или 80 и, наиболее предпочтительно, 90 вес.% ЧСА или носителя из другого материала. Для использования в ингаляторе микрочастицы можно помещать в композицию с обычным наполнителем, таким как лактоза или глюкоза.

Микрочастицы могут включать терапевтический агент и носитель или соединение, которое само по себе является терапевтически активным. Количество активного компонента следует выбирать, принимая во внимание его природу и активность, способ введения и другие факторы, известные специалистам в данной области. Только для примера: количество вводимых частиц может быть таким, чтобы доставлять 100 мг/день α-lантитрипсина или 0,1 г/день активного материала, такого как беклометазон.

Активный компонент может представлять из себя, например, диагностическое вещество или классический фармацевтический объект, который может быть связан или не связан, ковалентно или другим способом, с материалом-носителем. Терапевтический агент может представлять из себя белковый материал, такой как инсулин, паратиреоидный гормон, кальцитонин или подобный ему биологически активный пептид, альбутерол, салицилат, напроксен, аугментин или цитотоксический агент. Для экспериментальных целей может быть включен маркер, такой как лизин-флуоресцеин.

Микрочастицы настоящего изобретения могут включать, помимо терапевтического или диагностического агента, антагонист или связывающий рецепторы компонент. Например, в молекулярный носитель можно включать сахар или другую молекулу, имея в виду направленное введение связанного с носителем лекарства к данному рецептору на альвеолах или далее.

ЧСА в настоящем документе используется как иллюстрирующий пример водорастворимых материалов-носитиелей для использования в настоящем изобретении. Другие материалы, которые можно использовать, включают простые и сложные углеводы, простые и сложные амино- или полиаминокислоты, жирные кислоты или сложные эфиры жирных кислот и натуральные или рекомбинантные человеческие белки или их фрагменты или короткие формы.

Настоящее изобретение позволяет манипулировать природой сухих микрокапсул, чтобы оптимизировать свойства потока или носителя путем изменения и уменьшения сил когезии и адгезии внутри препарата микрочастиц. Например, если потребуется, можно изготавливать микрокапсулы, которые заранее будут нести положительный или отрицательный заряд, путем использования высокозаряженных мономерных или полимерных материалов, например лизина, или полилизина и глутамина, или полиглутамата в системах без ЧСА, или гетерогенных системах, включающих ЧСА и активные компоненты.

Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является сушка совместным распылением активного компонента и ЧСА, имеющая целью облегчение стабилизации активного компонента во время изготовления композиции, упаковки и, что более важно, во время пребывания на альвеолярном эпителии. В этой среде может быть высокая протеолитическая активность. В то время как для защиты лекарств пептидной природы можно использовать ингибиторы протеаз, вполне могут существовать и противопоказания к такому подходу. Используя ЧСА, как в качестве наполнителя, так и в качестве носителя, можно попробовать большое количество альтернативных веществ, на которые могут действовать местно активные протеазы. Еще одним преимуществом является то, что поскольку ЧСА, как было установлено, проходит через альвеолярный барьер, посредством трансклеточных механизмов, опосредованных или не опосредованных рецепторами, его можно использовать в качестве носителя для облегчения прохождения активного компонента через эпителиальную выстилку.

В еще одном варианте осуществления, активный компонент перед сушкой распылением может быть ковалентно связан с ЧСА через посредство расщепляемых связей. Этот вариант осуществления представляет из себя способ переноса активных компонентов на всем пути от устройства до кровотока и, возможно, к мишеням внутри тела. Формирование частиц, имеющих оптимальный аэродинамический размер, означает, что "физический" носитель доставляет активный компонент к участку, на котором происходит его всасывание. Отложившись на альвеолах, "молекулярный" носитель затем защищает активный компонент и облегчает его происхождение в кровоток и, оказавшись в кровотоке, может дополнительно увеличить период полужизни в циркуляции и даже направлять активный компонент к определенным участкам внутри тела с помощью опосредованных рецепторами явлений.

Удобная технология связывающих агентов описана в WO-A-9317713 (Rijksuniversiteit Groningen). Описываются чувствительные к эстеразам полиоксикислотные связывающие агенты. Такая технология, примененная для деривации ЧСА перед сушкой распылением, делает возможным изготовление ковалентной системы носителя для доставки лекарств в системную сосудистую сеть. В этом случае используется способность ЧСА переходить через альвеолы для переноса лекарств в течение длительного периода времени, в то же время защищая потенциально нестабильные объекты.

Несмотря на то, что активным компонентом, который используют в настоящем изобретении, можно пропитывать микрочастицы или каким-либо другим способом присоединять его к ним после их изготовления, предпочтительно соединять его в композиции с ЧСА. Микрочастицы могут быть покрыты, по крайней мере, частично гидрофобным или не растворимым в воде материалом, таким как жирная кислота, чтобы понизить скорость их растворения и защитить от набухания в водной среде.

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Установку для сушки распылением, которую используют в примерах и которую можно приобрести у компании A/S Niro Atomizer, Soeborg, Дания, под торговым наименованием "Mobile Minor", детально описывают в WO-A-9218164.

Пример 1
20%-ный раствор стерильного апирогенного ЧСА в апирогенной воде (для инъекций) прокачивали через форсунку двухпоточного атомизатора, смонтированного на коммерческой установке для сушки распылением, описанной выше. Скорость перестальтического насоса поддерживали на уровне, приблизительно, 10 мл/мин, таким образом, чтобы при температуре воздуха при впуске 220^oC, температура воздуха при выпуске сохранялась на уровне 95^oC.

Сжатый воздух подавался на двухпоточную распыляющую форсунку под давлением 2,0 - 6,0 бар (2,0 - 6,0 • 10⁵ Па). При таком режиме получаются микрокапсулы со средним размером 4,25 - 6,2 мкм.

В типичном случае увеличение среднего размера частиц (путем понижения давления атомизации) ведет к увеличению количества микрокапсул с размером, превышающим 10 мкм (смотри таблицу 1).

При описанных выше условиях, т. е. на первом этапе примера 1 WO-A-9218164, при давлении в форсунке 7,5 бар, мы получали микрочастицы размером 4,7 мкм. Эти растворимые микрочастицы были гладкими и сферическими при содержании частиц с размером, превышающим 6 мкм, менее 1%. Эти микрочастицы растворяли в водной среде и определяли молекулярный вес ЧСА посредством гель-хроматографии. Полученные хроматограммы для ЧСА до и после сушки ЧСА распылением были практически одинаковы. Дополнительный анализ ЧСА до и после сушки распылением посредством триптического пептидного картирования с помощью ЖХВР показал отсутствие заметных различий высвобожденных пептидов. Оба анализа показали, что при условиях сушки распылением, описанных для получения микрочастиц размером 4,7 мкм, структуре белка мало или вовсе не наносится повреждений.

Пример 2
Альфа-1 антитрипсин, выделенный из сыворотки человека, высушивали распылением при условии, подобных условиям примера 1, с температурой впуска 150^oC и температурой выпуска 80^oC. Остальные условия сушки были те же, что в примере 1. Изготовленные растворимые микрочастицы имели средний размер 4,5 мкм. Эти микрочастицы растворяли в водной среде и анализировали на предмет удерживания структуры белка и нормальной ингибирующей трипсин активности, а затем сравнивали с оригинальными лиофилизированным исходным материалом. Анализ посредством гель-хроматографии, хроматографии с обращенной фазой и капиллярного электрофореза показал, что после сушки распылением не наблюдалось значительных структурных изменений. Анализ ингибирующей активности (таблица 2) показал, что в пределах ошибки эксперимента достигалось полностью сохранение ингибирующей активности.

Пример 3
С помощью общего способа пример 1 были изготовлены микрокапсулы, состоящие из алкогольдегидрогеназы (АДГ) и лактозы (АДГ 0,1 вес.%, лактозы 99,9 вес. %). Мы установили, что для достижения максимального сохранения активности фермента требуется оптимизация этапа сушки распыления. Применялись общие условия примера 1, но изменялась температура при впуске и выпуске для получения условий, которые позволили изготавливать микрочастицы желаемого размера (4 - 5 мкм), полностью сохраняемые активность после сушки и повторного растворения в водной среде. Процент сохраненной активности по сравнению с оригинальным материалом для каждого условия сушки распылением показан в таблице 3. Микрокапсулы были гладкими и сферическими и содержали воздух, о чем свидетельствовал их внешний вид в дефенилксилоле (ДФК) при световой микроскопии.

Пример 4
Для изучения влияния скорости подачи жидкого сырья на выход интактных сферических частиц была выполнена серия экспериментов при условиях, описанных в примере 1. Мы установили, что используя способность содержащих газ микрочастиц отражать ультразвук, можно определить оптимальные условия для максимального увеличения выхода интактных гладких сферических микрокапсул. Микрокапсулы, полученные после сушки распылением, фиксировали нагреванием, чтобы сделать их нерастворимыми, а затем суспендировали в воде для замера эхо-сигнала. Мы установили, что увеличение скорости подачи жидкого сырья уменьшает количество интактных микрочастиц, первоначально сформированных при сушке распылением (таблица 4). Средний размер частиц и общая устойчивость к давлению, т. е. толщина стенок, не изменялась, однако изменялась общая эхогенность, по мере возрастания скорости потока жидкости с 4 до 16 мл/мин. Мы установили, что более медленное испарение (при более высоких скоростях потока жидкости) ведет к уменьшению количества получаемых интактных сферических частиц.

Это исследование проводили путем ресуспендирования фиксированных нагреванием микрочастиц при концентрации 1 • 10⁶ мл в 350 мл воды. Этот раствор медленно перемешивали в 500 мл химическом стакане, над которым был установлен ультразвуковой зонд 3,5 МГц, соединенный с медицинской установкой для получения ультразвукового изображения Sonus 1000. Поступавшая ультразвуковая картинка улавливалась анализатором и сравнивалась с водой, служившей контролем, для получения единиц видеоплотности эхо-сигнала. Это исследование можно также адаптировать для изучения устойчивости к давлению, путем оценки эхо-сигнала до и после воздействия на образцы циклических подъемов давления, прикладываемых к маточному раствору частиц. Этот анализ отличает неполные частицы, которые после повторного растворения выпускают воздух, от полностью сферических частиц, которые "инкапсулируют" воздух внутри оболочки. Неполные частицы не демонстрируют устойчивости к давлению немедленно теряют способность отражать ультразвук. Ответ на дозу для фиксированных альбуминовых частиц примера 1 составляет, приблизительно, 5, 9, 13, 20, 22 и 24 ЕД видеоплотности (интенсивность обратного рассеяния) при концентрациях микрокапсул, соответственно, 0,25, 0,5 1, 2, 3 и 4 • 10⁶ на мл.

Пример 5
Для уменьшения размеров частиц и сужения распределения по разным размерам был проведен важный эксперимент. Этот эксперимент служил целям эффективного повышения содержания газа в эхоконтактном агенте и уменьшения количества частиц, превышающих нужные размеры. Этот опыт также полезен для создания композиций, предназначенных для введения в дыхательные пути тем, что он увеличивает до максимума потенциальное количество подходящих для вдыхания частиц в диапазоне размеров 1 - 5 мкг и независимо производит больше гладких частиц, которые являются менее когезионными по сравнению с несферическими частицами такого же размера.

Мы установили, что возможно уменьшение размеров частиц путем снижения содержания растворенных веществ в сырьевом растворе. Этот эффект частично опосредуется влиянием вязкости на образование капелек. Однако мы установили также, что снижение содержания растворенных веществ при тех же условиях, которые мы применяли, ведет к значительному уменьшению количества интактных частиц. В дополнительных экспериментах мы обнаружили, что инкорпорация в сырьевой раствор смешивающихся с водой летучих растворителей повышает скорость образования оболочки при сушке с сопутствующим увеличением количества интактных частиц или полых частиц (таблица 5). Оценку пустотелости микрокапсул производили с помощью определения под микроскопом количества частиц, всплывающих к поверхности покровного стекла в гемоцитометре, и сравнения его с количеством частиц, определенном подсчетом на Coulter.

Пример 6
Для изготовления гладких сферических растворимых микрочастиц использовался ряд материалов. Этот ряд включает инертные материалы, такие как ЧСА, лактоза, маннитол, альгинат натрия; активные материалы, такие как α-l-антитрипсин, и смеси активного материала и инертного носителя, такие как лактоза/алкогольдегидрогеназа, лактоза/будесонид, ЧСА/сальбутамол. Во всех случаях были получены гладкие, сферические, содержащие газ частицы.

Мы оценивали успешность процесса в сохранении контроля над строением частиц. Эти частицы суспендировали в пропаноле, а затем изучались под микроскопом. Частицы, которые содержат газ, имеют интенсивно белое ядро, окруженное интактным черным ободком, в то время как разрушенные или плохо сформированные частицы выглядят как "призраки". Микроскопическая
оценка следующих микрочастиц иллюстрирует ряд материалов и активных компонентов, которые можно высушивать для изготовления гладких сферических частиц:
ЧСА
казеин
гемоглобин
лактоза
АДГ/лактоза
ЧСА/пероксидаза
лактоза/сальбутамол
лактоза/будесонид
Пример 7
Лактозу и будесонид высушивали распылением при условиях, описанных в нижеприведенной таблице (таблица 6).

Полученный сухой порошок смешивали с наполнителем лактозой в мешалке типа V в пропорциях, перечисленных в таблице 7. Смеси затем помещали в желатиновые капсулы и выгружали из Rotahaler^TM в двухступенчатый импинжер, работавший в режиме 60 л/мин. Пригодную для вдыхания фракцию рассчитывали как процентную долю, отложившуюся в нижней камере.

Для получения пригодных для вдыхания фракций значительно превосходят долю таких фракций в измельченном продукте, который используется в настоящее время в этом устройстве, которая обычно находится в пределах максимум 10 - 20%.

Композиции будесонид/лактоза, детализированные в примере 7, испытывались в экспериментальном питаемом самотеком многодозовом ИСП. Изучаемыми параметрами являлись изменение выбрасываемой дозы после 30 нажатий и пригодная для вдыхания фракция в четырехступенчатом импинжерном устройстве. Результаты представлены в таблице 8.

Для современных устройств ИСП предварительная рекомендация фармокопеи США составляет менее 25% изменения выброшенной дозы. Очевидно, что все испытанные нами композиции удовлетворяют этим требованиям, в случаях композиций 1 и 2 эти параметры значительно меньше современных ограничений.

Пример 8
Для снижения скорости растворения растворимых микрокапсул, как описано в предыдущих примерах, микрокапсулы можно покрывать жирными кислотами, такими как пальмитиновая или бегеновая кислоты. На растворимые микрокапсулы примера 1 было нанесено покрытие путем суспендирования смеси растворимых ЧСА микрокапсул и глюкозы (50 вес.%) в этаноловом растворе, содержащем 10% пальмитиновой или бегеновой кислоты. Раствор выпаривали, а полученный плотный остаток смывали, пропуская через мельницу Fritsch.

Эффективность покрытия оценивали непрямым методом, выведенным из наших предыдущих ультразвуковых исследований. Ультразвуковую картинку получали с химического стакана с водой, содержащего 1 • 10⁶ микрокапсул/мл, с помощью ультразвуковой машины HP Sonus 1000, соединенной с анализатором изображений. В течение всего времени измеряли видеоинтенсивность по сравнению с контрольными замерами (ED видеоплотности) (таблица 9).

Микрокапсулы без покрытия быстро теряли весь воздух и, следовательно, способность отражать ультразвук. Однако микрокапсулы с покрытием сохраняли свою структуру более продолжительное время и, таким образом, демонстрировали продолжительный сигнал в течение нескольких минут.

Пример 9
Растворимые микрокапсулы из маннитола были изготовлены, как описано в примере 1 (сырье для сушки распылением - 15%-ный водный раствор маннитола), и покрыты или пальмитиновой или бегеновой кислотой, как описано в примере 8. Образец каждого вида суспендировали в воде и измеряли его эхогенность. Через десять минут после первого анализа вновь измеряли эхогенность суспендированных образцов (таблица 10).

Пример 10
Растворимые микрокапсулы с модельным активным соединением (лизин-флуоресцеин), содержавшимся в матриксе, изготавливали, чтобы сделать возможным получение "активного" соединения в форме высокотекучего сухого порошка. При растворении микрокапсул активное соединение высвобождалось в своей нативной форме.

При использовании лизина в качестве модельного соединения молекулы его метили флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ), чтобы за соединением можно было наблюдать во время приготовления растворимых микрокапсул и во время последующего его высвобождения при растворении.

3 г лизина добавляли к ФИТЦ (общее количество 0,5 г) в карбонатном буфере. После инкубации при 30^oC в течение часа полученный раствор анализировали на наличие аддукта ФИТЦ/лизин с помощью тонкослойной хроматографии. Последняя показала наличие стабильного аддукта ФИТЦ/лизин.

Аддукт ФИТЦ/лизин перемешивали со 143 мл 25% этанолом, содержавшим 100 мг/мл ЧСА для получения сырья для сушки распылением. Условия сушки распылением, которые использовались для получения микрокапсул, подробно описаны в таблице 11. Мы обнаружили, что в отсутствии этанола лишь малая доля частиц имеет гладкую сферическую структуру.

В результате процесса сушки распылением было получено 17,21 г микрокапсул, которые не растворялись при ресуспендировании образца в этаноле. Более того, не наблюдалось высвобождение аддукта ФИТЦ/лизин. Однако при добавлении к микрокапсулам, суспендированным в этаноле, 10 мл воды микрокапсулы растворились, и ФИТЦ/лизин высвободился. Анализ аддукта с помощью тонкослойной хроматографии перед инкорпорированием в микрокапсулы и после высвобождения из микрокапсул при растворении показал, что модельное соединение не претерпело изменений.

Размеры растворимых микрокапсул определяли в неводной системе тиоцианата аммония и пропан-2-ола с помощью Multisizer II (Coulter Electronics). Микрокапсулы имели средние размеры 3,28 • 0,6 мкм, и 90% массы находилось в пределах 2 - 5 мкм.

Микрокапсулы смешивали с глюкозой (50% (вес./об.) микрокапсул: 50% (вес. /об. ) глюкозы) и смесь смалывали, трижды пропуская через мельницу Fritsch. Когда образец порошка добавляли к воде, ФИТЦ/лизин, как определяли анализом ТСХ, сравнивая с его оригинальной формой, высвобождался интактным. Этот пример демонстрирует осуществимость изготовления аминокислотной или пептидной композиции, включающей ЧСА, которая может быть использована в композициях, предназначенных для вдыхания.

Пример 11
500 мг беклометазона растворяли в этаноле, добавляли к 50 мл сырьевого раствора ЧСА (10% вес./об.) и высушивали распылением при условиях, описанных в примере 10. Размеры микрокапсул, полученных этим способом, определяли в неводной системе, как подробно описано в примере 10. Микрокапсулы имели средние размеры 3,13 ± 0,71 мкм, и 90% массы находилось в пределах 2 - 5 мкм.

Беклометазон экстрагировали из микрокапсул путем осаждения ЧСА в 10% трихлоруксусной кислоте, а супернатант экстрагировали этанолом. Экстракт в этаноле анализировали посредством ЖХВР на длине волны 242 нм. Обнаруженный в этом экстракте беклометазон присутствовал в свободном состоянии, но когда экстрагировали альбуминовый осадок, то обнаружили присутствие беклометазона, соединенного с нативным ЧСА. Было установлено, что, несмотря на то, что наибольшая часть активного соединения находилась в свободном состоянии, некоторая часть присутствовала в связанном с альбумином состоянии. Поскольку альбумин очень медленно проникает в кровоток, это позволяет осуществить контроль над высвобождением активного соединения в течение продолжительного периода времени по сравнению с несвязанным лекарством.

Пример 12
В то время, как, по меньшей мере, в примерах 10 и 11, любое связывание активных соединений являлось следствием природных свойств альбумина, в этом примере получают продукт после первоначального поперечного связывания активного соединения, перед сушкой распылением.

К раствору метотрексата 10 мг/мл добавляли 25 мг карбодиимида (EDCI). Этот раствор перемешивали в течение 4 часов для инициирования и гарантии полной активации метотрексата. К активированному лекарству добавляли 50 мг ЧСА и перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Метотрексат химически связывался с ЧСА через аминогруппы альбумина. Этот конъюгат затем использовали как сырье для сушки распылением, как подробно описано в примере 10.

Из полученных таким способом микрокапсул отбирали образцы, определяли их характеристики и анализировали на содержание лекарства. Микрокапсулы имели средние размеры 3,2 ± 0, 6 мкм, и 90% массы находилось в пределах 2 - 5 мкм. Анализ содержания лекарства в микрокапсулах показал, что микрокапсулы не высвободили лекарство; даже после растворения лекарство все еще оставалось связанным с ЧСА. Расщепление альбумина протеиназой K высвобождало связанное лекарство, которое, как было показано, было присоединено лишь к ограниченному количеству аминокислот и малых пептидов. Ранее было показано, что активность доксорубицина, присоединенного к полимерным носителям, оказывает благоприятное действие на опухоли, демонстрирующие фенотип, устойчивый ко многим лекарственным средствам.

Пример 13
Микрокапсулы из напроксена были изготовлены, так как подробно описано в примерах 10 и 12, с использованием соотношения лекарства к ЧСА от 1 до 5.

Растворимые микрокапсулы сохраняли активное соединение неводного растворителя. Более того, при растворении микрокапсул в водном растворе активное соединение оставалось связанным с альбумином, что подтверждается анализом посредством ЖХВР на длине волны 262 нм, как и ранее.

Напроксен высвобождался из альбумина при расщеплении протеиназой K и эстеразой.

Пример 14
Используя образцы микрокапсул, изготовленных в примерах 8-13, оценивали их поведение в ингаляторе, распыляющем сухой порошок. Воспроизводимость дозирования каждой композиции оценивали в совокупности с поведением образца при распылении с помощью микроскопической техники.

Образец каждой композиции добавляли в резервуарную воронку экспериментального ингалятора, распыляющего сухой порошок (ИСП). В этом ингаляторе с сухим порошком использовали сжатый воздух для проталкивания порошка в дозирующее устройство. Это дозирующее устройство калибровали с помощью высушенной распылением лактозы.

Несмотря на то, что количества, отмеряемые в дозирующее устройство, у разных образцов изменялись, как функция от их композиции, воспроизводимость дозирования для каждого образца была постоянной; средняя величина для трех доз составляла 5,0 ± 0,25 мг. Поведение образцов при распылении изучали путем подсоединения ингалятора к вакуумной камере; имитация ингаляции достигалась высвобождением вакуума через ИСП, а сбор выпущенной дозы осуществлялся на предметное стекло, покрытое смолой. Эти предметные стекла оценивали на дисперсию частиц. Они продемонстрировали, что ИСП дезаггломерировал образцы, образуя равномерную дисперсию микрочастиц на предметных стеклах.

Пример 15
Характеристики сухих порошковых композиций примеров 10 - 13 анализировали с помощью сдвоенного импинжера (Apparatus A для ингаляций под давлением, Британская фармокопея 1988) после выгрузки из Rotahaler (Glaxo UK), с 7 мл в ступени 1 и 30 мл в ступени 2 дистиллированной воды. Композиции доставлялись из желатиновых капсул N 3 с помощью Rotahaler, подсоединенного к сдвоенному импинжеру посредством резинового переходника. Вакуумный насос работал в режиме 60 л/мин на два 3-секундных выброса. Анализировалось то количество каждого из образцов, которое достигало уровня ступени 1 и 2 импинжера. Все образцы показали наибольшую часть отложения на ступени 2 импинжера, что указывало на оптимальный для доставки в альвеолы размер частиц.

Пример 16
Было проведено сравнение дозирования и отложения фиксированных нерастворимых микрокапсул и растворимых микрокапсул, полученных, как описано в примере 10, на легких кроликов.

Под наркозом новозеландским белым кроликам вводили растворимые микрокапсулы или фиксированные микрокапсулы. Дозирование осуществлялось с помощью управляемого компьютером аэрозольного ингалятора (Mumed Ltd., UK). Растворимые микрокапсулы суспендировали в CFC 11, а фиксированные частицы суспендировали в воде. После введения дозы легкие кроликов удаляли и оценивали отложение капсул.

Было установлено, что фиксированные капсулы оставались интактными в альвеолярной ткани легких. Это свидетельствует о том, что микрокапсулы имеют подходящий для дисперсии в легких размер. Для сравнения, не было обнаружено наличия интактных растворимых микрокапсул; эти капсулы растворились в жидкостях легкого. Тем не менее, при использовании флюоресцентной микроскопии наблюдалось присутствие аддукта ФИТЦ/лизин в некоторой части альвеолярной ткани. Помимо этого, наличие аддукта было также обнаружено в крови и моче животных, в противоположность фиксированным капсулам, которых там не оказалось.

Реферат

Изобретение относится к медицине. Микрочастицы из водорастворимого материала, которые являются гладкими и сферическими, и, по меньшей мере, 90% которых имеют среднемассовый размер частиц 1 - 10 мкм, которые несут терапевтический или диагностический агент, или используют такой агент в качестве водорастворимого материала, могут успешно применяться в ингаляторах, распыляющих сухой порошок, для доставки указанного агента. Предлагаемые частицы осуществляют более эффективную доставку лекарственных и диагностических средств в альвеолы. 5 с. и 14 з.п. ф-лы, 11 табл.

Формула