Тонкодисперсный инсулин, тонкодисперсные аналоги инсулина и способы их промышленного получения - RU2694063C2
Код документа: RU2694063C2
Чертежи
Описание
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущества на основании предварительной заявки США № 62/022026, поданной в Бюро по патентам и товарным знакам США 8 июля 2014 года, содержание которой полностью включено в данный документ в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Варианты осуществления настоящего изобретения в целом относятся к легочной доставке человеческого инсулина и/или аналога человеческого инсулина, а также к способу получения тонкодисперсного человеческого инсулина и/или аналога человеческого инсулина для легочной доставки. Аспекты вариантов осуществления настоящего изобретения также относятся в целом к композициям, содержащим тонкодисперсный человеческий инсулин, и/или тонкодисперсный аналог человеческого инсулина, обладающий улучшенными характеристиками частиц.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Все больше внимания уделяется легочной абсорбции как способу неинвазивного введения и системной доставки терапевтических средств (в основном пептидов и белков), поскольку легкие характеризуются большой площадью абсорбирующей поверхности (до 100 м2), наличием очень тонких или предельно тонких абсорбирующих мукозальных мембран (например, толщиной примерно 0,1 мкм - 0,2 мкм) и хорошим кровоснабжением. Очень тонкий альвеолярно-капиллярный и бронхиально-капиллярный барьер на поверхности легких обеспечивает быстрое проникновение частиц человеческого инсулина в кровоток индивидуума, со скоростью, подобной той, которая достигается при использовании быстродействующего аналога человеческого инсулина, представляющего собой измененную форму человеческого инсулина, отличную от встречающегося в природе человеческого инсулина, но функционирующую в организме человека подобно человеческому инсулину, хотя и с большей эффективностью в отношении гликемического контроля.
Инсулинсодержащие композиции можно вводить подкожно или внутривенно. Вдыхаемый инсулин обладает такой же эффективностью, как и вводимый путем инъекции инсулин короткого действия. Технология легочной доставки разработана так, чтобы вдыхаемый инсулин мог эффективно достигать легочных капилляров, в которых он абсорбируется.
Человеческие легочные дыхательные пути содержат бронхиолы, которые являются непроницаемыми для инсулина, а также альвеолы. Вдыхаемый инсулин может абсорбироваться через альвеолы и проникать в кровоток. Вдыхаемые противоастматические средства откладываются до достижения альвеол. Путем медленных и равномерных вдохов с использованием устройств частицы человеческого инсулина можно доставлять в альвеолы, где человеческий инсулин может высвобождаться в кровоток.
Вдыхаемый человеческий инсулин можно использовать для доставки инсулина перед едой людям с диабетом типа I и/или II. Данный способ введения также может облегчить раннее применение инсулиновой терапии у людей, отвергающих инъекции инсулина вследствие таких реакций, как воспаление, появление синяков, беспокойство и т.п.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения способ получения ингаляционной формы человеческого инсулина, подходящей для легочной доставки, включает в себя: растворение сырьевого инсулина в кислом растворе с получением раствора человеческого инсулина; титрование раствора инсулина буферным раствором с получением суспензии, содержащей тонкодисперсные частицы инсулина; и стабилизацию тонкодисперсных частиц инсулина.
Кислый раствор может содержать воду, органический растворитель или их смесь.
Кислый раствор может содержать органический растворитель в количестве от 10 до 90 об. % по отношению к общему объему кислого раствора.
Кислый раствор может содержать органический растворитель в количестве, варьирующем от более 0 до 90 об. % по отношению к общему объему кислого раствора.
Органический растворитель может содержать спирт.
В качестве спирта можно использовать метанол, этанол или их смесь.
Буферный раствор может иметь pH от 3 до 10.
Стабилизация тонкодисперсных частиц инсулина может включать в себя добавление к суспензии стабилизирующего средства.
Стабилизирующее средство может иметь нейтральный pH и может смешиваться с водой.
Стабилизирующее средство может содержать спирт, кетон, или их смесь.
Стабилизация может повышать выход тонкодисперсных частиц инсулина.
Тонкодисперсные частицы инсулина можно получить при pH от 3 до 9.
Тонкодисперсные частицы инсулина можно получить при pH от 4,5 до 7,5.
Тонкодисперсные частицы инсулина могут содержать практически сферические частицы со среднеобъемным диаметром примерно от 1,2 до 2 мкм.
Тонкодисперсные частицы инсулина могут содержать до 99 об. % частиц размером менее 5 мкм, по отношению к общему объему тонкодисперсных частиц инсулина.
Кислый раствор может иметь pH в диапазоне от 1,0 до 3,0. Например, кислый раствор может иметь pH в диапазоне от 1,8 до 2,2.
Кислый раствор может иметь pH, примерно равный 2, и может содержать воду и органический растворитель, такой как метанол, этанол, или их смесь, содержание которого может составлять от 10 об. % до 90 об. % по отношению к общему объему кислого раствора.
Тонкодисперсные частицы инсулина могут быть практически сферическими по форме и могут иметь размер менее 5 мкм.
Тонкодисперсные частицы инсулина могут содержать такой инсулин, как человеческий инсулин, животный инсулин, аналог инсулина, или их смесь.
Аналог инсулина может представлять собой инсулин аспарт, инсулин гларгин, или их смесь.
Процедуры растворения, титрования и/или стабилизации можно проводить при комнатной температуре.
Сырьевой инсулин может включать в себя кристаллический инсулин, такой как кристаллический человеческий инсулин, кристаллический животный инсулин, кристаллический аналог инсулина, или их смесь.
Кристаллический аналог инсулина может представлять собой кристаллический инсулин аспарт, кристаллический инсулин гларгин, или их смесь.
В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, тонкодисперсные частицы инсулина представляют собой практически сферические частицы, содержащие инсулин, выбранный из группы, состоящей из человеческого инсулина, животного инсулина, аналога инсулина и их смеси.
Практически сферические частицы могут иметь среднеобъемный диаметр примерно от 1,2 до 2 мкм.
Содержание практически сферических частиц размером менее 5 мкм может составлять до 99 об. % по отношению к общему объему тонкодисперсных частиц инсулина.
Аналог инсулина может представлять собой инсулин аспарт, инсулин гларгин, или их смесь.
Вышеприведенное описание вариантов осуществления настоящего изобретения не является исчерпывающей информацией о сущности изобретения, поскольку другие подходящие аспекты настоящего изобретения могут стать очевидными для специалиста в данной области на основании нижеследующего подробного описания, используемого отдельно или в сочетании с прилагающимися чертежами и таблицами, в которых демонстрируется один или несколько вариантов осуществления настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Прилагающиеся чертежи наряду с описанием иллюстрируют варианты осуществления настоящего изобретения, и, вместе с описанием, служат для разъяснения принципов настоящего изобретения.
На фиг. 1 приведена блок-схема, иллюстрирующая вариант осуществления способа получения тонкодисперсного инсулина и/или аналога инсулина.
На фиг. 2 приведено полученное методом сканирующей электронной микроскопии (SEM) изображение частиц тонкодисперсного человеческого инсулина, полученных в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 3 приведен график, иллюстрирующий распределение по размеру частиц тонкодисперсного человеческого инсулина, полученных в соответствии с вариантом осуществления, приведенным на фиг. 2.
На фиг. 4 приведена диаграмма, демонстрирующая профиль примесей человеческого инсулина до и после микронизации в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 5 приведены результаты анализа растворенных тонкодисперсных частиц инсулина, полученных в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
На фиг. 6 и 7 приведены диаграммы, демонстрирующие результаты исследования частиц человеческого инсулина, полученных в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения и доставляемых из заполненного баллона, с помощью каскадного импактора Андерсена.
На фиг. 8 приведено полученное методом сканирующей электронной микроскопии (SEM) изображение частиц тонкодисперсного инсулина гларгина, полученных в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 9 показаны результаты анализа растворенных частиц тонкодисперсного инсулина гларгина, полученных в соответствии с вариантом осуществления, приведенным на фиг. 8, методом ВЭЖХ.
На фиг. 10 и 11 приведены диаграммы, демонстрирующие результаты исследования частиц инсулина гларгина, полученных в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения и доставляемых из заполненного баллона, с помощью каскадного импактора Андерсена.
На фиг. 12 приведено полученное методом сканирующей электронной микроскопии (SEM) изображение частиц тонкодисперсного инсулина аспарта, полученных в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
На фиг. 13 показаны результаты анализа растворенных частиц тонкодисперсного инсулина аспарта, полученных в соответствии с вариантом осуществления, приведенным на фиг. 12, методом ВЭЖХ.
На фиг. 14 и 15 приведены диаграммы, демонстрирующие результаты исследования частиц инсулина аспарта, полученных в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения и доставляемых из заполненного баллона, с помощью каскадного импактора Андерсена.
На фиг. 16 приведено полученное методом атомной силовой микроскопии (AFM) изображение частиц человеческого инсулина, полученных путем размола на струйной мельнице.
На фиг. 17 приведено полученное методом атомной силовой микроскопии (AFM) изображение тонкодисперсных частиц инсулина, полученных по способу, описанному в примере 2.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Нижеследующее подробное описание предлагается только для иллюстрации некоторых конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения. Альтернативные варианты осуществления, очевидные для специалистов в данной области, также входят в объем настоящего изобретения. В контексте настоящего изобретения термин "инсулин" используется в широком смысле и охватывает все формы инсулина или аналогов инсулина, которые можно использовать для лечения человека или животного. Например, в данном описании термин "инсулин" охватывает природный или синтетический человеческий инсулин, природный или синтетический животный инсулин, и аналоги инсулина (например, инсулин аспарт, инсулин гларгин и т.п.).
Вариант осуществления способа микронизации, обеспечивающего получение подходящих для ингаляции частиц инсулина с целью легочной доставки, включает в себя: растворение сырьевого инсулина (например, кристаллического инсулина и/или кристаллического аналога инсулина) в кислой среде (например, растворение в кислом растворе, облегчающем растворение сырьевого инсулина) с получением раствора инсулина; титрование раствора инсулина буферным раствором с получением суспензии, содержащей тонкодисперсные частицы инсулина; и добавление стабилизирующего средства (такого как органический растворитель и/или сорастворитель) для стабилизации тонкодисперсных частиц инсулина (например, для увеличения выхода тонкодисперсных частиц инсулина перед очисткой и сушкой). Варианты осуществления данного способа, проводимые при комнатной температуре, позволяют избежать или уменьшить применение тепловой обработки и/или механических усилий, используемых в таких способах, как лиофилизация, получение микросфер и размол на струйной мельнице. Некоторые варианты осуществления данного способа проводят без добавления полимера (например, полимерного наполнителя) к кислой среде, содержащей раствор и/или суспензию инсулина.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя способ получения ингаляционной формы инсулина, подходящей для легочной доставки. В вариантах осуществления указанного способа, используя в качестве сырья кристаллический инсулин, размер частиц которого может находиться в миллиметровом диапазоне, получают ингаляционную форму инсулина с размером частиц в микрометровом диапазоне, подходящую для применения в качестве активного фармацевтического ингредиента (API) для легочной доставки и обладающую улучшенными характеристиками, включающими в себя более сферическую форму и повышенную гладкость. Если не указано иначе, в данном описании размер частиц или диаметр частиц (например, среднеобъемный диаметр) измеряют методом лазерной дифракции.
На легочную доставку частиц лекарственного средства влияют их характеристики, такие как размер частиц, форма частиц, поверхностные неровности, растворимость, текучесть и/или т.п. Поскольку ингаляционные формы инсулина и/или аналогов инсулина используют в качестве активного ингредиента лекарственного средства, а не просто пассивного носителя, варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают сохранение, или по существу обеспечивают сохранение биологической активности после микронизации инсулина и аналогов инсулина.
Размер частиц (или аэродинамический диаметр) <5 мкм позволяет ингаляционной форме лекарственного средства абсорбироваться легкими. Частицы с подходящим аэродинамическим диаметром или размером обладают хорошей текучестью и легче диспергируются в нижних дыхательных путях (бронхиальных и альвеолярных участках), в которых абсорбция в кровоток улучшается или оптимизируется посредством альвеолярно-капиллярных поверхностей легких. С другой стороны, частицы лекарственного средства большего размера (например, частицы с аэродинамическим диаметром или размером >5 мкм) в основном улавливаются в верхних дыхательных путях, таких как горло и трахея, в результате инерционного соударения. Частицы большего размера практически не абсорбируются, поскольку они накапливаются в верхних дыхательных путях, в которых отсутствуют тонкие проницаемые капилляры, присутствующие в альвеолах. Накопленные частицы лекарственного средства могут запускать иммунную систему легких и вызывать увеличение числа макрофагов. Стимуляция или избыточная стимуляция макрофагов может приводить к накоплению других воспалительных клеток и, в конечном счете, может вызывать вторичное повреждение ткани, регенерацию и фиброз.
Размер частиц лекарственного средства может играть определяющую роль в легочной доставке. Для получения частиц с диаметром <5 мкм можно использовать ряд одностадийных способов микронизации, таких как сушка распылением и механический размол, которые позволяют уменьшить размер частиц порошкообразного исходного сырьевого инсулина, как правило, находящийся в миллиметровом диапазоне, до микрометрового диапазона, подходящего для легочной доставки.
Однако указанные способы микронизации частиц инсулина проводят с использованием нагревания и/или полимерного наполнителя, что может вызывать агрегацию и уменьшение активности инсулина, а также затруднять фармацевтическое производство. Кроме того, хотя полимерный наполнитель помогает стабилизировать композицию и повышает растворимость в процессе обработки, его применение приводит к появлению трудноудаляемых примесей.
Для преобразования частиц инсулина с размером в миллиметровом диапазоне (например, сырьевого инсулина) в частицы с размером в микрометровом диапазоне можно использовать процесс лиофилизации. Одна из причин применения лиофилизации заключается в том, что получение частиц в диапазоне 1-5 мкм является пределом способности данного метода уменьшать размер. Для повышения стабильности и растворимости в состав композиции также можно ввести полимер (полимеры) в качестве неактивного вещества или наполнителя.
Однако процесс микронизации методом лиофилизации может оказывать вредное воздействие на макромолекулы, такие как молекула инсулина. Например, в процессе лиофилизации молекулу подвергают нагреванию, чтобы обеспечить возгонку воды, а это может привести к конформационному изменению инсулина и даже к денатурации инсулина. Показано, что нагревание и встряхивание инициирует образование фибрилл инсулина.
Кроме того, скорость охлаждения в процессе лиофилизации (политермический процесс) оказывает влияние на размер и форму микрочастиц, однако лиофилизация может вызывать чрезмерное высушивание микрочастиц инсулина, образованных инсулином и полимером, и приводить к снижению химической или физической стабильности. Инсулин в сухом порошкообразном состоянии также более склонен к агрегации.
Также обнаружено, что микрочастицы инсулина образуются в результате растворения кристаллического инсулина при pH, близком к изоэлектрической точке инсулина, если в способе получения микрочастиц инсулина используют полимер. В данном способе можно использовать разные подходящие типы полимеров, такие как полиэтиленгликоль (PEG), поливинилпирролидон (PVP), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), а также механизмы биоадгезии. Добавление полимера к буферному раствору может дополнительно повысить растворимость кристаллического инсулина. Однако добавленный полимер невозможно эффективно и полностью удалить по окончанию процесса. Оставшийся после удаления полимер может снижать эффективность лекарственного средства, повышать токсичность и увеличивать уровень примесей.
Другие способы получения микросфер, содержащих инсулин, включают в себя добавление полимерных носителей, таких как PVP или PEG, способствующих растворению инсулина в кислой среде. Микросферы, получаемые с помощью таких способов, подвергают воздействию относительно высоких температур, которые могут оказывать вредное или повреждающее воздействие на инсулин. По окончанию таких способов для отмывания полимера используют органический растворитель (в котором инсулин плохо растворяется), который может вызывать агломерацию маленьких частиц инсулина. Кроме того, вышеуказанные органические растворители могут вызывать денатурацию молекул инсулина, содержащихся в микросферах, и оказывать токсическое действие после введения людям или животным.
Способы получения микрочастиц инсулина, отличные от вариантов осуществления настоящего изобретения, требуют применения органических растворителей и жестких условий стерилизации. Органические растворители (отличные от растворителей, используемых в настоящем изобретении) могут влиять на чистоту лекарственного средства и оказывать вредное воздействие in vivo, если некоторое количество их остается в микросферах. Кроме того, пористые структуры, образующиеся под влиянием органического растворителя, могут обуславливать неравномерное высвобождение дозы. Стерилизация с помощью термических, химических или радиационных методов может вызывать деградацию полимера и/или лекарственного средства, заключенного в микросферах. Применение стерилизующих растворов также может привести к увеличению примесей.
Препараты, обеспечивающие контролируемое высвобождение инсулина, могут представлять собой микросферы, полученные путем микрокапсулирования (например, в присутствии поверхностно-активного вещества) однородных микрокристаллов инсулина с использованием биоразрушаемых полимерных материалов. Однако такие композиции могут иметь низкое содержание инсулина, например, средняя частица может содержать менее 10% масс/масс инсулина по отношению к общей массе частицы инсулина.
Аспекты вариантов осуществления настоящего изобретения направлены на преодоление вышеуказанных проблем. Вариант осуществления способа промышленного получения ингаляционной формы инсулина или аналога инсулина может включать в себя следующие три (3) стадии:
(1) Растворение сырьевого инсулина (например, кристаллического инсулина или аналога инсулина) в кислой среде, облегчающей растворение сырьевого инсулина, с получением раствора инсулина. Кислая среда может представлять собой кислый раствор. Например, кислая среда может представлять собой кислый раствор, содержащий воду, органический растворитель (например, спирт, такой как метанол) или их смесь.
Свойства инсулина в кислой среде можно использовать для растворения инсулина. В некоторых вариантах осуществления кислая среда, обеспечивающая хорошие условия для растворения, имеет pH примерно от 1,0 до 3,0, например, от 1,8 до 2,2.
(2) Титрование раствора инсулина буферным раствором до достижения состояния суспензии (например, до получения суспензии). Титрование раствора инсулина можно использовать для изменения растворимости инсулина и осаждения инсулина в виде тонкодисперсных частиц инсулина образованием суспензии. Например, изменение pH раствора может оказывать влияние на растворимость инсулина. Инсулин содержит как кислые, так и основные функциональные группы. Аминокислоты (например, их аминогруппы и карбонильные группы), входящие в состав инсулина, могут иметь положительный заряд, отрицательный заряд, или они могут быть нейтральными, причем вместе они составляют общий заряд инсулина. При pH ниже изоэлектрической точки (IEP) инсулин имеет общий положительный заряд, а при pH выше IEP инсулин имеет общий отрицательный заряд. Таким образом, раствор инсулина можно титровать до достижения pH, близкого к значению IEP инсулина, чтобы уменьшить растворимость инсулина, перевести его в твердое состояние и осадить инсулин из раствора в виде мелких или крошечных частиц, имеющих размер в микрометровом диапазоне. По мере осаждения инсулина раствор инсулина превращается из прозрачного или практически прозрачного раствора в мутную беловатую суспензию (например, в суспензию, содержащую тонкодисперсные частицы инсулина).
(3) Стабилизация тонкодисперсных частиц инсулина путем добавления стабилизирующего средства (например, органического растворителя и, необязательно, сорастворителя) с целью увеличения выхода тонкодисперсных частиц инсулина перед очисткой и сушкой.
Для повышения выхода тонкодисперсных частиц инсулина можно добавить стабилизирующее средство (например, органический растворитель и/или сорастворитель). Используемые стабилизирующие средства (например, органический растворитель и, необязательно, сорастворитель), которые могут варьировать в зависимости от типа инсулина, более подробно описаны в нижеследующем разделе.
Аспекты вариантов осуществления настоящего изобретения обеспечивают следующие преимущества: более простые и безопасные способы проведения производственных процессов и/или получения конечных продуктов по сравнению со способами, основанными на применении лиофилизации, полимеров и микросфер; отсутствие необходимости применения полимерного наполнителя (которое может приводить к появлению дополнительных примесей); возможность проведения процесса микронизации при комнатной температуре; отсутствие или по существу отсутствие снижения молекулярной активности инсулина; а также уменьшение агрегации и/или деградации инсулина вследствие дополнительного нагревания.
Варианты осуществления нового способа микронизации инсулина и аналогов инсулина при комнатной температуре с целью легочной доставки в соответствии с настоящим изобретением включают в себя три нижеследующие основные стадии. Первая стадия включает в себя растворение сырьевого инсулина с размером частиц в миллиметровом диапазоне; вторая стадия включает в себя микронизацию (например, осаждение частиц инсулина с превращением раствора, содержащего инсулин, в суспензию, содержащую тонкодисперсные частицы инсулина); третья стадия включает в себя стабилизацию тонкодисперсных частиц инсулина; и четвертая стадия включает в себя отделение частиц инсулина от жидкого раствора. После отделения частиц инсулина от жидкого раствора можно провести промывание, сушку и очистку, чем и завершить вариант осуществления способа промышленного получения ингаляционной формы инсулина или аналога инсулина API.
На первой стадии сырьевой инсулин можно растворить в кислой среде (например, в кислом растворе), содержащей воду и органический растворитель, который является полярным, имеет низкую молекулярную массу и способен смешиваться с водой. Чтобы контролировать исходную растворимость инсулина, в состав раствора можно ввести метанол и/или этанол в количестве до 90 объемных процентов (об. %) по отношению к общему объему раствора. Например, метанол и/или этанол можно ввести в состав кислого раствора в количестве, предпочтительно составляющем примерно 90 об. % (по отношению к общему объему кислого раствора), однако можно использовать любое количество больше 0 и меньше 90 об. %.
Кислый раствор можно поместить на подставку мешалки. Раствор можно перемешивать постоянно, непрерывно или практически непрерывно со скоростью примерно от 40 до 200 оборотов в минуту (об/мин) до тех пор, пока он не станет полностью или почти полностью прозрачным. Применение слишком высокой скорости встряхивания и/или перемешивания может привести к турбулентности и неоднородному перемешиванию, тогда как применение слишком низкой скорости встряхивания и/или перемешивания может привести к образованию частиц инсулина, имеющих нежелательный размер (например, частиц с размером более 5 мкм). Раствор становится прозрачным или практически прозраным, когда инсулин переходит из твердой фазы в жидкую фазу (например, когда инсулин растворяется с образованием раствора инсулина). Растворение инсулина можно проводить в кислой среде.
На второй стадии скорость перемешивания можно уменьшить примерно до 30-100 об/мин, например, до 50-75 об/мин, или 50-60 об/мин. Раствор инсулина титруют или медленно титруют буферным раствором, при этом происходит постепенное осаждение инсулина, сопровождающееся превращением раствора из прозрачного или почти прозрачного в молочно белую суспензию, содержащую тонкодисперсные частицы инсулина.
Инсулин и/или аналог инсулина можно микронизировать при pH от 3 до 9, например при pH от 4,5 до 7,5. Буферный раствор может иметь pH от 3 до 10. Следовательно, суспензия, полученная в результате титрования раствора инсулина, может иметь pH от 3 до 9.
На третьей стадии используют стабилизирующее средство, имеющее нейтральный pH и способное смешиваться с водой. Примерами стабилизирующего средства являются спирт и/или кетон. В качестве спирта можно использовать, например, метанол, этанол, изопропиловый спирт, или их смеси, однако термин спирт не ограничивается указанными соединениями. В качестве кетона можно использовать ацетон, однако термин кетон не ограничивается указанным соединением. Стабилизирующее средство стабилизирует тонкодисперсные частицы инсулина.
Процесс очистки и/или сушки можно проводить после отделения тонкодисперсных частиц инсулина. Можно использовать любой подходящий способ очистки и/или сушки, существующий в данной области и известный рядовым специалистам в соответствующей области техники.
На фиг. 1 приведена блок-схема, иллюстрирующая вариант осуществления способа микронизации инсулина и/или аналога инсулина при комнатной температуре. В соответствии со схемой, приведенной на фиг. 1, вариант осуществления способа 100 микронизации инсулина включает в себя растворение сырьевого инсулина 102, осаждение инсулина с образованием и стабилизацией суспензии 104, и отделение инсулина 106.
Варианты осуществления настоящего изобретения далее описываются со ссылкой на примеры, приведенные в целях иллюстрации. Однако настоящее изобретение не ограничивается описанными здесь примерами.
Пример 1. Получение подходящих для ингаляции частиц инсулина в растворе, содержащем 90 об. % метанола
70 мг биосинтетического человеческого инсулина (рекомбинантный инсулин, поставляемый Sigma-Aldrich) в виде сырьевого порошка растворяют в 7,7 мл кислого раствора, имеющего pH примерно 1,9 и содержащего 90 об. % метанола (остальные 10 об. % составляют вода и HCl) по отношению к общему объему кислого раствора, во флаконе объемом 40 мл. Флакон помещают на подставку мешалки и постоянно перемешивают до тех пор, пока раствор не станет полностью прозрачным, или практически прозрачным, с получением раствора инсулина. Затем перемешивание замедляют (например, до скорости вращения примерно 75 об/мин) и раствор инсулина медленно титруют путем добавления по каплям 1,75 мл 0,1 M буферного раствора ацетата натрия (NaAc), имеющего pH 5,64. Прозрачный раствор инсулина превращается в мутную желтоватую суспензию, содержащую тонкодисперсные частицы инсулина. После окончательного или почти полного завершения титрования к суспензии добавляют примерно 10 мл этанола. Перемешивание продолжают еще 30 минут. Тонкодисперсные частицы инсулина отделяют от супернатанта суспензии в виде твердого вещества, которое дважды промывают этанолом, чтобы удалить метанол и соль. Твердое вещество сушат в вакууме при комнатной температуре.
На фиг. 2 приведено полученное методом сканирующей электронной микроскопии (SEM) изображение ингаляционной формы человеческого инсулина API, полученной по способу, описанному в примере 1. В настоящей заявке все изображения SEM получают с помощью прибора JEOL CarryScope JCM-5700 SEM. На фиг. 3 приведен график, иллюстрирующий распределение по размеру частиц ингаляционной формы инсулина API (тонкодисперсного инсулина), полученной по способу, описанному в примере 1. Результаты, приведенные на фиг. 2 и 3, позволяют сделать вывод, что размеры частиц ингаляционной формы инсулина API (тонкодисперсного инсулина), полученной по способу, описанному в примере 1, подходят для легочной доставки, например, частицы имеют размер < 5 мкм. Например, как можно видеть на фиг. 3, средний размер частиц D50 тонкодисперсного инсулина, полученного по способу примера 1, составляет менее 2 мкм. D50 представляет собой максимальный диаметр частиц, такой, что 50 об. % присутствующих в образце частиц по отношению к общему объему образца имеют меньший диаметр, и 50 об. % присутствующих в образце частиц имеют больший диаметр.
Пример 2. Периодический процесс получения подходящих для ингаляции частиц инсулина в растворе, содержащем 90 об.% метанола
1 грамм биосинтетического порошкообразного человеческого инсулина API (т.е., рекомбинантного инсулина, поставляемого Sigma-Aldrich) растворяют в 110 мл кислого раствора, имеющего pH примерно 1,9 и содержащего 90 об. % метанола (остальные 10 об. % составляют вода и HCl) по отношению к общему объему кислого раствора, в контейнере объемом 400 мл, включающем в себя центробежный смеситель или стержень магнитной мешалки. Полученный раствор перемешивают до тех пор, пока он не станет полностью или почти полностью прозрачным, т.е. до растворения инсулина. Затем перемешивание замедляют (например, до скорости вращения примерно 50 об/мин) и раствор инсулина медленно титруют путем добавления по каплям 25 мл 0,1 M буферного раствора NaAc (имеющего pH 5,64). Прозрачный раствор инсулина превращается в мутную желтоватую суспензию, содержащую тонкодисперсные частицы инсулина. После окончательного или почти полного завершения титрования к суспензии добавляют примерно 135 мл этанола, после чего перемешивание продолжают еще 30 минут.
Тонкодисперсные частицы инсулина отделяют от супернатанта суспензии в виде твердого вещества, которое дважды промывают этанолом, чтобы удалить метанол и соль. Твердое вещество сушат в вакууме при комнатной температуре. Массу продукта используют для расчета степени извлечения. Размер частиц определяют с помощью лазерного дифракционного анализатора размера частиц (т.е., прибора JEOL CarryScope JCM-5700 SEM).
Вышеуказанные процедуры повторяют четыре (4) раза для разных партий тонкодисперсного инсулина.
В таблице 1 показана воспроизводимость значений степени извлечения для четырех (4) партий, полученных по способу, описанному в примере 2. Как можно видеть из таблицы 1, степень извлечения, достигаемая в способе примера 2, превышает 86%.
Таблица 1
В таблице 2 показана воспроизводимость распределения по размеру частиц тонкодисперсного человеческого инсулина, присутствующих в партиях, полученных по способу примера 2. Результаты, приведенные в таблице 2, позволяют сделать вывод, что размеры частиц тонкодисперсного инсулина, полученного по способу, описанному в примере 1, подходят для легочной доставки, например, частицы имеют размер <5 мкм. Например, как можно видеть из таблицы 2, средний размер частиц D50 тонкодисперсного инсулина, полученного по способу примера 2, составляет 1,54 мкм, средний размер частиц D10 составляет 0,75 мкм и средний размер частиц D90 составляет 3,04 мкм, следовательно указанные частицы подходят для легочной доставки. D50 представляет собой максимальный диаметр частиц, такой, что 50 об. % присутствующих в образце частиц по отношению к общему объему образца имеют меньший диаметр, и 50 об. % присутствующих в образце частиц имеют больший диаметр. D10 представляет собой диаметр частиц, такой, что 10 об. % присутствующих в образце частиц по отношению к общему объему образца имеют меньший диаметр. D90 представляет собой диаметр частиц, такой, что 90 об. % присутствующих в образце частиц по отношению к общему объему образца имеют меньший диаметр.
Таблица 2
Химическую стабильность инсулина до и после обработки тестируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в соответствии с главой <621> Фармакопеи США (USP), и с помощью методов USP, используемых для тестирования чистоты при составлении фармакопейной статьи на человеческий инсулин. На фиг. 4 приведена диаграмма, демонстрирующая профиль примесей инсулина до и после микронизации по способу примера 2. Как можно видеть на фиг. 4, статистически значимые изменения в содержании примесей, таких как димеры инсулина, высокомолекулярные белки, дезамидоинсулин A-21 или родственные соединения, в препаратах инсулина после процесса микронизации отсутствуют.
На фиг. 5 приведены результаты анализа растворенных частиц инсулина, полученных по способу, описанному в примере 2, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). На хроматограмме ВЭЖХ, приведенной на фиг. 5, видно, что статистические различия во времени удерживания тонкодисперсного инсулина и исходного сырьевого инсулина отсутствуют. Результаты анализа тонкодисперсных частиц инсулина свидетельствуют о том, что в процессе микронизации химическая природа инсулина сохраняется или по существу сохраняется.
Распределение тонкодисперсных частиц инсулина по размеру определяют с помощью лазерного дифрактометра CUVETTE CUV-50ML/US, Sympatec Gmbh. Тонкодисперсные частицы инсулина анализируют в этанольной среде (в этанольном растворе). Полученные данные свидетельствуют о том, что более 99 об. % частиц по отношению к общему объему частиц имеют размер меньше 5 мкм, а средний среднеобъемный диаметр во всех четырех (4) партиях составляет 1,79 мкм, как показано в таблице 2. Таким образом, тонкодисперсные частицы инсулина могут содержать 99 об. % или более (например, от 99 до 100 об. %) частиц размером менее 5 мкм по отношению к общему объему тонкодисперсных частиц инсулина. В некоторых вариантах осуществления тонкодисперсные частицы инсулина могут содержать до 99 об. % частиц размером менее 5 мкм по отношению к общему объему тонкодисперсных частиц инсулина.
На фиг. 6 приведена диаграмма, демонстрирующая результаты исследования человеческого инсулина (API, полученного по способу, описанному в примере 2) с помощью каскадного импактора Андерсена, где инсулин доставляется из трех дозирующих аэрозольных ингаляторов с использованием такого пропеллента, как 1,1,1,2-тетрафторэтан (HFA 134A), 1,1,1,2,3,3,3,-гептафторпропан (HFA 227), или смесь HFA 134A и HFA 227, соответственно. Дозирующие аэрозольные ингаляторы получают по способу, описанному ниже в примере 11. Результаты, приведенные на фиг. 6, позволяют сделать вывод, что три разных пропеллента (HFA 134A, HFA 227 и смесь HFA 134A и HFA 227) дают сравнимые результаты при использовании в сочетании с тонкодисперсным человеческим инсулином, полученным по способу, описанному в примере 2.
На фиг. 7 также приведена диаграмма, демонстрирующая результаты анализа человеческого инсулина (API, полученного по способу, описанному в примере 2) с помощью каскадного импактора Андерсена, с распределением на три разные стадии, где инсулин доставляется из дозирующих аэрозольных ингаляторов с использованием трех разных пропеллентов (HFA 134a, HFA 227, или смесь HFA 134A и HFA 227, соответственно). Дозирующие аэрозольные ингаляторы получают по способу, описанному ниже в примере 11. Результаты, приведенные на фиг. 7, позволяют сделать вывод, что три разных пропеллента дают сравнимые результаты при использовании в сочетании с тонкодисперсным человеческим инсулином, полученным по способу, описанному в примере 2.
Пример 3. Способ получения подходящих для ингаляции частиц инсулина в растворе, содержащем 100 об. % воды
Подходящие для ингаляции частицы человеческого инсулина получают по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что раствор, содержащий примерно 100 об. % очищенной воды и имеющий pH 2,0 (раствор, содержащий очищенную воду и кислоту в количестве, достаточном для достижения pH 2,0), используют вместо кислого раствора, содержащего 90 об. % метанола, используемого в примере 1. Распределение частиц ингаляционной формы человеческого инсулина по размеру анализируют по способу, описанному в примере 2. Результаты анализа распределения частиц по размеру демонстрируют, что частицы ингаляционной формы человеческого инсулина имеют среднеобъемный диаметр 2,01 мкм. Как указано выше, частицы ингаляционной формы человеческого инсулина, полученные по способу, описанному в примере 1, имеют размер D50 менее 2 мкм, а средний среднеобъемный диаметр частиц во всех 4 партиях ингаляционной формы человеческого инсулина, полученных по способу, описанному в примере 2 (которые также получают с использованием кислого раствора, содержащего 90 об. % метанола), составляет 1,79 мкм. Таким образом, можно видеть, что состав растворителя (содержащего, например, метанол или воду) может оказывать влияние на размер частиц получаемого тонкодисперсного человеческого инсулина.
Пример 4. Способы получения подходящих для ингаляции частиц человеческого инсулина в растворе с низкой концентрацией метанола
Подходящие для ингаляции частицы человеческого инсулина получают по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что кислый раствор, содержащий 50 об. % метанола (остальные 50 об. % составляют вода и HCl) и имеющий pH примерно 2,0, или кислый раствор, содержащий 10 об. % метанола (остальные 90 об. % составляют вода и HCl) по отношению к общему объему кислого раствора, используют вместо кислого раствора, содержащего 90 об. % метанола, используемого для растворения сырьевого человеческого инсулина в примере 1.
В таблице 4 показаны результаты анализа распределения по размеру частиц человеческого инсулина, микронизированного по способам, описанным в примерах 1, 3 и 4.
Таблица 4
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что исходный растворитель (например, метанольный раствор или вода) и концентрация растворителя (например, концентрация метанола 10 об. %, 50 об. % или 90 об. % по отношению к общему объему кислого раствора), используемого для растворения человеческого инсулина (сырьевого) могут влиять на размер частиц тонкодисперсного человеческого инсулина.
Пример 5. Способы получения подходящих для ингаляции частиц человеческого инсулина в растворе, содержащем 10 об. % этанола
Подходящие для ингаляции частицы человеческого инсулина получают по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что кислый раствор, содержащий 10 об. % метанола по отношению к общему объему кислого раствора (остальные 90 об. % составляют вода и HCl) и имеющий pH примерно 2,0, используют вместо кислого раствора, содержащего 90 об. % метанола, используемого для растворения инсулина в примере 1. Распределение по размерам частиц полученной ингаляционной формы человеческого инсулина анализируют по способу, описанному в примере 2. Результаты анализа распределения частиц по размерам демонстрируют, что частицы ингаляционной формы человеческого инсулина имеют среднеобъемный диаметр 1,36 мкм.
Пример 6. Способ микронизации человеческого инсулина с получением подходящих для ингаляции частиц, в котором используют раствор, содержащий 90 об. % метанола, при разных значениях pH
Подходящие для ингаляции частицы человеческого инсулина получают по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что вместо буферного раствора, имеющего pH 5,64, используют ряд буферных растворов, содержащих NaOH и имеющих pH от 3 до 9. Распределение по размерам частиц полученной ингаляционной формы человеческого инсулина анализируют по способу, описанному в примере 2. Для доведения pH раствора также используют NaOH. Результаты анализа распределения частиц по размерам и значения pH соответствующих буферных растворов приведены в таблице 5. Из результатов, приведенных в таблице 5, в вариантах осуществления способа микронизации можно использовать буферный раствор, имеющий pH от 3 до 9.
Таблица 5
Пример 7. Способ получения подходящих для ингаляции частиц человеческого инсулина с использованием изопропилового спирта в качестве сорастворителя
Подходящие для ингаляции частицы человеческого инсулина получают по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что изопропиловый спирт используют вместо этанола, который в примере 1 добавляют к суспензии после полного или почти полного завершения титрования. Распределение по размерам частиц полученной ингаляционной формы человеческого инсулина анализируют по способу, описанному в примере 2. Результаты анализа распределения частиц по размерам демонстрируют, что среднеобъемный диаметр частиц ингаляционной формы человеческого инсулина оставляет 1,27 мкм.
Пример 8. Способ получения подходящих для ингаляции частиц человеческого инсулина с использованием ацетона в качестве сорастворителя
Подходящие для ингаляции частицы человеческого инсулина получают по способу, описанному в примере 1, за исключением того, что ацетон используют вместо этанола, который в примере 1 добавляют к суспензии после полного или почти полного завершения титрования. Распределение по размерам частиц полученной ингаляционной формы человеческого инсулина анализируют по способу, описанному в примере 2. Результаты анализа распределения частиц по размерам демонстрируют, что среднеобъемный диаметр частиц ингаляционной формы человеческого инсулина оставляет 1,32 мкм.
Пример 9. Способ микронизации аналога инсулина гларгина с получением подходящих для ингаляции частиц
Инсулин гларгин представляет собой аналог человеческого инсулина длительного действия. Используемый здесь инсулин гларгин получают путем ультрафильтрации коммерчески доступного инсулина гларгина (LANTUS®). Перед применением инсулин гларгин промывают и лиофилизируют. 70 мг промытого и лиофилизированного инсулина гларгина растворяют в 7,7 мл кислого раствора, имеющего pH примерно 2,2 и содержащего 90 об. % метанола (остальные 10 об. % составляют вода и HCl) по отношению к общему объему кислого раствора, с получением раствора инсулина гларгина. После полного или почти полного растворения инсулина гларгина полученный раствор титруют путем добавления по каплям 1,75 мл фосфатного буферного раствора, pH 6,9. К раствору добавляют 10 мл этанола. Вышеуказанные стадии растворения, титрования и добавления этанола проводят при постоянном (практически непрерывном) перемешивании. Прозрачный раствор инсулина гларгина превращается в мутную суспензию, содержащую частицы тонкодисперсного инсулина гларгина (частицы тонкодисперсного инсулина гларгина). Частицы тонкодисперсного инсулина гларгина отделяют, промывают и сушат. Распределение по размерам частиц тонкодисперсного инсулина гларгина анализируют методом лазерной дифракции, описанным в примере 2. Результаты анализа распределения частиц демонстрируют, что среднеобъемный диаметр частиц тонкодисперсного инсулина гларгина составляет 2,27 мкм. На фиг. 8 приведено полученное методом сканирующей электронной микроскопии (SEM) изображение частиц тонкодисперсного инсулина гларгина. На фиг. 9 приведена хроматограмма ВЭЖХ растворенных частиц тонкодисперсного инсулина гларгина. Значения времени удерживания, определенные методом ВЭЖХ и приведенные на фиг. 9, свидетельствуют о том, что химические свойства инсулина гларгина не изменяются (или практически не изменяются) в процессе микронизации. На фиг. 10 и 11 приведены диаграммы, демонстрирующие результаты исследования с помощью каскадного импактора Андерсена частиц инсулина гларгина, доставляемых из дозирующего аэрозольного ингалятора с использованием HFA 134A в качестве пропеллента. Получение дозирующих аэрозольных ингаляторов описано ниже в примере 11. Приведенные на фиг. 10 и 11 результаты исследования согласуются полностью или почти полностью.
Пример 10. Способ микронизации аналога инсулина аспарта с получением подходящих для ингаляции частиц
Инсулин аспарт представляет собой аналог инсулина быстрого действия. Используемый здесь инсулин аспарт получают путем ультрафильтрации NovoLog® (полученного от Novo Nordisk, Bagsværd, Denmark). После ультрафильтрации и перед применением инсулин аспарт промывают и лиофилизируют. 70 мг промытого и лиофилизированного инсулина аспарта растворяют в 7,7 мл кислого водного раствора, имеющего pH примерно 2 и содержащего HCl, с получением раствора инсулина аспарта. После полного или почти полного растворения инсулина аспарта полученный раствор титруют путем добавления по каплям 4,2 мл ацетатного буферного раствора, pH 5,64. К раствору добавляют 78 мл этанола с получением суспензии. Вышеуказанные стадии растворения, титрования и добавления этанола проводят при постоянном (практически непрерывном) перемешивании. Прозрачный раствор инсулина аспарта превращается в мутную суспензию, содержащую частицы тонкодисперсного инсулина аспарта (частицы тонкодисперсного инсулина аспарта). Частицы тонкодисперсного инсулина гларгина отделяют, промывают и сушат. Распределение по размерам частиц тонкодисперсного инсулина аспарта анализируют методом лазерной дифракции, описанным в примере 2. Результаты анализа распределения частиц демонстрируют, что среднеобъемный диаметр частиц тонкодисперсного инсулина аспарта составляет 2,72 мкм. На фиг. 12 приведено полученное методом сканирующей электронной микроскопии (SEM) изображение частиц тонкодисперсного инсулина аспарта. На фиг. 13 приведена хроматограмма ВЭЖХ растворенных частиц тонкодисперсного инсулина аспарта. Значения времени удерживания, определенные методом ВЭЖХ и приведенные на фиг. 13, свидетельствуют о том, что химические свойства инсулина аспарта не изменяются (или практически не изменяются) в процессе микронизации.
На фиг. 14 и 15 приведены диаграммы, демонстрирующие результаты исследования с помощью каскадного импактора Андерсена частиц инсулина аспарта, доставляемых из дозирующего аэрозольного ингалятора с использованием HFA 134A в качестве пропеллента. Получение дозирующих аэрозольных ингаляторов описано ниже в примере 11. Приведенные на фиг. 14 и 15 результаты исследования согласуются полностью или почти полностью.
Пример 11. Получение дозирующих аэрозольных ингаляторов для анализов in vitro с использованием каскадного импактора Андерсена
Дозирующие аэрозольные ингаляторы (MDI) получают с помощью нижеследующего способа. Подходящее или соответствующее количество тонкодисперсного человеческого инсулина API (например, частиц тонкодисперсного человеческого инсулина или частиц тонкодисперсного аналога человеческого инсулина) и этанола помещают в баллон ингалятора. Затем содержимое баллона перемешивают путем обработки ультразвуком с помощью VWR Aquasonic в течение 5 мин с получением однородной или практически однородной суспензии. Добавляют разные пропелленты, такие как HFA 134A, HFA 227, или их смесь, после чего баллон герметично закрывают путем зажимания, используя подходящий клапан.
Тонкодисперсный человеческий инсулин (например, частицы тонкодисперсного человеческого инсулина или частицы тонкодисперсного аналога инсулина) помещают в дозирующий аэрозольный ингалятор (MDI) в качестве активного ингредиента. Концентрация человеческого инсулина или аналога инсулина в ингаляторе составляет 3 мг/г. Данные, полученные с помощью каскадного импактора Андерсена и показанные на фиг. 7, фиг. 11 и фиг. 15, хорошо согласуются с результатами анализа распределения частиц по размерам, полученными с помощью лазерного дифракционного анализатора размеров частиц. В приведенных здесь результатах, полученных с помощью каскадного импактора Андерсена, испускаемую дозу определяют как процент человеческого инсулина или аналога инсулина, оседающего на каскадном импакторе Андерсена.
Форма и шероховатость (или гладкость) поверхности частиц тонкодисперсного человеческого инсулина, полученных с помощью вариантов осуществления описанного здесь способа, являются в высокой степени подходящими или благоприятными (например, подходящими или благоприятными для легочной доставки). Микронизация путем размола на струйной мельнице является традиционным способом измельчения частиц с размером в миллиметровом диапазоне до частиц с размером в микрометровом диапазоне. Процесс размола на струйной мельнице включает в себя частые столкновения частиц между собой и со стенками камеры мельницы, вызываемые движущимся с высокой скоростью потоком газа. Тонкодисперсные частицы, полученные путем размола на струйной мельнице, удаляют из камеры мельницы с помощью движущегося по окружности газового потока и центробежных сил. Указанные механические усилия могут оказывать неблагоприятное воздействие на поверхность и форму тонкодисперсных частиц, например, как описано ниже в сравнительном примере 1, с получением частиц, которые могут не быть удобными или подходящими для легочной доставки.
Сравнительный пример 1. Получение частиц человеческого инсулина путем размола на струйной мельнице
Частицы человеческого инсулина получают путем размола на струйной мельнице с использованием размалывающего давления N2 75 фунтов на квадратный дюйм и скорости подачи примерно 1 г/мин. На фиг. 16 приведено полученное методом атомной силовой микроскопии (AFM) изображение частиц человеческого инсулина, полученных путем размола на струйной мельнице. Как можно видеть на изображении, приведенном на фиг. 16, частицы человеческого инсулина, полученные путем размола на струйной мельнице, имеют шероховатую и неправильную (или неровную) форму.
На фиг. 17 приведено полученное методом AFM изображение частиц ингаляционной формы человеческого инсулина, микронизированного по способу, описанному в примере 2. Поскольку варианты осуществления раскрытого здесь способа проводят при комнатной температуре и без применения механических усилий и/или тепловой обработки (или практически без применения механических усилий и/или тепловой обработки), форма и поверхность частиц тонкодисперсного человеческого инсулина являются более подходящими или более предпочтительными для легочной доставки людям.
Хотя настоящее изобретение описано с использованием конкретных вариантов осуществления, следует понимать, что изобретение не ограничивается раскрытыми вариантами осуществления, но, наоборот, охватывает разные модификации и эквивалентные схемы, удовлетворяющие сущности и объему прилагаемой формулы изобретения, а также их эквиваленты. Термины "примерно" и "практически", используемые в описании и формуле изобретения, обозначают приблизительное соответствие, но не степень, и отражают неизбежные вариации, связанные с измерением, значащими цифрами и взаимозаменяемостью, известные рядовым специалистам в соответствующей области техники. Кроме того, следует понимать, что, если не указано иначе, все значения, приведенные на протяжении описания и прилагающейся формулы изобретения, даже если перед ними не стоит термин "примерно", также определяются этим термином в неявной форме.
Реферат
Изобретение относится к области медицины и касается способа получения ингаляционной формы инсулина, подходящей для легочной доставки, который включает в себя: растворение сырьевого инсулина в кислом растворе с получением раствора инсулина; титрование раствора инсулина буферным раствором с получением суспензии, содержащей тонкодисперсные частицы инсулина; и стабилизацию тонкодисперсных частиц инсулина. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 12 пр., 4 табл., 17 ил.
