Системы и способы доставки биоактивных средств с применением транспортных последовательностей, происходящих от бактериального токсина - RU2593715C2

Чертежи

Описание

Родственные патентные заявки

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки США №61/403394, поданной 15 сентября 2010 года, включенной во всей полноте в данный документ посредством ссылки.

Область техники

Область настоящего изобретения относится, отчасти, к стратегии новых фармацевтических применений. Более конкретно, настоящее изобретение относится к нетоксичной мутантной форме гена Cholix (ntCholix) Vibrio cholera, варианту Cholix, усеченному по аминокислоте A³⁸⁶ (Cholix³⁸⁶) и применению других различных полипептидных последовательностей, происходящих от Cholix, для улучшения доставки в кишечник биологически активных терапевтических средств. Важно, что системы и способы, описанные в данном документе, предусматривают следующее: возможность доставлять дозы макромолекул без инъекций; возможность доставлять груз, такой как (но без ограничений) siRNA или антисмысловые молекулы, во внутриклеточные компартменты, где требуется их активность; и доставку наночастиц и носителей на основе дендримеров через биологические мембраны, которая иначе была бы затруднена из-за барьерных свойств большинства таких мембран.

Предшествующий уровень техники

Большинство разрешенных в настоящее время низкомолекулярных лекарственных средств всасывается через слизистую оболочку тонкого кишечника для обеспечения доставки в системный кровоток. Фактически, низкомолекулярные лекарственные средства отбираются на основе их стабильности и эффективного всасывания через слизистую оболочку кишечника. Подобная пероральная доставка биологически активных полипептидов (означает полимер, состоящий из аминокислотных остатков; как правило, обозначается как белок или пептид) составляла долговременную цель фармацевтической промышленности. Поскольку желудочно-кишечный (GI) тракт приспособлен для переваривания белков и пептидов, поступающих с пищей, существуют многочисленные физические, физиологические и биологические барьеры, которые ограничивают применимость поглощения терапевтических белков и пептидов из кишечника способом, аналогичным таковому, достигаемому с малыми молекулами; Mahato, R.I., et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 20(2-3): p.153-214 (2003).

Был установлен ряд технологий, которые можно применять для защиты терапевтических белков и пептидов на протяжении желудка, позволяющих им достигать всасывающей поверхности эпителиальных клеток в тонком кишечнике и отделяющих их от условий желудка и кишечника, которые функционируют для разрушения белков и пептидов, поступающих с пищей. К сожалению, однако, эффективный транспорт через этот простой одинарный слой клеток остается существенным препятствием вследствие внутриклеточного направленного перемещения к деструктивным лизосомным компартментам после эндосомального поглощения полипептидов на поверхности просвета; Woodley, J.F., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 11(2-3): p.61-95 (1994). В действительности, этот барьер приспособлен для ингибирования поглощения белков и пептидов до тех пор, пока эти макромолекулы могут в достаточной степени разрушиться для всасывания посредством переносчиков аминокислот и ди- или трипептидов. В связи с этим был предпринят ряд попыток преодоления физических, физиологических и биологических барьеров слизистой оболочки кишечника.

Существуют два основных пути через простой эпителий, который образует клеточный барьер слизистой оболочки кишечника. Конкретно, после прохождения через покрывающий слой слизи молекула может двигаться между соседними эпителиальными клетками (околоклеточный путь) или двигаться через клетки (трансклеточный путь) с помощью серии везикул, которые направленно перемещаются внутри, но не сливаются содержимым с цитоплазмой; Т. Jung et al., Eur J Pharm Biopharm, 50: 147-160 (2000). Другими словами, в обоих путях транспортируемое белковое или пептидное терапевтическое средство не входит в клетку, а скорее остается в среде, внешней относительно цитоплазмы клетки.

Важнейшим барьером для случайного перемещения терапевтического белка и перемещения пептида через околоклеточный путь служит комплекс из белков на апикальной шейке этих клеток, известный как плотный контакт (TJ). Хотя временное открывание и закрывание структур TJ может облегчать транспорт пептидов через эпителий кишечника, данный подход имеет ключевые ограничения: например, он не вполне применим для молекул свыше ~5 кДа; имеется возможность для неселективного поступления материалов в организм из просвета кишечника; и он представляет собой путь, в который вовлекается только небольшая часть площади поверхности эпителия кишечника.

Важнейшим барьером для случайной миграции белковых или пептидных терапевтических средств через клетки с помощью трансклеточного пути является стандартное направленное перемещение везикул, при помощи которого содержимое этих везикул доставляется в деструктивный (лизосомальный) путь. По сравнению с околоклеточным путем перемещение благодаря везикулярному трансклеточному пути может приспосабливаться для материалов диаметром до 100 нм, причем в него вовлекается по существу вся поверхность эпителиальной клетки, и оно может быть высокоселективным в отношении поглощения материалов благодаря применению взаимодействий рецептор-лиганд для поступления в везикулу. Таким образом, трансклеточный путь является очень привлекательным для эпителиального транспорта белковых или пептидных терапевтических средств, если при этом можно избежать деструктивного пути.

У некоторых патогенов решена проблема направленного перемещения через барьер, как показано при помощи эффективного трансцитоза секретируемых полипептидных факторов вирулентности, которые функционируют для содействия и/или стабилизации инфекции хозяина. Экзотоксины представляют собой класс белков, высвобождаемых множеством микроорганизмов, которые действуют как сильные факторы вирулентности. Экзотоксины воздействуют на многоклеточные организмы, а также обладают способностью действовать как сильные токсины у человека; Roszak, D.B., and Colwell, R.R., Microbiol Rev 51: 365-379 (1987). Эти белки обычно убивают или инактивируют клетки-хозяева посредством механизмов, которые включают селективное нарушение синтеза белка. В соответствии с этим всего несколько молекул требуется для того, чтобы убить, что согласуется с наблюдением, что бактериальные экзотоксины известны как одни из наиболее токсичных средств. Подкласс этих белков включает семейство белков, которое состоит из дифтерийного токсина (DT) из Corynebacterium diphtheria, экзотоксина A из Pseudomonas aeruginosa (PE) и недавно идентифицированного белка, названного Cholix из Vibrio cholera, функционирующего для интоксикации клеток-хозяев посредством ADP-рибозилирования фактора элонгации 2 (EF2); Yates, S.P., et al., Trends Biochem Sci, 31: 123-133 (2006). Эти экзотоксины синтезируются в виде одной цепи из аминокислот, которая сворачивается в отдельные домены, которые, как было установлено, имеют специфические функции в нацеливании, проникновении и интоксикации клеток-хозяев.

Недавно была описана биология экзотоксина A из Pseudomonas aeruginosa (PE); Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today, 7(4): p.247-58 (2002). РЕ состоит из одной цепи из 613 аминокислот с теоретическим молекулярным весом (MW) 66828,11 Да, изоэлектрической точкой (pl) 5,28, которая функционально сворачивается в три отдельных домена, обозначенные домен I (Ala¹-Glu²⁵²), домен II (Gly²⁵³-Asn³⁶⁴), домен III (Gly⁴⁰⁵-Lys⁶¹³, который содержит область с ADP-рибозилтрансферазной активностью), и короткую связанную дисульфидной связью петлю, связывающую домены II и III, которая известна как Ib-петля (Ala³⁶⁵-Gly⁴⁰⁴). Организация этих доменов при pH 8,0 была определена на основе дифракции на кристалле при разрешении ~1,5 Å; Wedekind, J.E. et al., J Mol Biol, 314: 823-837 (2001). Домен I (Ia+Ib) имеет сердцевину, образованную 13-нитчатым β-рулетом, домен II состоит из шести α-спиралей, и домен III имеет сложную α/β-упорядоченную структуру. При помощи исследований подтвердилась идея, что блочная природа PE обеспечивает функции отдельных доменов: домен I связывается с рецепторами клетки-хозяина, домен II вовлекается в перемещение через мембрану, и домен III функционирует как ADP-рибозилтрансфераза. По-видимому, PE секретируется Р. aeruginosa в непосредственной близости от апикальной поверхности эпителиальной клетки, возможно в ответ на стимулы среды и/или клеточные сигналы; Deng, Q. and J.T. Barbieri, Annu Rev Microbiol, 62: p.271-88 (2008). Сразу после секреции происходит интернализация внутрь клеток после того, как домен I PE связывается с мембранным белком α2-макроглобулином, белком, который также известен как белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP1) или CD91; смотри, например, FitzGeraId, D.J., et al., J Cell Biol, 129(6): p.1533-41 (1995); Kounnas, M.Z., et al., J Biol Chem, 267(18); p.12420-3 (1992). После интернализации PE избегает направленного перемещения к лизосоме, а вместо этого эффективно доставляется к базолатеральной поверхности клетки, где он высвобождается в биологически активной форме; Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today, 7(4): p.247-58 (2002). После прохождения через эпителий PE функционирует как фактор вирулентности, проникая в CD91-положительные клетки в подслизистом пространстве (макрофаги и дендритные клетки), где он затем проходит через путь разворачивания, что приводит к доставке в цитоплазму домена III; смотри, например, Mattoo, S., Y.M. Lee, and J.E. Dixon, Curr Opin Immunol, 19(4): p.392-401 (2007); Spooner, R.A., et al., Virol J, 3: p.26 (2006).

Бактерия Vibrio cholerae наиболее известна благодаря своему одноименному средству вирулентности, холерному токсину (CT), который может вызывать острую опасную для жизни тяжелую водянистую диарею. CT представляет собой белковый комплекс, состоящий из одной субъединицы A, сгруппированной с пентамером из субъединиц B, который связывается с ганглиозидными структурами G_M1 клеточной поверхности на апикальной поверхности эпителия. CT секретируется V. cholera после горизонтального переноса генов с вирулентными штаммами V. cholerae, несущими вариант лизогенного бактериофага, называемого CTXf или CTXφ. Последние вспышки холеры, однако, позволили предположить, что штаммы некоторых серогрупп (не-O1, не-O139) не экспрессируют CT, а скорее используют другие факторы вирулентности. Подробные анализы данных из окружающей среды и клинических данных применительно к не-O1, не-O139 позволили предположить наличие нового предполагаемого секретируемого экзотоксина с некоторым сходством с PE.

Jorgensen, R. et al., J Biol Chem, 283(16): 10671-10678 (2008) сообщили, что некоторые штаммы V. cholerae, в самом деле, действительно содержали белковый токсин, сходный с PE, который они назвали токсин Cholix (Cholix). По сравнению с PE Cholix имеет немного больший теоретический MW (70703,89 Да) и немного более кислую теоретическую pl (5,12). Кристаллическая структура белка Cholix из 634 аминокислот была проанализирована при ~2 Å. Было обнаружено, что доменная структура и организация в чем-то сходны с PE: домен I (Val¹-Lys²⁶⁵), домен II (Glu²⁶⁶-Ala³⁸⁶), домен III (Arg⁴²⁶-Lys⁶³⁴) и Ib-петля (Ala³⁸⁷-Asn⁴²⁵). Дополнительное структурное сходство с PE включает: сайт для фуриновой протеазы для активации в клетке; C-концевую последовательность KDEL, которая может направлять токсин в эндоплазматический ретикулум клетки-хозяина; и область с ADP-рибозилтрансферазной активностью в пределах домена III.

Примечательно, что PE и Cholix не обладают значительным генетическим сходством и ограниченным сходством по аминокислотному выравниванию. Исследование генома V. cholera на РЕ-подобные нуклеотидные последовательности не приводит в результате к совпадению любого рода. Только на уровне белковой последовательности имеется намек на то, что PE-подобный белок может продуцироваться этой бактерией. Даже в этом случае, имеется только 32% гомологии между аминокислотными последовательностями PE и Cholix со сходством (42% гомологии), сосредоточенным в ADP-рибозилирующих элементах домена III, и с низкими уровнями аминокислотной гомологии (~15-25%) для большинства сегментов доменов I и II применительно к двум белкам. Более того, эта общая конфигурация Cholix по сравнению с PE даже более примечательна, поскольку эти два белка со сходными элементами произошли от двух различных направлений: Р. aeruginosa представляет собой GC-богатую бактерию, тогда как V. cholera является AT-богатой. То, что эти два токсина, возникшие в двух различных генетических направлениях, пришли к почти одинаковой структуре, но только с 32% аминокислотной гомологии, позволяет предположить, что структурное и функциональное сходство Cholix и PE, вероятно, основано на сходных прессах выживания, а не посредством сходных генетических основ. Очень низкая аминокислотная гомология доменов I и II применительно к этим двум белкам подчеркивает функциональную важность свернутых структур этих двух белков, а не их аминокислотных последовательностей.

По-видимому, C-концевой участок Cholix и PE функционирует при интоксикации клеток посредством ADP-рибозилирования EF2 сходным образом. Недавние исследования, в которых вторую половину Cholix (домен 1 разрушен) нацеливали на раковые клетки посредством конъюгации с антителом, направленным на трансферриновый рецептор, позволяют предположить, что C-концевые участки PE и Cholix, вовлеченные в ADP-рибозилирование EF2, действительно функционально подобны; Sarnovsky, R., et al., Cancer Immunol Immunother 59: 737-746 (2010). Хотя этот дистальный участок Cholix на 36% идентичен и на 50% сходен с PE, поликлональные иммунные сыворотки, вырабатывающиеся у животных, а также сыворотки от больных с нейтрализующими иммунными ответами на этот аналогичный дистальный участок PE, не дает перекрестной реакции с этим вторым участком Cholix. Аналогично, иммунная сыворотка, вырабатывающаяся на этот Cholix, не дает перекрестной реакции с PE. Эти данные позволяют предположить, что хотя как PE, так и Cholix имеют способность к интоксикации клеток посредством сходного механизма, и эти два белка имеют общую структуру сердцевины, имеются выраженные различия в их элементах, которые экспрессированы на поверхности этих белков.

Поскольку предыдущие исследования с применением PE показали, что этот токсин легко транспортируется через поляризованные монослои эпителиальных клеток in vitro и in vivo без интоксикации; Mrsny, R.J., et al., Drug Discov Today, 7(4): p.247-58 (2002), была начата исследовательская работа для дополнительной оценки свойств и биологии Cholix с особым вниманием в отношении функциональных аспектов проксимальных участков Cholix; конкретно, в отношении применения доменов I и II для облегчения транспорта через эпителиальные монослои кишечника. Поскольку домены I и IIa, по-видимому, являются единственными необходимыми элементами PE, которые требуются для эпителиального трансцитоза, особенно важным было исследовать эти аналогичные домены у Cholix. Как утверждалось ранее, существует только ~15%-25% аминокислотной гомологии на протяжении большинства областей, которые, как считается, составляют часть доменов I и IIa. Домены были изучены посредством серии исследований: отслеживанием биологического распределения Cholix после нанесения на эпителиальные поверхности in vivo, оценкой характеристик трансклеточного транспорта Cholix через монослои поляризованных эпителиальных клеток in vitro и доставкой биологически активного груза, генетически интегрированного в белок Cholix на его C-конце. Предварительные данные, полученные в результате генетического слияния первых двух доменов Cholix (аминокислоты 1-386) с зеленым флуоресцентным белком (GFP) или химического связывания этих экспрессированных доменов с латексными гранулами диаметром 100 нм, показали, что отмечался транспорт Cholix, присоединенного к 100 нм латексным гранулам, через эпителиальные монослои кишечника in vitro и in vivo. To, что груз GFP сохранял свой флуоресцентный характер во время и после процесса трансцитоза также поддерживает точку зрения, что Cholix использует недеструктивный (или привилегированный) путь направленного перемещения через поляризованные эпителиальные клетки. Этот результат служит хорошим предзнаменованием для его (повторного) применения в качестве инструмента для доставки биологически активных грузов через эпителиальные барьеры организма, например, таковые в дыхательных и желудочно-кишечных трактах.

Также важным примечанием из предварительных исследований является наблюдение, которое позволяет предположить явное различие между PE и Cholix в отношении взаимодействия с клеточными рецепторами. Как утверждалось ранее, PE поступает в эпителиальные клетки после того, как домен I PE связывается с мембранным белком α2-макроглобулином, белком, который также известен как белок 1, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности (LRP1) или CD91. Несмотря на то, что точная природа поверхностного рецептора для Cholix не была установлена, предварительные исследования позволяют предположить, что Cholix не приводит к интоксикации некоторых клеточных линий, экспрессирующих CD91, но приводит к интоксикации некоторых клеточных линий, действительно экспрессирующих CD91. В настоящее время не ясно, какие другие рецепторы, кроме CD91, могут вовлекаться в эпителиальный трансцитоз PE. Тем не менее, Cholix и PE, по-видимому, характеризуются отличающимися взаимодействиями с клеточными рецепторами, демонстрирующими явные различия, которые являются достаточными для того, чтобы предположить очень различные и непредвиденные применения в отношении как пероральных биологических препаратов, так и внутриклеточной доставки биоактивных средств.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на свойствах направленного перемещения через мембрану Cholix и обнаружении того, что Cholix эффективно транспортируется через поляризованные эпителиальные клетки воздухоносных путей и кишечника, что позволяет предположить, что полипептидные последовательности, происходящие от Cholix (в том числе проксимальные элементы белка) можно применять для эффективного трансцитоза белка и наночастиц, что представляет стратегию новых фармацевтических применений.

В связи с этим один аспект настоящего изобретения предполагает обеспечение выделенных конструктов для доставки (например, генетические слияния или химические конструкты), содержащих транспортный домен (например, полипептидная последовательность, происходящая от Cholix) и груз. Как транспортный домен, так и груз могут экспрессироваться/связываться в различных стехиометрических соотношениях и пространственной организации. Различные грузы могут также экспрессироваться/связываться на одном и том же конструкте. В предпочтительных вариантах осуществления такой груз может включать один или любой из белков, пептидов, малых молекул, siRNA, PNA, miRNA, ДНК, плазмиды и антисмысловых последовательностей.

Другой аспект настоящего изобретения предполагает обеспечение возможности доставлять груз, такой как макромолекулы, без инъекций.

Другой аспект настоящего изобретения предполагает обеспечение возможности доставлять груз, такой как (но без ограничений) макромолекулы, малые молекулы, siRNA, PNA, miRNA, ДНК, плазмида и антисмысловые молекулы, во внутриклеточные компартменты, где требуется их активность.

Другой аспект настоящего изобретения предполагает обеспечение транспорта груза путем доставки наночастиц и/или носителей на основе дендримеров через биологические мембраны.

Способы введения/доставки, предполагаемые для применения в настоящем изобретении, включают, например, пероральное введение, ингаляционное введение, интраназальное введение, буккальное введение, сублингвальное введение, глазное введение (в том числе, но без ограничений, доставка к стекловидному телу, роговице, конъюктиве, склере и задней и передней камерам глаза), местное нанесение, инъекцию (с иглой или без иглы), внутривенную инфузию, применение микроиглы, введение с помощью состава лекарственное депо, введение с помощью внутриоболочечного применения, введение с помощью внутрибрюшинного применения, введение с помощью внутрисуставного применения, доставку внутриклеточно, доставку через гематоэнцефалический барьер, доставку через гематоретинальный барьер, вводимые для локальной доставки и действия и/или доставляемые для системной доставки.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую конструкты для доставки и фармацевтически приемлемый носитель.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 изображен обзор стратегии, примененной для C-концевой модификации ntCholix для облегчения слияния с грузом, причем в данном случае груз представляет собой флуоресцентный краситель Alexa488.

На фигуре 2 изображен транспорт ntCholix-Alexa488® через поляризованные эпителиальные клетки кишечника in vitro. Монослои клеток Caco-2 подвергли воздействию тестируемых материалов в течение 4 часов. Процентную долю транспортированного материала определили посредством анализа стандартной кривой флуоресценции, присутствующей в образцах, и представили как среднюю величину (N=4). В качестве контроля применили BSA-Alexa488.

Вариант(ы) осуществления изобретения

Как будет понятно специалистам в данной области техники, вышеприведенное описание подробно описывает определенные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и, таким образом, является только образцом и не отображает действительный объем настоящего изобретения. Также будет понятно, что терминология, используемая в данном документе, служит только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, определяемого посредством прилагаемой формулы изобретения.

Если не определяется иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Используемые в данном документе следующие термины имеют значение, приписываемое им, если не указывается иное.

Исследования, лежащие в основе настоящего изобретения, относятся к применению в качестве транспортного домена полипептидных последовательностей, происходящих от Cholix, которые будут применяться для получения выделенных конструктов для доставки для улучшения доставки в кишечник биологически активных терапевтических средств. Важно, что системы и способы, описанные в данном документе, предусматривают следующее: возможность доставлять дозы макромолекул без инъекций; возможность доставлять "груз" во внутриклеточные компартменты, где требуется их активность; и доставку наночастиц и/или носителей на основе дендримеров через биологические мембраны, которая иначе была бы затруднена из-за барьерных свойств большинства таких мембран.

Зрелый токсин Cholix ("Cholix") представляет собой чрезвычайно активный мономерный белок (молекулярный вес 70 кДа), секретируемый Vibrio cholerae, который состоит из трех выступающих глобулярных доменов (Ia, II и III) и одного небольшого субдомена (Ib), который соединяет домены II и III. Аминокислотная последовательность зрелого Cholix представлена в Jorgensen, R. et al., J Biol Chem, 283(16): 10671-10678 (2008) и ссылках, цитируемых там. Полипептидные последовательности, происходящие от Cholix, применяемые в получении выделенных конструктов для доставки по настоящему изобретению, будут происходить из описанной в литературе белковой последовательности из 634 аминокислот зрелого Cholix.

Таким образом, конструкты для доставки по настоящему изобретению содержат транспортный домен. Используемый в данном документе "транспортный домен" означает структурные домены, которые способны выполнять определенные функции, например, клеточное распознавание (т.е. включают рецептор-связывающий домен) и трансцитоз (т.е. включают домен для трансцитоза). В основном, транспортные домены, которые применяются в получении конструктов для доставки по настоящему изобретению, представляют собой полипептидные последовательности, происходящие от Cholix, имеющие структурные домены, соответствующие функциональным доменам, например, Ia и II, Cholix.

Наряду с участками молекулы, которые соответствуют функциональным доменам Cholix, конструкты для доставки по настоящему изобретению могут дополнительно включать макромолекулу для доставки в биологический компартмент субъекта. В определенных вариантах осуществления макромолекула выбирается из группы из нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида, белка, полисахарида и липида. В дополнительных вариантах осуществления полипептид выбирается из группы, состоящей из полипептидных гормонов, цитокинов, хемокинов, факторов роста и факторов свертывания крови, которые обычно вводятся субъектам посредством инъекции. Последовательности всех этих макромолекул хорошо известны специалистам в данной области техники, а присоединение этих макромолекул к конструктам для доставки находится в пределах навыков специалиста в данной области техники при применении стандартных методик.

Макромолекула может вводиться в любой участок конструкта для доставки так, чтобы при этом не нарушить активность клеточного связывания или трансцитоза. Макромолекула соединяется с остальной частью конструкта для доставки через расщепляемый линкер. "Линкер" означает молекулу, которая соединяет две другие молекулы, либо ковалентно, либо посредством ионных, ван-дер-ваальсовых или водородных связей, например, молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с одной комплементарной последовательностью на 5'-конце и с другой комплементарной последовательностью на 3'-конце, тем самым соединяя две некомплементарные последовательности. "Расщепляемый линкер" означает линкер, который может распадаться или иным образом разъединяется с отделением двух компонентов, связанных расщепляемым линкером. Расщепляемые линкеры обычно расщепляются под действием ферментов, как правило, пептидаз, протеаз, нуклеаз, липаз и т.п. Расщепляемые линкеры могут также расщепляться под действием стимулов среды, таких как, к примеру, изменения температуры, pH, концентрации солей и т.д., если такое изменение происходит в среде после трансцитоза конструкта для доставки через поляризованную эпителиальную мембрану.

В определенных вариантах осуществления конструкты для доставки дополнительно содержат вторую макромолекулу, которая выбирается из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида, белка, липида и малой органической молекулы, и второй расщепляемый линкер, где расщепление в указанном втором расщепляемом линкере отделяет указанную вторую макромолекулу от остальной части указанного конструкта. В определенных вариантах осуществления первая макромолекула представляет собой первый полипептид, а указанная вторая макромолекула представляет собой второй полипептид. В определенных вариантах осуществления первый полипептид и второй полипептид ассоциируются с образованием мультимера. В определенных вариантах осуществления мультимер представляет собой димер, тетрамер или октамер. В дополнительных вариантах осуществления димер представляет собой антитело.

В определенных вариантах осуществления макромолекулу можно выбрать так, чтобы она не была расщепляемой ферментом, присутствующим на базально-латеральной мембране эпителиальной клетки. К примеру, анализы, описанные в примерах, можно применять для стандартного тестирования того, может ли такой расщепляющий фермент расщеплять макромолекулу, подлежащую доставке. Если да, то макромолекулу можно изменить стандартным образом для того, чтобы исключить непригодную аминокислотную последовательность, распознаваемую расщепляющим ферментом. Измененную макромолекулу затем можно протестировать для того, чтобы удостовериться, что она сохраняет активность, с применением стандартных в области техники способов.

В определенных вариантах осуществления первый и/или второй расщепляемый линкер расщепляется под действием фермента, который проявляет более высокую активность на базально-латеральной стороне поляризованной эпителиальной клетки, чем на апикальной стороне поляризованной эпителиальной клетки. В определенных вариантах осуществления первый и/или второй расщепляемый линкер расщепляется под действием фермента, который проявляет более высокую активность в плазме, чем на апикальной стороне поляризованной эпителиальной клетки.

В определенных вариантах осуществления расщепляемый линкер можно выбрать исходя из последовательности таким образом, чтобы в случае пептидной, полипептидной или белковой макромолекул для доставки избежать применения расщепляемых линкеров, которые содержат последовательности, присутствующие в макромолекуле, подлежащей доставке. К примеру, если макромолекула содержит AAL, то расщепляемый линкер можно выбрать таким образом, чтобы он расщеплялся под действием фермента, который не распознает данную последовательность.

Наряду с участками молекулы, которые соответствуют функциональным доменам Cholix, конструкты для доставки по настоящему изобретению могут дополнительно содержать "груз" для доставки во внутриклеточные компартменты, где требуется их активность. "Груз", используемый в данном документе, включает, но без ограничений: макромолекулы, малые молекулы, siRNA, PNA, miRNA, ДНК, плазмиду и антисмысловые молекулы. Другие примеры груза, который может доставляться в соответствии с настоящим изобретением, включают, но без ограничений, противоопухолевые соединения, такие как нитрозомочевины, например кармустин, ломустин, семустин, стрептозотоцин; метилгидразины, например прокарбазин, дакарбазин; стероидные гормоны, например глюкокортикоиды, эстрогены, прогестины, андрогены, тетрагидродезоксикортикостерон; иммуноактивные соединения, такие как иммуносупрессоры, например пириметамин, триметоптерин, пеницилламин, циклоспорин, азатиоприн; и иммуностимуляторы, например левамизол, диэтилдитиокарбамат, энкефалины, эндорфины; противомикробные соединения, такие как антибиотики, например бета-пактам, пенициллин, цефалоспорины, карбапенемы и монобактамы, ингибиторы бета-лактамазы, аминогликозиды, макролиды, тетрациклины, спектиномицин; противомалярийные средства, амебициды; противопротозойные средства; противогрибковые средства, например амфотерицин бета, противовирусные средства, например ацикловир, идоксуридин, рибавирин, трифлуридин, видарбин, ганцикловир; паразитициды; антигельминтики; радиофармацевтические средства; желудочно-кишечные лекарственные средства; гематологические соединения; иммуноглобулины; белки свертывания крови, например антигемофильный фактор, комплекс фактора IX; антикоагулянты, например дикумарол, гепарин Na; ингибиторы фибролизина, например транексамовая кислота; сердечно-сосудистые лекарственные средства; периферические антиадренергические лекарственные средства; гипотензивные лекарственные средства центрального действия, например метилдопа, метилдопа HCl; гипотензивные прямые вазодилататоры, например, диаксозид, гидразин HCl; лекарственные средства, воздействующие на ренин-ангиотензиновую систему; периферические вазодилататоры, например, фентоламин; антиангинальные лекарственные средства; сердечные гликозиды; кардиотонические средства, например амринон, милринон, эноксимон, феноксимон, имазодан, сульмазол; противоаритмические средства; блокаторы входа кальция; лекарственные средства, воздействующие на липиды крови, например ранитидин, бозентан, резулин; респираторные лекарственные средства; симпатомиметические лекарственные средства, например альбутерол, битолтерола мезилат, добутамин HCl, допамин HCl, эфедрин So, эпинефрин, фенфлурамин HCl, изопротеренол HCl, метоксамин HCl, норэпинефрина битартрат, фенилэфрин HCl, ритодрин HCl; холиномиметические лекарственные средства, например, ацетилхолин Cl; антихолинэстеразы, например эдрофоний Cl; реактиваторы холинэстеразы; адреноблокирующие лекарственные средства, например ацебутолол HCl, атенолол, эсмолол HCl, лабеталол HCl, метопролол, надолол, фентоламина мезилат, пропанолол HCl; антимускариновые лекарственные средства, например анизотропинметилбромид, атропин SO₄, клинидиум Br, гликопирролат, ипратропий Br, скополамин HBr; нейромышечные блокирующие лекарственные средства; деполяризующие лекарственные средства, например атракурия безилат, гексафлуорения Br, метокурина иодид, сукцинилхолина Cl, тубокурарина Cl, векурония Br; мышечные релаксанты центрального действия, например баклофен; нейромедиаторы и нейромедиаторные средства, например ацетилхолин, аденозин, аденозинтрифосфат; аминокислотные нейромедиаторы, например, возбуждающие аминокислоты, GABA, глицин; нейромедиаторы биогенные амины, например допамин, эпинефрин, гистамин, норэпинефрин, октопамин, серотонин, тирамин; нейропептиды, оксид азота, токсины K⁺-каналов; антипаркинсонические лекарственные средства, например амальтидин HCl, бензатропина мезилат, карбидопа; диуретические лекарственные средства, например дихлорфенамид, метазоламид, бендрофлуметиазид, политиазид; противомигренозные лекарственные средства, например, карбопроста трометамина мезилат, метисергида малеат. Транспортные домены конструктов для доставки по настоящему изобретению обычно содержат рецептор-связывающий домен. Рецептор-связывающий домен может представлять собой любой рецептор-связывающий домен, известный специалисту в данной области техники, без ограничений для связывания с рецептором клеточной поверхности, который присутствует на апикальной мембране эпителиальной клетки. Предпочтительно, рецептор-связывающий домен специфично связывается с рецептором клеточной поверхности. Рецептор-связывающий домен должен связываться с рецептором клеточной поверхности с достаточным сродством, что делает возможным эндоцитоз конструкта для доставки.

В определенных вариантах осуществления рецептор-связывающий домен может включать пептид, полипептид, белок, липид, углевод или малую органическую молекулу, или их комбинацию. Примеры каждой из данных молекул, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности, присутствующими на апикальной мембране эпителиальных клеток, хорошо известны специалистам в данной области техники. Подходящие пептиды или полипептиды включают, но без ограничений, рецептор-связывающие домены бактериальных токсинов, такие как рецептор-связывающие домены из PE, холерного токсина, токсина Cholix, ботулотоксина, дифтерийного токсина, шига-токсина, шига-подобного токсина и т.д.; антитела, в том числе моноклональные, поликлональные и одноцепочечные антитела или их производные, факторы роста, такие как EGF, IGF-I, IGF-II, IGF-III и т.д.; цитокины, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-6 и т.д.; хемокины, такие как MIP-1a, MIP-1b, MCAF, IL-8 и т.д.; и другие лиганды, такие как CD4, молекулы клеточной адгезии из суперсемейства иммуноглобулинов, интегрины, лиганды, специфичные к рецептору IgA и т.д. Специалист в области техники может выбрать подходящий рецептор-связывающий домен исходя из паттерна экспрессии рецептора, с которым связывается рецептор-связывающий домен.

Рецептор-связывающий домен можно присоединять к остальной части конструкта для доставки посредством любого способа или средств, известных специалисту в данной области техники, пригодных для присоединения таких молекул без ограничений. В определенных вариантах осуществления рецептор-связывающий домен экспрессируется вместе с остальной частью конструкта для доставки в виде белка слияния. Такие варианты осуществления особенно пригодны, когда рецептор-связывающий домен и остальная часть конструкта образованы из пептидов или полипептидов.

Транспортные домены конструктов для доставки по настоящему изобретению дополнительно содержат домен для трансцитоза. Домен для трансцитоза может представлять собой любой домен для трансцитоза, известный специалисту в данной области техники, осуществляющий трансцитоз химерных белков, которые прикрепились к рецептору клеточной поверхности, присутствующему на апикальной мембране эпителиальной клетки. В предпочтительных вариантах осуществления домен для трансцитоза представляет собой домен II Cholix.

Без намерения ограничиваться какой-либо конкретной теорией или механизмом действия полагают, что домен для трансцитоза обеспечивает направленное перемещение конструкта для доставки через поляризованную эпителиальную клетку после того, как конструкт связывается с рецептором, присутствующим на апикальной поверхности поляризованной эпителиальной клетки. Такое направленное перемещение через поляризованную эпителиальную клетку называется в данном документе "трансцитозом". Данное направленное перемещение обеспечивает высвобождение конструкта для доставки из базально-латеральной мембраны поляризованной эпителиальной клетки.

Для доставки груза, предназначенного для внутриклеточной активности, конструкт для доставки содержит домен для эндоцитоза для того, чтобы переместить груз в клетку, и также может содержать расщепляемый линкер. Подобное включает внутриклеточную доставку груза с применением наночастицы и/или носителей на основе дендримеров, нацеленных на рецептор клеточной поверхности, посредством декорирования поверхности носителя одной или несколькими копиями домена для эндоцитоза с или без применения линкеров.

Без намерения ограничиваться какой-либо конкретной теорией или механизмом действия полагают, что домен для эндоцитоза обеспечивает направленное перемещение конструкта для доставки в клетку после того, как конструкт связывается с рецептором, присутствующим на поверхности клетки. Такое направленное перемещение в клетку называется в данном документе "эндоцитозом". Данное направленное перемещение обеспечивает высвобождение конструкта для доставки в соответствующий внутриклеточный компартмент, в том числе (но без ограничений) ядро и ядерную оболочку, рибосомные везикулы, эндоплазматический ретикулум, митохондрии, аппарат Гольджи и цитозоль.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения будет оцениваться идентификация протеаз и пептидаз, которые осуществляют биологические процессы, происходящие на базолатеральной поверхности данных клеток. Данные протеазы и пептидазы будут попадать в несколько категорий, которые можно определить по их субстратам: 1) пре-про-гормоны и ферменты, которые секретируются из базолатеральных поверхностей эпителия и нуждаются в обрезке для их активации, 2) активные гормоны или ферменты, активность которых нейтрализуется при помощи события расщепления для регуляции их активности, и 3) системные ферменты или факторы роста, поведение которых на базолатеральной поверхности изменяется при помощи ферментативной модификации. Примеры нескольких потенциальных активностей, попадающих в эти различные категории и которые могут быть пригодны для расщепления на базолатеральной поверхности конструктов носитель-линкер-груз, включают членов подсемейства S9B пролилолигопептидаз, например, FAP и DDP IV, которые были описаны в уровне техники.

Последовательности нуклеиновой кислоты и полинуклеотиды по настоящему изобретению можно получить посредством любого подходящего способа, в том числе, к примеру, клонированном подходящих последовательностей или прямым химическим синтезом с помощью способов, таких как фосфотриэфирный способ из Narang, et al., Meth. Enzymol., 68: 90-99 (1979); фосфодиэфирный способ из Brown, et al., Meth. Enzymol., 68: 109-151 (1979); диэтилфосфорамидитный способ из Beaucage, et al., Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981); твердофазный фосфорамидитный триэфирный способ, описанный в Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts., 22(20): 1859-1862 (1981), например, с применением автоматических синтезирующих устройств, описываемых, к примеру, в Needham-VanDevanter, et al. Nucl. Acids Res. 12: 6159-6168 (1984); и способ твердой подложки из патента США №4458066. При химическом синтезе получают одноцепочечный олигонуклеотид. Его можно превратить в двуцепочечную ДНК с помощью гибридизации с комплементарной последовательностью или с помощью полимеризации с ДНК-полимеразой с применением одной цепи в качестве матрицы. Специалист будет учитывать, что хотя химический синтез ДНК ограничен последовательностями приблизительно 100 оснований, более длинные последовательности можно получить лигированием более коротких последовательностей.

В предпочтительном варианте осуществления последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению получают с помощью методик клонирования. Примеры подходящих методик клонирования и секвенирования, а также инструкций, достаточных для использования специалистами в качестве руководства в отношении множества процедур клонирования, находятся в Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Berger and Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press, Inc., San Diego Calif. (1987)) или Ausubel, et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, NY (1987). Описание продукта от производителей биологических реагентов и оборудования для экспериментов также обеспечивает полезную информацию. Такие производители включают SIGMA chemical company (Сент-Луис, Миссури), R&D systems (Миннеаполис, Миннесота), Pharmacia LKB Biotechnology (Пискатауэй, Нью-Джерси), CLONTECH Laboratories, Inc. (Пало-Альто, Калифорния), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Милуоки, Висконсин), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Гейтерсберг, Мэриленд), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Букс, Швейцария), Invitrogen, Сан Диего, Калифорния и Applied Biosystem (Фостер Сити, Калифорния), а также многие другие коммерческие источники, известные специалисту.

Клетки, подходящие для воспроизводства или для поддержки рекомбинантной экспрессии белка, хорошо известны в области техники. Такие клетки можно трансфицировать или трансдуцировать, в зависимости от конкретного случая, с помощью конкретного вектора экспрессии, а большие количества клеток, содержащих вектор, можно вырастить для засевания крупномасштабных ферментеров для получения достаточных количеств белка для клинических применений. Такие клетки могут включать прокариотические микроорганизмы, такие как E. coli; различные эукариотические клетки, такие как клетки яичников китайского хомячка (CHO), NSO, 292; дрожжи; клетки насекомых, а также трансгенных животных или трансгенных растений и т.п. В области техники известны стандартные методики для экспрессии чужеродных генов в этих системах.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают генетическое слияние или химический конструкт по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в данном документе "фармацевтически приемлемый носитель" означает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и антигрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Некоторые примеры фармацевтически приемлемых носителей представляют собой воду, физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, декстрозу, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композицию изотонических средств, к примеру, сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых веществ представляют собой смачивающие средства или минимальные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела. За исключением случаев, когда какой-либо традиционный наполнитель, носитель или среда несовместима с конструктами для доставки по настоящему изобретению, предусматривается их применение в фармацевтических препаратах по настоящему изобретению.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции активных соединений можно получить с носителем, который будет защищать композицию от быстрого высвобождения, например, составы с контролируемым высвобождением, в том числе имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Многие способы получения таких составов запатентованы или в общем известны специалистам в данной области техники. Смотри, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).

В определенных вариантах осуществления конструкты для доставки по настоящему изобретению могут вводиться перорально, к примеру, с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем. Соединение (и другие ингредиенты, при желании) также можно заключать в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой, прессовать в таблетки или вводить непосредственно в пищу субъекта. Для перорального терапевтического введения конструкты для доставки могут вводиться с наполнителями и применяться в форме проглатываемых таблеток, таблеток для медленного растворения в щечном кармане, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, капсул-пластинок и т.п. Для введения соединения по настоящему изобретению иным способом, чем парентеральное введение, может существовать необходимость покрыть соединение или вводить соединение совместно с материалом для предотвращения его инактивации.

Как правило, субъекту вводится фармацевтически эффективное количество конструкта для доставки по настоящему изобретению. Специалист может легко определить, достаточна ли дозировка конструкта для доставки для того, чтобы доставить эффективное количество макромолекулы, как описывается ниже. В определенных вариантах осуществления вводится от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1 г конструкта для доставки. В других вариантах осуществления вводится от приблизительно 10 мкг до приблизительно 500 мг конструкта для доставки. В еще одних вариантах осуществления вводится от приблизительно 10 мкг до приблизительно 100 мг конструкта для доставки. В еще других вариантах осуществления вводится от приблизительно 10 мкг до приблизительно 1000 мкг конструкта для доставки. В еще одних вариантах осуществления вводится от приблизительно 10 мкг до приблизительно 250 мкг конструкта для доставки. В еще одних вариантах осуществления вводится от приблизительно 10 мкг до приблизительно 100 мкг конструкта для доставки. Предпочтительно, вводится от приблизительно 10 мкг до приблизительно 50 мкг конструкта для доставки.

Конструкты для доставки по настоящему изобретению обеспечивают некоторые преимущества по сравнению с традиционными методиками локальной или системной доставки макромолекул субъекту. Главным среди таких преимуществ является возможность доставлять макромолекулу без применения иглы для прокалывания кожи субъекта. Многим субъектам требуются повторяющиеся регулярные дозы макромолекул. К примеру, диабетикам необходимо инъецировать инсулин несколько раз в день для контроля концентраций сахара в крови. Качество жизни таких субъектов могло бы значительно улучшиться, если бы доставку макромолекулы можно было осуществлять без инъекции, при этом избегая боли или потенциальных осложнений, связанных с ней.

Кроме того, многие варианты осуществления конструктов для доставки можно конструировать и экспрессировать в рекомбинантных системах. Рекомбинантная технология дает возможность получить конструкт для доставки с инсерционным сайтом, предназначенным для введения любой подходящей макромолекулы. Такие инсерционные сайты дают возможность специалисту быстро и легко получить конструкты для доставки для того, чтобы доставлять новые макромолекулы в случае возникновения потребности в этом.

Помимо этого, связь макромолекулы с остальной частью конструкта для доставки с помощью линкера, который расщепляется под действием фермента, присутствующего на базально-латеральной мембране эпителиальной клетки, обеспечивает освобождение макромолекулы из конструкта для доставки и высвобождение из остальной части конструкта для доставки вскоре после трансцитоза через эпителиальную мембрану. Такое освобождение снижает вероятность индукции иммунного ответа на макромолекулу. Это также обеспечивает взаимодействие макромолекулы, свободной от остальной части конструкта для доставки, с ее целью.

Другие преимущества конструктов для доставки по настоящему изобретению будут очевидны для специалистов в данной области техники.

Пример 1

Получили плазмидный конструкт, кодирующий зрелый Cholix Vibrio cholera, и применили его для экспрессии зрелого белка Cholix в системе экспрессии E. coli, как описано ранее; смотри, например, Jorgensen, R. et al., J Biol Chem, 283(16): 10671-10678 (2008). Нетоксичную мутантную форму гена Cholix (далее в данном документе именуемую "ntCholix") также получили посредством генетической делеции глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 581 (ΔE581), которая аналогична делеции (ΔE553) в белке PE, что делает его нетоксичным без значительного изменения его конформации; Killeen, K.P. and Collier, R.J., Biochim Biophys Acta, 1138: 162-166 (1992). Успешно выполнили экспрессию белка с применением клеток DH5α E. coli (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) после трансформации соответствующей плазмидой с помощью теплового шока (1 мин при 42°C). Трансформированные клетки, отобранные на антибиотик-содержащих средах, выделили и вырастили в бульоне Луриа-Бертани (Difco). Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-D-тиогалактопиранозида (IPTG). Через два часа после индукции при помощи IPTG клетки собрали с помощью центрифугирования при 5000 xg в течение 10 мин при 4°C. Тельца включения выделили после лизиса клеток и белки солюбилизировали в 6 M гуанидине-HCl и 2 мМ EDTA (pH 8,0) с 65 мМ дитиотреитолом. После рефолдинга и очистки белки хранили из расчета ~5 мл/мл в PBS (pH 7,4), не содержащем Ca²⁺ и Mg²⁺ при -80°C. На основании эксклюзионной хроматографии было подтверждено, что все белки, использованные в этих исследованиях, имеют >90% чистоту.

Затем форму ntCholix модифицировали на его С-конце для обеспечения прямого химического связывания через свободный сульфгидрильный остаток, расположенный вблизи C-конца белка. Стратегия C-концевой модификации показана на фигуре 1. C-концевая модификация включала цистеин-ограниченную петлю, содержащую консенсусную последовательность расщепления (ENLFQS) для высокоселективной протеазы из вируса гравировки табака (TEV), второй цистеин и гексагистидиновую (His₆) метку. Второй Cys включили для образования дисульфидного мостика с Cys, который в конечном итоге применяется для связывания. Добавление His₆-последовательности к белку упростило очистку, а с помощью последовательности расщепления для TEV обеспечили механизм для селективного удаления концевого остатка Cys, с последующим восстановлением в мягких условиях. Расщепление при помощи TEV и восстановление в мягких условиях 0,1 мМ дитиотреитолом после экспрессии и выделения конструктов ntCholix обеспечило прямое химическое связывание груза, флуоресцентного красителя Alexa Fluor® 488 путем реакции на основе малеимида как обобщенного механизма присоединения груза. Полученный в результате конструкт в данном документе обозначается ntCholix-Alexa488. После расщепления протеазой TEV, восстановления и связывания груза посредством реакции малеимида со свободным сульфгидрилом успешно выполнили удаление освобожденной C-концевой последовательности посредством второго этапа Ni²⁺ колоночной хроматографии.

Пример 2

Трансэпителиальный транспорт ntCholix-Alexa488 оценили in vitro с применением монослоев Caco-2. Вначале, клетки Caco-2 (количество пассажей 25-35) вырастили до конфлюэнтных монослоев, как описано ранее; Rubas, W. et al., Pharm Res, 10: 113-118 (1993). Вкратце, клетки поддерживали при 37°C в DMEM/среде для быстрого роста, обогащенной 2 мМ L-глутамином, 10% фетальной бычьей сывороткой и 100 единицами пенициллина/стрептомицина, в атмосфере 5% CO₂ и 90% влажности. Клетки пассировали каждую неделю при индексе разведения 1:3 в 75 см² флаконы и высевали на предварительно смоченные и покрытые коллагеном проницаемые (размер пор 0,4 мкм) поликарбонатные (Transwell™) фильтрующие подложки от Corning Costar (Кембридж, Массачусетс) при плотности 63000 клеток/см². Среду для роста заменяли через день. Конфлюэнтные монослои, которые определялись по приобретению значительного трансэпителиального сопротивления (TEER), определяемого с применением вольтомметра (World Precision Instruments, Сарасота, Флорида), использовали через 20-26 дней после высевания.

Также получили два дополнительных материала для применения в качестве контролей для оценки in vitro транспорта Cholix. В качестве внутреннего контроля относительно повреждения фильтра в коммерческом источнике (Sigma) приобрели тетраметилродаминизотиоцианат (TRITC)-меченый 70 кДа декстран. В качестве контроля относительно неспецифического краситель-опосредованного транспорта осуществили реакцию некоторых свободных аминов на поверхности бычьего сывороточного альбумина (BSA; Sigma) с Alexa488 сукцинимидильный сложный эфир карбоновой кислоты (A488-CASE; Invitrogen). Реакцию связывания осуществляли при комнатной температуре, при нейтральном pH, при молярном соотношении 10:1 A488-CASE:BSA в течение 4 часов, по достижении этого времени добавили избыток глицина для остановки реакции. Полученный в результате очищенный продукт содержал ~3 молекулы Alexa488 на молекулу BSA. Тетраметилродаминизотиоцианат (TRITC)-меченый 70 кДа декстран (Sigma), применили в качестве внутреннего контроля относительно повреждения фильтра. Измерения флуоресценции провели с применением прибора BMG labtech FLUOstar Omega с настройками возбуждение при 540 нм и излучение при 610 нм для TRITC-декстрана (оптимальное Ex=547 и Em=572) и возбуждение при 480 нм и излучение при 520 нм для Alexa488 белков (оптимальное Ex=496 и Em=519).

Скорости потока трансэпителиального транспорта измерили in vitro в апикальном (Ap) - базолатеральном (Bl) и в Bl-Ap направлениях с применением поляризованных монослоев клеток Caco-2 для описания процессов потока слизистая оболочка - серозная оболочка и серозная оболочка - слизистая оболочка, соответственно. Непосредственно перед началом исследования транспорта измерили трансэпителиальное сопротивление (TEER) каждого фильтра; причем показатели TEER монослоев <200 Ω·см² исключили из исследования. Ap и Bl среды удалили из включенных монослоев, и промыли эти поверхности однократно фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Затем один набор монослоев получил Ap (донорное) нанесение 100 мкл PBS, содержащего 10 мкг ntCholix-A488 и 10 мкг TRITC-декстрана или 10 мкг BSA-A488 и 10 мкг TRITC-декстрана. Приемные (Bl) компартменты затем получили 500 мкл PBS для того, чтобы задать Т₀ для исследования транспорта. Образцы отобрали как из донорного, так и из приемного компартментов через 4 часа после инкубации при 37°C для определения количества материала, транспортированного через монослой, и количества, оставшегося на апикальной поверхности, соответственно.

После 4 часов воздействия наблюдали, что произошел транспорт ~5% материала, добавленного на апикальную поверхность этих монослоев (смотри фигуру 2). Любые фильтры, демонстрировавшие уровни 75 кДа TRITC-декстрана в базальном компартменте, исключали из анализа. Контрольный белок BSA-Alexa488 не показал каких-либо значительных уровней в базальном компартменте при таком же периоде 4 часа (смотри фигуру 2). Средние значения транспорта составили 5,025±1,13% для Cholix и 0,56±0,33 для BSA (N=4). Эти данные подтверждают, что генетически детоксифицированная форма Cholix может осуществлять эффективный транспорт in vitro через поляризованные монослои клеточной линии рака кишечника человека, Caco-2.

Пример 3

Также получили и экспрессировали в E. coli вариант Cholix, усеченный по аминокислоте A³⁸⁶ (Cholix³⁸⁶), а также генетическое лигирование зеленого флуоресцентного белка (GFP) на C-конце Cholix³⁸⁶ (Choli³⁸⁶GFP). Экспрессию белка успешно провели с применением клеток DH5α Е. coli (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) после трансформации с помощью соответствующей плазмиды посредством теплового шока (1 мин при 42°C). Трансформированные клетки, отобранные на антибиотик-содержащих средах, выделили и вырастили в бульоне Луриа-Бертани (Difco). Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ изопропил-D-тиогалактопиранозида (IPTG). Через два часа после индукции при помощи IPTG клетки собрали с помощью центрифугирования при 5000 xg в течение 10 мин при 4°C. Тельца включения выделили после лизиса клеток и белки солюбилизировали в 6 М гуанидин-HCl и 2 мМ EDTA (pH 8,0) с 65 мМ дитиотреитолом. После рефолдинга и очистки белки хранили из расчета ~5 мл/мл в PBS (pH 7,4), не содержащем Ca²⁺ и Mg²⁺, при -80°C. Рефолдинг Cholix³⁸⁶GFP отслеживали по приобретению и сохранению характерного признака флуоресценции, связанного с этим флуоресцентным белком; Sample et al., Chem Soc Rev, 38(10): p.2852-64 (2009). Зеленый флуоресцентный белок (GFP) приобрели у Upstate (Шарлоттсвилл, Виргиния). На основании эксклюзионной хроматографии было подтверждено, что все белки, использованные в этих исследованиях, имеют >90% чистоту.

Полистирольные гранулы (диаметр 10 нм), содержащие ковалентно интегрированный красный флуоресцентный краситель со свойствами возбуждения/излучения 468/508 нм и с альдегидными функциональными группами на поверхности (XPR-582), получили от Duke Scientific (Пало-Альто, Калифорния). Сто мкл гранул XPR-582 (при 2% твердых частиц) смешали с приблизительно 2,5 нмоль GFP или Cholix³⁸⁶GFP в конечном объеме 200 мкл нейтрального (pH 7,0) фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Через 2 часа легкого покачивания при комнатной температуре добавили 20 мкл 2 мг/мл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA; Sigma, Сент-Луис, Миссури) в PBS. Препараты затем диализировали с помощью трех циклов разведения PBS и концентрирования с применением фильтрующего устройства Microcon от Millipore (Бедфорд, Массачусетс) с порогом молекулярного веса 100000. Конечные препараты покрытых гранул содержали 1% твердых частиц.

Пример 4

Клетки A549 (ATCC CCL-185™), L929 (ATCC CRL-2148™) и Caco-2 (ATCC HTB-37™) содержали в 5% CO₂ при 37°C на полных средах: среде Игла, модифицированной Дульбекко, F12 (DMEM F12), дополненными 10% фетальной бычьей сывороткой, 2,5 мМ глутамином, 100 единицами пенициллина/мл и 100 мкг стрептомицина/мл (Gibco BRL, Гранд Айленд, Нью-Йорк). Каждые 2-3 дня клетки снабжали этими средами (обозначенной полной средой) и пассировали каждые 5-7 дней. Для анализов клетки высеяли на 24- или 96-луночные планшеты и вырастили до конфлюэнтности.

Клетки Caco-2 вырастили в виде конфлюэнтных монослоев на покрытых коллагеном подложках трансвел с поликарбонатной мембраной с размером пор 0,4-мкм (Corning-Costar, Кембридж, Массачусетс) и использовали через 18-25 дней после достижения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)>250 Ω·см², измеряемого с применением вольтметра чопстик Millicell-ERS® (Millipore). Апикальный-базолатеральный (A→B) и базолатеральный-апикальный (B→A) транспорт Cholix или Cholix³⁸⁶GFP через эти монослои определили посредством измерения количества транспортированного белка через 4 часа после нанесения 20 мкг при 37°C. Для проверки барьерных свойств монослоя в ходе исследования использовали измерения TEER и степень 10 кДа флуоресцентного декстрана (измеряли с применением протокола эксклюзионной ВЭЖХ). Степень транспорта Cholix определили титрацией собранных сред в анализе цитотоксичности на основе клеток. Транспортированный Cholix³⁸⁶GFP измерили с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) с применением антитела к GFP для захвата и поликлональных сывороток к Cholix для обнаружения.

Скорости транспорта через монослои поляризованных клеток Caco-2 in vitro были сравнимы для Cholix, ntCholix и Cholix³⁸⁶GFP, как оценивается с помощью анализа в формате ELISA. В случае Cholix, поляризованные клетки Caco-2 не подверглись интоксикации белком, при проверке этого относительно TUNEL-обнаружения апоптоза или высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH). Важно, был обнаружен эффективный транспорт Cholix и химерных белков на основе Cholix от апикальной до базолатеральной поверхности монослоев Caco-2, но не в базолатеральном-апикальном направлении. Данные скорости и направленность транспорта были сравнимыми с теми, которые наблюдали ранее для PE, тестируемыми в таком же формате. Дополнительно, наблюдалось, что добавление кроличьей иммунной сыворотки к Cholix не блокировало эффективный транспорт Cholix или Cholix-родственных белков через монослои Caco-2 in vitro.

Конфокальную флуоресцентную микроскопию применили для изучения природы трансцитоза Cholix³⁸⁶GFP через монослои Caco-2 in vitro. В исследовании в зависимости от времени было показано, что Cholix³⁸⁶GFP поступает в эпителиальные клетки на протяжении 5 минут после его апикального нанесения и транспортируется через клетки к базолатеральной области клетки на протяжении 15 минут. У образцов, которые подвергли апикальному воздействию Cholix³⁸⁶GFP в течение 15 минут с последующим удалением избытка Cholix^GFP из апикальной камеры, наблюдали, что флуоресценции GFP продолжалась в направлении базолатеральной поверхности клетки, а не в обратном направлении к апикальной поверхности. Это однонаправленное перемещение Cholix³⁸⁶GFP подтверждалось измерением содержания Cholix³⁸⁶GFP в апикальных и базолатеральных компартментах на протяжении этого периода времени. При нанесении Cholix³⁸⁶GFP на базолатеральную поверхность монослоев Caco-2 не демонстрировалась какая-либо значительная флуоресценция, поступающая в клетки, что согласуется с исследованиями транспорта. Вестерн-блот анализ транспортированных Cholix, ntCholix и Cholix³⁸⁶GFP позволил предположить, что эти белки транспортируются без значительных изменений.

В in vitro исследованиях также было показано, что флуоресцентные латексные гранулы диаметром 100 нм, химически связанные с Cholix³⁸⁶GFP, эффективно транспортируются через монослои Caco-2 после апикального нанесения. При отборе латексных гранул с диаметром 100 нм обеспечили материал, который может легко поместиться в полости эндосомы диаметром 125 нм, происходящей из покрытой клатрином ямки. Таким образом, эти исследования позволяют предположить, что Cholix³⁸⁶GFP-латексные гранулы перемещаются через поляризованные клетки Caco-2 при помощи механизма, соответствующего захвату эндосом на апикальной поверхности клеток с последующим внутриклеточным направленным перемещением на основе эндосом. Предварительная инкубация Cholix³⁸⁶GFP-связанных флуоресцентных латексных гранул диаметром 100 нм с иммунной сывороткой к Cholix не изменила транспорт этих гранул. При применении сходного количество GFP, химически связанного с флуоресцентными латексными гранулами диаметром 100 нм, не происходило облегчение in vitro транспорта этих частиц через монослои Caco-2. Исследования при помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии подтверждали различия, которые наблюдали для трансцитоза латексной гранулы, покрытой Cholix³⁸⁶GFP в сравнении с GFP.

Полученный результат, что Cholix может транспортироваться через поляризованные эпителиальные барьеры подобно PE, является непредвиденным. Хотя их структуры подобны, как следует из кристаллографического анализа, аминокислотный состав их поверхностей сильно отличается; действительно, способы выравнивания на основании аминокислотного сходства с трудом находят соответствие этих двух белков. Это важно тем, что способность происходящего от патогена белка, такого как эти два фактора вирулентности, взаимодействовать с рецепторами клетки-хозяина предполагает вовлечение аминокислотных компонентов, экспрессируемых на поверхности. Так как оба этих белка (с их существенно отличающимися аминокислотными последовательностями) эффективно транспортируются через поляризованные эпителии, весьма вероятно, что некий иной механизм образует основу этой способности к транспорту. С нашей точки зрения структурные взаимоотношения, общие для PE и Cholix, образуют основу специфической способности их эффективного трансцитоза. Несмотря на то, что оба белка PE и Cholix, вероятно, обладают способностью связываться с рецептором на апикальной поверхности для обеспечения доступа в эндосомальные компартменты, более вероятно, что это взаимодействие и возможность вовлечения других рецепторов во внутриклеточное направленное перемещение этих белков основываются на конформационных структурах, а не на конкретных аминокислотах на поверхности белка.

Все продукты и способы, раскрытые и заявленные в данном документе, можно получить и осуществить без чрезмерного экспериментирования в свете настоящего раскрытия. Несмотря на то, что продукты и способы данного изобретения были описаны в контексте предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в области техники будет очевидно, что к продуктам и способам могут применяться вариации без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Все такие вариации и эквиваленты, очевидные для специалистов в области техники, будь то существующие в настоящее время или разработанные впоследствии, считаются находящимися в пределах сущности и объема настоящего изобретения, как определяется прилагаемой формулой изобретения. Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые в описании, указывают на уровни квалификации специалистов в области техники, которым соответствует настоящее изобретение. Все патенты, патентные заявки и публикации включаются в данный документ посредством ссылки во всей их полноте для всех целей и в той же степени, как если бы конкретно и отдельно указывалось, что каждая отдельная публикация включается посредством ссылки во всей ее полноте для любой и всех целей. Настоящее изобретение, иллюстративно описанное в данном документе, можно надлежащим образом осуществить на практике в отсутствие любого(ых) элемента(ов), конкретно не раскрытого(ых) в данном документе. Таким образом, например, в каждом случае в данном документе любой из терминов "содержащий", "по существу состоящий из" и "состоящий из" можно заменить любым из двух остальных терминов. Термины и выражения, которые были использованы, применялись в качестве терминов для описания и не для ограничения, и применение таких терминов и выражений не предназначено для исключения каких-либо эквивалентов показанных и описанных признаков или их частей, но признается, что в пределах объема заявленного настоящего изобретения возможны различные модификации. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение конкретно раскрывается посредством предпочтительных вариантов осуществления и необязательных признаков, специалист в данной области техники может прибегнуть к модификации и вариации понятий, раскрытых в данном документе, и что такие модификации и вариации рассматриваются находящимися в пределах объема данного изобретения, как определяется прилагаемой формулой изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению нетоксичной мутантной формы гена Cholix (ntCholix) Vibrio cholera, и может быть использовано в медицине. Получают вариант Cholix, усеченный по аминокислоте A(Cholix) или с удаленным остатком Glu. Полученный нетоксичный вариант Cholix связывают с терапевтическим грузом, который может представлять собой макромолекулу, малую молекулу, siRNA, PNA, miRNA, ДНК, плазмиду и антисмысловую молекулу. Изобретение позволяет осуществлять доставку терапевтического груза через поляризованные эпителиальные клетки, в том числе кишечника, в направлении от апикальной к базолатеральной поверхности монослоев клеток без инъекций. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Формула