Иммортализованная стволовая клетка и лекарственная композиция и лекарственный препарат, содержащие ее в качестве активного ингредиента - RU2619221C2

Чертежи

Показать все 16 чертежа(ей)

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к иммортализованной стволовой клетке, полученной из пульпы зуба, а также к фармацевтической композиции и фармацевтическому препарату, которые содержат ее в качестве активного ингредиента. В частности, изобретение относится к иммортализованной стволовой клетке, которую получают путем модификации стволовой клетки, полученной из естественно отторгнутых или удаленных, молочных или постоянных человеческих зубов, к фармацевтической композиции, содержащей множество факторов роста, продуцированных иммортализованными клетками, и к содержащему их фармацевтическому препарату.

Уровень техники

Методы восстановления функций поврежденной ткани, вызванной рядом причин, грубо классифицируются на трансплантационную терапию и регенерационную терапию. Трансплантационная терапия подразумевает, что органы, предоставленные донором, пересаживают для восстановления утерянных функций живого организма.

В отличие от этого, регенерационная терапия подразумевает, что клетки или ткани нескольких человек, включая самого пациента, культивируют для их обработки с формированием органов; а затем они заменяют пораженные клетки или органы, подлежащие восстановлению или регенерации, с использованием стволовых клеток.

В настоящее время для регенерационной терапии используют, или полагают, что они применимы, три типа клеток, такие как: человеческие соматические стволовые клетки, человеческие эмбриональные стволовые клетки (ES клетки) и человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS клетки).

В исследовании уже были использованы человеческие соматические стволовые клетки. Они существуют в тканях взрослого организма и обладают свойством дифференцироваться только в определенные ткани или органы. При этом "мезенхимальные клетки", существующие в костном мозге или жировых клетках, могут необычно дифференцироваться в различные ткани, такие как кости, хрящи, артерии и вены. При использовании таких соматических клеток, использование аутологичных клеток предотвращает иммунное отторжение и дает хорошее приживление. Кроме того, отсутствуют сообщения, что долговременное культивирование этих стволовых клеток вызывает их малигнизацию.

С другой стороны, известно, что клетки, которые должны быть дифференцированы, ограничены до некоторой степени, сбор клеток из тканей человека сопровождается инвазией, типы тканей, которые будут образованы дифференцированными клетками, ограничены до некоторой степени, и возможное количество пассажей ограничено до сорока и несколько раз, а именно, от 100 до 200 дней, которые вычисляются исходя из количества дней.

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (ES клетки) представляют собой стволовые клетки, из которых получают "внутреннюю клеточную массу" избыточного эмбриона (бластоцисты) для культивирования, полученного из регенерационной терапии и т.п. Поскольку они формируют тератомы в качестве индикатора своей плюрипотентности, полагают, что они могут быть дифференцированы в любую тридермальную фазу. Сообщалось, что они могут быть дифференцированы в миокард, нерв и сетчатку глаза. Поскольку эмбриональные стволовые клетки (ES) являются штаммом иммортализованных клеток, один штамм в их числе является непрерывно бесконечно культивируемым. Кроме того, при соответствующих условиях культивирования, продукт, обладающий сходными с клеткой свойствами, получают в больших масштабах.

С другой стороны, они используют оплодотворенную яйцеклетку так, чтобы она нуждалась в определенной обработке, которая не вызывает этических проблем. Также они представляют собой, в основном, гетеротрансплантацию; требуются средства для предотвращения реакции отторжения - иммунного ответа. Кроме того, известно, что им необходимы гетерологичные клетки или сыворотка при культивировании клеток в неблагоприятных условиях; и они легко образуют тератомы (доброкачественные опухоли), если очень незначительное количество недифференцированных клеток смешаны в трансплантированной регенерированной ткани.

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки образуются путем введения части генов, которые специфически экспрессируются в ES клетке, в клетку взрослого человека (дерма и подобное). При использовании аутологичных плюрипотентных клеток, проблема иммунного отторжения не возникает; методика дифференциации для ES клеток используется “как таковая”.

Наконец, индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки не используют оплодотворенную яйцеклетку, которая используется в ES клетках, но использует взрослую ткань для того, чтобы продуцировать клетку, обладающую такими же свойствами, что и эмбриональная стволовая клетка. При использовании аутологичных iPS клеток, проблемы реакции отторжения - иммунного ответа не существует.

С другой стороны, известно, что клетки легко превращаются в доброкачественные опухолевые клетки или раковые клетки (опухолевые эмбриональные клетки), и доля клеток, определенных как iPS клетки, является низкой; поскольку морфологически аналогичные клетки ES клеткам выбирают из всех клеток, которым интродуцированы гены.

Применение стволовых клеток в регенерационной терапии как таковых вызывает описанные выше проблемы. Таким образом, осуществляют поиск метода с использованием биологических факторов, продуцируемых различными стволовыми клетками, но не с использованием стволовых клеток “самих по себе”, например, различных факторов роста (WO 2011/118795, в настоящем описании ниже называется как "уровень техники 1").

В уровне техники 1 описана композиция для лечения пораженной области, содержащая культуральный раствор стволовых клеток, полученных, например, от человека, таких как естественно отторгнутых молочных зубов и подобное, а именно, культуральный раствор, включающий факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), бета-трансформирующий фактор роста (TGF-β) и тому подобное.

Уровень техники

[Патентные документы]

[Патентный документ 1] WO 2011/118795

Краткое изложение сущности изобретения

Задачи, решаемые изобретением

Предшествующий уровень техники является замечательным с той точки зрения, что в нем описана указанная выше композиция для лечения поврежденного участка, оказывающая эффекты восстановления кожи, пораженной воздействием ультрафиолетовых лучей, и регенерации костной ткани, и тому подобное.

Напротив, поскольку стволовая клетка, полученная из используемой пульпы зубов, не является стабильной клеточной линией, представляющий интерес культуральный раствор стволовых клеток не может быть получен до тех пор, пока стволовая клетка не будет получена в момент использования или не будет разморожен криосохраненный образец для роста клеток. Таким образом, существует проблема, заключающаяся в том, что требуется время, чтобы получить культуральный раствор.

Обычно, в числе культивируемых клеток, клеточный штамм, полученный из нормальной клетки, не может делиться после 50-60 пересевов, и клетка погибает. Естественно, что соотношения в композиции биологических факторов, продуцируемых культивируемыми клетками, изменяются в зависимости от времени. Таким образом, существует трудная задача получения супернатанта культуры, имеющего стабильные их соотношения, если клетки линии способны к неограниченному росту.

С другой стороны, в качестве типичных клеток, способных к неограниченному росту, могут быть указаны раковые клетки. То есть раковая клетка выходит из-под контроля и неограниченно растет, хотя такой рост и деление нормальных клеток находится под контролем живого организма. Таким образом, даже если клетка может неограниченно расти, злокачественная клетка не может быть использована; потому что клетки могут продуцировать вредные биологические факторы для живого организма.

Как описано выше, существует значительная потребность в стабильной иммортализованной клетке, которая не является злокачественной, но способна к неограниченному росту.

Для того чтобы использовать супернатант в качестве фармацевтического препарата, иммортализованная стволовая клетка должна обладать способностью непрерывно продуцировать определенные биологические факторы.

Способы решения задач

Настоящее изобретение было осуществлено в описанных выше условиях.

А именно, первый аспект настоящего изобретения относится к иммортализованной стволовой клетке, изолирующей стволовые клетки, выбранные из группы, состоящей из соматических клеток млекопитающего, за исключением раннего эмбриона млекопитающего, и мезенхимальных стволовых клеток; осуществлению первичного культивирования указанной стволовой клетки; трансфекции 4 генов в указанную первично культивированную стволовую клетку с выполнением генной трансфекции для выбора из их числа иммортализованных стволовых клеток посредством экспрессии STRO 1 в качестве индикатора. В настоящем описании указанные мезенхимальные стволовые клетки предпочтительно выбраны из группы, состоящей из стволовых клеток пульпы зуба, стволовых клеток костного мозга, стволовых клеток пуповины и стволовых клеток жировой ткани. Кроме того, указанные стволовые клетки предпочтительно выбирают из группы, состоящей из естественно отторгнутых молочных зубов, выпавших постоянных зубов, удаленных молочных зубов и удаленных постоянных зубов.

Указанный ранний эмбрион предпочтительно является эмбрионом на стадии бластодермы. Кроме того, указанное млекопитающее, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из человека, свиньи, лошади и обезьяны. Указанные стволовые клетки костного мозга, предпочтительно, являются клетками, способными дифференцироваться в мезенхимальную систему стволовых клеток, таких как остеобласты - клетки костной ткани, хрящевые клетки, жировые клетки и т.п., и немезенхимальную систему. Указанные умбиликальные стволовые клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки и мезенхимальные клетки, включенные в пуповинную кровь, которые соединяет эмбрион и плаценту. Предпочтительно, умбиликальные стволовые клетки включают многие из этих клеток. Указанные стволовые клетки костного мозга, предпочтительно, являются клетками, способными дифференцироваться в мезенхимальную систему стволовых клеток, таких как остеобласты - клетки костной ткани, хрящевые клетки, жировые клетки и т.п., и немезенхимальную систему. Умбиликальные стволовые клетки предпочтительно получают из Вартонова студня (Warton's jelly). Адипоцитные стволовые клетки представляют собой, предпочтительно, недифференцированные клетки, которые могут дифференцироваться в любые стволовые клетки.

Указанные 4 гена, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гена hTERT, гена bmi-1, гена E6, гена E7, гена Oct3/4, гена Sox2, гена Klf4, гена c-Myc и гена p16INK4a. В настоящем описании они предпочтительно представляют собой hTERT, bmi-1, Е6 и Е7 для введения в мезенхимную клетку. Кроме того, они предпочтительно представляют собой 4 гена, выбранные из группы, состоящей из Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, p16INK4a для введения в соматические клетки.

Указанная иммортализованная стволовая клетка предпочтительно обладает способностью к восстановлению теломеры и обладает способностью к делению по меньшей мере 200 раз. Кроме того, по меньшей мере 40% клеточной популяции, предпочтительно, представляет собой STRO-1-экспрессирующие клетки при 20 удвоений популяции, и обладает способностью продуцировать неонатальную костную массу, аналогичную первичной культивированной клетке.

Кроме того, указанная иммортализованная стволовая клетка секретирует предпочтительно по меньшей мере IGF-1, VEGF, TGF-β1 и HGF в указанный культуральный раствор.

Вторым аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая указанный культуральный раствор указанных иммортализованных стволовых клеток, обладающих описанными выше свойствами.

Кроме того, третий аспект настоящего изобретения представляет собой фармацевтический препарат для восстановления пораженной ткани, содержащий указанную фармацевтическую композицию. В настоящем описании лекарственные формы фармацевтического препарата для восстановления пораженной ткани выбраны из группы, состоящей из порошка, жидкости, геля, спрея и системы для введения через кожу. Кроме того, указанная пораженная ткань является предпочтительно любой тканью, выбранной из группы, состоящей из ткани, пораженной язвой или пролежнем, ткани головного мозга с дегенеративным поражением клеток, ткани головного мозга, частично утраченной после хирургической операции, ткани головного мозга, пораженной травматическим заболеванием головного мозга, ткани головного мозга, пораженной воспалительным заболеванием головного мозга, пораженной костной ткани, пораженного пародонта, ткани, пораженной заболеванием центральной нервной системы, и ткани, пораженной не поддающимся лечению заболеванию кожи.

В настоящем описании, указанная клеточная дегенерация, предпочтительно, вызвана заболеванием, выбранным из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, когнитивных расстройств, шизофрении, депрессии, церебральной гипоксии, бокового амиотрофического склероза, церебрального инфаркта, мозжечковой дегенерации, сахарного диабета и гепатита. Кроме того, указанное травматическое заболевание головного мозга предпочтительно вызвано дорожно-транспортным происшествием или несчастным случаем, вызванным падением. Указанная воспалительная энцефалопатия также предпочтительно является заболеванием, выбранным из группы, состоящей из энцефалита, энцефалопатии, эпилепсии, болезни Крейцфельда-Якоба и полиомиелита. Кроме того, указанное заболевание центральной нервной системы, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из травмы спинного мозга и миелопатии. Указанным рефрактерным дерматитом, предпочтительно является атопический дерматит.

Кроме того, содержание культурального раствора для репарации предпочтительно составляет от 50 до 500% (масса/объем), когда раствор, полученный с помощью любых иммортализованных стволовых клеток, составляет 100%.

Четвертый аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения иммортализованной стволовой клетки, включающий стадии: отделения стволовой клетки от популяции клеток, отобранных из группы, состоящей из мезенхимальных клеток молочной железы, раннего эмбриона и соматических клеток, отличных от указанных мезенхимальных клеток; культивирования указанных стволовых клеток в качестве первичной культуры с получением первично культивированных клеток; трансфекции 4 генов в указанную первично культивированную клетку для продуцирования ген-трансфицированной клетки; и отбора клеток путем использования STRO-1-экспрессирующего количества при 20 клеточных удвоениях и способности костной регенерации в качестве индексов.

В настоящем описании мезенхимальная клетка предпочтительно выбрана из группы, состоящей из клетки пульпы зуба, клетки костного мозга, умбиликальной клетки и жировой клетки. Клетка пульпы зуба, эмбрион в начальной стадии развития, стволовые клетки костного мозга, а также умбиликальные стволовые клетки являются такими, как описано выше. Млекопитающее является также таким, как описано выше.

Кроме того, 4 гена предпочтительно выбраны из группы, состоящей из hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc и p16INK4a. В настоящем описании они предпочтительно представляют собой hTERT, bmi-1, E6 и E7, предназначенных для введения в мезенхимальную клетку. Кроме того, они представляют собой 4 гена, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc и p16INK4a, предназначенных для введения в соматическую клетку.

hTERT является геном обратной транскриптазы теломеразы человека, и bmi также является комплексом белков группы polycomb, который относится к ауторепродукции или контролю пролиферации стволовых клеток. Е6 и Е7 являются генами, которые находятся в открытой рамки считывания, кодирующей “ранний” ген, используемый для ауторепродукции вирусом папилломы человека.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу чрескожного всасывания для восстановления поврежденной ткани, включающий стадии: получения пленкообразующей лекарственной формы путем растворения указанного фармацевтического препарата для восстановления указанной поврежденной ткани в пленкообразующем, сохраняющем влагу компоненте; покрытия указанного поврежденного участка указанной пленкообразующей лекарственной формой; и контакта положительно заряженного электрода с желаемым участком.

Иммортализованные стволовые клетки по настоящему изобретению содержат по меньшей мере 40% положительных клеток STRO-1 после того как они разделятся 40 раз. Кроме того, поскольку они обладают способностью восстанавливать теломеры, они могут делиться по меньшей мере 200 раз. Альтернативно, они могут секретировать различные биологические факторы в культуральный раствор в течение длительного времени.

Положительный эффект изобретения

Согласно настоящему изобретению, соответственно, могут быть получены иммортализованные стволовые клетки, которые могут непрерывно продуцировать определенные биологические факторы в течение длительного времени.

Кроме того, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, предусмотрены фармацевтическая композиция и препарат на ее основе, который может быть использован для восстановления поврежденного участка.

Кроме того, предусмотрен превосходный способ всасывания через кожу для повышения скорости всасывания из поврежденного участка.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен график, показывающий зависимость времени культивирования от количества удвоений популяции (количество удвоений популяции, здесь ниже называется "PD") между иммортализованными стволовыми клетками и неиммортализованными стволовыми клетками. На фиг. 1, SHED-T представляет иммортализованные клетки, и SHED-C представляет неиммортализованные клетки.

На фиг. 2 представлен график, показывающий результаты экспрессии STRO-1 как в SHED-C, так и SHWD-T (см. фиг. 2(A)-(D)). Где PD20 обозначает, что количество удвоений составляет 20, PD30 обозначает, что количество удвоений составляет 30, и PD40 обозначает, что количество удвоений составляет 40.

На фиг. 3 представлена фотография, на которой изображено лечение язвы на коже. (А) показывает состояние до начала лечения язвы, и (В) показывает состояние кожи после лечения.

На фиг. 4 представлен график, показывающий зависимость между количеством удвоений популяции (число раз) и массы вновь образованной костной ткани. На рисунке, ** показывает р<0,05, *** показывает р<0,01. Массу вновь образованной костной ткани вычисляли с использованием следующего уравнения:

Масса вновь образованной кости=участок вновь образованной костной ткани/видимый участок×100.

На фиг. 5 представлены изображения SHED-C и SHED-T с окрашиванием тканей в каждый момент индивидуального удвоения, показанного на фиг. 4, в момент, когда они были трансплантированы.

На фиг. 6 представлены фотографии, показывающие восстановление пролежня. (А) показывает состояние кожи до лечения, и (B) после лечения.

На фиг. 7 представлены КТ изображения, показывающие развитие изменения формы кости через 1-6 месяцев после пересадки имплантата при использовании фармацевтического препарата. (А)-(С) представляют собой изображения, показывающие фронтальную проекцию, и (D)-(F) представляют собой изображения в горизонтальной плоскости.

На фиг. 8 представлены изображения, показывающие состояние альвеолярного кости пациента с пародонтозом. На (А) показано состояние в начале лечения (до операции), и на (B) показано состояние через 3 месяца после операции.

На фиг. 9 представлены фотографии, показывающие результат остеогенеза в ячейке при использование β-ТСР в качестве матрицы. (А) показывает результат через 3 месяца после удаления зуба, и (В) показывает результат имплантации, выполненной через 6 месяцев после удаления зуба.

На фиг. 10 показаны замещения и другие из β-TCP (β-трикальцийфосфат, 3CaO-P₂O₅) костной ткани в случае, когда β-TCP используют в качестве матрицы. (А) представляет фотографию, изображающую удаленный материал, и (B) показывает результат гистохимического анализа. (С) и (D) являются частично увеличенными изображениями представленных изображений. На фигурах NB показывает новую кость, и TCP показывает β-TCP. Кроме того, BV показывает кровеносный сосуд, и SF показывает нижнюю часть удаленной ткани.

На фиг. 11 показан участок применения, когда культуральный раствор стволовых клеток вводят в интраназально через обонятельную луковицу.

На фиг. 12 представляет собой фотографию осуществления трансназального введения.

На фиг. 13 представляет собой МРА изображение, показывающее тромбоз кровеносного сосуда у пациента с нарушением мозгового кровообращения.

На фиг. 14 представлено изображение среза КТ, показывающее поврежденный участок мозга у пациента с нарушением мозгового кровообращения.

На фиг. 15 представлено МРТ изображение, показывающее объем кровотока в поврежденном участке головного мозга у пациента с нарушением мозгового кровообращения. (А) представляет собой изображение сразу после инсульта, и (B) представляет собой изображение после лечения.

На фиг. 16 представлен график, показывающий результат изменений (NIHSS) (по шкале тяжести инсульта Национального института здравоохранения США), которое отражает состояние пациента в период лечения.

На фиг. 17 представлена фотография, показывающая восстановление функционального состояния пациента. (A) представляет собой фотографию, показывающую состояние восстановления функции руки, и (B) показывает состояние физических показателей.

На фиг. 18 представлен результат, зависящий от времени изменения после краткой оценки состояния когнитивных функций (Mini Mental State: MMS), или теста Hasegawa, выполненного для группы, которой вводили лекарственный препарат, и для группы, которой не вводили лекарственный препарат. На фиг. 18 (А) показан результат для группы, которой не вводили лекарственный препарат, и на фиг. 18 (В) показан результат для группы, которой вводили лекарственный препарат.

На фиг. 19 представлена фотография, показывающая результаты лечения кожных заболеваний, не поддающихся лечению. На фиг. 19 (A) показано состояние до начала лечения, и на фиг. 19 (В) показано состояние в конце лечения.

Вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение подробно описано ниже.

Для того чтобы получить иммортализованную стволовую клетку по настоящему изобретению, сначала стволовые клетки выделяют из клеточной группы, состоящей из мезенхимальных клеток млекопитающего, клеток эмбриона на ранней стадии развития и соматических клеток за исключением мезенхимальных клеток. В качестве млекопитающего, животное, предпочтительно, выбрано из группы, состоящей из человека, свиньи, лошади и обезьяны, потому что клетки, полученные от млекопитающего, генетически схожи с человеческими клетками и не опасны ввиду инфекционного заболевания.

В настоящем описании термин "мезенхимальная клетка" определяется как клетка, обладающая способностью дифференцироваться в клетку, принадлежащую к мезенхимальным, таким как остеобласты, адипоциты, мышечные клетки, клетки хряща и тому подобное. Конкретными примерами мезенхимальных клеток являются клетка пульпы зуба, клетки костного мозга, умбиликальные клетки и адипоциты указанных выше животных. Кроме того, термин "ранний эмбрион", определяется как эмбрион на ранней стадии - бластоциста, то есть находящийся на более прогрессивной стадии, чем оплодотворенная яйцеклетка, и необходимой для формирования ES клеток. Термин "соматическая клетка", определяется как общий термин для клеток, за исключением половых клеток, из которых состоит живой организм.

Кроме того, термин "клетка пульпы зуба" определяется как одна из стволовых клеток, включенная в нерв зуба, и обладающая способностью к регенерации. Поскольку она защищена твердым материалом зубов, УФ свет или радиоактивное излучение не проникает, и гены в этих клетках нелегко повреждаются. Термин "клетки костного мозга" определяется как общий термин для клеток, полученных из пунктата костного мозга, и клетки костного мозга включают клетки ряда лейкоцитов, таких как миелобласты или клетки ряда эритробластов, мегакариоциты и плазматические клетки, и тому подобное.

В настоящем описании термин "умбиликальная клетка" определяется как клетка, находящаяся в пупочном канатике, который связывает эмбрион и плаценту. Она находится в пуповине, а также в пуповинной крови. Пуповина содержит пуповинную кровь, которая обогащает гемопоэтические стволовые клетки.

Поскольку гены вводят в стволовые клетки, как описано выше, имеются указанные гены, например, hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, INK4a и тому подобное. Ген hTERT является теломера-репаративным ферментом; bmi-1 представляет собой ген Bmi-1, который является одним из белков, состоящих из комплекса белков группы polycomb. В настоящем описании Bmi-1 необходим для поддержания гемопоэтических стволовых клеток с эффектом увеличения стволовых клеток путем увеличения активности.

Е6 и Е7, оба представляют собой ранние гены или HPV-16 или HPV-18. Кроме того, Oct3/4 представляет собой ген, который взаимодействует с Sox2, чтобы повысить транскрипцию гена-мишени. Klf4 (фактором транскрипции типа Kruppel 4) регулирует гены, связанные с клеточным делением и эмбриогенезом, и связан со злокачественной опухолью желудочно-кишечного тракта в качестве супрессора опухоли.

Sox2 относится к SRY-связанному семейства генов HMG box и известен как ген, который связан с поддержанием недифференцированных функций (тотипотентность). с-Мус является геном, стимулирующим злокачественную опухоль, и способствует как выживанию, так и гибели клеток в с-Мус-индуцированной опухоли. p16INK4a является геном, который играет важную роль для контроля клеточного цикла опухолевых клеток.

Далее описан пример получения иммортализованной клетки с использованием зубной пульпы, полученной из естественно отторгнутого молочного зуба человека.

Сначала естественно отторгнутый молочный зуб дезинфицируют с помощью дезинфицирующего средства, например, хлоргексидина, изодина и подобного. После этого коронку зуба разделяют в горизонтальном направлении с помощью, например, зубного дрильбора и т.п., для извлечения зубной пульпы.

Полученную ткань пульпы суспендируют в базальной среде, например, такой как среда Игла, модифицированная Дульбекко (далее обозначаемая как "DMEM"), содержащей от 5 до 15% (объем/объем) фетальной сыворотки (здесь далее, иногда обозначаемая как "DMEM"), и от 50 до 150 ед/мл антибиотиков, и подобное. Затем обрабатывают от 1 до 5 мг/мл коллагеназы при 37°C в течение 0,5-2 часов.

В качестве базальной среды могут быть использованы DMEM, среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков (IMDM; GIBCO и т.д.), среда Хэма F12, HamF12; SIGMA, Gibco и т.д.), среда RPMI1640 и тому подобное. Кроме того, может быть использован смешанный носитель, содержащий по меньшей мере две среды. В качестве примера смешанной среды может быть указана среда, включающая IMDM и HamF12 в равном количестве (например, коммерчески доступная под торговым наименованием: IMDM/HamF12 (Gibco)).

В качестве добавляемых в среду компонентов могут быть использованы, например, сыворотка крови (фетальная бычья сыворотка или фетальная телячья сыворотка, обозначенные как "FBS" или "FCS"), сыворотки крови человека, сыворотки овец и заменители сыворотки (нокаутный заменитель сыворотки (KSR) и т.д.), бычий сывороточный альбумин (BSA), антибиотики, такие как пенициллин, стрептомицин и другие, витамины, минералы и тому подобное.

Базальная среда может быть также использована для селекции культуры клеток, как указано ниже, и для культивирования селектированных клеток.

После ферментативной обработки, для извлечения клеток пульпы зуба, выполняют процедуру центрифугирования в течение от 3 до 10 минут (3000-7000 оборотов в минуту). В зависимости от необходимости, клетки селектируют с помощью клеточного фильтра. Селектированные клетки, например, ресуспендируют в 3 до 6 мл базальной среды для посева в чашку с диаметром от 4 до 8 см для культивирования прилипающих клеток.

Далее добавляют среду, например, DMEM, содержащую 10% FCS, и затем клетки инкубируют в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 2 недель. После удаления среды, клетки промывают от 1 до нескольких раз PBS и т.п. Вместо удаления среды и промывки клеток, прилипающие стволовые клетки, полученные из клеток зубов, которые образуют колонии, могут быть собраны. Для отделения от чашки, адгезивные полученные из зубов стволовые клетки обрабатывают раствором, включающим 0,025-0,1% трипсин и 0,3-1 мМ EDTA, в течение нескольких минут при 37°С. Далее отделенные клетки собирают.

После ферментативной обработки, для сбора клеток пульпы зуба, образец центрифугируют в течение примерно 3-10 минут (3000-7000 оборотов в минуту). В случае необходимости, клетки отделяют друг от друга с помощью клеточного фильтра. Разделенные клетки ресуспендируют, например, в 3-6 мл базальной среды для посева в чашку для культивирования прилипающих клеток с диаметром от 4 до 8 см.

Затем добавляют культуральную среду, например, DMEM, с добавлением 10% FCS; Затем клетки инкубируют в инкубаторе с 5% при 37°С в течение 2 недель. Культуральный раствор удаляют и клетки промывают PBS от 1 до нескольких раз. Вместо удаления культуральной среды и промывки клеток, могут быть собраны прилипающие клетки пульпы зубов, образующие колонии. Прилипающие клетки пульпы зубов отделяют от чашки, например, с помощью 0,025-0,1% трипсина и 0,3-1 мМ EDTA, в течение нескольких минут при температуре 37°С, и затем их собирают.

Далее селектированные прилипающие клетки, полученные указанным выше способом, культивируют. Например, стволовые клетки, полученные указанным выше способом, высевают в чашки для культивирования прилипающих клеток и затем культивируют в инкубаторе в условиях 5% СО₂ и при 37°C. Кроме того, могут быть получены первичные культивированные клетки человеческих стволовых клеток естественно отторгнутых молочных зубов (SHED-P).

В пересеиваемой культуре, когда клетки становятся субконфлюэнтными или конфлюэнтными при макроскопическом наблюдении, как указано выше, клетки собирают с помощью трипсина и EDTA. Затем клетки снова высевают в чашки для культивирования, содержащие культуральную среду.

В настоящем описании термин "субконфлюентный", означает состояние, при котором клетки прикрепляются к около 70% площади дна сосуда для культивирования. Например, пассаж выполняют от 1 до 8 раз, и селектированные клетки размножают до необходимого количества клеток, например, около 1×10⁷ клеток/мл. После культивирования, как описано выше, клетки собирают для хранения в жидком азоте. Клетки, отобранные у различных доноров, могут быть сохранены в виде банка стволовых клеток пульпы зуба.

Далее, для создания ген-трансдуцированных клеток, в первичные культивированные клетки, полученные из первичной культуры стволовых клеток, вводят 4 гена. Гены, трансдуцированные по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой 4 типа, выбранные из группы, состоящей из hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc и p16INK4a. При введении hTERT, bmi-1, E6 и E7 могут быть получены иммортализованные клетки, имеющие самое большое количество удвоений популяции. В настоящем описании hTERT является геном для теломеразной обратной транскриптазы человека; bmi-1 является геном группы Polycomb, относятся к ауторепродукции стволовых клеток или регулирования дифференциации. Е6 и Е7 являются генами, которые присутствуют в открытой рамки считывания, кодирующей ранний ген, используемый для саморепликации вируса папилломы человека.

Эти гены могут быть введены следующим образом.

Для клонирования генов, подготавливают плазмиду для вставки генов-мишеней и затем вставляют в челночный вектор, например, pShuttle2. Для селекции трансформантов, устойчивых к канамицину, трансформируют E. coli с помощью вектора челночного вектора. Для идентификации рекомбинанта посредством анализа сайтов рестрикции, очищают плазмидную ДНК селектированного трансформанта, устойчивого к канамицину.

Затем используют рестриктазу, например, PI-Sce I и I-Cue I, чтобы вырезать кассету экспрессии из челночного вектора; затем лигируют в вектор аденовируса, например, Adeno-X вирусную ДНК. Полученный продукт лигирования расщепляют с помощью SwaI и используют для преобразования E.coli.

В числе полученных трансформантов были селектированы трансформанты, устойчивые к ампициллину. ДНК рекомбинантного аденовируса, в которую вставлены гены, очищают для идентификации трансформанта путем анализа сайтов рестрикции.

Далее, аденовирус обрабатывают PacI для трансфекции клеток НЕК 293. Рекомбинантный аденовирус культивируют и затем собирают для определения их титров. В соответствии с обычным способом очистки вируса, его используют для инфицирования клетки-мишени, SHED-P.

Клеточную популяцию, инфицированную вирусом, окрашивают с помощью FITC в соответствии с обычным способом, и затем положительные клетки STRO-1 обнаруживают с использованием проточного цитометра. В настоящем описании STRO-1 рассматривается как один из маркеров для мезенхимальных стволовых клеток, обладающих плюрипотентностью в костном мозге, и становится показателем клеточной иммортализации.

В соответствии с вышеописанной методикой, могут быть получены иммортализованные стволовые клетки из пульпы зуба.

Далее, полученные иммортализованные стволовые клетки культивируют в базальной среде, например, среде DMEM, дополненной 10% FBS в условиях 5% CO₂ при 37°С в течение 24-48 часов с получением культурального раствора. Для того чтобы собрать культуральный раствор, используют, например, пипетки типа Komagome и т.п. Собранный культуральный раствор может быть использован “как таковой” в качестве активного ингредиента для фармацевтических препаратов по настоящему изобретению. Кроме того, он может быть использован в качестве активного ингредиента для фармацевтических препаратов после обработки, такой как конденсация, замена растворителя, диализ, лиофилизация, разбавление и тому подобное.

Как описано ниже, культуральный раствор иммортализованных стволовых клеток, полученных описанным выше способом, включает ряд факторов роста и демонстрирует множество функций без высокой очистки. А именно, композиция по настоящему изобретению для использования при многих заболеваниях может быть получена обычным способом. Таким образом, можно избежать снижения биологической активности факторов роста, вызванного высокой очисткой.

Следует отметить, что "культуральный раствор иммортализованных клеток", используемый в настоящем изобретении, определяется как культуральный раствор, включающий различные биологические факторы, полученные при культивировании иммортализованных стволовых клеток, и он представляет собой раствор, который не включает любые клетки, такие как иммортализованная стволовая клетка и другие клетки. При получении культурального раствора без сыворотки, бессывороточную среду предпочтительно используют в течение всего процесса, от первичной культуры до пассажа, или используют в течение нескольких пассажей перед сбором клеток.

Стволовые клетки пульпы зуба, селектированные и культивированные с использованием вышеописанного метода, являются клетками, полученными из тканей живого организма, и обладают свойствами, аналогично свойствам первичных культивированных клеток. В большинстве случаев, первичные культивированные клетки обладают свойствами, аналогичными свойствам клеток органа, используемого в качестве источника, и важно, что их свойства близки к нормальной клетке. Тем не менее, они растут медленнее по сравнению с клеточной линией, и иногда дедифференцируются в процессе непрерывного культивирования. Таким образом, трудно сохранять обладающие свойствами клетки.

Тем не менее, иммортализованная стволовая клетка по настоящему изобретению имеет значительно более высокий коэффициент экспрессии STRO-1, который становится показателем анапластической степени, по сравнению с коэффициентом стволовых клеток пульпы зуба, которые не являются иммортализованными клетками на момент времени, когда удвоения популяции соответствуют 20 или 40. Предпочтительно, чтобы иммортализованная стволовая клетка имела более высокий коэффициент, например, около 1,5-3, потому что высокий коэффициент экспрессии STRO-1 становится показателем, при котором клетки демонстрируют свойства, аналогичные свойствам первичным культивированным клеткам.

Кроме того, иммортализованные стволовые клетки секретируют по меньшей мере два фактора роста, выбранных из группы, состоящей из инсулиноподобного фактора роста (IGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), трансформирующего фактора роста β (TGF-β) и фактора роста гепатоцитов (HGF) в культуральный раствор. В настоящем описании термин "фактор роста" является общим термином для полипептидов, которые способствуют делению клеток, вызывают морфологическое изменение или клеточную гипертрофию. Факторы роста различаются в зависимости от продуцирующих их клеток, и они грубо классифицируются на эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста опухоли (TGF) и тому подобное.

Кроме того, поскольку рецепторы на клеточной мембране каждой клетки обладают активностью тирозинкиназы, связывание с ними факторов роста вызывает фосфорилирование остатков тирозина в белках и вызывает клеточный рост или пролиферацию. Известно, что существует несколько примеров того, что фактор роста становится индуктором мезодермы в онтогенезе. Кроме того, известно, что существует несколько примеров, того, что лимфокин, который модулирует иммунную систему, становится индуктором мезодерма в онтогенезе. Такие факторы роста могут быть определены посредством известного ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA), анализа на микрочипе или тому подобное.

IGF-1 является полипептидом, имеющим в высокой степени аналогичную с инсулином последовательность и, аналогично инсулину, вызывает в культуральных клетках реакции, такие как митогенез и т.п. Также известно, что IGF оказывает влияние на рост нервных клеток. VEGF относится к семейству гликопротеинов, вовлеченных в васкулогенез, посредством которого вновь образуются кровеносные сосуды в области, где кровеносные сосуды еще не сформировались, в период эмбриональной стадии эмбриогенеза, и в ангиогенез, посредством которого вновь образуются кровеносные сосуды путем разветвления и продления уже существующих кровеносных сосудов. TGF-β также становится мощным ингибитором роста различных клеток и принимает значительное участие в дифференциации, миграции и адгезии клеток, и играет важную роль в обширной области, такой как онтогенез, реконструкция тканей, заживление ран, воспаления и иммунитет, инвазия злокачественной опухоли и метастазирование, и тому подобное. Кроме того, HGF обладает рядом физиологических активностей, будучи вовлеченным в регенерацию и защиту тканей и органов, например, стимуляцию пролиферации клеток и движение клеток, антиапоптоз (клеточная смерть), морфогенетическую индукцию, ангиогенез и другие, для различных клеток, включая гепатоциты.

Каждую стволовую клетку, описанную выше, культивируют, например, в среде DMEM, дополненной 15% FCS, при 37°С в течение определенного времени, при этом может быть получен культуральный раствор, включающий указанные выше факторы роста. Следует отметить, что культуральный раствор стволовых клеток включает около 70 типов белков, за исключением IGF-1, VEGF, TGF-β и HGF.

15 мл культурального раствора из полученного культурального раствора выливают на ультрацентрифужный фильтр Amicon Units-10K (Millipore Limited). Затем центрифугируют при 4000×g в течение приблизительно 60 минут, чтобы сконденсировать около 200 мкл. Далее, тот же объем PBS в виде культурального раствора выливают в пробирку и вновь центрифугируют при 4000×g в течение приблизительно 60 минут, для замены растворителя на PBS. Полученные 200 мкл раствора собирают в микропробирку с получением культурального раствора конденсированных стволовых клеток.

Вместо метода с использованием Amicon, как описано выше, концентрирование может быть выполнено методом осаждения этанолом. Например, 45 мл 100% этанола добавляют к 5 мл культурального раствора, для их смешивания, и затем оставляют при -20°С в течение 60 минут. Затем, для удаления супернатанта, центрифугируют при 15000×g в течение 15 минут при 4°С.

Далее, например, 10 мл 90% этанола добавляют в лунку со смесью, и затем снова центрифугируют при 15000×g в течение 5 минут при 4°С. После удаления супернатанта, полученный осадок может быть растворен, например, в 500 мкл стерилизованной воды. После растворения, весь объем собирают в микропробирку и получают конденсированный культуральный раствор стволовых клеток.

Культуральный раствор, полученный описанным выше способом, может быть также лиофилизирован обычным способом, с получением фармацевтического препарата, который подготавливают во время применения.

Содержание фактора роста в культуральном растворе, включенном в фармацевтический препарат, предпочтительно составляет приблизительно от 50 до 500% масс. от его общей сухой массы. Поскольку, когда содержание составляет не более 50% масс., он не оказывает какого-либо эффекта; и когда превышает 500% масс., улучшение эффекта не ожидается.

В качестве лекарственной формы фармацевтического препарата, указаны, например, порошок, жидкость, гель, спрей, системы для чрескожного введения и тому подобное. Например, фармацевтический препарат может быть получен путем добавления наполнителя, эксципиента, регулятора кислотности и подобного, для разлива в контейнер небольшого размера, например, стерильные стеклянные ампулы, пробирки для разделения сыворотки и тому подобное. При применении препарат растворяют с помощью физиологического раствора или стерильной дистиллированной воды для инъекций, и затем он может быть введен путем трансназального введения. Альтернативно, для адгезии на пораженный участок, его вводят с помощью слоя марли, пропитанной раствором. В случае применения препарата для остеогенеза альвеолярной кости и других костей, в качестве матричного компонента используют коллаген, β-ТСР и другие вещества, которые погружают в жидкий раствор для заливки.

В качестве поврежденных тканей, в отношении которых применяется фармацевтический препарат по настоящему изобретению, указаны, например: ткани, в которых формируется язва или пролежни, мозговая ткань, поврежденная закупоркой кровеносных сосудов, и ткани, поврежденные костным заболеванием, пародонтозом и заболеванием центральной нервной системы, и подобным.

В настоящем описании, "язва" определяется как участок с поражением ткани, образованный на поверхности органа с лизисом или отслоением ткани в результате некроза, и язва формируется в эпидермисе, дерме, слизистой оболочке и т.д. Если поражение ткани пальцев стопы не достигают дермы, его называют эрозией. Конкретно, язва образуется на участке контакта с поверхностью тела, такой как кожа, слизистая оболочка полости рта и носа, роговицы и т.д., или поверхностью полых органов, таких как желудочно-кишечный тракт, дыхательный путь, мочевыводящие пути, кровеносные сосуды и других органов

Клинический термин "пролежни" означает, что в тканях, прилегающих к участку поверхности организма, который контактирует с поддерживающей поверхностью (главным образом с кроватью), нарушено местное кровообращение и возникает некроз, когда пациент введен в состояние, при котором он может удерживать одно и то же положение, и не может перевернуться.

Термин "нарушения, вследствие хирургической операции", обозначает нарушение, которое вызвано хирургической операцией, такой как удаления опухоли головного мозга и других опухолей.

Термин "закупорка кровеносных сосудов" означает состояние, при котором кровеносный сосуд закупоривается по любой из следующих причин. Например, ситуация, при которой кровеносный сосуд сужается вследствие атеросклероза и кровоток останавливается; эмбола (сгусток крови или жирных кислот) отрывается от выстилки кровеносного сосуда, блокируя кровоток, и кровоток не достигает атеросклеротического участка кровеносного сосуда близко к сердцу; и кровоснабжение останавливается воспалением, спазмом или изменением компонента крови или кровотока.

"Головной мозг" обладает функциями запоминания, проявления эмоций, принятия решений и т.п. Головной мозг покрыт жидкостью, называемой спинномозговой жидкостью. Спинномозговая жидкость (ликвор, CSF) обладает защитной функцией мозга и осуществляет транспорт питания и метаболитов. Спинномозговая жидкость может быть получена путем спинномозговой пункции пациента, однако свойства зависят от заболевания пациента и подобного.

В настоящем описании термин "спинной мозг" означает нервный ствол позвоночных. Кроме того, термин "центральная нервная система" означает ткань, включающую спинной мозг и головной мозг. Центральная нервная система работает в качестве рефлекторного центра для стимуляций из периферии или объединения стимуляций.

Повреждение центральной нервной системы вызывается травмой спинного мозга и подобного. В настоящем описании термин "повреждение спинного мозга" является состоянием, при котором спинной мозг поврежден под воздействием внешних или внутренних факторов, таких как опухоль, грыжа спинного мозга и других факторов. В зависимости от степени, повреждение классифицируются на полное, при котором спинной мозг полностью расщеплен, и неполное, при котором спинной мозг поврежден или сдавлен, но функция спинного мозга частично сохраняется.

"Миелопатия" возникает вследствие развития шейного спондилеза, вызванного старением (отек вверх межпозвоночного диска или формирование остистого отростка).

Фармацевтический препарат может быть нанесен на пораженный участок в жидкой форме или в форме геля, и наносится в виде пленкообразующего препарата. Во-первых, он абсорбируется компонентом, удерживающим влагу, например, марлей, удерживающей влагу пленкой для медицинского применения и т.п., для получения препарата в форме пленки. Далее, препарат в форме пленки наносят на пораженный участок, покрывая его. Отрицательно заряженный электрод в виде стержня помещают на пленку, которая покрывает пораженный участок, осторожно вращая стержень. Положительно заряженный электрод контактирует с желаемым участком, за исключением пораженного участка.

Как описано выше, активный ингредиент в фармацевтической композиции эффективно вводиться с использованием электрического тока между электродом, прикрепленным к пораженному участку, и электродом, контактирующим с областью, не являющейся пораженным участком.

При применении фармацевтического препарата по настоящему изобретению, его наносят на поврежденную ткань, что может обеспечить быстрое восстановление ткани.

Пример 1

(Получение иммортализованных SHED и способ культивирования)

(1) Агенты для экстракции, плазмиды и т.п.

(1-1) Реагент и другие компоненты

Использовали канамицин (KAN), ампициллин (Amp), жидкую среду LB и среду с агаром LB, гликоген, агарозу, стерилизованную воду, ацетат аммония, ацетат натрия, додецилсульфат натрия и РНКазу А. Подготавливали 50 мг/мл канамицин (KAN) и ампициллин (Amp) для хранения их в качестве исходных растворов при -20°C. Подготавливали гликоген при концентрации 20 мг/мл. Подготавливали 10 мг/мл РНКазу A для хранения при -20°C. Подготавливали 10М (насыщенный) ацетат аммония (NH₄OAc) и 3М ацетат натрия (NaOAc; pH 5,2).

(1-2) Рестрикционный фермент и т.п.

Компетентные клетки E.coli (компетентные клетки Supercharge EZ10 Electro, код продукта 636756), Swa I (код продукта 1111A, Smi I является аналогичным), Xho I (код продукта 1094A), T4 ДНК-лигаза (код продукта 2011A), NucleoBond Xtra Midi (код продукта 740410.10/0.50/0.100), плазмиды NucleoSpin (код продукта 740588 10/50/250) были приобретены у компании Takara Bio Inc. Pac I приобретали у компании New England Biolabs.

(1-3) Буфер и т.п.

Получали 1×ТЕ буфер (10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), включая 1 мМ EDTA), который представляет собой смесь фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), насыщенный 100 мМ Трис-HCl (рН 8,0). Далее в настоящем описании он называется “раствор PCI". Этанол использовали или 100%-ый или 70%-ый. Для очистки pAdeno-X плазмидной ДНК, использованной в рекомбинации на малом участке, получали следующие буферы 1-4.

Буфер 1: 25 мМ Трис-HCl, включающий 10 мМ EDTA и 50 мМ глюкозы (рН 8,0) (после автоклавирования хранили при 4°C).

Буфер 2: 0,2М NaOH, содержащий 1% SDS (получали непосредственно перед использованием, плотно закрывали и хранили при комнатной температуре).

Буфер 3: 5M KOAc (после автоклавирования хранили при 4°C).

Буфер 4: 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), включающий 1 мМ EDTA и 20 мкг/мл РНКазы (непосредственно перед применением добавляли РНКазу, хранили при -20°C).

(2) Очистка аденовируса и реагенты для β-gal анализа

Использовали клетки HEK293 (ATCC #CRL1573), трансформированные аденовирусом человека типа V. Клетки HEK293 культивировали в полной среде. Композиция полной среды представляла собой DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, базальная среда) с добавлением 100 ед/мл пенициллина G натрия, 100 мкг/мл стрептомицина, 4 мМ глутамина и 10% FBS. Получали раствор пенициллина G натрия при концентрации 10000 ед/мл, и получали раствор сульфата стрептомицина при концентрации 10000 мкг/мл. Их хранили в виде исходных растворов.

При культивировании использовали 60 мм планшет, 100 мм планшет, 6-луночный планшет, сосуды Т75 и Т175.

Трипсин-EDTA (код продукта CC-5012) приобретали у компании Takara Bio Inc. Получали забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS, без Ca²⁺ и Mg²⁺) и забуференный фосфатом физиологический раствор по Дульбекко (DPBS, с Ca²⁺ и Mg²⁺). Кроме того, использовали 0,33% нейтральный раствор красного красителя, и 0,4% трипановый раствор синего красителя.

В анализе β-gal, X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (25 мг/мл)) в растворе диметилформамида (ДМФА) хранили при -20°C в светонепроницаемом контейнере. Использовали набор Luminescent β-gal Detection II (код продукта 631712, Takara Bio Inc).

(3) Предварительный тест

(3-1) Конструирование рекомбинантного аденовируса, включающего LacZ (pAdeno-X-LacZ)

После размораживания клеток НЕК293 и удаления ДМСО из раствора, клетки HEK293 ресуспендировали в 10 мл полной среды. Затем все количество переносили на культуральный планшет, имеющий диаметр 100 мм. После адгезии НЕК293 на планшете, культуральную среду удаляли. Затем клетки промывали один раз стерильным PBS. Затем добавляли 1 мл трипсина-EDTA для их обработки в течение 2 минут.

Далее, для прекращения взаимодействия трипсина добавляли 10 мл в полной среде, и затем клетки мягко суспендировали. Используя количество жизнеспособных микроорганизмов, 10⁵ клеток переносили на чашку с диаметром 100 мм, содержащую 10 мл среды для равномерного рассеивания.

Использовали pShuttle2-LacZ (вектор позитивного контроля, включенный в Adeno-X экспрессионную систему 1) и Adeno-X вирусную ДНК (ферментативно обработанную PI-Sce I и I-Ceu I), включенные в набор. В соответствии с протоколом, прилагаемым к набору, конструировали рекомбинантный аденовирус, включающий LacZ. Им инфицировали клетку-мишень, SHED, и анализировали экспрессию β-галактозидазы для подтверждения того, что вектор был сконструирован.

(3-2) Конструирование рекомбинантной плазмиды pShuttle2

До конструирования рекомбинантного вектора pShuttle2 (здесь ниже называемый "вектор rpShuttle2"); E. coli DH5α трансформировали с помощью включенных в набор вектора pShuttle2 и вектора pShuttle2-LacZ. Трансформированные клетки селектировали на планшете с агаром LB, включающим 50 мкг/мл канамицина (здесь ниже называемый "LB/Kan"). Бактериальные клетки, полученные из одной колонии, высевали на новой LB/Kan для инкубирования при 37°C в течение ночи.

Далее, hTERT, bmi-1, Е6 и Е7 клонировали в pShuttle2. Вектор pShuttle2 расщепляли с помощью фермента рестрикции, подходящего для этих генов.

Далее, было решено встроить информационный пакет вектора pShuttle2 (PT3416-5), прилагаемый к набору, сайт множественного клонирования ДНК. Плазмиду, обработанную рестриктазой, обрабатывали с использованием щелочной фосфатазы для очистки.

Согласно общепринятому способу получали целевые ДНК-фрагменты, подлежащие очистке. Вектор обрабатывали ферментом рестрикции и лигировали фрагменты гена. Используя продукт лигирования, трансформировали клетки DH5α (компетентные клетки). Часть компетентной клетки подвергали трансформации с помощью контрольного вектора, pShuttle2-lacZ, включенного в набор для использования в качестве позитивного контроля.

Смесь, включая трансформированную E.coli, высевали на планшеты с агаром LB/Kan для селекции устойчивых к канамицину (Kanr) трансформированных клеток (колония). Выбирали от пяти до 10 Kan резистентных клонов, и их высеивали в небольшом количестве жидкой среды для амплификации. После подтверждения того, что эти клоны содержат вектор rpShuttle2, их инкубировали в течение ночи. Затем, с использованием коммерчески доступной адсорбционной колонки с силикагелем, сконструированную плазмидную ДНК очищали обычным способом.

Плазмидную ДНК обрабатывали ферментом рестрикции, которые будут подвергнуты электрофорезу в 1% агарозном геле; тем самым идентифицировали целевую рекомбинантную плазмиду. При секвенированием подтверждали направление встроенного фрагмента и встроенного сайта для определения позитивного клона.

Рекомбинантную pShuttle2 плазмидную ДНК (здесь далее обозначаемую как "rpShuttle2 плазмидная ДНК") непосредственно трансфицировали в клетку-мишень, и затем ее подвергали вестерн-блоттингу для предварительной оценки экспрессии целевого белка.

(3-3) Двойная ферментная обработка rpShuttle2 плазмидной ДНК c помощью PI-Sce I/I-Ceu I

От rpShuttle2 плазмидной ДНК, полученной указанным выше способом, получали кассету экспрессии встроенного гена с помощью PI-Sce I и I-Ceu I. В соответствии с in vitro методом лигирования, описанном в протоколе прилагаемой к набору, полученную кассету экспрессии встраивали в Adeno-X вирусную ДНК. Получали 30 мкл раствора для двойной ферментной обработки с помощью PI-Sce I/I-Ceu I для rpShuttle2 плазмидной ДНК. Смешивали с реагентами, представленными в следующей таблице 1, помещенными в 1,5 мл-овую стерилизованную микроцентрифужную пробирку.

Далее, после полного смешивания, микроцентрифужную пробирку слегка центрифугировали, и затем инкубировали в течение 3 часов при 37°C.

Реакционную смесь для двойной ферментной обработки (5 мкл) подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле с EtBr вместе с лэддером размером 1 т.н. (размер ДНК маркера).

(3-4) Экстрагирование смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт

В центрифужную пробирку добавляли остатки раствора для двойной ферментной обработки (25 мкл), 70 мкл 1×ТЕ буфера (рН 8,0) и 100 мкл смеси PCI, содержимое пробирки смешивали на вихревой мешалке. Затем пробирку центрифугировали на микроцентрифуге при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Затем водный слой переносили в 1,5 мл-овую чистую центрифужную пробирку. В этот момент добавляли 400 мкл 95% этанола, 25 мкл 10М ацетата аммония и 1 мкл гликогена (20 мг/мл), и затем перемешивали на вихревой мешалке.

Далее, центрифугировали при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Затем супернатант удаляли аспирацией с получением осадка. 300 мкл 70% этанола добавляли к осадку, центрифугировали в течение 2 минут при 14000 оборотов в минуту. Супернатант осторожно аспирировали для удаления, осадок сушили воздухом около 15 мин.

После того, как осадок высушили, его растворяли в 10 мкл стерилизованного 1×ТЕ-буфера (рН 8,0), и раствор хранили при -20°C.

(4) Конструирование рекомбинантной Adeno-X плазмидной ДНК

(4-1) Субклонирование кассеты экспрессии в Adeno-X вирусный геном

Реагенты, представленные в следующей таблице 2, последовательно добавляли в 1,5 мл-овую стерилизованную микроцентрифужную пробирку. Затем содержимое мягко перемешивали и слегка центрифугировали. Затем инкубировали при 16°C в течение ночи.

К каждому образцу добавляли 90 мкл 1×ТЕ буфера (pH 8,0) и 100 мкл смеси PCI, и затем полученную смесь мягко перемешивали на вихревой мешалке. Центрифугировали при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут, и водный слой переносили в 1,5 мл чистую микропробирку. Затем в пробирку добавляли 400 мкл 95% этанола, 25 мкл 10М раствора ацетата аммония и 1 мкл гликогена (20 мг/мл), и затем смесь слегка перемешивали на вихревой мешалке.

Полученную смесь подвергали центрифугированию при 4°C в течение 5 минут при 14000 оборотов в минуту, и супернатант удаляли путем аспирации с получением осадка. Следующие процедуры осаждения этанолом аналогичны описанным в (3-4).

После сушки осадок растворяли в 15 мкл стерильной деионизированной воды.

(4-2) Swa I ферментная обработка рекомбинантной Adeno-X плазмидной ДНК

Получали раствор для ферментной обработки как показано в следующей таблице 3, и добавляли каждый образец в центрифужную пробирку. Затем их инкубировали в течение 2 часов при 25°C.

К каждому образцу добавляли 80 мкл буфера 1×TE (pH 8,0) и 100 мкл смеси PCI, и затем смесь мягко перемешивали на вихревой мешалке. Следующие процедуры осаждения этанолом аналогичны описанным в (3-4), и разведенный раствор осадка хранили до использования при -20°C.

(4-3) Подтверждение результата трансформации клеток E. coli посредством рекомбинантной Adeno-X плазмидной ДНК

Электропорированные компетентные клетки (E. coli) трансформировали с помощью SWA I обработанных продуктов, полученных в примере (4-2), используя Supercharge EZ10 Electrocompetent Cell (код продукта 636756).

Смесь трансформированных клеток высевали на чашки с агаровой средой, которая представляет собой смесь среды LB и ампициллина (конечная концентрация 100 мкг/мл) (здесь далее называемая "чашка с LB/Amp-агаром"), и затем инкубировали при 37°C в течение ночи. Около 10⁶ клеток колоний получали в виде трансформированных клеток, устойчивых к ампициллину (AMPR). Полученные колонии проверяли с помощью набора Adeno-X System PCR Screening Primer, прилагаемому к продукту.

Бактериальные клетки одной колонии высевали в 5 мл свежей жидкой среды LB/Amp и инкубировали в течение ночи. На следующий день, в соответствии со способом на малом участке, как описано ниже, очищали Adeno-X плазмидную ДНК.

(4-4) Мини-масштабное получение рекомбинантной Adeno-X плазмидной ДНК

5 мл log-фазы культуральной среды центрифугировали при 14000 оборотах в минуту в течение 30 секунд для удаления супернатанта. Осадок снова центрифугировали при 10000 оборотах в минуту в течение 1 минуты, и затем супернатант удаляли с помощью микропипетки.

Добавляли 150 мкл буфера 1 и мягко пипетировали для повторного суспендирования. 150 мкл буфера 2 добавляли к клеточной суспензии. Затем клеточную суспензию мягко преобразовывали в смесь и оставляли в течение 5 минут на льду. К охлажденной суспензии клеток добавляли 150 мкл буфера 3, и затем эту суспензию вновь преобразовывали в смесь и оставляли в течение 5 минут на льду.

Суспензию клеток центрифугировали при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут, и прозрачный супернатант переносили в 1,5 мл-овую чистую центрифужную пробирку. 450 мкл смеси PCI добавляли в супернатант, и затем преобразовывали в смесь. Затем центрифугировали при 4°C при 14000 оборотов в минуту в течение 5 минут, и водный слой переносили в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.

Следующие процедуры осаждения этанолом аналогичны описанным в (4-1), и разведенный раствор осадка хранили до использования при -20°C. Представляющую интерес рДНК идентифицировали, используя анализ с ферментами рестрикции и ПЦР, как описано ниже.

(5) Анализ сайта рестрикции полученной rAdeno-X плазмидной ДНК

Анализ проводили с использованием PI-SCE I и I-Ceu I. Представленные в следующей таблице 4 реагенты помещали в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Затем добавляли 30 мкл PI-Sce I/I-Ceu I раствора для двойной ферментной обработки, затем полностью перемешивали и затем пробирку слегка вращали, чтобы собрать содержимое.

Это содержимое инкубировали при 37°C в течение 3 часов, чтобы выполнить рестрикционную обработку. Реакционную смесь после обработки подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле с EtBr.

(6) Получение рекомбинантного аденовируса

(6-1) Получение rAdeno-X плазмидной ДНК для трансфекции клеток НЕК293

Реагенты, представленные в следующей таблице 5, помещали в 1,5 мл-овую стерилизованную центрифужную пробирку для смешивания, и затем ее слегка центрифугировали на микроцентрифуге. Затем ее инкубировали при 37°C в течение 2 часов для обработки rAdeno-X плазмидной ДНК с использованием рестрикционного фермента Pac I.

Добавляли 60 мкл 1× буфера TE (pH 8,0) и 100 мкл смеси PCI, и затем мягко перемешивали на вихревой мешалке. Затем центрифугировали на микроцентрифуге при 4°C в течение 5 минут при 14000 оборотов в минуту. Водный слой осторожно переносили в 1,5 мл-вую чистую стерилизованную центрифужную пробирку.

Следующие процедуры осаждения этанолом аналогичны описанным в примере (3-4), и разведенный раствор осадка хранили при -20°C перед использованием.

(6-2) Трансфекция Adeno-X плазмидной ДНК, обработанной Pac I, в клетки HEK293

За 24 часа до трансфекции плазмидной ДНК, клетки НЕК 293 высевали на 60 мм культуральный планшет так, чтобы число клеток составляло примерно 1-2×10⁶ (около 100 клеток/мм²). Затем их инкубировали при 37°C в присутствии 5% СО₂.

10 мкл Adeno-X плазмидной ДНК, обработанной PacI, трансфицировали в каждый культуральный планшет для введения Adeno-X ДНК в клетки HEK293 в соответствии со стандартным методом трансфекции (набор CalPhos Mammalian Transfection, код продукта 631312, Takara Bio Inc.). Наличие CPE (цитопатический эффект) подтверждали со следующего дня трансфекции.

Через одну неделю, клетки, прилипшие на дне или стенке культурального планшета, высвобождали посредством мягкого перемешивания. Полученную клеточную суспензию переносили в 15 мл стерилизованную центрифужную пробирку с коническим дном и центрифугировали при комнатной температуре в течение 5 минут при 1500×g.

Полученный осадок суспендировали в 500 мкл стерилизованного PBS. Раствор 3-х кратно подвергали процедуре свободного размораживания, который замораживали в смеси сухой лед/этанол и размораживали в инкубаторе при 37°C с получением лизата, в котором клетки были полностью разморожены. Далее, раствор слегка центрифугировали для удаления взвешенных веществ, и затем супернатант переносили в другую стерилизованную пробирку для немедленного использования. Лизат, не использованный немедленно, хранили при -20°C.

К клеткам, культивируемым в планшете с диаметром 60 мм, добавляли 250 мкл лизата и продолжали культивирование. Следует отметить, что при использовании анти-Hexon антитела, включенного в набор Adeno-X Rapid Titer (код продукта 631028, Takara Bio Inc), титрование аденовируса выполняли согласно руководству (PT3651-1), прилагаемому к набору.

(6-3) Вирусная амплификация для получения вируса, имеющего высокий титр

За 24 часа до начала титрования, клетки HEK293 высевали в сосуд T75 и инкубировали при 37°C при 5% CO₂ в течение ночи, для подтверждения, что они достигли 50-70%-ной конфлюентности.

На следующий день среду заменяли средой, содержащей вирус для инфицирования при MOI=10. После инкубации при 37°C в присутствии 5% СО₂ в течение 90 минут, сосуд извлекали, и в сосуд добавляли 10 мл среды.

Клетки культивировали при 37°C 3-4 часа в присутствии 5% CO₂, и подтверждали наличие CPE. После высвобождения 50% клеток, суспензию высвобожденных клеток получали способом, описанным выше; суспензию помещали в 15 мл-овую стерилизованную центрифужную пробирку с коническим дном. Выполняли описанную выше процедуру замораживания и размораживания, и клетки размораживали. При использовании набора Adeno-X Rapid Titer (код продукта 631028), получали титр, составляющий 10⁷ БОЕ/мл.

Выполняли вестерн-блоттинг, и с его помощью подтверждали, имеет ли упакованный геном аденовируса копии специфической транскрипционной единицы относительно гена-мишени в качестве функциональной формы.

(7) Инфицирование клетки-мишени аденовирусом

(7-1) Инфицирование клетки-мишени

За 24 часа до инфицирования, 1×10⁶ клеток SHED высевали на 6-луночный планшет. На следующий день после посева, среду удаляли и в каждую лунку планшета добавляли 1,0 мл среды, содержащей вирус. Раствор наносили на монослой, образованный SHED.

Клетки инкубировали при 37°C в течение 4 часов в присутствии 5% CO₂, и SHED инфицировали вирусом. Затем добавляли свежую среду и затем инкубировали при 37°С в присутствии 5% СО₂. Через 24-48 часов после инфицирования, анализировали экспрессию интродуцированного гена в зависимости от времени.

(7-2) Анализ экспрессии β-галактозидазы инфицированных клеток

Экспрессию β-галактозидазы в прилипающих клетках, инфицированных Adeno-X-LacZ, анализировали с помощью набора Luminescent β-gal Detection II (код продукта 631712, Clontec Laboratories Inc.).

Пример 2

(1) Получение SHED

Использовали естественно отторгнутые молочные зубы здорового 10-ти летнего мальчика. После того, как естественно отторгнутые молочные зубы дезинфицировали раствором Isodine, венец зуба горизонтально разрезали с помощью зубного дрильбора, и затем ткань пульпы собирали с помощью зубной фрезы. Полученную ткань пульпы зуба ферментативно обрабатывали в растворе, включающем 3 мг/мл коллагеназы I типа и 4 мг/мл дисперсии, при 37°C в течение 1 часа. Далее, раствор фильтровали с использованием 70 мм клеточного фильтра (Falcon).

Отфильтрованные клетки ресуспендировали в 4 мл среды для посева в чашку для культивирования с диаметром 6 см. DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла), включающая 10% FCS, добавляли в чашку и культивировали в течение 2 недель в инкубатор в 5% CO₂ при 37°C. Прилипшие клетки, образующие колонии (стволовые клетки пульпы зуба), обрабатывали смесью 0,05% трипсин-EDTA 0,2 мМ в течение 5 минут при 37°C, и затем клетки, отделенные от чашки, собирали.

Далее, прилипшие клетки, селектированные указанным выше способом, высевали на чашки для культивирования для прилипающих клеток (чашка с коллагеновым покрытием), и клетки инкубировали в инкубаторе в атмосфере 5% CO₂ при 37°C в качестве первичной культуры с получением клеток первичной культуры. Когда клетки стали макроскопически субконфлюентными (около 70% поверхности культурального контейнера была покрыта клетками), либо конфлюентными, клетки обрабатывали смесью 0,05% трипсина-EDTA 0,2 мМ при 37°C в течение 5 минут, для отделения клеток от контейнера и затем собирали.

Полученные таким образом клетки снова высевали на чашке, содержащей среду, и несколько раз выполняли пассаж для роста с получением количества клеток, составляющего приблизительно 1×10⁷ клеток/мл. Полученные клетки хранили в жидком азоте.

После этого, используя клетки первичной культуры, выполняли пассаж при концентрации клеток 1×10⁴ клеток/см². В эксперименте использовали клетки, пассированные от 1 до 3 раз. BMMSC человека (мезенхимальная стволовая клетка костного мозга, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга) приобретали у компании Lonza Group Ltd. и культивировали в соответствии с инструкцией, прилагаемой производителем.

Как описано выше, получали стволовые клетки пульпы естественно отторгнутых молочных зубов (SHED) человека. Среди полученных SHED, около 1×10⁶ клеток из клеток, экспрессирующих STRO-1, были сортированы из каждого образца с использованием FACSTARPLUS (Becton, Dickinson and Company).

Согласно инструкции производителя, прилагаемой к набору для окрашивания бромдезоксиуридином, BrdU (Invitrogen), BrdU вводили в клетки в течение 12 часов для оценки темпов роста SHED (n=3 в каждой группе). Эти эксперименты повторяли 5 раз. После однофакторного дисперсионного анализа, для оценки статистически значимого расхождения выполняли тест Тьюки-Крамера.

Для обнаружения STRO-1 посредством иммунофлуоресценции, SHED фиксировали с помощью 3% параформальдегида и дважды промывали PBS, и затем обрабатывали с использованием 100 мМ глицина в течение 20 минут. Далее проницаемость этих клеток нарушали с помощью 0,2% Triton-X (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут. Затем их инкубировали в смеси 5% ослиной сыворотки и 5% бычьего сывороточного альбумина в течение 20 минут.

Далее, клетки инкубировали первичными антителами, мышиными антителами против STRO-1 человека (1:100, R&D Inc.) в течение 1 часа, и затем инкубировали с вторичным антителом, козьим антителом к мышиному иммуноглобулину М-FITC (1:500, Southern Biotech Корпорация) в течение 30 минут, и затем подготавливали для исследования с использованием вектора Shield DAPI (Vector Laboratories Inc.).

После этого, в 6-ти луночный планшет добавляли α-МЕМ с добавлением 15% FBS, и затем отсортированные клетки высевали в каждую лунку с получением клонов. Для исследования объединяли около 300 колоний в числе пролиферирующих клеток.

(2) Трансгенез

Как описано выше, 4 гена, bmi-1, Е6, Е7 и hTERT, интегрировали в вектор аденовируса с получением вирусного вектора для экспрессии генных продуктов. В качестве контроля подготавливали контрольный вектор, в который эти гены не интегрировали.

SHED высевали на чашку с коллагеновым покрытием диаметром 100 мм при концентрации 1×10⁶ клеток, а затем добавляли DMEM с добавлением 10% FBS. Клетки культивировали до тех пор, пока они не стали субконфлюентными. Среду удаляли путем аспирации и добавляли 500 мкл вирусного раствора, разведенного средой (MOI=10), и затем инкубировали при 37°C в течение 1 часа в инкубаторе с 5% CO₂ для инфицирования вирусным вектором. Через 48 часов от инфицирования, среду заменяли указанной выше средой. Инфицированные клетки инкубировали в течение 10 дней в среде с добавлением пуромицина (1 пг/мл) для отбора устойчивого клона, и объединяли 500-600 устойчивых клонов. Каждые 3-4 дня, около 0,5×10⁵ клеток SHED высевали в чашку с культурой, имеющей диаметр 100 мм, для выполнения пассажа. SHED, в который были перенесены гены, назвали SHED-T, и SHED, в который не были перенесены гены, назвали SHED-C.

Пример 3

(1) Измерение скорости роста SHED-C и SHED-T

Статус времени удвоения популяции SHED-T (SHED, в который были перенесены гены) показан на фиг. 1. На фигуре вертикальная ось показывает количество удвоений популяции (количество клеточных делений, раз), и ось абсцисс показывает период времени (день культивирования). Стандартом оценки созревания было состояние, при котором SHED в культуре не делились в течение 1 месяца.

Рост SHED-C остановился на примерно 30 разе для вхождения в фазу созревания или завершения пролиферации. В отличие от этого, SHED-T превысили этот рост и пролифелировали после того, как прошло 800 дней.

(2) Анализ с использованием проточной цитометрии

Для получения суспензии отдельных клеток, монослой прилипающих клеток обрабатывали смесью трипсин/EDTA. К 2×10⁵ клеткам добавляли моноклональные анти-STRO-1 антитела (1:100) и оставляли для анализа с использованием проточного цитометра FACS Calibur (Becton, Dickinson и компании). Когда относительный уровень флуоресценции был больше, чем 99%, по сравнению с контрольными антителами, относящимися к одному и тому же изотипу, экспрессия была позитивной. Как в SHED-T, так и в SHED-C клетки первичной культуры и позже пассированные клетки фиксировали и окрашивали FITC связывающими STRO-1 антителами. Затем анализировали с применением проточной цитометрии. Тест повторяли дважды. Доля STRO-1 положительных клеток в SHED-C составляла 27% при PD20, и уменьшилась на 15% при PD30 (фиг. 2(А) и (B)). Доля STRO-1 положительных клеток в SHED-T составляла 46% при PD20 и 41% при PD40, соответственно (фиг. 2(C) и (D)).

(3) Исследование дифференцирующей способности

Дифференцирующие способности SHED-C или SHED-T при PD0, PD10 и PD20 исследовали посредством способности формировать новую костную массу и гистологического окрашивания ткани.

Во-первых, 2,0×10⁶ клеток SHED-С или SHED-Т смешивали с 40 мг керамического порошка гидроксиапатита/трикальцийфосфат (HA/TCP) (Olympus Corporation), и затем смесь инокулировали подкожно ниже дорсальной поверхности мыши с ослабленным иммунитетом 10-ти недельного возраста (NIH-bgnu-xid, самка, Harlan Sprague Dawley Inc.).

Через восемь недель после инокуляции, инокулянт извлекали и фиксировали с использованием 4% формалина для удаления солей кальция. Затем его буферировали с использованием раствора PBS, включающего 10% EDTA для заливки в парафин. Часть его хранили в 70% этаноле для заливки в смоле.

Парафиновый срез депарафинировали и гидратировали. После этого, срез окрашивали гематоксилином и эозином (здесь ниже обозначаются как "H&E"). На фиг. 5(А)-(С) показаны окрашенные изображения SHED-T (иммортализованные стволовые клетки) при PD0-PD20, и на фигурах (D)-(F) показаны окрашенные изображения SHED-C (нормальные клетки) при PD0-PD20. Для определения новорожденной формации in vivo, отбирали заданные положения и вычисляли площадь новорожденного и видимого участка для получения новорожденной массы этих значений для инокулянта, образованного после инокуляции SHED-T или инокуляции SHED-C.

Новорожденная масса = Новорожденная площадь/видимая площадь×100

На фиг. 4 показаны изменения новорожденной массы SHED-T и SHED-C при каждом количестве удвоения популяции (время удвоения). На фигуре, ** показывает, что р<0,05, *** показывает, что р<0,01. Следует отметить, что новорожденная масса была получена с помощью следующего уравнения.

Как показано на фиг. 4, новорожденная масса уменьшалась в зависимости от увеличения удвоений популяции SHED-C, и уменьшалась до значения около 1/5 при PD20 по сравнению со значением при PD0. В отличие от этого, костная масса не изменялась при PD20 в SHED-T, и костная масса в SHED-T была в 5 раз больше, чем у SHED-C при PD20.

(4) Оценка активности развития злокачественной опухоли

1×10⁶ клетки SHED-C или клетки SHED-T инокулировали в подкожную ткань мышам с ослабленным иммунитетом. После инокуляции, проводили наблюдение в течение более чем 30 дней. Тем не менее, опухоль не была сформирована в течение срока наблюдения у любой из мышей, которым были пересажены клетки. Кроме того, все клоны культивируемых клеток не показали морфологического изменения в пределах от 40 до 200 PD в клетках SHED-Т.

Тем самым было показано, что SHED-T не обладают активностью развития злокачественной опухоли.

(5) Оценка

Было показано, что SHED-T обладают пролиферативной способностью, поддерживая способность к дифференциации даже после 260PD. Тем не менее, SHED-C обладает способностью дифференциации, но уже в течение не более чем 30PD.

Как описано выше, было показано, что SHED-T превращаются в иммортализованные стволовые клетки и подходят для крупномасштабного производства супернатанта SHED, обладающего более высокой активностью.

Пример 4

(1) Лечебное действие в отношении лучевой язвы в цервикальной области

64-летнему пациенту со злокачественной опухолью языка (мужчина) в правой части языка (T3N0M0) была выполнена резекция половины языка. Через 6 месяцев, поскольку был выявлен метастаз в лимфоузле правой стороны шеи, выполняли облучение в дозе 60 Гр и тотальное рассечение шеи. Через 3 недели после рассечения, наблюдали неполное заживление раны от подчелюстной области до шеи, и образование язвы (фиг. 3(A)). Соответственно был поставлен диагноз: лучевая язва шеи.

Для облегчения заживления раны, в слой марли размером, который обеспечивает покрытие пораженного участка, помещали 10 мл культурального раствора SHED-T, полученного описанным выше способом. Затем его прикрепляли на пораженный участок. Через два дня марлю с культуральным раствором меняли 14 раз. Через 1 месяц, язва заживилась (фиг. 3(В)). Исходя из вышеизложенного, было показано, что культуральный раствор оказывает лечебный эффект на язву.

(2) Лечебное действие в отношении пролежня

Пролежень, образовавшийся в бедре 60-летнего мужчины, обрабатывали культуральным раствором SHED-T. Мужчина 2 года назад перенес инсульт, и возникла гемиплегия. Для того чтобы вылечить пролежни, он пришел в нашу больницу.

Грануляционная ткань с инфекцией (фиг. 6(А)) была полностью удалена; для покрытия пораженного участка наносили 10 мл культурального раствора SHED-Т без разведения. Марлю меняли каждый день. Через 2 недели сформировался новый эпидермис от края кожи с покрытием пораженного участка (фиг. 6(B)).

Исходя из вышеизложенного, было показано, что культуральный раствор имел лечебный эффект на язву и пролежень.

Пример 5

(1) Лечебное действие культурального раствора SHED-Т в области стоматологии

Лечебные эффекты культурального раствора SHED-T в области стоматологии исследовали в 28 участках всех 16 пациентов (возраст 35-70), включая 11 мужчин и 5 женщин.

Случаи заболевания распределялись следующим образом: 14 пациентов (18 участков) имели отношение к имплантату, и 7 пациентов (10 участков) имели отношение к пародонтозу. Случаи заболевания пациентов, имеющих отношение к имплантату, распределялись следующим образом: 11 пациентов имели отношение к направленной костной регенерации (GBR) - сохранение лунки зуба (15 участков), и 3 пациента имели отношение к синус-лифтингу (3 участка).

В настоящем описании процедура GBR (направленная костная регенерация) является методом лечения для ускорения регенерации костной ткани, например, пораженной альвеолярной кости, челюсти и тому подобное. Ее применяют в случаях, когда имеется недостаточное количество костной ткани для встраивания имплантата. Кроме того, сохранение лунки зуба представляет собой способ регенерации кости путем вставки искусственной кости и т.п. в "отверстие" в момент удаления зуба для предотвращения резорбции кости.

Синус-лифтинг (поднятие дна верхнечелюстной пазухи) выполняется в случае, когда верхнечелюстная пазуха внутри верхней челюсти увеличена, и толщина определенной части альвеолярной кости становится недостаточной для введения имплантата. Это метод включает надавливание на нижнюю стенку верхнечелюстной пазухи, введение костного трансплантата или костного протезного материала (в последнее время используют часть тела имплантата) в область верхнечелюстной пазухи, имеющей недостаточную толщину.

Оценку исследуемых случаев выполняли на 26 участках до сентября 2011 с использованием рентгенограммы (включая КТ) на 3 месяц или 6 месяц после операции. Их оценивали на следующие 5 классов. Результаты показаны в таблице 6, фиг. 7(А)-7(F), фиг. 8(А)-8(B) и фиг. 9(А)-9(B).

На фиг. 7(A) отмечено, что порошкообразный β-TCP был уложен на участке, указанном белой стрелкой. В отличие от этого, на фиг. 7(C) структура аналогичного участка, указанного стрелкой, изменилась с превращением в бесструктурную, такую же, как и костная ткань, расположенная на участке ниже. Таким образом, продемонстрировано способствование формированию костной ткани.

Кроме того, наблюдалось, что грануляционная ткань образовывалась на участке, отмеченном белой стрелкой, но костная ткань и незрелая кость не образовывались на участке, отмеченном черной стрелкой на фиг. 7(D). В отличие от этого, было подтверждено, что участок, отмеченный черной стрелкой, становился зрелой костью и способствовал остеогенезу, как показано на фиг. 7(F).

Исходя из вышеизложенного, было подтверждено способствование остеогенезу в области стоматологии.

5 (замечательно): остеогенез было выявлен на более 30% дефектного участка

4 (эффективно): остеоанагенез был выявлен на дефектном участке (менее чем приблизительно 30%)

3 (без изменений): остеоанагенез не был ясен, но какая-то резорбция костной ткани

2 (резорбция): был выявлена резорбция костной ткани

1 (плохо): протекала тяжелая костная резорбция или было неблагоприятное событие

Таблица 6

Из 28 случаев случаи № 27 и 28 не были оценены, потому что не было времени для их оценки. Из всех оцененных случаев (26 случаев) замечательных (5) было 10 случаев (38,5%), эффективных (4) было 7 случаев (26,9%), никаких изменений (3) было 8 случаев (30,8%), резорбции (2) был 1 случай (3,8%), и отрицательный эффект (1) было 0 случаев.

Сумма замечательных и эффективных случаев составляла 17 (65,4%), и частота ответа была высокой.

В детализации каждого заболевания, замечательных (5) было 9 (52,9%), в случаях, относящихся к имплантатам эффективных (4) было 4 (23,5%), без изменений (3) было 3 (17,7%), резорбции (2) был 1 (5,9%) и неблагоприятное событие (1) 0. Таким образом, в случаях имплантатов, сумма замечательных и эффективных случаев составляла 13 (79,4%), и частота ответа была очень высокой.

В 9 случаях, относящихся к пародонтозу, замечательных был 1 (11,1%), эффективных было 3 (33,3%), без изменений было 5 (55,6%), и резорбции и неблагоприятного события не было ни одного. В случаях, относящихся к пародонтозу, сумма замечательных и эффективных случаев составляла 4 (44,4%), и частота ответа была хорошей.

Кроме того, в зависимости от матрицы, в 8 случаях, имеющих β-TCP матрицу, замечательных было 4 (50,0%), эффективных было 3 (37,5%), без изменений и неблагоприятного события не было ни одного, и резорбции был 1 (12,5%). Когда β-TCP был использован в качестве матрицы, сумма замечательных и эффективных случаев была 7 (87,5%), и частота ответа была превосходной.

В 18 случаях, Terudermis или Teruplug (Col) был использован в качестве матрицы, и замечательных было 6 (33,3%), эффективными оказались 4 (22,2%), никаких изменений не было 8 (44,5%), резорбции было 1 (0,1%), и неблагоприятного события не было. При использовании в качестве матрицы Terudermis или Teruplug (Col) сумма замечательных и эффективных случаев была 10 (55,5%), и частота ответа была высокой.

В случае имплантатов, как показано на фиг. 7-9, все случаи показали регенерацию костной ткани.

Кроме того, при использовании в качестве матрицы β-TCP, с использованием окрашивания ткани гематоксилином и эозином было показано, как происходила замена β-TCP на костную ткань и тому подобное. Результаты показаны на фиг. 10(А)-(D). На фигуре отчетливо наблюдалось образование новой костной ткани, как показано NB, а также было выявлен кровеносный сосуд, как показано BV.

Исходя из вышеизложенного, было подтверждено, что культуральный раствор SHED-T обладает остеогенезной активностью.

Пример 6

(1) Интраназальное введение цитокинов, полученных из стволовых клеток пульпы зуба пациенту с нарушениями мозгового кровообращения

Для изучения действия лечения 8 пациентам, страдающим каким-либо видом ишемии в сером веществе, ишемии в белом веществе или ишемии в смешанной области (6 мужчин, 2 женщины) вводили культуральный раствор SHED-T. Перед началом данного клинического исследования все восемь пациентов получали стандартное лечение. Они были продиагностированы с помощью МРТ, и прошли неврологический тест и их оценивали по балльной шкале NIHSS. Для пациентов, указанных в таблице 1, прошло от 20 до 133 дней после развития симптомов ишемии. Сведения о пациентах представлены в следующей таблице 7.

SHED-CM (культуральный раствор SHED-T), приготовленный в примере 1, поступал путем интраназального введения с участка, где расположены обонятельные нервы в полости носа (фиг. 11 и 12). Период введения отсчитывали от начала введения.

Статусы восстановления оценивали нейрохирургом или невропатологом на момент времени 1 день, 2 дня, 4 дня, 7 дней, 14 дней, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев и 1 год от начала приема. Слепой тест не проводили. Для всех пациентов проводили МРТ и МРА головного мозга. МРА называется магнитно-резонансной ангиографией, и она является исследованием по определению состояние кровеносных сосудов в пространственном изображении. Изображение МРА и изображение МРТ одного пациента показаны на фиг. 13 или фиг. 14, соответственно.

Уровень кислорода крови, температура тела, артериальное давление, частота сердечных сокращений, частота дыхания и т.п. до и после введения культурального раствора SHED-T тщательно контролировали с помощью электрокардиограммы. До и после введения также делали рентген грудной клетки.

Перед интраназальным введением SHED-CM и спустя 1 год всем пациентам делали магнитно-резонансную ангиографию для определения сосудистого участка, и наблюдаемое изображение фотографировали с использованием цветной ядерной магнитно-резонансной томографии (МРТ). Неврологический статус оценивали по шкале инсульта Национального института здоровья (NIHSS).

У 2 из 8 пациентов (оба были в острой фазе) было обнаружено заметное восстановление по стандарту NIH и изображению МРТ (фиг. 15(А) и 15(В) и фиг. 16). Пациент № 2 восстановился до такой степени, что мог переставлять чашки парализованной правой рукой, как показано на фиг. 17(A), и стать амбулаторным пациентом, как показано на фиг. 17(B).

Ни у кого из пациентов, получавших лечение SHED-CM, не наблюдалось образования опухоли, аномального роста клеток в центральной нервной системе и неврологического повреждения. Кроме того, ни у кого из пациентов не было каких-либо проблем в носовой полости, системной злокачественной опухоли и системного инфекционного заболевания.

Исходя из вышеизложенного, было показано, что культуральный раствор может быть неограниченно получен с использованием иммортализованных стволовых клеток. Кроме того, было показано, что когда получают фармацевтический препарат с использованием данного культурального раствора, это позволяло продуцировать большое количество факторов роста. Таким образом, имеется преимущество в том, что это позволяет снизить производственную стоимость фармацевтического препарата.

Как указано выше, можно поддерживать количество содержимого и типы факторов роста в растворе клеток почти постоянным, поскольку конкретные иммортализованные стволовые клетки используется в качестве источника клеток, и стволовые клетки продолжают устойчиво продуцировать конкретные факторы роста. Таким образом, имеется преимущество в том, что компоненты, содержащиеся в культуральном растворе легко стандартизировать, когда раствор производится в больших масштабах.

Пример 7

(1) Интраназальное введение цитокинов, полученных из стволовых клеток пульпы зуба пациентам с болезнью Альцгеймера

SHED-T интраназально вводили пациентам с болезнью Альцгеймера для изучения эффекта лечения. Средний возраст пациентов, 3 женщин, были 79,5±3.

Культуральный раствор SHED-T вводили интраназально один раз в день всего 28 раз. Результаты введения оценивали с использованием теста минимальной оценки психического состояния и шкалы деменции Hasegawa, показанных в следующих таблицах 8 и 9.

Как показано на фиг. 18(A), в группе без введения не было большого улучшения, даже когда для оценки был использован либо тест MMS, либо Hasegawa.

В отличие от этого, в группе, которой вводился культуральный раствор SHED-T, значение индекса начало увеличиваться через 3 месяца. Через 7 месяцев степень повышения становилась больше в обоих тестах MMS и Hasegawa по достижению облегчения симптомов болезни Альцгеймера.

В группе пациентов, у одной 78 летней пациентки с болезнью Альцгеймера было показано заметное улучшение. У пациентки был инфаркт мозга 11 мая, период Хэйсэй 22 (2010 год), и появилась серьезная амнезия (Cornell Medical Index (Корнелльский медицинский опросник): CMI=27). Поэтому она пришла в профилактическое учреждение 20 декабря, период Хэйсэй 22.

С 9 февраля, период Хэйсэй 23 (2011 год), культуральный раствор SHED-T вводили интраназально один раз в день всего 28 раз. Затем результаты ведения оценивали с использованием теста минимальной оценки психического состояния и шкалы деменции Hasegawa, показанных в таблицах 8 и 9. Было обнаружено превосходное улучшение высшей функции мозга. Поскольку пациент выздоровел достаточно, чтобы самостоятельно готовить и ходить, его выпустили из профилактического учреждения и возвратили в собственный дом 16 апреля, период Хэйсэй 23.

5. Память (3 балла)
- предлагается опять повторить названия товаров, предложенных в пункте 311. Копирование фигур
- Скопируйте следующие фигуры

6. Названия (2 балла)
- Пациенту по очереди показывают часы и карандаш, и предлагается ему/ей их назвать

Таблица 9

Исходя из вышеуказанного, культуральный раствор SHED-T обладает превосходным эффектом в случае болезни Альцгеймера.

Пример 8

(1) Лечебный эффект культурального раствора SHED-T в отношении гепатита

Радикальным лечением серьезного заболевания печени, такого как декомпенсированный цирроз и т.п., является пересадка печени. Тем не менее, осуществляется также симптоматическая терапия, ввиду таких причин, как нехватка доноров и т.п. Для того чтобы решить эту проблему, была проведена регенерационная терапия печени путем введения факторов роста, полученных из иммортализованных стволовых клеток молочных зубов (SHED-T).

Субъектами были 3 пациента, мужчины без активного периода гепатомы (58 до 70 лет), но с классификацией по Child-Pugh не менее 7, общим билирубином не более 3,0 мг/дл, и количеством тромбоцитов не менее 5,0×10¹⁰, как представлено в таблице 10. Следует отметить, что у пациентов была хроническая фаза инфаркта головного мозга, и они проходили лечение от болезни Паркинсона (не менее 1 года прошло с момента появления симптомов).

По протоколу факторы роста, полученные из иммортализованных стволовых клеток молочных зубов (2 мкг), разводили в 5 мл физиологического раствора и вводили интраназально каждый день. 1 курс составлял 28 раз, и осуществляли 2 курса.

Подробности описания заболевания и результаты представлены в таблице 11.

(2) Результаты

У всех пациентов как содержание общего белка, так и уровень сывороточного альбумина повышались, и CP изменялось от класса B до класса А. Поэтому считалось, что печень восстанавливается.

Пример 9

(Действие лечения культуральным раствором SHED-T в отношении сахарного диабета II типа)

Изучали действие лечения с помощью SHED-T в отношении сахарного диабета II типа. По протоколу факторы роста, полученные из иммортализованных стволовых клеток молочных зубов (2 мкг), разводили в 5 мл физиологического раствора и вводили интраназально каждый день. 1 курс составлял 28 раз, и осуществляли 2 курса.

Результаты оценивали по изменению HbAlc (гликированный гемоглобин) в качестве показателя перед лечением и через 12 недель после начала. Следует обратить внимание, что любые неблагоприятные события, такие как головная боль, риналгия, колебания глюкозы в крови и т.п., у пациента не обнаруживались. Кроме того, всем пациентам вводили метформин в качестве внутренней медицины и применяли кинезиологию. Тем не менее, каких-либо эффектов не наблюдалось.

У всех пациентов HbAlc (%) снижался по сравнению с началом лечения, и показания сахарного диабета были улучшены. Исходя из вышеизложенного, было показано, что SHED-Т также обладает действием в отношении сахарного диабета.

Пример 10

(Действие лечения культуральным раствором SHED-T в отношении не поддающихся лечению кожных заболеваний)

SHED-T (2 мкг) разводили в 5 мл физиологического раствора и наносили на пораженную область у собаки (лабрадор ретривер, 8 лет, самка) с не поддающимся лечению кожным заболеванием (атопический дерматит) один раз в день. 1 курс составлял обработку 14 раз.

Перед использованием SHED-T в течение 2 месяцев вводили препарат интерферона-γ собаке, но эффект от лечения не был достигнут. Поэтому препарат был заменен на SHED-T.

Перед началом лечения SHED-T, как показано на фиг. 19А, пораженные участки выглядели белыми из-за выпадения волос. После лечения волосы отросли, и пораженные участки были полностью излечены до такой степени, что трудно было распознать, на каком участке был дерматит.

Исходя из вышеизложенного, было показано, что SHED-T обладает положительным действием в отношении не поддающихся лечению кожных заболеваний.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение может быть использовано при получении фармацевтического препарата, используемого в области медицины и стоматологии.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Описаны иммортализованные стволовые клетки, которые получают путем выделения стволовых клеток, выбранных из группы, состоящей из мезенхимальных клеток млекопитающих и соматических клеток, первичным культивированием клеток, с получением клеток первой стадии культуры, трансфекцией четырех видов генов в клетки первой стадии культуры, с получением трансгенных клеток, и выбором желаемых иммортализованных стволовых клеток из числа трансгенных клеток с использованием экспрессии STRO-1 в качестве индекса. Также представлены лекарственная композиция и лекарственный препарат для восстановления поврежденных тканей, которые содержат супернатант культуры иммортализованных стволовых клеток в качестве активного ингредиента. Изобретение позволяет получать иммортализованные стволовые клетки, которые продуцируют фактор роста, способный регенерировать различные виды тканей, которые были повреждены в результате различных причин, и способа продуцирования указанных выше иммортализованных стволовых клеток. Изобретение расширяет арсенал лекарственных средств для восстановления поврежденных тканей и способов абсорбции супернатанта культуры. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 19 ил., 12 табл., 10 пр.

Формула