Термофильная маннаногидролаза и содержащие ее жидкости разрыва - RU2557297C2

Чертежи

Показать все 9 чертежа(ей)

Описание

Область техники

Выделенный фермент маннаногидролаза, который гидролизует галактоманнановые субстраты при температурах, составляющих свыше 160°F, обладает конкретной применимостью в качестве фермента-разжижителя в жидкостях разрыва, содержащих гуаровую камедь и модифицированные гуаровые камеди.

Уровень техники

Гидравлический разрыв используется для создания разрывов в подземных формациях, которые исходят от буровой скважины в область формации с целью увеличения скорости, с которой могут быть получены жидкости из формации. Как правило, высоковязкая жидкость разрыва закачивается в скважину под давлением, достаточным для разрыва подземной формации. С целью поддержания повышенного давления на формацию, добавляют твердый расклинивающий агент в жидкость разрыва, которая подается в разрыв под высоким давлением, применяемым к жидкости.

Более чем 65% стандартных жидкостей разрыва делают из гуаровой камеди (галактоманнаны) или из производных гуаровой камеди, таких как гидроксипрпилпроизводное гуаровой камеди (HPG), карбоксиметилпроизводное гуаровой камеди (CMG) и карбоксиметилгидроксипропилпроизводное гуаровой камеди (CMHPG). Эти полимеры могут быть поперечно-сшитыми с целью повышения их вязкости и повышения их способности к транспортировке расклинивающего агента.

После того как высоковязкая жидкость разрыва транспортирует расклинивающий агент в формацию, используются разжижители для снижения вязкости жидкости, которая дает возможность расклинивающему агенту оседать в разрыве, усиливая таким образом воздействие формации по отношению к скважине. Разжижители работают путем уменьшения молекулярной массы полимеров, "разрушая", таким образом, полимер. Затем разрыв становится высокопроницаемым проходом обратно в скважину для получаемых жидкостей и газа.

В качестве разжижителей наиболее широко используются химические окислители и ферменты. Окислитель генерирует радикал, который затем разрушает полимер. Реакция ограничена тем фактом, что окислители необходимо добавлять в стехиометрическом соотношении, иначе они будут атаковать не только полимер, но и любую молекулу, которая склонна к окислению. С другой стороны, ферменты являются каталитическими и специфичными к субстрату и будут катализировать гидролиз специфичных связей внутри полимера. Фермент будет разрушать множество полимерных связей в течение его срока действия. К сожалению, ферменты действуют в очень узком температурном интервале и их функции часто инактивируются при высоких температурах.

Обычные ферменты, используемые для разрушения галактоманнанов, хорошо работают при температурах от комнатной до умеренных (75°F - 150°F). При повышенных температурах, (>150°F), эти ферменты быстро денатурируют и теряют активность. Фермент бета-маннаназа, используемый в обычных ферментных составах, имеет температурный максимум, составляющий приблизительно 150°F. Профили активности выявили, что фермент сохраняет мало активности или не сохраняет ее после этого момента. Так как многие скважинные операции разрыва проводят при температурах, составляющих свыше 150°F, то было бы предпочтительно иметь фермент, который может разрушать жидкости разрыва на основе гуаровой камеди при таких повышенных температурах.

Сущность изобретения

Фермент маннаногидролаза эффективно гидролизует галактоманнины и обладает особенной эффективностью при гидролизе полимеров гуаровой камеди в интервалах повышенных температур. Высокотемпературный фермент маннаногидролаза может быть связан с глутатион-S-трансферазой (GST) или может быть не связан с GST.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая фермент маннаногидролазу, была получена из гена β-маннаназы из Caldocellum saccharolyticum с оптимизацией кодонов для экспрессии в E. coli. Ген, кодирующий маннаногидролазу, (далее "htβ"), имеет нуклеотидную последовательность, представленную на ФИГ.1A, с оптимизацией кодонов для повышения экспрессии маннаногидролазы в E. coli. Ген htβ может затем быть проклонирован в подходящие плазмидные векторы, такие как pUC57, pUC 19 и pGS-21a, или в другие коммерчески доступные или специально сконструированные клонирующие векторы. Маннаногидролаза может быть трансформирована и экспрессирована в коммерчески доступных штаммах Escherichia coli. Транслированная аминокислотная последовательность маннаногидролазы представлена на ФИГ.1B.

Затем может быть получена водная жидкость разрыва, содержащая фермент, полимер на основе гуаровой камеди и сшивающий агент.

При использовании в гидравлическом разрыве маннаногидролаза эффективна в разрушении полимеров на основе гуаровой камеди при температурах, составляющих свыше 160°F.

Краткое описание чертежей

С целью более полного понимания чертежей, на которые делается ссылка в подробном описании настоящего изобретения, представлено краткое описание каждого чертежа, где:

На ФИГ.1A представлена нуклеотидная последовательность, которая кодирует маннаногидролазу, используемую в изобретении;

На ФИГ.1B представлена аминокислотная последовательность фермента маннаногидролазы;

На ФИГ.2 представлена схема создания плазмид pUC57-htβ, pGS-21a-gst-htβ и pGS-21-htβ, несущих ген маннаногидролазы;

На ФИГ.3 сопоставляется уменьшение вязкости 25 частей на триллион суспензии гуаровой камеди, поперечно сшитой с помощью бората, содержащей фермент маннаногидролазу, через 18 часов при 180°F по сравнению с суспензией, не содержащей фермент маннаногидролазу;

На ФИГ.4 сопоставляется уменьшение вязкости 25 частей на триллион суспензии гуаровой камеди, поперечно сшитой с помощью бората, содержащей фермент маннаногидролазу, через 18 часов при 160°F по сравнению с суспензией, не содержащей фермент маннаногидролазу;

На ФИГ.5 сопоставляется уменьшение вязкости суспензии гуаровой камеди, поперечно сшитой с помощью бората, содержащей фермент маннаногидролазу, через 10 часов при 180°F по сравнению с суспензией, не содержащей фермент маннаногидролазу;

На ФИГ.6 сопоставляется уменьшение вязкости суспензии гуаровой камеди, поперечно сшитой с помощью бората, содержащей фермент маннаногидролазу, через 3,5 часа при 140°F по сравнению с суспензией, не содержащей фермент маннаногидролазу;

На ФИГ.7 сопоставляется уменьшение вязкости при различных температурах суспензии гуаровой камеди, содержащей фермент маннаногидролазу;

На ФИГ.8 представлены микрофотографии барьеров из расклинивающего агента, и сопоставляется проводимость суспензии, содержащей фермент маннаногидролазу, по сравнению с суспензией, не содержащей фермент маннаногидролазу.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Высокотемпературный фермент, используемый в способе разрыва по изобретению, если он не связан с глутатион-S-трансферазой (GST), то обозначается в настоящем документе как "маннаногидролаза", и "GST-маннаногидролаза", когда он представляет собой продукт слияния β-маннаназы и GST.

Фермент маннаногидролаза, описанный в настоящем документе, происходит из термофильных и анаэробных бактерий Caldocellum saccharolyticum. Выделение гена, кодирующего фермент β-маннаназу, описано в публикации E. Luthi et al., "Cloning, Sequence Analysis, and Expression in Escherichia coli of a Gene Coding for a β-Mannanase From the Extremely Thermophilic Bacterium 'Caldocellum saccharolyticum', Applied and Environmental Microbiology, Mar. 1991, pp. 694-700, которая включена в настоящей документ в качестве ссылки.

Затем проводили оптимизацию кодонов гена фермента маннаногидролазы для повышения эффективности его экспрессии в E. coli. Нуклеотидная последовательность гена htβ представлена на ФИГ.1 A. Нуклеотидная последовательность имеет 74% гомологии с последовательностью гена маннаназы, изображенной на ФИГ.2 у Luthi et al. Нуклеотидная последовательность включает кодирующую последовательность маннаногидролазы и лидерную последовательность на N-конце.

На ФИГ.2 (a) проиллюстрировано, что ген htβ может быть проклонирован в клонирующий вектор pUC57 для создания плазмиды pUC57-htβ. На (b) и (c) проиллюстрировано, что ген может быть проклонирован в экспрессирующий вектор pGS-21a, который содержит кодирующий участок белка GST. На (b) проиллюстрировано, что полученный в результате ген кодирует продукт слияния GST и маннаногидролазы. На (c) проиллюстрировано, что полученный в результате ген кодирует фермент без слияния с фрагментом GST. В результате экспрессия с использованием плазмид pGS-21a-gst-htβ и pGS-21a-htβ (b) и (c), соответственно, получают маннаногидролазу, слитую с N-концевой областью белка GST, и маннаногидролазу, не связанную с белком GST, соответственно.

На каждой из ФИГ.2 (a), (b) и (c), Amp^r регулирует экспрессию β-лактамазы, rep(pMBl), и fl ori соответствуют последовательностям начала репликации pUC57 и pGS-21a, соответственно, ответственным за репликацию плазмид, lacl кодирует лактозный репрессор, T7 соответствует T7 РНК-полимеразному промотору, и MCS соответствует полилинкеру с множеством сайтов клонирования. 5'-конец оптимизированной последовательности содержит сайт эндонуклеазы рестрикции BamHI, и 3'-конец содержит сайт эндонуклеазы рестрикции HindIII для клонирования в экспрессирующий вектор pGS-21a для создания слитого белка GST-маннаногидролаза. Альтернативно, 5'-сайт BamHI заменяли на сайт эндонуклеазы рестрикции Ndel для создания белка маннаногидролазы, не связанной с GST.

Плазмиды pGS-21a-htβ, pGS-21a-gst-htβ и pUC57-htβ могут быть трансформированы в коммерчески доступные штаммы E. coli и могут культивироваться. Затем клетки могут быть собраны, лизированы, и полученный в результате раствор используют в качестве клеточного лизата. Бесклеточный экстракт может быть получен путем удаления клеточного дебриса из лизата, и затем фермент может быть выделен из экстракта. Термин "выделенный" означает, что фермент был удален из интактных клеток или из клеточного дебриса, и при условиях, отличных от естественной среды, он является свободным от других чужеродных или нежелательных нуклеиновых кислот, протеаз и липидов, и представлен в форме, подходящей для применения в качестве разжижителя для жидкостей разрыва.

Ген, кодирующий фермент маннаногидролазу, может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, которая по существу гомологична нуклеотидной последовательности, представленной на ФИГ.1A. Термин "по существу гомологичный" используется в настоящем документе для обозначения нуклеотидов, обладающих, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с последовательностью, представленной на ФИГ.1.

Транслированная аминокислотная последовательность маннаногидролазы представлена на ФИГ.1B. Как правило, транслированная аминокислотная последовательность фермента маннаногиролазы, используемого для способа гидравлического разрыва, описанного в настоящем документе, по меньшей мере, на 60% гомологична транслированной аминокислотной последовательности, представленной на ФИГ.1B.

В предпочтительной форме, выделенный белок по существу свободен от других белков. Предпочтительно получение белков со степенью чистоты более чем 40%, более предпочтительно, со степенью чистоты более чем 60%. Еще более предпочтительно, получение белка в высокочистом виде, т.е., со степенью чистоты более чем 80%, более предпочтительно, со степенью чистоты более чем 95%, и еще более предпочтительно, со степенью чистоты более чем 99%, которую определяли с помощью SDS-PAGE.

Маннаногидролаза эффективно гидролизует полимер на основе гуаровой камеди в интервалах повышенных температур, таких как свыше 72°F, как правило, в интервалах pH примерно от 5 примерно до 11. Фактически, маннаногидролаза гидролизует полимер на основе гуаровой камеди при температурах, составляющих свыше 160°F, а также свыше 180°F. Кроме того, маннаногидролаза может использоваться в комбинации с другими ферментами и/или с окисляющими разжижителями для разрушения гелей гуаровой камеди при более широких температурных интервалах и интервалах pH.

Водная жидкость разрыва, используемая по изобретению, может быть получена путем смешивания гидратируемого полимера в водной жидкости. Водная жидкость может представлять собой, например, воду, солевой раствор или водно-спиртовые смеси. Для этой процедуры может использоваться любой аппарат для смешивания. В случае периодического смешивания, гидратируемый полимер и водная жидкость смешиваются в течение периода времени, которого достаточно для образования гидратируемого раствора. Гидратируемый полимер добавляют к водной жидкости в концентрациях в интервале примерно от 0,1% до 5% по массе водной жидкости. Наиболее предпочтительный интервал по настоящему изобретению составляет примерно от 0,2% до 0,8% по массе.

Гидратиуемый полимер, используемый в настоящем изобретении, представляет собой не модифицированную гуаровую камедь, а также модифицированную гуаровую камедь. Не модифицированная гуаровая камедь является предпочтительной. Примеры модифицированной гуаровой камеди включают гидроксипропилгуаровую камедь, карбоксиметилгидроксипропилгуаровую камедь и карбоксиметилгидроксиэтилцеллюлозу.

Дополнительно к ферменту-разжижителю и гидратируемому полимеру жидкость разрыва включает сшивающий агент. Сшивающий агент может представлять собой полимер с ионами металлов, включающими соединения, содержащие алюминий, сурьму, цирконий и титан, включающие так называемые органотитанаты, а также соединения, высвобождающие бораты и бор. В случае боратных сшивателей, сшивающим агентом может быть любое вещество, которое является источником боратных ионов. Подходящие боратные сшиватели включают органобораты, монобораты, полибораты, минеральные бораты, борную кислоту, борат натрия, включая ангидрид или любой гидрат, боратные минералы, такие как колеманит или улексит, а также любые боратные комплексы с органическими соединениями для задержки высвобождения боратного иона. Боратные сшивающие агенты являются предпочтительными.

Сшивающий агент предпочтительно присутствует в количестве в интервале примерно от 0,001% до свыше 0,5% по массе водной жидкости. Предпочтительно, концентрация сшивающего агента находится в интервале примерно от 0,005% примерно до 0,25% по массе водной жидкости.

Как правило, фермент вводят в виде водного раствора фермента. Массовое процентное содержание раствора фермента в жидкости для обработки скважины зависит от количества единиц активности фермента в водном растворе фермента. Например, количество водного раствора фермента, имеющего активность 30000 единиц активности фермента в жидкости для обработки скважины, как правило, составляет примерно от 0,05 примерно до 1,3 масс.%, предпочтительно, примерно от 0,103 примерно до 0,206 масс.%. Массовое процентное содержание раствора фермента, содержащего различное количество единиц активности фермента, можно определить с использованием определенного массового процентного содержания для раствора фермента, содержащего 30000 единиц активности фермента.

Оптимальное pH водной жидкости, содержащей сшиваемый полимер, является щелочным и, как правило, составляет примерно от 9,5 примерно до 11.

Жидкости разрыва по изобретению также могут содержать включенное в их состав вещество, регулирующее pH, в качестве материала, дополнительного к ферменту-разжижителю. Веществом, регулирующим pH, может быть любое вещество, которое исходно инертно, но при этом слегка гидролизует в гелеобразной жидкости разрыва с получением кислоты Брэнстеда, таким образом, постепенно снижая pH гелеобразной жидкости и активируя фермент-разжижитель. Предпочтительные вещества, регулирующие pH, включают органические ангидриды, ацилгалогениды, сульфонилгалогениды, бензилгалогениды и низкомолекулярные эфиры, которые медленно гидролизуют с получением кислот Брэнстеда. Под "низкомолекулярным" эфиром понимают, что эфир должен быть растворим в жидкости разрыва с целью осуществления его предназначенной цели гидролиза в течение периода времени с получением кислоты. Как правило, чем выше молекулярная масса, тем менее растворим эфир. В результате, эфиры с меньшей молекулярной массой являются предпочтительными в связи с легкостью применения. Предпочтительно, вещество, регулирующее pH, представляет собой низкомолекулярный эфир, выбранный из группы, состоящей из этилацетата, 2-этоксиэтилацетата, этилацетоацетата, триэтилцитрата, метилбензоата и диметилфталата. Типичные молекулярные массы для 2-этоксиэтилацетата, этилацетоацетата и триэтилцитрата, используемых в примерах, которые представлены ниже, составляет 132, 130 и 276, соответственно. Предпочтительно, количество вещества, регулирующего рН, находится в интервале примерно от 0,01% примерно до 0,85% по массе водной жидкости.

Жидкость обработки скважины может быть получена на месте с использованием пеногенератора с большими сдвиговыми усилиями или может быть транспортирована в желаемое месторасположение.

Жидкость разрыва может дополнительно содержать расклинивающий агент, который обычно добавляют к жидкости перед добавлением сшивающего агента. Подходящие расклинивающие агенты включают стандартные агенты, известные в данной области, включающие зернистый кварцевый песок, стеклянные гранулы, алюминиевые гранулы, керамику, пластмассовые гранулы, включающие полиамиды, и сверхлегкие (ULW) частицы, такие как перемолотая или измельченная шелуха орехов типа грецкого ореха, кокоса, ореха-пекана, миндаля, плода фителефаса, бразильского ореха и т.д.; перемолотая или измельченная шелуха семян (включая косточки фруктов), таких как слива, олива, персик, вишня, абрикос и т.д.; перемолотая или измельченная шелуха семян других растений, таких как маис (например, сердцевина кукурузного початка или кукурузные зерна), и т.д.; обработанный древесный материал, такой как материал, полученный из древесины, такой как древесина дуба, гикори, грецкого ореха, тополя, красного дерева и т.д., включая такую древесину, которая была обработана с помощью шлифовки, обтесывания или другой формы измельчения, обработки и т.д.

Кроме того, расклинивающий агент может включать пористую керамику или органические полимерные частицы. Пористый зернистый материал может быть обработан с использованием непористого проникающего материала, покрывающего слоя или лакирующего слоя. Например, пористый зернистый материал может представлять собой обработанный зернистый материал, определенный в Патентной публикации U.S. № 20050028979, где (a) ASG обработанного пористого материала составляет менее чем ASG пористого зернистого материала; (b) проницаемость обработанного материала составляет менее чем проницаемость пористого зернистого материала; или (c) пористость обработанного материала составляет менее чем пористость пористого зернистого материала.

Расклинивающие агенты обычно используются в концентрациях примерно от 1 до 8 фунтов на галлон состава жидкости разрыва, но если необходимо, могут использоваться более высокие или более низкие концентрации.

Жидкость разрыва также может содержать другие подходящие добавки, широко распространенные в индустрии эксплуатации скважины, такие как поверхностно-активные вещества, ингибиторы коррозии, агенты замедляющие сшивку и так далее.

В обычной операции разрыва, жидкость разрыва по изобретению прокачивают под достаточно высоким давлением для того, чтобы вызвать образование или расширение разрывов и для помещения расклинивающего агента в разрыв.

Следующие примеры являются иллюстрациями некоторых из вариантов осуществления настоящего изобретения. Все процентные содержания, представленные в Примерах, приведены в виде массовых единиц за исключением тех, что могут быть указаны иначе.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Ген htβ клонировали в клонирующий вектор pUC57 с созданием плазмиды pUC57-htβ и в экспрессирующий вектор pGS-21a c созданием плазмиды pGS-21a-htβ. Плазмиды pGS-21a-htβ и pUC57-htβ трансформировали в компетентные клетки E. Coli, штаммы BL21 (DE3) или DH5a, и культивировали в 5 мл питательной среды LB-Miller при 98,6°F при 200 об./мин. в течение 16 часов. Культуральный бульон с добавленным в него ампициллином в концентрации 100 мкг/мл использовали в качестве посевного материала для 100 мл культуры E. coli, несущей плазмиды pGS-21a-htβ или pUC57-htβ. Эти культуры растили при 98,6°F и при 200 об./мин. Через 4 часа к культуре добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,1 мМ. Через 3 часа инкубации в присутствии IPTG, клетки охлаждали до 39°F и собирали с помощью центрифугирования при 3000 об./мин. в течение 20 минут. Культуральную среду затем удаляли и клетки хранили при -4°F до момента применения. Клетки затем размораживали и ресуспендировали в 5 мл охлажденного 50 мМ натриево-фосфатного буфера. Лизоцим добавляли до конечной концентрации 1 мг/мл, и культуру инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Нуклеиновые кислоты разрушали с помощью коротких стимулов ультразвука, и конечный бесклеточный экстракт (CFX) получали путем центрифугирования.

Пример 2. Около 1 г/т стандартного фермента бета-маннаназы, коммерчески доступного как GBW-12CD от BJ Services Company, разводили в объемном соотношении 1:33 в воде, и добавляли около 2 мл CFX Примера 1, содержащего pGS-21a-htβ и pUC57-htβ, к 100 мл водной жидкости, содержащей 25 частей на триллион GW3, 2 г/т BF-7L и 1 г/т XLW-32, и инкубировали в течение 18 часов при 180°F. (GW-3 представляет собой агент суспензии гуаровой камеди, XLW-32 представляет собой боратный сшивающий агент, и BF-7L представляет собой буферный агент, каждый из которых коммерчески доступен в BJ Services Company). Образцам затем давали охладиться до комнатной температуры, и их вязкость измеряли с использованием вискозиметра Fann 35. Результаты представлены на ФИГ.3, где иллюстрируется, что маннаногидролаза обеспечивает почти полное снижение вязкости гуаровой камеди через 18 часов при 180°F, в то время как стандартный ферментный продукт не проявляет себя в качестве эффективного средства в снижении вязкости поперечно сшитой жидкости при данных температуре и pH. Стрелка на ФИГ.3 соответствует неразрушенному образцу. Исходное значение pH всех образцов составило 10,5.

Пример 3. Около 1 г/т стандартного фермента Примера 3 и 2 мл CFX из образцов, содержащих pGS-21a-htβ и pUC57-htβ из Примера 1, добавляли к 100 мл водной жидкости, содержащей 25 частей на триллион GW3, 2 г/т BF-7L и 1 г/т XLW-32, и инкубировали в течение 18 часов при 160°F. Образцы использовали при pH 6,5 и 10,5. Было продемонстрировано, что стандартный фермент, GBW-12, разрушает образец GW-3 при pH 6,5, но не при 10,5. Образцы, содержащие маннаногидролазу, обеспечивали частичное или полное разрушение поперечно сшитого GW-3 через 18 часов при 160°F. вязкости измеряли на приборе Fann 35, и их значения представлены на ФИГ.4, где демонстрируется снижение вязкости с помощью маннаногидролазы в 25 частей на триллион образца GW-3, поперечно сшитого с помощью бората. Стрелка соответствует неразрушенному образцу.

Пример 4. Получали 100 мл водной жидкости, содержащей 25 частей на триллион GW3, 1,5 г/т BF-7L и 1,5 г/т сшивающего агента в виде боратного минерала, суспендированного в нефтяном масле, коммерчески доступного в BJ Services Company в виде XLW-30. pH раствора составило 10,8. Затем получали образец. Один образец, обозначенный как (-), не содержал фермента в жидкости. Другой образец, обозначенный как (+), содержал 0,75 г/т разведенного 1/25 раствора маннаногидролазы, CFX, полученной из экспрессирующего вектора pGS21a-htβ. ФИГ.5 демонстрирует снижение вязкости двух образцов через 10 часов при 180°F. ФИГ.6 демонстрирует снижение вязкости двух образцов через 10 часов при 140°F.

Пример 5. Получали 100 мл водной жидкости, содержащей 25 частей на триллион GW3, 1,3 г/т BF-7L и 1 г/т сшивающего агента XLW-32, для тестов при 72°F и 140°F. Получали вторые 100 мл водной жидкости, содержащей 25 частей на триллион GW3, 2 г/т BF-7L и 1,5 г/т сшивающего агента XLW-32, для тестов при 200°F. Во всех образцах концентрация фермента маннаногидролазы составила 0,5 г/т. Реологические свойства каждого образца измеряли на вискозиметре Chandler HTHP 5550 при 100 сек^-1. ФИГ.7 демонстрирует реологические профили тестов при различных температурах и демонстрирует, что маннаногидролаза эффективна в снижении вязкости поперечно сшитого полимера галактоманнана в температурном интервале от 72°F до, по меньшей мере, 200°F.

Примеры 2, 3, 4 и 5 демонстрируют, что жидкости, содержащие маннаногидролазу, эффективно гидролизуют полимер на основе гуаровой камеди в интервалах повышенных температур и при таких pH, когда стандартный фермент не настолько эффективен.

Пример 6. Данный пример иллюстрирует восстановленную проводимость барьера из расклинивающего агента, обработанного с использованием водной жидкости, которая содержит фермент-разжижитель маннаногидролазу. Получали два образца по 100 мл водной жидкости, содержащих 25 частей на триллион GW-3, 1,5 г/т BF-7L и 1,3 г/т XLW-30. Один образец дополнительно содержал 1,25 г/т (разведение 1/5) маннаногидролазы (упомянутой в Примере 6); другой образец не содержал никакого фермента. 60-мл шприц оснащали проволочной мембраной 30 меш, обрезанной по внутреннему диаметру шприца. К мембране прилагался кусок фильтровальной бумаги (размер пор 2,5 мкм), которую также обрезали по внутреннему диаметру шприца. Затем на фильтровальную бумагу наносили 10 граммов 20/40 CarboProp, расклинивающего агента Carbo Ceramics. Затем добавляли 100 мл поперечно сшитой жидкости к слою расклинивающего агента и продавливали через барьер из расклинивающего агента до тех пор, пока плунжер не остановится наверху барьера из расклинивающего агента. На конец шприца надевали колпачок, и шприц погружали в водяную баню при 180°F на 24 часа. Затем шприц удаляли из водяной бани и давали ему охладиться до комнатной температуры. Затем шприц переворачивали и плунжер мягко удаляли для минимизации повреждений барьера из расклинивающего агента. Барьер из расклинивающего агента помещали на синее блюдце весов и немедленно визуализировали под сложным световым микроскопом с 10-м увеличением. На ФИГ.8 представлены микрофотографии барьеров из расклинивающего агента, иллюстрирующие проводимость суспензии, не содержащей маннаногидролазу (микрофотография А), по сравнению с суспензией, содержащей фермент маннаногидролазу (микрофотография В).

Как представлено на микрофотографии A, барьер из расклинивающего агента обладает высокоточной структурой, обозначающей то, что жидкость разрыва остается поперечно сшитой. (Оставшаяся жидкость из шприца также была поперечно сшита). Микрофотография B иллюстрирует барьеры из расклинивающего агента без четкой структуры, где барьер "распадается" немедленно после удаления из шприца. Оставшаяся жидкость из шприца была подобна воде, имея очень низкую вязкость. Барьеры из расклинивающего агента из жидкостей, содержащих мананногидролазу, демонстрировали состояния от геля с небольшим количеством поперечных сшивок до геля без поперечных сшивок. Это предполагает превосходную очистку и высокую степень получения проницаемости барьера из расклинивающего агента.

Пример 7. Далее данный пример иллюстрирует получение фермента маннаногидролазы в процессе ферментации с загрузкой 10 литров. Ген htβ клонировали в экспрессирующий вектор pGS21-a с использованием эндонуклеаз рестрикции NdeI и HindIII с созданием маннаногидролазы, не связанной с GST. Полученный в результате экспрессирующий вектор трансформировали в клетки BL21 (DE3) E. coli и высевали на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубировали при 98,6°F в течение ночи. Одну колонию выкалывали с чашки и использовали в качестве посевного материала в 100 мл бульона LB-Miller, содержащего 100 мкг/мл ампициллина. Культуру инкубировали в течение ночи при 98,6°F при 200 об./мин.

100 мл ночной культуры использовали в качестве посевного материала в 10 л среды Terrific Broth в ферментере Bioflow 3000 из New Brunswick Scientific. Ампициллин добавляли до конечной концентрации 100 мкг/мл. Ферментационную культуру растили в течение 24 часов при 98,6°F с максимальным перемешиванием и подпиткой сжатым воздухом для поддержания максимально возможной аэрации. Глицерин добавляли со скоростью 4 мл/час в течение полных 24 часов. Раствор противовспенивателя добавляли по необходимости. По достижении OD₆₀₀ значения 0,5 добавляли к смеси стерильный раствор лактозы, так, чтобы конечная концентрация лактозы в системе составила 15 мМ. Через 24 часа клеточную культуру сохраняли при 39°F до момента следующей обработки.

Затем клеточную культуру гомогенизировали и клеточный дебрис удаляли или посредством центрифугирования, или фильтрации через полиэфирсульфоновую мембрану с размером пор 0,2 мкм. Полученный в результате раствор затем можно было использовать в качестве раствора фермента маннаногидролазы или по необходимости подвергать его дополнительному концентрированию. В данном примере, фильтрат концентрировали с помощью проточной фильтрации вдоль потока (TFF) с использованием полиэфирсульфонового фильтра 30000 MWCO. Ультраконцентрат затем использовали в качестве раствора фермента маннаногидролазы.

Другие варианты осуществления в рамках данной формулы изобретения будут очевидны специалисту в данной области из описания изобретения, представленного в данном документе. Подразумевается, что описание изобретения вместе с примерами рассматриваются только в качестве примера, в то время как рамки и сущность изобретения определены с помощью формулы изобретения, представленной ниже.

Реферат

Изобретение относится к способу разрыва подземной формации, имеющей температуру в скважине, составляющую свыше 160°F, включающий введение в формацию водной гелеобразующей жидкости разрыва с рН от 9,5 до 11, включающей гидратируемый полимер, выбранный из группы, состоящей из гуаровой камеди и из модифицированных гуаровых камедей; сшивающий агент для поперечной сшивки гидратируемого полимера с образованием полимерного геля; и фермент-разжижитель, включающий фермент маннаногидролазу, который имеет аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. Изобретение позволяет проводить операции разрыва в скважинах при температуре выше 160°F. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 7 пр., 8 ил.

Формула