Лечение мышечной слабости с помощью щелочных фосфатаз - RU2754558C2

Чертежи

Описание

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с использованием стандартного трехбуквенного кода для аминокислот, как определено в 37 C.F.R. 1.822. (разделе 37 Кодекса федеральных нормативных актов статье 1.822). Перечень последовательностей представляется в виде текстового файла кода ASCII, созданного 30 марта 2017 года, около 84 КБ, который включен в данный документ посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Гипофосфатазия (ГФ) является редким, наследственным заболеванием скелета с частотой 1 на 100 000 новорожденных с наиболее тяжелыми формами заболевания. ГФ часто является смертельной, когда обнаруживается при рождении, с процентом детской смертности ~70%. Сильно пораженные пациенты часто умирают в младенчестве от дыхательной недостаточности из-за прогрессирующей деформации груди.

ГФ может быть результатом мутации с утратой функции в гене, кодирующем тканенеспецифическую щелочную фосфатазу (TNALP). ГФ приводит к значительному многообразию симптомов и заболеваний, от рахита (остеомаляция) до почти полного отсутствия минерализации костей in utero (во время внутриутробного развития). Большинство пациентов демонстрируют характерные особенности скелетных изменений, карликовость, болезненные нижние конечности, нарушение походки и преждевременное выпадение зубов. Например, симптомы ГФ в младенчестве могут включать недостаточное увеличение веса, появление рахита, нарушеннную минерализацию скелета, прогрессирующую деминерализацию скелета, переломы ребер и деформацию грудной клетки, в то время как детские симптомы ГФ могут включать карликовость и деформации скелета, такие как дугообразная изогнутость ног и увеличенные запястья, колени и лодыжки как результат воспаления метафизов. Мышечная слабость (или гипотонус) также является важным симптомом, связанным с ГФ. Из-за физических дефектов, связанных с ГФ, пациенты, страдающие от ГФ, часто демонстрируют снижение способности или неспособность выполнять повседневную деятельность, которую здоровые пациенты выполняют ежедневно, не требуя помощи.

Утверждалось (без данных), что гипотонус при ГФ, является результатом токсичности PPi (неорганического пирофосфата) (Whyte, M.; J. Bone Mineral Res. (Jan. 2017)). Единственная статья показала, что PPi был способен нарушать взаимодействия актина/миозина в модели бычьей мышцы (Meat Science 84: 364-370 (2010)). Однако конкретные данные о мышечной слабости и уровнях PPi (неорганического пирофосфата)/ALP (щелочной фосфатазы) недоступны. Ранние данные включали скелетные изменения (с акцентом на рентгенографическую общую оценку изменений (RGI-C), но не смогли отделить мышечную слабость от фенотипической гетерогенности ГФ.

Примечательно, что лечение ГФ, особенно приостановление нарушений, связанных с ГФ, таких как мышечная слабость, в течение длительного периода времени, является неизвестным. Таким образом, существует потребность в способах, которые могут быть использованы для лечения мышечной слабости, связанной с ГФ или другими заболеваниями. Кроме того, существует потребность в способах лечения гипотонуса или мышечной слабости у людей, вызванных или связанных с повышением PPi и/или низкой активностью щелочной фосфатазы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Мышечная слабость была отмечена как симптом у некоторых пациентов с ГФ и другими заболеваниями или расстройствами. При ГФ, повышенная концентрация PPi обусловлена мутацией с потерей функции в гене ALPL, который кодирует тканевой неспецифический изофермент щелочной фосфатазы (TNALP, а также печеночный/костный/почечный тип ALP), который является ферментом для субстратов, таких как неорганический пирофосфат (PPi), фосфоэтаноламин (PEA) и пиридоксаль 5'-фосфат (PLP). В данном изобретении описаны способы лечения болезни с мышечной слабостью у субъекта, характеризующегося повышенной концентрацией пирофосфата (PPi) и/или пониженной концентрацией щелочной фосфатазы.

Фенотип мышечной слабости пациентов с ГФ можно считать вторичным и вызванным дефектами минерализации костей, которые воспринимаются как характерная особенность ГФ. Неожиданно, но в данном описании говорится, что мышечная слабость при ГФ, вероятно, не обусловлена дефектом кости, так как разница между мышцами у мышей дикого типа (ДТ) и мышей AKP2^-/-наблюдалась в типах соотношения волокон камбаловидной мышцы или камбаловидной мышцы или сократительных свойствах мышцы ДРП (длинного разгибателя пальцев) ex vivo. Напротив, мышечная слабость при ГФ больше кореллировала с повышенной концентрацией PPi, так как снижение PPi путем введения асфотазы альфа улучшило силу захвата мышц мышей AKP2^-/-. Таким образом, субъект, имеющий болезнь с мышечной слабостью, характеризующуюся повышенной концентрацией PPi, даже без других симптомов ГФ или не диагностируемую еще как ГФ, все же может лечиться асфотазой альфа. Способы проверки силы захвата были описаны, см., например, Whyte, M. et al., Bone 2016 Dec; 93: 125-138; Whyte, M., et al. JCI Insight 2016;27:87-102; Whyte, M. et al., Bone 2015 Jun; 75: 229-39.

Описанное представляет собой (1) способы идентификации субъектов (например, людей), имеющих или склонных к заболеванию с мышечной слабостью для лечения рекомбинантным полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы (например, TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) и (2) лечение таких субъектов рекомбинантным полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы. Примерные показатели, полезные для оценки необходимости или эффективности лечения с использованием рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, включают (1) концентрацию PPi в плазме и/или щелочной фосфатазы, (2) тест двигательных умений Бруйнинкса-Озерецкого 2-го выпуска (BOT-2), (3) опросник оценки здоровья детей (CHAQ), (4) инструмент сбора педиатрических данных (PODCI), (5) шкалы развития младенцев и детей Бейли, 3-е издание (BSID-III), (6) шкалы оценки моторного развития Пибоди, 2-е издание (PDMS-2), (7) тест с шестиминутной ходьбой (6MWT), (8) степень мышечной силы и (9) ручную динамометрию (HHD). Способы дополнительно включают использование одного или нескольких описанных показателей (например, концентрации PPi в плазме, концентрации щелочной фосфатазы, BOT-2, CHAQ, PODCI, BSID-III, PDMS-2, 6MWT, степени мышечной силы и HHD) по отдельности или в любой комбинации для оценки эффективности лечения с использованием рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы у субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, при этом улучшения по сравнению с определенным показателем или значением показывают, что рекомбинантный полипептид, обладающий активностью щелочной фосфатазы, эффективен для лечения заболевания с мышечной слабостью.

В одном аспекте данное описание представляет способ лечения или улучшения состояния при мышечной слабости у субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы. В некоторых вариантах реализации, указанный субъект имеет повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi) и/или низкую активность или концентрацию щелочной фосфатазы. В одном варианте реализации, указанный субъект имеет повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi) в сыворотке. В других вариантах реализации, указанный субъект имеет повышенную концентрацию по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы (например, PPi, PLP, PEA и т.д.).

В другом аспекте данное описание также обеспечивает способ идентификации субпопуляции субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью, при этом субъекты в указанной субпопуляции имеют повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi).

В некоторых вариантах реализации, мышца указанного субъекта существенно не отличается от мышцы нормального субъекта без указанной мышечной слабости по меньшей мере одним свойством такой мышцы. Такое свойство может быть выбрано из типа соотношения мышечного волокна, сократительных свойств волокна или других мышечных свойств, известных в данной области техники. Такие мышцы могут включать любую мышцу субъекта, включая, например, скелетные или поперечно-полосатые мышцы, сердечные мышцы или гладкие мышцы. В некоторых вариантах реализации, такие мышцы включают по меньшей мере один тип мышц рук и ног, в частности, по меньшей мере, один тип мышц, выбранных из камбаловидных и мышц длинных разгибателей пальцев (ДРП).

В некоторых вариантах реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, вызвана повышенной концентрацией неорганического пирофосфата (PPi), такой как концентрация PPi, превышающая примерно 4,5 мкМ. В одном варианте реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, вызвана повышением концентрации неорганического пирофосфата в сыворотке (PPi). Например, повышенная концентрация PPi в образце (например, образец плазмы) у младенца или ребенка (например, субъекта менее примерно 12 лет) может быть около 5,71 мкМ или более, повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) от подростка (например, субъекта примерно от 13 до 18 лет) может быть около 4,78 мкМ или более; и повышенная концентрация PPi в образце (например, образец плазмы) от взрослого человека (например, субъекта в возрасте более чем 18 лет), может быть около 5,82 мкМ или более. В других вариантах реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, вызвана повышенной концентрацией по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы (например, PPi, PLP, PEA и т.д.). В некоторых вариантах реализации, повышенная концентрация пирофосфата (PPi) усиливает болезнь с мышечной слабостью, описанную в данном документе у указанного субъекта. В одном варианте реализации, повышенная концентрация PPi в сыворотке усиливает болезнь с мышечной слабостью, описанную в данном документе у указанного субъекта. Например, повышенная концентрация в сыворотке неорганического PPi, который усиливает болезнь с мышечной слабостью, может составлять, например, около 5,71 мкМ или более в образце (например, образце плазмы) от младенца или ребенка (например, субъекта менее примерно 12 лет), около 4,78 мкМ или более в образце (например, образце плазмы) от подростка (например, субъекта примерно от 13 до примерно 18 лет); и около 5,82 мкМ или более в образце (например, образце плазмы) от взрослого человека (например, субъекта более чем примерно 18 лет).

В некоторых вариантах реализации, болезнь с мышечной слабостью вызвана или усиливается низкой концентрацией щелочной фосфатазы у субъекта. Например, низкая концентрация щелочной фосфатазы в образце (например, образце плазмы) от субъекта может быть, например, около 90 ед/л или менее для субъекта в возрасте от 0 до 14 дней; около 134 ед/л или менее для субъекта в возрасте 15 дней до менее чем 1 года; около 156 ед/л или менее для субъекта в возрасте примерно от 1 года до менее чем 10 лет; около 141 ед/л или менее для субъекта в возрасте примерно от 10 лет до менее чем 13 лет; около 62 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем 15-летнего возраста; около 127 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем 15 лет; около 54 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно 15 лет до менее чем до 17 лет; около 89 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 15 лет до менее чем 17 лет; около 48 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно 17 лет и старше; или около 59 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно 17 лет и старше.

В других вариантах реализации, повышенная концентрация по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы (например, PPi, PLP, PEA и т.д.) усиливает болезнь с мышечной слабостью, описанную в данном документе у указанного субъекта.

Болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, включает, по меньшей мере, одно из следующего, например, гипофосфатазию (ГФ), отложение кристаллов дигидрата пирофосфата кальция (CPPD), наследственную гипофосфатемию (такую как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленную гипофосфатемия (XLH) и т.д.) или другие заболевания, имеющие фенотип мышечной слабости и повышенную концентрацию по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы (например, PPi, PLP, PEA и т.д.). В одном варианте реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, включает, по меньшей мере, одно из следующего, например, гипофосфатазию (ГФ), отложение кристаллов дигидрата пирофосфата кальция (CPPD), наследственную гипофосфатемию (такую как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленную гипофосфатемия (XLH) и т.д.) или другие заболевания, имеющие фенотип мышечной слабости и повышенную концентрацию (например, концентрацию в сыворотке) неорганического пирофосфата (PPi).

В некоторых вариантах реализации, введение по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) уменьшает концентрацию PPi в образце (например, образец плазмы) у указанного субъекта. Например, введение по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида пациенту, имеющего активность щелочной фосфатазы, уменьшает концентрацию PPi в образце (например, образец плазмы) до менее чем около 5,71 мкМ для младенца или ребенка (например, концентрацию PPi в плазме около 3,5 мкМ, около 4 мкМ, около 4,5 мкМ, около 5 мкМ или около 5,5 мкМ или концентрацию PPi плазмы в диапазоне от около 3,5 мкМ до около 5,5 мкМ); менее чем около 4,78 мкМ для подростка (например, концентрацию PPi плазмы около 3,5 мкМ, около 4 мкМ или около 4,5 мкМ или концентрацию PPi в плазме в диапазоне от около 3,5 мкМ до около 4,5 мкМ); или менее чем около 5,82 мкМ для взрослого человека (например, концентрацию PPi в плазме около 3,5 мкМ, около 4 мкМ, около 4,5 мкМ, около 5 мкМ или около 5,5 мкМ или концентрацию PPi в плазме в диапазоне от около 3,5 мкМ до около 5,5 мкМ).

В другом аспекте, в данном описании также предлагается способ, включающий: (i) идентификацию популяции субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью; (ii) определение субпопуляции субъектов среди популяции на этапе (i), где: (а) субъекты в указанной субпопуляции имеют повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi); (b) повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi), который усиливает мышечную слабость у субъектов в указанной субпопуляции; или (c) оба (a) и (b); и (iii) лечение указанной субпопуляции на этапе (ii).

В другом аспекте, в данном описании также предлагается способ, включающий: (i) идентификацию популяции субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью; (ii) определение субпопуляции субъектов среди популяции на этпапе (i), где: (а) субъекты в указанной субпопуляции имеют повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi); (b) повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi), который усиливает мышечную слабость у субъектов в указанной субпопуляции; или (c) оба (a) и (b); и (iii) лечение или уменьшение интенсивности по меньшей мере одного симптома болезни с мышечной слабостью у субъекта в субпопуляции на этапе (ii), включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы. В одном варианте реализации, указанные субъекты в субпопуляции имеют повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi) в сыворотке.

В некоторых вариантах реализации, мышца субъекта на этапе (iii), описанном в данном документе, существенно не отличается от мышцы нормального субъекта без указанного типа мышечной слабости по меньшей мере одним свойством мышцы. В одном варианте реализации, по меньшей мере, одно свойство мышцы включает, например, соотношение типа волокна и/или сократительные свойства волокна. Такие мышцы могут включать любую мышцу субъекта, включая, например, скелетные или полосатые мышцы, сердечные мышцы или гладкие мышцы. В некоторых вариантах реализации, такие мышцы включают по меньшей мере один тип мышц рук и/или ног, в частности, по меньшей мере, один тип мышцы, выбранной из камбаловидной и мышцы длинного разгибателя пальцев (ДРП). В некоторых вариантах реализации, способ включает идентификацию субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, и имеющего повышенную концентрацию PPi, повышенную концентрацию щелочной фосфатазы, снижение захвата, средний показатель силы BOT-2, например, менее чем 10, среднее значение скорости бега BOT-2 и показателя ловкости, например, менее чем 5, средний показатель индекса CHAQ, например, больше чем около 0,8, средний показатель PODCI, например, менее чем около 40, и среднее 6MWT, например, менее чем около 80% от прогнозируемого значения 6MWT, и/или степень мышечной силы, например, менее чем 5.

Например, повышенная концентрация PPi в образце (например, образец плазмы) у младенца или ребенка (например, субъект в возрасте менее чем примерно 12 лет) может быть около 5,71 мкМ или более, повышенная концентрация PPi в образце (например, образец плазмы) от подростка (например, субъект примерно от 13 до примерно 18 лет) может быть около 4,78 мкМ или более; и повышенная концентрация PPi в образце (например, образец плазмы) от взрослого человека (например, субъекта в возрасте более чем примерно 18 лет), может быть около 5,82 мкМ или более. Дополнительно, повышенная концентрация щелочной фосфатазы в образце (например, образце плазмы) от субъекта может быть, например, около 90 ед/л или менее для субъекта в возрасте от 0 до 14 дней; около 134 ед/л или менее для субъекта в возрасте 15 дней до менее чем 1 года; около 156 ед/л или менее для субъекта в возрасте примерно от 1 года до менее чем 10 лет; около 141 ед/л или менее для субъекта в возрасте примерно от 10 лет до менее чем примерно 13 лет; около 62 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем примерно 15-летнего возраста; около 127 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем примерно 15 лет; около 54 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно 15 лет до менее чем примерно 17 лет; около 89 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 15 лет до менее чем примерно 17 лет; около 48 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно 17 лет и старше; или около 59 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно 17 лет и старше.

В некоторых вариантах реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, вызвана повышением концентрации неорганического пирофосфата в сыворотке (PPi). В одном варианте реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, вызвана повышением концентрации неорганического пирофосфата (PPi) в сыворотке. Например, повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) у младенца или ребенка (например, субъекта в возрасте менее чем примерно 12 лет) может быть около 5,71 мкМ или более, повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) от подростка (например, субъекта примерно от 13 до примерно 18 лет) может быть около 4,78 мкМ или более; и повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) от взрослого человека (например, субъекта в возрасте более чем примерно 18 лет), может быть около 5,82 мкМ. В других вариантах реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, вызвана повышенной концентрацией по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы (например, PPi, PLP, PEA и т.д.).

В некоторых вариантах реализации, повышенная концентрация пирофосфата (PPi) усиливает болезнь с мышечной слабостью, описанную в данном документе у указанного субъекта на этапе (iii), описанном в данном документе. В одном варианте реализации, повышенная концентрация неорганического пирофосфата (PPi) в сыворотке усиливает болезнь с мышечной слабостью, описанную в данном документе у указанного субъекта. Например, повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) у младенца или ребенка (например, субъекта в возрасте менее чем примерно 12 лет) может быть около 5,71 мкМ или более, повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) от подростка (например, субъекта примерно от 13 до примерно 18 лет) может быть около 4,78 мкМ или более; и повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) от взрослого человека (например, субъекта в возрасте более чем примерно 18 лет), может быть около 5,82 мкМ.

В других вариантах реализации, повышением концентрации по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы (например, PPi, PLP, PEA и т.д.) усиливается болезнь с мышечной слабостью, описанную в данном документе у указанного субъекта.

Болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе для отбора субпопуляции, включает, по меньшей мере, одно из следующего, например, гипофосфатазию (ГФ), отложение кристаллов дигидратаcпирофосфата кальция (CPPD), наследственную гипофосфатемию (такую как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленную гипофосфатемия (XLH) и т.д.) или другие заболевания, имеющие фенотип мышечной слабости и повышенную концентрацию по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы (например, PPi, PLP, PEA и т.д.). В одном варианте реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, включает, по меньшей мере, одно из следующего, например, гипофосфатазию (ГФ), отложение кристаллов дигидрата пирофосфата кальция (CPPD), наследственную гипофосфатемию (такую как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленную гипофосфатемия (XLH) и т.д.) или другие заболевания, имеющие фенотип мышечной слабости и повышенную концентрацию (например, концентрацию в сыворотке) неорганического пирофосфата (PPi).

В некоторых вариантах реализации, введение по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) уменьшает концентрацию неорганического пирофосфата (PPi) в образце (например, образце плазмы) у указанного субъекта. Например, введение по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида пациенту, имеющего активность щелочной фосфатазы, уменьшает концентрацию PPi в образце (например, образце плазмы) до менее чем около 5,71 мкМ для младенца или ребенка (например, концентрацию PPi в плазме около 3,5 мкМ, около 4 мкМ, около 4,5 мкМ, около 5 мкМ или около 5,5 мкМ или концентрацию PPi плазмы в диапазоне от около 3,5 мкМ до около 5,5 мкМ); менее чем около 4,78 мкМ для подростка (например, концентрацию PPi плазмы около 3,5 мкМ, около 4 мкМ или около 4,5 мкМ или концентрацию PPi в плазме в диапазоне от около 3,5 мкМ до около 4,5 мкМ); или менее чем около 5,82 мкМ для взрослого человека (например, концентрацию PPi в плазме около 3,5 мкМ, около 4 мкМ, около 4,5 мкМ, около 5 мкМ или около 5,5 мкМ или концентрацию PPi в плазме в диапазоне от около 3,5 мкМ до около 5,5 мкМ).

В некоторых вариантах реализации, введение по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) увеличивает концентрацию щелочной фосфатазы в образце (например, образце плазмы) у указанного субъекта. Например, введение по меньшей мере рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы повышает концентрацию щелочной фосфатазы в образце (например, образце плазмы) от субъекта до, например, около 273 ед/л или более для субъекта в возрасте от 0 до 14 дней; около 518 ед/л или более для субъекта в возрасте 15 дней до менее чем 1 года; около 369 ед/л или более для субъекта в возрасте примерно от 1 года до менее чем 10 лет; около 460 ед/л или более для субъекта в возрасте примерно от 10 лет до менее чем примерно 13 лет; около 280 ед/л или более для женщины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем примерно 15-летнего возраста; около 517 ед/л или более для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем примерно 15 лет; около 128 ед/л или более для женщины-субъекта в возрасте примерно 15 лет до менее чем примерно 17 лет; около 365 ед/л или более для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 15 лет до менее чем примерно 17 лет; около 95 ед/л или более для женщины-субъекта в возрасте примерно 17 лет или старше; или около 164 ед/л или более для мужчины-субъекта в возрасте примерно 17 лет или старше.

В некоторых вариантах реализации, субъект может также проявлять меньшую зависимость от приспособлений вспомогательной мобильности (например, ходунков, инвалидного кресла, брейсов, костылей и ортезов) после введения по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы.

В любом из вышеуказанных аспектов, перед введением по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, субъект характеризуется как имеющий среднюю ручную динамометрию (HHD) со значением меньшим чем около 80% от прогнозируемого значения HHD (например, относительно нормального субъекта примерно того же возраста, одного и того же пола и/или того же роста), в частности, у которого значение HHD представляет силу захвата, сгибание колена, разгибание ноги в коленном суставе, сгибание бедра, разгибание бедра, или абдукцию бедра субъекта. Например, введение по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, приводит к среднему значению HHD субъекта около 50% или более от прогнозируемого значения HHD, например, при этом значение HHD представляет силу захвата, сгибание колена, разгибание ноги в коленном суставе, сгибание бедра, разгибание бедра или абдукцию бедра субъекта.

В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, вводится или может вводиться субъекту ежедневно, два раза в неделю, один раз в неделю или с меньшей частотой. В одном варианте реализации, по меньшей мере, один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, вводится субъекту ежедневно. По меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, может вводиться субъекту по меньшей мере неделю, две недели, один месяц, три месяца, шесть месяцев, один год или более длительный период, в течение всей жизни субъекта.

В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере, один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, вводится или может вводиться по меньшей мере одним путем. Такие пути включают, например, подкожные, внутривенные, внутримышечные, сублингвальные, интратекальные, внутрикожные или другие пути, известные в данной области техники. В одном варианте реализации, по меньшей мере, один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, вводится подкожно.

В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, включает по меньшей мере одну тканенеспецифическую щелочную фосфатазу (TNALP), плацентарную щелочную фосфатазу (PALP), щелочную фосфатазу зародышевой клетки (GCALP), щелочную фосфатазу кишечника (IALP) и биологически функциональные фрагменты, слития или их химерные конструкции. В одном варианте реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, включает по меньшей мере один из растворимого фрагмента TNALP, PALP, GCALP и IALP. В одном варианте реализации, описанная в данном документе тканенеспецифическая щелочная фосфатаза (TNALP) содержит или состоит из аминокислотной последовательности аминокислот 1-485 SEQ ID NO: 1. В другом варианте реализации, тканенеспецифическая щелочная фосфатаза (TNALP), описанная в данном документе, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, представляет собой слитый белок. В одном варианте реализации, по меньшей мере, один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, включает молекулу иммуноглобулина. Такая молекула иммуноглобулина может быть, например, кристаллизующимся фрагментом (Fc) или полноразмерным или его фрагментом, IgG, включая, но не ограничиваясь ими, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgG_2/4 или другими слитиями IgG. В одном варианте реализации, Fc, описанный в данном документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, содержит отрицательно заряженный пептид. Такой отрицательно заряженный пептид может включать по меньшей мере один пептид поли(глутаминовой кислоты) (polyE) или поли(аспарагиновой кислоты) (polyD), например, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, содержащий 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 последовательных кислых остатков, в частности, аспарагиновой кислоты (D) или глутаминовой кислоты (E), такой как, по меньшей мере, одной из D₁₀, D₁₆, E₁₀ и E₁₆. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере, один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, включает E₆, E₇, E₈, E₉, E₁₀, E₁₁, E₁₂, E₁₃, E₁₄, E₁₅, E₁₆, D₆, D₇, D₈, D₉, D₁₀, D₁₁, D₁₂, D₁₃, D₁₄, D₁₅ или D₁₆, например, E₆, E₁₀, D₆ или D₁₀.

В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере, один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, включает целевую костную щелочную фосфатазу, содержащую полипептид со структурой: Z-sALP-Y-спейсер-X-Wn-V, где sALP представляет собой внеклеточный домен щелочной фосфатазы; V отсутствует или представляет собой аминокислотную последовательность из по меньшей мере одной аминокислоты; X отсутствует или представляет собой аминокислотную последовательность из по меньшей мере одной аминокислоты; Y отсутствует или представляет собой аминокислотную последовательность из по меньшей мере одной аминокислоты; Z отсутствует или представляет собой аминокислотную последовательность из по меньшей мере одной аминокислоты; и Wn представляет собой полиаспартат или полиглутамат, где n=10-16.

В некоторых вариантах реализации, спейсер, описанный в данном документе, содержит фрагмент кристаллизующейся области (Fc). В одном варианте реализации, Fc, описанный в данном документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, содержит структуру sALP-Fc-D₁₀.

В одном варианте реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, включает димер, содержащий мономеры аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, вводят в дозе от около 0,1 мг/кг/ день до около 20 мг/кг/день или в сравнимой еженедельной дозе. В одном варианте реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, вводят в дозе от около 0,5 мг/кг/день до около 20 мг/кг/день или в сравнимой еженедельной дозе. В другом варианте реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, вводят в дозе от около 0,5 мг/кг/день до около 10 мг/кг/день или в сравнимой еженедельной дозе. В другом варианте реализации, по меньшей мере один рекомбинантный полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, описанный в данном документе, вводят в дозе от около 1 мг/кг/день до около 10 мг/кг/день или в сравнимой еженедельной дозе.

В некоторых вариантах реализации, субъект, описанный в данном документе, представляет собой млекопитающее (например, человека).

Определения

Используемые в данном документе формы единственного числа подразумевают «по меньшей мере один» или «один или несколько», если не указано иное. Кроме того, единственные формы включают множественные формы, если контекст явно не требует иного.

Используемый в данном документе термин «около» относится к количеству, составляющему ±10% от указанного значения, и предпочтительно составляет ±5% от указанного значения или более предпочтительно ±2% от указанного значения.

Используемый в данном документе термин «по меньшей мере» относится к количеству, составляющему ≤10% от указанного значения, и предпочтительно составляет ≤5% от указанного значения или более предпочтительно ≤2% от указанного значения.

Под «асфотазой альфа» подразумевается человеческий слитый белок TNALP (hTNALP), разработанный для лечения ГФ. Асфотаза альфа представляет собой слитый белок, включающий растворимый гликопротеин из двух идентичных полипептидных цепей, в котором каждая полипептидная цепь содержит аминокислотные остатки 1-726 SEQ ID NO: 1. Структура каждой полипептидной цепи содержит каталитический домен hTNALP, Fc-домен человеческого иммуноглобулина G₁и пептид дека-аспартата, используемый в качестве костно-нацеленного домена (структура hTNALP-Fc-D₁₀). Две полипептидные цепи ковалентно связаны двумя дисульфидными связями. Асфотаза альфа была одобрена под торговой маркой STRENSIQ^® (Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven, CT) в Соединенных Штатах, Европе, Японии, Канаде, Израиле, Австралии и Корее.

Термины «индивидуум», «субъект» и «пациент» используются взаимозаменяемо и относятся к любому субъекту, для которого требуется диагностика, лечение или терапия, в частности к людям. Другие субъекты могут включать, например, крупный рогатый скот, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей и тому подобное. Используемые в данном документе термины, субъект «в группе риска» или субъект, «склонный» к болезни, представляет собой субъект, который идентифицирован как имеющий риск развития заболевания, расстройства или симптомов, связанных с болезнью с мышечной слабостью.

Используемый в данном документе термин «средний» относится к числовому значению, выражающему среднее значение или медиану набора данных. Среднее значение набора данных вычисляется путем деления суммы значений в наборе данных на их число. Медиана набора данных вычисляется путем определения среднего значения в списке данных нечетных чисел или путем определения среднего значения двух значений данных в середине в списке четных чисел.

Термин «дикий тип» или «последовательность дикого типа», используемый для TNALP или других генов или белков данного описания, относится к типичной форме таких генов или белков, встречающихся у людей или млекопитающих, не относящихся к человеку, или других живых организмов. Последовательность дикого типа может относиться к стандартному «нормальному» аллелю в локусе гена или стандартной «нормальной» первичной аминокислотной последовательности (необязательно со стандартными «нормальными» посттрансляционными модификациями и/или межцепочечными связями и/или взаимодействиями между аминокислотными остатками) полипептида или белка, в отличие от того, который получают нестандартной «мутантной» аллелью или аминокислотной последовательностью/модификацией/взаимодействием. «Мутантные» аллели могут варьироваться в значительной степени и даже стать диким типом, если генетический сдвиг происходит внутри популяции. Понятно, что большинство или все локусы генов (с меньшей частотой, но все же возможно для большинства полипептидных последовательностей) существуют во множестве аллельных форм, которые различаются по частоте у всего ареал вида и, что однородный дикий тип может не обязательно существовать. В общем, однако, наиболее распространенная аллельная или аминокислотная последовательность, то есть та, которая имеет наивысшую частоту среди обычных людей или других организмов, является той, которую в данном описании считают диким типом.

Термин «нормальный», используемый для человека или других организмов в данном описании, относится, если не указано иное, к человеку или другим организмам без каких-либо заболеваний (например, ГФ), расстройств и/или симптомов или физиологических последствий (например, мышечная слабость), вызванных или связанных с аберрантной активностью (которая может быть вызвана, например, недостатком или отсутствием гена или белкового продукта и/или дефектной или утраченной функцией гена или белкового продукта) соответствующего гена или полипептида/белка. Наиболее очевидным примером нормального человека является человек, у которого нет мышечной слабости или симптомов мышечной слабости и нет мутаций или модификаций генов или белков (например, гена ALPL и белков ALP), что может привести к мышечной слабости, связанной с ГФ. В другом варианте, связанном с функциями ALP, рамки «нормального» человека в данном описании могут быть расширены до включения любых людей, не имеющих аберрантную активность эндогенной щелочной фосфатазы (которая может быть протестирована, например, на уровень субстрата (PPi, PEA и PLP) и сравнима с соответствующей активностью у других здоровых или нормальных людей).

Используемый в данном документе термин «повышенная» или «увеличенная» концентрация относится к концентрации (например, PPi) у субъекта, имеющего или склонного к заболеванию мышечной слабостю, описанному в данном документе, которая выше, чем концентрация у субъекта дикого типа, у другого субъекта без заболевания мышечной слабостью, у одного и того же субъекта в момент времени, когда субъект не имеет такой мышечной слабости, или у того же субъекта, если у субъекта не было такой мышечной слабости. Такая «повышенная концентрация» относится к повышенной концентрации внутри субъекта, описанного в данном документе, включая любую клетку, ткань, орган или часть субъекта. В одном варианте реализации, такая «повышенная концентрация» включает повышенную концентрацию в сыворотке субъекта.

Термины «Шкалы развития младенцев и детей Бейли, 3-е издание» или «BSID-III», используемые в данном документе, относятся к стандартизованной серии измерений, используемых для оценки моторики (мелкой и крупной), языка (восприятия и выражения) и когнитивного развития пациентов. См Bayley, (2006). Bayley scales of infant and toddler development: administration manual. San Antonio, TX: Harcourt Assessment, включены в виде ссылки в полном объеме. Измерения BSID-III включают ряд задач, связанных с развитием, которые применяются в отношении пациента. Исходные баллы успешно завершенных критериев преобразуются в баллы шкалл. Баллы шкал затем используются для определения показателей пациента по сравнению со здоровыми, стандартизированными по возрасту пациентами. BSID-III также может включать опросник социального-эмоционального адаптивного поведения, который выполняется с родителем/опекуном, чтобы установить диапазон адаптивного поведения пациента. Например, измерения для определения показателей BSID-III (например, показателя общей моторики BSID-III) могут включать прегензию, перцептивно-моторную координацию, моторное планирование и скорость, визуальный поиск, достижение, хватание объекта, управление объектами, функциональные практичные навыки, ответы на тактильный сигнал, движение конечностей и туловища, статическое позиционирование, динамическое движение, равновесие и моторное планирование. Затем эти измерения пациента преобразуются в показатель шкалы BSID-III (например, показатель общей моторики BSID-III) в диапазоне от 0 до 14, в которых показатели от 7 до 13 считаются нормальным диапазоном здоровых пациентов.

Используемый в данном документе термин «костно-нацеливающий фрагмент» относится к аминокислотной последовательности длиной от 1 до 50 аминокислотных остатков в длину, имеющей достаточное сродство к костному матриксу, вследствие чего, костно-наливающий компонент, полностью, имеет аффинность связывания in vivo с костным матриксом от около 10^-6 М до около 10^-15М (например, 10^-7 М, 10^-8 М, 10^-9 М, 10^-10 М, 10^-11 М, 10^-12 М, 10^-13 М, 10^-14 М или 10^-15 М).

Термины «тест двигательных умений Бруйнинкса-Озерецкого 2-го выпуска» или «BOT-2», используемые в данном документе, относятся ко второму изданию стандартизованного теста на крупные и мелкие двигательные умения пациентов, например в возрасте от примерно 4 до примерно 21 года. См. Bruininks, R. H. (2005). Bruininks-Oseretsky Test of Motor Proficiency, (BOT-2). Minneapolis, MN: Pearson Assessment, включенную в виде ссылки в полном объеме». BOT-2 проводится индивидуально для оценки крупных и мелких моторных навыков ряда пациентов. В частности, BOT-2 может использоваться для оценки физических нарушений и ограничений мобильности у пациентов с ГФ. BOT-2 обеспечивает суммарный балл показателей BOT-2 в следующих аспектах: сила, скорость движения и ловкость, точность моторики, координация мелкой моторики, ловкость рук, двусторонняя координация, равновесие, и координация верхних конечностей. Например, показатель силы BOT-2 можно определить, если пациент выполняет приседания, подпрыгивания, прыжок в длину с места, приседание с опорой и отжимания. Показатель скорости бега и ловкости может быть определен посредством того, как пациент прошел по гимнастическому бревну или выполнил челночный бег, прыжки в стороны на двух ногах или прыжки в стороны на одной ноге. Показатели как силы в BOT-2, так и скорости бега и ловкость в BOT-2 варьируют от 0 до 25, в которых балл от около 10 до 20 считается репрезентативным для здоровых пациентов.

Термины «опросник оценки здоровья детей» или «CHAQ», используемые в данном документе, относятся к опроснику, который используется для оценки состояния здоровья (например, способности выполнять повседневную деятельность (ADL) и частоты возникновения боли) пациентов в возрасте от 1 до 19 лет, таких как пациенты с ГФ. Для описания индексов CHAQ, см. Bruce & Fries (J. Rheumatol. 30(1): 167-178, 2003), включенную в виде ссылки в полном объеме. CHAQ может проводиться путем опроса или самоотчета для детей старше 8 лет. CHAQ включает в себя восемь подшкал в отношении одевания/ухода за собой, подъема, приема пищи, ходьбы, гигиены, достижения, захвата и физической деятельности. Диапазон показателей в каждой категории составляет от 0 до 3, в которых оценка 0 указывает на отсутствие какой-либо проблемы; оценка 1 указывает на наличие некоторого затруднения; оценка 2 указывает наличие значительного затруднения; и оценка 3 указывает на то, что пациент не может осуществлять указанную активность. Индекс CHAQ также может быть использован для определения наличия и степени тяжести боли.

Под «внеклеточным доменом» понимают любую функциональную внеклеточную часть нативного белка, например щелочной фосфатазы. В частности, внеклеточный домен не имеет сигнального пептида.

Под «Fc» понимают фрагментированную кристаллизующуюся область иммуноглобулина, например IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-3 или IgG-4, включая домены CH2 и CH3 тяжелой цепи иммуноглобулина. Fc может также включать любую часть шарнирной области, соединяющую области Fab и Fc. Fc может быть любого млекопитающего, включая человека, и может быть посттрансляционно модифицированным (например, путем гликозилирования). В неограничивающем примере, Fc может представлять собой фрагмент кристаллизующейся области человеческого IgG-1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

Под «фрагментом» подразумевается участки полипептида или нуклеиновой кислоты, которые содержат, предпочтительно, по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более всей длины эталонной молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида. Фрагмент может содержать, например, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 400, 500, 600, 700 или более аминокислотных остатков всей длины полипептида. Приводимые в качестве примера, фрагменты_SALP имеют аминокислотные остатки 18-498, 18-499, 18-500, 18-501, 18-502, 18-503, 18-504, 18-505, 18-506, 18-507, 18-508, 18-509, 18-510, 18-511 или 18-512 ALP (например, SEQ ID NO: 2-6) и могут включать дополнительные C-концевые и/или N-концевые участки.

Термины «ручная динамометрия» и «HHD», используемые взаимозаменяемо в данном документе, относятся к способу измерения захвата и силы мышц субъектов, в частности, у субъектов, имеющих или склонных к заболеванию мышечной слабостью. Динамометр может использоваться для оценки силы захвата, сгибания колена, разгибания ноги в коленном суставе, сгибания бедра, разгибания бедра и абдукции бедра субъекта (например, субъекта, имеющего или склонного к заболеванию мышечной слабостью). Например, сгибание колена и разгибание, а также сгибание, разгибание и абдукцию бедра у субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, можно измерить, используя, например, динамометр MICROFET2^TM, в то время как сила захвата субъекта может быть измерена с использованием, например, ручного динамометра Jamar. В частности, сотрудник удерживает динамометр в стационарном состоянии, и субъект оказывает максимальную силу против динамометра. Данные максимальных значений силы получают в фунтах, а затем преобразуют в Ньютоны (N). Затем значения крутящего момента вычисляются с использованием длины конечности в ньютон-метрах. Затем значение крутящего момента можно сравнить со значением, например, обычного субъекта примерно того же возраста, одного и того же пола и/или одного и того же роста и выразить как процентное значение для получения значения HHD субъекта.

Термины «гипофосфатазия» или «ГФ», используемые в данном документе, относятся к редкому наследуемому заболеванию скелета, вызванному, например, одной или несколькими мутациями с потерей функции в гене ALPL (щелочной фосфатазы, печени/кости/почек), который кодирует неспецифическую щелочную фосфатазу (TNALP). ГФ может быть дополнительно охарактеризована как инфантильная ГФ, детская ГФ, перинатальная ГФ (например, перинатальная доброкачественная ГФ или летальная перинатальная ГФ) или одонто-ГФ.

Под «наивным пациентом» или «наивным субъектом» подразумевается пациент или субъект, страдающий болезнью с мышечной слабостью, описанным в данном документе, который никогда не получал лечения щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы, таким как sALP (например, TNALP, например, полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющим по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).

Термин «боль», используемый в данном документе, относится к физическим страданиям или дискомфортам, вызванным описанной в данном документе болезнью с мышечной слабостью, таким как боль в мышцах. Например, симптомы боли могут включать, например, болезненность, сжимание или окоченение. Тяжесть боли может варьироваться между пациентами (например, хроническая боль или острая боль). В частности, хроническая боль относится к боли, которая длится дольше трех-шести месяцев или боли, которые выходят за пределы ожидаемого периода выздоровления. В отличии, острая боль относится к боли, которая обычно длится менее трех-шести месяцев. Как описано в данном документе, терапевтические композиции (например, включая sALP, такие как асфотаза альфа), могут вводиться пациенту, страдающему от боли (например, мышечной боли) в количестве, достаточном для облегчения или, по меньшей мере, частичного облегчения симптомов боли (например, дискомфорта, болезненности, сжимания или окоченения) и ее осложнений (например, усталости, бессонницы, ослабления иммунной системы, депрессии, беспокойства, стресса, раздражительности или инвалидности).

Термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к любой цепи из двух или более природных или неестественных аминокислотных остатков независимо от посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования), составляя все или часть естественно встречающегося или неприродного полипептида или пептида, как описано в данном документе.

Под «фармацевтически приемлемым носителем» или «фармацевтически приемлемым наполнителем» подразумевается по меньшей мере один носитель или наполнитель, соответственно, который физиологически приемлем для пациента, подвергавшегося лечению, сохраняя при этом терапевтические свойства соединения, с которым он вводится. Одним из примерных фармацевтически приемлемых веществ-носителей является физиологический раствор. Например, фармацевтически приемлемый носитель может включать хлорид натрия (например, 150-ти мМ хлорид натрия) и фосфат натрия (например, 25-ти мМ фосфат натрия). Другие физиологически приемлемые носители и их составы известны специалистам в данной области техники и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (20^th edition), A. Gennaro, Ed., 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

Под «фармацевтической композицией» понимается композиция, содержащая полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, составленная по меньшей мере, с одним фармацевтически приемлемым наполнителем, разбавителем или носителем. Фармацевтическая композиция может быть изготовлена или продана с одобрения правительственного регулирующего органа в рамках режима лечения для лечения или профилактики заболевания или нарушения у пациента. Фармацевтические композиции могут быть составлены, например, для подкожного введения, внутривенного введения (например, в виде стерильного раствора, свободного от эмболов в виде частиц и в системе растворителей, пригодной для внутривенного применения) для перорального введения (например, таблетка, капсула, желатиновая капсула или сироп) или любого другого препарата, описанного в данном документе, например, в стандартной дозированной форме. В одном варианте реализации, фармацевтическая композиция по данному изобретению вводится подкожно или составляется для подкожного введения.

Термин «физические нарушения», используемый в данном документе, относится к физиологическому состоянию, такому как слабость костей (остеопороз) и мышечная слабость, описанные в данном документе, которые могут ограничивать или элиминировать, например, способность к передвижению, функциональную выносливость и способность выполнять повседневную деятельность (ADL) пациента. В частности, физические нарушения могут ограничивать или устранять способность пациента выполнять ADL, которая является повседневными действиями, которые здоровые пациенты выполняют ежедневно, не требуя помощи, такой как функциональная мобильность или перенос (например, ходьба), купание и душ, одевание, самообслуживание при приеме пищи, личная гигиена и уход. Как описано в данном документе, терапевтические композиции (например, композиции, включающие sALP, такие как асфотаза альфа), могут вводиться пациенту для снижения тяжести и/или частоты физических нарушений, связанных с мышечной слабостью.

Используемые в данном документе термины «инструмент сбора педиатрических данных» или «PODCI» относятся к опроснику, используемому для оценки общего состояния здоровья, заболеваемости и способности выполнять ADL для пациентов в возрасте до 19 лет, особенно у пациентов с хроническими заболеваниями, такими как пациенты с ГФ. Описание PODCI см. Plint et al. (J. Pediatr. Orthop. 23(6): 788-790, 2003), включенную в виде ссылки в полном объеме. Анкета может быть заполнена пациентом или родителем/опекуном пациента со знанием состояния пациента. Восемь шкал, сформированных в PODCI, включают следующее: 1) шкалу верхних конечностей и физической функции для измерения сложности при выполнении ежедневного ухода за собой и студенческой деятельности; 2) шкалу передвижения и основной физической деятельности для измерения сложности, возникающей при выполнении повседневных физических действий и двигательной активности в повседневной деятельности; 3) шкалу спортивного/физического функционирования для измерения трудностей или ограничений, возникающих при участии в более активных действиях или спорте; 4) шкалу боли/комфорта для измерения уровня боли, испытываемого в течение прошедшей недели; 5) шкалу ожиданий при лечении для измерения долгосрочных ожиданий при лечении; 6) шкалу счастья для измерения общей удовлетворенности личной внешностью и чувством сходства с друзьями и другими людьми своего возраста; 7) удовлетворенность шкалой симптомов, чтобы измерить принятие пациентом текущих ограничений, если это будет пожизненное состояние; и 8) шкалу общего функционирования, которая является общей комбинированной шкалой, рассчитанной по первым четырем шкалам, перечисленным выше. Стандартизованные показатели генерируются из серии вопросов в PODCI и преобразуются в шкалу от 0 до 100, в которой 0 представляет значительные нарушения, а 100 представляет менее значительные нарушения.

Термины «шкалы оценки моторного развития Пибоди, 2-е издание» или «PDMS-2», используемые в данном документе, относятся к программе раннего развития моторики у детей, которая дает оценку крупных и мелких моторных навыков у пациентов от рождения и на протяжении детского возраста (например, младенцев и детей). Для описания шкал PDMS-2 см. van Hartingsveldt et al. (Occup.Ther. Int. 12(1): 1-13, 2005), включенную в виде ссылки в полном объеме. PDMS-2 состоит из шести подтестов, которые измеряют взаимосвязанные моторные способности на ранних этапах развития. Шесть подтестов включают следующее: 1) локомоторный подтест измеряет способность пациента перемещаться из одного места в другое (измерения включают в себя ползание, ходьбу, бег, подскоки и прыжки вперед); 2) подтесты рефлексов для измерения способности пациента автоматически реагировать на действия окружающей среды; 3) стационарный подтест, чтобы измерить способность пациента поддерживать контроль над его или ее телом в центре тяжести и сохранять равновесие; 4) подтест управления объектом для измерения способности пациента управлять объектом, например, ловить, бросать и пинать мяч; 5) подтест с хватанием, чтобы измерить способность пациента использовать его или ее руки, например способность удерживать объект одной рукой и действия, связанные с контролируемым использованием пальцев обеих рук; и 6) субтест визуально-моторной координации для измерения способности пациента использовать свои визуальные навыки восприятия для выполнения сложных задач координации глаз, таких как достижение и захват объекта, создание блоков и копирование конструкций. Измерения PDMS-2 для каждого подтеста преобразуются в показатель PDMS-2, такой как стандартный локомоторный показатель PDMS-2 в диапазоне от 0 до 13, в котором диапазон здоровых пациентов составляет от около 7 до около 13.

Термины «sALP», «растворимая щелочная фосфатаза» и «внеклеточный домен щелочной фосфатазы» используются взаимозаменяемо и относятся к растворимой немембранно-связанной щелочной фосфатазе или к домену, биологически активному фрагменту или его биологически активному варианту. sALP, включая, например, щелочную фосфатазу без С-концевого гликолипидного якорного домена (сигнальную последовательность GPI, например полипептиды, включающие или состоящие из аминокислотных остатков 18-502 человеческого TNALP (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 или 6)). В частности, TNALP может включать, например, полипептид, включающий или состоящий из аминокислотных остатков 1-485 SEQ ID NO: 1, такой как асфотаза альфа, или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95%-ю идентичность последовательности с аминокислотными остатками 1-485 SEQ ID NO: 1. sALP дополнительно включают, например, ортологи млекопитающих человеческого TNALP, такие как резус TNALP (SEQ ID NO: 7), крысиный TNALP (SEQ ID NO: 8), собачий TNALP (SEQ ID NO: 9), свиной TNALP (SEQ ID NO: 10), мышиный TNALP (SEQ ID NO: 11), бычий TNALP (SEQ ID NO: 12-14) или кошачий TNALP (SEQ ID NO: 15). sALP также включают растворимые, не связанные с мембраной формы человеческого PALP (например, полипептиды, включающие или состоящие из аминокислотных остатков 18-502 SEQ ID NO: 16 или 17), GCALP (например, полипептиды, включающие или состоящие из аминокислотных остатков 18-502 SEQ ID NO: 18) и IALP (например, полипептиды, включающие или состоящие из аминокислотных остатков 18-502 SEQ ID NO: 19), и дополнительные варианты и аналоги, которые сохраняют активность щелочной фосфатазы, например способность гидролизировать PPi. В sALP, в частности, не хватает N-концевого сигнального пептида (например, aa 1-17 SEQ ID NO: 2-6, 8, 11-13 или 15 или aa 1-25 из SEQ ID NO: 7).

Под полипептидом «sALP» подразумевается полипептид, имеющий структуру A-sALP-B, где sALP является таким, как определено в данном документе, и каждый из A и B отсутствует или представляет собой аминокислотную последовательность из по меньшей мере одной аминокислоты. Приводимый в качестве примера полипептид sALP имеет аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из аминокислот 1-485 SEQ ID NO: 1. Другие полипептиды sALP, в качестве примера, включают любые слитые полипептиды sALP, описанные в данном документе (например, слитый полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).

Под «сигнальным пептидом» подразумевается короткий пептид (длиной 5-30 аминокислот) на N-конце полипептида, который нацеливает полипептид в направлении секреторного пути (например, внеклеточному пространству). Сигнальный пептид обычно расщепляется во время секреции полипептида. Сигнальная последовательность может направлять полипептид во внутриклеточный компартмент или органеллу, например, аппарат Гольджи. Сигнальная последовательность может быть идентифицирована по гомологии или биологической активности пептида с известной функцией нацеливания полипептида на конкретный участок клетки. Специалист в данной области техники может идентифицировать сигнальный пептид с помощью легкодоступного программного обеспечения (например, пакета программного обеспечения для анализа последовательности из Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, или программ PILEUP/PRETTYBOX). Сигнальный пептид может быть одним из таких, который является, например, по существу идентичным аминокислотным остаткам 1-17 SEQ ID NO: 2-6 или аминокислотные остатки 1-25 SEQ ID NO: 7.

В контексте данного документа, когда полипептид или последовательность нуклеиновой кислоты упоминается как имеющие «по меньшей мере X% идентичности последовательности» к эталонной последовательности, где «X» представляет собой реальное число, подразумевается, что по меньшей мере X процентов аминокислотных остатков или нуклеотидов в полипептиде или нуклеиновой кислоте идентичны остаткам нуклеотидов в эталонной последовательности, когда последовательности оптимально выровнены. Оптимальное выравнивание последовательностей может быть определено различными способами, которые входят в компетенцию в данной области техники, например, алгоритмом выравнивания Смита-Ватермана (Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195-7, 1981) и BLAST (средство поиска основного локального выравнивания; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990). Эти и другие алгоритмы выравнивания доступны с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как «Best Fit» (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489, 1981), который включен в GeneMatcher Plus (Schwarz and Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, M.O., Ed pp 353-358, 1979), BLAST, BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, Megalign (DNASTAR), или другое программное обеспечение/ аппаратное обеспечение для выравнивания. Кроме того, специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения оптимального выравнивания по длине сравниваемых последовательностей.

Термины «пациент» и «субъект» используются взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь ими, человеку или нечеловекоподобному млекопитающему, такому как жвачное животное, лошадь, собака, овца или кошка.

Под «терапевтически эффективным количеством» понимается, описанное в данном документе количество полипептида или нуклеиновой кислоты, которое достаточно для существенного улучшения, лечения, предотвращения, задержки, подавления или остановки по крайней мере одного симптома ГФ. Терапевтически эффективное количество композиции, описанное в данном документе, может зависеть от тяжести расстройства, подвергаемого лечению, и состояния, веса и общего состояния пациента и может быть определено специалистом в данной области с учетом подобных факторов. Терапевтически эффективное количество композиции, описанное в данном документе, можно вводить пациенту в разовой дозе или в нескольких дозах, вводимых в течение определенного периода времени.

Под «лечением», «воздействием» или «обработкой» подразумевается медицинское лечение пациента с намерением вылечить, улучшить, стабилизировать, уменьшить вероятность или предотвратить болезнь с мышечной слабостью (например, у пациента с ГФ) и/или лечение пациента, проявляющего или, вероятно, имеющего слабость мышц (например, пациента с ГФ), например, путем введения фармацевтической композиции.

Этот термин включает активное лечение, такое как лечение, направленное конкретно на улучшение или связанное с излечением заболевания, патологического состояния, расстройства или нарушения, а также включает в каузальное лечение, то есть лечение, направленное на устранение причины ассоциированного заболевания, патологического состояния, расстройства или нарушения. Кроме того, этот термин включает паллиативное лечение, то есть лечение, предназначенное для облегчения или улучшения по меньшей мере одного симптома, а не лечения болезни, патологического состояния, расстройства или нарушения; симптоматическое лечение, то есть лечение, направленное на конституционные симптомы ассоциированного заболевания, патологического состояния, расстройства или нарушения; профилактическое лечение, то есть лечение, направленное на минимизацию или частичное или полное ингибирование развития ассоциированного заболевания, патологического состояния, расстройства или нарушения, например у пациента, который еще не заболел, или в остальных случаях подвержен риску конкретного заболевания, патологического состояния, расстройства или нарушения; и поддерживающее лечение, то есть лечение, используемое для дополнения другой конкретной терапии, направленной на улучшение ассоциированного заболевания, патологического состояния, расстройства или нарушения.

Используемый в данном документе термин «способность ходить» относится к способности пациента (например, пациента, страдающего заболеванием с мышечной слабостью, описанного в данном документе) подниматься и вставать на каждую ногу по очереди. Способность сходить может оцениваться с помощью тестов, в частности, шестиминутного теста с ходьбой (6MWT). См. American Thoracic Society statement: guidelines for the six-minute walk test (American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 166(1):111-7, 2002), включенную в виде ссылки в полном объеме.

Другие характеристики и преимущества данного описания будут очевидны из следующего подробного описания графических материалов и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий процент типа миозинового волокна во всех мышечных волокнах камбаловидной мышцы мышей дикого типа (ДТ) или мышей Akp2^-/-.

Фиг. 2A-2D представляют собой графики распределения размера волокон камбаловидных мышц, иссеченных из мышей дикого типа (ДТ) или мышей Akp2^-/-. Проценты волокон разных минимальных размеров (мкм²) показаны для всех волокон (фиг. 2А), волокон типа I (фиг. 2В), волокон типа IIa (фиг. 2С) или волокон типа IIb (фиг. 2D).

Фиг.3A-3D представляют собой графики сократительных свойств камбаловидных мышц у мышей дикого типа (ДТ) или мышей Akp2^-/-. Мышечная масса (фиг. 3А), сила (фиг. 3В), частота силы (фиг. 3С) и характеристики усталости (фиг. 3D) сравнивались как у мышей самцов, так и у самок.

Фиг.4A-4D представляют собой графики сократительных свойств мышц длинных разгибателей пальцев (ДРП) у мышей дикого типа (ДТ) или мышей Akp2^-/-. Мышечная масса (фиг. 4А), сила (фиг. 4В), частота силы (фиг. 4С) и характеристики усталости (фиг. 4D) сравнивались как у мышей самцов, так и у самок. Для усталости и частоты силы: n=3 на группу. Для мощности и удельной силы: n=6 на группу.

Фиг.5A-5B представляют собой графики сократительных свойств камбаловидных мышц (фиг. 5A) и длинных разгибателей пальцев (ДРП) (фиг. 5B) мышей дикого типа (ДТ) или мышей Akp2^-/- по отношению к концентрации PPi.

Фиг. 6 представляет собой график силы захвата передних конечностей или задних конечностей мышей дикого типа (ДТ), мышей Akp2^-/-, получающих непрерывное лечение асфотазой альфа (Tx-Tx) после 35-го дня или мышей Akp2^-/- с прерванным лечением асфотазой альфа (Tx-V) после 35-го дня.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сообщается, что мышечная слабость является одним из нескольких симптомов ГФ (Seshia et al. 1990 Archives of Disease in Childhood 65:130-131). В дополнении к ГФ, другие болезни или расстройства могут также приводить к мышечной слабости. Например, дефицит магния приводит к ослаблению мышечной массы у пациентов с заболеванием отложение пирофосфата кальция (CPPD или CPDD) (Hahn et al. 2012 BMC Gastroenterology 12-19). Некоторые заболевания или расстройства с мышечной слабостью, такие как ГФ, CPPD, наследственная гипофосфатемия (такая как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленная гипофосфатемия (XLH) и т.д.), являются характерным признаком повышенной концентрации пирофосфата (PPi) у субъекта, страдающего заболеваниями или расстройствами. При ГФ, повышенная концентрация PPi обусловлена мутацией(ями) с потерей функции в гене ALPL, который кодирует тканевой неспецифический изофермент щелочной фосфатазы (TNALP, а также печеночный/костный/почечный тип ALP), который является ферментом для субстратов, таких как PPi, фосфоэтаноламин (PEA) и пиридоксаль 5'-фосфат (PLP). При CPPD, дефицит Mg, который действует как кофактор для различных фосфатаз, приводит к увеличению количества PPi, который является необходимым предшественником образования кристаллов CPPD. Отложение пирофосфата кальция может в дальнейшем приводить к хроническому воспалительному артриту, гипофосфатазии, гипомагнеземии и гиперпаратиреозу с хондрокальцинозом и острыми приступами «псевдоподагры».

В данном описании раскрыты способы лечения заболевания с мышечной слабостью у субъекта, характеризующегося наличием одного или нескольких из следующего: повышенной концентрации PPi, пониженной концентрации щелочной фосфатазы, среднего показателя силы BOT-2, например, меньше чем 10, среднего значения скорости бега BOT-2 и показателя ловкости, например, менее чем 5, среднего показателя индекса CHAQ, например, больше, чем около 0,8, или среднего показателя PODCI, например, менее чем около 40, среднего 6MWT, например, менее чем около 80% от прогнозируемого значения 6MWT (например, в котором прогнозируемое значение 6MWT является значением 6MWT сопоставимым по возрасту и/или по гендерному признаку нормального субъекта), степени мышечной силы, например, менее чем 5, и/или среднего значения HHD (например, средней величины HHD мышцы или силы захвата), например, менее чем около 50% от прогнозируемого значения HHD (например, в котором прогнозируемое значение HHD является значением HHD сопоставимым по возрасту и/или гендерному признаку нормального субъекта). В частности, субъект был идентифицирован как имеющий или склонный к мышечной слабости.

Например, описанное представляет собой способы идентификации субъектов (например, людей), имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью для лечения рекомбинантным полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы (например, TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), характеризующихся как имеющих повышенную концентрацию PPi, пониженную концентрацию ALP, средний показатель силы BOT-2, например, менее чем 10, среднее значение скорости бега BOT-2 и показатель ловкости, например, менее чем 5, средний показатель индекса CHAQ, например, более чем около 0,8, средний показатель PODCI, например, менее чем около 40, средний 6MWT, например, менее чем около 80% от прогнозируемого значения 6MWT, степень мышечной силы, например, менее чем 5, и/или среднее значение HHD (например, среднее значение HHD или значение силы захвата), например, менее чем около 80% от прогнозируемого значения HHD». Например, повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) у младенца или ребенка (например, субъекта в возрасте менее чем примерно 12 лет) может быть около 5,71 мкМ или более, повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) от подростка (например, субъекта примерно от 13 до примерно 18 лет) может быть около 4,78 мкМ или более; и повышенная концентрация PPi в образце (например, образце плазмы) от взрослого человека (например, субъекта в возрасте более чем примерно 18 лет), может быть около 5,82 мкМ или более. В частности, сниженная концентрация ALPв образце (например, образце плазмы) от субъекта может быть, например, около 90 ед/л или менее для субъекта в возрасте от 0 до 14 дней; около 134 ед/л или менее для субъекта в возрасте 15 дней до менее чем 1 года; около 156 ед/л или менее для субъекта в возрасте примерно от 1 года до менее чем 10 лет; около 141 ед/л или менее для субъекта в возрасте примерно от 10 лет до менее чем 13 лет; около 62 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем 15-летнего возраста; около 127 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем 15 лет; около 54 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно 15 лет до менее чем до 17 лет; около 89 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 15 лет до менее чем 17 лет; около 48 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно 17 лет и старше; или около 59 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно 17 лет и старше.

В данном описании предлагается способ лечения или улучшения состояния при мышечной слабости у субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного рекомбинантного полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы. В частности, субъект был идентифицирован как имеющий или склонный к мышечной слабости.

В данном описании также предлагается способ идентификации субпопуляции субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью, при этом субъекты в указанной субпопуляции имеют повышенные концентрации PPi, пониженные концентрации щелочной фосфатазы и/или снижение силы захвата или мышечной силы (например, оценивается с использованием BOT-2, 6MWT, CHAQ, PODCI, степени мышечной силы и/или HHD).

Способы для: 1) идентификации субпопуляции субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью, при этом субъекты в указанной субпопуляции имеют повышенные концентрации PPi, пониженные концентрации ALP и/или снижение захвата или мышечной силы; и 2) затем лечения или улучшения, по меньшей мере, одного симптома заболевания с мышечной слабостью у субъекта в указанной субпопуляции также описываются.

Также описаны способы идентификации субпопуляции субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью, характеризующейся повышенными концентрациями PPi, пониженными концентрациями ALP и/или уменьшением захвата или мышечной силы.

Субпопуляция субъектов может быть идентифицирована независимо от того, были ли у них ранее диагностированы гипофосфатазия (ГФ), болезнь отложения пирофосфата кальция (CPPD) или наследственная гипофосфатемия (такая как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленная гипофосфатемия (XLH) и т.д.). Субпопуляцию идентифицируют, например, на основании повышенной концентрации PPi у таких субъектов. Причины повышенной концентрации PPi включают, например, дефекты в сигнальных молекулах или мутации в генах, которые кодируют такие сигнальные молекулы, которые регулируют продукцию, деградацию или другие пути, влияющие на стабильность PPi. Например, дефекты или мутации для сигнальных молекул могут приводить к сверхэкспрессии PPi или снижению деградации или гидролиза PPi. Пациенты с ГФ имеют дефектную или отсутствующую тканенеспецифическую щелочную фосфатазу, которая может гидролизовать PPi. Таким образом, подобно ГФ, при других заболеваниях, вызванных дефектами щелочных фосфатаз, концентрация PPi может быть повышена. Дефекты в сигнальных молекулах также включают дефекты в кофакторах или других молекулах, способствующих функционированию сигнальных молекул. Например, при CPPD дефицит Mg, который действует как кофактор для различных фосфатаз, приводит к повышенным уровням PPi.

Описаннное в данном документе представляет собой способы идентификации субпопуляции субъектов, которые либо проявляют симптом, связанный с мышечной слабостью, либо подвергающийся риску развития таких симптомов, связанных с мышечной слабостью. Идентифицированная популяция может включать субъектов, которые ранее были идентифицированы как имеющие такую мышечную слабость, или которые клинически здоровы без ранее поставленного диагноза. Болезни с мышечной слабостью в данном описании включают, например, ГФ или заболевания, связанные с ГФ, CPPD или заболевания, связанные с CPPD, наследственную гипофосфатемию (такую как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленную гипофосфатемию (XLH) и т.д.) или любые другие заболевания с мышечной слабостью с повышенным PPi. Способы идентификации субъекта в субпопуляции включают, например, обнаружение повышенной концентрации неорганического пирофосфата (PPi) у такого субъекта.

Целевые заболевания с мышечной слабостью

В данном документе предлагаются способы для лечения или улучшения по меньшей мере одного симптома субъекта, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью. Мышечная слабость, миопатия или миастения, описанные в данном документе, могут включать любое заболевание или расстройство, которое вызывает, является результатом или связано по меньшей мере с одним симптомом мышечной слабости. Термин «мышечная слабость», «миопатия», «миастения» или другие подобные выражения в данном описании относится к состоянию, связанному с ухудшением состояния мышечной функции, такому как отсутствие или недостаток мышечной силы, по сравнению с другими субъектами, не имеющими такого состояния или к одному и тому же субъекту в момент времени до подобного состояния. Мышечную слабость можно разделить на состояния которые имеют либо истинную либо кажущуюся мышечную слабость. Истинная мышечная слабость может включать состояние, при котором сила, оказываемая мышцами, меньше, чем можно было бы ожидать. Например, истинная мышечная слабость включает множество заболеваний скелетных мышц, включая мышечную дистрофию и воспалительную миопатию. В качестве примера, болезнь или расстройство включает мионеврально-связанные расстройства, такие как тяжелая миастения. Мышечная слабость также может быть вызвана низкими уровнями калия и других электролитов в мышечных клетках, где сила, оказываемая мышцами, меньше, чем можно было бы ожидать. Кажущаяся мышечная слабость (или не мионевральная мышечная слабость) описывает состояние, при котором субъект прилагает больше усилий, чем обычно (т.е. по сравнению с другими субъектами, не имеющими такого состояния или с одним и тем же субъектом в момент времени до возникновения такого состояния), требует проявления определенной силы, но фактическая мышечная сила является нормальной, например, синдром хронической усталости.

В некоторых состояниях, таких как тяжелая миастения, мышечная сила является нормальной при отдыхе, но истинная слабость возникает после того, как мышца была подвергнута нагрузке. Это справедливо и для некоторых случаев синдрома хронической усталости, когда была измерена объективная мышечная слабость после нагрузки с задержкой времени восстановления и является признаком некоторых опубликованных заболеваний. Эти заболевания или расстройства также включены в «мышечную слабость» данного описания.

Мышечная слабость также может быть классифицирована как «проксимальная» или «дистальная», основанная на местонахождении мышц, которые она затрагивает. Проксимальная мышечная слабость влияет на мышцы, наиболее близкие к средней линии тела, тогда как дистальная мышечная слабость влияет на мышцы конечностей. Проксимальная мышечная слабость проявляется в синдроме Кушинга и гипертиреозе.

На практике существуют другие категории мышечная слабость. Например, мионевральная усталость может быть классифицирована как «центральная» или «периферическая» в зависимости от ее причины. Центральная усталость мышц проявляется как общее чувство лишения энергии, в то время как периферическая мышечная усталость проявляется как локальная, мышечно-специфическая неспособность выполнять работу.

Тяжесть мышечной слабости можно классифицировать как разные «степени», в качестве примера, основываясь на следующих критериях:

Степень 0: Никакого сокращения или движения мышц.

Степень 1: Признак сокращения, но никакого движения в суставе.

Степень 2: Движение в суставе с силой тяжести элиминировано.

Степень 3: Движение против силы тяжести, но не против дополнительного сопротивления.

Степень 4: Движение против внешнего сопротивления с меньшей силой, чем обычно.

Степень 5: Нормальная сила.

Гипофосфатазия (ГФ) и мышечная слабость

Гипофосфатазия (ГФ) представляет собой редкое наследственное метаболическое расстройство, возникающее в результате мутации(ий) с потерей функции в гене тканенеспецифической щелочной фосфатазы (TNSALP). Биохимический признак представляет собой субнормальную активность ALP в сыворотке (гипофосфатаземия), которая приводит к повышению уровня в крови и/или моче трех субстратов фосфосоединений: неорганического пирофосфата (PPi), фосфоэтаноламина (PEA) и пиридоксаль 5'-фосфата (PLP). Дефицит TNSALP может вызвать ряд осложнений, включая преждевременную потерю молочных зубов, рахит, плохой рост, мышечная слабость, нарушение функционального статуса и боль. Мышечная слабость ц или миопатия, связанные с ГФ были обнаружены десятилетия назад. Например, Seshia et al. (1990) сообщили, что у трех детей с ГФ также были мышечные боли, скованность и симптомы проксимальной мышечной слабости нижних конечностей, которые встречались на ранней стадии расстройства (остальные представлены в двух из них). Примечательно, что Seshia et al. (1990) обнаружили, что эти симптомы «не могут быть объяснены скелетными нарушениями», а скорее «напоминают миопатию остеомаляции». Другие признаки и симптомы ГФ могут включать: длительную боль в мышцах или суставах, артрит (у взрослых и детей), псевдоподагру, вызванную отложением кальция в суставах, невозможность ходить без вспомогательного устройства, такого как костыли, ходунки, или инвалидная коляска и т.д. Недавно сообщалось, что асфотаза альфа, рекомбинантный костно-нацеленный TNASLP человека (то есть sALP-Fc-D₁₀) уменьшает концентрацию неорганического пирофосфата (PPi) и улучшает скелетную минерализацию, рост и функциональный статус пациентов с ГФ. Дети 5-12 лет с ГФ, получавшие асфотазу альфа более трех лет, показали улучшение мышечной силы, измеренное с помощью ручной динамометрии (HHD) и отдельных подтестов теста двигательных умений Бруйнинкса-Озерецкого 2-го выпуска (BOT-2), включая силу и показатели шкал скорости бега/гибкости. В результате они имели значительные преимущества в функциональном статусе своих мышц, который влияет на способность выполнять действия в повседневной жизни.

Асфотазу альфа можно вводить для лечения, например, перинатальной ГФ, инфантильной ГФ, детской ГФ и одонто-ГФ. Например, пациентов, имеющих детскую ГФ (например, дети от примерно 5 до примерно возраста 12 лет, имеющие ГФ) или инфантильную ГФ (например, груднички примерно 3 лет или менее 3 лет) можно лечить с помощью sALP (такого как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) с расчетом на период не менее одного года (например, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет или более чем десять лет (например, всей жизни пациента)).

Поскольку лечение асфотазой альфа значительно улучшает минерализацию кости у пациентов, было неясно, будет ли эффект на мышечную силу пациентов только как результат восстановления костной структуры и последующего восстановления прикрепления/роста скелетных мышц, или прямой терапевтический эффект непосредственно на мышцы пациента. Как описано в данном документе, мы обнаружили, что асфотаза альфа оказывает терапевтический эффект на мышцы пациента (например, пациента, имеющего болезнь с мышечной слабостью, такую как мышечную слабость у пациента, имеющего ГФ).

Болезнь отложения пирофосфата кальция (CPPD, или CPDD) и мышечную слабость

Болезнь отложения пирофосфата кальция (CPPD или CPDD) или болезнь отложения кристаллов пирофосфата дигидрата кальция представляет собойметаболическую артропатию, вызванную отложением кристаллов дигидрата пирофосфата кальция в суставах и вокруг них, особенно в суставном хряще и волокнистой хрящевой ткани. Несмотря на то, что CPPD часто протекает бессимптомно, и изменения обнаруживаются только радиографически (например, хондрокальциноз), могут возникать различные клинические проявления, включая острый (псевдоподагру) и хронический артрит. Отложение кристаллов провоцируют воспаление в суставе, что может привести к разрушению суставного хряща. Болезнь может приобретать несколько различных форм, связанных с артритом: остеоартрит, хронический ревматоидный артрит, (РА)-подобный воспалительный артрит, или острое болезненное воспалительное состояние, называемое псевдоподагрой. Название псевдоподагра происходит от того факта, что она напоминает другое острое болезненное состояние, называемое подагрой. Основное различие заключается в типе кристаллов, участвующих в воспалении и повреждении. В CPPD может быть вовлечен практически любой сустав, хотя чаще всего затрагиваются колени, запястья и бедра. Это состояние является наиболее распространенной причиной вторичного метаболического остеоартрита. Пациенты с CPPD могут испытывать существенную болезненность из-за боли при остром приступе псевдоподагры или симптомах хронической артропатии. Лечение симптоматического CPPD важно для предотвращения дальнейшего повреждения концевых органов, но оно не может обратить болезнь суставов.

Точный механизм развития CPPD остается неясным. От старения, генетических факторов или и того, и другого, у пациентов наблюдается расщепление аденозинтрифосфата, что приводит к увеличению концентрации неорганического пирофосфата в суставах. Изменения в матриксе хряща могут играть важную роль в стимулировании отложения кристаллов дигидрата пирофосфата кальция. Черезмерная активность ферментов, которые разрушают трифосфаты, такие как нуклеозидтрифосфат пирофосфогидролаза, наблюдается в хряще пациентов с CPPD. Поэтому неорганический пирофосфат может связывать кальций, что приводит к отложению в хряще и синовиальной оболочке. (см. Beutler et al., 1993 Arthritis Rheum. 36(5):704-715). Наиболее часто подвергается влиянию гиалиновый хрящ, но также может быть вовлечен волокнистый хрящ, такой как мениск коленного сустава. (Pritzker et al., 1988 J Rheumatol. 15(5):828-835).

Другие болезни и мышечная слабость

Аналогично ГФ и CPPD (или CPDD), другие заболевания или расстройства могут включать по крайней мере один признак мышечной слабости. Среди них некоторые типы заболеваний с мышечной слабостью имеют характерную повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi). Эти заболевания с мышечной слабостью с повышенной концентрацией PPi, в данном описании, также являются целями для лечения асфотазой альфа.

Например, наследственная гипофосфатемия (такая как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленная гипофосфатемия (XLH) и т.д.), как правило, имеет фенотип мышечной слабости. Гипофосфатемия или гипофосфатемический рахит представляет собой форму рахита, который характеризуется низким уровнем фосфата в сыворотке и устойчивостью к лечению ультрафиолетовым излучением или всасыванию витамина D. X-сцепленная гипофосфатемия (XLH) является доминирующим расстройством и составляет более 80% всей наследственной гипофосфатемии. XLH считается системным расстройством, из-за мутации фосфат-регулирующего гена, гомологичного эндопептидазам на Х-хромосоме (PHEX). Пациенты с XLH демонстрируют нормальную или низкую концентрацию 1,25-дигидроксивитамина D3 в сыворотке крови, что указывает на неадекватное образование этого метаболита витамина D. Оставшиеся 20% пациентов с наследственной гипофосфатемией имеют аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит из-за аутосомно-рецессивного гипофосфатемического рахита с приобретением функции и наследственного гипофосфатемического рахита с гиперкальциурией.

Способы лечения

В данном документе предлагаются способы лечения или улучшения по меньшей мере одного симптома субъекта, ребенка, подростка или взрослого человека, который имеет или склонен к заболеванию с мышечной слабостью. Такое лечение может включать введение щелочной фосфатазы или полипептида, обладающего активностью щелочной фосфатазы, для уменьшения повышенной концентрации PPi у такого субъекта. Например, растворимую щелочную фосфатазу (sALP, такую как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазу альфа), можно вводить среди разных возрастных групп детей, подростков или взрослых пациентов.

У субъектов может быть диагностировано заболевание с мышечной слабостю (например, HPP, CPPD, наследственная гипофосфатемия, описанные в данном документе и т.д.) перед введением щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Кроме того, субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может быть наивным субъектом, который ранее не получал лечение с помощью sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа).

Способ включает введение щелочной фосфатазы или полипептида, обладающего активностью щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) субъекту, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью в течение одной или нескольких доз в течение определенного периода времени. В частности, sALP, такой как асфотаза альфа, может вводиться субъекту, который ранее был определен, как имеющий повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi) или имеющий по меньшей мере один предопределенный биомаркер/показатель мышечной слабостью, такой как средний показатель силы BOT-2 менее чем 10, средний показатель скорости бега и показатель ловкости BOT-2 менее чем 5, средний показатель индекса CHAQ больше, чем около 0,8 и/или средний показатель PODCI менее чем около 40, среднее значение 6MWT менее около 80% от прогнозируемого значения 6MWT, степень мышечной силы менее 5, и/или среднее значения HHD (например, среднее значение HHD мышцы или значение захвата), например, менее около 80% от прогнозируемого значения HHD. Например, sALP можно вводить субъекту, который ранее был определен, как имеющий концентрацию PPi в образце (например, образце плазмы) более чем около 5,71 мкМ для младенца или ребенка (например, субъекта, в возрасте менее чем примерно 12 лет); более чем около 4,78 мкМ для подростка (например, субъекта от примерно 13 до примерно 18 лет); или более чем около 5,82 мкМ для взрослого (например, субъекта более чем примерно 18 лет). В других вариантах реализации, болезнь с мышечной слабостью, описанная в данном документе, вызвана повышенной концентрацией по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы (например, PPi, PLP, PEA и т.д.). В альтернативном варианте, щелочная фосфатаза или полипептид, обладающий активностью щелочной фосфатазы (например, asALP, такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа ) можно вводить субъекту, имеющему или склонному к заболеванию с мышечной слабостью до определения таких показателей (например, показателя силы BOT-2, показателя скорость бега BOT-2 и показателя ловкости, показателя индекса CHAQ, показателя шкалы BSID-III, стандартной оценки PDMS-2, показателя степени мышечной силы, значение 6MWT и/или значения HHD), чтобы можно было, например, увеличить активность ДРП, уменьшить боль и/или улучшить развитие моторики.

Кроме того, каждый из описанных показателей (например, показатель силы BOT-2, показатель скорость бега BOT-2 и показатель ловкости, показатель индекса CHAQ, показатель шкалы BSID-III, стандартная оценка PDMS-2, 6MWT, 12- POMA-G, модифицированная оценка мобильности, ориентированная на производительность (mPOMA-G, такая как показанная у Phillips et al., 2015 Bone Abstracts 4: P136) или значение HHD) субъекта, имеющего или склонного к мышечной слабости, описанной в данном документе, может использоваться отдельно или в любой комбинации для оценки эффективности лечения с использованием sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), в котором улучшения относительно определенного тестового показателя демонстрируют, что sALP является эффективным для лечения такой мышечной слабости.

Например, когда введение щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например, полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) субъекту, имеющему или склонному к заболеванию с мышечной слабостью, приводит к среднему увеличению показателя силы BOT-2 до около 10 или более чем около 10, в котором субъект ранее имел средний показатель силы BOT-2 менее чем около 10, тогда щелочная фосфатаза или полипептид, обладающий активностью щелочной фосфатазы является эффективным при лечении, например, физических нарушениях, связанных с болезнью с мышечной слабостью. В альтернативном варианте, когда введение sALP не приводит к среднему увеличению показателя силы BOT-2 до около 10 или более чем около 10, дозировка и/или частота введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы может быть изменена с целью определения эффективного количества щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы для субъекта. Например, дозировка sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) может быть увеличена, например, от около 3 мг/кг/неделю до около 6 мг/кг/неделю или от около 6 мг/кг/неделю до около 9 мг/кг/неделю.

Кроме того, когда введение щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например, полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазы альфа) субъекту, имеющему или склонному к заболеванию с мышечной слабостью, приводит к улучшению категоризации степени мышечной силы субъекта одной или нескольких (например, улучшение степени мышечной силы 1, 2, 3, 4 или 5 от предшествующего, более низкого уровня степени мышечной силы), в которой субъект ранее имел среднюю степень мышечной силы менее чем около 5, тогда щелочная фосфатаза или полипептид, обладающий активностью щелочной фосфатазы, эффективен при лечении, например, физических нарушениях, связанных с болезнью с мышечной слабостью. В альтернативном варианте, когда введение sALP не приводит к улучшению категоризации степени мышечной силы субъекта одной или нескольких из предшествующего, более низкой степени мышечной силы, доза и/или частота введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, может быть изменена (например, увеличена), чтобы определить эффективное количество щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы для субъекта. Например, дозировка sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) может быть увеличена, например, от около 3 мг/кг/неделю до около 6 мг/кг/неделю или от около 6 мг/кг/неделю до около 9 мг/кг/неделю.

Биомаркеры/оцениваемые показатели для диагностики и/или лечения болезни с мышечной слабостью

В предпочтительных вариантах реализации, болезнь с мышечной слабостью (такую как ГФ, включая, например, перинатальную ГФ, инфантильную ГФ, детскую ГФ и одонтогипофосфатазию, CPPD и наследственную гипофосфатемию, как описано в данном документе) лечат с помощью щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такая как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Способы, описанные в данном документе, также полезны для диагностики субъекта, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью, определения субъекта в качестве члена в конкретной субпопуляции субъектов, имеющих или склонных к заболеванию с мышечной слабостью, или тестирования эффективности лечения мышечной слабости. Например, субъект может быть диагностирован как имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью, если такой субъект обнаруживает определенные характерные биомаркеры. Субъекта можно лечить щелочной фосфатазой или полипептидом, обладающим активностью щелочной фосфатазы (например, sALP, такой как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), тогда как эффективность лечения или эффекты могут быть проанализированы с использованием определенных характерных биомаркеров или оцениваемых показателей. Такие биомаркеры могут включать, например, повышенную концентрацию неорганического пирофосфата (PPi) и/или пониженную щелочную фосфатазу (ALP) в сыворотке, костной или мышечной тканях или моче субъекта. В качестве примера, полезные показатели для способов лечения мышечной слабостью, описанных в данном документе, могут включать: (1) тест двигательных умений Бруйнинкса-Озерецкого 2-го выпуска (BOT-2), (2) опросник оценки здоровья детей (CHAQ), (3) инструмент сбора педиатрических данных (PODCI), (4) шкалы развития младенцев и детей Бейли, 3-е издание (BSID-III), (5) шкалы оценки моторного развития Пибоди, 2-е издание (PDMS-2), (6) тест с шестиминутной ходьбой (6MWT), (7) степень мышечной силы, и (8) ручную динамометрию (HHD), которые подробно описываются ниже.

Концентрации неорганического пирофосфата (PPi) и щелочной фосфатазы (ALP) плазмы

Субъекты, имеющие или склонные к заболеванию с мышечной слабостью, могут быть идентифицированы для лечения щелочной фосфатазой или полипептидом, обладающим активностью щелочной фосфатазы (например, sALP, такой как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) путем определения концентрации неорганического пирофосфата (PPi) и/или щелочной фосфатазы (ALP) в образце, таком как образец плазмы или мочи, от пациента. Любой способ, известный специалистам в данной области техники, может быть использован для количественной оценки концентраций PPi и/или ALP в образце плазмы или, в альтернативном варианте, в образце мочи, как подробно описано у Whyte et al., 1995 (J. Clin. Invest. 95 (4): 1440-1445), включенного в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Методы количественной оценки концентраций PPi в образце плазмы или мочи также описаны у Cheung et al., 1977 (Anal. Biochem. 83: 61-63), Cook et al., 1978 (Anal. Biochem. 91: 557-565), и Johnson et al., 1968 (Anal. Biochem. 26: 137-145), каждый из которых включен посредством ссылки в полном объеме.

В частности, щелочная фосфатаза или полипептид, обладающий активностью щелочной фосфатазы (например, asALP, такая как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут вводиться субъекту (например, человеку), имеющему или склонному к заболеванию с мышечной слабостью, ранее определенному, как имеющему концентрацию PPi в плазме до около 6 мкМ (например, около 4,5 мкМ, около 5 мкМ или около 5,5 мкМ или концентрацию PPi плазмы в диапазоне от около 4,5 мкМ до около 6 мкМ). Например, щелочная фосфатаза или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, вводят, например, младенцу или ребенку (например, субъекту в возрасте менее чем примерно 12 лет), имеющему концентрацию PPi в плазме около 5,71 мкМ или более; подростку (например, субъекту примерно от 13 до примерно 18 лет), имеющему концентрацию PPi в плазме около 4,78 мкМ или более; или взрослому (например, субъекту более чем примерно 18 лет), имеющему концентрацию PPi в плазме около 5,82 мкМ или более. Дополнительно, щелочная фосфатаза или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы могут быть введены субъекту (например человеку), имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, ранее определенного, как имеющего концентрацию концентрация ALP в плазме, например, около 90 ед/л или менее для субъекта в возрасте от 0 до 14 дней; около 134 ед/л или менее для субъекта в возрасте 15 дней до менее чем 1 года; около 156 ед/л или менее для субъекта в возрасте примерно от 1 года до менее чем 10 лет; около 141 ед/л или менее для субъекта в возрасте примерно от 10 лет до менее чем примерно 13 лет; около 62 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем примерно 15-летнего возраста; около 127 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 13 лет до менее чем примерно 15 лет; около 54 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно 15 лет до менее чем примерно 17 лет; около 89 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно от 15 лет до менее чем примерно 17 лет; около 48 ед/л или менее для женщины-субъекта в возрасте примерно 17 лет и старше; или около 59 ед/л или менее для мужчины-субъекта в возрасте примерно 17 лет или старше.

Концентрацию PPi в плазме и/или концентрацию ALP в плазме субъекта (например, человека), имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, можно сравнить с концентрацией PPi в плазме и/или ALP плазмы нормального субъекта для определения терапевтического эффекта у субъекта, которому вводили щелочную фосфатазу или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такая как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). В частности, щелочную фосфатазу или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, можно вводить в течение периода лечения, как минимум, одного года (например, по меньшей мере два года, по меньшей мере, три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере, пять лет, при не менее шести лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере, девять лет, по меньшей мере десять лет или более десяти лет, например, всю жизнь пациента). В альтернативном варианте, способы могут включать определение концентрации PPi в плазме и/или концентрации ALP в плазме перед введением щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, для оценки у субъекта эффекта лечения щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы.

Эти способы приводят к уменьшению PPi и/или увеличению концентрации ALP в образце (например, образце плазмы) от субъекта (например, человека), имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью. Например, лечение щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такой как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) приводит к уменьшению концентрации PPi в образце (например, образце плазмы) от пациента около 1мкM, около 1,5 мкM, около 2 мкM, около 2,5 мкM или около 3 мкM или 25% или более (например, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или более 60%). Таким образом, субъект демонстрирует концентрацию PPi в плазме, например, от около 2 мкM до около 5 мкМ, от около 3 мкМ до около 5 мкМ, от около 2 мкM до около 4 мкM или от около 2 мкM до около 3 мкM после введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы.

Аналогично, лечение щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы, приводит к увеличению концентрации ALP в образце (например, образце плазмы) от объекта (например, человека), имеющего или подверженного заболеванию с мышечной слабостью - 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или более 60% относительно субъекта до введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы. Например, введение щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, повышает концентрацию ALP в образце (например, образце плазмы) от субъекта до, например, около 273 ел/л или более для субъекта в возрасте от 0 до 14 дней; около 518 ел/л или более для субъекта в возрасте от 15 дней до менее чем 1 года; около 369 ед/л или более в возрасте примерно от 1 года до менее чем 10 лет; около 460 ед/л или более для субъекта в возрасте от примерно 10 лет до менее чем примерно 13 лет; около 280 ед/л или более для женщины-субъекта в возрасте от примерно 13 лет до менее чем примерно 15 лет; около 517 ед/л или более для мужчины-субъекта в возрасте примерно 13 лет менее до менее чем примерно 15 лет; около 128 ед/л или более для женщины-субъекта в возрасте примерно 15 лет до менее чем примерно 17 лет; около 365 ед/л или более для мужчины-субъекта в возрасте примерно 15 лет до менее чем примерно 17 лет; около 95 ед/л или более для женщины-субъекта примерно 17 лет или старше; или около 164 ед/л или более для мужчины-субъекта примерно 17 лет или старше.

Уменьшение PPi плазмы и/или увеличение концентраций ALP у субъекта (например, человека), имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью, можно поддерживать посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такой как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Например, концентрация PPi в плазме снижается примерно на 25% и остается на ±10% от уменьшенной концентрации PPi в плазме при лечении sALP и/или концентрация ALP в плазме увеличивается примерно на 50% и остается на ±10% от увеличенной концентрации ALP плазмы во время лечения щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы.

В альтернативном варианте, когда введение щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такой как TNALP, например, полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) не приводит к среднему снижению концентраций PPi в образце плазмы от субъекта (например, человека), имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью около 25% или более, доза и/или частота введения sALP могут быть изменены в порядке определения эффективного количества sALP для субъекта. Аналогично, когда введение щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, не приводит к среднему увеличению концентраций ALP в образце плазмы у субъекта около 50% или более, доза и/или частота введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, могут быть изменены в порядке определения эффективного количества щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы активность для субъекта. Например, дозировка щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, может быть увеличена, например, от около 2,1 мг/кг/неделю или от около 3,5 мг/кг/неделю до около 6 мг/кг/неделю или около 9 мг/кг/неделю.

Тест двигательных умений Бруйнинкса-Озерецкого 2-ое издание (BOT-2)

В качестве примера, тест двигательных умений Бруйнинкса-Озерецкого 2-го издания (BOT-2) описан в Bruininks, R.H. (2005). Bruininks-Oseretsky Test of Motor Proficiency, (BOT-2), Minneapolis, MN: Pearson Assessment, включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В частности, BOT-2 можно использовать для оценки физических нарушений и ограничений мобильности у субъекта, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью (например, ГФ), для получения показателя BOT-2 для субъекта.

BOT-2 включает в себя ряд тестов для оценки физических нарушений субъекта, которые могут проводиться, например, с набором, включая тесты. BOT-2 обеспечивает суммарный балл показателей BOT-2 в следующих аспектах: сила, скорость бега и ловкость, точность мелкой моторики, координация мелкой моторики, ловкость рук, билатеральная координация, равновесие, и координация верхних конечностей. Например, субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может выполнять приседания, подпрыгивания, прыжкам в длину с места, приседания с опорой и/или отжимания, чтобы определить показатель силы BOT-2; субъект, имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью, может пройти по гимнастическому бревну и/или выполнить челночный бег, прыжки в стороны на двух ногах и/или прыжки в стороны на одной ноге, чтобы определить скорость движения BOT-2 и ловкость; субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может вырезать круг и/или соединить точки, чтобы определить показатель BOT-2 точности мелкой моторики; субъект, имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью, может скопировать звезду и/или скопировать квадрат, чтобы определить показатель BOT-2 интеграции моторики; субъект, имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью может пересчитать деньги, сортировать карточки и/или текстильную мозайку, чтобы определить показатель ловкости рук; субъект, имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью, может постукивать своей ногой и пальцем и/или выполнить прыжки ноги вместе-ноги врозь для определения показателя билатеральной координации BOT-2; субъект, имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью может идти вперед по линии и/или стоять на одной ноге на гимнастическом бревне, чтобы определить показатель баланса BOT-2; и субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может бросить мяч в цель и/или поймать брошенный мячик, чтобы определить показатель координации верхних конечностей BOT-2.

Субъект, имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью (например, ГФ), мог выполнять тесты в одном или нескольких описанных направлениях (сила, скорость движения и ловкость, точность мелкой моторики, интеграция мелкой моторики, ловкость рук, билатеральная координация, баланс, и координация верхних конечностей) для получения показателя BOT-2, указывающего на физические нарушения у субъекта. В пределах каждого теста BOT-2 (сила, скорость и ловкость, точность мелкой моторики, интеграция мелкой моторики, ловкость рук, билатеральная координация, баланс, и координация верхних конечностей), такой субъект мог выполнить один или несколько тестов для определения показателя BOT- 2 у субъекта, например, субъект мог выполнить одно или несколько приседаний, подпрыгиваний, прыжков в длину с места, приседаний с опорой, чтобы определить показатель силы BOT-2. Таким образом, только один тест (например, один тест, выбранный из группы приседаний, подпрыгиваний, прыжка в длину с места, приседания с порой и отжимания) мог выполняться для определения показателя BOT-2 (например, показателя силы BOT-2) у субъекта, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью (например, ГФ).

Каждый из показателей BOT-2 (сила, скорость передвижения и ловкость, точность мелкой моторики, интеграция мелкой моторики, ловкость рук, билатеральная координация, баланс и координация верхних конечностей) субъекта, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью (например, ГФ) можно сравнить с показателем BOT-2 субъекта без заболевания мышц (например, ГФ), чтобы, например, определить стандартное отклонение показателя BOT-2. Каждый из показателей BOT-2 (например, сила, скорость движения и ловкость, точность мелкой моторики, интеграция мелкой моторики, ловкость рук, билатеральная координация, баланс и координация верхних конечностей) субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ) можно сравнить с показателем BOT-2 других субъектов, имеющих или, возможно, склонных к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ), чтобы, например, определить средний показатель BOT-2 для субъекта.

Показатели BOT-2 (например, сила, скорость передвижения и ловкость, точность мелкой моторики, интеграция мелкой моторики, ловкость рук, билатеральная координация, баланс и показатель координации верхних конечностей) варьируются от около 0 до равных или менее чем 25, в которых показатель от около 10 до около 20 считается репрезентативным для здорового субъекта (например, субъекта без заболевания с мышечной слабостью (например, ГФ)). Субъектов со средним показателем BOT-2 (например, сила, скорость передвижения и ловкость, точность мелкой моторики, интеграция мелкой моторики, ловкость рук, билатеральная координация, баланс и показатель координации верхних конечностей) менее чем около 10 можно лечить щелочной фосфатазой или полипептидом, обладающим активностью щелочной фосфатазы, например, sALP, такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).

Например, субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью, с показателем силы BOT-2 менее 10 (например, около 0, около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10) можно лечить с помощью sALP (такой как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) в течение периода времени, вплоть до всей жизни пациента. Аналогично, субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью, с показателем скорости бега и ловкости BOT-2 менее чем 10 (например, около 0, около 1, около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9 или около 10), затем можно лечить sALP (такой как, TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющим по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) в течение периода времени, вплоть до всей жизни субъекта.

Способы могут привести к улучшению показателя BOT-2 (например, силы, скорости бега и ловкости, точности мелкой моторики, интеграции мелкой моторики, ловкости рук, билатеральной координации, баланса и/или показателя координации верхних конечностей) субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ). Например, лечение щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы, таким как sALP (например, TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, такое лечение как при помощи sALP в течение определенного периода времени, может приводить к среднему увеличению показателя силы BOT-2 от около 10 до около 20 (например, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19 или около 20). Кроме того, лечение с помощью sALP (такой как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) может привести к среднему увеличению показателя скорости бега и ловкости BOT-2 от около 5 до около 20 (например, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12, около 13, около 14, около 15, около 16, около 17, около 18, около 19 или около 20).

Увеличение показателя BOT-2 (например, силы, скорости бега и ловкости, точности мелкой моторики, интеграции мелкой моторики, ловкости рук, билатеральной координации, баланса и/или показателя координации верхних конечностей) может поддерживаться посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, в течение определенного периода времени. Аналогичным образом, снижение физических нарушений мышц после введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, может поддерживаться при введении щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы.

Показатели BOT-2 (сила, скорость бега и ловкость, точность мелкой моторики, интеграция мелкой моторики, ловкость рук, билатеральная координация, баланс и показатель координации верхних конечностей) субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (такой как ГФ) могут использоваться по отдельности или в комбинации с другими показателями для оценки эффективности лечения с использованием щелочной фосфатазы или полипептида, обладающего активностью щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), по которым улучшения по сравнению с определенным контрольным показателем показывают, что щелочная фосфатаза или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, эффективны для лечения нарушений мышц, связанных с болезнью с мышечной слабостью. Например, когда введение sALP субъекту, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, приводит к среднему увеличению показателя скорости бега и ловкости BOT-2 до около 5 или более чем около 5, по которым субъект ранее имел средний показатель скорости бега и ловкости BOT-2 менее чем около 5, тогда sALP считается эффективным, например, при лечении физических нарушений, связанных с болезнью с мышечной слабостью.

Кроме того, в рамках каждого BOT-2 (силы, скорости бега и ловкости, точности мелкой моторики, интеграции мелкой моторики, ловкости рук, билатеральной координации, баланса и координации верхних конечностей), субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ, CPPD, наследственной гипофосфатемии, описанных в данном документе и т.д.) может выполнять один или несколько тестов для определения показателя BOT-2 субъекта. Например, субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может выполнять одно или несколько приседаний, подпрыгиваний, прыжок в длину с места, приседания с опорой и отжимания, чтобы определить показатель силы BOT-2, чтобы определить оценка силы BOT-2 и оценить эффективность лечения sALP. Субъект, имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью, может выполнять один или несколько прохождение по гимнастическому бревну, челночный бег, прыжки на двух ногах в стороны и/или прыжки на двух ногах в стороны для определения показателя скорости бега и ловкости BOT-2 и оценить эффективность лечения введения sALP. Субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может вырезать круг и/или соединить точки, чтобы определить показатель точности мелкой моторики BOT-2 и оценить эффективность лечения sALP. Субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может скопировать звезду и или скопировать квадрат, чтобы определить показатель интеграции мелкой моторики BOT-2 и оценить эффективность лечения sALP. Субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может выполнить один или несколько пересчетов денег, сортировку карточек и текстильной мозайки, для определения показателя ловкости рук BOT-2 и оценить эффективность лечения sALP. Субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может постукивать ногой или пальцем и/или выполнить прыжки ноги вместе-ноги врозь для определения показателя билатеральной координации BOT-2 и оценить эффективность лечения при введении sALP. Субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может идти вперед по линии и/или стоять на одной ноге на гимнастическом бревне, чтобы определить показатель баланса BOT-2 и оценить эффективность лечения при введении sALP. Субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может бросить мяч в цель и/или поймать брошенный мячик, чтобы определить показатель координации верхних конечностей BOT-2 и оценить эффективность лечения при введении sALP.

В альтернативном варианте, введение щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP, не приводит к среднему увеличению показателя скорости бега и ловкости BOT-2 до более чем около 5, дозировка и/или частота введения могут быть изменены для определения эффективного количества щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, субъекту, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ). Например, дозировка sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) может быть увеличена, например, от около 3 мг/кг/неделю до около 6 мг/кг/неделю или от около 6 мг/кг/неделю до около 9 мг/кг/неделю.

Опросник оценки состояния детей (CHAQ)

Опросник оценки состояния детей (CHAQ) можно назначить для оценки состояния здоровья детей, страдающих болезнью с мышечной слабостью (например, ГФ), для создания показателя индекса CHAQ для детей, как описанно у Bruce» & Fries (J. Rheumatol. 30(1): 167-178, 2003) и Klepper (Arthritis & Rheumatism, 49: S5-S14, 2003), включенных в данный документ посредством ссылки в полном объеме. CHAQ включает следующие восемь категорий вопросов одевания/ухода за сбой, подъема, приема пищи, ходьбы, гигиены, достижения, захвата и физической деятельности, в которых родитель или опекун регистрирует количество трудностей ребенка при болезни с мышечной слабостью (например, ГФ) при выполнении соответствующей физической деятельности. Диапазон баллов по каждой категории от 0 до 3, при котором оценка 0 указывает на отсутствие каких-либо затруднений; оценка 1 указывает на некоторое затруднение; оценка 2 указывает на большое затруднение; и оценка 3 указывает на то, что ребенок не может осуществлять указанную активность.

Детей, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью со средним показателем индекса CHAQ (например, указывающему на неспособность выполнять повседневную деятельность (ADL) и/или боль) более чем около 0,8 (например, около 0,8, около 1, около 1,2, около 1,4, около 1,6, около 1,8, около 2,0, около 2,2, около 2,4, около 2,6, около 2,8 или около 3,0), можно лечить путем введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Например, детей со средним показателем индекса CHAQ более 0,8 можно лечить путем введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как, sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) в течение периода времени, вплоть до всей жизни пациента. Кроме того, ребенку, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, описанной в данном документе, может быть задан один или несколько вопросов по одной или нескольким из восьми категорий (одевание/уход за собой, подъем, питание, ходьба, гигиена, захват, жостижение и физическая активность), чтобы получить средний показатель индекса CHAQ, и если средний показатель индекса CHAQ больше, чем около 0,8, ребенка можно лечить путем введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP.

Показатель индекса CHAQ у ребенка, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, описанной в данном документе, можно сравнить с показателем индекса CHAQ у детей без такой болезни как мышечная слабость, например, для определения стандартного отклонения показателя индекса CHAQ. Дополнительно, показатель индекса CHAQ у ребенка, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, описанной в данном документе, можно сравнить с показателем индекса CHAQ других детей, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью, описанной в данном документе, для, например, определения стандартного отклонения показателя индекса CHAQ.

Способы могут приводить к улучшению показателя индекса CHAQ (например, указывающему на неспособность к ADL и/или боль) ребенка, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью, описанной в данном документе. Например, лечение с помощью sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), такого как лечение с помощью sALP в течение периода времени, вплоть до всего срока жизни ребенка, может привести к среднему снижению показателя индекса CHAQ до около 0, до равного или меньше, чем около 0,5 (например, около 0, около 0,1, около 0,2, около 0,4 или около 0,5) у детей с ГФ.

Уменьшение показателя индекса CHAQ у ребенка, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ), может сохраняться при введении щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активностью щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, в течение периода времени, вплоть до всей жизни ребенка. Аналогичным образом, увеличение ADL и/или уменьшение боли ребенка может быть устойчивым во время введения sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) в течение периода времени, вплоть до всей жизни ребенка.

Показатель индекса CHAQ у ребенка, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ), может быть использован для оценки эффективности лечения с использованием щелочной фосфатазы или полипептида, обладающего активностью щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), по которым улучшения по сравнению с определенным контрольным показателем показывают, что щелочная фосфатаза или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, являются эффективными для лечения, например, невозможности физических действий повседневной жизни (ADL) и боли, связанной с болезнью с мышечной слабостью. В частности, ребенку, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, могут быть заданы один или несколько вопросов по одной или нескольким из восьми категорий (одевание/уход за собой, подъем, питание, ходьба, гигиена, достижение, захват и физическая деятельность), чтобы получить средний показатель индекса CHAQ и оценить эффективность лечения при введении sALP. Например, когда введение sALP ребенку, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, приводит к среднему снижению показателя индекса CHAQ до равного или меньше, чем около 0,5, при котором ребенок ранее имел средний показатель индекса CHAQ больше, чем около 0,8, тогда sALP эффективен при лечении, например, неспособности к физическим действиям повседневной жизни (ADL) и боли, связанной с болезнью с мышечной слабостью. В альтернативном варианте, когда введение sALP не приводит к среднему снижению показателя индекса CHAQ до равного или меньше чем около 0,5, дозировка и/или частота введения sALP могут быть изменены для определения эффективного количество sALP для ребенка, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Например, дозировка sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) может быть увеличена, например, от около 3 мг/кг/неделю до около 6 мг/кг/неделю или от около 6 мг/кг/неделю до около 9 мг/кг/неделю.

Инструмент сбора педиатрических данных (PODCI)

Определенные субъекты, имеющие или склонные к болезни с мышечной слабостью (например ГФ), могут быть идентифицированы для лечения щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы таким как sALP (например, TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) с использованием инструмента сбора педиатрических данных (PODCI). PODCI может применяться для оценки состояния здоровья детей для создания показателя PODCI пациента, как описано у Plint et al. (J. Pediatr. Orthop. 23(6): 788-790, 2003). PODCI включает восемь категорий вопросов, которые могут быть выполнены субъектом, имеющим или склонным к заболеванию с мышечной слабостью (например, ГФ) или родителем/опекуном субъекта. Категории, которые могут быть использованы для определения PODCI у субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, включают следующее: 1) шкалу верхних конечностей и физической функции для измерения сложности при выполнении ежедневного ухода за собой и студенческой деятельности; 2) шкалу передвижения и основной физической деятельности для измерения сложности, возникающей при выполнении повседневных физических действий и двигательной активности в повседневной деятельности; 3) шкалу спортивного/физического функционирования для измерения трудностей или ограничений, возникающих при участии в более активных действиях или спорте; 4) шкалу боли/комфорта для измерения уровня боли, испытываемого в течение прошедшей недели; 5) шкалу ожиданий при лечении для измерения долгосрочных ожиданий при лечении; 6) шкалу счастья для измерения общей удовлетворенности личной внешностью и чувством сходства с друзьями и другими людьми своего возраста; 7) удовлетворенность шкалой симптомов, чтобы измерить принятие пациентом текущих ограничений, если это будет пожизненное состояние; и 8) шкалу общего функционирования, которая является общей комбинированной шкалой, рассчитанной по первым четырем шкалам, перечисленным выше. В каждой из категорий стандартизованный показатель определяется для субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, и затем превращается в шкалу от 0 до 100, в которой 0 представляет значительные нарушения, а 100 представляет меньшие нарушения.

Субъектов, имеющих или склонные к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ) со средним показателем PODCI (например, указывающих на нарушения ADL и/или боль), менее чем около 40 (например, около 5, около 10, около 15, около 20, около 25, около 30, около 35 или около 39) можно лечить путем введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например, полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Например, субъектов со средним показателем PODCI менее чем 40, можно лечить путем введения sALP в течение определенного периода времени, вплоть до всей жизни пациента. Кроме того, субъекту, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, можно задать один или несколько вопросов по одной или нескольким из восьми шкал, описанным выше (например, передвижения и основной двигательной активности, спорт/физическое функционирование и шкале боль/комфорт), чтобы получить средний показатель PODCI, и если средний показатель PODCI больше, чем менее 40, пациента можно лечить путем введения sALP.

Способы, описанные в данном документе, могут приводить к увеличению показателя PODCI (например, показывающему нарушения ADL и/или боль) субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Например, лечение щелочной фосфатазой или полипептидом, обладающим активностью щелочной фосфатазы, таким как sALP (например, TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), такое как лечение с помощью sALP в течение периода времени, вплоть до всей жизни субъекта, может приводить к среднему увеличению показателя PODCI от около 40 до около 50 (например, около 40, около 41, около 42, около 43, около 44, около 45, около 46, около 47, около 48, около 49 или около 50).

Увеличение показателя PODCI может поддерживаться посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, обладающего активностью щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, в течение периода времени, вплоть до всей жизни субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Кроме того, увеличение ADL и/или уменьшение боли может поддерживаться посредством введения sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), в течение периода времени, вплоть до всей жизни субъекта.

Показатель PODCI субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ), может быть использован для оценки эффективности лечения с использованием щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), по которому улучшения по сравнению с определенным контрольным показателем показывают, что щелочная фосфатаза или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, являются эффективными для лечения, например, нарушения физических функций в повседневной деятельности (ADL) и боли, связанной с болезнью с мышечной слабостью. В частности, субъекту, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, можно задать один или несколько вопросов по одной или нескольким из восьми шкал (шкале верхней конечности и физической функции, шкале передвижения и основной физической деятельности, шкале спортивного/физического функционирования, шкале боли/комфорта, шкале ожиданий при лечении, шкале счастья, шкале удовлетворенности симптомами и шкале общего функционирования), чтобы получить средний показатель PODCI и оценить эффективность лечения при введении sALP.

Например, когда введение sALP субъекту, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, приводит к среднему увеличению показателя PODCI до около 40 или более, чем около 40, по которому субъект ранее имел средний показатель PODCI менее чем около 40, тогда sALP эффективен при лечении, например, нарушения вповседневной деятельности (ADL) и боли, связанной с болезнью с мышечной слабостью. В альтернативном варианте, когда введение sALP не приводит к среднему увеличению показателя PODCI до около 40 или более чем около 40, дозировка и частота введения sALP могут быть изменены, чтобы определить эффективное количество sALP для субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Например, дозировка sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), может быть увеличена, например, от около 3 мг/кг/ неделю до около 6 мг/кг/неделю или от около 6 мг/кг/неделю до около 9 мг/кг/ неделю.

Шкалы развития младенцев и детей Бейли, 3-е издание (BSID-III)

Еще один показатель, шкалы развития младенцев и детей Бейли, 3-е издание (BSID-III), может быть использован для оценки состояния здоровья субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ), от момента рождения, для получения показателя BSID-III субъекта, как описано у Бейли. (2006). Bayley scales of infant and toddler development: administration manual. San Antonio, TX: Harcourt Assessment. BSID-III включают ряд развивающих игровых заданий, которые могут быть использованы в отношении субъекта для определения исходного показателя BSID-III. Например, категории для определения показателя BSID-III у субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, младенцев в возрасте примерно трех лет или менее, имеющих ГФ), могут включать прегензию, перцептивно-моторную интеграцию, моторное планирование и скорость, визуальный поиск, достижение, хватание объекта, управление объектами, функциональные практичные навыки, ответы на тактильный сигнал, движение конечностей и туловища, статическое позиционирование, динамическое движение, равновесие и моторное планирование. Затем измерения BSID-III преобразуются в баллы шкал BSID-III, которые могут использоваться для определения показателей субъекта по сравнению со здоровыми, скорректированными по возрасту субъектами. Балл шкал BSID-III субъекта, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью (например, пациента с ГФ), может находиться в диапазоне от 0 до 14, в которых баллы от около 7 до около 13 считаются нормальным диапазоном здоровых субъектов.

Субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью, может выполнять тесты по одной или нескольким описанным категориям (прегензия, перцептивно-моторная интеграция, моторное планирование и скорость, визуальный поиск, достижение, хватание объекта, управление объектами, функциональные практичные навыки, ответы на тактильный сигнал, движение конечностей и туловища, статическое позиционирование, динамическое движение, равновесие и моторное планирование) как младенец (например, в возрасте примерно 3 лет или менее чем 3 года) для получения показателя BSID-III, указывающего на задержку моторного развития. Субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью со средним показателем BSID-III по одной или нескольким описанным категориям (прегензия, перцептивно-моторная интеграция, моторное планирование и скорость, визуальный поиск, достижение, хватание объекта, управление объектами, функциональные практические навыки, ответы на тактильный сигнал, движение конечностей и туловища, статическое позиционирование, динамическое движение, равновесие и моторное планирование) менее чем около 2, как и младенца, можно лечить путем введения sALP (например, TNALP, например, полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). В частности, субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью со средним показателем BSID-III менее чем около 2, как и младенца, можно лечить путем введения sALP в течение определенного периода времени, вплоть до всей жизни субъекта.

Способы могут приводить к улучшению среднего показателя BSID-III (например, указывающего на задержку моторного развития) субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Например, лечение с помощью sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), такое как лечение с помощью sALP в течение периода времени, вплоть до всей жизни субъекта, может приводить к среднему увеличению показателя BSID-III до более чем около 5 (например, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12 или около 13).

Увеличение показателя BSID-III может поддерживаться посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), в течение периода времени, вплоть до всей жизни субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Аналогичным образом, увеличение моторного развития может поддерживаться посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, в течение периода времени, вплоть до всей жизни субъекта.

Показатель BSID-III субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ), может быть использован для оценки эффективности лечения с использованием щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), по которому улучшения по сравнению с определенным контрольным показателем показывают, что щелочная фосфатаза или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, эффективны для лечения, например задержки моторного развития, связанного с болезнью с мышечной слабостью. В частности, субъект, имеющий или склонный к болезни с мышечной слабостью может выполнить тесты по одной или нескольким описанным категориям (прегензия, перцептивно-моторная интеграция, моторное планирование и скорость, визуальный поиск, достижение, хватание объекта, управление объектами, функциональные практичные навыки, ответы на тактильный сигнал, движение конечностей и туловища, статическое позиционирование, динамическое движение, равновесие и моторное планирование), как и младенец, (например, в возрасте примерно трех лет или менее, имеющий ГФ)для получения среднего показателя BSID-III и оценки эффективности лечения sALP.

Например, когда введение sALP ребенку, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, приводит к среднему увеличению балла шкал BSID-III до более чем около 5, по которым ребенок ранее имел средний балл шкал BSID-III менее чем около 2, как и младенец (например, в возрасте примерно 3 лет или менее чем возраст 3 лет), тогда sALP эффективен при лечении, например, задержки моторного развития, связанного с ГФ. В альтернативном варианте, когда введение sALP не приводит к среднему увеличению балла шкал BSID-III до более чем около 5, дозировка и/или частота введения sALP могут быть изменены, в порядке определения эффективного количества sALP для ребенка, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Например, дозировка sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) может быть увеличена, например, от около 3 мг/кг/неделю до около 6 мг/кг/неделю или от около 6 мг/кг/неделю до около 9 мг/кг/неделю.

Шкалы моторного развития Пибоди, 2-е издание (PDMS-2)

Другие показатели, шкалы моторного развития Пибоди, 2-е издание (PDMS-2), могут быть использованы для оценки состояния здоровья субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ), с момента рождения, для получения показателя PDMS-2 для субъекта, как описано у van Hartingsveldt et al. (Occup.Ther. Int. 12(1): 1-13, 2005). PDMS-2 включает шесть категорий подтестов для измерения моторных навыков субъекта, такого как пациент с ГФ.

В частности, измерения PDMS-2 могут быть определены посредством следующих подтестов: 1) локомоторного подтеста для измерения способности субъекта перемещаться из одного места в другое (измерения включают в себя ползание, ходьбу, бег, подскоки и прыжки вперед); 2) подтестов рефлексов для измерения способности субъекта автоматически реагировать на действия окружающей среды; 3) стационарного подтеста, для измерения способности субъекта поддерживать контроль над его или ее телом в центре тяжести и сохранять равновесие; 4) подтест управления объектом для измерения способности субъекта управлять объектом, например, ловить, бросать и пинать мяч; 5) подтеста с хватанием, чтобы измерить способность субъекта использовать его или ее руки, например способность удерживать объект одной рукой и действия, связанные с контролируемым использованием пальцев обеих рук; и 6) подтеста визуально-моторной координации для измерения способности субъекта использовать свои визуальные навыки восприятия для выполнения сложных задач координации глаз, таких как достижение и захват объекта, создание блоков и копирование конструкций. Измерение PDMS-2 может быть определено для одной или нескольких из этих категорий для субъекта, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью (например, ГФ), и затем преобразовано в показатель PDMS-2, такой как стандартный локомоторный показатель PDMS-2, ранжируемый в диапазоне от 0 до 13, в котором диапазон здоровых субъектов (например, субъектов без мышечной слабости) составляет от около 7 до около 13.

Субъектов, имеющих или склонных к заболеванию с мышечной слабостью со средним показателем PDMS (например, показывающим задержку моторного развития), можно лечить путем введения sALP (таким как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющим по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).

Способы, описанные в данном документе, могут приводить к улучшению показателя PDMS-2 (например, указывающего на задержку моторного развития) субъекта, имеющего или склонного к заболеванию с мышечной слабостью. Например, лечение щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы, таким как sALP (например, TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющим по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), может приводить к среднему увеличению показателя PDMS-2 от около 7 до около 13 (например, около 7, около 8, около 9, около 10, около 11, около 12 или около 13).

Увеличение показателя PDMS-2 может поддерживаться посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), в течение продолжительного времени, например, периода времени, вплоть до всей жизни субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Аналогично, увеличение моторного развития может поддерживаться посредством введения sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), в течение периода времени, вплоть до всей жизни субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью.

Показатель PDMS-2 субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью (например, ГФ), может быть использован для оценки эффективности лечения с использованием щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, такого как sALP (например, TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), по которому улучшения по сравнению с определенным контрольным показателем показывают, что щелочная фосфатаза или полипептид, имеющий активность щелочной фосфатазы, эффективны для лечения, например задержки моторного развития, связанного с болезнью с мышечной слабостью. Например, ребенок, имеющий или склонный к заболеванию с мышечной слабостью, может выполнять тесты по одной или нескольким описанным категориям (локомоторная, рефлексы, стационарная, управления объектом, захват и визуально-моторная) в возрасте от около 5 лет или менее чем 5 лет, чтобы получить средний показатель PDMS-2 и оценить эффективность лечения введения sALP.

Например, когда введение sALP ребенку, имеющему или склонному к заболеванию с мышечной слабостью, приводит к среднему увеличению стандартного показателя PDMS-2 до около 7, по которому у ребенка ранее был средний стандартный показатель PDMS-2 около 5, тогда sALP является эффективным при лечении, например, задержки моторного развития, связанной с ГФ. В альтернативном варианте, когда введение sALP не приводит к среднему увеличению стандартного показателя PDMS-2 до около 7, дозировка и/или частота введения sALP могут быть изменены, в порядке определения эффективного количества sALP для ребенка. Например, дозировка sALP (такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), может быть увеличена, например, от около 3 мг/кг/ неделю до около 6 мг/кг/неделю или от около 6 мг/кг/неделю до около 9 мг/кг/ неделю.

Тест с шестиминутной ходьбой (6MWT)

Субъекты, имеющие или склонные к заболеванию с мышечной слабостью, могут быть идентифицированы для лечения щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы (например, sALP, таким как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющим по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) с использованием 6MWT. В частности, 6MWT можно использовать для оценки способности ходьбы у взрослого человека, имеющего болезнь с мышечной слабостью, для получения значения 6MWT для взрослого человека. 6MWT можно выполнять в закрытом помещении или на открытом воздухе, используя квартирный, прямой, закрытый коридор (например, длиной около 30 метров) с жестким покрытием. Секундомер или другой таймер можно использовать для отслеживания времени, а механический счетчик или другое устройство можно использовать для определения расстояния (например, в метрах), которое проходит субъект, имеющий болезнь с мышечной слабостью. Например, длина коридора может быть отмечена каждые три метра, чтобы определить количество метров, пройденных субъектом, имеющим болезнь с мышечной слабостью, также с точкой поворота на 30 метров и стартовой линией. Расстояние, пройденное субъектом, имеющим болезнь с мышечной слабостью за шесть минут, можно затем сравнить с прогнозируемым числом пройденных метров, например, обычным субъектом примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста, и выразить как процентное значение для получения значения 6MWT субъекта. Значение 6MWT субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью, можно сравнить со значением 6MWT от исходного уровня субъекта. Кроме того, значение 6MWT субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью, можно сравнить со значением 6MWT нормального субъекта.

Субъектов, имеющих болезнь с мышечной слабостью со средним 6MWT менее чем около 80% от прогнозируемого значения 6MWT (например, относительно нормального субъекта примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста), можно лечить с помощью щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющим по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, для периода лечения по меньшей мере двух недель (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере семь месяцев, по меньшей мере восемь месяцев, по меньшей мере девять месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет, или всей жизни пациента, в частности, по меньшей мере шесть недель). Например, субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью со средним значением 6MWT или менее чем около 80% от прогнозируемого значения 6MWT (например, около 50%, около 55%, около 60%, около 65%, около 70%, или около 75% от прогнозируемого значения 6MWT) можно лечить щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы, для периода лечения по меньшей мере двух недель (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере семь месяцев, по меньшей мере восемь месяцев, по меньшей мере девять месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет, или всей жизни пациента, в частности, по меньшей мере шесть недель).

Способы могут привести к улучшению значения 6MWT пациента, имеющего болезнь с мышечной слабостью. Например, лечение щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы (например, sALP, таким как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, лечение щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы для периода лечения (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере семь месяцев, по меньшей мере восемь месяцев, по меньшей мере девять месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет, или всей жизни пациента, в частности, по меньшей мере шесть недель), может привести к увеличению среднего значения 6MWT около 80% или более от прогнозируемого значения 6MWT пациента (например, около 82%, около 84%,около 86%, около 88%, около 90%, около 92%, около 94%, около 96%, около 98%, или более от прогнозируемого значения 6MWT).

Увеличение значения 6MWT субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью, может поддерживаться посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, для периода лечения по меньшей мере двух недель (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере семь месяцев, по меньшей мере восемь месяцев, по меньшей мере девять месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет, или всей жизни пациента, в частности, по меньшей мере шесть недель). Например, значение 6MWT увеличивается более чем на около 80% от прогнозируемого значения 6MWT субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью, и остается на ± 10% от увеличенного значения 6MWT во время лечения щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы.

Аналогичным образом, улучшение способности к ходьбе субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью, можно поддерживать посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, например, для периода лечения, по меньшей мере, двух недель (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере четыре недели, по меньшей мере пять недель, по меньшей мере шесть недель, по меньшей мере семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере, десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере, шесть месяцев, по меньшей мере, семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, поменьшей мере, три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере, пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет или, по меньшей мере, десять лет или всей жизни пациента; в частности, поменьшей мере шесть недель). Например, субъект, имеющий болезнь с мышечной слабостью, проявляет меньшую зависимость от приспособлений вспомогательной мобильности, таких как ходунки, инвалидная коляска, брейсов, костылей или ортезов, на протяжении лечения с помощью sALP.

В альтернативном варианте, когда введение щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например, полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) не приводит к увеличению среднего значения 6MWT до более чем 80% от прогнозируемого значения 6MWT (например, нормального субъекта примерно того же возраста, того же пола и/или роста), дозировка и/или частота введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, могут быть изменены для определения эффективного количества щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, для субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью. Например, дозировка щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, может быть увеличена от, например, около 2,1 мг/кг/неделю или от около 3,5 мг/кг/неделю до около 6 мг/кг/неделю или около 9 мг/кг/неделю.

Ручная динамометрия (HHD)

Захват и мышечную силу субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью, можно оценить с помощью ручной динамометрии (HHD). Например, сгибание колена и разгибание, а также сгибание, разгибание и абдукцию бедра у субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью, можно измерить, используя, например, динамометр MICROFET2^TM, в то время как сила захвата субъекта может быть измерена с использованием, например, ручного динамометра Jamar. В частности, сотрудник удерживает динамометр в стационарном состоянии, и субъект оказывает максимальную силу против динамометра. Данные максимальных значений силы получают в фунтах, а затем преобразуют в Ньютоны (N). Затем значения крутящего момента вычисляются с использованием длины конечности в ньютон-метрах. Затем значение крутящего момента можно сравнить со значением крутящего моммента, например, обычного субъекта примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста и выразить как процентное значение для получения значения HHD субъекта.

Субъектов, имеющих болезнь с мышечной слабостью со средним значением HHD менее чем около 80% от прогнозируемого значения HHD (например, относительно нормального субъекта примерно того же возраста, того же пола и/или того же роста), можно лечить с помощью щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариантом полипептида, имеющим по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, для периода лечения по меньшей мере двух недель (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере семь месяцев, по меньшей мере восемь месяцев, по меньшей мере девять месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет, или всей жизни пациента, в частности, по меньшей мере шесть недель). Например, субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью со средним HHD менее чем около 80% от прогнозируемого значения HHD (например, около 30%, около 35%, около 40%, около 45%, около 50%, около 55%, около 60%, около 65%, около 70% или около 75% от прогнозируемого значения HHD) можно лечить щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы, для периода лечения по меньшей мере двух недель (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере семь месяцев, по меньшей мере восемь месяцев, по меньшей мере девять месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет, или всей жизни пациента, в частности, по меньшей мере шесть недель).

Способы могут привести к улучшению значения HHD субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью. Например, лечение щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы (например, sALP, таким как TNALP, например полипептидом sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), например, лечением щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы, для периода лечения, по меньшей мере, двух недель (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере, семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере семь месяцев, по меньшей мере, восемь месяцев, по меньшей мере, девять месяцев, по меньшей мере, один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет или, по меньшей мере, десять лет или всей жизни пациента; в частности, по меньшей мере, шесть недель), может привести к среднему увеличению значения HHD до около 80% или более от прогнозируемого значения HHD пациента (например, около 83%, около 85%, около 87%, около 90%, около 93%, около 95%, около 97% или около 100%, или около 100% от прогнозируемого значения HHD).

Увеличение значения HHD субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью, может поддерживаться посредством введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа), например, для периода лечения по меньшей мере двух недель (например, по меньшей мере три недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, пять недель, по меньшей мере, шесть недель, по меньшей мере семь недель, по меньшей мере восемь недель, по меньшей мере девять недель, по меньшей мере десять недель, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере четыре месяца, по меньшей мере пять месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере семь месяцев, по меньшей мере восемь месяцев, по меньшей мере девять месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет, или всей жизни пациента, в частности, по меньшей мере шесть недель). Например, значение HHD увеличивается более чем около 80% от прогнозируемого значения HHD субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью, и остается на ±10% от увеличенного значения HHD во время лечения щелочной фосфатазой или полипептидом, имеющим активность щелочной фосфатазы.

В альтернативном варианте, когда введение щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы (например, sALP, такого как TNALP, например, полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или варианта полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотазой альфа) не приводит к увеличению среднего значения HHD до более чем 80% от прогнозируемого значения HHD (например, субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью примерно того же возраста, того же пола и/или роста), дозировка и/или частота введения щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, могут быть изменены для определения эффективного количества щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, для субъекта, имеющего болезнь с мышечной слабостью. Например, дозировка щелочной фосфатазы или полипептида, имеющего активность щелочной фосфатазы, может быть увеличена от, например, около 2,1 мг/кг/неделю или от около 3,5 мг/кг/неделю до около 6 мг/кг/неделю или около 9 мг/кг/неделю.

Щелочная фосфатаза

Асфотаза альфа представляет собой человеческий слитый белок TNALP (hTNALP; SEQ ID NO: 1), приготовленный для лечения ГФ. В частности, асфотаза альфа (SEQ ID NO: 1) может эффективно использоваться для лечения гипофосфатазии (ГФ), ее симптомов и связанных с ней физических нарушений у субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью в течение длительного периода времени (например, по меньшей мере один день, по меньшей мере одну неделю, по меньшей мере две недели, по меньшей мере три недели, по меньшей мере один месяц, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере один год, по меньшей мере два года, по меньшей мере три года, по меньшей мере четыре года, по меньшей мере пять лет, по меньшей мере шесть лет, по меньшей мере семь лет, по меньшей мере восемь лет, по меньшей мере девять лет, по меньшей мере десять лет или более чем десять лет (например, всю жизнь субъекта)).

Учитывая результаты, описанные в данном документе, данное описание не ограничивается конкретной щелочной фосфатазой (ALP) или последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей ALP. Щелочные фосфатазы включают группу ферментов, которые катализируют расщепление фосфатной группы (например, гидролиз пирофосфата, PPi). Существует четыре известных вида изоферментов щелочной фосфатазы (ALP) млекопитающих: неспецифическая щелочная фосфатаза (TNALP, описанная ниже), плацентарная щелочная фосфатаза (PLALP) (например, образец № P05187, NP_112603 и NP_001623), щелочная фосфатаза зародышевых клеток (GALP) (например, образец № P10696) и кишечная щелочная фосфатаза (IALP) (например, образец № P09923 и NP_001622). В дополнение к ALP, приведенным в качестве примера, описанных выше, в данном описании также предлагается любой полипептид, имеющий идентичную или сходную структуру каталитического сайта и/или ферментативную активность ALP для лечения субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью. Конъюгаты доставки в костную ткань, включая sALP, дополнительно описаны в публикации РСТ №: WO 2005/103263 и WO 2008/138131.

TNALP, которые могут использоваться в соответствии с описанными в данном документе способами, включают, например, человеческую TNALP (образец № NP_000469, AAI10910, AAH90861, AAH66116, AAH21289 и AAI26166); резус TNALP (образец № XP_01109717); крысиную TNALP (образец № NP_037191); собачью TNALP (образец № AAF64516); свинную TNALP (номер входа AAN64273), мышиную (образец № NP_031457), коровью TNALP ( образец № NP_789828, NP_776412, AAM 8209 и AAC33858) и кошачью TNALP (образец № NP_001036028). В частности, TNALP может быть рекомбинантным TNALP человека (например, SEQ ID NO: 1, асфотаза альфа; см. патенты США № 7763712 и 7960529, включенные в данные документ посредством ссылки во всей их полноте), используемым для лечения субъектов, имеющих или склонных к болезни с мышечной слабостью. TNALP также может быть таковым, который проявляет по меньшей мере около 95% идентичности последовательности с полипептидом или нуклеотидной последовательностью вышеупомянутых TNALP.

Растворимая щелочная фосфатаза

ALP по данному изобретению включают растворимые (например, внеклеточные или не связанные с мембраной) формы любой из щелочных фосфатаз, описанных в данном документе. sALP по изобретению может быть, например, растворимой формой неспецифической щелочной фосфатазы человека (человеческой TNALP (hTNALP)). Данное описание не ограничивается конкретной sALP и может включать любой полипептид sALP, который физиологически активен в отношении, например, фосфоэтаноламина (PEA), неорганического пирофосфата (PPi) и пиридоксаль 5'-фосфата (PLP). В частности, sALP по данному изобретению является каталитически компетентной для улучшения скелетной минерализации кости. Данное описание дополнительно включает нуклеиновые кислоты, кодирующие описанные в данном документе sALP, которые могут быть использованы для лечения описанных в данном документе состояний мышечной слабости, включая, например, ГФ, CPPD, наследственную гипофосфатемию (такую как аутосомно-доминантный гипофосфатемический рахит (ADHR), аутосомно-рецессивный гипофосфатемический рахит, X-сцепленный гипофосфатемический рахит, X-сцепленную гипофосфатемия (XLH) и т.д.) и т.д.

TNALP представляет собой мембранно-связанный белок, заякоренный гликолипидным фрагментом на C-конце (Swiss-Prot, P05186). Этот гликолипидный якорь (GPI) добавляется пост-трансляционно после удаления гидрофобного С-концевого, который служит как временным мембранным якорем, так и сигналом для добавления GPI. Хотя GPI-якорь расположен в клеточной мембране, остальные части TNALP являются внеклеточными. В частности, TNALP (например, человеческий TNALP (hTNALP)) может быть сконструирован с заменой первой аминокислоты гидрофобной C-концевой последовательности (аланина) со стоп-кодоном, в результате чего получают сконструированный hTNALP, который содержит все аминокислотные остатки природной заякоревающей формы TNALP и без GPI-мембранного якоря. Специалисту в данной области техники будет понятно, что положение GPI-мембраного якоря будет варьироваться в разных ALP и может включать, например, последние 10, 12, 14, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 45, 50 или более аминокислотных остатков на С-конце полипептида. Рекомбинантный sTNALP может включать, например, аминокислоты 1-502 (от 18 до 502 когда секретируется), аминокислоты 1-501 (от 18 до 501, когда секретируется), аминокислоты 1-504 (от 18 до 504, когда секретируется), аминокислоты 1 до 505 (18-505, когда секретируется) или аминокислоты 1-502. Таким образом, С-концевой участок нативной ALP может быть усечен некоторыми аминокислотами без влияния на активность ALP.

В дополнение к C-концевому GPI-якорю, TNALP также имеет N-концевую сигнальную пептидную последовательность. N-концевой сигнальный пептид присутствует на синтезированном белке, когда он синтезируется, но отщепляется от TNALP после транспорта в ER. sALP согласно изобретению включают как секретируемые (то есть без N-концевого сигнала), так и несекретные (то есть имеющие N-концевой сигнал) формы. Специалисту в данной области техники будет понятно, что положение N-концевого сигнального пептида будет варьироваться в разных щелочных фосфатазах и может включать, например, первые 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30 или более аминокислотных остатков на N-конце полипептида. Специалист в данной области техники может спрогнозировать положение участка расщепления сигнальной последовательности, например, с помощью соответствующего компьютерного алгоритма, такого как описанного у Bendtsen et al. (J. Mol. Biol. 340(4):783-795, 2004) и доступного на странице сайта www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/.

Данное изобретение также включает консенсусные последовательности sALP, полученные из внеклеточного домена изоферментов ALP (например, TNALP, PALP, GCALP, IALP и т.д.). Таким образом, аналогично sTNALP, описанному выше, данное описание также относится к другим растворимым изоферментам ALP человека, то есть без пептидного сигнала, предпочтительно содержащему внеклеточный домен ALP. sALP по изобретению также содержат полипептидные последовательности, соответствующие консенсусной последовательности, полученной из внеклеточного домена ALP изоферментов ALP человека и ортологов TNALP млекопитающих (человека, мыши, крысы, коровы, кошки и собаки) или консенсуса, полученного из внеклеточного ALP домена только ортологов TNALP млекопитающих (человека, мыши, крысы, коровы, кошки и собаки). sALP по изобретению также включают те, которые соответствуют аналогичным консенсусным последовательностям, полученным из различных комбинаций этих ортологов TNALP или изоферментов ALP человека. Такие консенсусные последовательности приведены, например, в WO 2008/138131.

sALP по данному изобретению могут включать не только последовательность дикого типа sALP, описанные выше, но любой полипептид, имеющий по меньшей мере 50% (например, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и более) идентичности последовательности с этими щелочными фосфатазами (например, SEQ ID NO: 1-24; например, полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Примеры мутаций, которые могут быть введены в последовательность ALP, описаны в публикации США № 2013/0323244, включенной в данное описание посредством ссылки во всей ее полноте. sALP может быть необязательно гликозилированной в любом подходящем одном или более аминокислотных остатках. Кроме того, sALP может иметь по меньшей мере 50% (например, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и более) идентичности последовательности к любому из описанных в данном документе sALP (например, TNALP, например полипептиду sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). sALP может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более добавок, делеций или замен относительно любой из описанной в данном документе sALP (такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).

Слитые полипептиды sALP

Любой из sALP и линкеры, описанные в данном документе, могут быть объединен в полипептид sALP, например, полипептид sALP A-sALP-B, где каждый из A и B отсутствует или представляет собой аминокислотную последовательность из по меньшей мере одной аминокислоты (например, TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). Когда присутствует, A и/или B могут быть любыми линкерами, описанными в данном документе. В некоторых полипептидах sALP, A отсутствует, B отсутствует, или A и B оба отсутствуют. Полипептиды sALP по изобретению могут необязательно включать Fc-область, для обеспечения слитого полипептида sALP, как описано в данном документе. Полипептид sALP может необязательно включать костно-нацеливающий фрагмент, как описано в данном документе. В некоторых полипептидах sALP, линкер, например, гибкий линкер, может быть включен между костно-нацеливающим фрагментом и sALP, таким как дипептидная последовательность (например, лейцин-лизин или аспарагиновая кислота-изолейцин). Дополнительные, в качестве примера, ниже приведены Fc-области, линкеры и костно-нацеливающие компоненты.

Любой из sALP, линкеров и Fc-областей, описанные в данном документе, могут быть объединены в слитый полипептид, например рекомбинантный слитый полипептид, который содержит структуру Z-sALP-Y-спейсер-X-W_n-V, Z-W_n-X-спейсер-Y-sALP-V, Z-sALP-Y-W_n-X-спейсер-V и Z-W_n-X-sALP-Y-спейсер-V (например TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа). В частности, структура может быть Z-sALP-Y-спейсер-X-W_n-V или Z-W_n-X-спейсер-Y-sALP-V. sALP может представлять собой полноразмерные или функциональные фрагменты ALP, такие как растворимый внеклеточный домен ALP, как описано в данном документе (например, TNALP, PALP, GCALP и IALP). Любой из X, Y, Z и V и/или спейсер могут отсутствовать или быть аминокислотной последовательностью из по меньшей мере одной аминокислоты. W_n может быть костно-нацеливающим фрагментом, например, имеющим ряд последовательных остатков Asp или Glu, в которых n=1-50, например n=3-30, например, 5-15, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50. Костно-нацеливающий фрагмент, если он присутствует, может быть расположен в любом месте слитого полипептида, например, на или вблизи N-конца или на С-конце и/или в линкерной области. Например, костно-нацеливающий фрагмент находится на С-конце. Полипептиды sALP и слитые полипептиды также не могут включать костный-нацеливающий компонент.

Слитые полипептиды sALP по данному изобретению могут иметь структуру hTNALP-Fc-D₁₀. В частности, слитые полипептиды sALP могут включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа).

Подходящие спейсеры включают, но не ограничиваются ими, полипептиды, содержащие Fc, и гидрофильные и гибкие полипептиды, способные ослаблять силы отталкивания, вызванные присутствием концевого сильно отрицательно заряженного пептида (например, W_n). Например, sALP может представлять собой слитый полипептид, включающий Fc-область иммуноглобулина на N-концевом или C-концевом домене. Молекула иммуноглобулина имеет структуру, которая хорошо известна в данной области техники. Она включает две легкие цепи (~ 23 кД каждая) и две тяжелые цепи (~50-70 кД каждая), соединенные межцепочечными дисульфидными связями. Иммуноглобулины легко расщепляются протеолитически (например, путем расщепления папаином) в Fab (содержащие легкую цепь и VH и CH1-домены тяжелой цепи) и Fc (содержащие домены CH2 и CH3 тяжелой цепи вместе с соседними последовательностями). Подходящие фрагменты Fc, как описано в данном документе, включают Fc-фрагмент любой молекулы иммуноглобулина, включая IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, и их различные подклассы (например, IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1, IgA-2) от любого млекопитающего (например, человека). Например, Fc-фрагмент представляет собой человеческий IgG-1. Fc-фрагменты по изобретению могут включать, например, домены CH2 и CH3 тяжелой цепи и любую часть шарнирной области. Fc-область может быть необязательно гликозилирована в любом подходящем одном или более аминокислотных остатках, известных специалистам в данной области техники. В частности, Fc-фрагмент слитого полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или не имеет около 50% (например, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и более) идентичности последовательности SEQ ID NO: 20. Сконструированные, неприродные, например, Fc-области, могут быть использованы в способах по изобретению, например как описано в публикации международной заявки № WO2005/007809, которая включена посредством ссылки. Fc-фрагмент, описанный в данном документе, может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 или более добавок, делеций или замен относительно любого из Fc-фрагментов, описанных в данном документе.

Слитые полипептиды sALP, описанные в данном документе, (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), может включать область пептидного линкера между Fc-фрагментом. Кроме того, область пептидного линкера может быть включена между Fc-фрагментом и необязательно костно-нацеливающим компонентом. Линкерная область может быть любой последовательности и длины, которая позволяет sALP оставаться биологически активными, например, не стерически связанным. В качестве примера, длины линкеров составляют от 1 до 200 аминокислотных остатков, например, 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 51-55, 56-60, 61-65, 66-70, 71-75, 76-80, 81-85, 86-90, 91-95, 96-100, 101-110, 111- 120, 121-130, 131-140, 141-150, 151-160, 161-170, 171-180, 181-190 или 191-200 аминокислотных остатков. Например, линкеры включают или состоят из гибких частей, например областей без значительной фиксированной вторичной или третичной структуры. Примерами гибких линкеров являются богатые глицином линкеры, например, содержащие по меньшей мере 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или даже 100% глициновых остатков. Линкеры также могут содержать, например, сериновые остатки. В некоторых случаях, аминокислотная последовательность линкеров состоит только из глициновых и сериновых остатков. Линкер может быть необязательно гликозилирован по любому подходящему одному или более аминокислотных остатков. Кроме того, линкер, как описано в данном документе, может включать любую другую последовательность или фрагмент, присоединенных ковалентно или нековалентно. Линкер также может отсутствовать, при этом Fc-фрагмент и sALP слиты друг с другом непосредственно, без промежуточных остатков. Некоторые слитые полипептиды Fc-sALP или sALP-Fc можно рассматривать в соответствии с данным изобретением либо как 1) не имеющие линкера, либо как 2), имеющие линкер, который соответствует части sALP. Например, Fc, слитый непосредственно с hsTNALP (1-502), может рассматриваться, например, либо как не имеющий линкера, при этом hsTNALP представляет собой аминокислоты 1-502, либо как имеющий линкер с 17 аминокислотами, при этом hsTNALP (18-502).

Дополнительные аминокислотные остатки могут быть введены в полипептид согласно стратегии клонирования, используемой для получения слитых полипептидов. Например, дополнительные аминокислотные остатки не предусматривают дополнительный сигнал GPI-якоря, чтобы поддерживать полипептид в растворимой форме. Кроме того, любые такие дополнительные аминокислотные остатки, если они включены в полипептид по изобретению, не предусматриваю сайт расщепления для эндопротеаз клетки-хозяина. Вероятность того, что сконструированная последовательность будет расщеплена эндопротеазами клетки-хозяина, может быть спрогнозирована, как описано, например, Ikezawa (Biol. Pharm. Bull. 25:409-417, 2002).

sALP и слитые полипептиды sALP по изобретению (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут быть соединены в димеры или тетрамеры. Например, два мономера sALP-Fc могут ковалентно соединяться через две дисульфидные связи, расположенные в шарнирных областях Fc-фрагментов. Кроме того, полипептид или слитый полипептид по изобретению (например, полипептид sALP или слитый полипептид) могут быть гликозилированы или ПЭГилированы.

Получение нуклеиновых кислот и полипептидов

Нуклеиновые кислоты, кодирующие sALP и sALP-слитые полипептиды по изобретению (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть получены любым способом, известным в данной области техники. Как правило, нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый слитый полипептид, получают с использованием способов молекулярного клонирования и обычно помещают в вектор, такой как плазмида или вирус. Вектор используется для трансформации нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, подходящей для экспрессии слитого полипептида. Типичные способы описаны, например, у Maniatis et al. (Cold Springs Harbor Laboratory, 1989). Многие типы клеток могут быть использованы в качестве соответствующих клеток-хозяев, хотя клетки млекопитающих предпочтительнее, поскольку они способны обеспечивать соответствующие посттрансляционные модификации. Клетки-хозяева по данному изобретению могут включать, например, клетку яичника китайского хомячка (CHO), L-клетку, клетку C127, клетку 3T3, клетку BHK, клетку COS-7 или любую другую подходящую клетку-хозяина, известную в данной области техники. Например, клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO) (например, клетку CHO-DG44).

SALPs и sALP-слитые полипептиды (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут быть получены при любых условиях, подходящих для экспрессии полипептида sALP в клетке-хозяине. Такие условия включают соответствующий выбор среды, приготовленной с такими компонентами, как буфер, бикарбонат и/или HEPES, ионы, такие как хлорид, фосфат, кальций, натрий, калий, магний, железо, источники углерода, такие как простые сахара, аминокислоты, возможные липиды, нуклеотиды, витамины и факторы роста, такие как инсулин; обычные коммерчески доступные среды, такие как alpha-MEM, DMEM, Ham's-F12 и IMDM, дополненные 2-4 мМ L-глутамина и 5% фетальной бычьей сывороткой; обычные коммерчески доступные животные, свободные от белка среды, такие как Hyclone™ SFM4CHO, Sigma CHO DHFR^-, Cambrex POWER™ CHO CD, дополненные 2-4 мМ L-глутамина. Эти среды желательно готовить без тимидина, гипоксантина и L-глицина для поддержания селективного давления, позволяющего стабильную экспрессию белкового продукта.

Фармацевтические композиции и составы

Композиция по данному изобретению (например, включающая sALP и слитый полипептид sALP, такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), можно вводить различными способами, известными в данной области техники. Как будет понятно специалисту в данной области техники, путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от желаемых результатов. Путь введения может зависеть от множества факторов, таких как окружающая среда и терапевтические цели. В частности, описанные в данном документе полипептиды и слитые полипептиды, могут вводиться любым способом, известным в данной области техники, например, подкожно (например, путем подкожной инъекции), внутривенно, перорально, назально, внутримышечно, сублингвально, интратекально или внутрикожно. В качестве примера, фармацевтические композиции по изобретению могут быть в форме жидкости, раствора, суспензии, таблетки, капсулы, пилюли, желатиновой капсулы, порошка, геля, мази, крема, небулы, миста, средства для ингаляции, аэрозоля или фитосомы.

Дозировка

Любое количество фармацевтической композиции (например, включая sALP или слитый полипептид sALP, такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), можно вводить субъекту, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью. Дозировки будут зависеть от многих факторов, включая способ введения и возраст пациента. Обычно, количество композиции (например, sALP или слитого полипептида sALP, такого как TNALP, например, полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), содержащееся в одной дозе, будет представлять собой количество, которое эффективно для лечения состояния (например, ГФ), как описано в данном документе, не вызывая значительной токсичности.

Например, полипептиды sALP (такие как TNALP, например, полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), описанные в данном документе, могут вводиться субъекту, имеющему или склонному к болезни с мышечной слабостью, в отдельных дозах, ранжируемых, например, от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг (например, от 0,05 мг/кг до 500 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, от 5 мг/кг до 500 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг, от 10 мг/кг до 100 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 50 мг/кг, от 0,5 мг/кг до 25 мг/кг, от 1,0 мг/кг до 10 мг/кг, от 1,5 мг/кг до 5 мг/кг или 2,0 мг/кг до 3,0 мг/кг) или от 1 мкг/кг до 1000 мкг/кг (например, от 5 мкг/кг до 1000 мкг/кг, от 1 мкг/кг до 750 мкг/кг, от 5 мкг/кг до 750 мкг/кг, от 10 мкг/кг до 750 мкг/кг, от 1 мкг/кг до 500 мкг/кг, от 5 мкг/кг до 500 мкг/кг, от 10 мкг/кг до 500 мкг/кг, от 1 мкг/кг до 100 мкг/кг, от 5 мкг/кг до 100 мкг/кг, от 10 мкг/кг до 100 мкг/кг, от 1 мкг/кг до 50 мкг/кг, от 5 мкг/кг до 50 мкг/кг, или от 10 мкг/кг до 50 мкг/кг).

Примеры доз sALP включают, например, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250 или 500 мг/кг; или 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 900 или 1000 мкг/кг. Для всех доз или диапазонов, указанных в данном документе, термин «около» может быть использован для модификации этих доз на ± 10% от указанных значений или конечных точек диапазона. В частности, композиции (например, включая sALP (такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа)) в соответствии с данным описанием могут вводиться пациентам в дозах ранжируемых от около 0,001 мг/кг/день до около 500 мг/кг/день, от около 0,01 мг/кг/день до около 100 мг/кг/день или около от 0,01 мг/кг/день до около 20 мг/кг/день. Например, композиции sALP (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), можно вводить пациентам в недельной дозировке ранжированной, например, от около 0,5 мг/кг/неделю до около 140 мг/кг/неделю, например, от около 0,8 мг/кг/ неделю до около 50 мг/кг/ неделю или около 1 мг/кг/ неделю до около 10 мг/кг/неделю (например, около 6 или около 9 мг/кг/неделю). В частности, sALP (такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) можно вводить в дозе 2 мг/кг три раза в неделю (общая доза 6 мг/кг/неделя), 1 мг/кг шесть раз в неделю (общая доза 6 мг/кг/неделя), 3 мг/кг три раза в неделю (общая доза 9 мг/кг/неделя), 0,5 мг/кг три раза в неделю (общая доза 1,5 мг/кг/неделя) или 9,3 мг/кг три раза в неделю (общая доза 28 мг/кг/неделя). Дозировка будет регулироваться клиницистом в соответствии с обычными факторами, такими как степень заболевания и различные параметры субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью.

Дозировки композиций, включая sALP и слитые полипептиды sALP (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут быть предложены в виде одной или нескольких режимов приема препарата. Дозы можно вводить, например, ежечасно, каждые два часа, два раза в день, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно, раз в два месяца или каждый год. В альтернативном варианте, дозы можно вводить, например, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, 10 раз, 11 раз или 12 раз в день. В частности, режим приема препарата составляет один раз в неделю. Продолжительность режима приема препарата может быть, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней, неделю (недели) или месяц(ы) или даже на протяжении всей жизни субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью. Количество, частота и продолжительность дозировки будут регулироваться клиницистом в соответствии с обычными факторами, такими как степень заболевания и различные параметры субъекта, имеющего или склонного к болезни с мышечной слабостью.

Например, sALP или слитый полипептид sALP (такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), можно составить в виде раствора для инъекций, который представляет собой прозрачный, от бесцветного до слегка желтоватого, водный раствора, рН 7,4. sALP или полипептид sALP (такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) может быть составлен в концентрации 12 мг/0,3 мл, 18 мг/0,45 мл, 28 мг/0,7 мл, 40 мг/1 мл или 80 мг/0,8 мл. В частности, композицию можно приготовить в виде раствора для инъекций 40 мг/мл, в котором каждый мл раствора содержит 40 мг sALP или полипептида sALP (например, каждый флакон содержит 0,3 мл раствора и 12 мг sALP (40 мг/мл), каждый флакон содержит 0,45 мл раствора и 18 мг sALP (40 мг/мл), каждый флакон содержит 0,7 мл раствора и 28 мг sALP (40 мг/мл), или каждый флакон содержит 1,0 мл раствора и 40 мг асфотазы альфа (40 мг/мл)). sALP или полипептид sALP (такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) можно приготовить в виде раствора для инъекций в концентрации 100 мг/мл, в котором каждый 1 мл раствора содержит 100 мг sALP или полипептида sALP (например, каждый флакон содержит 0,8 мл раствора и 80 мг асфотазы альфа (100 мг/мл)).

Например, рекомендуемая доза sALP или слитого полипептида sALP ((такого как TNALP, например полипептида sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) составляет 2 мг/кг массы тела, вводимого подкожно три раза в неделю, или режим дозировки 1 мг/кг массы тела, вводимого подкожно шесть раз в неделю. Дополнительная информация о дозировке приведена ниже (Таблица 1).

Таблица 1. ДОЗИРОВКА АСФОТАЗЫ АЛЬФА

Состав

Композиции, включающие sALP и sALP слитые полипептиды (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть приготовлены в соответствии со стандартными способами. Фармацевтическая композиция является хорошо известной в области техники и дополнительно описывается, например, у Gennaro (2000) «Remington: The Science and Practice of Pharmacy,ʺ 20^th Edition, Lippincott, Williams & Wilkins (ISBN: 0683306472); Ansel et al. (1999) ʺPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,ʺ 7^th Edition, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (ISBN: 0683305727); и Kibbe (2000) ʺHandbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association,ʺ 3^rd Edition (ISBN: 091733096X). Например, композиция sALP (такая как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа), могут быть приготовлены, например, в виде буферного раствора в подходящей концентрации и пригодной для хранения при 2-8°C (например, 4°C). Композицию можно также приготовить для хранения при температуре ниже 0°С (например, -20°С или -80°С). Композицию можно дополнительно приготовить для хранения на срок до 2 лет (например, один месяц, два месяца, три месяца, четыре месяца, пять месяцев, шесть месяцев, семь месяцев, восемь месяцев, девять месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 1 год, 1,5 года или 2 года) при 2-8°C (например, 4°C). Таким образом, описанные в данном документе композиции могут быть стабильными при хранении в течение по меньшей мере 1 года при 2-8°С (например, 4°С).

Композиции, включающие sALP и sALP слитые полипептиды (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут быть в различных формах. Эти формы включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), золи или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит, в частности, от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.

Например, композиции, предназначенные для системной или местной доставки, могут быть в виде инъекционных или инфузионных растворов. Соответственно, композиции (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут быть приготовлены для введения парентеральным способом (например, подкожной, внутривенной, внутрибрюшинной или внутримышечной инъекцией). «Парентеральное введение», «вводимые парентерально» и другие грамматически эквивалентные фразы, используемые в данном документе, относятся к способам введения, отличным от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают, без ограничения, подкожную, внутрикожную, внутривенную, интраназальную, внутриглазную, ингаляционную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрилегочную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, внутрисуставную, эпидуральную, внутримозговую, внутричерепную, интракаротидную и внутрисуставную инъекцию и инфузию.

Композиции, включающие sALP и sALP слитые полипептиды (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) можно приготовить в виде раствора, микроэмульсии, золя, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для стабильного хранения при высокой концентрации. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения композиции, описанной в данном документе, в требуемое количество подходящего растворителя с одним или несколькими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости с последующей стерилизацией фильтром. Как правило, золи получают путем включения композиции, описанной в данном документе, в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций, способы получения включают вакуумную сушку и лиофильную сушку, которые производят порошок композиции, описанной в данном документе, плюс любой дополнительный желаемый ингредиент (см. ниже) из их ранее стерильно-фильтрованного раствора. Оптимальную текучесть раствора можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае золя и путем использования поверхностно-активных веществ. Длительная абсорбция инъекционных композиций может быть обеспечена путем включения в состав реагента, который задерживает абсорбцию, например, моностеаратные соли и желатин.

Композиции, описанные в данном документе, также могут быть приготовлены в композициях иммунолипосом. Такие лекарственные формы могут быть получены способами, известными в данной области техники, такими как, например, способами, описанными у Epstein et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:4030; и патенте США № 4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции описаны, например, в патенте США № 5013556.

Композиции, включающие sALP и слитые полипептиды sALP (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) также могут быть приготовлены с носителем, который защитит композицию (например, полипептид sALP или слитый полипептид sALP) от быстрого высвобождения, такой как композиция с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Могут использоваться рассасывающиеся, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. В данной области техники известны многие способы получения таких композиций. См, например, J.R. Robinson (1978) ʺSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,ʺ Marcel Dekker, Inc., New York.

Когда композиции должны использоваться в комбинации со вторым активным агентом, композиции могут быть совместно приготовлены со вторым агентом или композиции могут быть приготовлены отдельно от второй лекарственной формы. Например, соответствующие фармацевтические композиции могут быть смешаны, например, непосредственно перед введением и введены вместе или могут вводиться отдельно, например, в одно и то же или в разное время.

Композиции, включающие sALP и слитые полипептиды sALP (такие как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут быть приготовлены для введения пациенту или, если он вводится плоду, женщине, вынашивающей такой плод, наряду с внутривенной терапией гамма-глобулином (IVIG), плазмаферезом, замещением плазмы или плазменным обменом.

Носители/наполнители

Препараты, содержащие sALP или слитый полипептид sALP (такой как TNALP, например полипептид sALP SEQ ID NO: 1 или вариант полипептида, имеющий по меньшей мере 95% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, например, асфотаза альфа) могут быть предоставлены субъектам, имеющим или склонным к болезни с мышечной слабостью, в сочетании с фармацевтически приемлемыми стерильными водными или неводными растворителями, суспензиями или эмульсиями. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, рыбий жир и инъецируемые органические сложные эфиры. Водные носители включают воду, водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологические и буферные медицинские парентеральные носители, включая раствор хлорида натрия, раствор декстрозы Рингера, декстрозу плюс раствор хлорида натрия, раствор Рингера, содержащий лактозу или жирные масла. Например, фармацевтически приемлемый носитель может включать хлорид натрия и/или фосфат натрия, в котором композиция включает, например, около 150 мМ хлорида натрия и/или около 25 мМ фосфата натрия, рН 7,4.

Внутривенные носители могут включать жидкие и питательные заменители, заменители электролита, такие как те, которые основаны на декстрозе Рингера и тому подобное.Сюда могут быть включены фармацевтически приемлемые соли, например соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и тому подобное; и соли органических кислот, таких как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и тому подобное. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные вещества с рН и тому подобное, могут присутствовать в таких наполнителях. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Следующие примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения описания.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Исследование мышей AKP2^-/-

Нокаутные мыши AKP2 ^-/-создаются путем инактивации гена AKP2, который кодирует мышиный аналог человеческой неспецифической щелочной фосфатазы (TNSALP). Нокаутные мыши AKP2 ^-/-использовались в качестве модели человеческой ГФ, которая воспроизводит ГФ с момента младенчества (Narisawa et al., Dev Dyn. 1997; 208:432-446). В этом примере суммируются эффекты для изучения состава мышечных волокон и силы у мышей AKP2^-/- по сравнению с мышами дикого типа (ДТ), и для определения влияния асфотазы альфа на коррекцию фенотипа мышечной слабости у мышей AKP2^-/-.

В частности, были исследованы камбаловидные мышцы и мышцы-длинные разгибатели пальцев (ДРП). Для определения состава мышечного волокна измеряли или определяли размер и тип волокна. Мышцы отбирали для исследования, делали срезы и подвергали иммуногистохимии с антителами, распознающими тяжелую цепь ламинина или миозина I, IIa или IIB, как описано ранее (см. Barton et al., 2005 J Orthop Res.23: 259-265; Barton et al. 2012 Faseb J.26: 3691-3702; и Evans et al. 2008 Physiol. Genomics35: 86-95). Получение изображений проводили на эпифлуоресцентном микроскопе Leica DMR с использованием программного обеспечения OpenLab. Размер и тип волокна определяли с использованием MatLAB, где сигнал ламинина определял границу каждого мышечного волокна, а антитела против миозина определяли тип волокна.

Для определения силы мышечного волокна, сократительных свойств камбаловидных и мышц ДРП, мыши наблюдались около 2 недель с момента рождения. Свойства, подлежащие измерению, включают: способность развивать максимальную силу с использованием 120 и 100 Гц при сверхмаксимальном стимулирующем токе; удельная сила (сила на площадь поперечного сечения, частота силы посредством обработки кальция и/или различия в типе волокон, а также усталость с длительностью стимуляции 330 мсек каждые 1 сек (коэффициент заполнения 33%). Влияние уровня PPi на сократительную функцию камбаловидных и мышц ДРП измеряли посредством воздействия на иссеченные мышцы диапазона концентраций PPi (например, 2, 4, 8 и 10 мкМ). В одном эксперименте, в качестве примера, мышцы группы 1 подвергались воздействию 1 и 8 мкМ или 4 и 10 мкМ, а мышцы группы 2 подвергались воздействию 4 и 8 мкМ или 2 и 10 мкМ.

В результате, различия в соотношении типа волокна не наблюдались между камбаловидными мышцами мышей AKP2^-/- и камбаловидными мышцами мышей дикого типа (ДТ) (фиг. 1). По сравнению с мышцами мышей дикого типа (ДТ), мышцы AKP2^-/-имели везде меньшие волокна (фиг. 2). Например, мышца AKP2^-/- имела больший процент волокон типа 1 (фиг. 2B), волокна типа IIa (фиг. 2C) и волокон типа IIb (фиг. 2D) меньшего размера (например, менее 260 мкм²). Интересно, что мышца AKP2^-/-имела небольшую численность больших волокон миозина IIb, тогда как мышцы дикого типа не имели таких волокон (фиг. 2D). Одним из факторов, который может объяснить это, является небольшая доля волокон IIb в камбаловидной мышце (~ 2%). Сформированные камбаловидные мышцы редко имеют волокна IIb, но несформированные мышцы имеют быстрый мышечный фенотип, в сравнении со зрелыми мышцами, и поэтому остаточные волокна IIb все еще проявляются на этой стадии. В совокупности, мышь Akp2^-/-имела меньшие волокна без видимых изменений типа волокна.

Отдельное тестирование функционирования мышц проводилось на камбаловидных и мышцах ДРП 2-недельных мышей AKP2^-/- и контрольных ДТ. Как самцы, так и самки тестировались для установления любых различий в развитии силы в зависимости от пола.

Способность развивать максимальную силу тестировалась с использованием 120 и 100 Гц для ДРП и камбаловидной мышцы при сверхмаксимальном стимулирующем токе. Удельная сила (сила на площадь поперечного сечения) определялась для всех мышц. Статистической разницы в силе между разными видами или разными полами не было. Взаимосвязи частоты силы также определялись как оценка обработки кальция и/или различий в типах волокон. Видимых различий между группами не было. Также проводились тесты на усталость с использованием длительности стимуляции 330 мсек каждые 1 сек (коэффициент заполнения 33%). Видимых различий между группами не было. Как показано на фигуре 3, между камбаловидными мышцами мышей AKP2^-/- и камбаловидными мышцами мышей дикого типа (ДТ) не наблюдалось различий в массе (фиг. 3А), силе (фиг. 3В), частоте силы (фиг. 3C), или параметрах усталости (фиг. 3D). Точно так же, между мышцами ДРП мышей AKP2^-/- и мышцами ДРП мышей дикого типа (ДТ) не наблюдалось различий для массы (фиг. 4A), силы (фиг. 4B), частоты силы (фиг. 4C), или параметрах усталости (фиг. 4D). Обратите внимание, что для фигур частоты и усталости, для наглядности, планки погрешности не отображены. Хотя N был низким (N=3) для результатов усталости и частоты силы, отсутствие каких-либо явных различий между группами свидетельствует о том, что действительно не было никакой разницы. Этот результат согласуется с распределением типа волокна, измеренного ранее (фиг. 2).

У всех пациентов с ГФ, пациентов с CPPD и у мышей Akp2^-/-имелся повышенныйPPi в крови. Таким образом, вполне вероятно, что эти повышенные уровни компенсируются мышцами. Затем тестировалось влияние концентрации PPi на сократительные функции мышц. Экспериментальное исследование проводили с использованием 10 мкМ PPi, но при этом мышцы дикого типа (ДТ) демонстрировали обратимую потерю в развитии силы при воздействии 10 мкМ PPi. Влияние высокого PPi на силу мышц мышей ДТ и Akp2^-/- затем тестировалось в диапазоне концентраций, которые испытывались (2, 4, 8, 10 мкМ) для корректировки физиологического уровня, обнаруженного у мышей Akp2^-/- и пациентов с ГФ. Исходную когорту мышц тестировали с 2 и 8 мкМ, или с 4 и 10 мкМ концентрацией PPi. Вторую когорту мышц тестировали с 4 и 8 или 2 и 10 мкМ. Мышцы были сначала протестированы в обычном растворе Рингера, затем два тестовых условия в течение 30 минут каждое, и заканчивали возвратом к нормальному Рингеру. Данные по мышцам, которые не возвращались к исходным значениям силы в нормальном Рингере, не учитывались. Как показано на фигуре 5B, мышцы ДРП мышей AKP2^-/-более чувствительны к повышенным PPi, чем мышцы ДРП мышей дикого типа (ДТ). Например, более 4 мкМ PPi уменьшали относительную силу мышц ДРП мышей AKP2^-/-, тогда как относительная сила мышц ДРП мышей дикого типа (ДТ) резко не изменялась, если концентрация PPi не была по меньшей мере 10 мкМ ( фиг. 5В). Напротив, камбаловидные мышцы мышей AKP2^-/- и мышей дикого типа (ДТ) были чувствительны к повышенному PPi в той же степени (фиг. 5A).

Можно было провести дополнительные эксперименты по изучению эффектов PPi. Например, при повышенных значениях PPi может изменяться частота силы или утомляемость, что усугубляет слабость. Если продолжать таким образом, использование одной концентрации PPi (например, 8 мкМ) упростит исследование.

Затем мышам AKP2^-/- вводили асфотазу альфа, чтобы определить, существует ли корреляция между уменьшенной мышечной силой и увеличенными уровнями PPi в крови у мышей AKP2^-/- и оценить эффективность асфотазы альфа при коррекции связанного фенотипа. Поскольку мыши AKP2^-/- без лечения обычно умирают примерно в возрасте 12 дней (продолжительность жизни может быть увеличена до 18-20 дней, если добавлять пиридоксин, но это не существенно для измерения мышц) и слишком малы для измерения силы мышц in vivo,, было трудно использовать мышей AKP2^-/- без лечения в качестве контроля для анализа эффекта от воздействия асфотазы альфа. Вместо этого использовали эксперимент с исключением. В частности, мышей AKP2^-/-лечили асфотазой альфа с рождения до 35 дней. В то же время, некоторые мыши выводились из лечения, и их концентрацию PPi и силу мышц измеряли и сравнивали с концентрацией мышей, получавших непрерывное лечение. Итог плана исследования обобщен ниже:

Таблица 2. Oткрытое лечение с параллельным и рандомизированным контролем плана лечения.

ДТ: представляет собой однопометника дикого типа мышей Akp2^-/-

8,2 мг/кг асфотазы альфа вводили подкожно (ПК) мышам AKP2^-/- один раз в день с момента рождения до 35-го дня после рождения. Половина нокаутных мышей затем продолжала получать подкожное введение асфотазы альфа в том же режиме дозирования, в то время как другая половина получала подкожное введение контрольного носителя в том же режиме дозирования. В День 42 обе группы мышей AKP2^-/-, а также мыши дикого типа (ДТ) C57BL/6-129J, без лечения, тестировались на силу захвата.

Проводилось пять испытаний. Среди этих испытаний показатели усреднялись и нормировались по весу тела. Измеряли силу захвата передних и задних конечностей и сравнивали с мышами дикого типа (ДТ), мышами AKP2^-/-, получавшими непрерывное лечение (Tx-Tx), и мышами AKP2^-/- с прерванным лечением после 35-го дня (Tx-V). Мыши AKP2^-/-, получающие непрерывное лечение (Tx-Tx), демонстрировали более сильную силу захвата передних и задних конечностей по сравнению с мышами AKP2^-/- с прерванным лечением после 35-го дня (Tx-V), демонстрируя положительный эффект непрерывного лечения асфотазой альфа при болезни с мышечной слабостью (фиг. 6).

Эти исследования мышей предполагают, что мышечная слабость (наблюдаемая при ГФ) присутствует в мышиной модели. Более удивительно, они предполагают, что мышечная слабость при в ГФ, вероятно, не обусловлена дефектом костной ткани (который воспринимается как характерная особенность ГФ), так как разница между мышами дикого типа (ДТ) и мышами AKP2^-/-не наблюдалась в соотношении типа волокна, сократительных свойствах ex vivo или камбаловидной или мышцы ДРП, даже при том, что мыши AKP2^-/-, в некоторой степени, имели меньшие мышечные волокна. Напротив, мышечная слабость при ГФ больше коррелировала с повышенной концентрацией PPi, так как снижение PPi путем введения асфотазы альфа улучшило силу захвата мышц мышей AKP2^-/-. Таким образом, пациент-человек, страдающий болезнью с мышечной слабостью, характеризующийся повышенной концентрацией PPi, даже без других симптомов ГФ или еще без диагноза ГФ, в любом случае может получать лечение асфотазой альфа. Аналогичным образом, пациенты, имеющие или склонные к другим болезням с мышечной слабостью, например, пациенты с CPPD и пациенты с наследственной гипофосфатемией, также могут лечиться путем уменьшения повышенных PPi или других субстратов щелочной фосфатазы (например, PLP, PEA и т.д.) посредством введения асфотазы альфа.

Пример 2. Лечение мышечной слабости у людей

Как показано в исследованиях, описанных выше с нокаутными мышами AKP2^-/-, существует корреляция между повышенными циркулирующими уровнями PPi (в связи со снижением активности щелочной фосфатазы) и уменьшением мышечной силы. Такая корреляция может также существовать у пациентов с ГФ. Лечение асфотазой альфа также может быть эффективным для коррекции фенотипа мышечной слабости пациентов с ГФ или пациентов с другими заболеваниями с мышечной слабости, характеризующихся низкой щелочной фосфатазной активностью и/ или повышенной концентрацией PPi (например, при CPPD и/или наследственной гипофосфатемии). В этом примере описаны способы идентификации субпопуляции пациентов с болезнью с мышечной слабостью (например, ГФ, CPPD, наследственной гипофосфатемии и т.д.) с низкой щелочной фосфатазной активностью и/или повышенной концентрацией PPi, а также способы лечения или уменьшения фенотипа мышечной слабости у пациента в такой субпопуляции с асфотазой альфа. Пациент может быть идентифицирован как один из такой субпопуляций, если имеет повышенную концентрацию PPi (или повышенную концентрацию по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы, такого как PLP и PEA), и фенотип мышечной слабости (например, потеря мышечной силы). Кроме того, пациент может быть идентифицирован как имеющий концентрацию с низкой щелочной фосфатазой (таблица 4).

Таблица 3. Низкие и нормальные концентрации щелочной фосфатазы у женщин и мужчин по возрастным группам.

Идентификация болезни или фенотипа с мышечной слабостью может выполняться с использованием обычных технологий, известных в данной области техники. Измерение концентрации PPi (или PLP, PEA или других щелочных фосфатаз) у такого пациента также может быть проведено с использованием обычных технологий, известных в данной области техники, и их можно сравнить с концентрацией PPi нормальных субъектов или субъектов без такого заболевания с мышечной слабостью или фенотипа (Таблица 3). Повышенную концентрацию PPi затем можно определить посредством этого сравнения.

Таблица 4. Нормальные диапазоны уровней пирофосфата (PPi) у младенцев и детей, подростков и взрослых.

Чаще всего уровень активности щелочной фосфатазы в сыворотке или плазме измеряется и сравнивается с нормативными данными, регулируемыми по возрасту и полу. Исследования с нокаутными мышами AKP2^-/-проводили на камбаловидных мышцах и ДРП, чтобы понять лежащую в основе этиологию гипотонуса, что считалось бы чрезмерно инвазивным тестом, если бы проводилось на людях. Кроме того, поскольку мышечная ткань мыши является физиологически пластичной, данные по мышиной мышце, как ожидается, будут менее подвержены влиянию, чем соответствующая мышечная ткань человека. Тем не менее, небольшие изменения в реакции мыши коррелируют с более крупным ответом в мышечной ткани человека. Кроме того, поскольку PPi не является коммерчески доступным анализом, активность щелочной фосфатазы является принятым суррогатным маркером уровней PPi (и является обратно коррелятивным).

Те же или разные мышцы могут быть протестированы для диагностики болезней с мышечной слабостью или фенотипов у животных или людей. Например, другие скелетные или полосатые мышцы, или сердечные или гладкие мышцы могут быть испытаны на различные свойства. Например, пассивные механические свойства (например, свойства пяточного сегмента) мышц (например, икроножной мышцы и ахиллова сухожилия) могут быть испытаны с помощью способов, известных в данной области техники. Также можно протестировать вязкоупругое свойство жесткости мышц.

Ранее было показано, что асфотаза альфа эффективна для лечения пациентов с ГФ, и дозировка 3, 6 или 9 мг/кг/неделю была предложена для подкожного введения три раза в неделю или один раз в день. Тот же режим дозирования или какой-либо другой после аналогичных исследований, как показано в Примере 1, может быть предоставлен пациентам с ГФ, пациентам с CPPD или пациентам с гипофосфатемией без ГФ для лечения фенотипа мышечной слабости. Чтобы проверить эффект лечения, можно использовать ряд показателей. Некоторые такие показатели, используемые при лечении ГФ, включают, например, тест двигательных умений Бруйнинкса-Озерецкого 2-го издания (BOT-2), показатель рентгенографической общей оценки изменений (RGI-C) (7-балльная шкала, в которой оценка -3 представляет собой серьезное ухудшение, а оценка +3 указывает на частичное или полное выздоровление), шкалы развития младенцев и детей Бейли, 3-е издание (BSID-III), опросник оценки состояния детей (CHAQ), инструмент сбора педиатрических данных (PODCI), шкалы оценки моторного развития Пибоди, 2-е издание (PDMS-2), тест с шестиминутной ходьбой (6MWT), оценку мобильности, ориентированную на производительность, состоящую из 12-ти пунктов (POMA-G), модифицированную оценку мобильности, ориентированную на производительность (mPOMA-G, такую как, приведенную у Phillips et al., 2015 Bone Abstracts4: P136) и другие способы или тесты, известные в данной области техники. Как наивных пациентов, так и пациентов, которым проводилась другая терапия щелочной фосфатазой, можно лечить асфотазой альфа или другими родственными полипептидами, имеющими активность щелочной фосфатазы.

Пример 3. Лечение мышечной слабости у пациента 1

Пациент был идентифицирован, как имеющий гипотонус в сочетании с низким ALP (коррелируемым с высоким PPi), повышенным PLP и повышенным мочевым PEA. 6-летний пациент был представлен с симптомами гипотонуса с неизвестной этиологией. Дополнительные состояния пациента включали атрофию мозжечка, аксональную сенсорную и моторную периферическую полинейропатию и задержку развития, с клиническими и биохимическими данными, подтверждающими диагноз гипофосфатазии (ГФ). Пациент проходил физическую терапию с рождения и никогда не мог ходить без поддержки и полностью использовал инвалидное кресло. Пациент был не способен есть самостоятельно, был зависим от гастростомической трубки (G-tube) и был способен самостоятельно питаться только глотками молока и проявлял как рецептивную, так и экспрессивную задержку речи.

Первоначальная эндокринная оценка была частью многопрофильной клиники мышечной дистрофии, где пациент не произносил ни одного слова во время всего посещения и использовал только компьютерное устройство связи. Несколько врачей практически не подтвердили способность к говорению, за исключением нескольких отдельных слов, которые пациент смог повторить во время неврологической оценки. Пациент использовал небулайзер с пульмикортом. Первоначальные лабораторные данные были следующими: ALP 149 (нормальный 150-420 ед/л); PLP 172,4 (нормальный диапазон 20-125 нмоль/л); и мочевой PEA 180 (нормальный 0-106 нмоль/мгКр).

Подкожные инъекции асфотазы альфа по 6 мг/кг/ неделю были начаты через три месяца после первоначального посещения пациента. После трех месяцев на контрольном приеме родители сообщили, что с момента начала лечения у пациента, вероятно, появилось больше силы, в положении стоя и осуществил переход от инвалидного кресла к началу использования ходунков. Пациент показал улучшение способности нагружать ногу, хотя пациент все еще нуждался в значительной поддержке. Пациент был способен передвигаться на ногах и продемонстрировал некоторое владение верхними конечностями с довольно хорошей силой. В целом был отмечен улучшенный постуральный контроль туловища и шеи пациента. Эти улучшения были связаны с общим улучшением общего мышечного тонуса и силой мышц пациента, подтверждая гипотезу, полученную на основе мышиных данных in vitro.

Несколько медицинских специалистов и родители отметили заметное повышение способности к говорению у пациента. Улучшение было также отмечено у пациента в общем владении языка, включая использование большего количества слов и объединение слов для формирования простых предложений. Повышенная способность говорения у пациента также может быть результатом улучшения мышечного тонуса и силы в ответ на лечение.

В частности, после 3 месяцев, на контрольном приеме отмечены следующие улучшения после лечения асфотазой альфа: улучшение скорости роста (5,8 см/год по сравнению с 1,3 см в год до лечения); улучшение силы; улучшение речи, то есть высказывания слов спонтанно и даже формирование простых предложений; и улучшение минеральной плотности костей на 0,5 SD в поясничном отделе позвоночника.

Пациент потерял два зуба за месяц до начала лечения асфотазой альфа. В рентгенографических исследованиях, рентгеновские снимки запястий показали снижение минерализации костной ткани, но в остальном они были нормальными, рентгеновские снимки колен показали снижение минеральной плотности костной ткани, плоских костей и аномальных большеберцовых эпифизов. Пациент демонстрировал данные низкой минеральной плотности костной ткани. На начальном этапе, DXA-сканирование показало Z-баллы -4,6 и -3,3 для поясничного отдела и всего тела, соответственно, исключая голову. Повторное DXA-сканирование, проведенное через 3 месяца после начала лечения асфотазой альфа, показало улучшенные Z-баллов LBD на 0,5 SD, хотя Z-балл был все еще низким. Z-баллы плотности костной ткани (BMD) составляли -4,1 и -3,3 для поясничного отдела, и всего тела, соответственно, за исключением головы. У пациента наблюдался идиопатический перелом плечевой кости примерно через месяц после начала лечения; лечение асфотазой альфа продолжалось, и перелом хорошо срастался. Ультразвуковое исследование почек и исследование глаз были нормальными на начальном этапе.

Пример 4. Лечение мышечной слабости у пациента 2

Второй пациент был идентифицирован как имеющий гипотонус в сочетании с низким ALP (коррелируемым с высоким PPi), повышенным PLP и повышенным мочевым PEA. Также отмечалось, что 12-летний пациент с хромосомной дупликацией, задержкой развития, расстройством аутического спектра (синдромом Аспергера) и сложностью сенсорной обработки имеет низкий уровень ALP на уровне 90 ед/л (нормальный диапазон 141-460). Повторный уровень снова был низким на уровне 91 (при тестировании через 4 дня). Пациент уставал очень быстро, т.е. должен был отдыхать при выполнении повседневных действий, включая минимальную ходьбу, и не мог ходить на большие расстояния. Пациент также жаловался на непонятную боль в плечах, верхней части спины и других областях. Пациент указал, что он иногда просыпается от боли и с болью в плечах и имеют постоянную боль в ногах.

У пациента не было в анамнезе преждевременной потери зубов или переломов. Первоначальная оценка реабилитационной терапии показала балл мелкой моторики 13 (1-й процентиль). Возрастные эквиваленты для скорости ответа составляли 6,2 года. Визуально-моторный контроль показал многолетнюю задержку, то есть на уровне 7,9 года. Для скорости и ловкости верхних конечностей пациент находился на уровне 4,7 лет. Однако, в отношении потери зубов, семейный анамнез показал, что один из родителей начал носить зубные протезы, несмотря на возраст 21 год, и аналогично, у дедушки и бабушки по материнской линии также была преждевременная потеря коренных зубов и в раннем возрасте носили протезы. Уровень ALP матери был определен как 50 ед/л (диапазон нормальных значений лабораторного анализа 40-150). Первоначальные лабораторные показатели пациента были: ALP 82 (нормальный 150-420 ед/л); PLP 210 (нормальный диапазон 20-125 нмоль/л); и мочевой PEA 46 (нормальный 0-44 нмоль/мгКр).

Хотя у пациента не было в анамнезе преждевременной потери зубов, у нескольких членов семьи была преждевременная потеря зубов. Рентгенографический анализ показал нормальные рентгеновские снимки запястья и колен. Анализ минеральной плотности кости посредством DXA-сканирование показал нормальную BMD (L1-L4 Z-балл 2,1, TBLH (всего тела, за исключением головы) (Z-балл 2,4). У пациента в анамнезе не было переломов. Пациент сообщил о боли, присутствующей в нескольких местах в разное время, включая частые боли в ногах, достаточные для нарушения сна, боль на подошвенной поверхности ног при 5-10 минутах стоячего положения/ходьбы, напряжении/боли в квадрицепсах с усталостью, двусторонней боли в колене, и неопределенной боли в плече/груди. Ультразвук почек не выявил нефрокальциноз. Пациент постоянно находился на уровне 90%-ного перцентиля по росту и 92%-ного перцентиля по весу.

У пациента не было значительных нарушений физической активности, когда он полностью отдыхал, однако, он демонстрировал усталость квадрицепса с нарушенным контролем коленного сустава и двусторонним постукиванием ногами из-за слабой дорсальной флексии после двигательной активности более двух минут. Пациент был в состоянии ходить на пальцах ног, но продемонстрировал значительные компенсации при попытке ходить на пятках. Первоначальный тест пациента с шестиминутной ходьбой был 320 метров, значительно ниже нормы по возрасту/полу=672+55 метров. Пациент потребовал двух постоянных перерывов на отдых, опираясь на стену, дополнительно по отношению к усталости. Пациент демонстрировал постепенное увеличение нарушения походки, включая усталость квадрицепса и постукивание ногами из-за слабости дорсифлексии, а также нуждался в перерыве в виде сидения после 6MWT. У пациента были проблемы с физическими упражнениями и быстро запыхивался.

Пациент начинал подкожные инъекции асфотазой альфа по 6 мг/кг/неделю и повторно осматривался через 4 месяца лечения. В целом, пациент показал некоторые улучшения, в том числе в силе, ловкости и выносливости. Тест пациента с 6-минутной ходьбой улучшился до 597 метров (по сравнению с исходным значением 320 метров). В целом, после лечения пациент имел меньшую боль (оценка 2 из 10, а не 5 из 10, установленная во время предыдущего осмотра) и лучшую мобильность. Эти улучшения были связаны с общим улучшением общего мышечного тонуса и силой мышц пациента, подтверждая гипотезу, полученную на основе мышиных данных in vitro.

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном изобретении, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки в полном объеме. Различные модификации и варианты описанных способов, фармацевтических композиций и наборов по изобретению будут понятны специалистам в данной области техники в пределах объема, заявленного изобретения. Хотя изобретение описано в связи с конкретными вариантами реализации, следует понимать, что оно способно дополнительно модифицироваться и, что заявляемое изобретение не может быть ограничено такими конкретными вариантами реализации.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Alexion Pharmaceuticals, Inc.

<120> ЛЕЧЕНИЕ МЫШЕЧНОЙ СЛАБОСТИ С ПОМОЩЬЮ ЩЕЛОЧНЫХ ФОСФАТАЗ

<130> 50694-070WO1

<150> US 62/317,125

<151> 2016-04-01

<160> 20

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 726

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 1

Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala

1 5 10 15

Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr Asn

20 25 30

Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser

35 40 45

Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro

50 55 60

Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala Leu

65 70 75 80

Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr

85 90 95

Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val Gly

100 105 110

Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly Asn

115 120 125

Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser Val

130 135 140

Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala Ala

145 150 155 160

Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met Pro

165 170 175

Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Met

180 185 190

His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys Tyr

195 200 205

Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu Lys

210 215 220

Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp Lys

225 230 235 240

Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg Thr

245 250 255

Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly Leu

260 265 270

Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val Thr

275 280 285

Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu Arg

290 295 300

Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp

305 310 315 320

His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala Val

325 330 335

Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser Glu

340 345 350

Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr Phe

355 360 365

Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Met

370 375 380

Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly Asn

385 390 395 400

Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser Met

405 410 415

Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro Leu

420 425 430

Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys Gly

435 440 445

Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val Pro

450 455 460

His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His Cys

465 470 475 480

Ala Pro Ala Ser Ser Leu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

485 490 495

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

500 505 510

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

515 520 525

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

530 535 540

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

545 550 555 560

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

565 570 575

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

580 585 590

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

595 600 605

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

610 615 620

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

625 630 635 640

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

645 650 655

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

660 665 670

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

675 680 685

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

690 695 700

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Ile Asp Asp Asp Asp

705 710 715 720

Asp Asp Asp Asp Asp Asp

725

<210> 2

<211> 524

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn

1 5 10 15

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

20 25 30

Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

65 70 75 80

Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu

305 310 315 320

Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser

355 360 365

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His

485 490 495

Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu

500 505 510

Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe

515 520

<210> 3

<211> 524

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn

1 5 10 15

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

20 25 30

Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

65 70 75 80

Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu

305 310 315 320

Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser

355 360 365

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His

485 490 495

Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu

500 505 510

Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe

515 520

<210> 4

<211> 524

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn

1 5 10 15

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

20 25 30

Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

65 70 75 80

Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu

305 310 315 320

Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser

355 360 365

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His

485 490 495

Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu

500 505 510

Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe

515 520

<210> 5

<211> 524

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn

1 5 10 15

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

20 25 30

Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

65 70 75 80

Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Arg Tyr Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu

305 310 315 320

Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser

355 360 365

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His

485 490 495

Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu

500 505 510

Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe

515 520

<210> 6

<211> 524

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn

1 5 10 15

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

20 25 30

Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

65 70 75 80

Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ser Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asp Thr Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu

305 310 315 320

Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Leu Thr Ser Ser

355 360 365

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Val

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Gly His

485 490 495

Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu

500 505 510

Leu Ala Leu Ala Leu Tyr Pro Leu Ser Val Leu Phe

515 520

<210> 7

<211> 652

<212> Белок

<213> Macaca mulatta

<400> 7

Met Pro Thr Val Lys Thr Lys Gln Glu Ser His Ala Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Pro Arg Leu Ala Glu Arg Lys Gly Arg Val Gly Ala Ala Arg Arg

20 25 30

Gln Ser Pro Arg Ala Pro Gly Gly Gly Leu Pro Gly Pro Arg Ser Gly

35 40 45

Pro Ala Ala Ala Phe Ile Arg Arg Arg Gly Arg Trp Pro Gly Pro Arg

50 55 60

Cys Ala Pro Ala Thr Pro Arg Pro Arg Ser Arg Leu Cys Ala Pro Thr

65 70 75 80

Arg Leu Cys Leu Asp Glu Pro Ser Ser Val Leu Cys Ala Gly Leu Glu

85 90 95

His Gln Leu Thr Ser Asp His Cys Gln Pro Thr Pro Ser His Pro Arg

100 105 110

Arg Ser His Leu Trp Ala Ser Gly Ile Lys Gln Val Leu Gly Cys Thr

115 120 125

Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn

130 135 140

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

145 150 155 160

Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr

165 170 175

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

180 185 190

Ser Thr Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

195 200 205

Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala

210 215 220

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

225 230 235 240

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

245 250 255

Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly

260 265 270

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

275 280 285

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

290 295 300

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

305 310 315 320

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

325 330 335

Val His Asn Ile Arg Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

340 345 350

Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Lys Thr Asp Val Glu Tyr Glu Ile Asp Glu

355 360 365

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Val Asn Ile Trp

370 375 380

Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Phe Ile Trp Asn Arg

385 390 395 400

Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro His Asn Val Asp Tyr Leu Leu Gly

405 410 415

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Glu Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val

420 425 430

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Val Val Ala Ile Gln Ile Leu

435 440 445

Arg Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

450 455 460

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

465 470 475 480

Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ser Met Thr Ser Leu

485 490 495

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

500 505 510

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

515 520 525

Met Leu Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

530 535 540

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

545 550 555 560

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

565 570 575

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ser Lys

580 585 590

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile

595 600 605

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His

610 615 620

Cys Ala Pro Ala Ser Ser Ala Gly Ser Leu Ala Ala Gly Pro Leu Leu

625 630 635 640

Leu Pro Leu Ala Leu Phe Pro Leu Ser Ile Leu Phe

645 650

<210> 8

<211> 524

<212> Белок

<213> Rattus norvegicus

<400> 8

Met Ile Leu Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Pro Cys Leu Thr Asn

1 5 10 15

Ser Phe Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Ser Tyr Trp Arg Gln Gln

20 25 30

Ala Gln Glu Thr Leu Lys Asn Ala Leu Lys Leu Gln Lys Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Ile Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

65 70 75 80

Thr Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Thr Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Arg Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Lys Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Ile Ser Ile Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Leu Ala Leu Asp Pro Ser Arg Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Leu

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Val Ala Leu Arg Ile Leu

305 310 315 320

Thr Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Glu Ala Ile Gly Lys Ala Gly Thr Met Thr Ser Gln

355 360 365

Lys Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Asp Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ser Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His

485 490 495

Cys Ala Trp Ala Ser Ser Ala Ser Ser Pro Ser Pro Gly Ala Leu Leu

500 505 510

Leu Pro Leu Ala Leu Phe Pro Leu Arg Thr Leu Phe

515 520

<210> 9

<211> 502

<212> Белок

<213> Canis lupus familiaris

<400> 9

Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala Gln Gln Thr Leu Lys

1 5 10 15

Tyr Ala Leu Arg Leu Gln Asn Leu Asn Thr Asn Val Ala Lys Asn Val

20 25 30

Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Thr

35 40 45

Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro Gly Glu Glu Thr Arg

50 55 60

Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn

65 70 75 80

Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala Thr Ala Tyr Leu

85 90 95

Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val Gly Val Ser Ala Ala Thr

100 105 110

Gln Arg Thr His Cys Asn Thr Thr Gln Gly Asn Glu Val Thr Ser Ile

115 120 125

Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser Val Gly Ile Val Thr Thr

130 135 140

Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala Ala Tyr Ala His Ser Ala

145 150 155 160

Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met Pro Pro Glu Ala Leu Ser

165 170 175

Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu Met His Asn Val Lys Asp

180 185 190

Ile Glu Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe Pro Lys Asn

195 200 205

Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Met Asp Glu Lys Ser Thr Gly Ala Arg

210 215 220

Leu Asp Gly Leu Asn Leu Ile Asp Ile Trp Lys Asn Phe Lys Pro Arg

225 230 235 240

His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Leu Ala Leu

245 250 255

Asp Pro Tyr Thr Val Asp Tyr Leu Leu Gly Leu Phe Asp Pro Gly Asp

260 265 270

Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val Thr Asp Pro Ser Leu Ser

275 280 285

Glu Met Val Glu Ile Ala Ile Lys Ile Leu Ser Lys Lys Pro Arg Gly

290 295 300

Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His Glu

305 310 315 320

Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala Val Glu Met Asp Arg Ala

325 330 335

Ile Gly Lys Ala Gly Val Met Thr Ser Leu Glu Asp Thr Leu Thr Val

340 345 350

Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr Phe Gly Gly Tyr Thr Pro

355 360 365

Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Met Val Ser Asp Thr Asp

370 375 380

Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Lys

385 390 395 400

Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser Met Val Asp Tyr Ala His

405 410 415

Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro Leu Arg His Glu Thr His

420 425 430

Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys Gly Pro Met Ala His Leu

435 440 445

Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile Pro His Val Met Ala Tyr

450 455 460

Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Gln Asp His Cys Ala Ser Ala Ser Ser

465 470 475 480

Ala Gly Gly Pro Ser Pro Gly Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu

485 490 495

Pro Val Gly Ile Leu Phe

500

<210> 10

<211> 252

<212> Белок

<213> Sus scrofa

<400> 10

Ala Glu Leu Leu Ala Leu Asp Pro His Thr Val Asp Tyr Leu Leu Gly

1 5 10 15

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Val

20 25 30

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Met Ala Ile Arg Ile Leu

35 40 45

Ile Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

50 55 60

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

65 70 75 80

Val Glu Met Asp Arg Ala Ile Glu Gln Ala Gly Ser Met Thr Ser Val

85 90 95

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

100 105 110

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

115 120 125

Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

130 135 140

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

145 150 155 160

Met Val Asp Tyr Ala His Asp Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

165 170 175

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Ile Phe Ala Arg

180 185 190

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile

195 200 205

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Val Gly Ala Asn Arg Asp His

210 215 220

Cys Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ser Pro Ser Pro Gly Pro Leu Leu

225 230 235 240

Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Gly Ile Leu Phe

245 250

<210> 11

<211> 524

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 11

Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn

1 5 10 15

Ser Phe Val Pro Glu Lys Glu Arg Asp Pro Ser Tyr Trp Arg Gln Gln

20 25 30

Ala Gln Glu Thr Leu Lys Asn Ala Leu Lys Leu Gln Lys Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

65 70 75 80

Thr Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Thr Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Lys Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Ile Ser Ile Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Leu Ala Leu Asp Pro Ser Arg Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Leu

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Val Ala Leu Arg Ile Leu

305 310 315 320

Thr Lys Asn Leu Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Gln Ala Ile Gly Lys Ala Gly Ala Met Thr Ser Gln

355 360 365

Lys Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Asp Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ser Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His

485 490 495

Cys Ala Trp Ala Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ser Pro Gly Ala Leu Leu

500 505 510

Leu Pro Leu Ala Val Leu Ser Leu Arg Thr Leu Phe

515 520

<210> 12

<211> 524

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 12

Met Ile Ser Pro Phe Leu Leu Leu Ala Ile Gly Thr Cys Phe Ala Ser

1 5 10 15

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

20 25 30

Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn Ala Leu Arg Leu Gln Thr Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Ser

65 70 75 80

Pro Gly Glu Glu Thr Lys Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Tyr Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Gln Arg Ser Gln Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ser Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Lys Asp Ile Glu Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Phe Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asn Leu Ile Asp Ile Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Lys His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Asp Leu Leu Ala Leu Asp Pro His Ser Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Ala

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Met Ala Ile Arg Ile Leu

305 310 315 320

Asn Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Gln Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ala Met Thr Ser Val

355 360 365

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Arg Asp His

485 490 495

Cys Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ser Pro Ser Pro Gly Pro Leu Leu

500 505 510

Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Gly Ser Leu Phe

515 520

<210> 13

<211> 524

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 13

Met Ile Ser Pro Phe Leu Leu Leu Ala Ile Gly Thr Cys Phe Ala Ser

1 5 10 15

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

20 25 30

Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn Ala Leu Arg Leu Gln Thr Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Ser

65 70 75 80

Pro Gly Glu Glu Thr Lys Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Tyr Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Gln Arg Ser Gln Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ser Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Ile Lys Asp Ile Glu Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Phe Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asn Leu Ile Asp Ile Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Lys His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Asp Leu Leu Ala Leu Asp Pro His Ser Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Ala

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Met Ala Ile Arg Ile Leu

305 310 315 320

Asn Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Gln Ala Ile Gly Gln Ala Gly Ala Met Thr Ser Val

355 360 365

Glu Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Arg Asp His

485 490 495

Cys Ala Ser Ala Ser Ser Ser Gly Ser Pro Ser Pro Gly Pro Leu Leu

500 505 510

Leu Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Gly Ser Leu Phe

515 520

<210> 14

<211> 124

<212> Белок

<213> Bos taurus

<400> 14

Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn Ala

1 5 10 15

Leu Gly Leu Gln Lys Leu Asn Thr Lys Val Ala Lys Asn Val Ile Leu

20 25 30

Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile

35 40 45

Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu

50 55 60

Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn

65 70 75 80

Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly Thr Ala Pro His Pro Val Arg Val

85 90 95

Lys Ala Met Arg Ala Pro Trp Gly Glu Pro His Gln Arg Gln Cys Asn

100 105 110

Thr Arg Arg Ala Thr Ser Thr His Leu Leu Ala Gly

115 120

<210> 15

<211> 524

<212> Белок

<213> Felis catus

<400> 15

Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn

1 5 10 15

Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln

20 25 30

Ala Gln Gln Thr Leu Lys Asn Ala Leu Arg Leu Gln Lys Leu Asn Thr

35 40 45

Asn Val Val Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val

50 55 60

Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn

65 70 75 80

Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Tyr Val Ala

85 90 95

Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly

100 105 110

Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val

115 120 125

Gly Val Ser Ala Ala Thr Gln Arg Thr Gln Cys Asn Thr Thr Gln Gly

130 135 140

Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ser Gly Lys Ser

145 150 155 160

Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala

165 170 175

Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met

180 185 190

Pro Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu

195 200 205

Met His Asn Val Arg Asp Ile Glu Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Phe Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Met Asp Glu

225 230 235 240

Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asn Leu Val Asp Ile Trp

245 250 255

Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Leu Thr Leu Asp Pro Tyr Gly Val Asp Tyr Leu Leu Gly

275 280 285

Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Ser Thr

290 295 300

Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Ile Ala Ile Lys Ile Leu

305 310 315 320

Ser Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile

325 330 335

Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala

340 345 350

Val Glu Met Asp Gln Ala Ile Gly Arg Ala Gly Ala Met Thr Ser Val

355 360 365

Glu Asp Thr Leu Thr Ile Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr

370 375 380

Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro

385 390 395 400

Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ser Ile Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Gly Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser

420 425 430

Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys

450 455 460

Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile

465 470 475 480

Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ala Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His

485 490 495

Cys Ala Ser Ala Ser Ser Ala Gly Gly Pro Ser Pro Gly Pro Leu Phe

500 505 510

Leu Leu Leu Ala Leu Pro Ser Leu Gly Ile Leu Phe

515 520

<210> 16

<211> 532

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 16

Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn

20 25 30

Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala

35 40 45

Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly

50 55 60

Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp

65 70 75 80

Lys Leu Gly Pro Glu Thr Phe Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val

85 90 95

Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Ser Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly

100 105 110

Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr

115 120 125

Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg

130 135 140

Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala

165 170 175

Gly Ala Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp

180 185 190

Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln

195 200 205

Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr

225 230 235 240

Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp

245 250 255

Leu Ala Lys His Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu

260 265 270

Leu Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe

275 280 285

Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp

290 295 300

Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ser Arg

305 310 315 320

Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His

325 330 335

Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met

340 345 350

Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp

355 360 365

Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly

370 375 380

Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys

385 390 395 400

Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro

405 410 415

Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu

420 425 430

Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Gly

435 440 445

Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln

450 455 460

Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val

465 470 475 480

Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala

485 490 495

Pro Arg Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Pro Ser Val Val

500 505 510

Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Thr

515 520 525

Ala Thr Ala Pro

530

<210> 17

<211> 535

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 17

Met Leu Gly Pro Cys Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg

1 5 10 15

Leu Gln Leu Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp

20 25 30

Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu

35 40 45

Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp

50 55 60

Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln

65 70 75 80

Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe

85 90 95

Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro

100 105 110

Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn

115 120 125

Phe Gln Thr Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn

130 135 140

Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gly Lys Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala

165 170 175

Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser

180 185 190

Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile

195 200 205

Ala Thr Gln Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly

210 215 220

Gly Arg Lys Tyr Met Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro

225 230 235 240

Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val

245 250 255

Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met

275 280 285

Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser

290 295 300

Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu

305 310 315 320

Leu Ser Arg Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg

325 330 335

Ile Asp His Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu

340 345 350

Thr Ile Met Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser

355 360 365

Glu Glu Asp Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe

370 375 380

Ser Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala

385 390 395 400

Pro Gly Lys Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr

420 425 430

Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Asp Glu Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg

450 455 460

Gly Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile

465 470 475 480

Ala His Val Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys

485 490 495

Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Arg

500 505 510

Ser Val Val Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu

515 520 525

Leu Glu Thr Ala Thr Ala Pro

530 535

<210> 18

<211> 532

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 18

Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn

20 25 30

Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala

35 40 45

Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly

50 55 60

Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp

65 70 75 80

Lys Leu Gly Pro Glu Thr Phe Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val

85 90 95

Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Ser Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly

100 105 110

Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr

115 120 125

Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg

130 135 140

Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala

165 170 175

Gly Ala Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp

180 185 190

Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln

195 200 205

Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr

225 230 235 240

Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp

245 250 255

Leu Ala Lys His Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu

260 265 270

Leu Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe

275 280 285

Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp

290 295 300

Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ser Arg

305 310 315 320

Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His

325 330 335

Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met

340 345 350

Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp

355 360 365

Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly

370 375 380

Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys

385 390 395 400

Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro

405 410 415

Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu

420 425 430

Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Gly

435 440 445

Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln

450 455 460

Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val

465 470 475 480

Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala

485 490 495

Pro Arg Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Pro Ser Val Val

500 505 510

Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Thr

515 520 525

Ala Thr Ala Pro

530

<210> 19

<211> 528

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 19

Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu

1 5 10 15

Ser Leu Gly Val Ile Pro Ala Glu Glu Glu Asn Pro Ala Phe Trp Asn

20 25 30

Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ile

35 40 45

Gln Lys Val Ala Lys Asn Leu Ile Leu Phe Leu Gly Asp Gly Leu Gly

50 55 60

Val Pro Thr Val Thr Ala Thr Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Asn Gly

65 70 75 80

Lys Leu Gly Pro Glu Thr Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Leu

85 90 95

Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Arg Gln Val Pro Asp Ser Ala

100 105 110

Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Phe Gln Thr

115 120 125

Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg

130 135 140

Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Gln Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala

165 170 175

Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp

180 185 190

Met Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln

195 200 205

Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Ala Asp Ala

225 230 235 240

Ser Gln Asn Gly Ile Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp

245 250 255

Leu Ala Lys His Gln Gly Ala Trp Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu

260 265 270

Met Gln Ala Ser Leu Asp Gln Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe

275 280 285

Glu Pro Gly Asp Thr Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Pro Thr Leu Asp

290 295 300

Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg

305 310 315 320

Asn Pro Arg Gly Phe Tyr Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His

325 330 335

Gly His His Glu Gly Val Ala Tyr Gln Ala Leu Thr Glu Ala Val Met

340 345 350

Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp

355 360 365

Thr Leu Thr Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly

370 375 380

Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Ser Lys

385 390 395 400

Ala Gln Asp Ser Lys Ala Tyr Thr Ser Ile Leu Tyr Gly Asn Gly Pro

405 410 415

Gly Tyr Val Phe Asn Ser Gly Val Arg Pro Asp Val Asn Glu Ser Glu

420 425 430

Ser Gly Ser Pro Asp Tyr Gln Gln Gln Ala Ala Val Pro Leu Ser Ser

435 440 445

Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln

450 455 460

Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Ser Phe Val Ala His Val

465 470 475 480

Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala

485 490 495

Pro Pro Ala Cys Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Val Ala Ala Ser Leu

500 505 510

Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ser Ala Ala Pro

515 520 525

<210> 20

<211> 227

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический конструкт

<400> 20

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<---

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к способу лечения или улучшения состояния при мышечной слабости у пациента человека, страдающего мышечной слабостью или со склонностью к ее возникновению. Способ лечения или улучшения состояния при мышечной слабости у пациента человека, страдающего мышечной слабостью или со склонностью к ее возникновению, включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества щелочной фосфатазы, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO:1, где у пациента повышена концентрация пирофосфата (PPi), и где у пациента: ранее не была диагностирована гипофосфатазия (НРР); имеется НРР и нет других симптомов, связанных с НРР; или нет НРР и имеется мышечная слабость или склонность к ее развитию. Вышеописанный способ лечения позволяет понижать концентрацию пирофосфата и эффективно лечить или улучшать состояния при мышечной слабости у пациента человека. 48 з.п. ф-лы, 4 табл., 6 ил., 4 пр.

Формула