Способ повышения экспрессии кодируемых рнк белков - RU2733424C2

Чертежи

Показать все 17 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к РНК, содержащей по меньшей мере одну открытую рамку считывания (ОРС) и содержащей по меньшей мере одну модификацию, которая повышает экспрессию кодируемого пептида или белка. Кроме того, изобретение относится к медицинскому применению указанной модифицированной РНК, введенной индивидууму с помощью струйной инъекции. Изобретение относится также к фармацевтической композиции и набору компонентов, которые содержат указанную модифицированную РНК, предназначенным для введения путем струйной инъекции, предпочтительно для применения в области генной терапии и/или генетической вакцинации. Кроме того, изобретение относится к способу повышения (локализованной) экспрессии кодируемых РНК пептидов или белков в дерме (собственно коже) или мышце (млекопитающего), заключающемуся в том, что вводят модифицированную РНК путем струйной инъекции. И, наконец, изобретение относится к способу лечения, заключающемуся в том, что вводят модифицированную РНК путем струйной инъекции индивидууму, который нуждается в этом.

Предпосылки создания изобретения

Генная терапия и генетическая вакцинация относятся к наиболее перспективным и быстро развивающимся методам современной медицины. Они могут обеспечивать высоко специфические и индивидуальные подходы к лечению широкого разнообразия заболеваний. Целями указанных терапевтических подходов могут являться, в частности, наследственные генетические заболевания, а также аутоиммунные болезни, инфекционные болезни, злокачественные или связанные с опухолями заболевания, а также воспалительные заболевания. Кроме того, с помощью указанных подходов можно предупреждать также (раннее) начало указанных заболеваний.

Основной концептуальной идеей, положенной в основу генной терапии, является соответствующая модуляция нарушенной генной экспрессии, ассоциированной с патологическими состояниями конкретных заболеваний. Патологически измененная генная экспрессия может приводить к отсутствию или сверхпроизводству имеющих решающее значение генных продуктов, например, участвующих в пути передачи сигналов, таких факторов, как гормоны, факторы, связанные с генами «домашнего хозяйства», участвующие в метаболизме ферменты, структурные белки и т.п. Измененная генная экспрессия может являться не только результатом нарушенной регуляции (дисрегуляция) транскрипции и/или трансляции, но также и мутаций в ОРС, кодирующей конкретный белок. Патологические мутации могут вызываться, например, хромосомными аберрациями или более специфическими мутациями, такими как точечные мутации или мутации сдвига рамки считывания, которые все могут приводить к ограниченной функциональности и потенциально к полной потере функции генного продукта. Однако дисрегуляция транскрипции и/или трансляции может также иметь место, если мутации затрагивают гены, кодирующие белки, которые участвуют в транскрипционном или трансляционном механизме клетки. Указанные мутации могут приводить к патологической повышающей или понижающей регуляции генов, которые сами являются функциональными. Гены, кодирующие генные продукты, которые обладают указанными регулирующими функциями, могут представлять собой, например, факторы транскрипции, сигнальные рецепторы, белки-мессенджеры или т.п. Однако потерю функции указанных генов, кодирующих регуляторные белки, можно при определенных обстоятельствах восстанавливать путем искусственной интродукции других факторов, которые действуют также в прямом направлении относительно нарушенного генного продукта. Указанные дефекты генов можно также компенсировать с помощью генной терапии посредством замены самих поврежденных генов.

Из вышесказанного следует, что оба метода, т.е. генная терапия и генетическая вакцинация, в целом базируются на введении молекул нуклеиновых кислот пациенту и последующей транскрипции и/или трансляции кодируемой генетической информации.

ДНК, а также РНК можно применять в качестве молекул нуклеиновых кислот, предназначенных для введения в контексте генной терапии или генетической вакцинации. Известно, что ДНК является относительно стабильной и с ней легко манипулировать. Однако применение ДНК связано с риском нежелательного включения введенных ДНК-фрагментов в геном пациента, что может приводить к потере функции нарушенных генов. Другим риском является нежелательное возникновение антител к ДНК. Другим недостатком является ограниченный уровень экспрессии кодируемого пептида или белка, который можно достигать при введении ДНК, и последующей транскрипции/трансляции. Присутствие среди других факторов специфических факторов транскрипции, которые регулируют транскрипцию ДНК, оказывает огромное влияние на уровень экспрессии вводимой ДНК. При отсутствии указанных факторов транскрипция ДНК не обеспечивает получение необходимых количеств РНК. В результате ограничивается уровень полученного транслированного пептида или белка.

Путем применения в генной терапии или генетической вакцинации РНК вместо ДНК риски нежелательной геномной интеграции и образования антител к ДНК минимизируется или можно избегать обоих указанных явлений. Однако РНК считается относительно нестабильным видом молекул. С одной стороны, во внеклеточном пространстве РНК подвергаются расщеплению практически повсеместно встречающимися РНКазами. С другой стороны, время полужизни мРНК в цитоплазме in vivo ограничено скоростью ферментативного расщепления мРНК, которая зависит, по меньшей мере частично, от действующих в цис-направлении элементов в молекуле мРНК. Тем самым контролируемое расщепление мРНК вносит вклад в тонкую регуляцию экспрессии эукариотических генов (Friedel и др., Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life, Nucleic Acid Research, 2009, cc. 1-12). Таким образом, каждая встречающаяся в естественных условиях мРНК имеет индивидуальное время полужизни в зависимости от гена, из которого происходит мРНК.

В течение многих лет существовало мнение, что мРНК является слишком нестабильной, для того, чтобы применять ее для целей генной терапии. Однако в последнее десятилетие несколько групп исследователей занялись решением указанной проблемы и не только продемонстрировали возможность опосредуемой мРНК трансфекции с неожиданными результатами, касающимися эффективности трансфекции и продолжительности экспрессии белка, но также смогли продемонстрировать огромные преимущества по сравнению с применением плазмидной ДНК (пДНК). Одним из таких преимуществ является тот факт, что для экспрессии кодируемых белков мРНК не требуется пересекать ядерный барьер (см. обзор у Tavernier и др., J Control Release. 150(3), 30 марта 2011 г., сс. 238-247; PMID: 20970469).

Для генной терапии и генетической вакцинации модифицированная и тем самым стабилизированная РНК, как правило, является более пригодной, чем немодифицированная РНК, которая обычно быстро расщепляется. С одной стороны, продукт, кодируемый РНК-последовательностью, требуется накапливать in vivo. С другой стороны, РНК должна сохранять свою структурную и функциональную целостность при включении ее в приемлемую лекарственную форму, в процессе хранения и при введении. Поэтому были предприняты значительные усилия, направленные на предупреждение их раннего расщепления или распада, с целью получения стабильных молекул РНК для генной терапии и генетической вакцинации.

После интродукции в клетку время полужизни (нестабилизированной) мРНК является ограниченным. В результате производство белка, кодируемого этой мРНК, происходит максимум в течение нескольких дней. Очевидно, что указанный факт ограничивает применимость генной терапии на основе (нестабилизированной) мРНК. Например, ее нельзя применять для коррекции наследственных заболеваний, поскольку для этого требуются повторные введения (см. обзор Tavernier и др., J Control Release. 150(3), 30 марта 2011 г., сс. 238-247; PMID: 20970469).

Как отмечалось выше, мРНК обычно рассматривают как очень нестабильную молекулу по сравнению с ДНК, особенно после достижения ею цитоплазмы, в которой она подвергается действию расщепляющих ферментов. Основной причиной ее нестабильности является присутствие гидроксильной группы на втором атоме углерода сахарного остатка, которая вследствие стерической помехи препятствует мРНК принимать стабильную структуру в виде двойной β-спирали и делает молекулу более подверженной гидролитическому расщеплению. Полученные ранее сведения о внутриклеточном введении мРНК подвергались скептицизму главным образом из-за уверенности в том, что мРНК является чрезвычайно лабильной и не может удовлетворять протоколам трнсфекции.

Как отмечалось выше, одним из преимуществ РНК является то, что ее достаточный уровень экспрессии может иметь место уже после введения РНК в цитоплазму клетки (в отличие от ДНК, которая должна пересекать оболочку ядра). Однако «оголенные» молекулы нуклеиновых кислот не могут эффективно проникать в клетки из-за их крупных размеров и гидрофильной природы, обусловленной отрицательно заряженными фосфатными группами. Кроме того, они очень чувствительны к опосредуемому нуклеазами расщеплению. Таким образом, требованием, важным для генной терапией, является разработка эффективных и безопасных средств введения РНК в клетку.

В целом, описаны вирусные и невирусные методы введения (см., например, Tavernier и др., J Control Release. 150(3), 30 марта 2011 г., сс. 238-247; PMID: 20970469). С позиции безопасности и экономии процесса, как правило, предпочтительны невирусные методы. В то время как некоторые из этих методов базируются на физическом разрушении барьерной функции клеточных мембран, в других применяют катионные молекулы-носители для облегчения переноса генов к клеткам-мишеням без расщепления вводимого гена.

Впервые понимание механизма проникновения «оголенной» РНК было достигнуто при изучении на мышах при применении внутрикожного введения путем инъекции. В этом плане было установлено, что местное проникновение в клетки дермы характеризуется насыщением, это означает, что при внутрикожной инъекции мРНК можно достигать лишь определенного уровня белка. Более тщательное исследование in vitro подтвердило насыщаемость при проникновении и продемонстрировало также наличие зависимости от температуры и дозы (см. обзор Schlake и др., RNA Biology 9:11, ноябрь 2012 г., сс. 1-12).

До сих пор для обработок на основе мРНК наиболее часто применяют внутрикожную инъекцию, что обеспечивает поглощение мРНК клетками Лангерганса и кожными дендритными клетками (DC), после чего имеет место транспорт в дренирующие лимфатические узлы (см. обзор Van Lint и др., Human Vaccines & Immunotherapeutics 9:2, февраль 2013 г., сс. 248-257). Другие пути введения, которые применяли для введения РНК, включают внутримышечную инъекцию, внутриузловую инъекцию (инъекция в лимфатический узел) и внутриопухолевую инъекцию.

То, что экспрессия белка, опосредуемая интродукцией гетерологичной мРНК in vivo, в целом является возможной и достаточной для выработки поддающегося оценке иммунного ответа, известно не только из экспериментов с использованием РНК в качестве вакцины. Однако в контексте требуемого уровня экспрессии белка более важным может являться выработка эффективного иммунного ответа и еще более важным - обеспечение терапевтического действия с помощью получения опосредуемого мРНК белка.

Таким образом, эффективный перенос РНК в клетки индивидуума все еще представляет собой «узкое место» в эффективной экспрессия белков, интродуцированных в клетку с помощью гетерологичной РНК. Терапевтическая эффективность лекарственных средство на основе РНК, прежде всего в области генной терапии, в большой степени зависит от экспрессии генных продуктов, кодируемых терапевтической молекулой РНК.

Таким образом, в основу изобретения положена задача повысить экспрессию генетической информации, содержащейся в молекуле РНК, которую интродуцируют в клетку или ткань. В частности, в основу изобретения положена задача повысить экспрессию белка, кодируемого молекулой РНК, которую используют для генной терапии или генетический вакцинации и которую вводят индивидууму.

Задача, положенная в основу настоящего изобретения, решается с помощью объекта изобретения, представленного в формуле изобретения.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложена РНК, содержащая по меньшей мере одну открытую рамку считывания (ОРС) и содержащая по меньшей мере одну модификацию («модифицированная РНК»), которая повышает экспрессию кодируемого белка, для медицинского применения, при котором модифицированную РНК вводят индивидууму с помощью струйной инъекции. В частности, в изобретении предложена модифицированная РНК, кодирующая по меньшей мере один пептид или белок, экспрессию которого дополнительно повышают с помощью струйной инъекции. Кроме того, в изобретении предложена фармацевтическая композиция и набор компонентов, которые содержат указанную модифицированную РНК, предназначенные для введения путем струйной инъекции, предпочтительно для применения в области генной терапии и/или генетической вакцинации. Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ повышения экспрессии белка с помощью струйной инъекции соответствующей РНК, которая содержит по меньшей мере одну модификацию, повышающую экспрессию белка, кодируемого указанной РНК.

В целом, задача, положенная в основу настоящего изобретения, решается путем создания модифицированной РНК, при этом экспрессия кодируемого белка в ткани-мишени или клетке-мишени дополнительно повышается в результате применения струйной инъекции.

Краткое описание чертежей

Представленные ниже чертежи даны только с целью иллюстрации и представляют собой другой путь описания настоящего изобретения. Указанные чертежи не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение.

На чертежах показано:

на фиг. 1 - данные об экспрессии люциферазы в морских свинках.

Морским свинкам инъецировали 20 мкг модифицированной мРНК, которая кодирует люциферазу светлячка (Photinus pyralis) (PpLuc(GC) - muag - A64 - С30 - гистонSL (гистоновая структура типа «стебель-петля»), путем струйной инъекции или общепринятой внутрикожной игольной инъекции. Через 24 ч после инъекции получали образцы кожи и измеряли экспрессию люциферазы;

на фиг. 2 - данные об экспрессии люциферазы в морских свинках.

Морским свинкам инъецировали в различных дозах (10, 40 и 80 мкг) модифицированную мРНК, которая кодирует люциферазу Photinus pyralis (PpLuc(GC) - muag - A64 - С30 - гистонSL, путем струйной инъекции или общепринятой внутрикожной игольной инъекции. Через 24 ч после инъекции получали образцы кожи и измеряли экспрессию люциферазы;

на фиг. 3 - результаты сравнения немодифицированной и модифицированной мРНК.

Морским свинкам инъецировали в различных дозах (5 и 80 мкг) немодифицированную мРНК (PpLuc(wt)-A30) и модифицированную мРНК (PpLuc(GC) - muag - А64 - С30 - гистонSL), которая кодирует люциферазу Photinus pyralis, путем струйной инъекции или общепринятой внутрикожной игольной инъекции. Через 24 ч после инъекции получали образцы кожи и измеряли экспрессию люциферазы;

на фиг. 4 - последовательность мРНК R1265: PpLuc(GC) - muag - А64 - С30 - гистонSL (SEQ ID NO: 46);

на фиг. 5 - последовательность мРНК R2652: PpLuc(wt) - А30 (SEQ ID NO: 47);

на фиг. 6 - последовательность мРНК R3454: PpLuc(wt) - А64 (SEQ ID NO: 48);

на фиг. 7 - последовательность мРНК R2462: PpLuc(GC) - A64 - C30 - гистонSL (SEQ ID NO: 49);

на фиг. 8 - последовательность мРНК R1256: PpLuc(GC) - muag - A64 - C30 (SEQ ID NO: 50);

на фиг. 9 - последовательность мРНК R2393: PpLuc(nat) - muag - A64 - C30 - гистонSL (SEQ ID NO: 51);

на фиг. 10 - последовательность мРНК R2403: RAV-G(GC) - muag - A64 - C30 - гистонSL (SEQ ID NO: 52);

на фиг. 11 - последовательность мРНК R3513: EPP(wt) - A30 (SEQ ID NO: 53);

на фиг. 12 - последовательность мРНК R3135: HSD17B4 - EPO(GC) - альбумин7 - А64 - С30 - гистонSL (SEQ ID NO: 54);

на фиг. 13 - результаты сравнения немодифицированной и модифицированной мРНК, кодирующей эритропоэтин (ЕРО)

Морским свинкам инъецировали немодифицированную мРНК (R3513: EPO(wt)-A30) или модифицированную мРНК (HSD17В4 - EPO(GC) - альбумин7 - А64 - С30 - гистонSL), кодирующую эритропоэтин (ЕРО), путем струйной инъекции или общепринятой внутрикожной игольной инъекции. Каждому животному осуществляли инъекцию в 3 области, используя по 80 мкг РНК на область инъекции. Через 24 ч после инъекции получали образцы крови и измеряли экспрессию ЕРО согласно методу, описанному в примере 5;

на фиг. 14 - последовательность РНК R2510 с оптимизированным содержанием G/C (SEQ ID NO: 64), кодирующая белок RSV-F (слитый белок F RSV) «длинного» штамма респираторно-синцитиального вируса (RSV) (RSV-F «длинный»), содержащийся вакцине на основе мРНК RSV-F;

на фиг. 15 - результаты сравнения общепринятой инъекции с использованием шприца и иглы и струйной инъекции мРНК-вакцины против RSV (титры антител)

Самок морских свинок (n=8/группу) инъецировали внутрикожно (i.d.) содержащей мРНК RSV-F вакциной (80 мкг R2510), либо 1×100 мкл с использованием общепринятой игольной инъекции (i.d.), 4×25 мкл с использованием игольной инъекции (i.d.) или 1×100 мкл с использованием струйной инъекции (i.d.). Контрольной группе (n=2) с помощью иглы инъецировали внутримышечно (i.m.) 20 мкг инактивированного «длинного» штамма RSV (2×50 мкл). Все животные получали бустерные инъекции в дни 14 и 28. Образцы крови собирали в день -3 (за три дня до первой вакцинации) и в дни 7, 21 и 42 для определения титров антител к RSV-F. эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 4;

на фиг 15А - данные о титрах «конечной точки» IgG1, определенных с помощью ELISA;

на фиг. 15Б - данные о титрах "конечной точки» IgG2a, определенных с помощью ELISA.

Продемонстрировано, что вакцина, содержащая мРНК RSV-F, индуцировала антитела к F-белку подкласса IgG1 (А) и подкласса IgG2a (Б) уже через 21 день (через одну неделю после первой бустер-вакцинации в день 14), когда вакцину вводили с помощью струйной инъекции (1×100 мкл). Сопоставимые титры антител были получены только в день 42 (через две недели после второй бустер-вакцинации в день 28), когда вакцину вводили с помощью общепринятой игольной инъекции (4×25 мл);

на фиг. 16 - результаты сравнения общепринятой инъекции с использованием шприца и иглы и струйной инъекции мРНК-вакцины против RSV (титры вирус-нейтрализующих антител)

Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 4. Титры вирус-нейтрализующих (VNT) антител определяли с помощью анализа уменьшения бляшек в дни -3, 21 и 42. Строили график зависимости медианных значений VNT от времени. VNT определяли как реципрокные титры нейтрализующего антитела при снижении на 60% «конечной точки» контроля вируса. Продемонстрировано, что значимые нейтрализующие RSV титры были определены в день 42 только в том случае, когда вакцину вводили путем струйной инъекции (1×100 мкл).

Для целей ясности и удобочитаемости ниже представлены следующие определения. Все технические особенности, упомянутые в этих определениях, могут относиться ко всем до единого вариантам осуществления изобретения. В контексте указанных вариантов осуществления изобретения могут быть специально даны дополнительные определения и пояснения. Когда в контексте настоящего изобретения упоминаются нуклеотидные последовательности, то эти последовательности, как правило, включают как специфическую РНК- или ДНК-последовательность, так и соответствующую последовательность-копию ДНК или РНК соответственно. Например, когда представлена ДНК-последовательность, то специалисту в данной области известно, что соответствующую РНК-последовательность получают путем замены остатков тимина на остатки урацила и наоборот.

Генная терапия: Генная терапия, как правило, может представлять собой лечение организма пациента или выделенных элементов организма пациента, например, выделенных тканей/клеток, с помощью нуклеиновых кислот, кодирующих пептид или белок. Как правило, она может включать по меньшей мере одну из следующих стадий а) введение нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы РНК, указанной в настоящем описании, непосредственно пациенту - любым путем введения - либо in vitro в выделенные клетки/ткани пациента, что приводит к трансфекции клеток пациента, либо in vivo/ex vivo, либо in vitro; б) транскрипция и/или трансляция интродуцированной молекулы нуклеиновой кислоты; и необязательно в) повторное введение выделенных трансфектированных клеток пациенту, если нуклеиновую кислоту не вводили непосредственно пациенту.

Генетическая вакцинация: Генетическая вакцинация, как правило, может представлять собой вакцинацию, осуществляемую путем введения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген или иммуноген или его фрагмент. Молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в организм индивидуума или в выделенные клетки индивидуума. После трансфекции определенных клеток организма или после трансфекции выделенных клеток антиген или иммуноген может экспрессироваться указанными клетками и затем презентоваться иммунной системе, вызывая адаптивный, т.е. антигенспецифический иммунный ответ. Таким образом, генетическая вакцинация, как правило, включает по меньшей мере одну из следующих стадий: а) введение нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы РНК, указанной в настоящем описании, индивидууму, предпочтительно пациенту, или в выделенные клетки индивидуума, предпочтительно пациента, что обычно приводит к трансфекции клеток индивидуума in vivo или in vitro; б) транскрипцию и/или трансляцию интродуцированной молекулы нуклеиновой кислоты; и необязательно в) повторное введение выделенных трансфектированных клеток индивидууму, предпочтительно пациенту, если нуклеиновую кислоту не вводили непосредственно пациенту.

Иммунная система: Иммунная система может защищать организмы от инфекции. Если патогену удалось преодолеть физический барьер организма и попасть в указанный организм, то врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифический ответ. Если патоген ускользает от этого врожденного ответа, у позвоночных имеется второй уровень защиты, представляющий собой адаптивную иммунную систему. В этом случае иммунная система адаптирует свой ответ в процессе инфекции для улучшения распознавания патогена. Затем этот улучшенный ответ сохраняется после элиминации патогена в форме иммунологической памяти и позволяет адаптивной иммунной системе организовывать более быстрые и сильные атаки каждый раз при проникновении указанного патогена. Таким образом, иммунная система включает врожденную и адаптивную иммунную систему. Каждая из этих двух частей, как правило, включает так называемые гуморальный и клеточный компоненты.

Адаптивная иммунная система: Адаптивная иммунная система в основном предназначена для устранения или предупреждения роста патогенов. Как правило, она регулирует адаптивный иммунный ответ, придавая иммунной системе позвоночных способность распознавать и запоминать специфические патогены (для создания иммунитета) и организовывать более сильную атаку в каждом случае при обнаружении патогена. Система обладает высокой способностью к адаптации вследствие соматической гипермутации (процесс ускоренных соматических мутаций) и V(D)J-рекомбинации (необратимая генетическая рекомбинация сегментов гена рецептора антигена). Этот механизм позволяет небольшому количеству генов создавать огромное количество различных рецепторов антигенов, которые затем уникальным образом экспрессируются на каждом индивидуальном лимфоците. Поскольку реаранжировка гена приводит к необратимому изменению ДНК каждой клетки, то все потомство такой клетки должно затем наследовать гены, кодирующие ту же самую рецепторную специфичность, включая В-клетки памяти и Т-клетки памяти, которые имеют решающее значение для долговременного специфического иммунитета.

Врожденная иммунная система: Врожденная иммунная система, которую называют также неспецифической иммунной системой, как правило, включает клетки и механизмы, которые неспецифически защищают хозяина от заражения другими организмами. Это означает, что клетки врожденной системы могут распознавать патогены и реагировать на них обычным путем, но, в отличие от адаптивной иммунной системы, она не обеспечивает долговременный или защитный иммунитет хозяину. Врожденная иммунная система может, например, активироваться лигандами Толл-подобных рецепторов (TLR) или другими вспомогательными субстанциями, такими как липополисахариды, TNF-альфа, лиганд CD40 или цитокины, монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-бета, TNF-альфа, факторы роста и hGH, лиганд человеческого Толл-подобного рецептора TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, лиганд мышиного Толл-подобного рецептора TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13, лиганд NOD-подобного рецептора, лиганд RIG-I-подобного рецептора, иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, иммуностимулирующая РНК (isPHK), CpG-ДНК, антибактериальный агент или противовирусный агент. Фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать одну или несколько из указанных субстанций. Как правило, ответ врожденной иммунной системы включает рекрутинг иммунных клеток к областям заражения посредством производства химических факторов, включая специализированные химические медиаторы, которые называют цитокинами; активацию каскада комплемента; идентификацию и удаление чужих субстанций, присутствующих в органах, тканях, крови и лимфе, специализированными лейкоцитами; активацию адаптивной иммунной системы; и/или функционирование в качестве физического и химического барьера для инфекционных агентов.

Иммунный ответ: Иммунный ответ, как правило, может представлять собой либо специфическую реакцию адаптивной иммунной системы на конкретный антиген (так называемый специфический или адаптивный иммунный ответ), либо неспецифическую реакцию врожденной иммунной системы (так называемый неспецифический или врожденный иммунный ответ) или их комбинацию.

Адаптивный иммунный ответ: Как правило, под адаптивным иммунным ответом понимают антигенспецифический ответ иммунной системы. Специфичность в отношении антигена позволяет вырабатывать ответы, приспособленные к специфическим патогенам или инфицированным патогеном клеткам. Способность создавать такие приспособленные ответы, как правило, поддерживается в организме «клетками памяти». Если патоген инфицирует организм более одного раза, то указанные специфические клетки памяти используются для его быстрой элиминации. В этом контексте первая стадия адаптивного иммунного ответа представляет собой активацию наивных антигенспецифических Т-клеток или других иммунных клеток, способных индуцировать антигенспецифический иммунный ответ, антигенпрезентирующими клетками. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные Т-клетки. Три типа клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, представляют собой дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из указанных клеток выполняет отдельную функцию при вызывании иммунных ответов. Дендритные клетки могут поглощать антигены посредством фагоцитоза и макропиноцитоза, и они могут стимулироваться при контакте, например, с чужим антигеном, к миграции в местную лимфоидную ткань, где может происходить их дифференцировка в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают находящиеся в форме частиц антигены, такие как бактерии, и могут индуцироваться инфекционными агентами или другими соответствующими стимулами и экспрессировать в результате этого молекулы ГКГС. Уникальная способность В-клеток к связыванию и интернализации растворимых белковых антигенов посредством своих рецепторов также может иметь важное значение для индукции Т-клеток. ГКГС-молекулы, как правило, ответственны за презентацию антигена Т-клеткам. При этом презентация антигена на молекулах ГКГС приводит к активации Т-клеток, что индуцирует их пролиферацию и дифференцировку в «вооруженные» эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является уничтожение (цитолиз) инфицированных клеток цитотоксическими CD8⁺-Т-клетками и активация макрофагов Th1-клетками, что в совокупности создает опосредованный клетками (клеточный) иммунитет, а активация В-клеток как Th2-, так и Th1-клетками, приводящая к образованию различных классов антител, запускает гуморальный иммунный ответ. Т-клетки распознают антиген посредством своих Т-клеточных рецепторов, которые не распознают антиген и не связываются с ним непосредственно, но вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, выведенных из патогена белковых антигенов, например, так называемые эпитопы, которые связываются с молекулами ГКГС на поверхностях других клеток.

Клеточный иммунитет/клеточный иммунный ответ: Клеточный иммунитет относится, как правило, к активации макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK), антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождению различных цитокинов в ответ на антиген. В более общем смысле клеточный иммунитет основан не на антителах, а на активации клеток иммунной системы. Как правило, клеточный иммунный ответ может характеризоваться, например, активацией антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, которые способны индуцировать апоптоз клеток, например, специфических иммунных клеток типа дендритных клеток или других клеток, экспонирующих эпитопы чужих генов на своей поверхности. Такие клетки могут представлять собой инфицированные вирусом или инфицированные внутриклеточными бактериями, или раковые клетки, экспонирующие опухолевые антигены. Другими характеристиками могут являться активация макрофагов и естественных клеток-киллеров, позволяющая им разрушать патогены, и стимуляция клеток к секреции различных цитокинов, которые влияют на функцию других клеток, участвующих в адаптивных иммунных ответах и врожденных иммунных ответах.

Иммуноген: В контексте настоящего изобретения под иммуногеном, как правило, понимают соединение, которое обладает способностью стимулировать иммунный ответ. Предпочтительно иммуноген представляет собой пептид, полипептид или белок. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуноген в контексте настоящего изобретения представляет собой продукт трансляции применяемой молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно искусственной молекулы нуклеиновой кислоты, указанной в настоящем описании. Как правило, иммуноген вызывает по меньшей мере адаптивный иммунный ответ.

Антиген: В контексте настоящего изобретения понятие «антиген» относится, как правило, к субстанции, которая может распознаваться иммунной системой, предпочтительно адаптивной иммунной системой, и которая обладает способностью запускать антигенспецифический иммунный ответ, например, посредством образования антител и/или антигенспецифических Т-клеток, в качестве компонента адаптивного иммунного ответа. Как правило, антиген может представлять собой или содержать пептид или белок, который может презентироваться ГКГС Т-клеткам.

Эпитоп: Эпитопы (которые называют также «антигенными детерминантами») можно подразделить на Т-клеточные эпитопы и В-клеточные эпитопы. В контексте настоящего изобретения Т-клеточные эпитопы или части белков могут содержать фрагменты, предпочтительно имеющие длину от примерно 6 до примерно 20 аминокислот или даже более, например, фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса I, предпочтительно имеют длину от примерно 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса II, предпочтительно имеют длину примерно 13 аминокислот или более, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большее количество аминокислот, при этом указанные фрагменты можно выбирать из любой части аминокислотной последовательности. Указанные фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы ГКГС, т.е. фрагменты, как правило, не распознаются в их нативной форме. В-клеточные эпитопы, как правило, представляют собой фрагменты, локализованные на внешней поверхности (нативных) белковых или пептидных антигенов, указанных в настоящем описании, предпочтительно состоящих из 5-15 аминокислот, более предпочтительно состоящих из 5-12 аминокислот, еще более предпочтительно состоящих из 6-9 аминокислот, которые могут распознаваться антителами, т.е. в их нативной форме.

Такие эпитопы белков или пептидов можно, кроме того, выбирать из любых указанных вариантов таких белков или пептидов. В этом контексте антигенные детерминанты могут представлять собой конформационные или прерывистые эпитопы, состоящие из сегментов указанных в настоящем описании белков или пептидов, которые расположены с перерывами в аминокислотной последовательности белков или пептидов, указанных в настоящем описании, но которые находятся вблизи друг от друга в трехмерной структуре, или непрерывные или линейные эпитопы, состоящие из одной полипептидной цепи.

Адъювант/адъювантный компонент: Адъювант или адъювантный компонент в наиболее широком смысле, как правило, представляет собой фармакологический и/или иммунологический агент, который может модифицировать, например, усиливать, действие других агентов, таких как лекарственное средство или вакцина. Это понятие следует рассматривать в широком смысле, и оно относится к широкому спектру субстанций. Как правило, указанные субстанции обладают способностью повышать иммуногенность антигенов. Например, адъюванты могут распознаваться врожденными иммунными системами и, например, могут вызывать врожденный иммунный ответ. «Адъюванты», как правило, не вызывают адаптивный иммунный ответ. Таким образом, «адъюванты» нельзя классифицировать как антигены. Механизм их действия отличен от механизма действий, запускаемых антигенами, которые приводят к адаптивному иммунному ответу.

Белок: Белок, как правило, содержит один или несколько пептидов или полипептидов. Белок, как правило, уложен с образованием 3-мерной структуры, которая может требоваться для проявления биологической функции белка.

Пептид: Пептид или полипептид, как правило, представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных мономеров, связанных пептидными связями. Он, как правило, содержит менее 50 мономерных звеньев. Однако понятие «пептид» не исключает молекулы, имеющие более 50 мономерных звеньев. Длинные пептиды называют также полипептидами, как правило, они имеют от 50 до 600 мономерных звеньев.

Фрагмент или участок белка: Под фрагментами или участками белка в контексте настоящего изобретения, как правило, понимают пептиды, соответствующие непрерывному участку аминокислотной последовательности белка, предпочтительно имеющие в длину от примерно 6 до примерно 20 или даже более аминокислот, например, участки, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса I, предпочтительно имеют длину от примерно 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса II, предпочтительно имеют длину примерно 13 аминокислот или более, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большее количество аминокислот, при этом указанные фрагменты можно выбирать из любой части аминокислотной последовательности. Указанные фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы ГКГС, т.е. фрагменты, как правило, не распознаются в их нативной форме. Фрагменты или участки белков, представленные в настоящем описании, могут содержать также эпитопы или функциональные сайты таких белков. Предпочтительно фрагменты или участки белков в контексте настоящего изобретения представляют собой антигены, прежде всего иммуногены, например, антигенные детерминанты (которые называют также «эпитопами»), или они не обладают антигенными характеристиками, вызывая адаптивный иммунный ответ. Таким образом, фрагменты белков или пептидов могут содержать по меньшей мере один эпитоп указанных белков или пептидов. Кроме того, под фрагментами белка можно понимать также домены белка, типа внеклеточного домена или трансмембранного домена, и укороченные или усеченные версии белка.

Фармацевтически эффективное количество: В контексте изобретения под фармацевтически эффективным количеством, как правило, понимают количество, достаточное для того, чтобы индуцировать фармацевтическое действие, такое как иммунный ответ, измененный патологический уровень экспрессируемого пептида или белка, или замену недостающего генного продукта, например, в случае наличия патологической ситуации.

Идентичность последовательности: Две или большее количество последовательностей являются идентичными, если они имеют одинаковую длину и порядок расположения нуклеотидов или аминокислот. Процент идентичности, как правило, характеризует степень идентичности двух последовательностей, т.е. он, как правило, характеризует процент нуклеотидов, которые соответствуют по своему положению идентичным нуклеотидам референс-последовательности. При определении степени идентичности считается, что подлежащие сравнению последовательности имеют одну и ту же длину, т.е. длину наиболее длинной последовательности из подлежащих сравнению последовательностей. Это означает, что первая последовательность, состоящая из 8 нуклеотидов, идентична на 80% второй последовательности, состоящей из 10 нуклеотидов, которая содержит первую последовательность. Другими словами, в контексте настоящего изобретения идентичность последовательностей предпочтительно относится к проценту нуклеотидов в последовательности, которые находятся в одних и тех же положениях в двух или большем количестве последовательностей, имеющих одинаковую длину. При сравнительном анализе первичной структуры последовательностей бреши обычно рассматривают как неидентичные положения безотносительно к их действительному положению.

Фрагмент последовательности: фрагмент последовательности, как правило, представляет собой укороченный участок полноразмерной последовательности, например, молекулы нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Следовательно, фрагмент последовательности, как правило, состоит из последовательности, которая идентична соответствующему сегменту полноразмерной последовательности. В контексте настоящего изобретения предпочтительный фрагмент последовательности состоит из непрерывного сегмента, содержащего такие элементы, как нуклеотиды или аминокислоты, который соответствует непрерывному состоящему из указанных элементов сегменту молекулы, из которой происходит фрагмент, длина которого составляет по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% от всей (т.е. полноразмерной) молекулы, из которой происходит фрагмент.

Последовательность молекулы нуклеиновой кислоты: Под последовательностью молекулы нуклеиновой кислоты, как правило, понимают конкретный и индивидуальный порядок расположения, т.е. (непрерывный) ряд входящих в нее нуклеотидов. Под последовательностью белка или пептида, как правило, понимают порядок расположения, т.е. (непрерывный) ряд входящих в нее аминокислот.

Стабилизированная молекула нуклеиновой кислоты: Стабилизированная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулу ДНК или РНК, модифицированную таким образом, чтобы она обладала большей стабильностью к расщеплению или разрушению, например, факторами окружающей среды или ферментативному расщеплению, такому как расщепление экзо- или эндонуклеазами, чем молекула нуклеиновой кислоты без модификации. Предпочтительно стабилизированная молекула нуклеиновой кислоты в контексте настоящего изобретения является стабилизированной в клетке, такой как прокариотическая или эукариотическая клетка, предпочтительно в клетке млекопитающего, такой как человеческая клетка. Стабилизирующее действие можно оказывать также вне клеток, например, в буферном растворе и т.д., например, в процессе производства фармацевтической композиции, которая содержит стабилизированную молекулу нуклеиновой кислоты.

Гетерологичная последовательность: Как правило, считается, что две последовательности является «гетерологичными», если они не получены из одного и того же гена. Т.е. хотя гетерологичные последовательности можно получать из одного и того же организма, они в естественных условиях (в природе) не встречаются в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты, например, в одной и той же мРНК

Молекула нуклеиновой кислоты: Молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, содержащую, предпочтительно состоящую из компонентов в виде нуклеиновых кислот. Понятие «молекула нуклеиновой кислоты» предпочтительно относится к молекулам ДНК- или РНК. Предпочтительно оно является синонимом понятия «полинуклеотид». Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты представляет собой полимер, содержащий или состоящий из нуклеотидных мономеров, которые ковалентно связаны друг с другом с помощью фосфодиэфирной связи сахарного/фосфатного каркаса.

Открытая рамка считывания: Открытая рамка считывания (ОРС) в контексте изобретения, как правило, может представлять собой состоящую из нескольких нуклеотидных триплетов последовательность, которая может транслироваться в пептид или белок. Открытая рамка считывания предпочтительно содержит на своем 5'-конце стартовый кодон, т.е. комбинацию трех последовательно расположенных нуклеотидов, кодирующих, как правило, аминокислоту метионин (ATG или AUG), и следующую за ним область, длина которой, как правило, кратна 3 нуклеотидам. ОРС предпочтительно оканчивается стоп-кодоном (например, ТАА, TAG, TGA). Как правило, в открытой рамке считывания присутствует только один стоп-кодон. Таким образом, открытая рамка считывания в контексте настоящего изобретения предпочтительно представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую из кратного трем количества нуклеотидов, которая начинается стартовым кодоном (например, ATG или AUG), и которая предпочтительно заканчивается стоп-кодоном (например, ТАА, TGA или TAG, или UAA, UAG, UGA соответственно). Открытая рамка считывания может быть выделена или она может быть встроена в более длинную нуклеотидную последовательность, например, в вектор или мРНК. Открытую рамку считывания можно называть также «кодирующей белок областью».

ДНК: ДНК является общепринятым сокращением дезоксирибонуклеиновой кислоты. Она представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, т.е. полимер, состоящий из нуклеотидов. Указанные нуклеотиды, как правило, представляют собой мономеры дезоксиаденозинмонофосфата, дезокситимидинмонофосфата, дезоксигуанозинмонофосфата и дезоксицитидинмонофосфата, которые сами состоят из сахарного фрагмента (дезоксирибоза), фрагмента, представляющего собой основание, и фосфатного фрагмента, и образуют полимеры с характерной каркасной структурой. Каркасная структура, как правило, образована с помощью фосфодиэфирных связей между сахарным фрагментом нуклеотида, т.е. дезоксирибозы, первого мономера и фосфатным фрагментом второго смежного мономера. Специфический порядок мономеров, т.е. порядок оснований, сцепленных с сахарным/фосфатным каркасом, называют ДНК-последовательностью. ДНК может быть одноцепочечной или двухцепочечной. В двухцепочечной форме нуклеотиды первой цепи, как правило, гибридизуются с нуклеотидами второй цепи, например, путем спаривания оснований А/Т и спаривания оснований G/C.

РНК, мРНК: РНК является общепринятым сокращением для рибонуклеиновой кислоты. Она представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, т.е. полимер, состоящий из нуклеотидов. Указанные нуклеотиды представляют собой, как правило, мономеры аденозинмонофосфата, уридинмонофосфата, гуанозинмонофосфата и цитидинмонофосфата, соединенные друг с другом вдоль так называемого каркаса. Каркас формируется с помощью фосфодиэфирных связей между сахаром, т.е. рибозой, первого мономера и фосфатным фрагментом второго смежного мономера. Конкретную последовательность мономеров называют РНК-последовательностью. Как правило, РНК можно получать путем транскрипции ДНК-последовательности, например, внутри клетки. В эукариотических клетках транскрипция, как правило, происходит в ядре или в митохондрии. In vivo транскрипция ДНК, как правило, приводит к образованию так называемой незрелой РНК, которая в результате процессинга должна превратиться в так называемую матричную (информационную) РНК, которую сокращенно обозначают как мРНК. Процессинг незрелой РНК, например, в эукариотических организмах, включает ряд различных пост-транскрипционных модификаций, таких как сплайсинг, 5'-кэпирование, полиаденилирование, экспорт из ядра или митохондрии и т.п. Совокупность указанных процессов называют также созреванием РНК. Зрелая матричная РНК, как правило, представляет собой нуклеотидную последовательность, которая может транслироваться в аминокислотную последовательность конкретного пептида или белка. Как правило, зрелая мРНК содержит 5'-кэп, 5'UTR, открытую рамку считывания, необязательно 3'UTR и поли(А)-последовательность. Помимо матричной РНК существует несколько некодирующих типов РНК, которые могут участвовать в регуляции транскрипции и/или трансляции. Под понятие «РНК» подпадают также другие кодирующие молекулы РНК, такие как вирусная РНК, ретровирусная РНК и РНК-репликон.

Бицистронная РНК, полицистронная РНК: Бицистронная или полицистронная РНК, как правило, представляет собой РНК, предпочтительно мРНК, которая, как правило, может иметь две (бицистронная) или большее количество (полицистронная) открытых рамок считывания (ОРС). В этом контексте открытая рамка считывания представляет собой последовательность, состоящую из нескольких кодонов, которые могут транслироваться в пептид или белок.

G/C-модифицированная: G/C-модифицированная нуклеиновая кислота, как правило, может представлять собой нуклеиновую кислоту, предпочтительно молекулу РНК, указанную в настоящем описании, на основе модифицированной последовательности дикого типа, которая содержит предпочтительно повышенное количество гуанозиновых и/или цитозиновых нуклеотидов по сравнению с последовательностью дикого типа. Для получения указанного повышенного количества можно осуществлять замену кодонов, содержащих аденозиновые или тимидиновые нуклеотиды, на кодоны, содержащие гуанозиновые или цитозиновые нуклеотиды. При повышенном содержании G/C в кодирующей области ДНК или РНК, при заменах можно использовать вырожденность генетического кода. Таким образом, замены кодонов предпочтительно не изменяют кодируемые аминокислотные остатки, но исключительно увеличивают содержание G/C в молекуле нуклеиновой кислоты.

5'-Кэп: 5'-Кэп представляет собой структуру, как правило, модифицированную нуклеотидную структуру, которая обычно «завершает» 5'-конец зрелой мРНК. 5'-кэп может, как правило, быть образован модифицированным нуклеотидом, прежде всего производным гуанинового нуклеотида. Предпочтительно 5'-кэп связан с 5'-концом через 5'-5'-трифосфатную связь. 5'-кэп может быть метилирован, например, может представлять собой m7GpppN, где N обозначает концевой 5'-нуклеотид нуклеиновой кислоты, несущей 5'-кэп, как правило, 5'-конец РНК. Встречающийся в естественных условиях 5'-кэп представляет собой m7GpppN.

Иммуностимулирующая РНК: Иммуностимулирующая РНК (isРНК) в контексте изобретения, как правило, может представлять собой РНК, которая обладает способностью индуцировать врожденный иммунный ответ. Обычно она не имеет открытой рамки считывания и, таким образом, не кодирует пептид-антиген или иммуноген, но вызывает врожденный иммунный ответ, например, посредством связывания со специфическим типом Толл-подобного рецептора (TLR) или другими приемлемыми рецепторами. Однако, естественно, также и мРНК, имеющие открытую рамку считывания и кодирующие пептид/белок, могут индуцировать врожденный иммунный ответ и, следовательно, могут являться иммуностимулирующими РНК.

Поли(А)-последовательность: Поли(А)-последовательность, которую называют также поли(А)-хвостом или 3'-поли(А)-хвостом, как правило, представляет собой последовательность адениновых нуклеотидов, содержащую, например, вплоть до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, например, от примерно 25 до примерно 400, предпочтительно от примерно 50 до примерно 400, более предпочтительно от примерно 50 до примерно 300, еще более предпочтительно от примерно 50 до примерно 250, наиболее предпочтительно от примерно 60 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов. Поли(А)-последовательность, как правило, локализована на 3'-конце мРНК. В контексте настоящего изобретения поли(А)-последовательность может быть локализована внутри мРНК или любой другой молекулы нуклеиновой кислоты, например, внутри вектора, например, вектора, служащего в качестве матрицы для создания РНК, предпочтительно мРНК, например, при транскрипции вектора.

Полиаденилирование: Под полиаденилированием, как правило, понимают добавление поли(А)-последовательности к молекуле нуклеиновой кислоты, такой как молекула РНК, например, незрелая мРНК. Полиаденилирование может индуцироваться так называемым сигналом полиаденилирования. Указанный сигнал предпочтительно локализован в сегменте нуклеотидов на 3'-конце молекулы нуклеиновой кислоты, такой как молекула РНК, подлежащая полиаденилированию. Сигнал полиаденилирования, как правило, содержит гексамер, состоящий из адениновых и/или урациловых/тиминовых нуклеотидов, предпочтительно последовательность гексамера AAUAAA. Также возможны другие последовательности, предпочтительно гексамерные последовательности. Полиаденилирование, как правило, имеет место во время процессинга пре-мРНК (которую называют также незрелой мРНК). Как правило, созревание РНК (превращение пре-мРНК в зрелую мРНК) включает стадию полиаденилирования.

3'-нетранслируемая область (3'UTR): 3'UTR, как правило, является частью мРНК, локализованной между кодирующей областью (т.е. открытой рамкой считывания) и поли(А)-последовательностью мРНК. 3'UTR мРНК не транслируется в аминокислотную последовательность. Последовательность 3'UTR, как правило, кодируется геном, который транскрибируется в соответствующую мРНК в процессе экспрессии гена. Геномная последовательность сначала транскрибируется в незрелую мРНК, которая содержит необязательные интроны. Незрелая мРНК затем дополнительно процессируется с образованием зрелой мРНК в процессе созревания. Указанный процесс созревания включает стадии 5'-кэппирования, сплайсинга незрелой мРНК с вырезанием необязательных интронов и модификаций 3'-конца, таких как полиаденилирование 3'-конца незрелой мРНК и необязательные расщепления эндо-/или экзонуклеазами и т.д. В контексте настоящего изобретения 3'UTR соответствует последовательности зрелой мРНК, которая расположена с 3'-стороны стоп-кодона кодирующей белок области, предпочтительно непосредственно примыкает с 3'-стороны к стоп-кодону кодирующей белок области, и которая простирается до 5'-стороны поли(А)-последовательности, предпочтительно до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к поли(А)-последовательности. Понятие «соответствует» означает, что последовательность 3'UTR может представлять собой последовательность РНК, такую как последовательность мРНК, указанную при определении последовательности 3'UTR, или последовательность ДНК, которая соответствует указанной последовательности РНК. В контексте настоящего изобретения понятие «3'UTR гена», например, «3'UTR гена альфа-или бета-глобина», означает последовательность, которая соответствует 3'UTR зрелой мРНК, полученной из указанного гена, т.е. мРНК, полученной путем транскрипции гена и созревания незрелой мРНК. Понятие «3'UTR гена» включает последовательность ДНК и последовательность РНК 3'UTR.

5'-нетранслируемая область (5'UTR): Под 5'UTR, как правило, понимают конкретный сегмент матричной РНК (мРНК). Она локализована на 5'-конце открытой рамки считывания мРНК. Как правило, 5'UTR начинается с сайта инициации транскрипции и закачивается на расстоянии одного нуклеотида перед стартовым кодоном открытой рамки считывания. 5'UTR может содержать элементы, предназначенные для контроля генной экспрессии, так называемые регуляторные элементы. Указанные регуляторные элементы могут представлять собой, например, сайты связывания рибосом или 5'-концевой олигопиримидиновый тракт. 5'UTR может подвергаться пост-транскрипционным модификациям, например, путем добавления 5'-кэпа. В контексте настоящего изобретения 5'UTR соответствует последовательности зрелой мРНК, локализованной между 5'-кэпом и стартовым кодоном. Предпочтительно 5'UTR соответствует последовательности, которая простирается от нуклеотида, расположенного с 3'-стороны 5'-кэпа, предпочтительно от нуклеотида, непосредственно примыкающего с 3'-стороны к 5'-кэпу, до нуклеотида, расположенного с 5'-стороны стартового кодона кодирующей белок области, предпочтительно до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону кодирующей белок области. Нуклеотид, непосредственно примыкающий с 3'-стороны к 5'-кэпу зрелой мРНК, как правило, соответствует сайту инициации транскрипции. Понятие «соответствует» означает, что последовательность 5'UTR может представлять собой последовательность РНК, такую как последовательность мРНК, указанная при определении последовательности 5'UTR, или последовательность ДНК, которая соответствует указанной последовательности РНК. В контексте настоящего изобретения понятие «5'UTR гена» обозначает последовательность, которая соответствует 5'UTR зрелой мРНК, полученной из этого гена, т.е. мРНК, полученной путем транскрипции гена и созревания незрелой мРНК. Понятие «5'UTR гена» включает последовательность ДНК и последовательность РНК 5'UTR.

5'-концевой олигопиримидиновый тракт (ТОР): 5'-концевой олигопиримидиновый тракт (ТОР), как правило, обозначает сегмент пиримидиновых нуклеотидов, локализованный в 5'-концевой области молекулы нуклеиновой кислоты, например, в 5'-концевой области некоторых молекул мРНК или в 5'-концевой области функционального элемента, например, транскрибируемой области некоторых генов. Последовательность начинается с цитидина, который, как правило, соответствует сайту инициации транскрипции, и за которым следует сегмент, как правило, состоящий примерно из 3-30 пиримидиновых нуклеотидов. Например, ТОР может содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или даже большее количество нуклеотидов. Пиримидиновый сегмент и, следовательно, 5'-ТОР, заканчивается одним нуклеотидом, примыкающим с 5'-стороны к первому пуриновому нуклеотиду, расположенному в прямом направлении относительно ТОР. Матричную РНК, которая содержит 5'-концевой олигопримидиновый тракт, часто обозначают как ТОР-мРНК. Таким образом, гены, из которых получают указанные матричные РНК, обозначают как ТОР-гены. Последовательности ТОР, например, обнаружены в генах и мРНК, кодирующих пептидные факторы элонгации и рибосомные белки.

ТОР-мотив: В контексте настоящего изобретения ТОР-мотив обозначает нуклеотидную последовательность, которая соответствует 5'-ТОР, описанному выше. Таким образом, ТОР-мотив в контексте настоящего изобретения предпочтительно обозначает сегмент пиримидиновых оснований длиной 3-30 нуклеотидов. Предпочтительно ТОР-мотив состоит по меньшей мере из 3 пиримидиновых нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 4 пиримидиновых нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 5 пиримидиновых нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 7 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 8 пиримидиновых нуклеотидов, при этом сегмент пиримидиновых нуклеотидов предпочтительно начинается на его 5'-конце с цитозинового нуклеотида. В ТОР-генах и ТОР-мРНК ТОР-мотив предпочтительно начинается на его 5'-конце с сайта инициации транскрипции и заканчивается одним нуклеотидом, примыкающим с 5'-стороны к первому пуриновому остатку в указанном гене или мРНК. ТОР-мотив в контексте настоящего изобретения предпочтительно локализован на 5'-конце последовательности, которая представляет собой 5'UTR, или на 5'-конце последовательности, которая кодирует 5'UTR. Таким образом, предпочтительно сегмент из 3 или большего количества пиримидиновых нуклеотидов, в контексте настоящего изобретения называют «ТОР-мотивом», если сегмент локализован на 5'-конце соответствующей последовательности, такой как модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, 5'UTR-элемент модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении, или нуклеотидная последовательность, которая происходит из 5'UTR ТОР-гена, указанного в настоящем описании. Другими словами, сегмент, состоящий из 3 или большего количества пиримидиновых нуклеотидов, который не локализован на 5'-конце 5'UTR или 5'UTR-элемента, но локализован где-либо внутри 5'UTR или 5'UTR-элемента, предпочтительно не обозначают как «ТОР-мотив».

ТОР-ген: ТОР-гены, как правило, характеризуются присутствием 5'-концевого олигопримидинового тракта. Кроме того, большинство ТОР-генов характеризуются связанной с ростом регуляцией трансляции. Однако известны также ТОР-гены с тканеспецифической регуляцией трансляции. Как указано выше, 5'UTR ТОР-гена соответствует последовательности 5'UTR зрелой мРНК, происходящей из ТОР-гена, которая предпочтительно простирается от нуклеотида, расположенного с 3'-стороны 5'-кэпа, до нуклеотида, расположенного с 5'-стороны стартового кодона. 5'UTR ТОР-гена, как правило, не содержит никаких стартовых кодонов, предпочтительно не содержит расположенных в обратном направлении AUG (uAUG) или расположенных в обратном направлении открытых рамок считывания (uOPC). В данном контексте под расположенными в обратном направлении AUG и расположенными в обратном направлении открытыми рамками считывания, как правило, понимают AUG и открытые рамки считывания, которые находятся с 5'-стороны относительно стартового кодона (AUG) открытой рамки считывания, которая должна транслироваться. 5'UTR ТОР-генов, как правило, являются относительно короткими. Длины 5'UTR ТОР-генов могут варьироваться от 20 нуклеотидов вплоть до 500 нуклеотидов и, как правило, они содержат менее чем примерно 200 нуклеотидов, предпочтительно менее чем примерно 150 нуклеотидов, более предпочтительно менее чем примерно 100 нуклеотидов. Примерами 5'UTR ТОР-генов в контексте настоящего изобретения являются нуклеотидные последовательности, простирающиеся от нуклеотида в положении 5 до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (например, ATG), указанные последовательности представлены в SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 14221-1363 заявки на патент PCT/EP 2012/002448 WO 2013/143700, или представляют собой их гомологи или варианты, описание указанных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки. В этом контексте наиболее предпочтительным фрагментом 5'UTR ТОР-гена является 5'UTR ТОР-гена без 5'ТОР-мотива. Понятие «5'UTR ТОР-гена» предпочтительно относится к 5'UTR встречающегося в естественных условиях ТОР-гена.

Немодифицированная референс-РНК: представляет собой РНК, соответствующую последовательности РНК дикого типа, в котором она присутствует в естественных условиях. Например, немодифицированная референс-мРНК соответствует последовательности мРНК, которая содержит встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды, включая нуклеотиды, содержащие встречающиеся в естественных условиях модификации и/или встречающиеся в естественных условиях нетранслируемые области, такие как встречающаяся в естественных условиях структура m7GpppN 5'-кэпа, необязательно встречающаяся в естественных условиях 5'UTR, если она присутствует во встречающейся в естественных условиях последовательности мРНК, открытую рамку считывания дикого типа, необязательно встречающуюся в естественных условиях 3'UTR, если она присутствует во встречающейся в естественных условиях последовательности мРНК, и поли(А)-последовательность, состоящую примерно из 30 аденозинов.

Трансфекция: Понятие «трансфекция» относится к интродукции молекул нуклеиновой кислоты, таких как молекулы ДНК или РНК (например, мРНК), в клетки, предпочтительно в эукариотические клетки. В контексте настоящего изобретения под понятие «трансфекция» подпадает любой известный специалисту в данной области метод интродукции молекул нуклеиновой кислоты в клетки, предпочтительно в эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих. Такие методы включают, например, электропорацию, липофекцию, например, на основе катионных липидов и/или липосом, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию на основе наночастиц, трансфекцию на основе вирусов или трансфекцию на основе катионных полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин, и т.д. Предпочтительно интродукцию осуществляют без использования вирусов.

Носитель/полимерный носитель: В контексте изобретения носитель, как правило, может представлять собой соединение, которое облегчает транспорт и/или включение в комплекс другого соединения (карго, полезный груз). Полимерный носитель, как правило, представляет собой носитель, образующий полимер. Носитель может быть связан со своим полезным грузом посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия. Носитель может транспортировать нуклеиновые кислоты, например, РНК или ДНК, к клеткам-мишеням. Носитель может (в некоторых вариантах осуществления изобретения) представлять собой катионный компонент.

Катионный компонент: Понятие «катионный компонент», как правило, относится к заряженной молекуле, которая является положительно заряженной (катион) при значении pH, составляющем, как правило, от 1 до 9, предпочтительно при значении pH, равном или ниже 9 (например, от 5 до 9), равном или ниже 8 (например, от 5 до 8), равном или ниже 7 (например, от 5 до 7), наиболее предпочтительно при физиологическом значении pH, например, от 7,3 до 7.4. Таким образом, катионный компонент может представлять собой любое положительно заряженное соединение или полимер, предпочтительно катионный пептид или белок, который является положительно заряженным в физиологических условиях, прежде всего в физиологических условиях in vivo. «Катионный пептид или белок» может содержать по меньшей мере одну положительно заряженную аминокислоту, или более чем одну положительно заряженную аминокислоту, например, выбранную из Arg, His, Lys или Orn. Следовательно, «поликатионные» соединения также подпадают под указанное определение, если они несут более одного положительного заряда в указанных условиях.

Вакцина: Под вакциной, как правило, понимают предназначенный для профилактики или терапии продукт, содержащий по меньшей мере один антиген, предпочтительно иммуноген. Антиген или иммуноген может иметь происхождение из любого материала, пригодного для вакцинации. Например, антиген или иммуноген может происходить из патогена, такого как бактерии или вирусные частицы и т.д., или из опухолевой или раковой ткани. Антиген или иммуноген стимулирует адаптивную иммунную систему организма вырабатывать адаптивный иммунный ответ.

Наполнитель: Под наполнителем, как правило, понимают материал, пригодный для хранения, транспортировки и/или введения соединения, такого как фармацевтически активное соединение. Например, он может представлять собой физиологически приемлемую жидкость, которую можно применять для хранения, транспортировки и/или введения фармацевтически активного соединения.

Подробное описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является модифицированная рибонуклеиновая кислота (РНК), которая содержит по меньшей мере одну открытую рамку считывания (ОРС), кодирующую по меньшей мере один пептид или белок, где РНК содержит по меньшей мере одну модификацию, которая повышает экспрессию кодируемого белка или пептида. Экспрессию указанного бека или пептида дополнительно повышают путем введения модифицированной РНК с помощью струйной инъекции. В этом контексте повышение производства белка вследствие по меньшей мере одной модификации РНК в контексте настоящего описания обозначают как «ассоциированное с модификацией повышение экспрессии белка».

Повышение производства белка вследствие струйной инъекции РНК в контексте настоящего описания обозначают как «ассоциированное с инъекцией повышение экспрессии белка», вне зависимости от применения модифицированной РНК или немодифицированной РНК.

Понятие «ассоциированное с модификацией повышение экспрессии белка» относится либо к ситуации, когда общее количество белка, полученного с модифицированной РНК, измеренное в определенный период времени, возрастает по сравнению с общим количеством белка, полученного с немодифицированной референс-РНК, у которой отсутствует модификация, либо к ситуации, когда уровень белка, полученного с модифицированной РНК, измеренный в определенный период времени, возрастает по сравнению с уровнем белка, полученного с немодифицированной референс-РНК, у которой отсутствует модификация.

Понятие «ассоциированное с инъекцией повышение экспрессии белка» относится к ситуации, когда общее количество белка, полученного с РНК, введенной с помощью струйной инъекции, измеренное в определенный период времени, возрастает по сравнению с общим количеством белка, полученного с этой же РНК, введенной с помощью общепринятой игольной инъекции, либо к ситуации, когда уровень белка, полученного с РНК, введенной с помощью струйной инъекции, измеренный в определенный период времени, возрастает по сравнению с уровнем белка, полученного с этой же РНК, введенной с помощью общепринятой игольной инъекции.

Согласно изобретению по меньшей мере одна модификация модифицированной РНК и введение с помощью струйной инъекции обладают синергетическим действием в отношении экспрессии белка или пептида, кодируемого модифицированной РНК. В других понятиях повышение экспрессии, достигаемое при использовании струйной инъекции для введения модифицированной РНК индивидууму/в ткань по сравнению с экспрессией, достигаемой при использовании общепринятой игольной инъекции для введения немодифицированной референс-РНК индивидууму/в ткань, является более значительным чем сумма повышения экспрессии, достигаемого при использовании модифицированной РНК по сравнению с немодифицированной референс-РНК, когда их вводят одинаковым путем «ассоциированное с модификацией повышение экспрессии белка», и повышения экспрессии, достигаемого при введении (немодифицированной) РНК с помощью струйной инъекции по сравнению с таким же введением (немодифицированной) РНК с помощью путей, отличных от струйной инъекции, прежде всего с помощью общепринятой игольной инъекции («ассоциированное с инъекцией повышение экспрессии белка»).

В этом контексте при создания изобретения неожиданно было установлено, что введение модифицированной РНК, которая содержит по меньшей мере одну модификацию, повышающую экспрессию кодируемого белка, с помощью струйной инъекции приводит к существенно большему повышению экспрессии кодируемого белка, чем ожидалось. Ожидалось, что введение с помощью струйной инъекции должно оказывать одинаковое действие на экспрессию белка, кодируемого модифицированной РНК и немодифицированной референс-РНК.

В контексте настоящего изобретения «ассоциированное с модификацией повышение экспрессии белка» может возрастать в определенный период времени после инициации экспрессии или общее производства белка в определенный период времени после инициации экспрессии может возрастать по сравнению с немодифицированной референс-РНК. Таким образом, уровень белка, полученного в определенный период времени после инициации экспрессии (или после инъекции, соответственно модифицированной РНК), например, через 6, 12, 24, 48 или 72 ч после инъекции, или общее количество белка, образовавшегося в определенный период времени, например, через 6, 12, 24, 48 или 72 ч, предпочтительно выше, чем уровень белка, обнаруженный в тот же момент времени после инициации экспрессии (или после инъекции), или общее количество белка, образовавшегося в такой же период времени при использовании немодифицированной референс-РНК.

Предпочтительно только модификация РНК (т.е. без введения модифицированной РНК с помощью струйной инъекции, но с применением, например, общепринятой игольной инъекции) приводит к достижению экспрессии кодируемого белка, которая по меньшей мере в 1,5 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз, еще более предпочтительно по меньшей мере в 10 раз, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 50 раз, превышает экспрессию белка при использовании соответствующей немодифицированной референс-РНК.

«Ассоциированная с инъекцией экспрессия белка» может повышаться в определенный момент времени после инициации экспрессии (после инъекции РНК) или общее производство белка в течение определенного периода времени после инициации экспрессии может повышаться по сравнению с использованием общепринятой игольной инъекции РНК. Так, уровень белка, установленный в определенный момент времени после инициации экспрессии (или соответственно после инъекции РНК), например, через 6, 12, 24, 48 или 72 ч после инъекции, или общее количество белка, полученного в течение периода времени, например, составляющего 6, 12, 24, 48 или 72 ч, предпочтительно выше, чем уровень белка в тот же момент времени после инициации экспрессии (или после инъекции) или общее количество белка, полученного за тот же период времени при использовании этой же РНК, инъецируемой с помощью общепринятого метода, например, с помощью игольной инъекции.

Предпочтительно струйная инъекция повышает производство белка с немодифицированной РНК лишь в незначительной степени, например, в 1,5 или 2 раза.

Согласно изобретению экспрессия белка, кодируемого РНК, которая содержит по меньшей мере одну модификацию и содержит по меньшей мере одну открытую рамку считывания, дополнительно возрастает (синергетическим образом) при применении струйной инъекции. Так, экспрессия белка дополнительно возрастает по сравнению с контролем, таким как РНК, которая имеет такую же модификацию, но которую вводят с помощью общепринятой игольной инъекции. Предпочтительно производство белка, полученного при использовании струйной инъекции модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении, возрастает по меньшей мере в 5 раз, более предпочтительно в 10 раз, еще более предпочтительно в 50 раз и еще более предпочтительно в 100 раз по сравнению с немодифицированной референс-РНК, которую вводят общепринятыми методами, прежде всего с помощью общепринятой игольной инъекции. Таким образом, повышение производства белка, полученного при использовании струйной инъекции модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении, возрастает по меньшей мере в 1,5 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 4 раза, еще более предпочтительно по меньшей мере в 5 раз и наиболее предпочтительно по меньшей мере в 10 раз по сравнению с повышением экспрессии белка при применении немодифицированной референс-РНК, вводимой с помощью струйной инъекции. Предпочтительно это относится к производству в данный момент времени после инициации экспрессии или к общему производству белка в данный период времени, например, в период времени, составляющий 6, 12, 24, 48 или 72 ч после инициации экспрессии или после инъекции РНК.

Понятие «струйная инъекция» в контексте настоящего описания относится к методу безыгольной инъекции, при котором жидкость, содержащая по меньшей мере одну модифицированную РНК и необязательно дополнительные приемлемые эксципиенты, принудительно пропускают через отверстие, создавая тем самым ультратонкую жидкую струю под высоким давлением, которая обладает способностью проникать через кожу млекопитающего и, в зависимости от условий инъекции, в подкожную ткань или мышечную ткань. В принципе жидкая струя образует отверстие в коже, через которую жидкая струя проходит в ткань-мишень. Предпочтительно струйную инъекцию применяют для внутрикожной, подкожной или внутримышечной инъекции модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении.

Ткань-мишень или вернее слой ткани, в которую жидкость доставляется с помощью струйной инъекции, зависит от нескольких параметров, таких как специфические характеристики жидкой струи, которую применяют, а также физические параметры, зависящие от конкретного типа кожи (и низлежащей ткани), куда вводят жидкость. Например, плотность коллагеновых волокон и общая эластичность ткани, подлежащей обработке, может оказывать влияние на степень проникновения жидкой струи. Несколько физических параметров могут влиять на результат, полученный при использовании струйной инъекции. Различные слои ткани, которые разделяются механическими барьерами (такие как поверхностная фасция), можно специально рассматривать (в качестве мишеней) путем отбора жидкой струи, которая может проникать достаточно глубоко в кожу или низлежащую ткань без проникновения через указанный механический барьер, который располагается ниже рассматриваемого слоя. Например, внутрикожное введение можно осуществлять путем использования жидкой струи, которая проникает в дерму, не разрушая поверхностную фасцию. Введенная жидкость распределяется в дерме горизонтально.

Несколько параметров, касающихся жидкой струи, могут влиять на эффективность инъекции и, в частности, на глубину проникновения, что соответственно определяет направленный перенос в определенный слой ткани. Одним из таких параметров является давление, под которым жидкая струя наносит удар по кожной поверхности. Указанное давление зависит, среди других факторов, от скорости выхода струи (реактивного выхода) (т.е. скорости, с которой струя выбрасывается из форсунки устройства для инъекции), а также от расстояния между форсункой и кожей или средой (воздух, жидкость), которая образует пространство между форсункой и кожей. Как правило, скорость струи (и давление, вызываемое струей) снижается по мере того, как струя выбрасывается из форсунки и пересекает пространство. Проникновение через кожу зависит также от диаметра струи, который прежде всего определяется размерами применяемой форсунки. Сопоставимые результаты в понятиях проникновения через ткань и введения жидкости можно получать прежде всего с помощью различных комбинаций параметров.

Для проникновения через кожу скорость реактивного выхода струи жидкости, содержащей РНК, предпочтительно составляет по меньшей мере 60 м/с, более предпочтительно по меньшей мере 80 м/с, еще более предпочтительно по меньшей мере 100 м/с и наиболее предпочтительно по меньшей мере 150 м/с.

Струя жидкости, содержащей РНК, которую применяют для струйной инъекции, как правило, является очень тонкой и ее выбирают так, чтобы сделать возможным проникновение через кожу. Предпочтительно диаметр струи жидкости выбирают в зависимости от требуемой ткани-мишени. Диаметр струи жидкости предпочтительно регулируют, изменяя отверстие форсунки, т.е. диаметр струи жидкости возрастает с увеличением диаметра отверстия форсунки. Предпочтительно диаметр струи жидкости соответствует диаметру отверстия, т.е. диаметр струи жидкости равен или слегка превышает диаметр отверстия форсунки. Как правило, при постоянной скорости реактивного выхода глубина проникновения в ткань должна быть больше для имеющей больший диаметр струи жидкости.

В одном из вариантов осуществления изобретения диаметр отверстия составляет от 20 до 600 мкм, предпочтительно от 100 до 300 мкм, более предпочтительно от 120 до 250 мкм.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения диаметр отверстия составляет от 20 до 150 мкм, предпочтительно от 30 до 130 мкм, более предпочтительно от 40 до 110 мкм, еще более предпочтительно от 50 до 100 мкм.

В другом варианте осуществления изобретения диаметр отверстия составляет от 70 до 300 мкм, предпочтительно от 80 до 200 мкм, более предпочтительно от 90 до 180 мкм, еще более предпочтительно от 100 до 150 мкм.

Предпочтительно продолжительность инъекции (т.е. промежуток времени от первого контакта струи с кожей-мишенью до момента времени прекращения струи) составляет менее чем 1,0 с, более предпочтительно менее чем 0,7 с и еще более предпочтительно менее чем 0,3 с. Наиболее предпочтительно продолжительность инъекции составляет менее чем 0,1 с.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения процесс струйной инъекции включает по меньшей мере две фазы, отличающиеся различными скоростями струи. Предпочтительно струйная инъекция начинается с первой фазы, при этом первую скорость струи выбирают так, чтобы гарантировать проникновение в ткань. Указанная первая скорость струи зависит в большой степени от скорости реактивного выхода, т.е. скорости, с которой струя жидкости выбрасывается из форсунки устройства. Указанную первую скорость дополнительно адаптируют к требуемой глубине инъекции. Затем на второй фазе применяют вторую скорость струи, которая подходит для введения жидкости в ткань-мишень. Указанная вторая скорость струи, как правило, ниже, чем первая скорость и ее выбирают так, чтобы не превышать абсорбционную способность ткани.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения струйная инъекция модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении, включает три фазы:

Начальная фаза проникновения отличается наиболее высоким давлением касательно профиля давления всего процесса струйной инъекции (ее также обозначают как фаза пикового давления). Фаза проникновения, как правило, продолжается менее чем 50 мс, более предпочтительно менее чем 10 мс, еще более предпочтительно менее чем 5 мс. Наиболее предпочтительно продолжительность фазы проникновения составляет менее 1 мс.

После фазы пикового давления давление понижают на фазе введения, поддерживая уровень, достаточный для инъекции струи жидкости в ткань-мишень. Предпочтительно на фазе введения уровень давления остается постоянным или лишь медленно снижается. Предпочтительно фаза введения продолжается менее чем 0,8 с, более предпочтительно менее чем 0,5 с, еще более предпочтительно фаза введения продолжается от 0,01 до 0,3 с, наиболее предпочтительно от 0,01 до 0,1 с.

Конечная стадия процесса струйной инъекции согласно указанному варианту осуществления изобретения отличается падением давления, прилагаемого к жидкости, которая содержит модифицированную РНК, до уровня, близкого к уровню атмосферного давления (фаза снижения давления). Как правило, давление резко снижают после фазы введения. Фаза снижения давления предпочтительно продолжается менее чем 0,3 с, более предпочтительно менее чем 0,2 с, еще более предпочтительно менее чем 50 мс, наиболее предпочтительно менее чем 10 мс.

В зависимости от подлежащего лечению индивидуума, ткани-мишени и специфического нанесения соответственно выбирают объем жидкости, которая содержит модифицированную РНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения объем вводимой жидкости составляет от 0,05 до 1000 мкл, предпочтительно от 0,1 до 500 мкл, более предпочтительно от 0,2 до 200 мкл. Более предпочтительно объем жидкости, содержащей модифицированную РНК, составляет 100 мкл.

В этом контексте объем жидкости, содержащей модифицированную РНК, составляет предпочтительно от 0,2 до 200 мкл и наиболее предпочтительно составляет 100 мкл, если модифицированную РНК вводят внутрикожно с помощью струйной инъекции.

Кроме того, объем жидкости, содержащей модифицированную РНК, предпочтительно составляет от 100 до 2000 мкл и наиболее предпочтительно составляет 500 мкл, если модифицированную РНК вводят внутримышечно с помощью струйной инъекции.

Если жидкость, содержащую модифицированную РНК, вводят подкожно с помощью струйной инъекции, то объем жидкости, содержащей модифицированную РНК, предпочтительно составляет от 100 до 2000 мкл и наиболее предпочтительно составляет 500 мкл.

В контексте настоящего изобретения для струйной инъекции можно применять любое устройство, если оно может создавать струю жидкости, пригодную для указанного в настоящем описании введения. Отсутствует ограничение, касающееся средств, с помощью которых происходит ускорение жидкости. Например, можно применять системы, основанные на применении пружины для выбрасывания жидкости, а также системы, основанные на применении газа или других пропеллентов. Кроме того, можно применять постоянную струю жидкости, предпочтительно по меньшей мере с двумя различными скоростями с использованием по меньшей мере двух фаз, указанных в настоящем описании. Альтернативно этому, можно применять импульсную микрофорсунку. Предпочтительно применяют системы для инъекции струи, которые поступают в продажу, такие как Stratis, Tropis (обе фирмы Pharmajet), Vitajet, Biojector 2000 или Bioject Zetajet (все три системы фирмы Bioject Medical Technologies Inc.), Glide (фирмы Glide Pharma), MediJector Vision (фирмы Antares), Sumavel DosePro (фирмы Zogenix), SQ Pen (фирмы Bespak) и Injex (фирмы Equidyne). Модифицированную РНК инъецируют с помощью указанной системы, которая предпочтительно обеспечивает точное и воспроизводимое введение предварительно отобранной дозы. Предпочтительно устройство гарантирует приемлемое натяжение кожи для инъекции в кожу струи жидкости. В предпочтительном варианте осуществления изобретения применяют устройство, описанное в международной заявке на патент WO 2013/090315, описание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительно модифицированную РНК инъецируют с помощью устройства, которое содержит по меньшей мере один из индивидуальных компонентов безыгольного устройства для инъекции, которое представлено на любом из чертежей 1-17В WO 2013/090315, предпочтительно компонент выбирают из группы, состоящей из сжимаемой основной пружины, пусковой кнопки, пружины для натяжения кожи, корпуса поршня, уплотняющей прокладки и ударник. Более предпочтительно модифицированную РНК инъецируют с использованием устройства, представленного на любом из чертежей 1-10 WO 2013/090315, в котором основную пружину можно предпочтительно заставлять смещаться в бок от конца шприца устройства для инъекции, когда давление прилагают к форсунке безыгольного шприца перед инъекцией. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированную РНК инъецируют с помощью устройства Tropis (фирма Pharmajet).

Согласно изобретению РНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию и содержащую по меньшей мере одну открытую рамку считывания, вводят путем струйной инъекции внутрикожно, внутримышечно или подкожно. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированную РНК вводят внутрикожно, при этом струйную инъекцию осуществляют с использованием форсунки, которая имеет диаметр от 20 до 150 мкм, предпочтительно от 30 до 130 мкм, более предпочтительно от 40 до 110 мкм, еще более предпочтительно от 50 до 100 мкм, и скорость реактивного выхода составляет предпочтительно по меньшей мере 80 м/с, более предпочтительно по меньшей мере 100 м/с, еще более предпочтительно по меньшей мере 150 м/с и наиболее предпочтительно по меньшей мере 190 м/с.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированную РНК вводят внутрикожно с помощью устройства TROPIS (фирма Pharmajet).

Как правило, успешному введению жидкости в дерму млекопитающего может способствовать образование волдыря (называемого также пузырьком) в месте инъекции. Предпочтительно диаметр волдыря составляет по меньшей мере 5 мм, более предпочтительно по меньшей мере 7 мм, еще более предпочтительно по меньшей мере 9 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10 мм.

В контексте настоящего изобретения понятие «модифицированная РНК» включает любой тип молекулы рибонуклеиновой кислоты, модифицированной так, чтобы количество белка или пептида, продуцируемого указанной модифицированной РНК, при измерении в определенный момент времени или в течение определенного промежутка времени повышалось по сравнению с РНК, у которой отсутствует модификация («немодифицированная референс-РНК»). Указанное повышение экспрессии в контексте настоящего описания обозначают согласно вышеизложенному как «ассоциированное с модификацией повышение экспрессии белка».

Таким образом, в изобретении предложена модифицированная молекула РНК, которая отличается повышенной экспрессией кодируемого белка по сравнению с соответствующей РНК, у которой отсутствует модификация («немодифицированная референс-РНК»). Для оценки производства белков in vivo модифицированной РНК экспрессию кодируемого белка определяют после инъекции модифицированной РНК в клетки-/ткани-мишени и сравнивают с экспрессией белка при использовании немодифицированной референс-РНК. В данной области известны количественные методы определения экспрессии белков (например, Вестерн-блоттинг, ELISA, масс-спектрометрия). Наиболее предпочтительным в этом контексте является определение экспрессии репортерного белка типа люциферазы или секретируемой (эмбриональной) щелочной фосфатазы (SEAP). Таким образом, модифицированную РНК или немодифицированную референс-РНК инъецируют в ткань-мишень, например, с помощью общепринятой игольной инъекции или струйной инъекции, предпочтительно внутрикожно, внутримышечно или подкожно. Через несколько часов или несколько дней (например, через 6, 12, 24, 48 или 72 ч) после инициации экспрессии или после инъекции РНК ткань из области инъекции изымают и лизируют. Затем лизаты можно применять для выявления и количественной оценки экспрессируемого белка (и таким образом для определения эффективности экспрессии белка) с использованием нескольких методов, например, Вестерн-блоттинга, ELISA, масс-спектрометрии или измерения флуоресценции или люминесценции.

При этом, если сравнивают экспрессию белка с модифицированной РНК и экспрессию белка с немодифицированной референс-РНК в определенный момент времени (например, через 6, 12, 24, 48 или 72 ч после инициации экспрессии или после инъекции РНК), то обе РНК инъецируют по отдельности подопытным животным, ткань из областей инъекции изымают через определенный период времени, получают белковые лизаты согласно конкретному протоколу, адаптированному к конкретному методу определения (например, Вестерн-блоттинг, ELISA и т.д., известному в данной области) и белок выявляют с помощью выбранного метода детекции и оценивают количественно.

Если требуется осуществлять количественную оценку общего количества белка, полученного в течение определенного периода времени, то ткань можно изымать через несколько моментов времени после инъекции РНК (например, через 6, 12, 24, 48 и 72 ч после инициации экспрессии или после инъекции РНК; как правило, из различных подопытных животных), и можно определять согласно описанному выше методу количество белка в данный момент времени. Для расчета кумулятивного количества белка можно применять математический метод определения общего количества белка, например, можно определять площадь под кривой (AUC) с помощью следующей формулы:

Для расчета площади под кривой для общего количества белка рассчитывают интеграл описываемой уравнением площади под кривой экспрессии между каждой из конечных точек (a и b).

Согласно изобретению молекулу РНК структурно модифицируют для повышения экспрессии кодируемого белка («ассоциированное с модификацией повышение экспрессии белка»). При этом модификация не ограничена какой-либо конкретной структурой, если экспрессия кодируемого белка повышается по сравнению с немодифицированной референс-РНК, указанной в настоящем описании. В данной области известно несколько модификаций РНК, которые можно применять к данной РНК в контексте настоящего изобретения.

Химические модификации:

В контексте настоящего описания понятие «модификация РНК» может относиться к химическим модификациям, включающим модификации каркаса, а также модификации сахаров или модификации оснований.

В этом контексте модифицированная молекула РНК, указанная в настоящем описании, может содержать нуклеотидные аналоги/модификации, например, модификации каркаса, модификации сахаров или модификации оснований. Модификация каркаса в контексте настоящего изобретения представляет собой модификацию, при которой химически модифицируют фосфаты каркаса нуклеотидов, присутствующих в молекуле нуклеиновой кислоты, указанной в настоящем описании. Модификация сахаров в контексте настоящего изобретения представляет собой химическую модификацию сахара в нуклеотидах нуклеиновой кислоты, указанной в настоящем описании. Кроме того, модификация оснований в контексте настоящего изобретения представляет собой химическую модификацию основного фрагмента в нуклеотидах нуклеиновой кислоты. В этом контексте нуклеотидные аналоги или модификации предпочтительно выбирают из нуклеотидных аналогов, которые можно применять для транскрипции и/или трансляции.

Модификации сахаров:

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, которые можно включать в модифицированную РНК, представленную в настоящем описании, можно модифицировать в сахарном фрагменте. Например, 2'-гидроксильную группу (ОН) можно модифицировать или заменять рядом различных «окси»- или «дезокси»-заместителей. Примеры «окси»-модификаций 2'-гидроксильной группы включают (но, не ограничиваясь только ими) алкоксигруппу или арилоксигруппу (-OR, например, R обозначает Н, алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероарил или сахар); полиэтиленгликоли (ПЭГ), -O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR; «закрытые» нуклеиновые кислоты (ЗНК), в которых 2'-гидроксил соединен, например, с помощью метиленового мостика, с 4' углеродом этого же сахара рибозы; и аминогруппы (-О-амино, в которых аминогруппа, например, NRR, может представлять собой алкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, гетероциклил, ариламиногруппу, диариламиногруппу, гетероариламиногруппу или дигетероариламиногруппу, этилендиамин, полиаминогруппу) или аминоалкоксигруппу.

«Дезокси»-модификации включают водород, аминогруппу (например, NH₂; алкиламиногруппу, диалкиламиногруппу, гетероциклил, ариламиногруппу, диариламиногруппу, гетероариламиногруппу, дигетероариламиногруппу или аминокислоту); или аминогруппа может быть присоединена к сахару через линкер, где линкер содержит один или несколько атомов С, N и О.

Сахарный фрагмент может содержать также один или несколько атомов углерода в противоположной стереохимической конфигурации относительно той, в которой соответствующий атом углерода находится в рибозе. Таким образом, модифицированная РНК может включать нуклеотиды, содержащие, например, арабинозу в качестве сахара.

Модификации каркаса:

Можно также модифицировать фосфатный каркас в модифицированных нуклеозидах и нуклеотидах, которые можно включать в модифицированную РНК, представленную в настоящем описании. Фосфатные группы каркаса можно модифицировать путем замены одного или нескольких атомов кислорода на другой заместитель. Кроме того, модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды могут включать полную замену немодифицированного фосфатного фрагмента на модифицированный фосфат, указанный в настоящем описании. Примеры модифицированных фосфатных групп включают (но, не ограничиваясь только ими) фосфоротиоат, фосфороселенаты, боранофосфаты, сложные эфиры боранофосфатов, кислые фосфонаты, фосфороамидаты, алкил- или арилфосфонаты и фосфотриэфиры. В фосфородитиоатах оба несвязанных кислорода замещены серой. Фосфатную связь можно модифицировать путем замены связанного кислорода на азот (связанные мостиком фосфороамидаты), серу (связанные мостиком фосфоротиоаты) и углерод (связанные мостиком метиленфосфонаты).

Модификации оснований:

Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, которые можно включать в модифицированную РНК, представленную в настоящем описании, можно модифицировать также во включающем нуклеотидное основание фрагменте. Примерами нуклеотидных оснований, встречающихся в РНК, являются (но, не ограничиваясь только ими) аденин, гуанин, цитозин и урацил. Например, нуклеозиды и нуклеотиды, указанные в настоящем описании, можно модифицировать химически на поверхности большой бороздки. В некоторых вариантах осуществления изобретения химические модификации большой бороздки могут включать аминогруппу, тиольную группу, алкильную группу или галогеновую группу.

В наиболее предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидные аналоги/модификации выбирают из модификаций оснований, которые предпочтительно выбирают из 2-амино-6-хлорпуринрибозид-5'-трифосфата, 2-аминопуринрибозид-5'-трифосфата, 2-аминоаденозин-5'-трифосфата, 2'-амино-2'-дезоксицитидинтрифосфата, 2-тиоцитидин-5'-трифосфата, 2-тиоуридин-5'-трифосфата, 2'-фтортимидин-5'-трифосфата, 2'-O-метилинозин5'-трифосфата, 4-тиоуридин-5'-трифосфата, 5-аминоаллилцитидин-5'-трифосфата, 5-аминоаллилуридин-5'-трифосфата, 5-бромцитидин-5'-трифосфата, 5-бромуридин-5'-трифосфата, 5-бром-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 5-бром-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, 5-йодцитидин-5'-трифосфата, 5-йод-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 5-йодуридин-5'-трифосфата, 5-йод-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, 5-метилцитидин-5'-трифосфата, 5-метилуридин-5'-трифосфата, 5-пропинил-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфата, 5-пропинил-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата, 6-азацитидин-5'-трифосфата, 6-азауридин-5'-трифосфата, 6-хлорпуринрибозид-5'-трифосфата, 7-деазааденозин-5'-трифосфата, 7-деазагуанозин5'-трифосфата, 8-азааденозин-5'-трифосфата, 8-азидоаденозин-5'-трифосфата, бензимидазолрибозид-5'-трифосфата, N1-метиладенозин-5'-трифосфата, N1-метилгуанозин-5'-трифосфата, N6-метиладенозин-5'-трифосфата, O6-метилгуанозин-5'-трифосфата, псевдоуридин-5'-трифосфата или пуромицин-5'-трифосфата, ксантозин-5'-трифосфата. Наиболее предпочтительные нуклеотиды для модификаций оснований выбирают из группы нуклеотидов с модифицированными основаниями, включающей 5-метилцитидин-5'-трифосфат, 7-деазагуанозин-5'-трифосфат, 5-бромцитидин-5'-трифосфат и псевдоуридин-5'-трифосфат.

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированные нуклеозиды включают пиридин-4-онрибонуклеозид, 5-азауридин, 2-тио-5-аза-уридин, 2-тиоуридин, 4-тиопсевдоуридин, 2-тиопсевдоуридин, 5-гидроксиуридин, 3-метилуридин, 5-карбоксиметилуридин, 1-карбоксиметилпсевдоуридин, 5-пропинилуридин, 1-пропинилпсевдоуридин, 5-тауринометилуридин, 1-тауринометилпсевдоуридин, 5-тауринометил-2-тиоуридин, 1-тауринометил-4-тиоуридин, 5-метилуридин, 1-метилпсевдоуридин, 4-тио-1-метилпсевдоуридин, 2-тио-1-метилпсевдоуридин, 1-метил-1-деазапсевдоуридин, 2-тио-1-метил-1-деазапсевдоуридин, дигидроуридин, дигидропсевдоуридин, 2-тиодигидроуридин, 2-тиодигидропсевдоуридин, 2-метоксиуридин, 2-метокси-4-тиоуридин, 4-метоксипсевдоуридин и 4-метокси-2-тиопсевдоуридин.

В некоторых вариантах осуществления модифицированные нуклеозиды включают 5-азацитидин, псевдоизоцитидин, 3-метилцитидин, N4-ацетилцитидин, 5-формилцитидин, N4-метилцитидин, 5-гидроксиметилцитидин, 1-метил-псевдоизоцитидин, пирролоцитидин, пирролопсевдоизоцитидин, 2-тиоцитидин, 2-тио-5-метилцитидин, 4-тиопсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метилпсевдоизоцитидин, 4-тио-1-метил-1-деазапсевдоизоцитидин, 1-метил-1-деазапсевдоизоцитидин, зебуларин, 5-азазебуларин, 5-метилзебуларин, 5-аза-2-тиозебуларин, 2-тиозебуларин, 2-метоксицитидин, 2-метокси-5-метилцитидин, 4-метоксипсевдоизоцитидин и 4-метокси-1-метилпсевдоизоцитидин.

В других вариантах осуществления изобретения модифицированные нуклеозиды включают 2-аминопурин, 2,6-диаминопурин, 7-деазааденин, 7-деаза-8-азааденин, 7-деаза-2-аминопурин, 7-деаза-8-аза-2-аминопурин, 7-деаза-2,6-диаминопурин, 7-деаза-8-аза-2,6-диаминопурин, 1-метиладенозин, N6-метиладенозин, N6-изопентениладенозин, N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин, 2-метилтио-N6-(цис-гидроксиизопентенил)аденозин, N6-глицинилкарбамоиладенозин, N6-треонилкарбамоиладенозин, 2-метилтио-N6-треонилкарбамоиладенозин, N6,N6-диметиладенозин, 7-метиладенин, 2-метилтиоаденин и 2-метоксиаденин.

В других вариантах осуществления изобретения модифицированные нуклеозиды включают инозин, 1-метилинозин, виозин, вибутозин, 7-деазагуанозин, 7-деаза-8-азагуанозин, 6-тиогуанозин, 6-тио-7-деазагуанозин, 6-тио-7-деаза-8-азагуанозин, 7-метилгуанозин, 6-тио-7-метилгуанозин, 7-метилинозин, 6-метоксигуанозин, 1-метилгуанозин, N2-метилгуанозин, N2,N2-диметилгуанозин, 8-оксогуанозин, 7-метил-8-оксогуанозин, 1-метил-6-тиогуанозин, N2-метил-6-тиогуанозин и N2,N2-диметил-6-тиогуанозин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотид можно модифицировать на поверхности большой бороздки, и он может включать замену водорода на С-5 урацила на метильную группу или галогеновую группу.

В конкретных вариантах осуществления изобретения модифицированный нуклеозид представляет собой 5'-O-(1-тиофосфат)аденозин, 5'-O-(1-тиофосфат)цитидин, 5'-O-(1-тиофосфат)гуанозин, 5'-O-(1-тиофосфат)уридин или 5'-O-(1-тиофосфат)псевдоуридин.

В других конкретных вариантах осуществления модифицированная РНК может содержать модификации нуклеозидов, выбранные из 6-азацитидина, 2-тиоцитидина, α-тиоцитидина, псевдоизоцитидина, 5-аминоаллилуридина, 5-йодуридина, N1-метилпсевдоуридина, 5,6-дигидроуридина, α-тиоуридина, 4-тиоуридина, 6-азауридина, 5-гидроксиуридина, дезокситимидина, 5-метилуридина, пирролоцитидина, инозина, α-тиогуанозина, 6-метилгуанозина, 5-метилцитидина, 8-оксогуанозина, 7-деазагуанозина, N1-метиладенозина, 2-амино-6-хлорпурина, N6-метил-2-аминопурина, псевдоизоцитидина, 6-хлорпурина, N6-метиладенозина, α-тиоаденозина, 8-азидоаденозина, 7-деазааденозина.

Липидная модификация:

Согласно другому варианту осуществления изобретения модифицированная РНК, указанная в настоящем описании, может содержать липидную модификацию. Такая модифицированная липидами РНК, как правило, содержит указанную в настоящем описании РНК. Такая модифицированная липидами молекула РНК, как правило, дополнительно содержит по меньшей мере один линкер, ковалентно связанный с молекулой РНК, и по меньшей мере один липид, ковалентно связанный с соответствующим линкером. Альтернативно этому, модифицированная липидами молекула РНК содержит по меньшей мере одну молекулу РНК, указанную в настоящем описании, и по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с указанной молекулой РНК. Согласно третьей альтернативе модифицированная липидами молекула РНК содержит молекулу РНК, указанную в настоящем описании, по меньшей мере один линкер, ковалентно связанный с указанной молекулой РНК, и по меньшей мере один липид, ковалентно связанный с соответствующим линкером, и также по меньшей мере один (бифункциональный) липид, ковалентно связанный (без линкера) с указанной молекулой РНК. В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы липидная модификация присутствовала на концах линейной последовательности РНК.

Модификация 5'-конца модифицированной РНК:

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения модифицированная молекула РНК, указанная в настоящем описании, может быть модифицирована путем добавления так называемой «5'-кэп»-структуры.

5'-кэп представляет собой структуру, как правило, модифицированную нуклеотидную структуру на 5'-конце зрелой мРНК. 5'-кэп может, как правило, быть образован модифицированным нуклеотидом, прежде всего производным гуанинового нуклеотида. Предпочтительно 5'-кэп связан с 5'-концом через 5'-5'-трифосфатную связь. 5'-кэп может быть метилирован, например, представлять собой m7GpppN, где N обозначает концевой 5'-нуклеотид нуклеиновой кислоты, несущей 5'-кэп, как правило, 5'-конец РНК. m7GpppN представляет собой структуру 5'-кэпа, которая встречается в естественных условиях в мРНК, которая транскрибируется с помощью полимеразы II и поэтому не рассматривается в качестве модификации, которая содержится в модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении. Это означает, что модифицированная РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать m7GpppN в качестве 5'-кэпа, но кроме этого модифицированная РНК содержит по меньшей мере одну дополнительную модификацию, указанную в настоящем описании.

Другими примерами структур 5'-кэпа являются глицерил, инвертированная дезоксигруппа (фрагмент), лишенная азотистого основания, 4',5'-метиленовый нуклеотид, 1-(бета-D-эритрофуранозильный) нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситольный нуклеотид, L-нуклеотиды, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, треопентофуранозильный нуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутильный нуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентильный нуклеотид, 3'-3'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-3'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 3'-2'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-2'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 1,4-бутандиолфосфатный, 3'-фосфороамидатный, гексилфосфатный, аминогексилфосфатный, 3'-фосфатный, 3'-фосфоротиоатный, фосфородитиоатный или связанный мостиком или несвязанный мостиком метилфосфонатный фрагмент. Указанные модифицированные структуры 5'-кэпа рассматриваются в качестве по меньшей мере одной модификации, содержащейся в модифицированной РНК, предлагаемой в настоящем изобретении.

Наиболее предпочтительными модифицированными структурами 5'-кэпа являются САР1 (метилирование рибозы нуклеотида, примыкающего к m7G), САР2 (метилирование рибозы 2-ого нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), САР3 (метилирование рибозы 3-его нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), САР4 (метилирование рибозы 4-ого нуклеотида, расположенного в прямом направлении относительно m7G), ARCA (аналог кэп-структуры с правильной ориентацией), модифицированный ARCA (например, модифицированный фосфотиоатом ARCA), инозин, N1-метилгуанозин, 2'-фторгуанозин, 7-деазагуанозин, 8-оксогуанозин, 2-аминогуанозин, ЗНК-гуанозин и 2-азидогуанозин.

Модификация последовательности открытой рамки считывания:

Модификация содержания G/C:

В конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения модифицируют содержание G/C в кодирующей области, которая кодирует по меньшей мере один пептид или белок, модифицированной РНК, представленной в настоящем описании, прежде всего повышают по сравнению с содержанием G/C в соответствующей ей кодирующей области дикого типа, т.е. немодифицированной кодирующей области. Аминокислотную последовательность, кодируемую по меньшей мере одной кодирующей областью, предпочтительно не модифицируют по сравнению с аминокислотной последовательностью, кодируемой соответствующей кодирующей областью дикого типа.

Указанная модификация содержания G/C в кодирующей области модифицированной РНК, представленной в настоящем описании, основана на том факте, что последовательность любой области мРНК, подлежащей трансляции, является важной для эффективной трансляции указанной мРНК. Таким образом, важными являются состав и последовательность различных нуклеотидов. В частности, последовательности мРНК, имеющие повышенное содержание G (гуанозин)/С (цитозин), являются более стабильными, чем последовательности мРНК, имеющие повышенное содержание А (аденозин)/U (урацил). Таким образом, согласно изобретению кодоны кодирующей области изменяют по сравнению с соответствующей кодирующей областью дикого типа таким образом, чтобы они содержали большее количество G/C-нуклеотидов, с сохранением транслируемой аминокислотной последовательности. Учитывая тот факт, что несколько кодонов кодируют одну и ту же аминокислоту (так называемая вырожденность генетического кода), можно определять наиболее предпочтительные с точки зрения стабильности кодоны (так называемые альтернативные наиболее часто встречающиеся кодоны).

В зависимости от аминокислоты, кодируемой кодирующей областью модифицированной мРНК, представленной в настоящем описании, существуют различные возможности модификации последовательности РНК, например, кодирующей области, по сравнению с соответствующей кодирующей областью дикого типа. В случае аминокислот, которые кодируются кодонами, содержащими исключительно нуклеотиды G или С, никакая модификация кодона не является необходимой. Так, кодоны Pro (ССС или CCG), Arg (CGC или CGG), Ala (GCC или GCG) и Gly (GGC или GGG) не нуждаются в модификации, поскольку в них не присутствует А или U.

В противоположность этому, кодоны, которые содержат нуклеотиды А и/или U, можно модифицировать путем замены на другие кодоны, которые кодируют эти же аминокислоты, но не содержат А и/или U. Их примерами являются:

кодоны CCU или ССА, кодирующие Pro, можно заменять на ССС или CCG;

кодоны CGU или CGA или AGA или AGG, кодирующие Arg, можно заменять на CGC или CGG;

кодоны GCU или GCA, кодирующие Ala, можно заменять на GCC или GCG;

кодоны GGU или GGA, кодирующие Gly, можно заменять на GGC или GGG.

В других случаях, когда нуклеотиды А или U нельзя элиминировать из кодонов, можно снижать содержание А и U с использованием кодонов, которые содержат нуклеотиды А и/или U в более низком количестве. Примерами указанных колонов являются:

кодон UUU, кодирующий Phe, можно заменять на UUC;

кодоны UUA, UUG, CUU или CUA, кодирующие Leu, можно заменять на CUC или CUG;

кодоны UCU или UCA или AGU, кодирующие Ser, можно заменять на UCC, UCG или AGC;

кодон UAU, кодирующий Tyr, можно заменять на UAC;

кодон UGU, кодирующий Cys, можно заменять на UGC;

кодон CAU, кодирующий His, можно заменять на САС;

кодон САА, кодирующий Gln, можно заменять на CAG;

кодоны AUU или AUA, кодирующие Ilе, можно заменять на AUC;

кодоны ACU или АСА, кодирующие Thr, можно заменять АСС или ACG;

кодон AAU, кодирующий Asn, можно заменять на ААС;

кодон AAA, кодирующий Lys, можно заменять на AAG;

кодоны GUU или GUA, кодирующие Val, можно заменять на GUC или GUG;

кодон GAU, кодирующий Asp, можно заменять на GAC;

кодон GAA, кодирующий Glu, можно заменять на GAG;

кодон UAA (стоп-кодон) можно заменять на UAG или UGA.

С другой стороны, в случае кодонов Met (AUG) и Trp (UGG), отсутствует возможность модификации последовательности.

Перечисленные выше замены можно использовать либо индивидуально, либо в любых возможных комбинациях для повышения содержания G/C в кодирующей области модифицированной РНК, представленной в настоящем описании, по сравнению с соответствующей кодирующей областью дикого типа (т.е. исходной последовательности). Так, например, все кодоны Thr, встречающиеся в последовательности дикого типа, можно заменять на АСС (или ACG).

Предпочтительно содержание G/C в кодирующей области модифицированной РНК, представленной в настоящем описании, повышают по меньшей мере на 7%, более предпочтительно по меньшей мере на 15%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 20%, по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области дикого типа. В конкретном варианте осуществления изобретения заменяют по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%, 95% или даже 100% пригодных для замены кодонов в кодирующей области, кодирующей по меньшей мере один белок или пептид, который содержит патогенный антиген или его фрагмент, вариант и/или производное, повышая тем самым содержание G/C в указанной кодирующей области.

В этом контексте наиболее предпочтительно повышать содержание G/C в кодирующей области модифицированной РНК, представленной в настоящем описании, до максимума (т.е. до 100% пригодных для замены кодонов), по сравнению с кодирующей областью дикого типа.

Оптимизация кодонов:

Согласно изобретению дополнительная предпочтительная модификация кодирующей области, которая кодирует по меньшей мере один пептид или белок, модифицированной РНК, представленной в настоящем описании, основана на открытии того факта, что эффективность трансляции определяется также различной частотой встречаемости тРНК в клетках. Таким образом, если в кодирующей области последовательности РНК дикого типа присутствуют в повышенном количестве так называемые «редкие кодоны», то уровень трансляции мРНК является значимо более низким, чем в том случае, когда присутствуют кодоны, кодирующие относительно «часто встречающуюся» тРНК.

В этом контексте кодирующую область модифицированной РНК предпочтительно модифицируют по сравнению с кодирующей областью дикого типа так, что по меньшей мере один кодон последовательности дикого типа, который кодирует тРНК, которая является относительно редкой в клетке, заменяют на кодон, который кодирует тРНК, которая относительно часто встречается в клетке и «несет» такую же аминокислоту, что и относительно редко встречающаяся тРНК. Посредством такой модификации кодирующую область модифицированной РНК, представленной в настоящем описании, модифицируют таким образом, чтобы встраивать кодоны, для которых доступны часто встречающиеся тРНК. Другими словами, согласно изобретению с помощью такой модификации все кодоны кодирующей области дикого типа, которые кодируют тРНК, являющуюся относительно редкой в клетке, в каждом случае заменяют на кодон, который кодирует тРНК, относительно часто встречающуюся в клетке, и которая в каждом случае «несет» такую же аминокислоту, что и относительно редкая тРНК.

тРНК, встречающиеся относительно часто в клетке, и наоборот, встречающиеся относительно редко, известны специалистам в данной области, см., например, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev., 11(6), 2001, сс. 660-666. Кодоны, которые применяют для наиболее часто встречающейся тРНК конкретной аминокислоты, например кодон Gly, который использует тРНК, встречающуюся наиболее часто в (человеческой) клетке, являются наиболее предпочтительными.

Согласно изобретению наиболее предпочтительным является объединение повышения, предпочтительно до максимума, содержания G/C в последовательности кодирующей области модифицированной РНК, представленной в настоящем описании, с помощью «часто встречающихся» кодонов без модификации аминокислотой последовательности пептида или белка, кодируемого кодирующей областью последовательности РНК. Этот предпочтительный вариант осуществления изобретения позволяет наиболее эффективно транслировать и стабилизировать (модифицированную) РНК-последовательность, представленную в настоящем описании.

Модификация 3'-конца модифицированной РНК:

Кроме того, в модифицированной РНК, содержащей по меньшей мере одну открытую рамку считывания, которую следует вводить путем струйной инъекции, можно модифицировать 3'-область кодирующей области, например, путем инсерции или добавления сегментов из нескольких повторов остатков аденина или цитозина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'-конец молекулы РНК модифицируют путем добавления серией адениновых нуклеотидов («поли(А)-хвост»).

Длина поли(А)-хвоста оказывает основное влияние на эффективность трансляции соответствующей конструкции. Для эффективной трансляции поли(А)-хвост введенных экзогенно мРНК должен состоять по меньшей мере из 20 остатков А. Кроме того, описано, что экспрессия мРНК положительно коррелирует с длиной поли(А)-хвоста (см. обзор Tavernier и др., J Control Release., 150(3), 30 марта 2011 г., сс. 238-247; PMID: 20970469). В этом контексте Holtkamp с соавторами продемонстрировали, что поли(А)-хвост, который состоит из 120 нуклеотидов, по сравнению с более короткой конструкцией повышает стабильность и эффективность трансляции мРНК (Holtkamp и др., Blood. 108(13), 15 декабря 2006 г., сс. 4009-4017; PMID: 16940422). В одном из вариантов осуществления изобретения для струйной инъекции применяют модифицированную РНК, которая содержит (необязательно в сочетании с другими модификациями) поли(А)-хвост, в которой поли(А)-хвост содержит по меньшей мере 30, предпочтительно более чем 50, более предпочтительно более чем 100, еще более предпочтительно более чем 200 адениновых нуклеотидов. Наиболее предпочтительно РНК содержит поли(А)-хвост, состоящий из 64 адениновых нуклеотидов.

В конкретных вариантах осуществления изобретения поли(А)-хвост рассматривается в качестве лишь по меньшей мере одной модификации, содержащейся в модифицированной РНК, предлагаемой в настоящем изобретении, если поли(А)-хвост содержит более чем 30 аденозинов, предпочтительно больше чем 50 аденозинов, более предпочтительно больше чем 100 аденозинов и еще более предпочтительно больше чем 200 аденозинов.

В других конкретных вариантах осуществления изобретения модификация с помощью поли(А)-хвоста не рассматривается в качестве по меньшей мере одной модификации модифицированной РНК, предлагаемой в настоящем изобретении. Это означает, что модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, может содержать поли(А)-хвост, указанный выше, но может содержать также по меньшей мере одну дополнительную модификацию, указанную в настоящем описании.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения подлежащая применению с помощью струйной инъекции модифицированная РНК, содержащая по меньшей мере одну открытую рамку считывания, содержит (необязательно в сочетании с другими модификациями) поли(С)-последовательность в 3'-области кодирующей области РНК. Подподпоследовательность, как правило, представляет собой сегмент, состоящий из нескольких цитозиновых нуклеотидов, как правило, от примерно 10 до примерно 200 цитидиновых нуклеотидов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 100 цитидиновых нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 70 цитидиновых нуклеотидов или еще более предпочтительно от примерно 20 до примерно 50 или даже от примерно 20 до примерно 30 цитидиновых нуклеотидов. Поли(С)-последовательность может предпочтительно располагаться на 3'-конце кодирующей последовательности, входящей в нуклеиновую кислоту. В конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения поли(С)-последовательность локализована на 3'-конце поли(А)-последовательности.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, содержит или кодирует гистоновую структуру типа «стебель-петля» на ее 3'-конце в качестве по меньшей мере одной модификации. В контексте настоящего изобретения последовательность гистоновой структуру типа «стебель-петля» предпочтительно выбирают по меньшей мере из одной из следующих формул (I) или (II):

формула (I) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (II) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

в которых:

где

у элементов stem1 и stem2 может происходить спаривание оснований друг с другом с образованием обратно комппементарной последовательности, где спаривание оснований может иметь место между stem1 и stem2, например, посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику нуклеотидов А и U/T или G и С, или посредством спаривания оснований не по Уотсону-Крику, например, посредством спаривания «качающихся» оснований («качающегося» спаривания оснований), обратного спариванию оснований по Уотсону-Крику, посредством хугстиновского спаривания оснований, посредством обратного хугстиновскому спаривания оснований, или у них может происходить спаривание оснований друг с другом с образованием частично обратно комплементарной последовательности, при этом неполное спаривание оснований может иметь место между stem1 и stem2, вследствие того, что для одного или нескольких оснований в одном стебле не имеется комплементарного основания в обратно комплементарной последовательности другого стебля.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать или кодировать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ia) или (IIa):

формула (Ia) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (IIa) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

в которой:

N, С, G, T и U имеют указанные выше значения.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать или кодировать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ib) или (IIb):

формула (Ib) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

формула (IIb) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

в которой:

N, С, G, T и U имеют указанные выше значения.

Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать или кодировать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ic)-(Ih) или (IIc)-(IIh), которые являются альтернативными по структуре типа «стебель-петля», и имеют линейную последовательность, соответствующую последовательностям гистоновой структуры типа «стебель-петля»:

формула (Ic): (консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля многоклеточных и простейших организмов):

N U

N N

N-N

N-N

N-N

N-N

G-C

N-N (структура типа «стебель-петля»)

NGNNNNNNUNNNNNCN

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 1),

формула (IIc): (консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля многоклеточных и простейших организмов):

N U

N N

N-N

N-N

N-N

N-N

G-C

N*N*NNNN-NNNN*N*N* (структура типа «стебель-петля»)

N*N*NNNNGNNNNNNUNNNNNCNNNN*N*N*

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 2),

формула (Id): (без пограничных элементов стебля)

N U

N N

N-N

N-N

N-N

N-N

C-G

N-N (структура типа «стебель-петля»)

NCNNNNNNUNNNNNGN

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 3),

формула (IId): (с пограничными элементами стебля)

N U

N N

N-N

N-N

N-N

N-N

C-G

N*N*NNNN-NNNN*N*N* (структура типа «стебель-петля»)

N*N*NNNNCNNNNNNUNNNNNGNNNN*N*N*

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 4),

формула (Ie): (консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля простейших организмов):

N U

N N

N-N

N-N

N-N

N-N

G-C

D-H (структура типа «стебель-петля»)

DGNNNNNNUNNNNNCH

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 5),

формула (IIe): (консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля простейших организмов):

N U

N N

N-N

N-N

N-N

N-N

G-C

N*N*NNND-HNNN*N*N* (структура типа «стебель-петля»)

N*N*NNNDGNNNNNNUNNNNNCHNNN*N*N*

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 6),

формула (If): (консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля многоклеточных организмов):

N U

N N

Y-V

Y-N

B-D

N-N

G-C

N-N (структура типа «стебель-петля»)

NGNBYYNNUNVNDNCN

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 7),

формула (IIf): (консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля многоклеточных организмов):

N U

N N

Y-V

Y-N

B-D

N-N

G-C

N*N*NNNN-NNNN*N*N* (структура типа «стебель-петля»)

N*N*NNNNGNBYYNNUNVNDNCNNNN*N*N*

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 8),

формула (Ig): (консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля позвоночных животных):

N U

D H

Y-A

Y-B

Y-R

H-D

G-C

N-N (структура типа «стебель-петля»)

NGHYYYDNUHABRDCN

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 9),

формула (IIg): (консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля позвоночных животных):

N U

D Н

Y-A

Y-B

Y-R

H-D

G-C

N*N*HNNN-NNNN*N*H* (структура типа «стебель-петля»)

N*N*HNNNGHYYYDNUHABRDCNNNN*N*H*

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 10),

формула (Ih): (человеческая (Homo sapiens) консенсусная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):

Y U

D Н

U-A

C-S

Y-R

H-R

G-C

D-C (структура типа «стебель-петля»)

DGHYCUDYUHASRRCC

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 11),

формула (IIh): (человеческая (Homo sapiens) консенсусная последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):

Y U

D Н

U-A

C-S

Y-R

H-R

G-C

N*H*AAHD-CVHB*N*H* (структура типа «стебель-петля»)

N*H*AAHDGHYCUDYUHASRRCCVHB*N*H*

(линейная последовательность) (SEQ ID NO: 12),

где в каждой из формул (Ic)-(Ih) или (IIc)-(IIh): N, С, G, А, Т и U имеют указанные выше значения; каждый U можно заменять на Т; каждый (высоко) консервативный G или С в элементах 1 и 2 «стебля» можно заменять на комплементарное ему нуклеотидное основание С или G при условии, что указанный комплементарный нуклеотид в соответствующем «стебле» параллельно заменяют на комплементарный ему нуклеотид; и/или G, А, Т, U, С, R, Y, М, K, S, W, Н, В, V, D и N представляют собой нуклеотидные основания, указанные ниже в таблице:

В этом контексте наиболее предпочтительной последовательностью гистоновой структуры типа «стебель-петля», которая соответствует по меньшей мере одной из формул (I) или (Ia)-(Ih), или (II), или (IIa)-(IIh), предлагаемых в настоящем изобретении, является последовательность, выбранная из встречающейся в естественных условиях последовательности гистоновой структуры типа «стебель-петля», более предпочтительно из последовательностей гистоновой структуры типа «стебель-петля» из простейших или многоклеточных организмов и еще более предпочтительно из последовательностей гистоновой структуры типа «стебель-петля» из позвоночных животных и наиболее предпочтительно из последовательностей гистоновой структуры типа «стебель-петля» из млекопитающих, наиболее предпочтительно из человеческих последовательностей гистоновой структуры типа «стебель-петля».

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», которая соответствует по меньшей мере одной из конкретных формул (I) или (Ia)-(Ih), или (II), или (IIa)-(IIh), предлагаемых в настоящем изобретении, представляет собой последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», которая содержит в каждом нуклеотидном положении наиболее часто встречающийся нуклеотид, или либо наиболее часто встречающийся, либо второй по частоте встречаемости в естественных условиях нуклеотид в последовательностях гистоновой структуры типа «стебель-петля» у многоклеточных и простейших организмов, простейших организмов, многоклеточных организмов, позвоночных животных и людей. В этом контексте наиболее предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% всех нуклеотидов соответствуют нуклеотидам, наиболее часто встречающимся в естественных условиях в последовательностях гистоновой структуры типа «стебель-петля».

В другом конкретном варианте осуществления изобретения последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», которая соответствует по меньшей мере одной из конкретных формул (I) или (Ia)-(Ih), указанных выше, выбирают из представленных ниже последовательностей гистоновой структуры типа «стебель-петля» (без пограничных элементов стебля):

VGYYYYHHTHRVVRCB (SEQ ID NO: 13, соответствует формуле (Ic)),

SGYYYTTYTMARRRCS (SEQ ID NO: 14, соответствует формуле (Ic)),

SGYYCTTTTMAGRRCS (SEQ ID NO: 15, соответствует формуле (Ic)),

DGNNNBNNTHVNNNCH (SEQ ID NO: 16, соответствует формуле (Ie)),

RGNNNYHBTHRDNNCY (SEQ ID NO: 17, соответствует формуле (Ie)),

RGNDBYHYTHRDHNCY (SEQ ID NO: 18, соответствует формуле (Ie)),

VGYYYTYHTHRVRRCB (SEQ ID NO: 19, соответствует формуле (If)),

SGYYCTTYTMAGRRCS (SEQ ID NO: 20, соответствует формуле (If)),

SGYYCTTTTMAGRRCS (SEQ ID NO: 21, соответствует формуле (If)),

GGYYCTTYTHAGRRCC (SEQ ID NO: 22, соответствует формуле (Ig)),

GGCYCTTYTMAGRGCC (SEQ ID NO: 23, соответствует формуле (Ig)),

GGCTCTTTTMAGRGCC (SEQ ID NO: 24, соответствует формуле (Ig)),

DGHYCTDYTHASRRCC (SEQ ID NO: 25, соответствует формуле (Ih)),

GGCYCTTTTHAGRGCC (SEQ ID NO: 26, соответствует формуле (Ih)),

GGCYCTTTTMAGRGCC (SEQ ID NO: 27, соответствует формуле (Ih)).

Кроме того, в этом контексте наиболее предпочтительными являются следующие последовательности гистоновой структуры типа «стебель-петля» (с пограничными элементами стебля), соответствующие одной из конкретных формул (II) или (IIa)-(IIh):

H*H*HHVVGYYYYHHTHRVVRCBVHH*N*N* (SEQ ID NO: 28, соответствует формуле (IIc)),

M*H*MHMSGYYYTTYTMARRRCSMCH*H*H* (SEQ ID NO: 29, соответствует формуле (IIc)),

M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H* (SEQ ID NO: 30, соответствует формуле (IIc)),

N*N*NNNDGNNNBNNTHVNNNCHNHN*N*N* (SEQ ID NO: 31, соответствует формуле (IIe)),

N*N*HHNRGNNNYHBTHRDNNCYDHH*N*N* (SEQ ID NO: 32, соответствует формуле (IIe)),

N*H*HHVRGNDBYHYTHRDHNCYRHH*H*H* (SEQ ID NO: 33, соответствует формуле (IIe)),

H*H*MHMVGYYYTYHTHRVRRCBVMH*H*N* (SEQ ID NO: 34, соответствует формуле (IIf)),

M*M*MMMSGYYCTTYTMAGRRCSMCH*H*H* (SEQ ID NO: 35, соответствует формуле (IIf)),

M*M*MMMSGYYCTTTTMAGRRCSACH*M*H* (SEQ ID NO: 36, соответствует формуле (IIf)),

H*H*MAMGGYYCTTYTHAGRRCCVHN*N*M* (SEQ ID NO: 37, соответствует формуле (IIg)),

H*H*AAMGGCYCTTYTMAGRGCCVCH*H*M* (SEQ ID NO: 38, соответствует формуле (IIg)),

M*M*AAMGGCTCTTTTMAGRGCCMCY*M*M* (SEQ ID NO: 39, соответствует формуле (IIg)),

N*H*AAHDGHYCTDYTHASRRCCVHB*N*H* (SEQ ID NO: 40, соответствует формуле (IIh)),

H*H*AAMGGCYCTTTTHAGRGCCVMY*N*M* (SEQ ID NO: 41, соответствует формуле (IIh)),

H*M*AAAGGCYCTTTTMAGRGCCRMY*H*M* (SEQ ID NO: 42, соответствует формуле (IIh)).

Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления изобретения модифицированная РНК содержит или кодирует по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», последовательность которой идентична по меньшей мере примерно на 80%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90% или даже более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% последовательности, содержащей не более 100% консервативных нуклеотидов в последовательностях гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующих по меньшей мере одной из конкретных формул (I) или (Ia)-(Ih), или (II), или (IIa)-(IIh), или встречающейся в естественных условиях последовательности гистоновой структуры типа «стебель-петля».

Наиболее предпочтительной последовательностью гистоновой структуры типа «стебель-петля» является последовательность, представленная в SEQ ID NO: 43 (CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA) или соответствующая последовательность РНК SEQ ID NO: 44 (CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA).

UTR-модификация:

Предпочтительно модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, имеет по меньшей мере одну модифицированную последовательность 5'- и/или 3' UTR (UTR-модификация). Указанные модификации в нетранслируемых 5'- и/или 3'-областях могут удлинять время полужизни РНК в цитозоле или могут повышать эффективность трансляции и в результате могут повышать экспрессию кодируемого белка или пептида. Указанные последовательности UTR характеризуются 100% идентичностью последовательностей с встречающимися в естественных условиях последовательностями, т.е. последовательностями, которые встречаются в вирусах, бактериях и эукариотических организмах, а также их можно использовать в виде частично или полностью синтетических последовательностей. Примером стабилизирующих последовательностей, которые можно использовать в настоящем изобретении для стабилизации РНК, являются нетранслируемые последовательности (UTR) гена (альфа-) или бета-глобина, например, Homo sapiens или Xenopus laevis. Другой пример стабилизирующей последовательности характеризуется общей формулой (C/U)CCAN_xCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC, которая присутствует в 3'UTR чрезвычайно стабильной мРНК, которая кодирует (альфа)-глобин, коллаген типа (I), 15-липоксигеназу или тирозингидроксилазу (см. Holcik и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1997, cc. 2410-2414). Наиболее предпочтительной в контексте настоящего изобретения является мутантная UTR (альфа)-глобина, которая содержит следующую последовательность GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG (SEQ ID NO: 45) (подчеркнутый нуклеотид обозначает мутацию по сравнению с последовательностью дикого типа), которую обозначают также «muag». Указанные интродуцированные последовательности UTR можно, естественно, применять индивидуально или в сочетании с одной другой и также в сочетании с другими модификациями последовательностей, которые известны специалистам в данной области.

Предпочтительно сигналы расщепления удаляют из 3'-нетраслируемых областей (3' UTR) РНК, предлагаемой в изобретении. В частности, элементы, богатые аденилатом уридилатом (ARE) заменяют 3'UTR стабильной мРНК (например, мРНК α- или β-глобина) (см. обзор Tavernier и др., J Control Release. 150(3), 30 марта 2011 г., сс. 238-247; PMID: 20970469).

В этом контексте установлено, что 3'UTR мРНК α-глобина может являться важным фактором для хорошо известной стабильности мРНК α-глобина (Rodgers и др., Regulated α-globin mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3'-to-5' exosome-dependent decapping, RNA, 8, 2002, cc. 1526-1537). 3'UTR мРНК α-глобина, вероятно, участвует в образовании специфического рибонуклеопротеинового комплекса, α-комплекса, присутствие которого коррелирует со стабильностью мРНК in vitro (Wang и др., An mRNA stability complex functions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro, Molecular and Cellular biology, т. 19, №7, июль 1999 г., cc. 4552-4560).

В этом контексте наиболее предпочтительно, когда встречающиеся в естественных условиях 5'- и/или 3'UTR гена, содержащего открытую рамку считывания, которая входит в модифицированную РНК, предлагаемую в изобретении, удаляют в модифицированной РНК. Таким образом, модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, предпочтительно содержит UTR, которые являются гетерологичными относительно открытой рамки считывания, если присутствуют в модифицированной РНК.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения комбинация из двух или большего количества модификаций, описанных выше, присутствует в одной модифицированной РНК, которую вводят путем струйной инъекции, и которая содержит по меньшей мере одну открытую рамку считывания. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения РНК, содержащую по меньшей мере одну открытую рамку считывания, модифицируют путем интродукции (гетерологичной) 3'UTR, поли(А)-хвоста, поли(С)-последовательности и гистоновой структуры типа «стебель-петля». Предпочтительно 3'UTR в ней представляет собой мутантную UTR (альфа)-глобина, которая содержит последовательность GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC CCCTCCTTGC ACCG (SEQ ID NO: 45; muag; подчеркнутый нуклеотид обозначает мутацию по сравнению с последовательностью дикого типа), поли(А)-хвост, состоящий из 64 адениновых нуклеотидов, поли(С)-последовательность, состоящую из 30 цитозиновых нуклеотидов, и гистоновую структуру типа «стебель-петля», выбранную из одной из формул (I) или (II), предпочтительно последовательность РНК, представленную в SEQ ID NO: 44 (CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA). Наиболее предпочтительно РНК согласно конкретному варианту осуществления содержит модификации последовательности, которые представлены на фиг. 4 (SEQ ID NO: 46; см. также пример 1).

В другом варианте осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, предпочтительно содержит по меньшей мере один из следующих структурных элементов: элемент, представляющий собой 5'- и/или 3'-нетранслируемую область (UTR-элемент), прежде всего 5'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 5'UTR ТОР-гена или из его фрагмента, гомолога или варианта, или элемент, представляющий собой 5'- /или 3'UTR, который может иметь происхождение из гена, из которого получают стабильную мРНК, или из его гомолога, фрагмента или варианта; гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно гистоновую структуру типа «стебель-петля» в ее 3'-нетранслируемой области; 5'-кэп-структуру; поли-А-хвост или поли(С)-последовательность.

В предпочтительном варианте осуществления первого объекта настоящего изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один 5'- или 3'UTR-элемент. В этом контексте UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'- или 3'UTR любого встречающегося в естественных условиях гена, или которую получают из фрагмента, гомолога или варианта 5'- или 3'UTR гена. Предпочтительно 5'- или 3'UTR-элемент, применяемый согласно настоящему изобретению, является гетерологичным относительно кодирующей области модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении. Хотя 5'- или 3'UTR-элементы, полученные из встречающихся в естественных условиях генов, являются предпочтительными, в контексте настоящего изобретения можно применять также созданные путем синтеза UTR-элементы.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления первого объекта настоящего изобретения последовательность модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении, содержит по меньшей мере один элемент, представляющий собой 5'-нетранслируемую область (5'UTR-элемент), который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'UTR ТОР-гена, или которую получают из фрагмента, гомолога или варианта 5'UTR ТОР-гена.

Наиболее предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит ТОР-мотив или 5'ТОР, указанный выше.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность 5'UTR-элемента, которую получают из 5'UTR ТОР-гена, оканчивается на ее 3'-конце нуклеотидом, локализованным в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в обратном направлении относительно стоп-кодона (например, A(U/T)G) гена или полученной из него мРНК. Таким образом, 5'UTR-элемент не содержит никакой части кодирующей белок области. Таким образом, предпочтительно кодирующий белок участок модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении, представляет собой кодирующую область.

Нуклеотидную последовательность, происходящую из 5'UTR ТОР-гена, получают из эукариотического ТОР-гена, предпочтительно ТОР-гена растений или животных, более предпочтительно ТОР-гена хордовых животных, еще более предпочтительно ТОР-гена позвоночных животных, наиболее предпочтительно ТОР-гена млекопитающих, например, ТОР-гена человека.

Например, 5'UTR-элемент предпочтительно выбирают из 5'UTR-элементов, содержащих или состоящих из нуклеотидной последовательности, которая происходит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, их вариантов, или предпочтительно из соответствующей РНК-последовательности. Понятие «гомологи SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700» относится к последовательностям из видов, отличных от человека {Homo sapiens), которые являются гомологами последовательностей SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая происходит из нуклеотидной последовательности, простирающейся от нуклеотидного положения 5 (т.е. нуклеотида, локализованного в положении 5 в последовательности) до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего к 5'-концу стартового кодона (локализованного на 3'-конце последовательностей), например, нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего к 5'-концу ATG-последовательности в нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, их вариантов или соответствующей РНК-последовательности. Наиболее предпочтительным является, если 5'UTR-элемент получают из нуклеотидной последовательности, простирающейся от нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего к 3'-концу 5'ТОР, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего к 5'-концу стартового кодона (локализованного на 3'-конце последовательностей), например, нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего к 5'-концу ATG-последовательности нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, их вариантов или соответствующей РНК-последовательности.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR ТОР-гена, кодирующего рибосомный белок, или из варианта 5'UTR ТОР-гена, кодирующего рибосомный белок. Например, 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 67, 170, 193, 244, 259, 554, 650, 675, 700, 721, 913, 1016, 1063, 1120, 1138 и 1284-1360, указанной в заявке на патент WO 2013/143700, соответствующей РНК-последовательности, ее гомолога или варианта, указанного в настоящем описании, предпочтительно лишенного 5'ТОР-мотива. Как описано выше, последовательность, простирающаяся от положения 5 до нуклеотида, непосредственно примыкающего в 5'-концу ATG (локализованного на 3'-конце последовательностей), соответствует 5'UTR указанных последовательностей.

Предпочтительно 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, имеющей происхождение из 5'UTR ТОР-гена, кодирующего белок большой субъединицы рибосомы (RPL), или из гомолога или варианта 5'UTR ТОР-гена, кодирующего белок большой субъединицы рибосомы (RPL). Например, 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 67, 259, 1284-1318, 1344, 1346, 1348-1354, 1357, 1358, 1421 и 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, соответствующей РНК-последовательности, ее гомолога или варианта, указанного в настоящем описании, предпочтительно лишенного 5'ТОР-мотива.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR, происходящей из 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32, предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) позвоночных животных, более предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) человека, или из варианта 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32, предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) позвоночных животных, более предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) млекопитающих, наиболее предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) человека, при этом предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит 5'ТОР указанного гена.

Таким образом, согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 55 (5'UTR человеческого белка большой субъединицы рибосомы 32 без 5'-концевого олигопримидинового тракта: GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC; которая соответствует SEQ ID NO: 1368 в заявке на патент WO 2013/143700) или предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, или в которой по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 55, или соответствующей РНК-последовательности, при этом предпочтительно описанный выше фрагмент представляет собой непрерывный сегмент нуклеотидов, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, содержит 5'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR ТОР-гена позвоночных животных, таких как млекопитающие, например, человеческого ТОР-гена, выбранного из RPSA, RPS2, RPS3, RPS3A, RPS4, RPS5, RPS6, RPS7, RPS8, RPS9, RPS10, RPS11, RPS12, RPS13, RPS14, RPS15, RPS15A, RPS16, RPS17, RPS18, RPS19, RPS20, RPS21, RPS23, RPS24, RPS25, RPS26, RPS27, RPS27A, RPS28, RPS29, RPS30, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL7, RPL7A, RPL8, RPL9, RPL10, RPL10A, RPL11, RPL12, RPL13, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL17, RPL18, RPL18A, RPL19, RPL21, RPL22, RPL23, RPL23A, RPL24, RPL26, RPL27, RPL27A, RPL28, RPL29, RPL30, RPL31, RPL32, RPL34, RPL35, RPL35A, RPL36, RPL36A, RPL37, RPL37A, RPL38, RPL39, RPL40, RPL41, RPLP0, RPLP1, RPLP2, RPLP3, RPLP0, RPLP1, RPLP2, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G, EEF2, EIF3E, EIF3F, EIF3H, EIF2S3, EIF3C, EIF3K, EIF3EIP, EIF4A2, РАВРС1, HNRNPA1, ТРТ1, TUBB1, UBA52, NPM1, ATP5G2, GNB2L1, NME2, UQCRB, или из их гомолога или варианта, в которых предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит ТОР-мотива, или 5'ТОР указанных генов и в которых необязательно 5'-конец 5'UTR-элемента начинается с нуклеотида, локализованного в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в прямом направлении относительно 5'-концевого олигопримидинового тракта (ТОР), и в которых также необязательно 5'UTR-элемент, происходящий из 5'UTR ТОР-гена, оканчивается на его 3'-конце нуклеотидом, локализованным в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в обратном направлении относительно стартового кодона (A(U/T)G) гена, из которого он получен.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32), гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35), белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1), гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4), индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1), гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1), или из их варианта, предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) позвоночных животных, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) позвоночных животных, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) позвоночных животных, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) позвоночных животных, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) позвоночных животных, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) позвоночных животных, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) позвоночных животных или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) позвоночных животных, или из их варианта, более предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) млекопитающих, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) млекопитающих, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) млекопитающих, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) млекопитающих, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) млекопитающих или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) человека, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) человека, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) человека, гена АТФ-синтазы, Н⁺-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) человека, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) человека, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) человека, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) человека или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) человека, или из их варианта, в которых предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит 5'ТОР указанного гена.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 5'UTR гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4), предпочтительно из гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы (HSD17B4) позвоночных животных, более предпочтительно из гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) человека. В предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99%, идентична 5'UTR, которая содержится в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 54. Предпочтительно 5'UTR содержит или состоит из 5'UTR, которая содержится в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 54.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99%, идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1368 или SEQ ID NO: 1412-1420, которые указаны в заявке, а патент WO 2013/143700, или соответствующей РНК-последовательности, или в которых по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99%, идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1368 или SEQ ID NO: 1412-1420, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, при этом предпочтительно фрагмент представляет собой описанный выше фрагмент, т.е. является непрерывным состоящим из нуклеотидов сегментом, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. от полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99%, идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 56 (5'UTR АТР5А1 без 5'-концевого олигопиримидинового тракта: GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCG-GAGTAACTGCAAAG; соответствует SEQ ID NO: 1414 в заявке на патент WO 2013/143700), или предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, или в которой по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99%, идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 26, или более предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, в которой предпочтительно фрагмент представляет собой описанный выше фрагмент, т.е. является непрерывным состоящим из нуклеотидов сегментом, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. от полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, содержит также по меньшей мере один 3'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR гена хордовых животных, предпочтительно гена позвоночных животных, более предпочтительно гена млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена, или из варианта 3'UTR гена хордовых животных, предпочтительно гена позвоночных животных, более предпочтительно гена млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена.

Понятие «3'UTR-элемент» относится к нуклеотидной последовательности, которая содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR или из варианта 3'UTR. 3'UTR-элемент в контексте настоящего изобретения может представлять собой 3'UTR мРНК. Таким образом, в контексте настоящего изобретения предпочтительно 3'UTR-элемент может представлять собой 3'UTR мРНК, предпочтительно искусственной мРНК, или может представлять собой матрицу для транскрипции 3'UTR мРНК. Таким образом, 3'UTR-элемент предпочтительно представляет собой нуклеотидную последовательность, которая соответствует 3'UTR мРНК, предпочтительно 3'UTR искусственной мРНК, такой как мРНК, полученная путем транскрипции созданной с помощью генной инженерии векторной конструкции. Предпочтительно 3'UTR-элемент выполняет функцию 3'UTR или кодирует последовательность, которая выполняет функцию 3'UTR.

Предпочтительно предлагаемая в изобретении мРНК содержит 3'UTR-элемент, который может происходить из гена, который соответствует мРНК с удлиненным временем полужизни (представляющей собой стабильную мРНК), например, 3'UTR-элемент указанный и описанный ниже.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 3'UTR гена, выбранного из группы, состоящей из гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), или из варианта 3'UTR гена, выбранного из группы, состоящей из гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1369-1390 в заявке на патент WO 2013/143700, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 3'UTR гена альбумина, предпочтительно гена альбумина позвоночных животных, более предпочтительно гена альбумина млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена альбумина, имеющего SEQ ID NO: 57.

3'UTR человеческого альбумина, имеющая SEQ ID NO: 57:

В этом контексте наиболее предпочтительно, когда модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, содержит 3'UTR-элемент, который содержит соответствующую РНК-последовательность, происходящую из SEQ ID NO: 1369-1390, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, или ее фрагмент, гомолог или вариант.

Наиболее предпочтительно 3'UTR-элемент содержит нуклеотидную последовательность, происходящую из фрагмента гена человеческого альбумина, которая представлена в SEQ ID NO: 58:

3'UTR гена 7 альбумина

В этом контексте наиболее предпочтительно, когда 3'UTR-элемент предлагаемой в изобретении мРНК содержит или состоит из РНК-последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 58.

В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR гена α-глобина, предпочтительно гена α- или β-глобина, более предпочтительно гена α-или β-глобина млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена α- или β-глобина, имеющего SEQ ID NO: 59-61:

3'UTR альфа-цепи гемоглобина 1 Homo sapiens (НВА1)

3'UTR альфа-цепи гемоглобина 2 Homo sapiens (HBA2)

3'UTR бета-цепи гемоглобина Homo sapiens (HBB)

Например, 3'UTR-элемент может содержать или состоять из центральной, связывающей α-комплекс области 3'UTR гена α-глобина, такого как ген человеческого α-глобина, предпочтительно имеющий SEQ ID NO: 62:

центральная связывающая α-комплекс область 3'UTR гена α-глобина (которую в контексте настоящего описания обозначают также как «muag»)

В этом контексте наиболее предпочтительно, когда 3'UTR-элемент модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении, содержит или состоит из РНК-последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 62 или ее гомолога, фрагмента или варианта.

Понятие «нуклеотидная последовательность, происходящая из 3'UTR […]-гена» предпочтительно относится к нуклеотидной последовательности, основой которой является 3'UTR-последовательность […]-гена или ее часть, например, 3'UTR гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1 цепи коллагена типа (I), предпочтительно гена альбумина или его части. Указанное понятие включает последовательности, соответствующие полной 3'UTR-последовательности, т.е. полноразмерной 3'UTR-последовательности гена, и последовательности, соответствующие фрагменту 3'UTR-последовательности гена, например, гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), предпочтительно гена альбумина.

Понятие ««нуклеотидная последовательность, происходящая из варианта 3'UTR […]-гена» предпочтительно относится к нуклеотидной последовательности, основой которой является вариант 3'UTR-последовательности гена, например, вариант 3'UTR гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), или его части, как указано выше. Указанное понятие включает последовательности, соответствующие полной последовательности варианта 3'UTR гена, т.е. полноразмерной 3'UTR-последовательности варианта гена, и последовательности, соответствующие фрагменту варианта 3'UTR-последовательности гена. Фрагмент в этом контексте предпочтительно состоит из непрерывного нуклеотидного сегмента полноразмерного варианта 3'UTR, на долю которого приходится по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% полноразмерного варианта 3'UTR. Указанный фрагмент варианта в контексте настоящего изобретения предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент варианта, указанного в настоящем описании.

Предпочтительно по меньшей мере один 5'UTR-элемент и по меньшей мере один 3'UTR-элемент действуют синергетически в отношении повышения производства белка указанной выше модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении. Более предпочтительно при применении модифицированной РНК с помощью струйной инъекции по меньшей мере один 5'UTR-элемент и/или по меньшей мере один 3'UTR-элемент действуют синергетически в отношении повышения производства белка.

В других конкретных вариантах осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, может содержать в дополнение по меньшей мере к одной модификации также последовательность участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES) или IRES-мотива, которая может разделять несколько открытых рамок считывания, например, если модифицированная РНК кодирует два или большее количество пептидов или белков. IRES-последовательность может оказаться особенно ценной, если мРНК представляет собой би- или полицистронную РНК.

В контексте настоящего изобретения понятие «РНК» не является ограничивающим и относится к любой рибонуклеиновой кислоте. Так, понятие РНК равным образом относится к рибонуклеиновым кислотам, которые функционируют в качестве кодирующих РНК, например, к вирусной РНК, РНК-репликону, или в качестве мРНК, или к искусственным РНК-конструкциям любого типа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК не представляет собой малую интерферирующую РНК (siРНК) или короткую РНК-шпильку (shРНК). Предпочтительно модифицированная РНК не представляет собой siРНК или shРНК, мишенью которой является ген, обусловливающий устойчивость, предпочтительно ген, обусловливающий устойчивость к нескольким лекарственным средствам, такой как MDR1/P-gp.

Согласно изобретению РНК содержит по меньшей мере одну модификацию, которая повышает экспрессию пептида или белка, кодируемого кодирующей областью РНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения РНК, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один тип модификации, указанной в настоящем описании. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения РНК, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере два различных типа модификаций, которые повышают экспрессию пептида или белка, кодируемого кодирующей областью РНК. Предпочтительно РНК, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать или двенадцать различных типов модификаций. Альтернативно этому, или в сочетании с другими типами модификаций специфическая модификация, указанная в настоящем описании, такая как 3'UTR, гистоновая структура типа «стебель-петля» или поли(С)-последовательность, может присутствовать также более чем в одной копии модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении. Это относится, прежде всего, к би- или полицистронным РНК. Модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, может содержать комбинации нескольких различных модификаций, таких как повышение содержания GC в сочетании с любой из таких модификаций, как, например, 5'UTR, поли(С)-последовательность, поли(А)-последовательность, 3'UTR или гистоновая структура типа «стебель-петля», при этом каждая отдельная модификация может присутствовать в форме одной копии на РНК или в форме множества копий на РНК.

Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения РНК, предлагаемая в изобретении, может содержать, например, следующие структуры:

5' - кодирующая область - гистоновая структура «стебель-петля» - 3'; или

5' - кодирующая область - гистоновая структура «стебель-петля» - поли(А)/(С)-последовательность - 3'; или

5' - кодирующая область - поли(А)/(С)-последовательность - гистоновая структура «стебель-петля» - 3'; или

5' - кодирующая область - сигнал полиаденилирования - гистоновая структура «стебель-петля» - 3'; или

5' - кодирующая область - гистоновая структура «стебель-петля» - гистоновая структура «стебель-петля» - поли(А)/(С)-последовательность - 3'; или

5' - кодирующая область - гистоновая структура «стебель-петля» - гистоновая структура «стебель-петля» - сигнал полиаденилирования - 3'; или

5' - кодирующая область - поли(А)/(С)-последовательность - поли(А)/(С)-последовательность - гистоновая структура «стебель-петля» - 3'; или

5' - кодирующая область - стабилизирующая последовательность - поли(А)/(С)-последовательность - поли(А)/(С)-последовательность - гистоновая структура «стебель-петля» - 3' и т.д.,

в которой кодирующая область предпочтительно содержит или состоит из последовательности с повышенным содержанием GC, указанной в настоящем описании, и

в которой 5'UTR-элемент предпочтительно присутствует в 5'-области кодирующей области и/или 3'UTR-элемент предпочтительно присутствует между 3'-концом кодирующей области и 3'-концом РНК.

В конкретном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК может содержать, например, любую одну из указанных ниже комбинаций структурных особенностей и модификаций:

5' - кодирующая область - поли(А)-последовательность - 3';

5' - кодирующая область - поли(А)-последовательность - поли(С)-последовательность - 3';

5' - кодирующая область - поли(А)-последовательность - поли(С)-последовательность - гистоновая структура «стебель-петля» - 3';

5' - кодирующая область - 3'UTR - поли(А)-последовательность - 3';

5' - кодирующая область - 3'UTR - поли(А)-последовательность - поли(С)-последовательность - 3';

5' - кодирующая область - 3'UTR - поли(А)-последовательность - поли(С)-последовательность - гистоновая структура «стебель-петля» - 3';

5' - 5'UTR - кодирующая область - поли(А)-последовательность - 3';

5' - 5'UTR - кодирующая область - поли(А)-последовательность - поли(С)-последовательность - 3';

5' - 5'UTR - кодирующая область - поли(А)-последовательность - поли(С)-последовательность - гистоновая структура «стебель-петля» - 3';

5' - кодирующая область - 3'UTR - поли(А)-последовательность - 3';

5' - 5'UTR - кодирующая область - 3'UTR - поли(А)-последовательность - поли(С)-последовательность - 3';

5' - 5'UTR - кодирующая область - 3'UTR - поли(А)-последовательность - поли(С)-последовательность - гистоновая структура «стебель-петля» - 3';

в которой кодирующая область предпочтительно содержит или состоит из последовательности с повышенным содержанием GC, указанной в настоящем описании.

Кодируемые белки:

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК содержит по меньшей мере одну открытую рамку считывания, которая кодирует терапевтический белок или пептид. В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере одной открытой рамкой считывания кодируется антиген, такой как патогенный антиген, опухолевый антиген, аллергический антиген или аутоиммунный антиген. При этом введение модифицированной РНК, кодирующей антиген, используют в подходе генетической вакцинации против заболевания, включающего указанный антиген.

В альтернативном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одной открытой рамкой считывания модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении, кодируется антитело.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная изобретения РНК, предлагаемая в изобретении, не содержит репортерный ген или маркерный ген. Предпочтительно модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует, например, люциферазу; зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его варианты (такие как eGFP, RFP или BFP); α-глобин; гипоксантин: гуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT); β-галактозидазу; галактокиназу; щелочную фосфатазу; секретируемую (эмбриональную) щелочную фосфатазу (SEAP)) или ген, обусловливающий устойчивость (такой как ген, обусловливающий устойчивость к неомицину, пуромицину, гигромицину и зеоцину). В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует люциферазу. В другом варианте осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует GFP или его вариант.

Антигены:

Патогенные антигены:

Модифицированная РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может кодировать белок или пептид, который содержит патогенный антиген или его фрагмент, вариант или производное. Указанные патогенные антигены происходят из патогенных организмов, прежде всего бактериальных, вирусных или протозойных (многоклеточных) патогенных организмов, которые индуцируют иммунологический ответ у индивидуума, прежде всего млекопитающего, более предпочтительно человека. Более конкретно, патогенные антигены предпочтительно представляют собой поверхностные антигены, например, белков (или фрагменты белков, например, наружная часть поверхностного антигена), локализованного на поверхности вирусного или бактериального, или протозойного организма.

Патогенные антигены представляют собой пептидные или белковые антигены, происходящие из патогена, ассоциированного с инфекционным заболеванием, который предпочтительно выбирают из антигенов, происходящих из патогенов Acinetobacter baumannii, рода Anaplasma, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, рода Aspergillus, Astroviridae, рода Babesia, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, вируса BK, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, рода Borrelia, Borrelia spp, рода Brucella, Brugia malayi, семейства Bunyaviridae, Burkholderia cepacia и других видов Burkholderia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, семейства Caliciviridae, рода Campylobacter, Candida albicans, Candida spp, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, приона CJD, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium spp, Clostridium tetani, Coccidioides spp, коронавирусов, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, вируса геморрагической лихорадки Крым-Конго, Cryptococcus neoformans, рода Cryptosporidium, Cytomegalovirus (CMV), вирусов Денге (DEN-1, DEN-2, DEN-3 и DEN-4), Dientamoeba fragilis, вируса Эбола (EBOV), рода Echinococcus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, рода Ehrlichia, Entamoeba histolytica, рода Enterococcus, рода Enterovirus, энтеровирусов, прежде всего вируса Коксаки А и энтеровируса 71 (EV71), Epidermophyton spp, вируса Эпштейна-Барра (EBV), Escherichia coli O157:Н7, O111 и О104:Н4, Fasciola hepatica и Fasciola gigantica, приона FFI, суперсемейства Filarioidea, флавивирусов, Francisella tularensis, рода Fusobacterium, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis, Gnathostoma spp, приона GSS, вируса Гуанарито, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, генипавируса (вирус Гендра и вирус Нипа), вируса гепатита А, вируса гепатита В (HBV), вируса гепатита С (HCV), вируса гепатита D, вируса гепатита, вируса герпеса простого 1 и 2 (HSV-1 и HSV-2), Histoplasma capsulatum, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), Hortaea werneckii, человеческого бокавируса (HBoV), человеческого вируса герпеса 6 (HHV-6) и человеческого вируса герпеса 7 (HHV-7), человеческого вируса метапенвмонии (hMPV), вируса папилломы человека (HPV), человеческих вирусов парагриппа (HPIV), вируса японского энцефалита, вируса JC, вируса Джунин, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, приона Куру, вируса Ласса, Legionella pneumophila, рода Leishmania, рода Leptospira, Listeria monocytogenes, вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вируса Мачупо, Malassezia spp, вируса Марбурга, вируса кори, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, вируса контагиозного моллюска (MCV), вируса паротита, Mycobacterium leprae и Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Nocardia spp, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi, семейства Orthomyxoviridae (грипп), Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus spp, Paragonimus westermani, парвовируса В19, рода Pasteurella, рода Plasmodium, Pneumocystis jirovecii, полиовируса, вируса бешенства, респираторно-синтициального вируса (RSV), риновируса, риновирусов, Rickettsia akari, рода Rickettsia, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, вируса долины Рифта, ротавируса, вируса краснухи, вируса Сабиа, рода Salmonella, Sarcoptes scabiei, коронавируса SARS, рода Schistosoma, рода Shigella, вируса Син Номбре, хантавируса, Sporothrix schenckii, рода Staphylococcus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, рода Taenia, Taenia solium, вируса клещевого энцефалита (TBEV), Toxocara canis или Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton spp, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, вируса ветряной оспы (VZV), Variola major или Variola minor, приона vCJD, вируса венесуэльского энцефалита лошадей, Vibrio cholerae, вируса Западного Нила, вируса западного энцефалита лошадей, Wuchereria bancrofti, вируса желтой лихорадки, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis.

В этом контексте наиболее предпочтительными являются антигены из патогенов, выбранных из вируса гриппа, респираторно-синтициального вируса (RSV), вируса герпеса простого (HSV), вируса папилломы человека (HPV), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), Plasmodium, Staphylococcus aureus, вируса Денге, Chlamydia trachomatis, цитомегаловируса (CMV), вируса гепатита В (HBV), Mycobacterium tuberculosis, вируса бешенства и вируса желтой лихорадки.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, кодирует белок или пептид вируса бешенства или его антигенный фрагмент. Предпочтительно модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, кодирует антигенный белок или пептид, выбранный из группы, состоящей из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина N (RAV-N), фосфопротеина Р (RAV-P), матриксного белка М (RAV-M) или РНК-полимеразы L (RAV-L) вируса бешенства или их фрагмента, варианта или производного.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, кодирует белок или пептид респираторно-синтициального вируса (RSV) или его антигенный фрагмент. Предпочтительно модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, кодирует антигенный белок или пептид, выбранный из группы, состоящей из слитого белка F, гликопротеина G, короткого гидрофобного белка SH, матриксного белка М, нуклеопротеина N, большой субъединицы полимеразы L, белка М2-1, белка М2-2, фосфопротеина Р, неструктурного белка NS1 или неструктурного белка NS2 респираторно-синтициального вируса (RSV) или его фрагмента, варианта или производного.

Опухолевые антигены:

В другом варианте осуществления изобретения модифицированная РНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может кодировать белок или пептид, который содержит пептид или белок, содержащий опухолевый антиген, фрагмент, вариант или производное указанного опухолевого антигена, где предпочтительно опухолевый антиген представляет собой меланоцит-специфический антиген, раково-тестикулярный антиген (СТ) или опухоль-специфический антиген, предпочтительно СТ-Х-антиген, не-Х-СТ-антиген, партнер, связывающий СТ-Х-антиген, или партнер, связывающий не-Х-СТ-антиген, или опухоль-специфический антиген, более предпочтительно СТ-Х-антиген, партнер, связывающий не-Х-СТ-антиген, или опухоль-специфический антиген, или фрагмент, вариант производное указанного опухолевого антигена; и при этом каждая из нуклеотидных последовательностей кодирует отличный от других пептид или белок; и при этом по меньшей мере одна из нуклеотидных последовательностей кодирует 5Т4, 707-АР, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, альфа-5-бета-1-интегрин, альфа-5-бета-6-интегрин, альфа-актинин-4/m, альфа-метилацил-кофермент А-рацемазу, ART-4, ARTC1/m, В7Н4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, бета-катенин/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, калретикулин, CAMEL, CASP-8/m, катепсин В, катепсин L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, коактозин-подобный белок, коллаген XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, циклин B1, циклин D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, гепсин, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, гомеобокс NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, незрелый ламининовый рецептор, калликреин-2, калликреин-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-А3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, маммоглобин A, MART-1/мелан-А, MART-2, MART-2/m, матриксный белок 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, мезотелин, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-антиген, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, миозин класса I/m, NA88-A, N-ацетилглюкозаминилтрансферазу-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, остеокальцин, остеопонтин, p15, p190 минорный bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-киназу, Pin-1, Pml/PARaльфa, POTE, PRAME, PRDX5/m, простеин, протеиназу-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, сурвивин, сурвивин-2В, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGFбета, TGFбетаRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, тирозиназу, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1 и WT1, и иммуноглобулиновый идиотип лимфоидной кровяной клетки или идиотип Т-клеточного рецептора лимфоидной кровяной клетки, или фрагмент, вариант или производное указанного опухолевого антигена; предпочтительно сурвивин или его гомолог, антиген из MAGE-семейства или его партнер по связыванию, или фрагмент, вариант или производное указанного опухолевого антигена.

В этом контексте наиболее предпочтительными опухолевыми антигенами являются NY-ESO-1, 5Т4, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин, Muc-1, PSA, PSMA, PSCA, STEAP и РАР.

В этом контексте наиболее предпочтительно по меньшей мере одна модифицированная РНК, которую вводят с помощью струйной инъекции, предлагаемой в изобретении, кодирует одну из приведенных ниже комбинаций антигенов:

- Muc-1, PSA, PSMA, PSCA и STEAP,

- Muc-1, PSA, PSMA, PSCA и PAP,

- Muc-1, PSA, PSMA, STEAP и PAP,

- Muc-1, PSA, PSCA, STEAP и PAP,

- Muc-1, PSMA, PSCA, STEAP и PAP,

- PSA, PSMA, PSCA, STEAP и PAP,

- Muc-1, PSA, PSMA, PSCA, STEAP и PAP.

В другом варианте осуществления изобретения наиболее предпочтительно по меньшей мере одна модифицированная РНК, которую вводят с помощью струйной инъекции, предлагаемой в изобретении, кодирует одну из приведенных ниже комбинаций антигенов:

- NY-ESO-1, 5Т4, MAGE-C1, MAGE-C2 и сурвивин,

- NY-ESO-1, 5Т4, MAGE-C1, MAGE-C2 и Muc-1,

- NY-ESO-1, 5Т4, MAGE-C1, сурвивин и Muc-1,

- NY-ESO-1, 5Т4, MAGE-C2, сурвивин и Muc-1,

- NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и Muc-1,

- 5Т4, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и Muc-1,

- NY-ESO-1, 5T4, MAGE-C1, MAGE-C2, сурвивин и Muc-1.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК, которую вводят с помощью струйной инъекции, кодирует белок или пептид, который содержит терапевтический белок или его фрагмент, вариант или производное.

Терапевтические белки, указанные в настоящем описании, представляют собой пептиды или белки, которые оказывают благоприятное действие при лечении любого врожденного или приобретенного заболевания или которые улучшают состояние индивидуума. Прежде всего, терапевтические белки играют большую роль при разработке терапевтических агентов, которые могут модифицировать и репарировать генетические ошибки, разрушать раковые или инфицированные патогеном клетки, лечить нарушения иммунной системы, лечить метаболические или эндокринные нарушения, наряду с другими их функциями. Например, эритропоэтин (ЕРО), представляющий собой белковый гормон, можно применять для лечения пациентов с дефицитом эритроцитов, который обычно является причиной почечных нарушений. Кроме того, к терапевтическим белкам относятся адьювантные белки, терапевтические антитела, а также гормонзаместительная терапия, которую применяют, например, при лечении женщин в период менопаузы. В более современных подходах соматические клетки пациента применяют для репрограммирования их в мультипатентные стволовые клетки, что заменяет спорную терапию на основе стволовых клеток. Кроме того, указанные белки, применяемые для репрограммирования соматических клеток или применяемые для дифференцировки стволовых клеток, рассматриваются в настоящем описании в качестве терапевтических белков. Кроме того, терапевтические белки можно применять для других целей, например, заживления ран, регенерации ткани, ангиогенеза и т.д.

Таким образом, терапевтические белки можно применять для различных целей, включая лечение различных заболеваний типа, например, инфекционных заболеваний, неоплазм (например, рака или опухолевых заболеваний), заболеваний крови и кроветворных органов, эндокринных заболеваний, заболеваний, связанных с питанием или с голоданием, и метаболических заболеваний, заболеваний нервной системы, заболеваний кровеносной системы, заболеваний дыхательной системы, заболеваний пищеварительной системы, заболеваний кожи и подкожной ткани, заболеваний скелетно-мышечной системы и соединительной ткани и заболеваний мочеполовой системы, вне зависимости от того, являются ли они врожденными или приобретенными.

В этом контексте наиболее предпочтительные терапевтические белки, которые среди прочего можно применять для лечения метаболических или эндокринных нарушений, выбирают из следующих белков: кислая сфингомиелиназа (болезнь Ниманна-Пика), адипотид (ожирение), агалсидаза-бета (человеческая галактозидаза А) (болезнь Фабри; предупреждает накоплению липидов, что может приводить к почечным и сердечно-сосудистым осложнениям), алглюкозидаза (болезнь Помпе (болезнь накопления гликогена типа II)), альфа-галактозидаза А (альфа-GAL А, агалсидаза альфа) (болезнь Фабри), альфа-глюкозидаза (болезнь накопления гликогена (GSD), болезнь Помпе), альфа-L-идуронидаза (мукополисахаридоз (MPS), синдром Гурлера, синдром Шейе), альфа-N-ацетилглюкозаминидаза (синдром Санфилиппо), амфирегулин (рак, метаболическое нарушение), ангиопоэтин ((Ang1, Ang2, Ang3, Ang4, ANGPTL2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6, ANGPTL7) (ангиогенез, стабилизирует сосуды), бетацеллюлин (метаболическое нарушение), бета-глюкуронидаза (синдром Слая), белки, участвующие в остеогенезе (BMP) (ВМР1, ВМР2, ВМР3, ВМР4, ВМР5, ВМР6, ВМР7, ВМР8а, BMP8b, BMP10, BMP15) (регенерирующее действие, связанные с костью состояния, хроническая болезнь почек (CKD)), CLN6-белок (связанное с CLN6 заболевание - атипичный поздний инфантилизм, вариант с поздним началом, ранний ювенильный, нейрональный цероидный липофусциноз (NCL)), эпидермальный фактор роста (EGF) (заживление ран, регуляция роста, пролиферации и дифференцировки клеток), эпиген (метаболическое нарушение), эпирегулин (метаболическое нарушение), фактор роста фибробластов (FGF, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23) (заживление ран, ангиогенез, эндокринные нарушения, регенерация ткани), галсульфаза (мукополисахаридоз VI), грелин (синдром раздражения толстой кишки (IBS), ожирение, синдром Прадера-Вилли, сахарный диабет типа II), глюкоцереброзидаза (болезнь Гоше), GM-CSF (регенеративное действие, производство лейкоцитов, рак), гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF) (заживление ран, гипертрофия сердца и развитие и функция сердца), гепатоцитарный фактор роста HGF (регенеративное действие, заживление ран), гепсидин (нарушения метаболизма железа, бета-талассемия), человеческий альбумин (пониженное производство альбумина (гипопротеинемия), повышенная потеря альбумина (нефротический синдром)), гиповолемия, гипербилирубинемия), идурсульфаза (идуронат-2-сульфатаза) (мукополисахароидоз II (синдром Гунтера)), интегрины αVβ3, αVβ5 и α5β1 (связывающие матрикс макромолекулы и протеиназы, ангиогенез), идуронатсульфатаза (синдром Гунтера), ларонидаза (формы Гурлер и Гурлер-Шейе мукополисахароидоза I), N-ацетилгалактозамин-4-сульфатаза (rhASB; галсульфаза, арилсульфатаза A (ARSA), арилсульфатаза В (ARSB)) (дефицит арилсульфатазы В, синдром Марото-Лами, мукополисахароидоз VI), N-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза (синдром Санфилиппо), фактор роста нервов (NGF, мозговой нейтротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3 (NT-3) и нейротрофин 4/5 (NT-4/5) (регенеративное действие, сердечно-сосудистые заболевания, коронарный атеросклероз, ожирение, диабет типа 2, метаболический синдром, острые коронарные синдромы, деменции, депрессия, шизофрения, аутизм, синдром Ретта, нервная анорексия, нервная булимия, заживление ран, кожные язвы, язвы на роговице, болезнь Альцгеймера), нейрегулин (NRG1, NRG2, NRG3, NRG4) (метаболическое нарушение, шизофрения), нейропилин (NRP-1, NRP-2) (ангиогенез, аксонный транспорт, выживание, миграция клеток), обестатин (синдром раздражения толстой кишки (IBS), ожирение, синдром Прадера-Вилли, сахарный диабет типа II), тромбоцитарный фактор роста (PDGF (PDFF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D) (регенеративное действие, заживление ран, нарушение ангиогенеза, артериосклероз, фиброз, рак), рецепторы TGF-бета (эндоглин, рецептор TGF-бета 1, рецептор TGF-бета 2, рецептор, TGF-бета 3) (почечный фиброз, болезнь почек, диабет, терминальная почечная недостаточность (ESRD), ангиогенез), тромбопоэтин (ТНРО) (фактор роста и развития мегакариоцитов (MGDF)) (тромбоцитарные нарушения, тромбоциты для донорства, восстановление количества тромбоцитов после миелосупрессивной химиотерапии), трансформирующий ростовой фактор (TGF (TGF-a, TGF-бета (TGFбета1, TGFбета2 и TGFбета3))) (регенеративное действие, заживление ран, иммунитет, рак, болезнь сердца, диабет, синдром Марфана, синдром Лойса-Дитца), VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F и PIGF) (регенеративное действие, ангиогенез, заживление ран, рак, проницаемость), несиритид (острая декомпенсированная застойная сердечная недостаточность), трипсин (связанная с пролежнем язва, варикозная язва, хирургическая обработка струпа, спонтанно раскрывающаяся рана, солнечный ожог, мекониевая непроходимость кишечника), адренокортикотропный гормон (АСТН) (болезнь Аддисона, мелкоклеточная карцинома, адренолейкодистрофия, врожденная адренальная гиперплазия, синдром Кушинга, синдром Нельсона, инфантильные спазмы), предсердный натрийуретический пептид (ANP) (эндокринные нарушения), холецистокинин (несколько), гастрин (гипогастринемия), лептин (диабет, гипертриглицеридемия, ожирение), окситоцин (стимулирует появление грудного молока, не возникающее после родов), соматостатин (симптоматическое лечение карциноидного синдрома, острого кровотечения из варикозно расширенных вен и акромегалии, поликистозных заболеваний печени и почки, акромегалии и симптомов, связанных с нейроэндокринными опухолями), вазопрессин (антидиуретический гормон) (несахарный диабет), кальцитонин (постменопаузальный остеопороз, гиперкальцемия, болезнь Педжета, метастазы в кости, фантомная боль в конечностях, спинальный стеноз), эксенатид (диабет типа 2, устойчивый к лечению метформином и сульфонилмочевиной), ростовой гормон (GH), соматотропин (недостаточность роста из-за дефицита GH или хроническая почечная недостаточность, синдром Прадера-Вилли, синдром Тернера, связанное со СПИДом истощение или кахексия при использовании противовирусной терапии), инсулин (сахарный диабет, диабетический кетоацидоз, гиперкалемия), инсулиноподобный фактор роста 1 IGF-1 (недостаточность роста у детей с делецией гена GH или серьезный первичный дефицит IGF1, нейродегенеративное заболевание, сердечнососудистые заболевания, сердечная недостаточность), мекасермина ринфабат, аналог IGF-1 (недостаточность роста у детей с делецией гена GH или серьезный первичный дефицит IGF1, нейродегенеративное заболевание, сердечнососудистые заболевания, сердечная недостаточность), мекасермин, аналог IGF-1 ((недостаточность роста у детей с делецией гена GH или серьезный первичный дефицит IGF1, нейродегенеративное заболевание, сердечно-сосудистые заболевания, сердечная недостаточность), пегвисомант (акромегалия), прамлинтид (сахарный диабет в сочетании с инсулином), терипаратид (остатки 1-34 человеческого паратиреоидного гормона) (серьезный остеопороз), бекаплермин (вспомогательное средство для хирургической обработки диабетических язв), диботермин-альфа (белок, участвующий в остеогенезе, 2) (хиругическое вмешательство по поводу спинальной фузии, репарация повреждения кости), гистрелина ацетат (гонадотропин-рилизменг-гормон; GnRH) (преждевременное половое созревание), октреотид (акромегалия, симптоматическое облегчение секретирующей вазоактивный интестинальный пептид (VIP) аденомы и метастатические карциноидные опухоли) и палифермин (фактор роста кератиноцитов; KGF) (серьезные оральные мукозиты у пациентов, подвергающихся химиотерапии, заживление ран). (В скобках указано конкретное заболевание, для лечения которого применяют терапевтический белок). Указанные и другие белки рассматриваются в качестве терапевтических, поскольку они являются средством лечения индивидуума путем замены у них дефектного эндогенного производства функционального белка в достаточных количествах. Таким образом, указанные терапевтические белки являются типичными белками млекопитающих, прежде всего человеческими белками.

Для лечения заболеваний крови, заболеваний кровеносной системы, заболеваний дыхательной системы, рака или опухолевых заболеваний, инфекционных болезней или иммунодефицитов можно применять следующие терапевтические белки: алтепаза (тканевый активатор плазминогена; tPA) (эмболия легких, инфаркт миокарда, острый ишемический удар, закупорка катетеров, помещенных в центральную вену), анистерплаза (тромболиз), антитромбин III (АТ-III) (врожденный дефицит АТ-III, тромбоэмболия), бивалирудин (снижает риск свертывания крови при коронарной ангиопластике и гепарининдуцированной тромбоцитопении), дарбепоэтин-альфа (лечение анемии у пациентов с хронической почечной недостаточностью и хронической почечной недостаточностью (с диализом или без диализа)), дротрекогин-альфа (активированный белок С) (серьезный сепсис с высоким риском смерти), эритропоиэтин, эпоэтин-альфа, эритропоэтин, эртропоэтин (анемия при хроническом заболевании, милеодисплазия, анемия, связанная с почечной недостаточностью или химиотерапией, предоперационная подготовка), фактор IX (гемофилия В), фактор VIIa (кровотечение у пациентов с гемофилией А или В и ингибиторы фактора VIII или фактора IX), фактор VIII (гемофилия А), лепирудин (индуцированная гепарином тромбоцитопения), концентрат белка С (тромбоз вен, молниеносная пурпура), ретеплаза (делеция мутеина в tPA) (лечение острого инфаркта миокарда, улучшение функции желудочка), стрептокиназа (острый развивающийся трансмуральный инфаркт миокарда, эмболия легких, тромбоз глубоких вен, артериальный тромбоз или эмболия, закупорка артериовенозного катетера), тенектеплаза (острый инфаркт миокарда), урокиназа (эмболия легких), ангиостатин (рак), анти-CD22 иммунотоксин (рецидивирующий острый миелоидный CD33⁺-лейкоз), денилейкина дифтитокс (кожная Т-клеточная лимфома (CTCL)), иммуноцианин (рак мочевого пузыря и предстательной железы), MPS (металлопанстимулин) (рак), афлиберцепт (немелкоклеточный рак легких (NSCLC), метастатический колоректальный рак (mCRC), гормон-рефрактерный метастатический рак предстательной железы, влажная форма дегенерации желтого пятна), эндостатин (рак, воспалительные заболевания типа ревматоидного артрита, а также болезнь Крона, диабетическая ретинопатия, псориаз и эндометриоз), коллагеназа (хирургическая обработка хронических кожных язв и зон серьезных ожогов, контрактура Дюпюитрена, болезнь Пейрони), человеческая дезоксирибонуклеаза I, дорназа (муковисцидоз; снижение инфекций дыхательной системы у отобранных пациентов с прогнозируемой форсированной жизненной емкостью легких (FVC), превышающей 40%), гиалуронидаза (применяется в качестве адъюванта для повышения абсорбции и диспергирования инъецируемых лекарственных средств, прежде всего анестетиков при офтальмических операциях и некоторых визуализирующих агентов), папаин (хирургическая обработка некротической ткани или разжижение отторгающихся некротических масс при острых и хронических повреждениях, таких как пролежневые язвы, варикозные и диабетические язвы, ожоги, послеоперационные раны, раны, связанные с пилонидальными кистами, карбункулы и другие раны), L-аспарагиназа (острый лимфоцитарный лейкоз, нуждающийся в экзогенном аспарагине для пролиферации), ПЭГ-аспарагиназа (острый лимфоцитарный лейкоз, нуждающийся в экзогенном аспарагине для пролиферации), расбуриказа (педиатрические пациенты с лейкозом, лимфомой и солидными опухолями, которых подвергают противораковой терапии, которая может вызывать синдром лизиса опухоли), человеческий хорионический гонадотропин (HCG) (способствует репродукции), человеческий фолликулостимулирующий гормон (FSH) (способствует репродукции), лютропин-альфа (бесплодие, связанное с дефицитом лютеинизирующего гормона), пролактин (гипопролактинемия, дефицит сывороточного пролактина, дисфункция яичников у женщин, состояние страха, артериогенная эректильная дисфункция, преждевременная эякуляция, олигозооспермия, астеноспермия, гипофункция семенных пузырьков, гипоандрогенизм у мужчин), ингибитор альфа-1-протеиназы (врожденный дефицит антитрипсина), лактаза (газообразование, вздутие, колики и диарея из-за неспособности переваривать лактозу), ферменты поджелудочной железы (липаза, амилаза, протеаза) (муковисцидоз, хронический панкреатит, панкреатическая недостаточность, состояние после операции Бильтрона типа II на желудке с наложением обходного анастомоза, закупорка панкреатических протоков, стеаторея, плохое пищеварение, газообразование, вздутие), аденозиндеаминаза (бычья ПЭГадемаза, ПЭГ-ADA) (серьезный комбинированный иммунодефицит из-за дефицита аденозиндеаминазы), абатацепт (ревматоидный артрит (прежде всего устойчивый к ингибированию TNFa)), алефацепт (чешуйчатый псориаз), анакинра (ревматоидный артрит), этанерцепт (ревматоидный артрит, полиартикулярный юношеский ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, чешуйчатый псориаз, анкилозирующий спондилит), антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1), анакинра (воспаление и разрушение хряща, связанные с ревматоидным артритом), тимулин (нейродегенеративные заболевания, ревматизм, нервная анорексия), антагонист TNF-альфа (аутоиммунные нарушения, такие как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, болезнь Крона, псориаз, гидраденит суппуративный, устойчивая астма), энфувиртид (ВИЧ-1 инфекция) и тимозин α1 (гепатит В и С). (В скобках указано конкретное заболевание, для лечения которого применяют терапевтический белок).

Кроме того, к терапевтическим белкам относят также адъювантные или иммуностимулирующие белки. В этом контексте адъювантные или иммуностимулирующие белки можно применять для индукции, изменения или повышения иммунного ответа у индивидуума для лечения конкретного заболевания или для облегчения состояния у индивидуума.

В этом контексте адъювантные белки можно выбирать из адъювантных белков млекопитающих, прежде всего человека, которые, как правило, содержат любой человеческий белок или пептид, который обладает способностью вызывать врожденный иммунный ответ (у млекопитающего), например, в виде реакции связывания экзогенного лиганда TLR с TLR. Более предпочтительно человеческие адъювантные белки выбирают из группы, состоящей из белков, которые являются компонентами и лигандами сигнальных сетей паттерн(образ)-распознающих рецепторов, которые включают TLR, NLR и RLH, включая TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11; NOD1, NOD2, NOD3, NOD4, NOD5, NALP1, NALP2, NALP3, NALP4, NALP5, NALP6, NALP6, NALP7, NALP7, NALP8, NALP9, NALP10, NALP11, NALP12, NALP13, NALP14J IPAF, NAIP, CIITA, RIG-I, MDA5 и LGP2, сигнальные трансдукторы передачи сигналов TLR, включая адаптерные белки, такие, например, как Trif и Cardif; компоненты передачи сигналов малых ГТФаз (RhoA, Ras, Rac1, Cdc42, Rab и т.д.), компоненты передачи сигналов PIP (PI3K, Src-киназы и т.д.), компоненты MyD88-зависимой передачи сигналов (MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TIRAP, TRAF6 и т.д.), компоненты независимой от MyD88 передачи сигналов (TICAM1, TICAM2, TRAF6, TBK1, IRF3, TAK1, IRAK1 и т.д.); активирующие киназы, включая, например, Akt, MEKK1, MKK1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, ERK1, ERK2, GSK3, PKC-киназы, PKD-киназы, GSK3-киназы, JNK, p38MAPK, TAK1, IKK, и TAK1; активирующие факторы транскрипции, включая, например, NF-κВ, c-Fos, c-Jun, с-Мус, CREB, АР-1, Elk-1, ATF2, IRF-3, IRF-7.

Адъювантные белки млекопитающих, прежде всего человека, можно выбирать также из группы, состоящей из белков теплового шока, таких как HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 и HSP90, gp96, фибриногена, повтор экстра-домена А типа III фибронектина; или компоненты системы комплемента, включая C1q, MBL, C1r, C1s, C2b, Bb, D, MASP-1, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C1qR, C1INH, C4bp, MCP, DAF, H, I, P и CD59, или компоненты, индуцирующие гены-мишени, включая, например, бета-дефензин, белки клеточной поверхности; или человеческие адъювантные белки, включая trif, лиганд flt-3, Gp96 или фибронектин и т.д. или гомолог любого из указанных выше человеческих адъювантных белков из других видов.

Адъювантные белки млекопитающих, прежде всего человека, могут содержать также цитокины, которые индуцируют или усиливают врожденный иммунный ответ, включая IL-1 альфа, IL1 бета, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, TNFальфа, IFNальфа, IFNбета, IFNгамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF; хемокины, включая IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1альфа, RANTES, эотаксин, CCL21; цитокины, которые высвобождаются из макрофагов, включая IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNF-альфа; а также s IL-1R1 и IL-1 альфа.

Терапевтические белки, предназначенные для лечения болезней крови, заболеваний кровеносной системы, заболеваний дыхательной системы, рака или опухолевых заболеваний, инфекционных болезней или иммунодефицитов, или адъювантные белки, как правило, представляют собой белки, происходящие из млекопитающих, предпочтительно человека, в зависимости от подлежащего лечению животного. Например, человека предпочтительно лечат терапевтическим белком человеческого происхождения.

Патогенные адъювантные белки, как правило, содержат патогенный адъювантный белок, который может вызывать врожденный иммунный ответ (у млекопитающего), более предпочтительно их выбирают из патогенных адъювантных белков, происходящих из бактерий, простейших, вирусов или грибов и т.д., например, бактериальных (адъювантных) белков, (адъювантных) белков простейших (например, профилин, напоминающий белок Toxoplasma gondii), вирусных (адъювантных) белков или грибковых (адъювантных) белков и т.д.

В частности, бактериальные (адъювантные) белки можно выбирать из группы, состоящей из бактериальных белков теплового шока или шаперонов, включая Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100; OmpA (белок наружной мембраны) из грамотрицательных бактерий; бактериальных поринов, включая OmpF; бактериальных токсинов, включая коклюшный токсин (РТ) из Bordetella pertussis, коклюшный токсин, представляющий собой аденилатциклазу CyaA и CyaC, из Bordetella pertussis, PT-9K/129G-мутанта из коклюшного токсина, коклюшного токсина в виде аденилатциклазы CyaA и CyaC из Bordetella pertussis, токсина столбняка, холерного токсина (СТ), В-субъединицы холерного токсина, CTK63-мутанта из холерного токсина, CTE112K-мутанта из СТ, термолабильного энтеротоксина Escherichia coli (LT), В-субъединицы термолабильного энтеротоксина (LTB), мутанты термолабильного энтеротоксина Escherichia coli с пониженной токсичностью, включая LTK63, LTR72; растворимого в феноле модулина; нейтрофил-активирующего белка (HP-NAP) из Helicobacter pylori; сурфактантного белка D; белка липопротеина А наружной поверхности из Borrelia burgdorferi, Ag38 (антиген с молекулярной массой 38 кДа) из Mycobacterium tuberculosis; белков из бактериальных фимбрий; энтеротоксина СТ холерного вибриона, пилина из пилий грамотрицтальных бактерий и сурфактантного белка А и т.д. или гомолога любых указанных выше бактериальных (адъювантных) белков любых видов.

Бактериальные (адъювантные) белки могут содержать также бактериальные флагеллины. В контексте настоящего изобретения бактериальные флагеллины можно выбирать из флагеллинов из организмов, включающих (но, не ограничиваясь только ими) Agrobacterium, Aquifex, Azospirillum, Bacillus, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Burkholderia, Campylobacter, Caulobacte, Clostridium, Escherichia, Helicobacter, Lachnospiraceae, Legionella, Listeria, Proteus, Псевдоmonas, Rhizobium, Rhodobacter, Roseburia, Salmonella, Serpulina, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, Wolinella, Yersinia, более предпочтительно из флагеллинов из видов, включающих (но, не ограничиваясь только ими) Agrobacterium tumefaciens, Aquifex pyrophilus, Azospirillum brasilense, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bartonella bacilliformis, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Caulobacter crescentus, штамм Bennett клон 1 Clostridium botulinum, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Lachnospiraceae bacterium, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeroguinosa, Pseudomonas syringae, Rhizobium meliloti, Rhodobacter sphaeroides, Roseburia cecicola, Roseburis hominis, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Serpulina hyodysenteriae, Serratia marcescens, Shigella boydii, Treponema phagedenis, Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Wolinella succinogenes и Yersinia enterocolitica.

(Адъювантные) белки простейших являются еще одним примером патогенных адъювантных белков. В этом контексте (адъювантные) белки простейших можно выбирать из любого белка простейших, обладающего адъювантным свойствами, более предпочтительно из группы, состоящей (но, не ограничиваясь только ими) Тс52 из Trypanosoma cruzi, PFTG из Trypanosoma gondii, белки теплового шока простейших, LeIF из Leishmania spp., напоминающего профилин белка из Toxoplasma gondii и т.д.

Вирусные (адъювантные) белки являются еще одним примером патогенных адъювантных белков. В этом контексте вирусные (адъювантные) белки можно выбирать из любого вирусного белка, обладающего адъювантным свойствами, более предпочтительно из группы, состоящей (но, не ограничиваясь только ими) из слитого гликопротеина (F-белок) респираторно-синтициального вируса, оболочечного белка из ММТ-вируса, белка вируса мышиного лейкоза, белка гемагглютинина из вируса кори и т.д.

Грибковые (адъювантные) белки являются еще одним примером патогенных адъювантных белков. В этом контексте грибковые (адъювантные) белки можно выбирать из любого грибкового белка, обладающего адъювантным свойствами, более предпочтительно из группы, состоящей (но, не ограничиваясь только ими) грибкового иммуномодулирующего белка (FIP; LZ-8) и т.д.

И, наконец, адъювантные белки можно выбирать также из группы, состоящей из гемоцианина лимфы улитки (KLH), OspA и т.д.

В другом варианте осуществления изобретения терапевтические белки можно применять для гормон-заместительной терапии, прежде всего терапии женщин в период менопаузы. Указанные терапевтические белки предпочтительно выбирают из эстрогенов, прогестерона или прогестинов и иногда тестостерона.

Кроме того, терапевтические белки можно применять для репрограммирования соматических клеток в плюро- или тотипотентные стволовые клетки. Для этой цели описано несколько факторов, прежде всего Oct-3/4, семейство генов Sox (Sox1, Sox2, Sox3 и Sox15), семейство Klf (Klf1, Klf2, Klf4 и Klf5), семейство Мус (c-myc, L-myc и N-myc), Nanog и LIN28.

Как отмечалось выше, в качестве терапевтических белков можно применять терапевтические антитела, представленные в настоящем описании. Указанные терапевтические антитела предпочтительно выбирают из антител, которые применяют среди прочего для лечения рака и опухолевых заболеваний, например,¹³¹I-тозитумомаб (фолликулярная лимфома, В-клеточные лимфомы, лейкозы), 3F8 (нейробластома), 8Н9, абаговомаб (рак яичников), адекатумумаб (рак предстательной железы и молочной железы), афутузумаб (лимфома), алацизумаб пегол, алемтузумаб (В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз, Т-клеточная лимфома), аматуксимаб, AME-133v (фолликулярная лимфома, рак), AMG 102 (запущенная почечно-клеточная карцинома), анатумомаб мафенатокс (немелкоклеточная карцинома легких), аполизумаб (солидные опухоли, лейкоз, неходжкинская лимфома, лимфома), бавитуксимаб (рак, вирусные инфекции), бектумомаб (неходжкинская лимфома), белимумаб (неходжкинская лимфома), бевацизумаб (рак ободочной кишки, рак молочной железы, опухоли головного мозга и центральной нервной системы, рак легких, гепатоцеллюлярная карцинома, рак почек, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, саркома, меланома, рак пищевода, рак желудка, метастатическая почечно-клеточная карцинома, рак почек, глиобластома, рак печени, пролиферативная диабетическая ретинопатия, дегенерация желтого пятна), биватузумаб мертансин (плоскоклеточная карцинома), блинатумомаб, брентуксимаб ведотин (гематологические виды рака), кантузумаб (рак ободочной кишки, рак желудка, рак поджелудочной железы, NSCLC), кантузумаб мертансин (колоректальный рак), кантузумаб равтансин (различные вида рака), капромаб пендетид (рак предстательной железы), карлумаб, катумаксомаб (рак яичников, неоплазмы фаллопиевых труб, перитонеальные неоплазмы), цетуксимаб (метастатический колоректальный рак и рак головы и шеи), цитатузумаб богатокс (рак яичников и другие солидные опухоли), циксутумумаб (солидные опухоли), кливатузумаб тетраксетан (рак поджелудочной железы), CNTO 328 (В-клеточная неходжкинская лимфома, множественная миелома, болезнь Кастлемена, рак яичников), CNTO 95 (меланома), конатумумаб, дацетузумаб (гематологические виды рака), далотузумаб, деносумаб (миелома, гигантоклеточная опухоль кости, рак молочной железы, рак предстательной железы, остеопороз), детумомаб (лимфома), дрозитумаб, экромексимаб (злокачественная меланома), эдреколомаб (колоректальная карцинома), элотузумаб (множественная миелома), элсилимомаб, энаватузумаб, энситуксимаб, эпратузумаб (аутоиммунные заболевания, системная красная волчанка, неходжкинская лимфома, лейкоз), эртумаксомаб (рак молочной железы), этарацизумаб (меланома, рак предстательной железы, рак яичников), фарлетузумаб (рак яичников), FBTA05 (хронический лимфоцитарный лейкоз), фиклатузумаб (рак), фигитумумаб (адренокортикальная карцинома, немелкоклетчная карцинома легких), флановотумаб (меланома), галиксимаб (В-клеточная лимфома), галиксимаб (неходжкинская лимфома), ганитумаб, GC1008 (запущенная почечно-клеточная карцинома; злокачественная меланома, фиброз легких), гемтузумаб (лейкоз), гемтузумаб озогамицин (острый миелогенный лейкоз), гирентуксимаб (светлоклеточная почечно-клеточная карцинома), глембатумумаб ведотин (меланома, рак молочной железы), GS6624 (идиопатический фиброз легких и солидные опухоли), HuC242-DM4 (рак ободочной кишки, рак желудка, рак поджелудочной железы), HuHMFG1 (рак молочной железы), HuN901-DM1 (миелома), ибритумомаб (рецидивирующая или рефрактерная низкой степени злокачественности фолликулярная или трансформированная В-клеточная неходжкинская лимфома (NHL)), икрукумаб, ID09C3 (неходжкинская лимфома), индатуксимаб равтансин, инотузумаб озогамицин, интетумумаб (солидные опухоли (рак предстательной железы, меланома)), ипилимумаб (саркома, меланома, рак легких, рак яичников, лейкоз, лимфома, опухоли головного мозга и центральной нервной системы, тестикулярный рак, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак молочной железы), иратумумаб (лимфома Ходжкина), лабетузумаб (колоректальный рак), лексатумумаб, линтузумаб, лорвотузумаб мертансин, лукатумумаб (множественная миелома, неходжкинская лимфома, лимфома Ходжкина), лумиликсимаб (хронический лимфоцитарный лейкоз), маратумумаб (рак ободочной кишки, миелома), матузумаб (рак легких, рак шейки матки, рак пищевода), MDX-060 (лимфома Ходжкина, лимфома), MEDI 522 (солидные опухоли, лейкоз, лимфома, рак тонкого кишечника, меланома), митумомаб (мелкоклеточная карцинома легких), могамулизумаб, MORab-003 (рак яичников рак фаллопиевых труб, перитонеальный рак), MORab-009 (рак поджелудочной железы, мезотелиома, рак яичников, немелкоклеточный рак легких, рак фаллопиевых труб, рак брюшной полости), моксетумомаб пасудотокс, МТ103 (неходжкинская лимфома), наколомаб тафенотокс (колоректальный рак), наптумомаб эстафенотокс (немелкоклеточная карцинома легких, почечно-клеточная карцинома), нарнатумаб, нецитумумаб (немелкоклеточная карцинома легких), нимотузумаб (плоскоклеточная карцинома, рак головы и шеи, носоглоточный рак, глиома), нимотузумаб (плоскоклеточные карциномы, глиома, солидные опухоли, рак легких), оларатумаб, онартузумаб (рак), опортузумаб монатокс, ореговомаб (рак яичников), ореговомаб (рак яичников, рак фаллопиевых труб, рак брюшной полости), РАМ4 (рак поджелудочной железы), панитумумаб (рак ободочной кишки, рак легких, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак яичников), патритумаб, пемтумомаб, пертузумаб (рак молочной железы, рак яичников, рак легких, рак предстательной железы), притумумаб (рак головного мозга), ракотумомаб, радретумаб, рамуцирумаб (солидные опухоли), рилотумумаб (солидные опухоли), ритуксимаб (крапивница, ревматоидный артрит, неспецифический язвенный колит, хронический очаговый энцефалит, неходжкинская лимфома, лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз), робатумумаб, самализумаб, SGN-30 (лимфома Ходжкина, лимфома), SGN-40 (неходжкинская лимфома, миелома, лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз), сибротузумаб, силтуксимаб, табалумаб (В-клеточные виды рака), такатузумаб тетраксетан, таплитумомаб паптокс, тенатумомаб, тепротумумаб (гематологические виды опухолей), TGN1412 (хронический лимфоцитарный лейкоз, ревматоидный артрит), тицилимумаб (т.е. тремелимумаб), тигатузумаб, TNX-650 (лимфома Ходжкина), тозитумомаб (фолликулярная лимфома, В-клеточные лимфомы, лейкозы, миелома), трастузумаб (рак молочной железы, рак эндометрия, солидные опухоли), TRBS07 (меланома), тремелимумаб, TRU-016 (хронический лимфоцитарный лейкоз), TRU-016 (неходжкинская лимфома), тукотузумаб целмолейкин, ублитуксимаб, урелумаб, велтузумаб (неходжкинская лимфома), велтузумаб (IMMU-106) (неходжкинская лимфома), волоциксимаб (почечно-клеточная карцинома, рак поджелудочной железы, меланома), вотумумаб (колоректальные опухоли), WX-G250 (почечно-клеточная карцинома), залутумумаб (рак головы и шеи, плоскоклеточный рак) и занолимумаб (Т-клеточная лимфома);

антитела, которые применяют среди прочего для лечения иммунных нарушений, например, эфализумаб (псориаз), эпратузумаб (аутоиммунные заболевания, системная красная волчанка, неходжкинская лимфома, лейкоз), этролизумаб (воспалительное заболевания кишечника), фонтолизумаб (болезнь Крона), иксекизумаб (аутоиммунные заболевания), меполизумаб (синдром гиперэозинофилии, астма, эозинофильный гастероэнтерит, синдром Черджа-Стросса, эозинофильный эзофагит), милатузумаб (множественная миелома и другие гематологические злокачественные заболевания), смешанные иммуноглобулины (первичные иммунодефициты), приликсимаб (болезнь Крона рассеянный склероз), ритуксимаб (крапивница, ревматоидный артрит, неспецифический язвенный колит, хронический очаговый энцефалит, неходжкинская лимфома, лимфома, хронический лимфоцитарный лейкоз), ронтализумаб (системная красная волчанка), руплизумаб (ревматические болезни), сарилумаб (ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит), ведолизумаб (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит), висилизумаб (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит), реслизумаб (воспаления дыхательных путей, кожи и желудочно-кишечного тракта), адалимумаб (ревматоидный артрит, болезнь Крона, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит), азелизумаб (серьезно пораженные пациенты), атинумаб (лечение нервных систем), атлизумаб (ревматоидный артрит, системный ювенильный идиопатический артрит), бертилимумаб (серьезные аллергические нарушения), бесилисомаб (воспалительные повреждения и метастазы), BMS-945429, ALD518 (рак и ревматоидный артрит), бриакинумаб (псориаз, ревматоидный артрит, воспалительные заболевания кишечника, рассеянный склероз), бродалумаб (воспалительные заболевания), канакинумаб (ревматоидный артрит), канакинумаб (криопирин-ассоциированные периодические синдромы (CAPS), ревматоидный артрит, хроническое обструктивное заболевание легких), цертолизумаб пегол (болезнь Крона), эрлизумаб (сердечный приступ, удар, травматический шок), фезакинумаб (ревматоидный артрит, псориаз), голимумаб (ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит), гомиликсимаб (аллергическая астма), инфликсимаб (ревматоидный артрит, болезнь Крона, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, чешуйчатый псориаз, болезнь Бехтерева, неспецифический язвенный колит), маврилимумаб (ревматоидный артрит), натализумаб (рассеянный склероз), окрелизумаб (рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, гематологические виды рака), одулимомаб (предупреждение отторжений трансплантатов органов, иммунологические заболевания), офатумумаб (хронический лимфоцитарный лейкоз, фолликулярная неходжкинская лимфома, В-клеточная лимфома, ревматоидный артрит, рецидивирующий ремиттирующий рассеянный склероз, лимфома, В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз), озорализумаб (воспаление), пекселизумаб (снижение побочных действий операции на сердце), ровелизумаб (геморрагический шок), SBI-087 (ревматоидный артрит), SBI-087 (системная красная волчанка), секукинумаб (увеит, ревматоидный артрит, псориаз), сирукумаб (ревматоидный артрит), тализумаб (аллергическая реакция), тосилизумаб (ревматоидный артрит, системный ювенильный идиопатический артрит, болезнь Кастлемена), торализумаб (ревматоидный артрит, волчаночный нефрит), TRU-015 (ревматоидный артрит), TRU-016 (аутоиммунное заболевание и воспаление), устекинумаб (рассеянный склероз, псориаз, псориатический артрит), устекинумаб (блокатор IL-12/IL-23) (чешуйчатый псориаз, псориатический артрит, рассеянный склероз, саркоидоз, the latter versus), вепалимомаб (воспаление), золимомаб аритокс (системная красная волчанка, болезнь трансплантат-против-хозяина), сифалимумаб (SLE, дерматомиозит, полимиозит), лумиликсимаб (аллергии), Rho(D)-иммуноглобулин (резус-конфликт); или выбирают из антител, применяемых для лечения инфекционных заболеваний, таких, например, как афелимомаб (сепсис), CR6261 (инфекционное заболевание/грипп А), эдобакомаб (сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями), эфунгумаб (инвазивные инфекции, вызываемые Candida), эксбивирумаб (гепатит В), фелвизумаб (инфекция, вызываемая респираторно-синциальным вирусом), форавирумаб (бешенство (профилактика)), ибализумаб (ВИЧ-инфекция), либивирумаб (гепатит В), мотавизумаб (инфекция, вызываемая респираторно-синциальным вирусом (профилактика)), небакумаб (сепсис), тувирумаб (хронический гепатит В), уртоксазумаб (диарея, вызванная Е. coli), бавитуксимаб (различные вирусные инфекции), пагибаксимаб (сепсис (например, вызванный стафилококком)), паливизумаб (предупреждение инфекции, вызываемой респираторно-синциальным вирусом, с высоким риском заражения педиатрических пациентов), панобакумаб (инфекция, вызываемая Pseudomonas aeruginosa), PRO 140 (ВИЧ-инфекция), рафивирумаб (бешенство (профилактика)), раксибакумаб (сибирская язва (профилактика и лечение)), регавирумаб (инфекция, вызываемая цитомегаловирусом), севирумаб (инфекция, вызываемая цитомегаловирусом), сувизумаб (вирусные инфекции) и тефибазумаб (инфекция, вызываемая Staphylococcus aureus);

антитела, которые применяют среди прочего для лечения болезней крови, например, абциксимаб (чрескожное коронарное вмешательство), аторолимумаб (гемолитическая болезнь новорожденных), экулизумаб (пароксизмальная ночная гемоглобинурия), меролизумаб (синдром гиперэозинофилии, астма, эозинофильный гастероэнтерит, синдром Черджа-Стросса, эозинофильный эзофагит) и милатузумаб (множественная миелома и другие виды гематологических злокачественных болезней);

антитела, которые применяют среди прочего для иммунорегуляции, например, антицимоцитарный глобулин (острое отторжение трансплантата почки, апластическая анемия), базиликсимаб (профилактика отторжения аллотранспланта у пациентов с трансплантатом почки, которую получают лечение иммунодепрессантами, включая циклоспорин и кортикостероиды), цеделизумаб (предупреждение отторжений трансплантатов органов, лечение аутоиммунных заболеваний), даклизумаб (профилактика острого отторжения аллотранспланта у пациентов с трансплантатом почки, рассеянный склероз), гавилимомаб (болезнь трансплантат-против-хозяина), инолимомаб (болезнь трансплантат-против-хозяина), муромонаб-CD3 (предупреждение отторжений трансплантатов органов), муромонаб-CD3 (острое отторжение аллотрансплантата почки или устойчивое к действию стероидов отторжение аллотрансплантата сердца или печени), одулимомаб (предупреждение отторжений трансплантатов органов, иммунологические заболевания) и сиплизумаб (псориаз, болезнь трансплантат-против-хозяина (предупреждение));

антитела, которые применяют для лечения диабета, например, гевокизумаб (диабет), отеликсизумаб (сахарный диабет типа 1) и терлизумаб (сахарный диабет типа 1);

антитела, которые применяют для лечения болезни Альцгеймера, например, бапинеузумаб, кренезумаб, гантенерумаб, понезумаб, R1450 и соланезумаб;

антитела, которые применяют для лечения астмы, например, бенрализумаб, энокизумаб, келиксимаб, лебрикизумаб, омализумаб, окселумаб, пасколизумаб, и тралокинумаб;

и антитела, которые применяют для лечения разнообразных нарушений, например, блосозумаб (остеопороз), CaroRx (кариес), фрезолимумаб (идиопатический фиброз легких, очаговый сегментальный гломерулосклероз, рак), фулранумаб (боль), ромосозумаб (остеопороз), стамулумаб (мышечная диистрофия), танезумаб (боль) и ранибизумаб (неоваскулярная возрастная дегенерация желтого пятна).

Кодирующая область модифицированной РНК, предлагаемой в настоящем изобретении, может присутствовать в виде моно-, би- или даже полицистронной РНК, т.е. РНК, которая несет кодирующую(ие) последовательность(и) одного, двух или большего количества белков или пептидов. Указанные кодирующие последовательности би- или даже полицистронной РНК могут разделяться по меньшей мере одной последовательностью участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES), например, указанной в настоящем описании, или сигнальными пептидами, которые индуцируют расщепление образовавшегося полипептида, который содержит несколько белков или пептидов.

Фармацевтическая композиция:

Кроме того, еще одним объектом настоящего изобретения является также применение модифицированной РНК, указанной в настоящем описании, или композиции, содержащей несколько молекул модифицированной РНК, указанных в настоящем описании, для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для экспрессии кодируемого пептида или белка, прежде всего для применения в генной терапии или генетической вакцинации, например, для лечения заболевания, предпочтительно указанного в настоящем описании, например, путем внесения или введения модифицированной РНК, указанной в настоящем описании, или композиции, содержащей несколько молекул модифицированной РНК, указанных в настоящем описании, в клетку (например, для экспрессии в клетке-хозяине или соматической клетке), ткань или организм, предпочтительно в неизмененной («оголенной») форме или в форме комплекса, или в виде фармацевтической композиции, указанной в настоящем описании, с использованием струйной инъекции.

Таким образом, наиболее предпочтительным объектом настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, содержащая модифицированную РНК, указанную в настоящем описании, или композиция, содержащая несколько модифицированных РНК, указанных в настоящем описании, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель, для введения с использованием струйной инъекции.

В качестве первого ингредиента фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одну модифицированную нуклеиновую кислоту, указанную в настоящем описании.

В качестве второго ингредиента предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может включать по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент. В этом контексте фармацевтически активный компонент представляет собой соединение, которое обладает терапевтическим действием с позиций лечения, облегчения или предупреждения конкретного показания или заболевания, указанного в настоящем описании. Указанные соединения включают (но, не ограничиваясь только ими) пептиды или белки, предпочтительно указанные в настоящем описании, нуклеиновые кислоты, предпочтительно указанные в настоящем описании, (терапевтически активные) низкомолекулярные органические или неорганические соединения (с молекулярной массой менее 5000, предпочтительно менее 1000), сахара, антигены или антитела, предпочтительно указанные в настоящем описании, терапевтические средства, уже известные из существующего уровня техники, антигенные клетки, антигенные клеточные фрагменты, клеточные фракции; компоненты клеточной оболочки (например, полисахариды), модифицированные, ослабленные или деактивированные (например, химически или путем облучения) патогены (вирус, бактерии и т.д.), адъюванты, предпочтительно указанные в настоящем описании, и т.д.

Кроме того, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. В контексте настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель, как правило, представляет собой жидкую или нежидкую основу предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. Носитель, как правило, представляет собой беспирогенную воду; изотонический соляной раствор или забуференные (водные) растворы, например, растворы, забуференные фосфатом, цитратом и т.д. Предназначенный для инъекции буфер может быть гипертоническим, изотоническим или гипотоническим относительно конкретной референс-среды, т.е. содержание в буфере солей может быть выше, идентичным или ниже их содержания в конкретной референс-среде, при этом предпочтительно можно применять такие концентрации вышеуказанных солей, которые не приводят к повреждению клеток в результате осмоса или других связанных с концентрацией воздействий. Референс-среды могут представлять собой, например, жидкости, применяемые в методах «in vivo», такие как кровь, лимфа, цитозольные жидкости или другие жидкости организма, или, например, жидкости, которые можно использовать в качестве референс-сред в методах «in vitro», такие как обычные буферы или жидкости. Указанные обычные буферы или жидкости известны специалисту в данной области. Наиболее предпочтительной жидкой основой является лактированный раствор Рингера.

Однако в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно использовать также один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей или разбавителей или капсулирующих соединений, которые можно применять для введения пациенту, подлежащему лечению. Понятие «совместимые» в контексте настоящего описания означает, что составляющие предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно смешивать с модифицированной РНК, указанной в настоящем описании, таким образом, чтобы не происходило взаимодействия, которое могло бы существенно снижать фармацевтическую эффективность предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции в обычных условиях применения.

Комплексообразование:

Кроме того, фармацевтическая композиция может содержать носитель для модифицированной РНК. Указанный носитель можно применять для того, чтобы опосредовать растворение в физиологически приемлемых жидкостях, транспорт и поглощение клетками фармацевтически активной молекулы модифицированной РНК. Следовательно, указанный носитель может представлять собой компонент, который можно применять для запасания и доставки модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении. Такие компоненты могут представлять собой, например, катионные или поликатионные носители или соединения, которые могут служить в качестве агентов для трансфекции или комплексообразования.

В этом контексте наиболее предпочтительными агентами для трансфекции или комплексообразования являются катионные или поликатионные соединения, включая протамин, нуклеолин, спермин или спермидин, или другие катионные пептиды или белки, таких как поли-L-лизин (ПЛЛ), полиаргинин, основные полипептиды, проникающие в клетки пептиды (СРР), включая ВИЧ-связывающие пептиды, Tat, ВИЧ-1 Tat (ВИЧ), полученные из Tat пептиды, пенетратин, полученные из VP22 пептиды или аналогичные пептиды, VP22 HSV (вирус герпеса простого), MAP, KALA или домены белковой трансдукции (PTD), РрТ620, богатые пролином пептиды, богатые аргинином пептиды, богатые лизином пептиды, MPG-пептид(ы), Рер-1, L-олигомеры, пептид(ы) кальцитонина, пептиды, полученные из Antennapedia (прежде всего, из Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, FGF, лактоферрин, транспортан, буфорин-2, Вас715-24, SynB, SynB(1), pVEC, полученные из hCT пептиды, SAP или гистоны.

Кроме того, указанные катионные или поликатионные соединения или носители могут представлять собой катионные или поликатионные пептиды или белки, которые предпочтительно содержат или дополнительно модифицированы так, что они содержат по меньшей мере одну -SH-группу. Предпочтительно катионный или поликатионный носитель выбирают из катионных пептидов, которые имеют следующую общую формулу (III):

в которой l+m+n+o+x=3-100, и l, m, n или o каждый независимо друг от друга обозначает любое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 и 91-100, при условии, что общее содержание Arg (аргинин), Lys (лизин), His (гистидин) и Orn (орнитин) составляет по меньшей мере 10% от всех аминокислот олигопептида; и Хаа обозначает любую аминокислоту, выбранную из нативных (т.е. встречающихся в естественных условиях) или не встречающихся в естественных условиях аминокислот за исключением Arg, Lys, His или Orn; и x обозначает любое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, при условии, что общее содержание Хаа не превышает 90% от всех аминокислот олигопептида. Любая из аминокислот Arg, Lys, His, Orn и Хаа может находиться в пептиде в любом положении. В этом контексте наиболее предпочтительными являются катионные пептиды или белки, состоящие из 7-30 аминокислот.

Кроме того, катионный или поликатионный пептид или белок, если он описывается указанной формулой {(Arg)_l;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)_o;(Xaa)_x} (формула (III)), представленной выше, и который содержат или дополнительно модифицирован так, что он содержит по меньшей мере одну -SH-группу, можно выбирать (но, не ограничиваясь только этим) из субстанций подформулы (IIIa):

в которой (Arg)_l;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)_o и x имеют значения, указанные в настоящем описании, Хаа' обозначает любую аминокислоту, выбранную из нативных (т.е. встречающихся в естественных условиях) или не встречающихся в естественных условиях аминокислот за исключением Arg, Lys, His, Orn или Cys, и у обозначает любое число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80 и 81-90, при условии, что общее содержание Arg (аргинин), Lys (лизин), His (гистидин) и Orn (орнитин) составляет по меньшей мере 10% от всех аминокислот олигопептида.

Кроме того, катионный или поликатионный пептид можно выбирать из субстанций подформулы (IIIb):

в которой эмпирическая формула {(Arg)_l;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)_o;(Xaa)_x} (формула (IV)) указана в настоящем описании и образует ядро аминокислотной последовательности, соответствующей (полуэмпирической) формуле (IV), и в которой Cys₁ и Cys₂ представляют собой остатки цистеина, расположенные проксимально или терминально относительно (Arg)_l;(Lys)_m;(His)_n;(Orn)₀;(Xaa)_x.

Кроме того, предпочтительные катионные или поликатионные соединения, которые можно применять в качестве агентов для трансфекции или комплексообразования, могут включать катионные полисахариды, например, хитозан, полибрен, катионные полимеры, например, полиэтиленимин (ПЭИ), катионные липиды, например, DOTMA: хлорид [1-(2,3-сиолеилокси)пропил)]-N,N,N-триметиламмония, DMRIE, ди-С14-амидин, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, СТАР, DOPC, DODAP, DOPE: диолеилфосфатидилэтаноламин, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: диоктадециламидоглицилспермин, DIMRI: бромид димиристооксипропилдиметилгидроксиэтиламмония, DOTAP: диолеоилокси-3-(триметиламмоний)пропан, DC-6-14: хлорид O,O-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмонийацетил)диэтаноламина, CLIP1: хлорид рац[(2,3-диоктадецилоксипропил)(2-гидроксиэтил)]диметиламмония, CLIP6: рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксиметилокси)этил]триметиламмоний, CLIP9: рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксисукцинилокси)этил]триметиламмоний, олигофектамин, или катионные или поликатионные полимеры, например, модифицированные полиаминокислоты, такие как полимеры β-аминокислот или обращенные полиамиды и т.п., модифицированные полиэтилены, такие как ПВП (поли(N-этил-4-винилпириднийбромид)) и т.п., модифицированные акрилаты, такие как пДМАЭМА (поли(диметиламиноэтилметилакрилат)) и т.п., модифицированные амидоамины, такие как пАМАМ (поли(амидоамин)) и т.п., модифицированные сложные поли-β-аминоэфиры (ПБАЭ), такие как модифицированные в диаминоконцевом фрагменте сополимеры 1,4-бутандиолдиакрилата и 5-амино-1-пентанола и т.п., дендримеры, такие как дендримеры полипропиламина или дендримеры на основе пАМАМ и т.п., полиимин(ы), такие как полиэтиленимин (ПЭИ), полипропиленимин и т.п., полиаллиламин, полимеры на основе сахарного каркаса, такие как полимеры на основе циклодекстрина, полимеры на основе декстрана, хитозан и т.п., силановые полимеры, такие как сополимеры PMOXA-PDMS и т.п., блокполимеры, включающие комбинацию одного или нескольких катионных блоков (например, выбранных из катионных полимеров, указанных выше) и одного или нескольких гидрофильных или гидрофобных блоков (таких, например, как полиэтиленгликоль) и т.п.

В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы молекула модифицированной РНК по меньшей мере частично входила в комплекс с катионным или поликатионным соединением, предпочтительно катионными белками или пептидами. «Частично» означает, что в комплекс с катионным или поликатионным соединением входит только часть модифицированной РНК, не входит в состав комплекса (т.е. находится в «свободной» форме). Предпочтительно соотношение входящая в комплекс модифицированная РНК : свободная модифицированная РНК выбирают из диапазона от примерно 5:1 до примерно 1:10 (мас./мас.), более предпочтительно из диапазона от примерно 4:1 до примерно 1:8 (мас./мас.), еще более предпочтительно из диапазона от примерно 3:1 до примерно 1:5 (мас./мас.) или 1:3 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно соотношение входящая в комплекс нуклеиновая кислота : свободная нуклеиновая кислота, выбирают из соотношения, составляющего примерно 1:1 (мас./мас.).

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения фармацевтическая композиция может содержать адъювант. В этом контексте под адъювантом можно подразумевать любое соединение, которое может инициировать или повышать иммунный ответ врожденной иммунной системы, т.е. неспецифический иммунный ответ. Другими словами, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция предпочтительно вызывает врожденный иммунный ответ благодаря адъюванту, который необязательно содержится в ней. Предпочтительно указанный адъювант можно выбирать из адъюванта, известного специалисту в данной области и пригодного для применения в конкретном случае, т.е. поддерживающего врожденный иммунный ответ у млекопитающего, например, адъювантного белка, указанного выше, или адъюванта, указанного ниже.

Наиболее предпочтительными адъювантами, которые обеспечивают запасание и доставку, являются катионные или поликатионные соединения, указанные выше для модифицированной РНК в качестве наполнителя, агент для трансфекции или комплексообразования.

Другими добавками, которые можно включать в фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, являются эмульгаторы, такие, например, как Tween^®; смачивающие вещества, такие, например, как лаурилсульфат натрия; красители; улучшающие вкус вещества; фармацевтические носители; наполнители для приготовления таблеток; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты.

Фармацевтическая композиция может содержать также любое дополнительное соединение, у которого известна способность, оказывать иммуностимулирующее действие в результате его аффинности связывания (в качестве лиганда) с человеческими Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 или в результате его аффинности связывания (в качестве лиганда) с мышиными Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13.

Фармацевтическую композицию предпочтительно можно вводить подкожно, внутримышечно или внутрикожно с помощью струйной инъекции. Стерильные инъецируемые формы фармацевтических композиций могут представлять собой водную или масляную суспензию. Такие суспензии можно приготавливать с помощью методов, известных в данной области, с использованием пригодных диспергирующих или смачивающих агентов или суспендирующих агентов.

Фармацевтическая композиция, как правило, содержит в «безопасном и эффективном количестве» компоненты фармацевтической композиции, прежде всего модифицированную РНК, указанную в настоящем описании. В контексте настоящего описания под «безопасным и эффективным количеством» предпочтительно подразумевается количество модифицированной РНК, указанной в настоящем описании, которое является достаточным для значимой индукции положительной модификации или предупреждения заболевания или нарушения, указанного в настоящем описании. Однако в то же время «безопасное и эффективное количество» является достаточно небольшим, чтобы избегать серьезных побочных действий и обеспечивать разумное соотношение между преимуществом и риском. Определение этих пределов, как правило, находится в компетенции осуществляющего лечение врача.

Настоящее изобретение относится также к нескольким вариантам применения модифицированной РНК, указанной в настоящем описании, композиции, содержащей несколько молекул модифицированной РНК, указанных в настоящем описании, фармацевтической композиции, содержащей модифицированную РНК, предлагаемую в настоящем описании, или наборов, которые их содержат.

Одним из конкретных объектов настоящего изобретения является первое применение в медицинских целях предлагаемой в изобретении модифицированной РНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении молекул РНК, указанных в настоящем описании, в качестве лекарственного средства, прежде всего в генной терапии или генетической вакцинации, предпочтительно для лечения указанных в настоящем описании заболеваний.

Другим объектом настоящего изобретения является второе применение в медицинских целях предлагаемой в изобретении модифицированной РНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении молекул РНК, указанных в настоящем описании, для лечения указанных в настоящем описании заболеваний, предпочтительно применение предлагаемой в изобретении модифицированной РНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении молекул РНК, указанных в настоящем описании, фармацевтической композиции, содержащей их, или содержащих их наборов для приготовления лекарственного средства, предназначенного для профилактики, лечения и/или облегчения указанных в настоящем описании заболеваний. Предпочтительно фармацевтическую композицию применяют или предполагают вводить пациенту, который нуждается в этом, для указанной цели.

Предпочтительно упомянутые в настоящем описании заболевания предпочтительно выбирают из инфекционных болезней, неоплазм (например, рак или опухолевые заболевания), заболевания крови и кроветворных органов, эндокринных заболеваний, заболеваний, связанных с питанием или с голоданием, и метаболических заболеваний, заболеваний нервной системы, заболеваний кровеносной системы, заболеваний дыхательной системы, заболеваний пищеварительной системы, заболеваний кожи и подкожной ткани, заболеваний скелетно-мышечной системы и соединительной ткани и заболеваний мочеполовой системы.

Заболевания:

Инфекционные болезни:

Предпочтительно инфекционные болезни, упомянутые в настоящем описании, предпочтительно выбирают из инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами, бактериями, простейшими и прионами. Указанные инфекционные болезни, как правило, выбирают из перечня, включающего инфекции, вызываемые Acinetobacter, африканскую сонную болезнь (африканский трипаносомоз), СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита), амебиаз, анаплазмоз, сибирскую язву, аппендицит, инфекции, вызываемые Arcanobacterium haemolyticum, аргентинскую геморрагическую лихорадку, аскариоз, аспергиллез, астровирусные инфекции, эпидермифитию стопы, бабезиоз, инфекции, вызываемые Bacillus cereus, бактериальный менингит, бактериальную пневмонию, бактериальный вагиноз (BV), бактероидные инфекции, балантидиоз, байлисаскаридозные инфекции, билхарзиоз, инфекции, вызываемые полиомавирусом ВК, черную пьедру, инфекции, вызываемые Blastocystis hominis, бластомикоз, боливийскую геморрагическую лихорадку, инфекции, вызываемые Borrelia (боррелиоз), ботулизм (и детский ботулизм), бычий цепень, бразильскую геморрагическую лихорадку, бруцеллез, инфекции, вызываемые Burkholderia, язву Бурули, инфекции, вызываемые калицивирусами (норовирусом и саповирусом), кампилобактериоз, кандидиоз (кандидоз), инфекции, вызываемые собачьим цепнем, болезнь кошачьей царапины, болезнь Шагаса (американский трипаносомиоз), шанкроид, ветрянку, хламидийные инфекции, инфекции, вызываемые Chlamydia trachomatis, инфекции, вызываемые Chlamydophila pneumoniae, холеру, хромобластомикоз, паховый лимфогранулематоз, клоноршиоз, инфекции, вызываемые Clostridium difficile, коккидиоидомикоз, простуду, колорадскую клещевую лихорадку (CTF), обычную простуду (насморк) (острый вирусный ринофарингит; острый ринит), остроконечные кондиломы, конъюнктивит, болезнь Крейтсфельдта-Якоба (CJD), геморрагическую лихорадку Крым-Конго (CCHF), криптококкоз, криптоспоридиоз, кожные мигрирующие личинки (CLM), кожный лейшманиоз, циклоспориоз, цистицеркоз, инфекции, вызываемые цитомегаловирусом, лихорадку Денге, дерматофитоз, диентамебиоз, дифтерию, дифиллоботриаз, донаваноз, дракункулез, весенне-летний менингоэнцефалит (FSME), геморрагическую лихорадку Эбола, эхинококкоз, эрлихиоз, энтеробиоз (инфекции, вызываемые острицами), инфекции, вызываемые Enterococcus, инфекции, вызываемые энтеровирусами, эпидемический тиф, эпиглоттит, инфекционный мононуклеоз, вызываемый вирусом Эпштейна-Барра, инфекционную эритему (пятая болезнь), внезапную экзантему, фасциолопсиоз, фасциолоз, фатальную семейную бессонницу (FFI), пятую болезнь, филариоз, пищевое отравление рыбами (сигуатера), рыбий цепень, грипп, пищевое отравление, вызываемое Clostridium perfringens, лисий солитер, инфекции, вызываемые свободноживущими амебами, инфекции, вызываемые Fusobacterium, газовую гангрену, геотрихоз, синдром Герстманна-Штросслера-Шейнкера (GSS), гиардиоз, сап, гнатостомиоз, гонорею, паховую гранулему (донованоз), стрептококковые инфекции группы А, стрептококковые инфекции группы В, инфекции, вызываемые Haemophilus influenzae, ящур (HFMD), хантавирусный легочный синдром (HPS), инфекции, вызываемые Helicobacter pylori, гемолитическо-уремический синдром (HUS), геморрагическую лихорадку, сопровождающуюся почечным синдромом (HFRS), генипавирусные инфекции, гепатит А, гепатит В, гепатит С, гепатит D, гепатит Е, герпес простой, герпес простой типа I, герпес простой типа II, опоясывающий лишай, гистоплазмоз, полые бородавки, инфекции, вызываемые нематодами, инфекции, вызываемые человеческим бокавирусом, гранулоцитарный элихиоз человека, гранулоцитарный анаплазмоз человека (HGA), инфекции, вызываемые человеческим метапневмовирусом, моноцитарный элихиоз человека, инфекции, вызываемые человеческим папилломавирусом (HPV), инфекции, вызываемые человеческим вирусом парагриппа, гименолепиоз, грипп, изоспориоз, японский энцефалит, болезнь Кавасаки, кератит, инфекции, вызываемые Kingella kingae, болезнь Куру, лямблиоз (гиардиоз), лихорадку Ласса, легионеллез (болезнь легионеров, лихорадка Понтиак), лейшманиоз, лепру, лептоспироз, вши, листериоз, боррелиоз Лайма, болезнь Лайма, лимфатический филяриоз (элефантиоз), лимфоцитарный хориоменингит, малярию, геморрагическую лихорадку Марбург (MHF), вирус Марбург, корь, мелиоидоз (болезнь Уайтмора), менингит, менингококковую болезнь, метагонимиоз, микроспоридиоз, миниатюрный цепень, выкидыш (воспаление предстательной железы), контагиозный моллюск (МС), мононуклеоз, свинку, мышиный тиф (эндемический тиф), мицетому, заболевание, вызываемое Mycoplasma hominis, микоплазменную пневмонию, миоз, мокрый/пеленочный дерматит, неонатальный конъюнктивит (офтальмия новорожденных), неонатальный сепсис (хориоамнионит), нокардиоз, влажную гангрену, инфекции, вызываемые вирусом Норвалк, онхоцеркоз (речная слепота), остеомиелит, отит среднего уха, паракокцидиоидомикоз (Южно-Американский бластомикоз), парагонимиоз, паратиф, пастереллез, педикулез головы (головные вши), педикулез тела (платяные вши), лобковый педикулез (лобковые вши, крабовые вши), воспаление тазовых органов (PID), коклюш (воющий кашель), железистую лихорадку Пфейффера, чуму, пневмококковые инфекции, пневмоцистозную пневмонию (РСР), пневмонию, полиомиелит (детская хромота), полиомиелит, свиной цепень, инфекции, вызываемые превотеллами, первичный амебный менингоэнцефалит (РАМ), прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию, псевдокруп, пситтакоз, Q-лихорадку, кроличью лихорадку, бешенство, лихорадку от крысиного укуса, синдром Рейтера, респираторные синцитиальные вирусные инфекции (RSV), риноспоридиоз, риновирусные инфекции, инфекции, вызванные риккетсиями, осповидный риккетсиоз, лихорадку долины Рифт (RVF), пятнистую лихорадку Скалистых гор (RMSF), ротавирусные инфекции, краснуху, сальмонеллезный паратиф, сальмонеллезный тиф, сальмонеллез, SARS (тяжелый острый респираторный синдром), чесотку, скарлатину, шистосомиоз (билхарциоз), японскую речную лихорадку, сепсис, шигеллоз (бактериальная дизентерия), опоясывающий герпес, оспу натуральную (вариола), мягкий шанкр, споротрихоз, стафилококковое пищевое отравление, стафилококковые инфекции, стронгилоидоз, сифилис, тениоз, столбняк, трехдневную лихорадку, клещевой энцефалит, лишай подбородка (паразитарный сикоз), лишай головы (опоясывающий лишай головы), лишай тела (опоясывающий лишай тела), лишай в паховой области (зуд жокея), лишай ладоней и рук (опоясывающий лишай рук), черный лишай, лишай ступней ног (стопа атлета), лишай на ногтях рук и ног (онихомикоз), лишай разноцветный (питириоз разноцветный), токсокариоз (синдром «блуждающей личинки» глазной (OLM) и синдром «блуждающей личинки» висцеральный (VLM)), токсоплазмоз, трихинелез, трихомониоз, трихуроз (инфекции, вызываемые нематодами волосоглавами), триппер, трипаносомиоз (сонная болезнь), лихорадка тсутсугамуши (цуцугамуши), туберкулез, туляремию, тиф, сыпной тиф, инфекции, вызываемые Ureaplasma urealyticum, вагинит (кольпит), вариантная болезнь Крейтсфельдта-Якоба (vCJD, nvCJD), венесуэльский энцефалит лошадей, венесуэльскую геморрагическую лихорадку, вирусную пневмонию, индийский висцеральный лейшманиоз, бородавки, лихорадку Западного Нила, западный энцефалит лошадей, белую пьедру (лишай белый), лающий кашель, дрожжевую пятнистость, желтую лихорадку, инфекции, вызываемые Yersinia pseudotuberculosis, иерсиниоз и зигомикоз.

Раковые заболевания:

Предпочтительно упомянутые в настоящем описании заболевания выбирают из рака или опухолевых заболеваний, которые предпочтительно включают, например, острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальную карциному, связанные со СПИДом виды рака, связанную со СПИДом лимфому, рак анального канала, рак аппендикса, астроцитому, базальноклеточную карциному, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистоцитому, глиому ствола головного мозга, опухоль головного мозга, астроцитому мозжечка, астроцитому/злокачественную глиому мозжечка, эпендимому, медуллобластому, супратенториально расположенные примитивные нейроэктодермальные опухоли, глиому зрительных путей и гипоталамуса, рак молочной железы, бронхиальные аденомы/карциноиды, лимфому Беркитта, карциноидную опухоль у детей, карциноидную опухоль желудочно-кишечного тракта, карциному неизвестного происхождения, первичную лимфому центральной нервной системы, астроцитому мозжечка у детей, астроцитому/злокачественную глиому мозжечка у детей, рак шейки матки, различные виды детского рака, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронические миелопролиферативные нарушения, рак ободочной кишки, кожную Т-клеточную лимфому, дермапластическую мелкокругоклеточную опухоль, рак эндометрия, эпендимому, рак пищевода, саркому Юинга из семейства опухолей Юинга, опухоль из экстракраниальных зародышевых клеток у детей, опухоль из экстрагонадальных зародышевых клеток, рак внепеченочных желчных протоков, внутриглазную меланому, ретинобластому, рак мочевого пузыря, гастральный рак (рак желудка), карциноидную опухоль желудочно-кишечного тракта, стромальную опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST), опухоль из экстракраниальных, экстрагонадальных или овариальных зародышевых клеток, гестационную трофобластическую опухоль, глиому ствола головного мозга, астроцитому мозжечка у детей, глиому зрительного пути и гипоталамуса у детей, желудочный карциноид, волосковоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, рак сердца, печеночно-клеточный (печени) рак, лимфому Ходжкина, рак гипофаринкса, глиому гипоталамуса и зрительного пути у детей, внутриглазную меланому, карциному из островковых клеток (эндокринная карцинома поджелудочных желез), саркому Капоши, рак почек (почечно-клеточный рак), рак гортани, лейкозы, острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, волосковоклеточный лейкоз, рак губ и ротовой полости, липосаркому, рак печени, немелкоклеточный рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфомы, связанную со СПИДом лимфому, лимфому Беркитта, кожную Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинские лимфомы, первичную лимфому центральной нервной системы, макроглобулинемию Вальденстрема, злокачественную фиброзную гистиоцитому кости/остеосаркому, медуллобластому у детей, меланому, внутриглазную (глазную) меланому, карциному из клеток Меркеля, злокачественную мезотелиому взрослых, мезотелиому у детей, метастатический плоскоклеточный рак шеи с бессимптомным началом, рак ротовой полости, синдром детской множественной эндокринной неоплазии, множественную миелому/неоплазму из плазматических клеток, грибовидный микоз, миелодиспластические синдромы, миелодиспластические/миелопролиферативные заболевания, хронический миелогенный лейкоз, острый миелоидный лейкоз взрослых, острый миелоидный лейкоз у детей, множественную миелому (рак костного мозга), хронические миелопролиферативные нарушения, рак носовой полости и параназального синуса, носоглоточную карциному, нейробластому, оральный рак, ротоглоточный рак, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, рак яичников, эпителиальный рак яичников (поверхностная стромально-эпителиальная опухоль), рак из овариальных зародышевых клеток, опухоль яичников с низким потенциальном злокачественности, рак поджелудочной железы, рак из островковых клеток поджелудочной железы, рак паранозального синуса и носовой полости, рак паращитовидной железы, рак пениса, рак глотки, феохромоцитому, пинеальную астроцитому, пинеальную герминому, пинеалобластому и супратенториально расположенные примитивные нейроэктодермальные опухоли у детей, аденому гипофиза, неоплазии из плазматических клеток/множественную миелому, плевролегочную бластому, первичную лимфому центральной нервной системы, рак предстательной железы, ректальный рак, почечно-клеточную карциному (рак почек), рак почечной лоханки и мочеточника, ретинобластому, рабдомиосаркому у детей, рак слюнных желез, саркому из семейства опухолей Юинга, саркому Капоши, саркому мягких тканей, саркому матку, синдром Сезари, рак кожи (не относящийся к меланоме), рак кожи (меланома), карцинома кожи из клеток Меркеля, рак тонкого кишечника, плоскоклеточную карциному, метастатический плоскоклеточный рак шеи с бессимптомным началом, супратенториально расположенную примитивную нейроэктодермальную опухоль у детей, тестикулярный рак, рак гортани, тимому у детей, тимому и карциному тимуса, рак щитовидной железы, рак щитовидной железы у детей, переходноклеточный рак почечной лоханки и мочеточника, гестационную трофобластическую опухоль, рак мочеиспускательного канала, рак эндометрия матки, саркому матки, вагинальный рак, глиому зрительного пути и гипоталамуса у детей, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема и опухоль Вильмса (рак почек) у детей.

Аллергены:

Предпочтительно упомянутые в настоящем описании заболевания выбирают из аллергий, которые предпочтительно включают, например, пыльцевую аллергию (аллергию на пыльцу трав, и пыльцу деревьев (например, на пыльцу орешника обыкновенного, березы, ольхи, рябины), цветочную пыльцу, пыльцу лекарственных растений (например, пыльцу полыни)), аллергию на клещей домашней пыли, аллергию на плесень (например, аллергию на представителей Acremonium, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Stachybotrys, Trichoderma или Alternarid), аллергию на домашних животных (аллергию на животных; например, кошек, собак, лошадей), пищевую аллергию (например, аллергию на рыбу (например, на окуня, треску, камбалу), морепродукты (например, на краба, омара, креветки), яйцо, пшеницу, орехи (например, арахис, миндаль, кешью, грецкие орехи), сою, молоко и т.д.) или аллергию на укусы насекомых (аллергию на яд насекомых, например яд ос, пчел, шершней, муравьев, комаров или клещей). В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения РНК, содержащую по меньшей мере одну модификацию и содержащую по меньшей мере одну открытую рамку считывания, применяют для лечения рака предстательной железы.

Аутоимунные заболевания:

Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения указанные в настоящем описании заболевания включают указанные ниже аутоимунные заболевания. Аутоимунные заболевания предпочтительно выбирают из таких заболеваний как аддисонова болезнь (аутоиммунный адреналит, болезнь Аддисона), гнездная алопеция, аддисонова анемия (болезнь Бирмера), аутоиммунная гемолитическая анемия (AIHA), аутоиммунная гемолитическая анемия (AIHA) холодового («холодного») типа (болезнь холодового гемагглютинина, холодовая аутоиммунная гемолитическая анемия (AIHA) (болезнь холодового агглютинина), (CHAD)), аутоиммунная гемолитическая анемия (AIHA) теплового типа (тепловая AIHA, тепловая аутоиммунная гемолитическая анемия (AIHA)), аутоиммунная гемолитическая анемия Доната-Ландштейнера (пароксизмальная холодовая гемоглобинурия), антифосфолипидный синдром (APS), атеросклероз, аутоиммунный артрит, артериит темпоральный, артериит Такаясу (болезнь Такаясу, болезнь дуги аорты), темпоральный артериит/гигантоклеточный артериит, аутоиммунный хронический гастрит, аутоиммунное бесплодие, аутоиммунная болезнь внутреннего уха (AIED), базедова болезнь (болезнь базедова), Бехтерева болезнь (болезнь Бехтерева, анкилозирующий спондилит, спондилит анкилозный), синдром Бехчета (болезнь Бехчета), заболевания кишечника, включая аутоиммунные воспалительные заболевания кишечника (включая язвенный колит (гранулематозный энтерит, болезнь Крона), кардиомиопатия, прежде всего аутоиммунная кардиомиопатия, идиопатическая дилатационная кардиомиопатия (DCM), целиакия-спру (глютеновая энтеропатия), иммунная дисфункция в виде синдрома хронической усталости (CFIDS), хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (CIDP), хронический полиартрит, синдром Черджа-Стросса, ложный пемфигоид, синдром Когана, CREST-синдром (синдром, включающий кальциноз, синдром Рейно, нарушения перистальтики пищевода, склеродактилию и телеангиэктазию), болезнь Крона (гранулематозный энтерит, язвенный колит), герпетиформный дерматит Дюринга, дерматологические аутоимунные заболевания, дерматомиозит, диабет, сахарный диабет типа 1 (диабет типа I, инсулинозависимый сахарный диабет), сахарный диабет типа 2 (диабет типа II), эссенциальная смешанная криоглобулинемия, фибромиалгия, фибромиозит, синдром Гудпасчера (опосредуемый антителами к GBM гломерулонефрит), реакция трансплантат-против-хозяина, синдром Гийена-Барре (GBM, полирадикулоневрит), гематологические аутоимунные заболевания, тиреоидит Хашимото, гемофилия, приобретенная гемофилия, гепатит, аутоиммунный гепатит, прежде всего аутоиммунные формы хронического гепатита, идиопатический фиброз легких (IPF), идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, иммунотромбоцитопеническая пурпура (болезнь Верльгофа; ITP), IgA-нефропатия, бесплодие, аутоиммунное бесплодие, ювенильный ревматоидный артрит (болезнь Стилла, синдром Стилла), синдром Лэмбрета-Итона, красный плоский лишай, лишай склеротический, красная волчанка, системная красная волчанка (SLE), красная волчанка (дискоидная форма), артрит Лайма (болезнь Лайма, боррелиозный артрит), синдром Меньера (болезнь Меньера); смешанное заболевание соединительной ткани (MCTD), рассеянный склероз (MS, энцефаломиелит диссеминирующий, болезнь Шарко), миастения гравис (тяжелая псевдопаралитическая миастения) (миастения, MG), миозиты, полимиозит, невральные аутоимунные заболевания, нейродермит, пузырчатка обыкновенная, буллезный пемфигоид, напоминающий рубец пемфигоид; узелковый полиартериит (узелковый периартеиит), полихондрит (панхондрит), полигландулярный (аутоиммунный) синдром (PGA-синдром, синдром Шмидта), полимиалгия ревматическая, первичная агаммаглобулинемия, первичный билиарный цирроз (РВС, первичный аутоиммунный холангит), прогрессирующий системный склероз (PSS), псориаз, псориаз обыкновенный, синдром Рейно, синдром Рейтера (болезнь Рейтера, триада: уретрит, конъюнктивит, реактивный артрит)), ревматоидный артрит (RA, хронический полиартрит, ревматическое заболевание суставов, ревматическая лихорадка), саркоидоз (болезнь Бека, болезнь Бенье-Бека-Шауманна), синдром негнущегося человека, склеродермия, склеродерма, синдром Шегрена, симпатическая офтальмия; транцитарная непереносимость глютена, отторжение трансплантированного органа, увеит, аутоиммунный увеит, васкулит, витилиго, (лейкодерма, пегая кожа) и болезнь Вегнера (гранануломатоз Вегнера).

В этом контексте наиболее предпочтительными являются наследственные болезни, выбранные из следующих: синдром 1р36-делеции; синдром 18р-делеции; дефицит 21-гидроксилазы; 45,X (синдром Тернера); 47,XX,+21 (синдром Дауна); 47,XXX (синдром тройной Х-хромосомы); 47,XXY (синдром Клайнфелтера); 47,XY,+21 (синдром Дауна); 47,ХYY-синдром; порфирия, связанная с дефицитом 5-ALA-дегидратазы (дефицит ALA-дегидратазы); порфирия, связанная с дефицитом дегидратазы 5-аминолевулиновой кислоты (дефицит ALA-дегидратазы); синдром 5р-делеции (синдром «кошачьего крика») 5р-синдром (синдром «кошачьего крика»); А-Т (атаксия-телеангиэктазия); ААТ (дефицит альфа-1-антитрипсина); отсутствие семявыносящего протока (врожденное билатеральное отсутствие семявыносящего протока); отсутствующий проток (конгенитальное билатеральное отсутствие семявыносящего протока); ацерулоплазминемия; ACG2 (ахондрогенез типа II); АСН (ахондроплазия); ахондрогенез типа II; ахондроплазия; дефицит кислой бета-глюкозидазы (болезнь Гоше типа 1); акроцефалосиндактилия (типа Апера) (синдром Апера); акроцефалосиндактилия типа V (синдром Пфейффера); акроцефалия (синдром Апера); острая церебральная болезнь Гоше (болезнь Гоше типа 2); острая перемежающаяся порфирия; дефицит ACY2 (болезнь Канавана); AD (болезнь Альцгеймера); краниосиностоз типа Аделаида (синдром Муенке); аденоматозный полипоз толстой кишки (семейный аденоматозный полипоз); аденоматозный полипоз ободочной кишки (семейный аденоматозный полипоз); ADP (дефицит дегидратазы ALA); дефицит аденилосукцинатлиазы; нарушения надпочечников (дефицит 21-гидроксилазы); адреногенитальный синдром (дефицит 21-гидроксилазы); адренолейкодистрофия; AIP (острая перемежающаяся порфирия); AIS (синдром андрогенной нечувствительности); AKU (алкаптонурия); порфирия, обусловленная дефицитом дегидратазы ALA (дефицит дегидратазы ALA); ALA-D-порфирия (дефицит дегидратазы ALA); дефицит дегидратазы ALA; алкаптонурия; болезнь Александера; алкаптонурический охроноз (алкаптонурия); дефицит альфа-1-антитрипсина; ингибитор альфа-1-протеиназы (дефицит альфа-1-антитрипсина); связанная с альфа-1-антитрипсином эмфизема (дефицит альфа-1-антитрипсина); дефицит альфа-галактозидазы А (болезнь Фабри); ALS (амиотрофический боковой склероз); синдром Альстрема; ALX (болезнь Александера); болезнь Альцгеймера; амелогенез несовершенный; дефицит дегидратазы аминолевулиновой кислоты (дефицит дегидратазы ALA); дефицит аминоацилазы 2 (болезнь Канавана); амиотрофический боковой склероз; болезнь Андерсона-Фабри (болезнь Фабри); синдром андрогенной нечувствительности; анемия; анемия наследственная сидеробластная (Х-сцепленная сидеробластная анемия); связанная с полом сидеробластная гипохромная анемия (Х-сцепленная сидеробластная анемия); анемия спленомегалическая семейная (болезнь Гоше); синдром Ангельмана; диффузная ангиокератома туловища (болезнь Фабри); диффузная ангиокератома (болезнь Фабри); ангиоматоз сетчатки (болезнь фон Гиппеля-Линдау); ANH1 (Х-сцепленная сидеробластная анемия); устойчивость в АРС типа Лейдена (тромбофилия, обусловленная фактором V Лейдена); синдром Апера; дефицит AR (синдром андрогенной нечувствительности); AR-CMT2 ее (болезнь Шарко-Мари-Тута типа 2); арахнодактилия (синдром Марфана); ARNSHL (несиндромная глухота, аутосомно-рецессивная); артроофтальмопатия, наследственная прогрессирующая (синдром Стиклера, COL2A1); артрохалазия множественная врожденная (синдром Элерса-Данло, тип артрохалазии); AS (синдром Ангельмана); дефицит Asp (болезнь Канавана); дефицит Aspa (болезнь Канавана); дефицит аспартоацилазы (болезнь Канавана); атаксия-телеангиэктазия; синдром аутизма-деменции-атаксии-хаотичных движений рук (синдром Ретта); аутосомальный доминантный ювенильный ALS (амиотрофический боковой склероз типа 4); аутосомно-доминантный синдром G/BBB Опитца (синдром делеции 22q11.2); аутосомно-рецессивная форма ювенильного ALS типа 3 (амиотрофический боковой склероз типа 2); аутосомно-рецессивная несиндромная потеря слуха (несиндромная глухота, аутосомно-рецессивная); аутосомно-рецессивное сенсороневральное ухудшение слуха и зоб (синдром Пендреда); AxD (болезнь Александера); синдром Айерсы (первичная легочная гипертензия); вариант GM2-ганглиозидоза с дефицитом гексоаминизазы В (болезнь Сандхоффа); BANF (нейрофиброматоз 2); синдром сморщенных покровов Бира-Стивенсона; доброкачественный пароксизмальный перитонит (средиземноморская лихорадка, семейная); синдром Бенджамина; бета-талассемия; дефицит ВН4 (дефицит тетрагидробиоптерина); двухсторонний акустический нейрофиброматоз (нейрофиброматоз 2); дефицит биотинидазы; рак мочевого пузыря; нарушения, связанные с кровотечением (тромбофилия, обусловленная фактором V Лейдена); синдром Блоха-Сульцбергера (распространенная пигментация); синдром Блума; заболевания кости; заболевания костного мозга (Х-сцепленная сидеробластная анемия); синдром Бонневи-Улльриха (синдром Тернера); болезнь Бурневилля (склероз туберозный); факоматоз Бурневилля (склероз туберозный); заболевания головного мозга (прионная болезнь); рак молочной железы; синдром Бирта-Хогга-Дюбе; болезнь хрупких костей (несовершенный остеогенез); синдром Брода-Тумба-Халлукса (синдром Рубинстайна-Тэйби); бронзовый диабет (гемохроматоз); бронзовый цирроз (гемохроматоз); бульбоспинальная мышечная атрофия, Х-сцепленная (болезнь Кеннеди); синдром Бургера-Грутца (дефицит липопротеинлипазы, семейный); CADASIL; CGD, хроническое грануломатозное нарушение; камптомелическая дисплазия; болезнь Канавана; рак; семейный раковый синдром (наследственный неполипозный колоректальный рак); рак молочной железы (опухоль молочной железы); рак мочевого пузыря (опухоль мочевого пузыря); дефицит карбоксилазы, множественный, поздняя форма (дефицит биотинидазы); кардиомиопатия (синдром Нунан); синдром «кошачьего крика» (Cri du chat-синдром); CAVD (врожденное двухсторонне отсутствие семявыводящего протока); кардио-фасциальный синдром Кейлора (синдром делеции 22q11.2); CBAVD (врожденное двухстороннее отсутствие семявыводящего протока); болезнь органов брюшной полости; СЕР (врожденная эритропоэтическая порфирия); дефицит церамид-тригексозидазы (болезнь Фабри); цереброретинальный ангиоматоз, семейный (болезнь фон Гиппеля-Линдау); артериопатия мозжечка с субкортикальными инфарктами и лейкоэнцефалопатией (CADASIL); аутосомально-доминантная артериопатия мозжечка с субкортикальными инфарктами и лейкоэнцефалопатией (CADASIL); склероз мозжечка (туберозный склероз); цереброатрофическая гипераммониемия (синдром Ретта); синдром цереброзидного липидоза (болезнь Гоше); CF (муковисцидоз); СН (врожденный гипотиреоидизм); болезнь Шарко (амиотрофический боковой склероз); болезнь Шарко-Мари-Тута; хондродистрофия (ахондроплазия); синдром хондродистрофии (ахондроплазия); хондродистрофия, сопровождающаяся сенсоневральной глухотой (отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия); хондрогенез несовершенный (ахондрогенез, типа II); хореоатетозный гиперурикемический синдром, сопровождающийся членовредительством (синдром Леша-Найхана); классическая галактоземия (галактоземия); классический синдром Элерса-Данло (Элерса-Данло синдром, классического типа); классическая фенилкетонурия (фенилкетонурия); расщелина губы и неба («волчья пасть») (синдром Стиклера); танатофорная карликовость с формой черепа в виде трилистника (танатофорная дисплазия типа 2); CLS (синдром Коффина-Лоури); СМТ (болезнь Шарко-Мари-Тута); синдром Коккейна; синдром Коффина-Лоури; коллагенопатия, типы II и XI; рак ободочной кишки, семейный неполипозный (наследственный неполипозный колоректальный рак); рак ободочной кишки, семейный (семейный аденоматозный полипоз); колоректальный рак; полный дефицит HPRT (синдром Леша-Найхана); полный дефицит гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (синдром Леша-Найхана); компрессионная невропатия (наследственная невропатия с предрасположенностью к параличам от сдавливания); врожденная гиперплазия надпочечников (дефицит 21-гидроксилазы); врожденное двухстороннее отсутствие семявыводящего протока (врожденное отсутствие семявыводящего протока); врожденная эритропоэтическая порфирия; врожденное заболевание сердца; врожденная гипомиелинизация (болезнь Шарко-Мари-Тута типа 1/болезнь Шарко-Мари-Тута типа 4); врожденный гипотиреоидизм; врожденная метемоглобинемия (метемоглобинемия, врожденная метемоглобинемия); врожденный остеосклероз (ахондроплазия); врожденная сидеробластная анемия (Х-сцепленная сидеробластная анемия); заболевание соединительной ткани; синдром конотрункальных и лицевых аномалий (синдром делеции 22q11.2); анемия Кули (бета-талассемия); нарушение обмена меди (болезнь Вильсона); нарушение транспорта меди (болезнь Менкеса); копропорфирия, наследственная (наследственная копропорфирия); дефицит копропорфириногеноксидазы (наследственная копропорфирия); синдром Коудена; дефицит СРО (наследственная копропорфирия); дефицит CPRO (наследственная копропорфирия); дефицит СРХ (наследственная копропорфирия); черепно-лицевой дизартроз (синдром Крузона); черепно-лицевой дизостоз (синдром Крузона); кретинизм (врожденный гипотиреоидизм); болезнь Крейтцфельдта-Якоба (прионовая болезнь); синдром «кошачьего крика» (Cri du chat) (болезнь Крона, фибростеноз); синдром Крузона; синдром Крузона с черным акантозом (дермоскелетный синдром Крузона); дермоскелетный синдром Крузона; CS (синдром Коккейна) (синдром Коудена); синдром Куршманна-Баттена-Штейнерта (миотоническая дистрофия); синдром сморщенной кожи Бира-Стивенсона (Бира-Стивенсона синдром сморщенной кожи); нарушение вследствие мутации хромосомы; дефицит D-глицератдегидрогеназы (гипероксалурия, первичная); синдром пятнистого метафиза (спондилоэпиметафизеальная дисплазия, типа Струдвика); DAT - деменция альцгеймеровского типа (болезнь Альцгеймера); генетическая гиперкальциурия (болезнь Дента); DBMD (мышечная дистрофия, типа Дюшенна и Бекера); синдром глухоты и зоб (синдром Пендреда); синдром глухоты-пигментного ретинита (синдром Ашера); болезнь, обусловленная дефицитом фенилаланингидроксилазы (фенилкетонурия); дегенеративные заболевания нервов; синдром де Груши 1 (синдром де Груши); синдром Дежерина-Сотта (болезнь Шарко-Мари-Тута); обусловленная дефицитом дельта-аминолевулинатдегидратазы порфирия (дефицит дегидратазы ALA); деменция (CADASIL); демиелиногенная лейкодистрофия (болезнь Александера); дерматоспараксический тип синдрома Элерса-Данло (синдром Элерса-Данло дерматоспараксического типа); дерматоспараксис (синдром Элерса-Данло дерматоспараксического типа); инвалидности вследствие пороков развития; dHMN (амиотрофический боковой склероз типа 4); DHMN-V (дистально-спинальная мышечная атрофия, типа V); дефицит DHTR (синдром андрогенной нечувствительности); диффузный склероз с глобоидными клетками (болезнь Краббе); синдром Ди Георге; дефицит дигидротестостеронового рецептора (синдром андрогенной нечувствительности); дистально-спинальная мышечная атрофия, типа V; DM1 (миотоническая дистрофия типа 1); DM2 (миотоническая дистрофия типа 2); синдром Дауна; DSMAV (дистально-спинальная мышечная атрофия, типа V); DSN (болезнь Шарко-Мари-Тута типа 4); DSS (болезнь Шарко-Мари-Тута, типа 4); мышечная дистрофия Дюшенна/Бекера (мышечная дистрофия, Дюшенна и Бекера типов); остановка в росте, ахондропластическая (ахондроплазия); остановка в росте, танатоформная (танатоформная дисплазия); карликовость; синдром карликовости-ретинальной дистрофии-глухоты (синдром Коккейна); дисмиелиногенная лейкодистрофия (болезнь Александера); дистрофия миотоническая (миотоническая дистрофия); синдром пигментозной дистрофии сетчатки-дизостоза (синдром Ашера); семейная форма болезни Альцгеймера с ранним началом (EOFAD) (болезнь Альцгеймера); EDS (синдром Элерса-Данло); синдром Элерса-Данло; болезнь Экмана-Лобстайна (несовершенный остеогенез); компрессионная невропатия (наследственная невропатия с предрасположенностью к параличам от сдавливания); эпилойя (туберозный склероз); ЕРР (эритропоэтическая протопорфирия); эритробластная анемия (бета-талассемия); эритрогепатическая протопорфирия (эритропоэтическая протопорфирия); дефицит эритроид-5-аминолевулинатсинтетазы (Х-сцепленная сидеробластная анемия); эритропоэтическая порфирия (врожденная эритропоэтическая порфирия); эритропоэтическая протопорфирия; эритропоэтическая уропорфирия (врожденная эритропоэтическая порфирия); рак глаза (ретинобластома FA - атаксия Фридрейха); болезнь Фабри; лицевые повреждения и нарушения; тромбофилия, обусловленная фактором V Лейдена; FALS (амиотрофический боковой склероз); семейная акустическая неврома (нейрофиброматоз типа II); семейный аденоматозный полипоз; семейная болезнь Альцгеймера (FAD) (болезнь Альцгеймера); семейный амиотрофический боковой склероз (амиотрофический боковой склероз); семейная дизаутономия; семейная индуцированная жирами гипертриглицеридемия (дефицит липопротеинлипазы, семейный); семейный гемахроматоз (гемахроматоз); семейный дефицит LPL (дефицит липопротеинлипазы, семейный); семейный неполипозный рак ободочной кишки (наследственный неполипозный колоректальный рак); семейный пароксизмальный полисерозит (средиземноморская лихорадка, семейная); семейная РСТ (поздняя кожная порфирия); семейная компрессионная невропатия (наследственная невропатия с предрасположенностью к параличам от сдавливания); семейная первичная легочная гипертензия (FPPH) (первичная легочная гипертензия); семейный синдром Тернера (синдром Нунан); семейная сосудистая лейкоэнцефалопатия (CADASIL); FAP (семейный аденоматозный полипоз); FD (семейная дизавтономия); псевдосиндром Тернера у женщин (синдром Нунан); дефицит феррохелатазы (эритропоэтическая протопорфирия); болезнь ферропортина (гемахроматоз типа 4); лихорадка (средиземноморская лихорадка, семейная); синдром FG; FGFR3-ассоциированный корональный синостоз (синдром Мюнке); фибриноидная дегенерация астроцитов (болезнь Александера); фиброкистозная болезнь поджелудочной железы (муковисцидоз); FMF (средиземноморская лихорадка, семейная); болезнь Феллинга (фенилкетонурия); fra(X)-синдром (синдром хрупкой Х-хромосомы); синдром хрупкой Х-хромосомы; хрупкость костей (несовершенный остеогенез); FRAXA синдром (синдром хрупкой Х-хромосомы); FRDA (атаксия Фридрейха); атаксия Фридрейха (Фридрейха атаксия); Фридрейховская атаксия; FXS (синдром хрупкой Х-хромосомы); дефицит G6PD; болезнь, обусловленная дефицитом галактокиназы (галактоземия); болезнь, обусловленная дефицитом галактозо-1-фосфатуридилтрансферазы (галактоземия); галактоземия; болезнь, обусловленная дефицитом галактозилцеримидазы (болезнь Краббе); галактозилцерамидный липидоз (болезнь Краббе); дефицит галактозилцереброзидазы (болезнь Краббе); галактозилсфингозиновый липидоз (болезнь Краббе); дефицит GALC (болезнь Краббе); дефицит GALT (галактоземия); болезнь Гоше; Гоше-подобная болезнь (болезнь псевдо-Гоше); дефицит GBA (болезнь Гоше типа 1); GD (болезнь Гоше); генетические нарушения головного мозга; генетическая эмфизема (дефицит альфа-1-антитрипсина); генетический гемахроматоз (гемахроматоз); гигантоклеточный гепатит, неонатальный (неонатальный гемахроматоз); дефицит GLA (болезнь Фабри); глиобластома, ретинальная (ретинобластома); глиома, ретинальная (ретинобластома); глобоидно-клеточная лейкодистрофия (GCL, GLD) (болезнь Краббе); глобоидно-клеточная лейкоэнцефалопатия (болезнь Краббе); дефицит глюкоцереброзидазы (болезнь Гоше); глюкоцереброзидоз (болезнь Гоше); глюкозилцереброзидный липидоз (болезнь Гоше); дефицит глюкозилцерамидазы (болезнь Гоше); дефицит глюкозилцерамид-бета-глюкозидазы (болезнь Гоше); глюкозилцерамидный липидоз (болезнь Гоше); глицериновая ацидурия (гипероксалурия, первичная); глициновая энцефалопатия (некетоновая гиперглицинемия); гликолевая ацидурия (гипероксалурия, первичная); ганглиозидоз GM2, типа 1 (болезнь Тэя-Сакса); синдром зоба-глухоты(синдром Пендреда); синдром Грефе-Ашера (синдром Ашера); синдром Гренблад-Страндберга (эластичная псевдоксантома); порфирия Гунтера (врожденная эритропоэтическая порфирия); болезнь Гунтера (врожденная эритропоэтическая порфирия); гемахроматоз (гемахроматоз); синдром Халлгрен (синдром Ашера); ихтиоз арлекина; болезнь Hb S (серповидноклеточная анемия); НСН (гипохондроплазия); НСР (наследственная копропорфирия); пороки развития головы и головного мозга; нарушения слуха и глухота; проблемы со слухом у детей; HEF2A (гемахроматоз типа 2); HEF2B (гемахроматоз#типа 2); гематопорфирия (порфирия); дефицит синтетазы гема (эритропоэтическая протопорфирия); гемахроматоз (гемахроматозис); гемахроматоз; болезнь гемоглобина М (метемоглобинемия бета-глобинового типа); болезнь гемоглобина S (скрповидноклеточная анемия); гемофилия; HEP (гепатоэритропоэтическая порфирия); дефицит AGT в печени (гипероксалурия, первичная); гепатоэритропоэтическая порфирия; синдром гепатолентикулярной дегенерации (болезнь Вильсона); наследственная артро-офтальмопатия (синдром Стиклера); наследственная копропорфирия; наследственный дистопический липидоз (болезнь Фабри); наследственный гемахроматоз (ННС) (гемахроматоз); наследственная миопатия с тельцами включения (регенерация скелетной мышечной ткани); наследственная анемия с избытком железа (Х-сцепленная сидеробластная анемия); наследственная моторная и сенсорная невропатия (болезнь Шарко-Мари-Тута); наследственная моторная невропатия (спинально-мышечная атрофия); наследственная моторная невропатия, типа V (дистальная спинально-мышечная атрофия, типа V); наследственный множественный экзостоз; наследственный неполипозный колоректальный рак; синдром наследственной периодической лихорадки (средиземноморская лихорадка, семейная); наследственный коли-полипоз (семейный аденоматозный полипоз); наследственная легочная эмфизема (дефицит альфа-1-антитрипсина); наследственная устойчивость к активированному белку С (тромбофилия, обусловленная фактором V Лейдена); наследственная сенсорная и автономная невропатия типа III (семейная дизавтономия); наследственная спастическая параплегия (детский восходящий наследственный спастический паралич); наследственная спинальная атаксия (атаксия Фридрейха); наследственный спинальный склероз (атаксия Фридрейха); анемия Херрикса (серповидноклеточная анемия); гетерозиготный OSMED (синдром Вейссенбахера-Цвеймюллера); гетерозиготная отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия (синдром Вейссенбахера-Цвеймюллера); дефицит НехА (болезнь Тея-Сакса); дефицит гексозаминидазы А (болезнь Тея-Сакса); дефицит альфа-субъединицы гексозаминидазы (вариант В) (болезнь Тея-Сакса); HFE-ассоциированный гемахроматоз (гемахроматоз); HGPS (прогерия); болезнь Гиппеля-Линдау (болезнь фон Гиппеля-Линдау); HLAH (гемахроматоз); HMN V (дистальная спинально-мышечная атрофия, типа V); HMSN (болезнь Шарко-Мари-Тута); HNPCC (наследственный неполипозный колоректальный рак); HNPP (наследственная невропатия с предрасположенностью к параличам от сдавливания); гомоцистинурия; дефицит оксидазы гомогентизиновой кислоты (алкаптонурия); гомогентизиновая ацидурия (алкаптонурия); гомозиготная поздняя кожная порфирия (гепатоэритропоэтическая порфирия); НР1 (гипероксалурия, первичная); НР2 (гипероксалурия, первичная); НРА (гиперфенилаланинемия); HPRT - дефицит гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (синдром Леша-Найхана); HSAN типа III (семейная дизавтономия); HSAN3 (семейная дизавтономия); HSN-III (семейная дизавтономия); человеческий дерматоспараксис (синдром Элерса-Данло дерматоспараксического типа); болезнь Гентингтона; синдром прогерии Гетчинсона-Гилфорда (прогерия); гиперандрогенизм, неклассического типа, обусловленный дефицитом 21-гидроксилазы (дефицит 21-гидроксилазы); гиперхиломикронемия, семейная (дефицит липопротеинлипазы, семейный); гиперглицинемия с кератозом и лейкопенией (пропионовая ацидемия); гиперлипопротеинемия типа I (дефицит липопротеинлипазы, семейный); гипероксалурия, первичная; гиперфенилаланинемия (гиперфенилаланинемия); гипохондродисплазия (гипохондроплазия); гипохондрогенез; гипохондроплазия; гипохромная анемия (Х-сцепленная сидеробластная анемия); гипокупремия, врожденная; синдром Менкеса); дефицит гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT) (синдром Леша-Найхана); IAHSP (детский восходящий наследственный спастический паралич); идиопатический гемахроматоз (гемахроматоз, типа 3); идиопатический неонатальный гемахроматоз (гемахроматоз, неонатальный); идиопатическая легочная гипертензия (первичная легочная гипертензия); нарушения иммунной системы (Х-сцепленный серьезный комбинированный иммунодефицит); пигментный дерматоз; детская церебральная болезнь Гоше (болезнь Гоше типа 2); детская болезнь Гоше (болезнь Гоше типа 2); детский восходящий наследственный спастический паралич; бесплодие; врожденная эмфизема (дефицит альфа-1-антитрипсина); врожденные человеческие трансмиссивные спонгиформные энцефалопатии (прионовая болезнь); врожденная предрасположенность к компрессионным параличам (наследственная невропатия с предрасположенностью к параличам от сдавливания); синдром Инсли-Астли (отоспондиломегаэпифизарная дисплазия); синдром перемежающейся острой порфирия (острая перемежающаяся порфирия); синдром кишечного полипоза, сопровождающейся кожной пигментацией (синдром Пейтца-Егерса); IP (пигментный дерматоз); нарушение накопления железа (гемахроматоз); изодицентрик 15 (idic15); изолированная глухота (несиндромная глухота); синдром Джексона-Вейсса; JH (гемахроматоз типа 2); синдром Юберта; JPLS (ювенильный первичный боковой склероз); ювенильный амиотрофический боковой склероз (амиотрофический боковой склероз типа 2); ювенильный зоб, хореоатетоз, синдром умственной отсталости (синдром Леша-Найхана); ювенильный гиперурекемический синдром (синдром Леша-Найхана); JWS (синдром Джексона-Вейсса); KD (Х-сцепленная спинально-бульбарная мышечная атрофия); болезнь Кеннеди (Х-сцепленная спинально-бульбарная мышечная атрофия); спинально-бульбарная мышечная атрофия Кеннеди (Х-сцепленная спинально-бульбарная мышечная атрофия); керазиновый гистиоцитоз (болезнь Гоше); керазиновый липидоз (болезнь Гоше); керазиновый тезауримоз (болезнь Гоше); кетоновая глицидемия (пропионовая ацидемия); кетоновая гиперглицинемия (пропионовая ацидемия); болезни почек (гипероксалурия, первичная); синдром Клайнфелтера; Клайнфелтеровский синдром; дисплазия Книста; болезнь Краббе; лакунарная деменция (CADASIL); ахондрогенез Лангера-Салдино (ахондрогенез, типа II); дисплазия Лангера-Салдино (ахондрогенез, типа II); болезнь Альцгеймера с поздним началом (болезнь Альцгеймера type 2); семейная болезнь Альцгеймера с поздним началом (AD2) (болезнь Альцгеймера type 2); болезнь Краббе с поздним началом (LOKD) (болезнь Краббе); нарушения обучаемости (неспособность к обучению); лентигиноз, периоральный (синдром Пейтца-Егерса); синдром Леша-Найхана; лейкодистрофии; лейкодистрофия с волокнистой формацией Розенталя (болезнь Александера); лейкодистрофия, спонгиоформная (болезнь Канавана); LFS (Ли-Фромени синдром); синдром Ли-Фромени; дефицит липазы D (дефицит липопротеинлипазы, семейный); дефицит LIPD (дефицит липопротеинлипазы, семейный); липидоз, цереброзидный (болезнь Гоше); липидоз, ганглиозидный, детский (болезнь Тея-Сакса); липоидный гистиоцитоз (керазинового типа) (болезнь Гоше); дефицит липопротеинлипазы, семейный; болезни печени (галактоземия); болезнь Лу Герига (амиотрофический боковой склероз); синдром Луи-Бар (атаксия-телеангиэктазия); синдром Линча (наследственный неполипозный колоректальный рак); дефицит лизилгидроксилазы (синдром Элерса-Данло кифосколиозного типа); болезнь Мачадо-Джозефа (спиноцеребеллярная атаксия 3-го типа); рак молочной железы у мужчин (рак молочной железы); нарушения мужских гениталий; синдром Тернера у мужчин (синдром Нунан); злокачественная неоплазма молочной железы (рак молочной железы); злокачественная опухоль молочной железы (рак молочной железы); злокачественная опухоль мочевого пузыря (рак мочевого пузыря); маммарный рак (рак молочной железы); синдром Марфана 15; синдром маркера X (синдром хрупкой Х-хромосомы); синдром Мартина-Белла (синдром хрупкой X-хромосомы); синдром Мак-Кьюна-Олбрайта; синдром Мак-Лауда; MEDNIK; средиземноморская анемия (бета-талассемия); средиземноморская лихорадка, семейная; мегаэфизеальная карликовость (отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия); синдром Менке (синдром Менкеса); синдром Менкеса; умственная отсталость с костно-хрящевыми аномалиями (синдром Коффина-Лоури); метаболические нарушения; метатропическая карликовость, типа II (дисплазия Книста); метатропическая дисплазия типа II (дисплазия Книста); метемоглобинемия#бета-гобинового типа; метилмалоновая ацидемия; MFS (синдром Марфана); MHAM (синдром Коудена); MK (синдром Менкеса); синдром Микро; микроцефалия; ММА (метилмалоновая ацидемия); MNK (синдром Менкеса); синдром моносомии 1р36 (синдром делеции 1р36); моносомия X (синдром Тернера); болезнь моторных нейронов, амиотрофический боковой склероз (амиотрофический боковой склероз); двигательные нарушения; синдром Мовата-Вильсона; мукополисахаридоз (MPS I); муковисцидоз (кистозный муковисцидоз); синдром Мюнке; мультиинфарктная деменция (CADASIL); множественная карбоксилазная недостаточность с поздним началом (дефицит биотинидазы); синдром множественной гамартомы (синдром Коудена); множественный нейрофиброматоз (нейрофиброматоз); мышечная дистрофия; мышечная дистрофия, типа Дюшенна и Бекера; атрофическая миотония (миотоническая дистрофия); атрофическая миотония (миотоническая дистрофия); миотоническая дистрофия; микседема, врожденная (врожденный гипотиреоидизм); синдром Нэнси-Инсли (отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия); хондродисплазия Ненса-Свитни (отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия); NBIA1 (пантотенаткиназа-ассоциированная нейродегенерация); синдром Нейла-Дингволла (синдром Коккейна); нейробластома, ретинальная (ретинобластома); нейродегенерация с накоплением железа в головном мозге типа 1 (пантотенаткиназа-ассоциированная нейродегенерация); нейрофиброматоз типа I; нейрофиброматоз типа II; неврологические заболевания; нейромышечные нарушения; нейронопатия, дистальная наследственная моторная, типа V (дистальная спинальная мышечная атрофия типа V); нейронопатия, дистальная наследственная моторная, с пирамидальной симптоматикой (амиотрофический боковой склероз типа 4); NF (нейрофиброматоз); Ниманна-Пика болезнь (болезнь Ниманна-Пика; синдром Ноака (синдром Пфейффера); некетотическая гиперглицинемия (глициновая энцефалопатия); ненейронопатическая болезнь Гоше (болезнь Гоше типа 1); гиперфенилаланинемия без фенилкетонурии (дефицит тетрагидробиоптерина); несиндромная глухота; синдром Нунан; норрботтенская болезнь Гоше (болезнь Гоше типа 3); охроноз (алкаптонурия); охронотический артрит (алкаптонурия); 01 (несовершенный остеогенез); OSMED (отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия); несовершенный остеогенез; остеопсатироз (несовершенный остеогенез); врожденный остеосклероз (ахондроплазия); отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия (отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия); отоспондиломегаэпифизеальная дисплазия; оксалоз (гипероксалурия, первичная); оксалурия, первичная (гипероксалурия, первичная); пантотенаткиназа-ассоциированная нейродегенерация; синдром Патау (трисомия 13); дефицит PBGD (острая перемежающаяся порфирия); дефицит РСС (пропионовая ацидемия); РСТ (поздняя кожная порфирия); PDM (миотоническая дистрофия типа 2); синдром Пендреда; периодическая болезнь (средиземноморская лихорадка, семейная); периодический перитонит (средиземноморская лихорадка, семейная); синдром периорифициального лентигиноза (синдром Пейтца-Егерса); нарушения периферических нервов (семейная дизавтономия); периферический нейрофиброматоз (нейрофиброматоз 1); перонеальная мышечная атрофия (болезнь Шарко-Мари-Тута); дефицит пероксисомальной аланин:глиоксилатаминотрансферазы (гипероксалурия, первичная); синдром Пейтца-Егерса; синдром Пфейффера; болезнь, обусловленная дефицитом фенилаланингидроксилазы (фенилкетонурия); фенилкетонурия; феохромоцитома (болезнь фон Гиппеля-Линдау); синдром Пьера Робена с фетальной хондродисплазией (синдром Вейссенбахера-Цвеймюллера); пигментный цирроз (гемахроматоз); PJS (синдром Пейтца-Егерса); PKAN (пантотенаткиназа-ассоциированная нейродегенерация); PKU (фенилкетонурия); плюмбопорфирия (обусловленная дефицитом ALA порфирия); РМА (болезнь Шарко-Мари-Тута); полиоссальная фиброзная дисплазия (синдром Мак-Кьюна-Олбрайта); полипоз-coli (семейный аденоматозный полипоз); полипоз, гамартоматозный кишечный (синдром Пейтца-Егерса); полипоз, кишечный, типа II (синдром Пейтца-Егерса); синдром полипов и пятен (синдром Пейтца-Егерса); дефицит порфобилиногенсинтазы (обусловленная дефицитом ALA порфирия); порфирия; нарушение порфиринового обмена (порфирия); РРН (первичная легочная гипертензия); дефицит РРОХ (вариегатная порфирия); синдром Прадера-Лабхарта-Вилли (синдром Прадера-Вилли); синдром Прадера-Вилли; пресенильная и сенильная формы деменции (болезнь Альцгеймера); первичный гемахроматоз (гемахроматоз); синдром первичной гиперурикемии (синдром Леша-Найхана); первичная легочная гипертензия; первичная сенильная дегенеративная деменция (болезнь Альцгеймера); прионовая болезнь; проколлаген типа EDS VII, мутантный (синдром Элерса-Данло, типа артрохалазии); прогерия (синдром прогении Гетчинсона-Гилфорда); прогерия-подобный синдром (синдром Коккейна); прогероидный нанизм (синдром Коккейна); прогрессирующая хорея, хроническая наследственная (Гентингтон) (болезнь Гентингтона); прогрессирующая мышечная атрофия (спинальная мышечная атрофия); прогрессирующий деформирующий несовершенный остеогенез с нормальными склерами (несовершенный остеогенез типа III); PROMM (миотоническая дистрофия типа 2); пропионовая академия; дефицит пропионил-СоА-карбоксилазы (пропионовая ацидемия); дефицит белка С; дефицит белка S; протопорфирия (эритропоэтическая протопорфирия); дефицит протопорфириногеноксидазы (пестрая порфирия); проксимальная миотоническая дистрофия (миотоническая дистрофия типа 2); проксимальная миотоническая миопатия (миотоническая дистрофия типа 2); псевдо-болезнь Гоше; псевдосиндром Ульриха-Тернера (синдром Нунан); псевдоксантома эластическая; психозиновый липидоз (болезнь Краббе); легочная артериальная гипертензия (первичная легочная гипертензия); легочная гипертензия (первичная легочная гипертензия); PWS (синдром Праддера-Вилли); РХЕ - псевдоксантома эластическая (псевдоксантома эластическая); Rb (ретинобластома); болезнь Реклингхаузена, поражения нервов (нейрофиброматоз 1); возвратный полисерозит (средиземноморская лихорадка, семейная); нарушения сетчатки; синдром пигментного ретинита-глухоты (синдром Ашера); ретинобластома; синдром Ретта; RFALS типа 3 (амиотрофический боковой склероз типа 2); синдром Рикера (миотоническая дистрофия типа 2); синдром Райли-Дэя (семейная дисавтономия); синдром Руси-Леви (болезнь Шарко-Мари-Тута); RSTS (синдром Рубинстайна-Тэйби); RTS (синдром Ретта) (синдром Рубинстайна-Тэйби); RTT (синдром Ретта); синдром Рубинстайна-Тэйби; синдром Зака-Барабаса (синдром Элерса-Данло, сосудистого типа); SADDAN; синдром семейной саркомы Ли-Фромени (синдром Ли-Фромени); синдром саркомы + рака молочной железы + лейкоза + карциномы коры надпочечников (SBLA) (синдром Ли-Фромени); SBLA-синдром (синдром Ли-Фромени); SBMA (Х-сцепленная спинально-бульбарная мышечная атрофия); SCD (серповидноклеточная анемия); шваннома, акустическая, двухсторонняя (нейрофиброматоз 2); SCIDX1 (Х-сцепленный серьезный комбинированный иммунодефицит); склероз туберозный (туберозный склероз); SDAT (болезнь Альцгеймера); SED врожденная (врожденная спондилоэпифизеальная дисплазия); SED Струдвика (спондилоэпифизеальная дисплазия, типа Струдвика); SEDc (спондилоэпифизеальная дисплазия врожденная); SEMD, типа Струдвика (спондилоэпифизеальная дисплазия, типа Струдвика); сенильная деменция (болезнь Альцгеймера типа 2); серьезная ахондроплазия с задержкой развития и черным акантозом (SADDAN); синдром Шпринтцена (синдром делеции 22q11.2); серповидноклеточная анемия; синдром нарушения развития скелета-кожи-головного мозга (SADDAN); нарушения кожной пигментации; SMA (спинальная мышечная атрофия); SMED, типа Струдвика (спондилоэпиметафизеальная дисплазия, типа Струдвика); SMED, типа I (спондилоэпиметафизеальная дисплазия, типа Струдвика); синдром Смита-Лемли-Опица; южно-африканская генетическая порфирия (пестрая порфирия); спастический паралич, начинающийся в детском возрасте, восходящий (начинающийся в детском возрасте восходящий наследственный спастический паралич); нарушения речи и коммуникации; сфинголипидоз типа Тэя-Сакса (болезнь Тэя-Сакса); спинально-бульбарная мышечная атрофия; спинальная мышечная атрофия; спинальная мышечная атрофия, дистального типа V (дистальная спинальная мышечная атрофия типа V); спинальная мышечная атрофия, дистальная, преимущественно верхних конечностей (дистальная спинальная мышечная атрофия типа V); спиноцеребральная атаксия; спондилоэпиметафизеальная дисплазия, типа Струдвика; спондилоэпифизеальная дисплазия врожденная; спондилоэпифизеальная дисплазия (коллагенопатия, типов II и XI); спондилоэпиметафизеальная дисплазия врожденная, типа Струдвика (спондилометафизеальная дисплазия, типа Струдвика); спондилометафизеальная дисплазия (SMD) (спондилоэпиметафизеальная дисплазия, типа Струдвика); спондилометафизеальная дисплазия, типа Струдвика (спондилоэпиметафизеальная дисплазия, типа Струдвика); губчатая дегенерация центральной нервной системы (болезнь Канавана); губчатая дегенерация головного мозга (болезнь Канавана); губчатая дегенерация белого вещества у детей (болезнь Канавана); спорадическая первичная легочная гипертензия (первичная легочная гипертензия); SSB-синдром (SADDAN); синдром курчавых волос (синдром Менкеса); болезнь Штейнерта (миотоническая дистрофия); синдром миотонической дистрофии Штейнерта (миотоническая дистрофия); синдром Стиклера; удар (CADASIL); синдром Струдвика (спондилоэпиметафизеальная дисплазия, типа Струдвика); подострая нейронопатическая болезнь Гоше (болезнь Гоше типа 3); шведская генетическая порфирия (острая перемежающаяся порфирия); шведская порфирия (острая перемежающаяся порфирия); хрящевая дисплазия типа швейцарского сыра (дисплазия Книста); болезнь Тэя-Сакса; TD - танатофорная карликовость (танатофорная дисплазия); TD с прямыми трубчатыми костями и черепом в виде трилистника (танатофорная дисплазия типа 2); телеангиэктазия, мозжечковая и кожно-глазная (атаксия-телеангиэктазия); синдром тестикулярной феминизации (синдром андрогенной нечувствительности); дефицит тетрагидробиоптерина; TFM - синдром тестикулярной феминизации (синдром андрогенной нечувствительности); талассемия, промежуточная форма (бета-талассемия); большая талассемия (бета-талассемия); танатофорная дисплазия; тиамин-чувствительная мегалобластная анемия с сахарным диабетом и сенсориневральной глухотой; тромбофилия, обусловленная дефицитом кофактора активированного белка С, типа Лейдена (тромбофилия, обусловленная фактором V Лейдена); болезнь щитовидной железы; томакулярная невропатия (наследственная невропатия с предрасположенностью к параличам от сдавливания); полный дефицит HPRT (синдром Леша-Найхана); полный дефицит гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (синдром Леша-Найхана); синдром Туретта; трансмиссивные деменции (прионовая болезнь); трансмиссивные спонгиоформные энцефалопатии (прионовая болезнь); синдром Триэчера Коллинза; аномальная ломкость костей (несовершенный остеогенез типа I); синдром тройной Х-хромосомы; синдром трипло-Х (синдром тройной Х-хромосомы); трисомия 21 (синдром Дауна); трисомия X (синдром тройной Х-хромосомы); синдром Труазье-Ано-Шоффара (гемахроматоз); TS (синдром Тернера); TSD (болезнь Тэя-Сакса); TSEs (прионовая болезнь); склероз туберозный (туберозный склероз); туберозный склероз; синдром Тернера; синдром Тернера у женщин с Х-хромосомой (синдром Нунан); фенотип синдрома Тернера, нормальный кариотип (синдром Нунан); Тернеровский синдром (синдром Тернера); подобный синдрому Тернера синдром (синдром Нунан); тип 2 болезни Гоше (болезнь Гоше типа 2); тип 3 болезни Гоше (болезнь Гоше типа 3); болезнь, обусловленная дефицитом UDP-галактозо-4-эпимеразы (галактоземия); болезнь, обусловленная дефицитом UDP-глюкозо-4-эпимеразы (галактоземия); болезнь, обусловленная дефицитом UDP-глюкозо/гексозо-1-фосфат-уридилтрансферазы (галактоземия); синдром Ульриха-Нунан (синдром Нунан); синдром Ульриха-Тернера (синдром Тернера); недифференцированная глухота (несиндромная глухота); дефицит UPS (острая перемежающаяся порфирия); рак мочевого пузыря (опухоль мочевого пузыря); дефицит UROD (поздняя кожная порфирия); дефицит уропорфириногендекарбоксилазы (поздняя кожная порфирия); дефицит уропорфириногенсинтазы (острая перемежающаяся порфирия); дефицит UROS (врожденная эритропоэтическая порфирия); синдром Ашера; дефицит UTP + гексозо-1-фосфат-уридилтрансферазы (галактоземия); синдром Ван-Богарта-Бертрана (болезнь Канавана); синдром Ван-дер-Хуве (несовершенный остеогенез типа I); вариегатная порфирия; велокардиофациальный синдром (синдром делеции 22q11.2); синдром VHL (болезнь фон Гиппеля-Линдау); ухудшение зрения и слепота (синдром Альстрема); болезнь фон Богарта-Бертрана (болезнь Канавана); болезнь фон Гиппеля-Линдау; болезнь фон Реклингаузена-Аппельбаума (гемахроматоз); болезнь фон Реклингаузена (нейрофиброматоз 1); VP (вариегатная порфирия); болезнь Фролика (несовершенный остеогенез); синдром Варденбурга; синдром Варбурга-Сйо-Фледелиуса (синдром Микро); WD (болезнь Вильсона); синдром Вейссенбахера-Цвеймюллера; болезнь Вильсона; Вильсоновская болезнь (болезнь Вильсона); синдром Вольфа-Хиршхорна; периодическая болезнь Вольффа (средиземноморская лихорадка, семейный); WZS (синдром Вейссенбахера-Цвеймюллера); ксеродерма пигментная; Х-сцепленная умственная отсталость и макроорхидизм (синдром хрупкой Х-хромосомы); X-сцепленная первичная гиперурикемия (синдром Леша-Найхана); Х-сцепленный серьезный комбинированный иммунодефицит; Х-сцепленная сидеробластная анемия; Х-сцепленная спинально-бульбарная мышечная атрофия (болезнь Кеннеди); Х-сцепленная ацидурия, обусловленная недостатком фермента (синдром Леша-Найхана); X-SCID (Х-сцепленный серьезный комбинированный иммунодефицит); XLSA (Х-сцепленная сидеробластная анемия); XSCID (X-сцепленный серьезный комбинированный иммунодефицит); XXX синдром (синдром трипло-Х); ХХХХ-синдром (48, ХХХХ); ХХХХХ-синдром (49, ХХХХХ); XXY-синдром (синдром Клайнфелтера); XXY-трисомия (синдром Клайнфелтера); XYY-кариотип (47,XYY-синдром); XYY-синдром (47,XYY-синдром) и YY-синдром (47,XYY- синдром).

В другом предпочтительном объекте изобретения модифицированную РНК, указанную в настоящем описании, или композицию, содержащую несколько модифицированных РНК, указанных в настоящем описании, можно применять для приготовления фармацевтической композиции, прежде всего для указанных выше целей, предпочтительно для применения в генной терапии или генетической вакцинации для лечения указанных выше заболеваний.

Фармацевтическую композицию можно применять также в генной терапии или генетической вакцинации прежде всего для лечения заболевания или нарушения, предпочтительно указанного в настоящем описании.

Следующим объектом настоящего изобретения являются также наборы, прежде всего наборы компонентов. Такие наборы, прежде всего наборы компонентов, как правило, содержат в качестве компонентов индивидуально или в комбинации с другими компонентами, указанными в настоящем описании, по меньшей мере одну модифицированную РНК, указанную в настоящем описании, фармацевтическую композицию или вакцину, которая содержит модифицированную РНК. По меньшей мере одну модифицированную РНК, указанную в настоящем описании, необязательно объединяют с дополнительными указанными в настоящем описании компонентами, при этом по меньшей мере одна модифицированная РНК, предлагаемая в изобретении, присутствует отдельно (первая часть набора) от по меньшей мере одной другой части набора, содержащей один или несколько других компонентов. Фармацевтическая композиция может, например, находиться в одной или в различных частях набора. В качестве репрезентативного примера, по меньшей мере одна часть набора может содержать по меньшей мере одну модифицированную РНК, указанную в настоящем описании, а по меньшей мере одна дополнительная часть набора - по меньшей мере один другой компонент, указанный в настоящем описании, например по меньшей мере одна другая часть набора может содержать по меньшей мере одну фармацевтическую композицию или ее часть, например, по меньшей мере одна часть набор может содержать модифицированную РНК, указанную в настоящем описании, по меньшей мере одну дополнительную часть по меньшей мере одного другого компонента набора, указанного в настоящем описании, по меньшей мере одну дополнительную часть по меньшей мере одного компонента фармацевтической композиции набора или фармацевтическую композицию в целом, и по меньшей мере одну дополнительную часть набора, например, по меньшей мере один фармацевтический носитель или наполнитель и т.д. В том случае, если набор или набор частей содержит несколько молекул модифицированной РНК, один компонент набора может содержать только одну, несколько или все молекулы модифицированной РНК, входящие в набор. В альтернативном варианте осуществления изобретения все/каждая модифицированная(ые) РНК могут(жет) входить в отличный от других/отдельный компонент набора, в результате чего каждый компонент образует часть набора. Кроме того, более одной модифицированной РНК может содержаться в первом компоненте в качестве части набора, а один или несколько других (второй, третий и т.д.) компонентов (представляющий собой одну или несколько других частей набора) может(гут) либо содержать одну или более одной модифицированной РНК, которые могут быть идентичными или частично идентичными, либо компонент, отличный от первого компонента. Набор или набор частей может содержать также технические инструкции с информацией о введении и дозировке модифицированной РНК, фармацевтической композиции или любого(ой) из ее компонентов или частей, например, если набор получают в виде набора частей.

Предпочтительно набор, предлагаемый в изобретении, содержит модифицированную РНК, предпочтительно в лиофилизированной форме, и приемлемый вектор для восстановления модифицированной РНК. В предпочтительном варианте осуществления изобретения модифицированная РНК находится в контейнере, предпочтительно в контейнере, в котором модифицированную РНК ресолюбилизируют. Предпочтительно контейнер может быть соединен с безыгольным устройством для инъекции, например, для заполнения одноразового шприца безыгольного устройства для инъекции.

Кроме того, в изобретении предложен способ повышения (локализованной) экспрессии кодируемых РНК пептидов или белков в дерме или мышце (млекопитающего), заключающийся в том, что вводят модифицированную РНК, указанную в настоящем описании, с использованием струйной инъекции.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения или предупреждения заболевания или нарушения, заключающийся в том, что вводят с использованием струйной инъекции модифицированную РНК, указанную в настоящем описании, индивидууму, который нуждается в этом, прежде всего больному человеку.

Способ лечения или предупреждения нарушения, предлагаемого в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой способ вакцинации и/или способ генной терапии, описанный выше.

Примеры

Приведенные ниже примеры служат для дополнительной иллюстрации изобретения. Эти примеры не направлены на ограничение сущности и объема изобретения.

1. Экспрессия люциферазы in vivo

Получение ДНК-матриц

Конструировали вектор для in vitro транскрипции, содержащий Т7-промотор, за которым располагались последовательность с повышенным содержанием GC, кодирующая люциферазу Photinus pyralis (PpLuc(GC)), мутантная 3'UTR альфа-глобина (muag), А64 поли(А)-последовательность, поли(С)- последовательность (С30) и последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» (гистон-SL):

SEQ ID NO: 46 (фиг. 4): PpLuc(GC) - muag - А64 - С30 - гистонSL (R1265)

Для сравнения конструировали вектор, содержащий Т7-промотор, за которым располагались последовательность дикого типа, кодирующая люциферазу Photinus pyralis (PpLuc(wt)), и A30 поли(А)-последовательность: SEQ ID NO: 47 (фиг. 5): PpLuc(wt) - А30 (R2652).

Для оценки действия применяемых модификаций конструировали следующие векторы:

SEQ ID NO: 48 (фиг. 6): PpLuc(wt) - А64 (R3454),

SEQ ID NO: 49 (фиг. 7): PpLuc(GC) - A64 - C30 - гистонSL (R2462),

SEQ ID NO: 50 (фиг. 8): PpLuc(GC) - muag - A64 - C30 (R1256),

SEQ ID NO: 51 (фиг. 9): PpLuc(nat) - muag - A64 - C30 - гистонSL (R2393).

Для дополнительных экспериментов конструировали указанный ниже вектор, кодирующий белок G вируса бешенства (RAV-G):

Аналогично вектору PpLuc(GC) - muag - А64 - С30 - гистонSL (R1265), который кодирует люциферазу, вектор RAV-G(GC) - muag - A64 - C30 - гистонSL (R2403) содержал Т7-промотор, за которым располагались последовательность с повышенным содержанием GC, кодирующая белок G вируса бешенства, мутантная 3'UTR альфа-глобина (muag), А64 поли(А)-последовательность, поли(С)-последовательность (С30) и последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» (гистон-SL):

SEQ ID NO: 52 (фиг. 10): RAV-G(GC) - muag - A64 - C30 - гистонSL (R2403).

Для дополнительных экспериментов конструировали указанные ниже векторы, кодирующие мышиный ЕРО:

Конструировали вектор для in vitro транскрипции, содержащий Т7-промотор, за которым располагались 5'-TOP-UTR-последовательность HSD17B4, последовательность с повышенным содержанием GC, кодирующая ЕРО (EPO(GC)), 3'UTR-последовательность альбумина (альбумин7), А64 поли(А)-последовательность, поли(С)-последовательность (С30) и последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля» (гистон-SL): SEQ ID NO: 54 (фиг. 12): HSD17B4 - EPO(GC) - альбумин7 - A64 - C30 - гистонSL (R3135).

Для сравнения конструировали вектор, содержащий Т7-промотор, за которым располагались последовательность дикого типа, кодирующая ЕРО (EPO(wt)) и А30 поли(А)-последовательность:

SEQ ID NO: 53 (Fig. 11): EPO(wt) - A30 (R3513).

In vitro транскрипция

ДНК-матрицы, описанные в примере 1, линеаризовали и транскрибировали in vitro с использованием Т7-полимеразы. Затем ДНК-матрицу расщепляли путем обработки ДНКазой. мРНК-транскрипты, содержащие 5'-кэп-структуру (mКэп), получали путем добавления избытка N7-метилгуанозин-5'-трифосфат-5'-гуанозина в реакционную смесь для транскрипции. Полученную таким образом мРНК очищали и ресуспендировали в воде.

Экспрессия люциферазы in vivo:

Для оценки экспрессии люциферазы in vivo морским свинкам инъецировали внутрикожно в указанных количествах оголенную мРНК с помощью струйной инъекции.

Через 24 ч животных умерщвляли и получали образцы (ухо, кожа из спины или мышца), замораживали при -78°С и лизировали в течение 3 мин при полной скорости в устройстве для лизиса тканей (фирма Qiagen, Гильден, Германия). Затем добавляли 600 мкл лизирующего буфера (25 мМ Трис, pH 7,5 (HCl), 2 мМ ЭДТК, 10% глицерина, 1% Тритон Х-100, 2 мМ ДТТ, 1 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид)) и полученные растворы подвергали дополнительной 6-минутной обработке при полной скорости в устройстве для лизиса тканей. После центрифугирования в течение 10 мин при 13500 об/мин при 4°С супернатанты смешивали с содержащим люциферин буфером (25 мМ глицилглицин, 15 мМ MgSO₄, 5 мМ АТФ, 62,5 мкМ люциферин) и определяли люминисценцию с помощью люминометра (Lumat LB 9507 (фирма Berthold Technologies, Бад-Вильдбад, Германия)).

Результаты:

В качестве первого результата установлено, что у морских свинок экспрессия люциферазы, кодируемой модифицированной мРНК, значительно повышалась при применении струйной инъекции по сравнению с общепринятой внутрикожной инъекцией с использованием иглы (см. фиг. 1).

Кроме того, неожиданно было установлено, что насыщающий уровень экспрессии можно повышать путем применения струйной инъекции по сравнению с общепринятым введением мРНК с помощью шприца с иглой (см. фиг. 2).

Также неожиданно было установлено, что экспрессия люциферазы с модифицированной мРНК (PpLuc(GC)) существенно повышалась при применении струйной инъекции по сравнению с экспрессией люциферазы с немодифицированной референс-мРНК (PpLuc(wt); см. фиг. 3).

Таким образом, модификация РНК и введение указанной модифицированной РНК с помощью струйной инъекции действуют синергетически в отношении повышения экспрессии белка, кодируемого РНК (см. таблицу 1).

В дополнительных экспериментах продемонстрировано, что дополнительное повышение экспрессии, достигаемое с помощью струйной инъекции с использованием модифицированной РНК, предлагаемой в изобретении (см. таблицу 2, ниже, например, R1265, R2462, R1256, R2393), по сравнению с использованием немодифицированной референс-РНК (см. таблицу 2; R2652), достигали при применении различных модифицированных РНК, каждая из которых содержала одну или несколько различных модификаций. В таблице 2 представлены данные о кратности повышения экспрессии белка, достигаемого путем введения данной РНК (например, R1265), стандартизованные относительно экспрессии белка, которая достигалась при введении соответствующей РНК с помощью общепринятой внутрикожной инъекции с использованием иглы. Например, экспрессия модифицированной РНК R1265 повышалась при применении струйной инъекции в 8,23 раза (по сравнению с экспрессией, полученной после инъекции с помощью иглы), в то время как экспрессия немодифицированной референс-РНК (R2652) повышалась лишь в 2,00 раза. В этом примере повышение экспрессии за счет модификации РНК, указанной в настоящем описании, было 4-кратным по сравнению с немодифицированной референс-РНК.

2. Индукция гуморального иммунного ответа с помощью мРНК-вакцины против RAV-G у людей

Иммунизация

Предварительные результаты, полученные в продолжающемся клиническом испытании (фаза I), продемонстрировали безопасность, а также эффективность вакцины, предлагаемой в изобретении. В клиническом опыте добровольцам вводили внутрикожно с помощью струйной инъекции, применяя устройство Tropis, в дни 0, 7 и 28 вакцину R2403, содержащую мРНК RAV-G. мРНК приготавливали согласно методу, описанному в примере 1, т.е. мРНК в комплексе с протамином в соотношении 2:1 (мас./мас.) смешивали с равным количеством свободной мРНК. В каждый из трех дней вакцинации вводили по 80 мкг мРНК.

Для оценки профиля безопасности вакцины, предлагаемой в изобретении, осуществляли мониторинг индивидуумов после введения (жизненно важные признаки, оценки переносимости в области вакцинации, гематологические анализы после второй и третьей инъекции). Предварительные результаты, полученные в продолжающемся клиническом испытании, позволили предположить, что иммунизация мРНК, предлагаемой в изобретении, хорошо переносилась людьми.

Эффективность иммунизации анализировали путем определения титров вирус-нейтрализующих антител (VNT) в сыворотке шести индивидуумов. Для этой цели собирали образцы крови в день 0 в качестве исходного уровня и в день 42. Сыворотку анализировали в отношении вирус-нейтрализующих антител на основе реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной ниже.

Оценка нейтрализации вируса

Определение гуморального иммунного ответа в виде вирус-нейтрализующих антител (специфический В-клеточный иммунный ответ) осуществляли с использованием анализа нейтрализации вируса. Результат указанного анализа обозначали как титр вирус-нейтрализующих антител (VNT). Согласно стандартам ВОЗ титр антитела рассматривается в качестве обеспечивающего защитное действие, если соответствующий VNT составлял по меньшей мере 0,5 МЕ/мл. Сыворотку, полученную согласно описанному выше методу, применяли для осуществления реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), используя клеточную культуру, адаптированную к применяемому для контрольного заражения штамму (CVS) вируса бешенства, рекомендованного OIE (Международное бюро по борьбе с эпизоотиями) (Всемирная организация по охране здоровья животных), и впервые описанного у Cliquet F., Aubert М. и Sagne L., J. Immunol. Methods, 212, 1998, cc. 79-87. В целом, метод состоял в следующем: инактивированную тепловой обработкой сыворотку следует тестировать в четырех повторностях в виде серийных двукратных разведений в отношении способности нейтрализовать 100 TCID₅₀ (дозы, инфицирующие 50% культуры ткани) CVS в объеме 50 мкл. Для этого разведения сыворотки инкубировали с вирусом в течение 1 ч при 37°С (влажная камера с 5% СО₂) и затем добавляли трипсинизированные ВНК-21-клетки (4×10⁵ клеток/мл; 50 мкл на лунку). Зараженную клеточную культуру инкубировали в течение 48 ч во влажной камере при 37°С и 5% СО₂. Заражение клеток анализировали после фиксации клеток с использованием 80% ацетона при комнатной температуре, используя конъюгат ФИТЦ-антитело к вирусу бешенства. Планшеты дважды промывали в ЗФР и избыток ЗФР удаляли. Клеточные культуры классифицировали как позитивные или негативные в отношении присутствия вируса бешенства. Наличие в обработанных сывороткой лунках клеток, классифицированных как негативные, свидетельствовало о нейтрализации вируса бешенства. В каждый FAVN-тест включали стандартную согласно ВОЗ или OIE сыворотку (сыворотка, представляющая собой положительный контроль), которая служила в качестве контроля для стандартизации анализа. Нейтрализующую активность тестируемой сыворотки рассчитывали относительно стандартной сыворотки, предоставленной ВОЗ, и выражали в виде международных единиц/мл (МЕ/мл). Результаты обобщены в таблице 3.

Результаты:

У пяти из шести индивидуумов (индивидуумы №1, 2, 4, 5 и 6) титр вирус-нейтрализующих антител, составляющий по меньшей мере 0,5 МЕ/мл, обнаружен в день 42. Согласно стандарту ВОЗ у указанных индивидуумов достигнут защитный гуморальный иммунный ответ, демонстрирующий эффективность иммунизации мРНК, предлагаемой в изобретении.

Заключение:

Согласно предварительным результатам, полученным в продолжающемся клиническом испытании, применение мРНК, предлагаемой в изобретении, для иммунизации людей, характеризуется благоприятным профилем безопасности. Эффективность указанного подхода продемонстрирована с помощью указанных предварительных опытов, согласно которым защитный гуморальный иммунный ответ (VNT≥0,5 МЕ/мл) достигался в день 42 у пяти из шести исследуемых индивидуумов.

3. Экспрессия ЕРО in vivo

Для определения экспрессии эритропоэтина in vivo морским свинкам вводили внутрикожно оголенную мРНК либо посредством общепринятой инъекции с использованием иглы, либо посредством струйной инъекции (3 животных на групп, каждое подвергали 3 инъекциям по 80 мкг РНК на область инъекции). Через 24 ч получали образцы крови из подкожной вены лапы. Уровни эритропоэтина в сыворотке определяли с помощью ELISA (набор для оценки мышиного эритропоэтина Quantikine ELISA, фирма R&D Systems).

Результаты: Экспрессия ЕРО, кодируемого модифицированной мРНК (HSD17B4-EPO(GC)-альбумин7-A64-C30-гистонSL (R3135)), значительно повышалась у морских свинок при применении струйной инъекции по сравнению с общепринятой внутрикожной инъекцией с использованием иглы (см. фиг. 13).

При создании неожиданно было установлено, что экспрессия ЕРО с модифицированной мРНК (HSB17B4-ЕРО(ОС)-альбумин7-А64-С30-гистонSL (R3135)) существенно повышалась при применении струйной инъекции по сравнению с экспрессией ЕРО с немодифицированной референс-мРНК (EPO(wt)-А30 (R3513)) (см. фиг. 13).

4. Сравнение воздействия общепринятой и струйной инъекции вакцины на основе мРНК RSV-F на индукцию гуморального иммунного ответа у морских свинок

Получение конструкций ДНК и мРНК:

Для применения в настоящих примерах ДНК-последовательности, кодирующие белок RSV-F штамма RSV-«длинный» (АТСС VR-26), получали и затем использовали в реакциях in vitro транскрипции.

Слитый белок F штамма RSV АТСС VR-26 «длинный» имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63:

Сначала получали ДНК-последовательности, кодирующие указанные выше мРНК. ДНК-конструкцию, кодирующую РНК-последовательность R2510 (SEQ ID NO: 64), получали путем интродукции 5'-TOP-UTR, происходящей из рибосомного белка 32L, имеющего SEQ ID NO: 55, модифицируя кодирующую последовательность дикого типа путем интродукции последовательности с оптимизированным содержанием GC для стабилизации, с последующей интродукцией стабилизирующей последовательности, происходящей из альбумин-3'UTR (альбумин7, представленный в SEQ ID NO: 58), сегмента, состоящего из 64 аденозинов (поли(А)-последовательность), сегмента, состоящего из 30 цитозинов (поли(С)-последовательность), и гистоновой структуры типа «стебель-петля», представленной в SEQ ID NO: 44. На фиг. 14 представлена последовательность соответствующей мРНК (R2510; SEQ ID NO: 64).

In vitro транскрипция:

Соответствующие ДНК-плазмиды, полученные согласно разделу 1, транскрибировали in vitro с использованием Т7-полимеразы в присутствии аналога кэпа (m⁷GpppG). Затем мРНК очищали с помощью PureMessenger^® (фирма CureVac, Тюбинген, Германия; WO 2008/077592 А1).

Реагенты:

Комплексообразующий реагент: протамин

Получение вакцины:

Получали комплекс мРНК с протамином путем добавления протамина к мРНК в соотношении (1:2) (мас./мас.) (адъювантный компонент). После инкубации в течение 10 мин добавляли в таком же количестве свободную мРНК, применяемую в качестве кодирующей антиген РНК.

Вакцина на основе RSV-F «длинного» (R2510): содержит адъювантный компонент, который состоит из мРНК, кодирующей F-белок RSV «длинного» штамма (R2510), представленный в SEQ ID NO: 63, которая образует комплекс с протамином, в соотношении 2:1 (мас./мас.), и кодирующую антиген свободную мРНК, которая кодирует F-белок «длинного» штамма RSV (R2510), SEQ ID NO. 63 (соотношение 1:1; входящая в комплекс РНК:свободная РНК).

Иммунизация

В день 0 самкам морских свинок (n=8/группу) вводили внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе RSV-F, описанную выше (80 мкг R2510/мышь/в день вакцинации) либо из расчета 1×100 мкг с помощью общепринятой инъекции с использованием иглы (i.d.), либо 4×25 мкл с помощью инъекции с использованием иглы (i.d.), либо 1×100 мкл с помощью струйной инъекции (i.d.), как представлено в таблице 4. Контрольной группе (n=2) с помощью иглы инъецировали внутримышечно (i.m.) 20 мкг инактивированного «длинного» штамма RSV (2×50 мкл). Антиген инактивированного респираторно-синтициального вируса («Respiratory Syncytial Virus Antigen») (инактивированный штамм RSV «длинный») покупали в INSTITUT VIRION/SERION GmbH-SERION IMMUNDIAGNOSTICA GmbH. Инактивированный вирус разводили в стерильном ЗФР, так, чтобы конечная концентрация составляла 0,2 мкг/мкл. Всех животных подвергали бустерным инъекциям в дни 14 и 28. Собирали образцы крови в день -3 (за три дня до первой вакцинации) и в дни 7, 21 и 42 для определения титров антител к RSV F.

Определение антител к F-белку RSV с помощью ELISA

Планшеты для ELISA сенсибилизировали инактивированным штаммом RSV-«длинный» (производства института Virion/Serion, конечная концентрация 5 мкг/мл) (фирма Sino Biological Inc.). Сенсибилизированные планшеты инкубировали с сывороткой морских свинок с использованием указанных разведений (стадии 5-кратного разведения от 1:50 до 1:3906250) и определяли связывание специфических антител с F-белком с использованием биотинилированных изотипспецифических антител к IgG1 и IgG2a морских свинок в комбинации со стрептавидином-HRP (пероксидаза из хрена) с применением в качестве субстрата диаммониевой соли 2,2'-азидобис[3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты] (ABTS).

Титры RSV-нейтрализующих антител (VNT)

Анализировали сыворотку путем определения титров вирус-нейтрализующих антител (VNT). В целом, метод состоял в следующем: образцы сыворотки разводили в соотношении 1:10 минимальной эссенциальной средой Игла (ЕМЕМ), инактивировали нагреванием и дополнительно серийно разводили в соотношении 1:4. Разведенные образцы сыворотки инкубировали с RSV (25-50 БОЕ) в течение 1 ч при комнатной температуре и инокулировали в двух повторностях монослои конфлюэнтных HEp-2-клеток в 24-луночных планшетах. После инкубации в течение 1 ч при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО₂ на лунки наслаивали среду, содержащую 0,75% метилцеллюлозы. После инкубации в течение 4 дней дополнительный слой удаляли и клетки фиксировали с использования окрашивания с помощью 0,1% кристаллического фиолетового в течение 1 ч и затем отмывали и сушили на воздухе. Соответствующие величины, обратные титрам нейтрализующих антител, определяли в конечной точке, соответствующей 60%-ному снижению количества вирусов.

Результаты

Как продемонстрировано на фиг. 15, мРНК-вакцина, содержащая RSV-F, индуцировала образование антител к F-белку подкласса IgG1 (А) и подкласса IgG2a (Б) уже в день 21 (одна неделя после первой бустер-вакцинации в день 14), когда вакцину вводили с помощью струйной инъекции (1×100 мкл). Сопоставимые титры антител достигались только в день 42 (две недели после второй бустер- вакцинации в день 28), когда вакцину вводили путем общепринятой инъекции с помощью иглы (4×25 мкл). Таким образом, мРНК-вакцина, содержащая RSV-F, введенная с помощью струйной инъекции, индуцировала гуморальный иммунный ответ против F-белка RSV, отличающийся более быстрой кинетикой по сравнению с введением с использованием общепринятой инъекции с помощью иглы.

Как продемонстрировано на фиг. 16, выраженные титры нейтрализующих RSV антител удалось обнаружить в день 42 только тогда, когда вакцину вводили с помощью струйной инъекция (100 мкл). Таким образом, вакцинация с помощью струйной инъекции приводила к более быстрому началу иммунных ответов по сравнению с общепринятой инъекцией с помощью иглы.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> КуреВак ГмбХ

<120> Способ повышения экспрессии кодируемых РНК белков

<130> CU01P139WO1

<160> 64

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ic)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(8)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(14)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<400> 1

ngnnnnnnun nnnncn 16

<210> 2

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIc)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(6)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(13)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(19)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(24)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 2

nnnnnngnnn nnnunnnnnc nnnnnn 26

<210> 3

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Id)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(8)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(14)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<400> 3

ncnnnnnnun nnnngn 16

<210> 4

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IId)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(6)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(13)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(19)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(26)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 4

nnnnnncnnn nnnunnnnng nnnnnn 26

<210> 5

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ie)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(8)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(14)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<400> 5

dgnnnnnnun nnnnch 16

<210> 6

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIe)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(5)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(13)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(19)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(26)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 6

nnnnndgnnn nnnunnnnnc hnnnnn 26

<210> 7

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (If)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(8)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<400> 7

ngnbyynnun vndncn 16

<210> 8

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIf)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(6)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(26)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 8

nnnnnngnby ynnunvndnc nnnnnn 26

<210> 9

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ig)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<400> 9

nghyyydnuh abrdcn 16

<210> 10

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIg)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(6)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(23)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 10

nnhnnnghyy ydnuhabrdc nnnnnh 26

<210> 11

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ih)

<400> 11

dghycudyuh asrrcc 16

<210> 12

<211> 26

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIh)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 12

nhaahdghyc udyuhasrrc cvhbnh 26

<210> 13

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность according to формулы (Ic)

<400> 13

vgyyyyhhth rvvrcb 16

<210> 14

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ic)

<400> 14

sgyyyttytm arrrcs 16

<210> 15

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ic)

<400> 15

sgyycttttm agrrcs 16

<210> 16

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ie)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(5)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(8)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(14)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<400> 16

dgnnnbnnth vnnnch 16

<210> 17

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ie)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(5)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 17

rgnnnyhbth rdnncy 16

<210> 18

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ie)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<400> 18

rgndbyhyth rdhncy 16

<210> 19

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (If)

<400> 19

vgyyytyhth rvrrcb 16

<210> 20

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (If)

<400> 20

sgyycttytm agrrcs 16

<210> 21

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (If)

<400> 21

sgyycttttm agrrcs 16

<210> 22

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ig)

<400> 22

ggyycttyth agrrcc 16

<210> 23

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ig)

<400> 23

ggcycttytm agrgcc 16

<210> 24

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ig)

<400> 24

ggctcttttm agrgcc 16

<210> 25

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ih)

<400> 25

dghyctdyth asrrcc 16

<210> 26

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ih)

<400> 26

ggcyctttth agrgcc 16

<210> 27

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (Ih)

<400> 27

ggcycttttm agrgcc 16

<210> 28

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIc)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 28

hhhhvvgyyy yhhthrvvrc bvhhnn 26

<210> 29

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIc)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 29

mhmhmsgyyy ttytmarrrc smchhh 26

<210> 30

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIc)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 30

mmmmmsgyyc ttttmagrrc sachmh 26

<210> 31

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIe)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(5)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(19)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(26)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 31

nnnnndgnnn bnnthvnnnc hnhnnn 26

<210> 32

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIe)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 32

nnhhnrgnnn yhbthrdnnc ydhhnn 26

<210> 33

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIe)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 33

nhhhvrgndb yhythrdhnc yrhhhh 26

<210> 34

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIf)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<400> 34

hhmhmvgyyy tyhthrvrrc bvmhhn 26

<210> 35

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIf)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 35

mmmmmsgyyc ttytmagrrc smchhh 26

<210> 36

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIf)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 36

mmmmmsgyyc ttttmagrrc sachmh 26

<210> 37

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIg)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 37

hhmamggyyc ttythagrrc cvhnnm 26

<210> 38

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIg)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 38

hhaamggcyc ttytmagrgc cvchhm 26

<210> 39

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIg)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 39

mmaamggctc ttttmagrgc cmcymm 26

<210> 40

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIh)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 40

nhaahdghyc tdythasrrc cvhbnh 26

<210> 41

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIh)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n обозначает a, u, t, g и c или их нуклеотидный аналог; может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 41

hhaamggcyc tttthagrgc cvmynm 26

<210> 42

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность формулы (IIh)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(26)

<223> может присутствовать или отсутствовать

<400> 42

hmaaaggcyc ttttmagrgc crmyhm 26

<210> 43

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Специфическая последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля»

<400> 43

caaaggctct tttcagagcc acca 24

<210> 44

<211> 24

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Специфическая последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля»

<400> 44

caaaggcucu uuucagagcc acca 24

<210> 45

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мутантная UTR (альфа)-глобина

<400> 45

gcccgatggg cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accg 44

<210> 46

<211> 1870

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> мРНК-последовательность ppluc(gc) - muag - a64 - c30 - гистонSL

<400> 46

gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60

cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120

ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180

guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240

ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300

ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360

gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420

gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480

gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540

cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600

caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660

cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720

cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780

ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840

gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900

cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960

gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020

cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080

ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140

ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200

gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260

cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320

cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380

gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440

cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500

gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560

cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620

ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680

agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740

auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc 1860

caccagaauu 1870

<210> 47

<211> 1712

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> PpLuc(wt) - A30

<400> 47

gggagaaagc uuaccaugga agacgccaaa aacauaaaga aaggcccggc gccauucuau 60

ccuuuagagg auggaaccgc uggagagcaa cugcauaagg cuaugaagag auacgcccug 120

guuccuggaa caauugcuuu uacagaugca cauaucgagg ugaacaucac guacgcggaa 180

uacuucgaaa uguccguucg guuggcagaa gcuaugaaac gauaugggcu gaauacaaau 240

cacagaaucg ucguaugcag ugaaaacucu cuucaauucu uuaugccggu guugggcgcg 300

uuauuuaucg gaguugcagu ugcgcccgcg aacgacauuu auaaugaacg ugaauugcuc 360

aacaguauga acauuucgca gccuaccgua guguuuguuu ccaaaaaggg guugcaaaaa 420

auuuugaacg ugcaaaaaaa auuaccaaua auccagaaaa uuauuaucau ggauucuaaa 480

acggauuacc agggauuuca gucgauguac acguucguca caucucaucu accucccggu 540

uuuaaugaau acgauuuugu accagagucc uuugaucgug acaaaacaau ugcacugaua 600

augaauagcu cuggaucuac uggguuaccu aagggugugg cccuuccgca uagaacugcc 660

ugcgucagau ucucgcaugc cagagauccu auuuuuggca aucaaaucau uccggauacu 720

gcgauuuuaa guguuguucc auuccaucac gguuuuggaa uguuuacuac acucggauau 780

uugauaugug gauuucgagu cgucuuaaug uauagauuug aagaagagcu guuuuuacga 840

ucccuucagg auuacaaaau ucaaagugcg uugcuaguac caacccuauu uucauucuuc 900

gccaaaagca cucugauuga caaauacgau uuaucuaauu uacacgaaau ugcuucuggg 960

ggcgcaccuc uuucgaaaga agucggggaa gcgguugcaa aacgcuucca ucuuccaggg 1020

auacgacaag gauaugggcu cacugagacu acaucagcua uucugauuac acccgagggg 1080

gaugauaaac cgggcgcggu cgguaaaguu guuccauuuu uugaagcgaa gguuguggau 1140

cuggauaccg ggaaaacgcu gggcguuaau cagagaggcg aauuaugugu cagaggaccu 1200

augauuaugu ccgguuaugu aaacaauccg gaagcgacca acgccuugau ugacaaggau 1260

ggauggcuac auucuggaga cauagcuuac ugggacgaag acgaacacuu cuucauaguu 1320

gaccgcuuga agucuuuaau uaaauacaaa ggauaucagg uggcccccgc ugaauuggaa 1380

ucgauauugu uacaacaccc caacaucuuc gacgcgggcg uggcaggucu ucccgacgau 1440

gacgccggug aacuucccgc cgccguuguu guuuuggagc acggaaagac gaugacggaa 1500

aaagagaucg uggauuacgu cgccagucaa guaacaaccg cgaaaaaguu gcgcggagga 1560

guuguguuug uggacgaagu accgaaaggu cuuaccggaa aacucgacgc aagaaaaauc 1620

agagagaucc ucauaaaggc caagaagggc ggaaagucca aauugugagg acuaguagau 1680

cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1712

<210> 48

<211> 1746

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> R3454: PpLuc(wt) - A64

<400> 48

gggagaaagc uuaccaugga agacgccaaa aacauaaaga aaggcccggc gccauucuau 60

ccuuuagagg auggaaccgc uggagagcaa cugcauaagg cuaugaagag auacgcccug 120

guuccuggaa caauugcuuu uacagaugca cauaucgagg ugaacaucac guacgcggaa 180

uacuucgaaa uguccguucg guuggcagaa gcuaugaaac gauaugggcu gaauacaaau 240

cacagaaucg ucguaugcag ugaaaacucu cuucaauucu uuaugccggu guugggcgcg 300

uuauuuaucg gaguugcagu ugcgcccgcg aacgacauuu auaaugaacg ugaauugcuc 360

aacaguauga acauuucgca gccuaccgua guguuuguuu ccaaaaaggg guugcaaaaa 420

auuuugaacg ugcaaaaaaa auuaccaaua auccagaaaa uuauuaucau ggauucuaaa 480

acggauuacc agggauuuca gucgauguac acguucguca caucucaucu accucccggu 540

uuuaaugaau acgauuuugu accagagucc uuugaucgug acaaaacaau ugcacugaua 600

augaauagcu cuggaucuac uggguuaccu aagggugugg cccuuccgca uagaacugcc 660

ugcgucagau ucucgcaugc cagagauccu auuuuuggca aucaaaucau uccggauacu 720

gcgauuuuaa guguuguucc auuccaucac gguuuuggaa uguuuacuac acucggauau 780

uugauaugug gauuucgagu cgucuuaaug uauagauuug aagaagagcu guuuuuacga 840

ucccuucagg auuacaaaau ucaaagugcg uugcuaguac caacccuauu uucauucuuc 900

gccaaaagca cucugauuga caaauacgau uuaucuaauu uacacgaaau ugcuucuggg 960

ggcgcaccuc uuucgaaaga agucggggaa gcgguugcaa aacgcuucca ucuuccaggg 1020

auacgacaag gauaugggcu cacugagacu acaucagcua uucugauuac acccgagggg 1080

gaugauaaac cgggcgcggu cgguaaaguu guuccauuuu uugaagcgaa gguuguggau 1140

cuggauaccg ggaaaacgcu gggcguuaau cagagaggcg aauuaugugu cagaggaccu 1200

augauuaugu ccgguuaugu aaacaauccg gaagcgacca acgccuugau ugacaaggau 1260

ggauggcuac auucuggaga cauagcuuac ugggacgaag acgaacacuu cuucauaguu 1320

gaccgcuuga agucuuuaau uaaauacaaa ggauaucagg uggcccccgc ugaauuggaa 1380

ucgauauugu uacaacaccc caacaucuuc gacgcgggcg uggcaggucu ucccgacgau 1440

gacgccggug aacuucccgc cgccguuguu guuuuggagc acggaaagac gaugacggaa 1500

aaagagaucg uggauuacgu cgccagucaa guaacaaccg cgaaaaaguu gcgcggagga 1560

guuguguuug uggacgaagu accgaaaggu cuuaccggaa aacucgacgc aagaaaaauc 1620

agagagaucc ucauaaaggc caagaagggc ggaaagucca aauugugagg acuaguagau 1680

cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaaa 1746

<210> 49

<211> 1810

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> R2462: PpLuc(GC)-A64-C30-гистонSL

<400> 49

gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60

cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120

ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180

guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240

ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300

ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360

gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420

gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480

gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540

cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600

caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660

cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720

cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780

ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840

gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900

cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960

gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020

cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080

ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140

ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200

gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260

cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320

cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380

gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440

cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500

gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560

cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620

ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguagau 1680

cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc 1800

caccagaauu 1810

<210> 50

<211> 1846

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> R1256: PpLuc(GC)-muag-A64-C30

<400> 50

gggagaaagc uugaggaugg aggacgccaa gaacaucaag aagggcccgg cgcccuucua 60

cccgcuggag gacgggaccg ccggcgagca gcuccacaag gccaugaagc gguacgcccu 120

ggugccgggc acgaucgccu ucaccgacgc ccacaucgag gucgacauca ccuacgcgga 180

guacuucgag augagcgugc gccuggccga ggccaugaag cgguacggcc ugaacaccaa 240

ccaccggauc guggugugcu cggagaacag ccugcaguuc uucaugccgg ugcugggcgc 300

ccucuucauc ggcguggccg ucgccccggc gaacgacauc uacaacgagc gggagcugcu 360

gaacagcaug gggaucagcc agccgaccgu gguguucgug agcaagaagg gccugcagaa 420

gauccugaac gugcagaaga agcugcccau cauccagaag aucaucauca uggacagcaa 480

gaccgacuac cagggcuucc agucgaugua cacguucgug accagccacc ucccgccggg 540

cuucaacgag uacgacuucg ucccggagag cuucgaccgg gacaagacca ucgcccugau 600

caugaacagc agcggcagca ccggccugcc gaagggggug gcccugccgc accggaccgc 660

cugcgugcgc uucucgcacg cccgggaccc caucuucggc aaccagauca ucccggacac 720

cgccauccug agcguggugc cguuccacca cggcuucggc auguucacga cccugggcua 780

ccucaucugc ggcuuccggg ugguccugau guaccgguuc gaggaggagc uguuccugcg 840

gagccugcag gacuacaaga uccagagcgc gcugcucgug ccgacccugu ucagcuucuu 900

cgccaagagc acccugaucg acaaguacga ccugucgaac cugcacgaga ucgccagcgg 960

gggcgccccg cugagcaagg aggugggcga ggccguggcc aagcgguucc accucccggg 1020

cauccgccag ggcuacggcc ugaccgagac cacgagcgcg auccugauca cccccgaggg 1080

ggacgacaag ccgggcgccg ugggcaaggu ggucccguuc uucgaggcca agguggugga 1140

ccuggacacc ggcaagaccc ugggcgugaa ccagcggggc gagcugugcg ugcgggggcc 1200

gaugaucaug agcggcuacg ugaacaaccc ggaggccacc aacgcccuca ucgacaagga 1260

cggcuggcug cacagcggcg acaucgccua cugggacgag gacgagcacu ucuucaucgu 1320

cgaccggcug aagucgcuga ucaaguacaa gggcuaccag guggcgccgg ccgagcugga 1380

gagcauccug cuccagcacc ccaacaucuu cgacgccggc guggccgggc ugccggacga 1440

cgacgccggc gagcugccgg ccgcgguggu ggugcuggag cacggcaaga ccaugacgga 1500

gaaggagauc gucgacuacg uggccagcca ggugaccacc gccaagaagc ugcggggcgg 1560

cgugguguuc guggacgagg ucccgaaggg ccugaccggg aagcucgacg cccggaagau 1620

ccgcgagauc cugaucaagg ccaagaaggg cggcaagauc gccguguaag acuaguuaua 1680

agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740

auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc cucuag 1846

<210> 51

<211> 1870

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> R2393: PpLuc(nat)-muag-A64-C30-гистонSL

<400> 51

gggagaaagc uuaccaugga agacgccaaa aacauaaaga aaggcccggc gccauucuau 60

ccuuuagagg auggaaccgc uggagagcaa cugcauaagg cuaugaagag auacgcccug 120

guuccuggaa caauugcuuu uacagaugca cauaucgagg ugaacaucac guacgcggaa 180

uacuucgaaa uguccguucg guuggcagaa gcuaugaaac gauaugggcu gaauacaaau 240

cacagaaucg ucguaugcag ugaaaacucu cuucaauucu uuaugccggu guugggcgcg 300

uuauuuaucg gaguugcagu ugcgcccgcg aacgacauuu auaaugaacg ugaauugcuc 360

aacaguauga acauuucgca gccuaccgua guguuuguuu ccaaaaaggg guugcaaaaa 420

auuuugaacg ugcaaaaaaa auuaccaaua auccagaaaa uuauuaucau ggauucuaaa 480

acggauuacc agggauuuca gucgauguac acguucguca caucucaucu accucccggu 540

uuuaaugaau acgauuuugu accagagucc uuugaucgug acaaaacaau ugcacugaua 600

augaauagcu cuggaucuac uggguuaccu aagggugugg cccuuccgca uagaacugcc 660

ugcgucagau ucucgcaugc cagagauccu auuuuuggca aucaaaucau uccggauacu 720

gcgauuuuaa guguuguucc auuccaucac gguuuuggaa uguuuacuac acucggauau 780

uugauaugug gauuucgagu cgucuuaaug uauagauuug aagaagagcu guuuuuacga 840

ucccuucagg auuacaaaau ucaaagugcg uugcuaguac caacccuauu uucauucuuc 900

gccaaaagca cucugauuga caaauacgau uuaucuaauu uacacgaaau ugcuucuggg 960

ggcgcaccuc uuucgaaaga agucggggaa gcgguugcaa aacgcuucca ucuuccaggg 1020

auacgacaag gauaugggcu cacugagacu acaucagcua uucugauuac acccgagggg 1080

gaugauaaac cgggcgcggu cgguaaaguu guuccauuuu uugaagcgaa gguuguggau 1140

cuggauaccg ggaaaacgcu gggcguuaau cagagaggcg aauuaugugu cagaggaccu 1200

augauuaugu ccgguuaugu aaacaauccg gaagcgacca acgccuugau ugacaaggau 1260

ggauggcuac auucuggaga cauagcuuac ugggacgaag acgaacacuu cuucauaguu 1320

gaccgcuuga agucuuuaau uaaauacaaa ggauaucagg uggcccccgc ugaauuggaa 1380

ucgauauugu uacaacaccc caacaucuuc gacgcgggcg uggcaggucu ucccgacgau 1440

gacgccggug aacuucccgc cgccguuguu guuuuggagc acggaaagac gaugacggaa 1500

aaagagaucg uggauuacgu cgccagucaa guaacaaccg cgaaaaaguu gcgcggagga 1560

guuguguuug uggacgaagu accgaaaggu cuuaccggaa aacucgacgc aagaaaaauc 1620

agagagaucc ucauaaaggc caagaagggc ggaaagucca aauugugagg acuaguuaua 1680

agacugacua gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accgagauua 1740

auaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc ccaaaggcuc uuuucagagc 1860

caccagaauu 1870

<210> 52

<211> 1792

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> R2403: RAV-G(GC)-muag-A64-C30-гистонSL

<400> 52

gggagaaagc uuaccauggu gccccaggcc cugcucuucg ucccgcugcu gguguucccc 60

cucugcuucg gcaaguuccc caucuacacc auccccgaca agcuggggcc guggagcccc 120

aucgacaucc accaccuguc cugccccaac aaccucgugg ucgaggacga gggcugcacc 180

aaccugagcg gguucuccua cauggagcug aaggugggcu acaucagcgc caucaagaug 240

aacggguuca cgugcaccgg cguggucacc gaggcggaga ccuacacgaa cuucgugggc 300

uacgugacca ccaccuucaa gcggaagcac uuccgcccca cgccggacgc cugccgggcc 360

gccuacaacu ggaagauggc cggggacccc cgcuacgagg agucccucca caaccccuac 420

cccgacuacc acuggcugcg gaccgucaag accaccaagg agagccuggu gaucaucucc 480

ccgagcgugg cggaccucga ccccuacgac cgcucccugc acagccgggu cuuccccggc 540

gggaacugcu ccggcguggc cgugagcucc acguacugca gcaccaacca cgacuacacc 600

aucuggaugc ccgagaaccc gcgccugggg auguccugcg acaucuucac caacagccgg 660

ggcaagcgcg ccuccaaggg cagcgagacg ugcggguucg ucgacgagcg gggccucuac 720

aagucccuga agggggccug caagcugaag cucugcggcg ugcugggccu gcgccucaug 780

gacgggaccu ggguggcgau gcagaccagc aacgagacca aguggugccc ccccggccag 840

cuggucaacc ugcacgacuu ccggagcgac gagaucgagc accucguggu ggaggagcug 900

gucaagaagc gcgaggagug ccuggacgcc cucgagucca ucaugacgac caagagcgug 960

uccuuccggc gccugagcca ccugcggaag cucgugcccg gguucggcaa ggccuacacc 1020

aucuucaaca agacccugau ggaggccgac gcccacuaca aguccguccg cacguggaac 1080

gagaucaucc cgagcaaggg gugccugcgg gugggcggcc gcugccaccc ccacgucaac 1140

gggguguucu ucaacggcau cauccucggg cccgacggca acgugcugau ccccgagaug 1200

caguccagcc ugcuccagca gcacauggag cugcuggucu ccagcgugau cccgcucaug 1260

cacccccugg cggaccccuc caccguguuc aagaacgggg acgaggccga ggacuucguc 1320

gaggugcacc ugcccgacgu gcacgagcgg aucagcggcg ucgaccucgg ccugccgaac 1380

ugggggaagu acgugcugcu cuccgccggc gcccugaccg cccugaugcu gaucaucuuc 1440

cucaugaccu gcuggcgccg ggugaaccgg agcgagccca cgcagcacaa ccugcgcggg 1500

accggccggg aggucuccgu gaccccgcag agcgggaaga ucaucuccag cugggagucc 1560

uacaagagcg gcggcgagac cgggcuguga ggacuaguua uaagacugac uagcccgaug 1620

ggccucccaa cgggcccucc uccccuccuu gcaccgagau uaauaaaaaa aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaug cauccccccc 1740

cccccccccc cccccccccc ccccaaaggc ucuuuucaga gccaccagaa uu 1792

<210> 53

<211> 638

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> R3513: EPO (wt)-A30

<400> 53

gggagaaagc uuaccauggg ggugcccgaa cgucccaccc ugcugcuuuu acucuccuug 60

cuacugauuc cucugggccu cccaguccuc ugugcucccc cacgccucau cugcgacagu 120

cgaguucugg agagguacau cuuagaggcc aaggaggcag aaaaugucac gauggguugu 180

gcagaagguc ccagacugag ugaaaauauu acagucccag auaccaaagu caacuucuau 240

gcuuggaaaa gaauggaggu ggaagaacag gccauagaag uuuggcaagg ccugucccug 300

cucucagaag ccauccugca ggcccaggcc cugcuagcca auuccuccca gccaccagag 360

acccuucagc uucauauaga caaagccauc aguggucuac guagccucac uucacugcuu 420

cggguacugg gagcucagaa ggaauugaug ucgccuccag auaccacccc accugcucca 480

cuccgaacac ucacagugga uacuuucugc aagcucuucc gggucuacgc caacuuccuc 540

cgggggaaac ugaagcugua cacgggagag gucugcagga gaggggacag gugaccacua 600

guagaucuaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 638

<210> 54

<211> 981

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> R3135: HSD17B4-EPO (GC)-albumin7-A64-C30-гистонSL

<400> 54

gggucccgca gucggcgucc agcggcucug cuuguucgug ugugugucgu ugcaggccuu 60

auucaagcuu accaugggcg ugcccgagcg gccgacccug cuccugcugc ucagccugcu 120

gcucaucccc cuggggcugc ccguccucug cgcccccccg cgccugaucu gcgacucccg 180

ggugcuggag cgcuacaucc ucgaggccaa ggaggcggag aacgugacca ugggcugcgc 240

cgaggggccc cggcugagcg agaacaucac gguccccgac accaagguga acuucuacgc 300

cuggaagcgc auggaggugg aggagcaggc caucgagguc uggcagggcc ugucccuccu 360

gagcgaggcc auccugcagg cgcaggcccu ccuggccaac uccagccagc ccccggagac 420

acugcagcuc cacaucgaca aggccaucuc cgggcugcgg agccugaccu cccuccugcg 480

cgugcugggc gcgcagaagg agcucaugag cccgcccgac acgacccccc cggccccgcu 540

gcggacccug accguggaca cguucugcaa gcucuuccgc gucuacgcca acuuccugcg 600

gggcaagcug aagcucuaca ccggggaggu gugccgccgg ggcgaccgcu gaccacuagu 660

gcaucacauu uaaaagcauc ucagccuacc augagaauaa gagaaagaaa augaagauca 720

auagcuuauu caucucuuuu ucuuuuucgu ugguguaaag ccaacacccu gucuaaaaaa 780

cauaaauuuc uuuaaucauu uugccucuuu ucucugugcu ucaauuaaua aaaaauggaa 840

agaaccuaga ucuaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900

aaaaaaaaaa aaaaaaaugc aucccccccc cccccccccc cccccccccc cccaaaggcu 960

cuuuucagag ccaccagaau u 981

<210> 55

<211> 42

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 55

ggcgctgcct acggaggtgg cagccatctc cttctcggca tc 42

<210> 56

<211> 75

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 56

gcggctcggc cattttgtcc cagtcagtcc ggaggctgcg gctgcagaag taccgcctgc 60

ggagtaactg caaag 75

<210> 57

<211> 186

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 57

catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60

aagcttattc atctgttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120

ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180

gaatct 186

<210> 58

<211> 186

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 58

catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60

tagcttattc atctcttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120

ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180

gaacct 186

<210> 59

<211> 110

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 59

gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60

ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc 110

<210> 60

<211> 108

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 60

gctggagcct cggtagccgt tcctcctgcc cgctgggcct cccaacgggc cctcctcccc 60

tccttgcacc ggcccttcct ggtctttgaa taaagtctga gtgggcag 108

<210> 61

<211> 132

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 61

gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60

taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120

tattttcatt gc 132

<210> 62

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> центральная связывающая альфа-комплекс область 3’UTR гена альфа-глобина

<400> 62

gcccgatggg cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accg 44

<210> 63

<211> 574

<212> PRT

<213> респираторно-синцитиальный вирус

<400> 63

Met Glu Leu Pro Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe

20 25 30

Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

50 55 60

Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Asn

65 70 75 80

Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu

85 90 95

Met Gln Ser Thr Thr Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

100 105 110

Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Lys Thr Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val

130 135 140

Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Ile Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu

145 150 155 160

Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

165 170 175

Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

180 185 190

Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn

195 200 205

Lys Gln Ser Cys Arg Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln

210 215 220

Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

225 230 235 240

Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

245 250 255

Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys

260 265 270

Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile

275 280 285

Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro

290 295 300

Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

325 330 335

Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

340 345 350

Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

355 360 365

Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val

370 375 380

Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

385 390 395 400

Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

405 410 415

Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

420 425 430

Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp

435 440 445

Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly

450 455 460

Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

465 470 475 480

Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn

485 490 495

Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu

500 505 510

Leu His His Val Asn Ala Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr

515 520 525

Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Val

530 535 540

Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser

545 550 555 560

Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn

565 570

<210> 64

<211> 2107

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> RSV-F «длинный» (GC) R2510

<400> 64

ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accauggagc 60

ugcccauccu caaggccaac gccaucacca ccauccuggc ggccgugacg uucugcuucg 120

ccagcuccca gaacaucacc gaggaguucu accagagcac cugcuccgcc gucagcaagg 180

gcuaccuguc cgcccuccgg accggguggu acacgagcgu gaucaccauc gagcugucca 240

acaucaagga gaacaagugc aacggcaccg acgcgaaggu gaagcugauc aaccaggagc 300

ucgacaagua caagaacgcc gucaccgagc ugcagcugcu caugcagagc acgaccgccg 360

ccaacaaccg cgcgcggcgc gagcugccgc gguucaugaa cuacacccug aacaacacca 420

agaagacgaa cgugacccuc uccaagaagc gcaagcggcg cuuccugggg uuccugcucg 480

gcguggggag cgccaucgcc uccggcaucg ccgucagcaa ggugcugcac cuggagggcg 540

aggugaacaa gaucaagucc gcccuccuga gcaccaacaa ggcggucgug ucccugagca 600

acgggguguc cguccucacc agcaaggugc uggaccugaa gaacuacauc gacaagcagc 660

uccugcccau cgugaacaag caguccugcc ggaucagcaa caucgagacg gucaucgagu 720

uccagcagaa gaacaaccgc cugcucgaga ucacccggga guucagcgug aacgccggcg 780

ugaccacccc cgucuccacg uacaugcuga ccaacagcga gcugcucucc cugaucaacg 840

acaugcccau caccaacgac cagaagaagc ugaugagcaa caacgugcag aucgugcgcc 900

agcaguccua cagcaucaug uccaucauca aggaggaggu ccucgccuac guggugcagc 960

ugccgcugua cggggucauc gacacccccu gcuggaagcu ccacacgagc ccccugugca 1020

ccaccaacac caaggagggc uccaacaucu gccugacgcg gaccgaccgc gggugguacu 1080

gcgacaacgc cggcagcgug uccuucuucc cccaggccga gaccugcaag guccagagca 1140

accggguguu cugcgacacc augaacuccc ucacgcugcc gagcgaggug aaccugugca 1200

acgucgacau cuucaacccc aaguacgacu gcaagaucau gaccuccaag accgacguga 1260

gcuccagcgu gaucaccucc cucggcgcga ucgucagcug cuacgggaag acgaagugca 1320

ccgccagcaa caagaaccgc ggcaucauca agaccuucuc caacgggugc gacuacguga 1380

gcaacaaggg cguggacacc gucuccgugg gcaacacccu guacuacgug aacaagcagg 1440

aggggaagag ccuguacguc aagggcgagc ccaucaucaa cuucuacgac ccccucgugu 1500

ucccguccga cgaguucgac gccagcaucu cccaggugaa cgagaagauc aaccagagcc 1560

uggccuucau ccggaagucc gacgagcugc ugcaccacgu caacgccggg aagagcacga 1620

ccaacaucau gaucaccacc aucaucaucg ugaucaucgu gauccuccug ucccugaucg 1680

cggucggccu ccugcuguac ugcaaggccc gcagcacgcc cgugacccuc uccaaggacc 1740

agcugagcgg gaucaacaac aucgccuucu ccaacugagg acuagugcau cacauuuaaa 1800

agcaucucag ccuaccauga gaauaagaga aagaaaauga agaucaauag cuuauucauc 1860

ucuuuuucuu uuucguuggu guaaagccaa cacccugucu aaaaaacaua aauuucuuua 1920

aucauuuugc cucuuuucuc ugugcuucaa uuaauaaaaa auggaaagaa ccuagaucua 1980

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040

aaaugcaucc cccccccccc cccccccccc ccccccccca aaggcucuuu ucagagccac 2100

cagaauu 2107

<---

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Описано применение модифицированной РНК, содержащей одну открытую рамку считывания и модификацию, которая повышает экспрессию кодируемого пептида или белка, где указанная модификация включает модификацию GC-контента в его кодирующей области по сравнению с кодирующей областью его дикого типа, при этом заменяют по меньшей мере 5% пригодных для замены кодонов в кодирующей области, кодирующей пептид или белок, повышая тем самым содержание G/C в указанной кодирующей области, где транслируемая аминокислотная последовательность кодирующей области дикого типа, сохранена, для производства лекарственного средства для генной терапии или генетической вакцинации, которое вводят с помощью безыгольной инъекции. Кроме того, описана фармацевтическая композиция для генной терапии или генетической вакцинации, содержащая модифицированную РНК согласно изобретению и по меньшей мере один приемлемый фармацевтический эксципиент. В заявке описаны также фармацевтическая композиция и набор компонентов, которые содержат указанную модифицированную РНК, предназначенную для введения с помощью струйной инъекции, предпочтительно для применения в области генной терапии и/или генетической вакцинации. Кроме того, в заявке описан способ повышения (локализованной) экспрессии кодируемых РНК пептидов или белков в дерме или мышце (млекопитающего), заключающийся в том, что вводят модифицированную РНК с помощью струйной инъекции. И, наконец, в заявке описан способ лечения, заключающийся в том, что вводят модифицированную РНК с помощью струйной инъекции индивидууму, который нуждается в этом. 5 н. и 92 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 4 пр.

Формула