Противоопухолевая композиция - RU2728748C2

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции, отличающейся тем, что она содержит по меньшей мере одну нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую по меньшей мере один специфический неоантиген опухоли, поксвирус и антитело к CTLA4. Данное изобретение также относится к применению композиций по изобретению для лечения злокачественных новообразований.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Традиционное лечение опухолевых заболеваний заключается в применении химических или биологических соединений (химиотерапия), облучения (лучевая терапия) и/или хирургического вмешательства. Даже не смотря на огромный прогресс, достигнутый за последние годы в области адресных терапий, в частности, использующих моноклональные антитела или другие молекулы, мишенями которых являются специфические рецепторы, смертность по-прежнему остается высокой и продолжается разработка дальнейших терапевтических подходов для снижения смертности и/или побочных эффектов, связанных с этими заболеваниями и их лечением.

Среди разрабатываемых новых терапевтических подходов особое внимание уделяется генной терапии и иммунной терапии.

Идея иммунизации против существующих опухолевых клеток основана на том наблюдении, что опухолевые клетки экспрессируют мутантные белки, белки с аберрантным гликозилированием или вирусные белки, когда речь идет об опухолях, вызванных вирусной инфекцией. Внутри опухоли экспрессия этих белков не запускает развитие эффективного иммунного ответа. Действительно, в опухоли особым образом может создаваться микроокружение, предупреждающее инициацию иммуного ответа, направленного против указанных антигенов и/или экспрессирующих их клеток. Кроме того, даже если иммунный ответ индуцируется, он не всегда оказывается эффективным из-за развития анергии при опухолях. Предположили, что для развития иммунного ответа будет более эффективным осуществлять инъекции антигенов, ассоциированных с опухолевыми клетками, в зону, где иммунная система является активной.

Среди антигенов, ассоциированных с опухолями, можно упомянуть опухолевые неоантигены, появившиеся вследствие накопления в популяции клеток мутаций, вызывающих злокачественное перерождение. Такие мутации могут, например, возникать вследствие воздействия ультрафиолетового излучения или канцерогенных веществ табака или иных факторов. Некоторые из них непосредственно задействованы в канцерогенезе, другие являются всего лишь преходящими, однако все они, из-за изменения аминокислот в последовательности белка, могут восприниматься иммунной системой как чужеродные и поэтому антигенные.

В контексте лечения злокачественных новообразований генная терапия применялась по трем основным направлениям. Первое заключалось в инъекциях в месте опухоли генов, кодирующих иммуностимулирующие молекулы, подходящие для снятия местного ингибирования иммунной системы. Например, непосредственно в опухоли осуществляли инъекции генов, кодирующих интерлейкины. Предполагали, что местная продукция интерлейкинов обеспечит нормальную активность иммунной системы и деструкцию опухолевых клеток. Однако, результаты, полученные с указанным типом стратегии, оказались разочаровывающими.

Второе направление исследований заключалось в инъекциях в опухолевые клетки генов, кодирующих цитотоксические молекулы или индуцирующих непосредственную или опосредованную продукцию цитотоксических молекул. Эта стратегия предположительно делает возможной деструкцию опухолевых клеток и возможно, высвобождение антигенов в организм, таким образом обеспечивая активацию иммунной системы.

Последнее направление исследований заключалось в применении для вакцинации пациентов нуклеиновых кислот, кодирующих антигены, ассоциированные с опухолями. Действительно, продукция антигена клетками пациента, а не их инъекция in-situ, делает возможной лучшую презентацию антигенов, больше соответствующую той, что имеет место у опухолевых клеток.

Однако, противоопухолевый ответ, наблюдавшийся при вышеупомянутых различных видах терапии, оказался ненамного лучше по сравнению с клиническим ответом, наблюдавшимся при стандартном лечении.

Таким образом, необходимо разработать новые продукты и/или новые способы, обеспечивающие длительный контроль объема опухоли и увеличение доли выживших пациентов, получающих лечение.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции, отличающейся тем, что она содержит по меньшей мере одну нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую по меньшей мере один специфический неоантиген опухолевой клетки, по меньшей мере один поксвирус и антитело к CTLA4.

Специфическая комбинация указанных трех компонентов делает возможным развитие иммунного ответа, направленного против неоантигена(ов), кодируемого(ых) нуклеиновокислотной последовательностью. Поксвирус позволяет как улучшить трансфекцию нуклеиновокислотной последовательностью, так и улучшить качество иммунного ответа, направленного против неоантигена(ов). Антитело к CTLA-4 также делает возможным усиление иммунного ответа против неоантигена(ов). Применение нуклеиновокислотной последовательности делает возможным быстрое и персонализированное получение последовательности, кодирующей неоантиген(ы). Действительно, существующие технологии позволяют полностью секвенировать генотип опухолевых клеток пациента и идентифицировать конкретные мутации путем сравнения с ДНК организма пациента. Если указанные мутации не являются синонимичными, принадлежат к кодирующим последовательностям, экспрессируемым опухолью и обусловлены ее свойствами, которые предположительно являются иммуногенными, то последние можно применять для иммунизации против опухоли.

Мутации в геноме опухолей и образованные неоантигены представляют собой уникальную комбинацию, присущую опухоли конкретного пациента или клонам, образующим эту опухоль.

Использование неоантигенов как средства для иммунизации пациента против его/ее собственных опухолевых клеток является новой концепцией. Ее осуществление осложняется необходимостью производства за короткое время персонализированных фармацевтических препаратов, соответствующих неоантигенам, несомых опухолью конкретного пациента.

До настоящего времени терапевтическую иммунизацию в онкологии осуществляли с применением продуктов двух основных категорий. Первая состоит во введении, как правило, посредством инъекции, пептидов или белков, предположительно являющихся антигенами, присутствующими в опухоли, всех в присутствии адъювантов, применение которых иногда вызывает беспокойство. Вторая заключается во введении нуклеиновых кислот, кодирующих антигены, предположительно присутствующих в опухоли, но обычно соответствующих белкам, предпочтительно экспрессируемым опухолью, которые, однако не обязательно отличаются от неопухолевых вариантов и не обязательно подпадают под определение неоантигена.

Из указанных двух классов продуктов иммунотерапия с применением генной терапии, в частности, основанной на применении вирусных векторов, продемонстрировала существенную эффективность при лечении опухолей, которая оказалась воспроизводимой. Иммунотерапия с применением генной терапии, прежде всего на основе вирусов, естественным образом воспринимается иммунной системой как сигнал опасности. Они являются более иммуногенными и в принципе не требуют применения адъювантов. Вирусный компонент, в частности, если он представляет собой поксвирус, индуцирует врожденный иммунный ответ, способствующий развитию адаптивного иммунного ответа против экспрессируемых антигенов.

Дизайн и фармацевтическое производство генетически модифицированного вируса, экспрессирующего последовательности, кодирующие один или множество неоантигенов, присутствующих в опухоли пациента, выполнимы с технической точки зрения, однако требуют длительного и дорогостоящего процесса, который очень трудно сделать универсальным.

Продукция плазмид или двуцепочечных замкнутых линейных нуклеиновых кислот или иных векторов, экспрессирующих гены, кодирующие один или множество неоантигенов, напротив, является простой, относительно недорогой операцией, реализуемой в большинстве случаев за несколько недель.

Совместная инъекция нуклеиновой кислоты, кодирующей один или множество неоантигенов, и вируса, в частности, поксвируса, может обеспечить за короткое время получение персонализированного фармацевтического препарата, соответствующего неоантигенам, несомым опухолью пациента, при этом присутствие вируса, подающего сигнал опасности, необходимый для развития иммунного ответа, также будет преимуществом.

Кроме того, поксвирус, из-за наличия в его мембране фосфолипидных компонентов, может способствовать проникновению нуклеиновой кислоты в клетки, находящиеся вблизи от места инъекции, и, следовательно, экспрессии антигенных белков, кодируемых нуклеиновой кислотой.

Последовательность нуклеиновой кислоты в случае вектора, экспрессирующего ДНК, способствует распознаванию специфическими сенсорами двухцепочечной ДНК в цитоплазме клеток, куда проникли указанные векторы. Такое распознавание влечет за собой биологический ответ, способствующий иммунному ответу.

Таким образом, нуклеиновокислотная последовательность и поксвирус имеют различные пути влияния, которые являются комплементарными и делают возможным развитие более выраженного ответа.

Следующим преимуществом поксвируса является его способность возможно экспрессировать дополнительные опухолевые антигены, которые могут экспрессироваться и презентироваться в месте инъекции в дополнение к неоантигенам. Например, в случае опухолей, индуцированных ВПЧ, следует упомянуть его белки Е6 и Е7 или в случае аденокарцином - белок MUC1.

Антитела к CTLA4 являются ингибиторами отрицательных регуляторов контрольных точек иммунного ответа. До сих пор их вводили системным, внутривенным путем, с существенной эффективностью, по меньшей мере при лечении злокачественной меланомы кожи и немелкоклеточного рака легкого, но взамен получали довольно значимые побочные эффекты.

Совместное введение антитела к CTLA4 или фрагмента антитела может стимулировать иммунный ответ, индуцированный иммунотерапией, в частности, комбинацией вектора, экпрессирующего гены, и поксвируса. Для этой цели дозы, сниженные до 1/20 или менее от обычных доз для системного введения, считают достаточными. При указанных дозах после совместной инъекции концентрация в дренирующем лимфоузле в месте инъекции предположительно выше, чем при системном способе введения, тогда как собственно системная концентрация существенно снижена, так же, как и риск побочных эффектов.

В рамках данного изобретения термин «нуклеиновокислотная последовательность» относится к кодирующей нуклеиновокислотной последовательности типа ДНК или РНК. Эта нуклеотидная последовательность не включена в вирусный геном или не инкапсулирована в вирусную частицу.

Согласно одному воплощению изобретения, указанная нуклеиновокислотная последовательность выбрана из группы, содержащей плазмиды и векторы линейной ДНК или РНК.

Согласно одному воплощению изобретения, указанная нуклеиновокислотная последовательность является голой, т.е. не связана с молекулами, способствующими ее проникновению в эукариотические клетки, например, такими как катионные полимеры, вирусные полимеры, липиды и/или липосомы.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, указанная нуклеиновокислотная последовательность представляет собой двуцепочечную замкнутую линейную нуклеиновокислотную последовательность. Кроме того, способ получения замкнутых линейных нуклеиновых кислот сопровождается образованием очень небольших количеств технологических примесей, в частности, бактериальных, что позволяет избежать трудоемких стадий очистки и позволяет ускорить их применение и сделать его менее дорогостоящим.

Замкнутые линейные нуклеиновые кислоты хорошо известны специалистам в области техники, их структура, функции и способы, позволяющие их получать, в частности, описаны в документах CN 103080337, ЕР 2601312, GB 201013153, JP 2013535210, US 2013216562, WO 12017210, AU 2010209532, СА 2751130, CN 102301010, DK 2391731, ЕА 021069, ЕА 201101141, ЕР 2391731, ЕР 2612925, ES 2400890, GB 200901593, HK 1159693, IL 213930, IN 05006CN2011, JP 2012516147, KR 20110107846, МХ 2011007937, NZ 594004, SG 173102, US 2012282283, US 9109250, W0 10086626.

В рамках данного изобретения термин «неоантиген, ассоциированный с опухолевой клеткой» относится к белку, экспрессируемому опухолевой клеткой в мутированной форме при сравнении с последовательностью ДНК организма пациента.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения антитело к CTLA-4 предпочтительно выбрано из группы, включающей ипилимумаб и тремелимумаб. Оно может также представлять собой фрагмент антитела, мишенью которого является CTLA-4 или любая молекула, содержащая паратоп, специфически направленный против CTLA-4. Для ясности уточняется, что термин «антитело к СТ1-А-4» не применим к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитело к CTLA-4.

Согласно предпочтительному воплощению, указанная нуклеиновокислотная последовательность дополнительно содержит регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию специфических неоантигенов опухолевой клетки в эукариотических клетках.

Согласно предпочтительному воплощению, регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию неоантигена(ов), ассоциированных с опухолевой клеткой, в эукариотических клетках, включают промотор транскрипции гена и область инициации трансляции в клетках-хозяевах. Указанная нуклеиновокислотная последовательность может содержать множество последовательностей, каждая из которых кодирует различные неоантигены, ассоциированные с опухолями. В случае множества неоантигенов, последовательности, кодирующие последние, могут быть помещены под контроль идентичных или различных регуляторных элементов.

Согласно предпочтительному воплощению, поксвирус является живым или убитым.

Согласно предпочтительному воплощению, поксвирус не содержит гетерологичные последовательности.

Согласно предпочтительному воплощению, поксвирус происходит от вируса осповакцины, вируса оспы канареек или вируса оспы кур.

Согласно предпочтительному воплощению, указанный поксвирус происходит от вируса осповакцины, выбранного из штаммов Копенгаген, Вайет (Wyeth) и модифицированного вируса Анкара (MVA).

Согласно предпочтительному воплощению, указанный поксвирус происходит от вируса осповакцины штамма Копенгаген. Согласно предпочтительному воплощению, указанный поксвирус происходит от вируса осповакцины штамма MVA.

В рамках данного изобретения термин «происходит от» означает, что указанный вирус относится к указанному штамму.

Согласно следующему предпочтительному воплощению, указанный поксвирус включает гетерологичную последовательность ДНК, кодирующую по меньшей мере существенную область антигена, ассоциированного с опухолевой клеткой.

Согласно предпочтительному воплощению, последовательности ДНК, кодирующие по меньшей мере существенную область антигена, ассоциированного с опухолевой клеткой, находятся под контролем промотора гена поксвируса.

Согласно предпочтительному воплощению, последовательности, кодирующие по меньшей мере существенную область антигена, ассоциированного с опухолевой клеткой, находятся под контролем промотора гена вируса осповакцины, и в частности, промотора, выбранного из промоторов генов тимидин-киназы (TK), 7.5K, H5R и K1 L.

Согласно еще более предпочтительному воплощению изобретения, указанный промотор представляет собой промотор гена белка 7.5K вируса осповакцины.

Согласно предпочтительному воплощению, последовательности ДНК, кодирующие по меньшей мере существенную область антигена, ассоциированного с опухолевой клеткой, встроены внутри несущественной области использованного вируса.

Согласно предпочтительному воплощению, несущественной областью является ген TK.

В случае, когда указанный поксвирус происходит от вируса осповакцины штамма Копенгаген, последовательности, кодирующие по меньшей мере существенную область антигена, ассоциированного с опухолевой клеткой, предпочтительно встроены в локус TK и/или KIL указанного вируса осповакцины.

В случае, когда указанный поксвирус происходит от вируса осповакцины штамма MVA, последовательности, кодирующие по меньшей мере существенную область антигена, ассоциированного с опухолевой клеткой, предпочтительно встроены по меньшей мере в одну из вырезаемых зон I - VI указанного вируса осповакцины и, в частности, II и/или III.

Данное изобретение также относится к композиции по изобретению, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый субстрат, позволяющий вводить ее посредством инъекции людям или животным.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, указанный фармацевтически приемлемый субстрат позволяет осуществлять инъекцию указанной композиции посредством безыгольного инъектора.

В рамках данного изобретения термин «безыгольный инъектор» относится к устройству для внутрикожной, подкожной или внутримышечной инъекций жидкой активной субстанции для терапевтического применения у человека или в ветеринарии с помощью потока жидкости под давлением для проникновения в ткани. Жидкость может быть более или менее вязкой, может быть смесью жидкостей или гелем.

Введение нуклеиновых кислот обычно требует применения методики электропорации, совмещенной с инъекцией. Другим решением является инъекция под давлением при помощи безыгольной системы. Ее преимуществом также является обеспечение лучшей диффузии в тканях благодаря инъекции под давлением. При необходимости ее применение также позволяет готовить смесь продуктов, предназначенных для инъекции, непосредственно перед введением. Применение безыгольной системы инъекции под давлением способствует лучшему проникновению в ткани по сравнению с обычными иглами и, следовательно, трансфекции большего количества клеток. Таким образом, задачей является обеспечение иммунного ответа против неоантигенов, экспрессируемых нуклеиновокислотной последовательностью.

Данное изобретение также относится к набору, содержащему нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую по меньшей мере один специфический неоантиген или опухолевую клетку, по меньшей мере один поксвирус и антитело или фрагмент антитела, направленного против CTLA4.

Указанный набор может, в частности, применяться для приготовления композиции по изобретению непосредственно перед применением.

Данное изобретение также относится к применению композиции по изобретению для лечения злокачественного новообразования или опухоли.

Данное изобретение также относится к применению композиции по изобретению для лечения злокачественного новообразования шейки матки, ЛОР-органов или любой другой опухоли, вызванной ВПЧ, злокачественного новообразования печени, ассоциированного с хроническим носительством вируса гепатита В или С, или злокачественного новообразования, экспрессирующего белок MUC1.

СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно предпочтительному воплощению изобретения, опухолевые клетки пациента, которому предстоит лечение, анализируют, используя биоптат или образец, взятый во время операции. Выделяют и секвенируют ДНК и РНК опухолевых клеток, а также ДНК организма, полученную из образца крови.

Последовательности ДНК здоровых клеток сравнивают с последовательностью ДНК опухолевых клеток и идентифицируют соматические мутации, содержащиеся в кодирующих и экспрессируемых областях.

Мутированные кодирующие и экспрессируемые последовательности анализируют, используя алгоритмы, подходящие для выявления, например, наиболее антигенных и способных служить мишенями. Такие экспрессируемые кодирующие несинонимичные мутированные последовательности, специфичные для опухолевых клеток пациента, обозначаемые неоантигенами, затем получают из ДНК или посредством синтеза ДНК и помещают в экспрессирующий вектор (плазмиду или замкнутую линейную нуклеиновую кислоту или РНК). Согласно предпочтительному воплощению изобретения применение способа, описанного в заявке на патент ЕР 2391731, нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую один или множество неоантигенов, ассоциированных с опухолью пациента, помещают в замкнутую линейную нуклеиновую кислоту под контроль последовательностей, необходимых для ее экспрессии в эукариотических клетках. Таким образом, указанная последовательность предпочтительно располагается по ходу транскрипции относительно промотора, обеспечивающего экспрессию в эукариотических клетках, и против хода транскрипции от последовательности, терминирующей транскрипцию. Она может быть представлена сильным промотором эукариот и, в частности, ранним промотором ЦМВ. Промотор имеет либо вирусное происхождение, либо клеточное происхождение. В качестве примера вирусного промотора, отличного от ЦМВ, следует упомянуть ранний или поздний промотор вируса SV40 или промотор LTR вируса саркомы Рауса. В качестве примера клеточного промотора следует упомянуть промотор гена белка цитоскелета, например, такого как промотор десмина или промотор актина. Предпочтительно, интрон может быть встроен внутри указанной последовательности, кодирующей один или множество неоантигенов, ассоциированных с опухолью пациента. Действительно, известно, что некоторые интроны повышают транскрипцию последовательностей нуклеиновых кислот.

Поксвирус, использованный в композиции, предпочтительно представляет собой вирус MVA. Последний берет свое происхождение от вируса осповакцины штамма Анкара, полученного в результате последовательных пассажей на клетках куриного эмбриона. Эти многочисленные пассажи привели к ослаблению данного вируса, который, поэтому оказалось возможным его применение в последних кампаниях вакцинации против оспы.

Описание различных штаммов MVA, способов, подходящих для возможного встраивания любых экзогенных генов в их геном, а также способов получения и очистки данного вируса представлены в документах WO 0168820, WO 0242480, W003008533, W003048184, W003053463, W003054175, WO 03088994, WO 03097675, WO 03097844, WO 03097845, WO 03097846, WO 04048582, WO 04048606, WO 05054484, WO 06089690, WO 08028665, WO 08045346, WO 08131926, WO 08131927, WO 08138533, WO 09052328, WO 9152969, WO 10057650, WO 10060632, WO 10102822, WO 11042180, WO 11092029, WO 12010280, WO 12048817, WO 12059243, WO 13083254, WO 13189611, WO 14019718, WO 14037124, WO 14062778, WO 14063832, WO 9813500, WO 9915692.

Поксвирус может также содержать последовательности, кодирующие дополнительные специфические антигены опухоли, поражающей пациента. Например, последовательности, кодирующие антигены Е6 и Е7 вируса папилломы человека, или последовательности, кодирующие антигены NS3, NS4, NS5B вируса гепатита С или белок Mud с аберрантным гликозилированием в опухолях.

Наконец, композиция по изобретению будет предпочтительно содержать антитело к CTLA4 или фрагмент антитела, еще более предпочтительно, ипилимумаб. В рамках данного изобретения термин антитело также обозначает биспецифические антитела, содержащие по меньшей мере один специфический паратоп CTLA4.

Предпочтительно, композиция по изобретению дополнительно содержит фармацевтически приемлемый субстрат. В рамках данного изобретения «фармацевтически приемлемый субстрат» обозначает все субстраты, растворители, разбавители, эксципиенты, адъюванты, дисперсионные среды и их эквиваленты, совместимые с фармацевтическим введением.

Композиция, предназначенная для применения в изобретении, подходящим образом забуферена, чтобы подходить для применения у человека при физиологических или слегка щелочных значениях рН.

Композицию по изобретению можно вводить пациенту разичными способами, например, такими как подкожное, внутрикожное, внутримышечное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутриопухолевое, внутрисосудистое, внутриартериальное введение.

Инъекции можно осуществлять стандартными шприцами и иглами, но предпочтительно посредством безыгольного инъектора типа биоджект (bioject).

Введение композиции по изобретению можно осуществлять в виде однократной или повторных доз с некоторым интервалом времени, варьирующим от одних суток до одного года. Предпочительно, введение осуществляют один раз в неделю семь раз подряд и затем один раз в три недели.

Подходящую дозу можно корректировать в зависимости от различных параметров, в частности, способа введения, используемой композиции, возраста, состояния здоровья и массы тела хозяина, природы и степени выраженности симптомов, типа сопутствующего лечения и частоты проведения терапии.

Специалисты в области техники способны определить подходящее количество для каждого элемента в составе композиции по изобретению. Например, поксвирус можно применять в количестве от 10⁴ до 10⁹ pfu, последовательность голой нуклеиновой кислоты в количестве от 10 мкг до 20 мг, а антитело к CTLA4 в количестве от 10 нг до 20 мг на инъекцию.

Предпочтительно, композицию по изобретению можно применять в сочетании с лучевой терапией, химиотерапией, хирургическим вмешательством и/или дополнительными иммунотерапевтическими продуктами, такими как антитела к PD1 и PDL1, или с комбинацией множества указанных способов лечения одновременно.

Реферат

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтической композиции для развития противоопухолевого иммунного ответа, которая содержит по меньшей мере одну нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую по меньшей мере один специфический неоантиген опухолевой клетки, по меньшей мере одну вирусную частицу поксвируса и антитело к CTLA4 в эффективном количестве. Настоящее изобретение обеспечивает развитие противоопухолевого иммунного ответа. 12 з.п. ф-лы.

Формула