Материнские иммунные выделения и их применение для лечения и/или профилактики болезненных состояний человека - RU2239439C2

Чертежи

Показать все 9 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к терапии и профилактике болезненных состояний человека, характеризующихся снижением или утратой нормального слизистого выделения или его нормальных защитных свойств или к болезненным состояниям человеческого организма, чувствительным к действию таких слизистых выделений.

Под слизистым выделением здесь подразумеваются, среди прочего, слюна, слезы, носовые выделения, кишечные выделения и генитальные выделения.

Уровень техники

Слизистые выделения имеют различные свойства, включая способность к механической смазке и очистке, иммунологическую защитную функцию, буферную способность и способность к реминерализации зубов в том случае, когда слизистое выделение представляет собой слюну, а также могут использоваться как растворители для стимуляции нервной системы. Кроме смачивающих и смазывающих свойств, которые являются характерной особенностью мукополисахаридов (муцинов), слюна содержит большое количество специфических и неспецифических антимикробных агентов, которые регулируют содержание микрофлоры во рту.

Специфическая защита осуществляется секретируемыми иммуно-глобулинами, которые продуцируются иммунной системой и адресованно воздействуют на антигены клеточной поверхности в ответ на появление определенных видов микробов. Набор биологически активных молекул, некоторые из которых пока еще мало изучены, обеспечивают более общую защиту; они включают пептиды и белки, составляющие врожденную иммунную систему. Ферменты - лизоцим, сиалопероксидаза и амилаза участвуют в неспецифическом антимикробном действии слюны, так же как и агглютинирующие белки и пленкообразующие белки, а также лактоферрин, которые все имеются в слюнных выделениях.

Лактоферрин - это связывающий железо белок, эффективно удаляющий железо из питательной среды ротовой микрофлоры; он также модулирует всасывание железа в желудочно-кишечном тракте и обладает терапевтическим действием, предотвращая избыточное поступление этого металла.

Слюна играет фундаментальную роль в сохранении здоровья рта. Любое снижение нормального выделения слюны или содержания ее нормальных составляющих может иметь драматические последствия для здоровья рта человека и приводить к повышению частоты возникновения инфекции Candida, воспаления десен, периодонтита, зубного кариеса, изъязвлений и халитоза. Взаимоотношения между защитными и предохраняющими свойствами слюны и указанными выше инфекциями являются в основном профилактическими. Нормальное выделение слюны у здоровых людей не защищает полностью от появления любой инфекции, однако уменьшение или утрата нормального слюноотделения вызывает предрасположенность к увеличенной частоте заболеваний и рецидивов, ими вызванных.

Степень поражения какой-либо оральной инфекцией во многом зависит также от количества и качества слюны индивидуума. Считается, что воспаление десен и зубной кариес принадлежат к наиболее распространенным заболеваниям в мире; их всеобщее распространение заставляет большинство специалистов в области здравоохранения классифицировать их как следствие факторов гигиены или косметики. Тем не менее, у индивидуумов с серьезной потерей функции слюны зубной кариес может превращаться в развившуюся обезображивающую и ослабляющую болезнь, требующую серьезного вмешательства дантиста и других врачей.

Болезненное состояние утраты нормальной функции слюнных желез в медицине описано как ксеростомия или “синдром сухости во рту”. Это очень распространенное заболевание, вызываемое многими факторами. Многие пожилые люди страдают от прогрессирующей ксеростомии, часто являющейся результатом применения других медицинских препаратов - например, антивоспалительных препаратов, антигистаминов, анальгетиков, наркотиков, противогипертонических лекарств, диуретиков, психотропных и противопсихозных препаратов и лекарств против паркинсонизма. Ксеростомия является также особенностью синдрома Сьергена - аутоиммунного заболевания, родственного ревматоидному артриту. Некоторые наиболее неблагополучные индивидуумы - это лица, подвергшиеся радиотерапии опухолей головы и шеи, так как неизбежным побочным эффектом радиации является нарушение функции слюнных желез.

Хотя ксеростомию обычно описывают как “синдром сухости во рту”, она часто вызывает также сухость других областей слизистой оболочки, в особенности если это симптом синдрома Сьергена, независимо от его этиологии. Это болезненное состояние серьезно ухудшает комфортность жизни больных и ведет к повышенной частоте возникновения зубного кариеса, болезни десен, изъязвлений и молочницы.

Ксеростомия или другие болезненные состояния, приводящие к ослаблению выделительной функции слизистых оболочек, могут вызвать у человека предрасположенность к резкому повышению частоты возникновения ротовой молочницы, вызываемой патогенными дрожжами рода Candida. Эти предрасполагающие условия включают иммуносупрессивную, цитотоксическую и радиационную терапию, ВИЧ-инфекцию, лейкемию и диабет. Наименее очевидная и, возможно, наиболее распространенная предрасположенность к дрожжевой инфекции возникает при передозировке антибактериальных лекарств и стероидов.

Ротовая молочница или другие проявления этой инфекции - как, например, дрожжевой вагинит, вообще называют кандидиазом; наиболее типичный возбудитель - Candida albicans. Появление новых видов Candida у лиц, инфицированных ВИЧ и получавших ранее длительный профилактический курс противогрибковых лекарств для лечения ротового кандидиаза, было описано Coleman и др. AIDS. 1997. Т. 11, №5. С.557-567.

Более распространенные проблемы со здоровьем ротовой полости, включающие зубной кариес, воспаление десен, периодонтит и халитоз, обсуждаются ниже. Большинство людей подвергаются этим заболеваниям на некоторых этапах жизни, причем острота болезненного состояния зависит от многих факторов, включая специфические иммунные механизмы организма, генетические факторы, влияющие на образование зубной эмали и десен, факторы диеты и гигиены, влияющие на количество и тип заселяющих бляшки микроорганизмов. Хотя имеются некоторые противоречия в мнениях относительно микробной этиологии этих инфекций, хорошо известно, что в прогрессировании этих заболеваний участвуют специфические микроорганизмы. Например, имеются три группы микроорганизмов, обычно связанных с зубным кариесом, а именно Streptococci, Lactobacilli и Actinomycetes.

Для лечения болезненных состояний, проистекающих из ослабления или утраты нормального тока слизистой секреции или ее нормальных иммунных свойств, существует много способов терапии. Например, используют широкий спектр антибиотиков, включая антигрибковые препараты и антибактериальные препараты.

Антибиотики - антигрибковые или антибактериальные - следует применять умеренно, так как всегда есть риск развития у микроорганизма устойчивости к ним и перехода инфекции в не поддающееся лечению состояние. Большинство антибиотиков имеют побочные действия, ограничивающие их применение для радикального лечения, - от тошноты и расстройств желудочно-кишечного тракта до повреждений печени и нежелательного взаимодействия с другими лекарствами.

Применяемый для лечения ксеростомии пилокарпин, выделенный из растения Pilocarpus microphilus, является одним из наиболее эффективных среди доступных в настоящее время сиаловых препаратов. Для его применения необходимо индивидуально подбирать дозу, так как среди его побочных эффектов - слезоточивость, головокружение, потливость, ринит и нарушение резкости зрения. Пилокарпин действует на обмен холина на уровне мускариновых рецепторов и имитирует действие ацетилхолина на парасимпатичекие нервы. Ацетилхолин стимулирует секрецию воды и электролита; другой нейропереносчик, норадреналин, действует посредством симпатических нервов и стимулирует секрецию белка и макромолекул. Теоретически пилокарпин должен влиять только на секрецию воды и электролита. Однако имеется некоторая кросс-реактивность на клеточном уровне, где до определенной степени на секрецию жидкости и белка воздействует универсальный активатор - циклический аденозинмонофосфат. Однако качество слюны или другого слизистого выделения, являющегося ответом на действие пилокарпина, ограничено по содержанию в нем необходимых макромолекул, в особенности секреторных иммунных компонентов. Содержимое слюны, состоящее из секреторного иммуноглобулина и других иммунных компонентов, переносится из сыворотки через эпителий путем процесса эндоцитоза и экзоцитоза и является в основном продуктом малых мукоидных желез, на которые нейротрансмиттеры непосредственно не действуют.

Важно также отметить, что пилокарпин часто применяется для облегчения ксеростомии у индивидуумов, имеющих ослабленную иммунную систему из-за других факторов. Стимулирование секреции жидкости у таких пациентов не может исправить свойственную им утрату иммунного компонента.

Относительно просто можно приготовить насыщенный раствор солей кальция и калия, копирующий ионные компоненты слюны. Такой раствор уже выпускается фирмой Antigen Pharmaceuticals Limited под торговой маркой “Luborant” и содержит хлориды калия, магния и кальция, калий-фосфатные буферы, фторид натрия и карбоксиметилцеллюлозу. Производится также большое число реминерализующих продуктов, включая “Remodent” (товарный знак) - раствор костного кальция. Недостаток всех этих продуктов состоит в том, что тонкое равновесие насыщающих слюну веществ не копируется подходящими ингибиторами кристаллизации, активными в точках кариесного поражения. Поэтому велика опасность неконтролируемого отложения камня.

Большинство людей толерантны к белку куриных яиц (т.е. имеют хорошую переносимость этого белка), поскольку он регулярно потребляется в пищу, подобным же образом большинство людей толерантны к молоку различных жвачных животных.

Известно, что содержание специфических антител в молоке и яйцах можно повысить предварительной иммунизацией соответственно коров или кур. Благодаря своему пищевому происхождению, такие антитела обеспечивают привлекательный способ длительной пассивной иммунизации слизистых оболочек человека. Перспективность применения гипериммунного иммуноглобулина яиц для профилактики зубного кариеса описана Hatta H. и др. Caries Research. 1997, 31, с.268-278.

Европейский патент №А 0152270 раскрывает метод пассивной иммунизации млекопитающих к болезненным состояниям, вызванным антигеном, который заключается во введении млекопитающему иммунизирующих количеств антител, полученных из домашней птицы или рогатых жвачных, иммунизированных против данного антигена; при этом млекопитающие толерантны к антителам, благодаря предыстории потребления содержащего антитела материала, полученного из яиц домашней птицы или молока жвачных.

Заявка на Ирландский патент №65218 описывает применение секреторного иммуноглобулина из яиц и молока в качестве профилактического средства против инфекций, в особенности против инфекций эпителия слизистой оболочки Candida albicans. В этом документе описано, что фракции иммуноглобулина из яиц кур иммунизированных С. albicans, эффективно подавляют рост, адгезию на клетках ротовой полости и образование трубок гифы в лабораторных культурах вида С. albicans.

Применение иммуноглобулина яиц для пассивной иммунизации было позднее описано Ikemori и др. // American Journal of Veterinary Research. 1992, 53, с. 2005. Роль секреторных иммуноглобулинов и перспективность для иммунизации против Streptococcus mutans были продемонстрированы Mastecky и др. // J. Clin. Invest. 1978, 61, с.731-737.

По определению, процесс пассивной иммунизации направлен против определенных видов микробов и предназначен для их удаления, без воздействия на другие виды, которые могут также присутствовать. Как описано ранее, ротовая полость в частности и слизистая оболочка в общем подвергаются патогенной колонизации большим числом видов микробов. Трудно предсказать, будут ли какие-либо из известных патогенов, или все они, воздействовать на какого-либо из индивидуумов в определенное время, поэтому методы пассивной иммунизации лучше всего предназначены для профилактики и терапии специфических болезненных состояний.

Разумные основания применения пассивной иммунизации в поддержании здоровья слизистой оболочки связаны с потенциальной мимикрией естественных секреторных иммуноглобулинов, имеющихся в слизистой. Присутствие секреторного иммуноглобулина в человеческой слюне хорошо известно и изложено в обзоре Brandtzaeg // Human Saliva: Clinical Chemistry and Microbiology. Vol. 2. P. 1-55. Ред. J.Tenovuo. Изд. CRC Press, 1989. В этом же издании дан обзор J.Tenovuo, касающийся неиммуноглобулиновых защитных факторов слюны человека (с.55-93).

Неиммуноглобулиновые защитные факторы включают ферменты лизоцим, лактоферрин и сиалопероксидазу, а также другие природные компоненты иммунной системы. Врожденная иммунная система имеет широкий спектр антимикробной активности, не требующей предварительного контакта с антигеном, что необходимо для специфического, адаптивного ответа, в котором антитела являются главным компонентом.

Другими авторами описано присутствие в секретах слюны человека природных иммунных компонентов (Wolff и др. // J. Histochem. Cytochem. 1990, 38, с. 1531-1534). Высокая антимикробная активность была приписана наличию нескольких групп полипептидов, выделенных из слизистых секретов многих различных видов позвоночных и беспозвоночных (Mahada и др. // Gut. 1997, 40, с.161-163). Среди идентифицированных молекулярных факторов - магаинины, цекропины, дефензины, коллектины, а также богатые пролином и аргинином лептиды.

Возможность применения антимикробных пептидов в поддержании здоровья зубов дана в обзоре Miyasaki и Lehrer // Int. J. Antimicrobial Agents. 1998, 9, с.269-280. Авторы дают обширный список известных к настоящему времени антимикробных пептидов и данные об их происхождении, причем ни один из них не получен из молока или яиц.

Таким образом, имеется потребность в альтернативных и усовершенствованных способах лечения указанных выше болезненных состояний человека путем терапии и профилактики, лишенных побочных эффектов, присущих общепринятым способам лечения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предлагает применение материнского иммунного выделения, обладающего биологической активностью, характерной для слизистого выделения человека и обладающего переносимостью для людей, для производства лекарства для лечения и/или профилактики болезненного состояния человека, характоризующегося утратой указанного слизистого выделения или его нормальных биологических свойств, или состояния, чувствительного к указанному слизистому выделению.

Использованный здесь термин “человек” (“human”) может охватывать животных, находящихся в близком генетическом родстве с человеком, которым помогают описанные здесь терапевтические и профилактические способы лечения. -

Использованный здесь термин “материнское иммунное выделение” означает любое биологическое выделение, осуществляемое материнским родителем вида для защиты развивающегося зародыша или новорожденного. Примерами таких выделений являются жидкое содержимое куриного яйца или молоко коровы. Помимо питательных функций, эти жидкости передают пассивный иммунитет развивающемуся зародышу цыпленка или в желудок новорожденного теленка посредством их секреторных иммунных компонентов, включающих антитела, но не ограничивающихся ими.

Слизистое выделение может быть выбрано из слюны, слез, носовых выделений, кишечных выделений и генитальных выделений.

В последующем описании изобретение будет принципиально описано для случая определенного материнского иммунного выделения, а именно материала жидкости яиц, и его применения для лечения и/или профилактики болезненных состояний ротовой полости.

Так, один из аспектов настоящего изобретения представляет применение материнского иммунного выделения, имеющего биологическую активность, присущую человеческой слюне, к которому люди толерантны, для производства лекарства для лечения и/или профилактики болезненного состояния ротовой полости, характеризующегося утратой нормальной слюны или ее нормальных биологических свойств.

В том случае, когда материнское иммунное выделение представляет собой жидкость яиц, то жидкость яиц предпочтительно получают от домашних кур.

В одном из вариантов осуществления жидкость яиц получают из яичного желтка.

Предпочтительно яичный желток делипидизирован (из него удалены липиды).

В альтернативном исполнении жидкость яиц получают из яичного белка.

Врожденная иммунная активность яйца не ограничивается компонентами яичного желтка, белки яичного белка также проявляют антимикробную активность и подавляют как рост, так и адгезию микробов, и по этой причине они чрезвычайно полезны в имитировании характеристик слизистого выделения в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно яичный белок представляет собой яичный белок, очищенный от овальбумина (деовальбуминизированный яичный белок).

Для использования антимикробной активности белков яичного белка предпочтительно удалить его основной структурный компонент - овальбумин. Специалистам в данной области хорошо известны методы разделения белков. Пригоден любой обычный метод, основанный на гель-фильтрации, ионном обмене, селективном осаждении или иной препаративной хроматографической технике, если остаточные второстепенные компоненты могут быть выделены в количестве, приближающемся к их исходному содержанию в интактном яичном белке.

В следующем варианте осуществления, жидкость яиц представляет собой смесь делипидизированного желтка и деовальбуминизированного яичного белка.

Экстракт яичного желтка и экстракт яичного белка, в соответствии с данным здесь описанием, представляют собой богатый источник компонентов, подобных компонентам слюны и других слизистых выделений, включая (но не ограничиваясь ими): яичный лизоцим (литическая активность), овотрансферрин (связывание железа), авидин (комплексирование пектина с биотином), овомукоид (ингибирование протеиназ), муцин, лецитин и пероксидазную активность, так же как специфические и неспецифические иммуноглобулины и неспецифические антимикробные компоненты врожденной иммунной системы.

Подобные биологически активные ингредиенты имеются в экстракорпоральных выделениях многих позвоночных и в особенности в экстракорпоральных выделениях желез млекопитающих, включая молочные железы. Экстракорпоральные выделения представляют собой биологические жидкости, которые обновляют, укрепляют и защищают поверхность раздела между телом и внешним окружением. В случае выделений молочных желез и компонентов птиц, экстракорпоральные выделения являются также средством распространения такой защищаемой поверхности на новорожденного.

Согласно следующему примеру осуществления выделение представляет собой молоко, в особенности козье молоко.

Подобным же образом молоко любого жвачного содержит выделяемые материнским животным секретируемые иммунные компоненты. Колострум, первое молоко после родов, в особенности богато иммуноглобулином; в природе оно предназначено для передачи новорожденному пассивного иммунитета до последующего созревания у новорожденного дремлющей иммунной системы. Подобно яйцам, молоко и в особенности колострум содержат секреторные антитела, специфичные ко всем антигенам, с которыми встречалось материнское животное.

Выбор яиц домашней птицы и молока коровы или козы дает удобный источник этих компонентов. Поскольку эти материалы являются обычно потребляемыми в пищу продуктами, они значительно более доступны, чем, например, ослиное молоко или голубиные яйца, хотя последние также представляют собой полностью адекватный источник подобного материала для применения в соответствии с настоящим изобретением.

Как указано выше, эти выделения названы здесь “материнское иммунное выделение”. Экстракты из такого выделения могут быть применены для копирования необходимых компонентов слизистого выделения человека и могут быть применены, в соответствии с настоящим изобретением, для терапии и/или профилактики болезненных состояний человека, характеризующихся, при всем прочем, ослаблением или утратой нормального тока выделений слизистых оболочек или их нормальных защитных свойств.

Термин “профилактика” использован здесь в том смысле, что он охватывает применение материнского иммунного выделения для производства лекарства, которое может быть применено для увеличения или фактического замещения нормального слизистого выделения.

Лекарство, предназначенное для применения в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой смесь биологически активных ингредиентов природного происхождения, которая имитирует действие полноценного слизистого выделения, в особенности путем замены иммунных компонентов (как специфических, так и неспецифических), смазывания и увлажнения муцинов и при необходимости копированием слюнных ингибиторов кристаллизации фосфата кальция. Эта смесь может копировать известные биологические функции полноценных слизистых выделений, используя возникающие естественным путем реплики их макромолекулярных составляющих, и как таковая она полезна для длительного профилактического использования в описанных здесь применениях для целей здравоохранения.

Под лекарством здесь подразумевается также специальная пищевая рецептура.

Например, описанные здесь лекарства могут быть включены в рецептуры детской молочной смеси в терапии или профилактике желудочно-кишечных инфекций.

Предпочтительно материнское иммунное выделение содержит составляющие его врожденной иммунной системы.

Врожденная иммунная система отличается от специфической или адаптивной иммунной системы тем, что компоненты врожденной иммунной системы не специфичны по отношению ни к одному микробному виду или антигенному типу и не требуют никакого предварительного контакта (иммунизации) для проявления защитной реакции.

Далее, предпочтительно, чтобы антитела, содержащиеся среди компонентов врожденной иммунной системы, были представлены природными неиммунизированными антителами.

Затем, предпочтительно, чтобы антитела, содержащиеся среди составляющих врожденной иммунной системы, включали в себя полиспецифические антитела.

Материнское иммунное выделение может быть усилено для специфических применений путем иммунизации животного перед сбором выделения, однако это обычно не требуется.

Таким образом, материнское иммунное выделение или его часть могут быть получены от гипериммунизованного животного.

Предпочтительно, если лекарство в соответствии с настоящим изобретением представляет собой реплику слюны, чтобы оно содержало в качестве своего составляющего фракцию иммуноглобулинов, имитируя таким образом секреторные IgА и IgG человеческой слюны. При необходимости иммунные свойства могут быть усилены с помощью вакцинации донорского животного антигенами, полученными из любого патогена ротовой полости или из их комбинации:

- виды Streptococcus: mutans, rattus, cricetus, sobrinus, ferus, macacae, downei или его серотипы, sanguis, oralis, mitis, salivarius, vestibularis;

- виды Lactobacillus: rhamnous, acidophilus и caseii;

- виды Actinomyces: israelii, naeslundii и viscosus;

- виды Crapnocytophaga: sputigena, ochracea и gingivalis;

- Fusobacterium nucleatum;

- Actinobacillus actimomycetemcomitans;

- виды Candida: albicans, dublinensis, glabrata, tropicalis krusei, kefyr и среди других stellatoidae.

Как указывалось выше, в одном из осуществлении изобретений лекарство представляет собой реплику указанного слизистого выделения человека.

Чтобы разработать эффективные рецептуры для профилактики и терапии слизистой оболочки, необходимо скопировать по возможности наиболее полно все свойства природных выделений. Наиболее желательные рецептуры включают широкий спектр антимикробной активности без полного антисепсиса, что позволяет предотвратить чрезмерное расселение вредных патогенов и в то же время способствовать восстановлению равновесия природной микрофлоры. Слюна в естественном процессе способствует росту природной микрофлоры ротовой полости и в то же время подавляет чрезмерное микробное заселение слизистой оболочки (см. Saliva and Oral Health. Ред. Edgar и O'Mullane. Изд. British Dental Association. C.100-101). Для поддержания здорового состояния слизистой оболочки главными являются смачивающее и смазывающее свойства природных выделений, а в случае слюны наиболее важной для сохранения зубной эмали является уникальная способность регулировать кристаллизацию кальция. Желательно также, чтобы разработанные для длительной профилактики рецептуры не обладали побочным действием, характерным для обычных антибиотиков или антисептиков.

Предпочтительно, чтобы указанное выделение было обогащено одним или более из его врожденных иммунных составляющих.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает применение для профилактики или терапии вышеупомянутых болезненных состояний в составе материнских иммунных выделений или их реплик, как будет здесь детальнее описано ниже:

1) неиммунизированнных “природных” или “примитивных” антител;

2) комбинаций компонентов врожденной иммунной системы, которые факультативно включают неиммунизированные антитела; и

3) комбинаций компонентов врожденной иммунной системы с иммунизированными (гипериммунными) антителами.

В соответствии с приведенным описанием можно усилить действие материнского иммунного выделения или его реплики при необходимости путем экстракции различных составляющих врожденной иммунной системы из материнского иммунного выделения с последующим обогащением материнского иммунного выделения или его реплики смесью экстрагированных составляющих иммунной системы или каждым из экстрагированных составляющих иммунной системы в отдельности. Таким образом, в результате такой процедуры можно получить природный или “фоновый” иммуноглобулин с активностью, которая приближается к активности гипериммунного иммуноглобулина.

Обычно в соответствии с настоящим изобретением белки врожденной иммунной системы экстрагируют и обогащают из яичного желтка, что основано на их биологической способности к адгезии на поверхности микробной клетки. Для использования в такой связи пригодны пекарские дрожжи, так как они применяются в пищевых продуктах. Составляющие врожденной иммунной системы, имеющие сродство к микробной клетке, адгезируют на дрожжах и выделяются центрифугированием. Компоненты врожденной иммунной системы могут быть десорбированы с дрожжей путем изменения рН и ионной силы. Благодаря полиспецифической природе врожденной иммунной системы компоненты из фракций, десорбированных с пекарских дрожжей, сильно адгезируют на многих видах микробов и таким образом ингибируют адгезию этих видов микробов на клетках эпителия слизистых оболочек.

Удаление из желтка липидной фракции не является необходимым, но это повышает выход и облегчает измерение содержания белка. При необходимости липиды яичного желтка могут быть удалены с применением для их растворения надкритической двуокиси углерода, или же их можно более просто удалить, разбавляя яичный желток девятью объемами дистиллированной воды и замораживая в течение 24 ч при -70°С. После оттаивания липидную фракцию отделяют центрифугированием. Супернатант процеживают сквозь муслиновую ткань для удаления фракций липидов низкой плотности, которые всплывают.

Микробные клетки могут быть эффективно использованы в качестве "приманки” для белков врожденной иммунной системы. Таким образом можно повысить содержание этих белков в целом, используя метод, основанный на их биологической способности к адгезии на поверхности микробных клеток; это позволяет одновременно экстрагировать и обогащать все типы молекул, имеющих это свойство.

Кроме использования микробных клеток самих по себе, можно также использовать компоненты клеточных стенок подходящих видов микробов, связанные с инертной поверхностью - как, например, с полистирольными гранулами.

Яичный желток является сложной структурой, состоящей из гранул и сферических телец, суспендированных в водном растворе белка (плазмы), отделенной от яичного белка желточной мембраной. Макромолекулярные составляющие желтка представлены липидами, белками, липопротеинами и фосфопротеинами, олигосахаридами и гликопротеинами, с различной растворимостью в воде и различной степенью сродства друг к другу, так что некоторые из них агрегированы в сферические тельца. Обширный обзор по яичным белкам дан в Egg Science and Technology. Ред. Staedelman и Cotterill. Изд. Hayworth, ISBN №156022 8555. С.105-175.

Водорастворимые белки плазмы яичного желтка были классифицированы как альфа-, бета-, гамма- и дельта-ливетины, что соответствует сывороточным белкам цыпленка. Отмечено {Chang Р. К. и др. // J. Food Sci. 1970. 35. С.87-88), что в освобожденном от липидов экстракте желтка идентифицируются 19 отдельных белков, при этом в альфа- и бета-фракциях обнаруживаются 9 белков; гамма-фракция представляет собой одиночный белок, соответствующий сывороточному гамма-глобулину. В 1969 г. Leslie G.A. и Clem L.W. (// J. Exp. Med. Т. 130. С. 1337-1352) идентифицировали белок гамма-глобулин как иммуноглобулин IgY.

С помощью изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) можно показать, что компоненты врожденной иммунной системы, десорбированные с пекарских дрожжей, содержат до 11 отдельных белковых зон; два из этих белков в сильной степени фосфорилированы или гликозилированы, так как они визуализуются только с помощью окраски нитратом серебра или амидочерным. По крайней мере одна из зон ИЭФ соответствует гамма-глобулину (антителам), а остальные не являются иммуноглобулиновыми белками.

Как описано выше, состав врожденной иммунной системы не ограничивается только компонентами яичного желтка, но включает также и компоненты яичного белка. Индивидуальные составляющие врожденной иммунной системы можно фракционировать с помощью любого из методов, обычно применяемых специалистами в данной области для получения очищенных компонентов, обладающих дискретными биологическими функциями.

Очищенные фракции включают белки, липопротеины, пептиды, пептидогликаны, липиды, углеводы, олигосахариды или любые другие макромолекулярные компоненты или комбинации компонентов, проявляющие биологические свойства, подобные свойствам иммунного выделения.

При применении компонентов врожденной иммунной системы для создания синтетической слизистой или для других профилактических применений в воздействии на слизистую оболочку человека в соответствии с описанным здесь, может оказаться необходимым стандартизовать относительную концентрацию каждого из этих компонентов. Стандартизация может быть достигнута путем очистки определенных количеств каждого компонента и их добавления обратно в порцию деовальбуминизированного яичного белка, или делипидизированного яичного желтка, или их экстрактов.

Таким образом, далее более детально описываются биологические свойства компонентов яиц и молока, которые имитируют функции слюны и которые могут быть экстрагированы, очищены и заново скомбинированы для получения реплики (отпечатка) слюны, что далее называется “реплика слюны”.

Не претендуя на то, чтобы быть связанными какими-либо теоретическими объяснениями изобретения, следует отметить, что неспецифические иммунные составляющие - такие, как олигосахариды - могут усиливать действие других составляющих, включая иммуноглобулины, вызывая конъюгацию индивидуальных компонентов и облегчая таким образом комбинированные воздействия на поверхность микробных клеток.

Идентифицированная врожденная иммунная система яиц включает следующие составляющие, имитирующие подобные факторы в человеческой слюне:

Лизоцим: Яичный белок богат ферментом лизоцимом, и этот его компонент может быть легко экстрагирован и очищен. Слюна обычно содержит около 100 мг лизоцима в литре. Хорошо известно, что антимикробная функция этого фермента состоит в гидролизе муреина бактериальной клеточной стенки, в особенности в грамположительных бактериях, включая Streptococcus mutans, что приводит к лизису клеток в гипотонических растворах. Считается также, что лизоцим усиливает действие секреторного иммуноглобулина.

Лактоферрин: Слюна содержит в литре 10-20 мг этого связывающего железо белка, который, как было показано, удаляет железо, предотвращая его использование ротовой микрофлорой в качестве питания. Яичный белок содержит около 13% овотрансферрина, который, как теперь известно, структурно и функционально подобен лактоферрину слюны и ферритину человеческой плазмы.

Ингибирование фактора роста: Tenovuo J.O. (1989) (см. выше) предположил наличие в слюне связывающих факторов, подобных лактоферрину, но активных в удалении витамина В12. Яичный белок содержит авидин, который, как известно, связывает биотин до такой степени, что это способно вызывать у крыс питательный дефицит по этому витамину. Биотин является необходимым фактором роста для Candida albicans и других патогенных видов дрожжей {Odds F.C. Candida and Сandidosis. С.13).

Ингибирование ферментов: Известно также, что слюна содержит целый ряд ингибиторов ферментов. Так, было показано, что в слюне содержатся цистатины-ингибиторы активности бактериальной протеазы (Saitoh Е. и Isemura S. // Crit. Rev. Оral Вiol. Med. 1993, 4, С.487-493). Наряду с цистатинами, яичный белок содержит ингибиторы трипсина, известные как овомукоид, которые являются мощными протеолитическими ингибиторами, похожими на цистатины и другие компоненты слюны.

Ливетины: Неспецифические и полиспецифические составляющие яичного желтка, включая гамма-ливетин, которые действуют подобно секреторным антителам, связываясь с поверхностью микробных клеток и создавая таким способом молекулярный барьер, предотвращающий их адгезию на тканях организма-хозяина.

Копированные свойства слюны и других слизистых выделений, соответственно описанному здесь, включают (но не ограничиваются ими):

- специфические и неспецифические/полиспецифические иммунные свойства секретируемого иммуноглобулина;

- врожденные иммунные свойства лизоцима, сиалопероксидазы, гистатинов, муцинов, адгезинов, дефензинов, магаининов, коллектинов и цекропинов;

- свойство овомукоида и других факторов ингибировать протеолитическую активность;

- свойство лактоферрина, авидина и других удаляющих ростовые факторы агентов осуществлять метаболическую регуляцию;

- свойства статеринов, богатых пролином белков (БПБ) и фосфопротеинов ингибировать кристаллизацию кальция и формирование пленки;

- увлажняющие и смазывающие свойства муцинов и гликопротеинов;

- реминерализующие свойства карбоната кальция;

- буферные свойства фосфатов кальция и калия; и

- питательные для микробов свойства глюкозы, мочевины и свободных аминокислот.

Реплика слюны может быть распространена в соответствии с настоящим изобретением на профилактику и терапию ротовой инфекции.

Для адресованного воздействия на специфические микроорганизмы могут быть приготовлены специфические рецептуры с повышенной концентрацией индивидуальных составляющих.

С составляющими врожденной иммунной системы, экстрагированными в соответствии с данным описанием, можно также комбинировать специфические иммуноглобулины, полученные от гипериммунизированных нужными антигенами животных.

Рецептуры против дрожжей Candida в соответствии с настоящим изобретением обычно содержат сочетания специфических противокандидных иммуноглобулинов с повышенной концентрацией авидина. Авидин в таких составах связывает биотин - необходимый фактор роста Candida. Повышение в таких составах концентрации овотрансферрина с целью извлечения железа лишает клетки дрожжей как железа, так и биотина, что приводит к значительному повышению антимикробной активности.

Следует учитывать, что такие рецептуры эффективны в лечении кандидоза вообще и в особенности вагинальной молочницы.

Рецептуры против халитоза в соответствии с настоящим изобретением обычно содержат комбинации специфических иммуноглобулинов к грамотрицательным анаэробным микроорганизмам (с которыми обычно связана протеолитическая активность во рту), включая Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Bacteroides forsynthus и Fusobacterium, а также овомукоид, ингибирующий протеолитическую активность этих организмов.

Повышение концентрации лизоцима в вышеуказанных рецептурах еще более повышает антимикробную активность, даже против грамотрицательных организмов, на которые лизоцим сам по себе обычно не действует.

Антибляшковые рецептуры в соответствии с настоящим изобретением обычно включают комбинации иммуноглобулинов, специфических для вида Streptococcus mutans, вместе с повышенной концентрацией лизоцима, который обладает сильным литическим действием на эти грамположительные кокки.

Повышенная концентрация каждого из идентифицированных выше индивидуальных компонентов реплики слюны означает количество указанного компонента, которое увеличено по отношению к его количеству в реплике слюны путем добавления экстракта этого компонента к порции реплики слюны. Предпочтительно количество добавленного авидина не должно превышать 1 мг/мл, а количество добавленного лизоцима или овотрансферрина не должно превышать 5 мг/мл.

Для вышеуказанных рецептур предпочтительно, хотя и не является необходимым, чтобы смеси были приготовлены в разбавленном растворе водного экстракта цельного яйца.

Было показано, что действие индивидуальных составляющих, которые обладают характеристической биологической активностью, усиливается разбавленным водным экстрактом цельного яйца. Не связывая себя какими-либо теоретическими объяснениями этого, предполагается, что определенные водорастворимые компоненты действуют как агрегирующие факторы, способствующие конъюгации индивидуальных компонентов на поверхности микробной клетки.

Составляющие реплики слюны по настоящему изобретению, будучи обычно составляющими яиц домашней птицы, которые были экстрагированы, очищены и заново объединены в рецептуре со специфическими свойствами, зависящими от их намеченного применения, должны быть в форме, наиболее подходящей для данного применения. Активные ингредиенты могут быть в форме высушенного вымораживанием порошка, предназначенного для введения в зубную пасту, или же они могут быть объединены в жидкую форму, предназначенную для полоскания рта. Они могут быть также инкапсулированы или эмульгированы в мази или в полимере для применения в качестве покрытия нитки для чистки зубов или в качестве фиксаторов для зубных протезов. Другие подходящие рецептуры включают зубные вкладыши и пастилки.

В любом препарате, предназначенном для применения по настоящему изобретению, различные составляющие могут быть смешаны с наполнителями, предназначенными для усиления адгезии активных составляющих в ротовой или другой слизистой оболочке или для осуществления длительного или контролируемого высвобождения составляющих в намеченном месте действия.

В предпочтительном осуществлении для орального применения рецептура активных ингредиентов представлена в рецептуре жевательной резинки для длительного высвобождения.

Лекарства, приготовленные из материнского иммунного выделения в соответствии с настоящим изобретением, могут применяться при многих болезненных состояниях и заболеваниях ротовой полости.

Рецептуры реплики слюны, предназначенные для применения в соответствии с данным изобретением, могут применяться для общей профилактики зубного кариеса и заболеваний десен у лиц без предрасположенности к другим заболеваниям ротовой полости, или же они могут быть составлены более специфическим образом, чтобы дополнить нормальный ток слюны при рецидивирующих инфекциях - как, например, молочница у здоровых во всех других отношениях индивидуумов. Реплика слюны может быть также составлена таким образом, чтобы полностью заменить ослабленное в смысле иммунитета содержимое нормальной слюны у индивидуумов с дефектным иммунитетом. Реплика слюны может быть также составлена таким образом, чтобы дополнить или полностью заменить ослабленную функцию слюнных желез при ксеростомии. Возможны также более специфические рецептуры, включающие индивидуальные компоненты - такие, как ингибиторы протеаз (овомукоид) при бактериальном халитозе.

Как указано выше, описанные здесь лекарства могут применяться для лечения и/или профилактики ротовой инфекции.

Например, лекарства могут применяться для профилактики и терапии ротовой молочницы, которая может быть рецидивирующей инфекцией, вызванной ксеростомией.

Лекарство в соответствии с изобретением может также применяться для профилактики зубного кариеса.

Описанные здесь лекарства могут быть также применены для лечения и/или профилактики болезненного состояния ротовой полости, характеризующегося воспалением десен.

Дополнительно лекарства, описанные здесь в соответствии с изобретением, могут применяться для лечения и/или профилактики халитоза.

В случае ротовой ксеростомии и халитоза предпочтительными формами являются зубные эликсиры и жевательная резинка, как указано выше.

Описанные здесь лекарства могут быть применены также для облегчения последствий определенных метаболических нарушений.

Так, описанные здесь лекарства могут быть применены для ограничения усваивания железа из пищи.

Слюна является жевательной смазкой и смачивает всю пережевываемую пищу. Достоверно установлено, что роль слюнной амилазы состоит в том, что она обычно служит для инициирования расщепления крахмала во рту. Менее понятно взаимодействие с пищей других составляющих слюны, в особенности их роль в модуляции абсорбции ингредиентов пищи. Предполагается, что роль лактоферрина в регуляции усвоения железа имеет значение для лиц, страдающих гемохроматозом, у которых утрачен регуляторный контроль количества поглощаемого железа, что приводит к избыточному накоплению железа. Лекарство для минимизирования усвоения железа из пищи может быть специально составлено путем повышения содержания овотрансферрина и фосвитина.

Таким образом, способность овотрансферрина и фосвитина связывать железо может быть использована для удаления железа из пищи, ограничивая таким образом его доступность для связывания организмом, что может быть необходимо для лечения гемохроматоза. Добавление к таким составам ингибитора протеолитической активности, овомукоида, дополнительно ингибирует расщепление комплекса овотрансферрина с железом трипсином, что еще больше ограничивает усвоение с пищей этого элемента.

Подобным же образом оказывается, что в регуляции получения с пищей аллергенов играет роль секреторный IgА. Лекарства в соответствии с данным изобретением могут быть применены для ингибирования поступления в организм компонентов пищи, которые могут вызывать у некоторых индивидуумов аллергию. Иммуноглобулиновая фракция может быть специально предназначена для воздействия на эти компоненты путем иммунизации донорских животных против специфических аллергенов, и это таким образом минимизирует всасывание таких аллергенов через кишечник.

Таким образом, возможно применение лекарств в соответствии с данным изобретением для воздействия на поступление определенных компонентов из пищи.

Кроме того, лекарства могут содержать одну или более из неорганических солей, типичных для слюны человека.

Терапевтические свойства реплики слюны в соответствии с данным изобретением могут быть еще более усилены введением растительных экстрактов, известных своими укрепляющими свойствами в поддержании здоровья рта.

Таким образом, лекарства, описанные здесь в соответствии с данным изобретением, могут вводиться одновременно, раздельно или последовательно с растительным экстрактом, который усиливает действие указанного выделения.

Полезно, чтобы растительный экстракт был получен из Vaccinium myrtilis, Zea mais, Melissa officianalis или Pilocarpus microphilus.

Научная литература и фармакопейная библиография подтверждают терапевтическое значение экстракта V. myrtilis в поддержании здоровья рта: Мorazzoni Р. и Bombardelli Е. // Fitoterapia. 1996, LXVII, с.1.

Антоцианины, содержащиеся в этом экстракте, проявляют следующую активность:

- стимуляция биосинтеза мукополисахаридов;

- стимуляция биосинтеза гликозаминогликанов.

- противовоспалительное действие вследствие снижения капиллярной проницаемости - по-видимому, из-за сшивания коллагена, что приводит к появлению устойчивости к коллагеназной активности.

Общие вяжущие свойства стандартизованного экстракта вызывают повышенное выделение слюны и слизистой секреции во рту.

Было достоверно продемонстрировано, что розмариновая кислота из Melissa officionalis (лимонный бальзам) обладает терапевтической эффективностью при лечении простого герпеса (Herpes simplex): Wolbling G.H. и Leonhardt К. // Рhytomedicine. 1994, 1, с.25-31.

Было отмечено, что неомыляющаяся фракция Zea mais стимулирует альвеолярный рост костей за счет стимуляции остеобластных клеток и вследствие этого полезна для возмещения утраты костной ткани при периодонтите (Nuova Linnеа За, Locarno, Switzerland).

Лекарство пилокарпин обычно дают в форме капсул пациентам, страдающим ксеростомией, три раза в день по 5 мг. Лекарство представляет собой холинэргический агонист и действует, повышая продукцию жидкости с небольшим увеличением содержания макромолекулярных компонентов, которые необходимы для биологической функции слюны. Часто наблюдаются побочные эффекты такой терапии, включающие потение, слезоточивость и тошноту. Обычно для минимизации таких побочных эффектов дозу подбирают индивидуально; индивидуальная эффективная доза может варьироваться от 1 до 15 мг три раза в день.

Растение известно южноамериканским индейцам под названием Joborandi, они обычно жуют его, пользуясь его сиалогенными свойствами. Введение пилокарпина в жевательную резинку облегчает контроль индивидуальной дозы, подобно тому, как это облегчается для людей, использующих вместо курения никотиновую жевательную резинку. Введение в жевательную резинку описанных здесь экстрактов выделений материнской иммунной системы вместе с пилокарпином обеспечивает увеличение количества жидкости и макромолекулярных составляющих, необходимых для копирования естественной слюны.

В следующем аспекте данное изобретение представляет рецептуру для применения в лечении и/или профилактике болезненного состояния ротовой полости, характеризующегося утратой нормальной слюны или ее нормальных биологических свойств, которая содержит материнское иммунное выделение, пределенное здесь выше, и полиол.

Предпочтительно полиол выбран из эритритола, маннитола, сорбитола и ксилитола.

Известно, что такие полиолы используются в продуктах для зубной гигиены и препятствуют микробной конверсии пищевых углеводов, что предотвращает образование кислоты в зубных бляшках.

Предпочтительно далее, чтобы рецептура была в форме жевательной резинки, таблетки, зубного эликсира или зубной пасты.

В следующем аспекте изобретения предлагается состав для применения в лечении и/или профилактике болезненного состояния человека, характеризующегося утратой слизистого выделения, продуцируемого человеком, или его нормальных биологических свойств, или состояния, чувствительного к указанному слизистому выделению, причем указанный состав содержит врожденный иммунный материал материнского иммунного выделения, имеющий биологическую активность, характерную для указанного иммунного выделения.

Лекарства для применения в соответствии с данным изобретением могут вводиться или применяться в любой форме, эффективной для достижения необходимого терапевтического или профилактического эффекта.

Рецептуры, описанные выше, обычно представляют собой рецептуры, пригодные для лечения ротовой полости. Однако необходимо учитывать, что другие применения могут включать рецептуры для введения в рот, парэнтерального введения и местного применения, носовые аэрозоли, маточные кольца и суппозитории.

В случае болезненных состояний глаз можно применять глазные капли, мази, глазные имплантаты и т.п.

Условия, чувствительные к материнскому иммунному выделению, включают лечение ран и ссадин, ожогов и кожных инфекций.

Так, описанные здесь лекарства могут быть введены в перевязочные средства.

Типичные кожные инфекции, которое можно лечить в соответствии с изобретением, включают простудные болячки, дерматит, прыщи и перхоть.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 представляет собой гистограмму, показывающую число клеток С. albicans, адгезированных на клетках эпителия ротовой полости в присутствии только одного обогащенного белка яичного желтка или в комбинации с де-овальбуминизированным яичным белком по сравнению с гипериммунным противокандидным иммуноглобулином и контролем, как описано в примере 6.

Фиг.2 - гистограмма зависимости оптической плотности (ОП) при 600 нм от дозы деовальбуминизированного яичного белка (в мг/мл) в культуральной среде через 9 час после инокуляции, как описано в примере 7.

Фиг.3 - гистограмма зависимости ОП при 600 нм от дозы деовальбуминизированного яичного белка (в мг/мл) в культуральной среде через 9, 12 и 15 час после инокуляции, как описано в примере 7.

Фиг.4 - график зависимости ОП при 600 нм от времени (в час), показывающий рост С. albicans на дрожжевой азотной среде с 2% глюкозы, дополненной лизоцимом (1 мг/мл), овотрансферрином (1 мг/мл) или авидином (0,1 мг/мл) или их комбинациями, как описано в примере 7.

Фиг.5 - график зависимости ОП при 600 нм от времени (в час), показывающий рост С. albicans на дрожжевой азотной среде с 2% глюкозы, дополненной деовальбуминизированным яичным белком (1 мг/мл) или комбинацией овотрансферрина (0,25 мг/мл), лизоцима (1 мг/мл) и авидина (0,05 мг/мл).

Фиг.6 - комбинированный график, показывающий зависимость утраты кальция из насыщенного раствора (в % от концентрации насыщенного раствора) от времени (в мин) в присутствии слюны, врожденных иммунных составляющих яйца и контроля, как описано в примере 9.

Фиг.7 - набор графиков зависимости ОП при 600 нм от времени в час), показывающих рост St. mutans в 80% среде SBNB с различными концентрациями ксилитола и врожденных иммунных компонентов яйца, как описано в примере 10.

Фиг.8 - серия гистограмм, показывающих зависимость ОП при 600 нм от увеличения концентрации деовальбуминизированного яичного белка (в мг/мл) и деовальбуминизированного яичного белка в присутствии ксилитола (0,5 мг/мл), как описано в примере 10.

Фиг.9 - набор графиков зависимости ОП при 600 нм от времени (в час), показывающих рост Sf. mutans в 80% среде SBNB в присутствии различных полиолов (0,5%) и экстракта врожденной иммунной системы яйца (0,075%), как описано в примере 10.

Фиг.10 показывает относительный процент адгезии St. mutans на гранулах оксиапатита в присутствии белков врожденной иммунной системы из яиц и молока в сравнении с гипериммунным анти-St.mutans IgY, как описано в примере 12.

Далее изобретение будет иллюстрировано следующими примерами.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1

Этот пример показывает, как водная фракция цельного яйца ингибирует связывание Streptococcus mutans с насыщенной слюной экспериментальной зубной эмалью (гранулы оксиапатита). Пока остается неизвестным, является ли ингибирование результатом конкурентного связывания со слоем пленки, или это специфическое ингибирование.

Приблизительно 100 мл слюны собирали на льду от одного индивидуума в течение 2 час; ток слюны стимулировали жеванием пленки “Parafilm” (Parafilm -товарный знак).

Экстракт яйца готовили следующим образом: разбивали одно яйцо в 1 л стерильной дистиллированной воды, перемешивали встряхиванием в течение 1 мин и оставляли стоять в холодильнике в течение 12 час. Водорастворимую фракцию сливали с нерастворимого осадка и использовали, как описано далее. Одну половину образца слюны разбавляли физиологическим солевым раствором, другую половину разбавляли водной фракцией неспецифического экстракта куриного яйца. Обе фракции стерилизовали фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм.

К каждой фракции объемом 50 мл добавляли 1 г гранул оксиапатита (фирмы BDH) и оставляли увлажняться в течение 12 час. Обе фракции инокулировали суспензией культуры Streptococcus mutans, выращенной на сахарозо-кровяном агаре в атмосфере азота, обогащенного двуокисью углерода (чтобы стимулировать продукцию внеклеточных полисахаридов) и инкубировали в течение 12 час при 30°С.

Гранулы из обоих образцов промывали дважды равными объемами стерильного физиологического солевого раствора и окрашивали по стандартной методике Грама. Поскольку гранулы оксиапатита захватывают небольшое количество красителя, грамположительные кокки на гранулах хорошо различимы под микроскопом. По субъективной оценке очевидно, что экстракт яичного желтка ингибирует адгезию St. mutans, т.к. гранулы, подвергнутые действию только слюны, содержали примерно в 100 раз большее количество видимых клеток.

Тот факт, что водный экстракт из неиммунизированных яиц ингибировал адгезию St. mutans на оксиапатите в присутствии белков слюны, требует дальнейшего исследования. Возможно, что яйца содержат следовые количества иммуноглобулина к видам стрептококков вследствие прижизненного контакта кур с этим микроорганизмом. Другая возможность состоит в том, что компоненты яичного желтка, которые, как показано ниже, ингибируют осаждение кальция, могут также связываться с компонентами слюны - статерином и БПБ, что создает стерические препятствия для последующего связывания St. mutans. Возможно также, что врожденные иммунные компоненты яиц участвуют в подавлении адгезии.

Пример 2

Этот пример демонстрирует, что водорастворимая фракция цельного яйца способна ингибировать осаждение кальция.

Водорастворимый экстракт цельного яйца готовили, как описано в примере 1. Температуру яичного раствора поддерживали, помещая раствор в водяную баню при 20°С. К неочищенному раствору яйца добавляли бикарбонат кальция до получения насыщенного раствора; образовывался осадок, который объединялся с нерастворенным карбонатом кальция на дне флакона. Через 12 час прозрачный супернатант (образовавшуюся сверху в результате отстаивания фракцию) сливали в свежий флакон и выдерживали при 20°С в водяной бане. Подобный же раствор готовили из дистиллированной воды и карбоната кальция без яйца, причем супернатант так же сливали с нерастворенных кристаллов. Оба раствора помещали в открытые сверху стаканы на 500 мл, каждый из которых содержал 500 мг гранул оксиапатита (BDH) в качестве инициаторов кристаллизации. Растворы выдерживали в водяной бане при 20°С в течение 3 суток, и в течение этого периода наблюдали скорость кристаллизации. Кристаллизация наблюдалась через 24 часа в растворе, не содержавшем экстракта яиц, и не обнаруживалась в растворе яиц вплоть до 60 час. Эксперимент был повторен троекратно с одинаковым результатом.

Неясно в точности, почему яйцо обладает способностью ингибировать кристаллизацию. Можно предположить, что это - биологический механизм с многими сферами применения, включая отложение кальция в скорлупе или в развивающемся зародыше цыпленка. Какова бы ни была причина наблюдаемого свойства, это приводит к очевидному применению в составлении рецептур продуктов, заменяющих слюну.

Пример 3

Реплика человеческой слюны, разработанная как главное профилактическое средство в поддержании здоровья рта

Желток яйца неиммунизированных кур используется в этом примере как исходный материал для описанной выше цели. Полную водорастворимую фракцию очищают только удалением фракции холестерина. Это достигается одним из стандартных промышленных методов; жидкая двуокись углерода с успехом применяется в пищевой промышленности и обеспечивает очень удобный способ удаления липидов и жирорастворимых фракций из водного раствора яичного желтка без повреждения белковой фракции. Полученную водорасторимую фракцию, содержащую фракции иммуноглобулина и неспецифические иммунные составляющие, подвергают сушке вымораживанием.

Высушенный вымораживанием грубый экстракт может быть введен в любую подходящую систему доставки, включая жевательную резинку, и применен для получения общего профилактического эффекта в поддержании здорового состояния рта, как здесь описано выше.

Пример 4

Реплика слюны, предназначенная для общей профилактики в поддержании здоровья рта

Домашние куры могут быть иммунизированы с использованием любого из указанных выше микробных антигенов или их комбинации, или любого антигена, вызывающего заболевание при абсорбции во рту. Когда титр антител в яйцах достигает максимума, яйца собирают и производят очистку иммунных составляющих.

Используя стандартные промышленные методы фракционирования белков, включая метод гель-фильтрационной хроматографии, можно разделить компоненты водорастворимой фракции яичного белка. Специфические фракции, содержащие лизоцим, овотрансферрин, авидин и овомукоид, могут быть дополнительно очищены с использованием ионообменной хроматографии и техники молекулярных сит. Могут быть выделены также фракции специфических гликопротеинов, содержащие муцины и агглютинирующие белки.

Как из желтка, так и из белка были выделены фракции, дающие ингибирование кристаллизации кальция, что указывает на то, что либо это -различные молекулярные образования с похожими свойствами, либо те и другие являются составляющими желточной мембраны.

Каждую отдельную фракцию высушивают вымораживанием и определяют в ней содержание белка и специфическую активность. Очищенные фракции могут быть использованы для приготовления стандартизованных рецептур. Затем в стерильном водном экстракте цельного яйца готовят раствор следующих фракций:

Компонент Примерная концентрация, мМ

Неспецифические иммунные составляющие 2000

Специфический иммуноглобулин 200

Гликопротеины 200

Липополисахариды 200

Муцины 200

Овомукоид 100

Лизоцим 100

Авидин 100

Овотрансферрин 100

Мочевина 10

Необходимые аминокислоты 10

Необходимые жирные кислоты 10

Кальций

Магний 0,2

Натрий 20

Калий 20

Аммоний 5

Моногидрофосфат (двухвалентный) 20

Дигидрофосфат (одновалентный) 20

Бикарбонат 20

рН раствора доводят до 6,7, используя 0,1М раствор соляной кислоты или 0,1 М раствор гидроокиси аммония.

Раствор высушивают и используют в качестве активного ингредиента в приготовлении окончательных рецептур жевательной резинки, таблеток, зубной часты, покрытий нитки для чистки зубов, зубных вкладышей и зубных эликсиров, а также он может быть использован в специальных пищевых рецептурах.

Пример 5

Экстракция и обогащение составляющих врожденной иммунной системы из яичного желтка

Свежие пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) инактивировали, суспендируя 40 г в 1 л 10 мМ фосфатного буфера рН 7,0 и прогревая при 60°С в течение 1 часа. Инактивация необходима для предотвращения действия протеаз в ходе процедуры экстракции. Использование пекарских дрожжей предпочтительно, поскольку они употребляются в пищу и поэтому избавляют от проблем, связанных с безопасностью и токсикологией. Затем инактивированные дрожжи промывали с центрифугированием сначала в 1,0 М калий-фосфатном буфере при рН 4,0, содержащем 0,01% Tween 80 (Tween - товарный знак), а затем дважды в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0. Высокая ионная сила и низкий рН в буфере с Tween выполняют задачу удаления всех слабо связанных капсулярных белков или макромолекул клеточной поверхности, которые могут препятствовать процессу эксттракции.

Очищенный от липидов экстракт яичного желтка готовили по методу, описанному здесь выше, и концентрацию белка в нем доводили до 10 мг/мл добавлением 10 мМ калий-фосфатного буфера рН 7.

Обработанные дрожжи добавляли к раствору яичного желтка в количестве 1 г влажного веса клеток на каждые 25 мг белка. Суспензию инкубировали при 30°С в течение 1 часа, на этом этапе компоненты врожденной иммунной системы связывались с поверхностью дрожжевых клеток. Дрожжи вместе со связанным материалом отделяли центрифугированием, промывали дважды 10 мМ фосфатным буфером при рН 7,0, ресуспендировали в 1,0 М калий-фосфатном буфере рН 4,0 с 0,01% Tween и интенсивно перемешивали в течение 30 мин для десорбирования связанных компонентов яйца. Отработанные дрожжи удаляли центрифугированием, а супернатант диализировали против 10 мМ калий-фосфатного буфера рН 7,0.

Определение содержания белка в этой фракции проводили методом Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Выход выделенного белка составлял 48% от содержания белка в яичном растворе. Более высокий выход мог быть достигнут повторением процесса со свежими дрожжами в том же самом растворе яичного желтка или десорбированием при более низком рН. Максимальный выход, достигнутый с использованием описанных методов, составлял 54%, что указывает на то, что около 40% белков в яичном желтке не связывается с клетками дрожжей.

При изоэлектрическом фокусировании в 4% полиакриламидном геле (Pharmacia, Швеция) профиль белка из делипидизированных яиц сопоставляли с профилем для фракции, десорбированной с пекарских дрожжей. Материал образца наносили на гель микропипеткой (50 мкг белка в 20 мкл) и электрофорез проводили в невосстанавливающих условиях обычным образом с использованием установки ВioRad (BioRad - товарный знак) при мощности 100 Вт. При использовании окрашивания комбинацией красителей кумасси голубого и нитрата серебра в делипидизированной фракции яиц обнаруживали 19 отдельных белков; это согласуется с публикацией Сhang Р.К. с соавт. (1970) (см. выше). Девять зон были видны во фракции десорбированного (обогащенного) белка, к которым добавлялись две другие, второстепенные зоны, видимые только при окрашивании нитратом серебра и соответствующие кислотным фосфопротеинам. Важно отметить, что число белковых зон не может быть прямо сопоставлено с общим числом белков, обогащенных из яичного раствора, т.к. некоторые из видимых белковых зон могут соответствовать субъединицам индивидуальных глобулярных белков, диссоциирующих в процессе десорбции.

Пример 6

Эффективность действия in vitro обогащенных составляющих яичного желтка

Существенной особенностью обогащенной фракции белков яйца, приготовленной в примере 5, является ее способность связываться с широким кругом микробных видов. Чтобы продемонстрировать полиспецифичность способности к связыванию обогащенных белков яичного желтка, готовили инактивированные прогревом суспензии в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0 следующих организмов: Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Streptococcus mutans, Streptococcus faecalis, Lactobacillus casei, Porphyromonas gingivalis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimuhum, Clostridium difficile и Pseudomonas aeruginosa. Культуры микроорганизмов выращивали в бульоне, как описано ниже, промывали центрифугированием в буфере с высокой ионной силой, после чего уравновешивали в буфере с низкой ионной силой и разбавляли до оптической плотности 1,0 при 600 нм.

Культивирование микробных клеток:

Дрожжи Candida albicans выращивали на декстрозном агаре Sabouraud фирмы Oxoid. Бульонные культуры готовили в декстрозном бульоне Sabouraud, если клетки нужны были для измерений адгезии на клетках ротовой полости или для оценки в этих клетках антиадгезивных свойств любых экстрактов врожденной иммунной системы. Ингибирование роста оценивали на среде Yeast Nitrogen Base фирмы Difco, дополненной 2% глюкозы.

Бактерии Streptococcus mutans. Streptococcus faecalis, Porphyromonas gingivalis, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium и Clostridium difficile культивировали на кровяной агаровой плотной среде Columbia фирмы Oxoid с добавкой очищенной от фибриногена лошадиной кровью от фирмы Oxoid. Clostridium difficile и Porhyromonas gingivalis являются облигатными анаэробами, их культивировали в анаэробных условиях в “газовом сосуде” с использованием пакетов для газа фирмы Oxoid. В том случае, когда на клетках Streptococcus mutans проводили изучение антиадгезивных свойств, этот микроорганизм сначала культивировали на бульоне Brain Heart Infusion Broth в анаэробных условиях в газовом сосуде, чтобы обеспечить формирование гликанов клеточной поверхности, которые, как считается, вносят вклад в адгезивные свойства этого микроорганизма. 5,0 мл каждой инактивированной прогревом культуры добавляли к 5,0 мл раствора обогащенных яичных белков, содержащих 10 мг общего белка в 1 мл, и инкубировали при 30°С в течение 1 часа. Культуры затем инактивировали прогревом так, как описано в примере 5. Микробные клетки отделяли центрифугированием, промывали и десорбировали связанный белок, как описано в примере 5. Результаты измерений количества белка, связанного с каждым типом клеток, представленные количеством остаточного белка в супернатанте после инкубации и количеством, обнаруженным после десорбции, приведены в таблице 1.

В каждом случае обнаруживается, что примерно 15%-20% внесенного белка утрачено. Наиболее приемлемое объяснение этого состоит в том, что этот белок остается связанным с микробными клетками.

Адгезия на клетках эпителия ротовой полости:

Для демонстрации способности обогащенных белков яичного желтка к адгезии in vitro на клетках ротовой полости исследования были проведены следующим образом.

Клетки эпителия ротовой полости собирали с внутренней поверхности щеки клеточным скребком “Costar” или острым краем ложки. Клетки разбавляли в фосфатно-буферном солевом растворе при рН 7 и промывали на фильтровальной ткани с размером пор 18 мкм для удаления клеточных обломков и бактерий. Промытые клетки подсчитывали на гемоцитометрическом стекле под микроскопом. Клетки смешивали со свежевыращенными (промытыми) дрожжами в соотношении 100 дрожжевых клеток на каждую клетку ротовой полости и инкубировали в присутствии или без испытуемого материала при 30°С в течение 1 часа с аккуратным покачиванием. Если использовали мешалки “Cytospin” (Cytospin -товарный знак), то их скорость вращения была 200 об/мин.

После инкубации клеточную смесь фильтровали сквозь фильтровальную ткань с размером пор 18 мкм, наносили на чистое микроскопное предметное стекло и высушивали на воздухе в течение ночи. Высушенные предметные стекла фиксировали теплом, быстро проводя их через пламя бунзеновской горелки. На стекло наносили на 1 мин водный раствор кристалл-виолета (1% весовая концентрация), затем стекло ополаскивали и высушивали. При микроскопии с 500-кратным увеличением можно было относительно легко подсчитать число дрожжевых клеток, прикрепившихся к каждой клетке ротовой полости. Среднее число дрожжевых клеток, адгезированных на 100 клетках ротовой полости, было выбрано в качестве меры коэффициента связывания.

Обогащенные белки яичного желтка сравнивали с гипериммунным антикандидным иммуноглобулином, экстрагированным из яиц, отложенных курами, иммунизированными убитыми нагреванием клетками С. albicans. Гипериммунный антикандидный иммуноглобулин получали, как описано ниже.

Получение гипериммунных антител

Свежевыращенные клетки С. albicans разбавляли в фосфатно-буферном солевом растворе до концентрации, дающей оптическую плотность при 600 нм, равную 1. Клеточные суспензии ослабляли прогревом при 60°С в течение 1 часа и немедленно после этого использовали.

Курам-несушкам делали внутримышечные инъекции в две точки по 1 мл ослабленных клеток в полном адъюванте Фройнда с интервалом в 2 недели в течение 8 недель. Титр антител измеряли методом твердофазного иммуноанализа ELISA с козьим антикуриным иммуноглобулином, конъюгированным с пероксидазой (фирма Sigma, Англия).

Гипериммунные яичные антитела выделяли из яиц следующим образом: яичный желток отделяли от белка на чистой ткани, чтобы отделить и высушить все остатки белка с внешней поверхности желточной мембраны. Собранные желтки разрушали в стеклянном стакане и добавляли 9 объемов дистиллированной воды. Раствор замораживали в течение ночи при -70°С. После оттаивания раствор центрифугировали и супернатант сливали сквозь муслин для удаления всплывающих липидов низкой плотности.

К делипидизированному содержимому яиц добавляли порциями 12% полиэтиленгликоль (с молекулярным весом 8000) и давали системе прийти в равновесие в течение 1 часа при комнатной температуре. Осадок отделяли центрифугированием и доводили до исходного объема охлажденным на льду этанолом, через 20 мин раствор центрифугировали и осадок ресуспендировали в минимальном объеме 10 мМ фосфатного буфера. Растворенную фракцию диализировали в течение ночи против фосфатного буфера.

Контролем (“контрольное яйцо”) был необогащенный делипидизированный яичный желток, все три фракции испытывали при концентрациях 1 мг/мл и 10 мг/мл. Результаты представлены на фиг.1. Из фиг.1 следует, что гипериммунный яичный иммуноглобулин при концентрации 10 мг/мл вызывает снижение на 79% числа дрожжевых клеток, адгезированных на 100 клетках ротовой полости. Обогащенные яичные белки при концентрации 10 мг/мл давали снижение на 70%, тогда как снижение на 95% достигалось комбинацией 1,0 мг/мл обогащенных яичных белков с 1,0 мг/мл деовальбуминизированного яичного белка (de-OEW), полученного, как описано в примере 7.

Пример 7

Деовальбуминизированный белок яиц (de-OEW) получали следующим образом.

Готовили водный раствор свежего куриного белка в 9 частях деионизованной воды и добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 90% (вес к объему). После уравновешивания в течение 30 мин осадок белка собирали центрифугированием и ресуспендировали в деионизованной воде. Растворенный осадок диализовали против 10 мМ аммоний-ацетатного буфера рН 5,5 и доводили концентрацию белка до 10 мг/мл разбавлением тем же буфером.

Полученный раствор яичного белка наносили на колонку со смолой Whatman DE-52 (Whatman - товарный знак), предварительно уравновешенной 10 мМ ацетатом аммония при рН 5,5. Загрузка колонки составляла 10 мг белка на 1 мл объема смолы. При этих условиях лизоцим, авидин и овотрансферрин не связывались со смолой и выходили с колонки в начале элюирования. Цистатин, овоингибитор, глобулины G2 и G3 элюировали с колонки градиентом с повышением ионной силы ацетата аммония от 10 до 500 мМ. Благодаря близости изоэлектрических точек, последние порции элюента с этой колонки содержали вместе с овальбумином смешанные фракции овомукоида, овомуцина, овогликопротеина, овофлавопротеина и овомакроглобулина.

Последний элюент с колонки DE-52 концентрировали ультрафильтрацией через мембраны с пределом исключения 10000 кДа и затем наносили на гель-фильтрационную колонку с S-100, используя в качестве носителя 10 мМ аммоний-ацетатный буфер рН 5,5. При разделении по молекулярному весу первый элюент содержал овомуцин и овомакроглобулин, за которыми следовала большая фракция, содержащая овальбумин, после чего в позднем элюенте обнаруживали овомукоид, овофлавопротеин и овогликопротеин.

Белок, выходящий с колонки S-100 перед и после элюирования овальбумина, объединяли с материалом, элюирующимся с колонки DE-52 перед появлением смешанной фракции овальбумина. Объединенные растворы концентрировали ультрафильтрацией и диализовали в патроне UF с добавлением 10 мМ калий-фосфатного буфера рН 7, 0.

В этом примере было обнаружено, что деовальбуминизированный яичный белок проявляет уникальную дозовую зависимость при добавлении к культурам бактерий или дрожжей. Ингибирующая активность этого материала зависит от концентрации культуральной среды, возраста инокулюма и дозы. В отличие от большинства ингибирующих веществ, эффект не возрастал с увеличением дозы; реакция была одинаковой при концентрациях свыше 1,0 мг/мл, при которой материал стимулирует рост. Между 1,0 и 0,1 мг/мл (в зависимости от концентрации силы среды) наблюдалось ингибирование роста. Эта уникальная дозовая зависимость может отражать особенности растворимости de-OEW или растворимости его индивидуальных составляющих. Известно, что слюна проявляет подобные стимуляцию и ингибирование роста, и считается, что это предпосылка для поддержания во рту нормальной микрофлоры (см. Sailva and Oral Health. Ред. Edgar и O'Mullane. Изд. British Dental Association. C. 100-101). Длительное применение антибиотиков и бактерицидных агентов вызывает полный антисепсис рта, что приводит к исчезновению здоровой микрофлоры, которую слюна в норме поддерживает, что создает благоприятные условия для последующей колонизации рта нежелательными видами.

Было исследовано влияние de-OEW на рост St. mutans, результаты приведены на фиг.2 и 3.

На фиг.2 показано ингибирующее действие de-OEW на рост Streptococcus mutans в среде 80% SBNB через 9 час после инокуляции. 80% SBNB - это ростовый бульон фирмы Oxoid, с концентрацией 80% от нормальной, дополненный 2% сахарозы и забуференный при рН 6,8 добавлением до 0,5% двузамещенного фосфата калия. Ингибирующий эффект отчетливо виден при концентрациях между 0,2 мг/мл и 1,0 мг/мл. Как продемонстрировано в отдельном эксперименте, ингибирующий эффект длится в течение всего цикла роста, как видно из фиг.3 с точками, соответствующими 9, 12 и 15 час.

В отличие от антибиотиков или антисептиков, врожденная иммунная система не обладает бактерицидным действием. Двойственность ингибирования и стимуляции является уникальной особенностью, которая отражает свойства слизистой человека (слюны), соответствующие тому, что полный антисепсис рта нежелателен.

Некоторые из индивидуальных составляющих яичного белка были охарактеризованы более полно, чем составляющие яичного желтка (см. Staedelman и Cotterill. Egg Science and Technology. С.119-137). Основные компоненты вместе с обычно приписываемыми им свойствами суммированы в таблице 2.

Известно, что три из этих составляющих ингибируют рост микроорганизмов, - это лизоцим, овотрансферрин и авидин. Ингибирующие свойства лизоцима приписываются его ферментативному действию на клеточные стенки определенных бактерий (но не дрожжей). Известно, что овотрансферрин связывает ионы многих металлов, в том числе железа, снижая таким образом их содержание в среде. Авидин связывает биотин и таким образом лишает его доступности для тех организмов, которым он требуется как необходимый фактор роста (включая дрожжи). Относительная степень влияния каждого из этих ингредиентов на рост Candida albicans показана на фиг.4. Ни лизоцим, ни овотрансферрин сами по себе не ингибируют рост, тогда как авидин дает приблизительно 50%-ное подавление. Все три ингредиента в комбинации подавляют рост на 80%, демонстрируя таким образом синергизм действия. Деовальбуминизированный яичный белок подавляет рост даже на 98%.

Относительные процентные концентрации известных составляющих деовальбуминизированного яичного белка представлены в таблице 3.

Из таблицы 3 следует, что 1,0 мг деовальбуминизированного яичного белка содержит менее 0,25 мг овотрансферрина, менее 0,1 мг лизоцима и менее 0,05 мг авидина.

Фиг.5 иллюстрирует действие комбинации овотрансферрина (0,25 мг/мл), лизоцима (0,1 мг/мл) и авидина (0,05 мг/мл) на рост С. albicans в сравнении с действием 1 мг/мл деовальбуминизированного яичного белка и показывает, что более высокий ингибирующий эффект деовальбуминизированного яичного белка не может быть объяснен только наличием этих трех ингредиентов.

Пример 8

Рецептура синтетической слюны

Деовальбуминизированный яичный белок (полученный по примеру 7) и обогащенный делипидизированный яичный желток (по примеру 5) объединяли в равных количествах по весу и растворяли в растворе органических солей со следующими конечными концентрациями.

рН раствора доводили до 6,7 добавлением 0,1 М соляной кислоты или 0,1 М гидроокиси аммония.

Рецептура имела консистенцию, подобную консистенции свежей цельной слюны, с близкой реологией и с устойчивостью к высушиванию, эквивалентной устойчивости слюны.

Пример 9

Ингибирование кристаллизации кальция

Кальций выпадает в осадок из насыщенного раствора хлорида кальция или карбоната кальция на любой подходящей поверхности, дающей затравку для инициации роста кристаллов.

Раствор 4 мМ хлорида кальция готовили в буфере 50 мМ HEPES при рН 7,2. К этому раствору добавляли равные количества по весу деовальбуминизированного яичного белка (приготовленного по примеру 7) и делипидизированного обогащенного яичного желтка (приготовленного по примеру 5) до конечной концентрации 0,01% (вес к объему) (0,1 мг/мл). 8 Мл этого раствора добавляли к 1,6 г гранул оксиапатита фирмы ВОН в универсальном флаконе “Sterilin” объемом 25 мл. После уравновешивания при комнатной температуре добавляли 8,0 мл 50 мМ HEPES рН 7,2, содержащего 15 мМ дигидрофосфат калия. Действие фосфата калия в этом растворе заключалось в создании насыщенного раствора по отношению к иону кальция.

Утрату кальция из раствора измеряли иономером Наnnа с реагентами Наnnа для определения кальция по методу, описанному Van der Reijden W.A. и др. (// Caries Research. 1997, 31, С.216-223). Процентную утрату кальция из раствора сравнивали в чистом контроле, не содержащем добавленного белка, контроле с гранулами, насыщенными слюной, и испытуемом растворе, содержащем врожденные составляющие яиц по описанному выше. Результаты представлены на фиг.6. Через 40 мин наблюдалось 65%-ное снижение концентрации в растворе в чистом контроле, в присутствии слюны снижение составляло 35%, тогда как белки яиц наилучшим образом защищали раствор, обеспечивая лишь 18%-ное снижение концентрации.

Пример 10

Введение полиолов

Рецептуры врожденных иммунных составляющих в соответствии с описанным здесь способны замещать фторид в качестве активного ингредиента в зубной пасте и других зубных порошках и средствах гигиены рта, обеспечивая наравне с фторидом широкий спектр полезных антимикробных эффектов в случае зубного кариеса и еще более широкий спектр полезного действия в ограничении воспаления десен, ротовой молочницы и халитоза.

В этом примере показано, что врожденные иммунные составляющие яиц усиливают действие ксилитола и что ксилитол сдвигает ингибирующую концентрацию врожденных яичных белков. Таким образом, имеет место эффект синергизма между этими двумя компонентами, показывающий повышенную пользу введения низких концентраций полиолов в рецептуры врожденных иммунных составляющих яиц.

Клетки St. mutans культивировали в пробирке в 80% забуференном питательном бульоне с сахарозой (среда SBNB). Эта среда описана здесь как 80% SBNB, т.к. конечная концентрация питательного бульона составляет 80% от нормальной.

Среда была приготовлена следующим образом:

питательный бульон Oxoid 20,8 г

дикалиевый гидрофосфат 17,9 г

сахароза 40 г

дистиллированная вода 1 л

рН этого раствора доводили до 6,8 добавлением соляной кислоты. Аликвоты указанного раствора объемом 5 мл разливали в 25 мл пробирки, которые затем закрывали ватными пробками и автоклавировали для стерилизации.

Растворы испытуемого материала, который представлял собой яичные белки врожденной иммунной системы с добавлением полиолов в различных концентрациях или без полиолов, готовили в 0,1 М фосфатном буфере рН 6,8 и стерилизовали фильтрование через капсульные фильтры с размером пор 0,2 мкм.

В пробирки со стерильной средой добавляли различные объемы испытуемого материала для получения заданных концентраций испытуемого материала после доведения объема жидкости в каждой пробирке до 10 мл добавлением стерильного 0,1 М фосфатного буфера рН 6,8.

Подготовленные пробирки инокулировали 0,1 мл культуры St. mutans, выращенной в течение 12 час в 80% SBNB без добавления испытуемого материала. Инокулированные пробирки инкубировали на водяной бане при 37°С и измеряли увеличение оптической плотности с помощью колориметра EEL с фильтром 600 нм. Каждая серия имела чистый контроль, состоящий из неинокулированной среды, и контроль, состоящий из инокулированной среды без испытуемого материала.

Результаты представлены на фиг.7-9.

Фиг.7 показывает эффект введения ксилитола в 80% SBNB с St. mutans. Наблюдается увеличение степени ингибирования при повышении концентрации ксилитола от 0,25% до 1,0% (вес к объему). Та же серия демонстрирует ингибирующее действие яичных белков врожденной иммунной системы при их концентрации от 0,025% вплоть до 0,075% (вес к объему). Как видно, комбинация 0,5% ксилитола с 0,075% экстракта составляющих врожденной иммунной системы яичного белка, приготовленного в соответствии с примером 7, обеспечивает усиление ингибирования. Необходимо отметить, что эта серия демонстрирует также обращение ингибирующего действия белков врожденной иммунной системы, описанное выше.

Фиг.8 показывает результаты 9-часового роста St. mutans в 60% SBNB в присутствии повышающейся концентрации экстракта, приготовленного в примере 7. Эта же серия представляет ту же последовательность, дополненную 0,5% ксилитола. Ксилитол расширял “окно” ингибирующих концентраций с 0,2-1,0 мг/мл для одного яичного экстракта до 0,2-5,0 мг/мл с добавлением 0,5% ксилитола.

Фиг.9 иллюстрирует действие маннитола, сорбитола, эритритола и ксилитола при концентрации 0,5% (вес к объему) вместе с 0,075% (вес к объему) экстракта, приготовленного в примере 7, на рост St. mutans в 80% SBNB. Ксилитол осуществлял оптимальное ингибирование при условиях испытаний, другие полиолы могут давать похожее ингибирование и иметь различные ингибирующие концентрации.

Пример 11

Экстракция и обогащение составляющих врожденной иммунной системы из молока

Содержание белка в молоке отличается от содержания белка в яйцах, и распределение белков врожденной иммунной системы среди нефункциональных материалов также различается. Поэтому, чтобы учесть эти индивидуальные различия, необходимо модифицировать метод экстракции по сравнению с методом, примененным в случае яиц.

Липидную фракцию удаляли из молока замораживанием при -70°С в течение 24 час, после оттаивания центрифугировали и фильтровали супернатант. В случае яиц делипидизация не является необходимой, но распределение белков врожденной иммунной системы в молоке требует разрушения и отделения глобул жира.

Добавлением лимонной кислоты понижали рН полученного супернатанта до 3,5 и диализовали его против деионизованной воды для удаления ионов металлов и низкомолекулярных составляющих, которые связываются со многими из функциональных групп белков врожденной иммунной системы молока. Деионизованный раствор белка концентрировали ультрафильтрацией сквозь мембрану с пределом исключения не более 10000. Концентрацию раствора белка доводили до 10 мг/мл добавлением 10 мМ калий-фосфатного буфера. Экстракцию белков врожденной иммунной системы осуществляли с использованием пекарских дрожжей, как описано в примере 5.

Пример 12

Сравнение активности in vitro обогащенных экстрактов яиц и молока с активностью гипериммунных антител к Streptococcus mutans из яиц

Проводили сопоставление активности in vitro обогащенных составляющих врожденной иммунной системы яиц, таких обогащенных составляющих из молока и гипериммунных антител против St. mutans из яиц. Клетки St. mutans активно адгезируют на гранулах оксиапатита, покрытых слюной, аналогично их адгезии на поверхности зубной эмали. Необходимо предварительно покрыть гранулы оксиапатита свежей цельной слюной, поскольку клетки St. mutans закрепляются на белках слюны на поверхности зубов.

Аликвоты по 0,1 г гранул оксиапатита взвешивали в центрифужных пробирках “Sterilin” (Sterilin - товарный знак) и инкубировали с 2,0 мл свежей слюны в течение 2 час с аккуратным встряхиванием при 30°С. Увлажненные гранулы промывали дважды дистиллированной водой для удаления оставшейся слюны.

St. mutans выращивали в течение 12 час в среде Brain Heart Infusion Broth, дополненной 2% сахарозы. Бульонные культуры дважды промывали в фосфатно-буферном солевом растворе рН 7,0 с помощью центрифугирования. Собранные клетки ресуспендировали в фосфатно-буферном солевом растворе и разбавляли до оптической плотности при 600 нм, равной 1,0.

Гипериммунные антитела к St. mutans из яиц готовили, как описано в примере 6. Антитела разбавляли до концентрации 10 мг/мл 10 мМ фосфатным буфером рН 7. Раствор, содержавший равные количества по весу обогащенного экстракта яичных желтков (приготовленного, как описано в примере 5) и деовальбуминизированного яичного белка (приготовленного, как описано в примере 7), разбавляли до 10 мг/мл добавлением 10 мМ фосфатного буфера. Обогащенные белки врожденной иммунной системы из молока, приготовленные, как описано в примере 11, разбавляли до 10 мг/мл. Из каждого испытуемого раствора 1,0 мл добавляли к 1, 0 мл подготовленных клеток St. mutans и инкубировали при 30°С в течение 1 часа. Определение в чистом контроле проводили с использованием фосфатно-буферного солевого раствора вместо испытуемого раствора белка.

После инкубации испытуемые растворы промывали дважды фосфатно-буферным солевым раствором, клетки ресуспендировали в 1,0 мл того же буфера и добавляли к гранулам оксиапатита, покрытым слюной. Гранулы вместе с испытуемыми растворами инкубировали в течение 2 час при 30°С, затем аккуратно промывали 5 раз стерильным фосфатно-буферным солевым раствором для удаления всех бактериальных клеток, не связавшихся с гранулами.

Приблизительную оценку количеств бактерий, связавшихся с каждой гранулой, получали окрашиванием гранул кристалл-виолетом и отмывкой спиртом, с последующим наблюдением под микроскопом с 500-кратным увеличением. Возможно применение также стандартной техники окрашивания по Граму.

Более точное измерение относительных количеств бактерий, связавшихся с каждой гранулой, получают методом, описанным Hatta Н. с соавт. (1997) (см. выше); для снятия сцепленных с гранулами бактерий в этой работе применяли ультразвуковую обработку.

В данном примере для десорбции бактерий применяли тот же самый буфер с высокой ионной силой, который был использован в примере 5 для десорбции обогащенных яичных белков с дрожжей. К каждому испытуемому образцу добавляли 1,0 мл 1 М фосфатного буфера рН 4 с 0,01% Tween. После энергичного встряхивания в течение 30 сек немедленно производили серийные разведения супернатанта. В соответствии со стандартным методом подсчетов на чашках, 1 мл каждого разведения распределяли по поверхности чашки Петри со свежим кровяным агаром. После инкубации чашки просматривали и подсчитывали число колоний; для определения числа жизнеспособных клеток в исходном образце число колоний умножали на коэффициент, учитывающий степень разведения. Средние значения трех тестов приведены в таблице 4.

Результаты иллюстрирует также фиг.10.

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к лечению и профилактике заболеваний, связанных с дефектом защитных функций слизистых оболочек. Для этого предлагается использовать экстракты биологического выделения материнской иммунной системы, предназначенного для защиты зародыша или новорожденного, обеспечивающие ингибирование адгезии микробной клетки на слизистой оболочке. Примерами таких выделений являются жидкость яиц или молоко домашнего животного или их части. Эти выделения могут быть обогащены имеющимися в них природными иммуноглобулинами, так что они имеют активность, приближающуюся к активности гипериммунизированного иммуноглобулина. Заявленные средства позволяют обеспечивать лечение и/или профилактику ротовой инфекции, зубного кариеса, ксеростомии, халитоза, а также заболеваний слизистых кишечника и гениталий. 3 н. и 37 з.п.ф-лы, 10 ил., 4 табл.

Формула