Косметическая композиция из жидкости, образующейся при вылуплении рыб из икры - RU2611639C2

Чертежи

Показать все 7 чертежа(ей)

Описание

Настоящее изобретение относится к способам получения композиции, содержащей полипептиды и/или части полипептидов, которую можно получить из жидкости, образующейся при вылуплении рыб из икры, и к различным способам применения указанной композиции на коже. В частности, композиции, содержащие указанные полипептиды и/или части полипептидов, подходят для лечения различных медицинских и косметических расстройств или состояний кожи.

Кожа является одним из наиболее уязвимых органов тела. Хотя кожные расстройства или патологические состояния редко опасны для жизни, они могут причинять дискомфорт и вызывать хроническую утрату трудоспособности. Кроме того, поскольку кожа находится на виду, расстройства и патологические состояния кожи могут приводить к психологическому стрессу. Следовательно, существует постоянная потребность в эффективных способах лечения патологических состояний и расстройств кожи.

Кожа образует самый большой орган тела, составляющий примерно 12-16 процентов массы тела человека. Она выполняет множество жизненно важных функций, выступая в качестве как барьера, так и регулятора между внешним миром и контролируемой средой в нашем организме.

Кожа состоит из 3 слоев, а именно из эпидермиса, дермы и подкожно-жировой клетчатки. Эпидермис представляет собой самый верхний, эпителиальный слой кожи. Он действует как физический барьер, предотвращающий потерю воды организмом и проникновение веществ и организмов в тело. Его толщина варьирует в зависимости от местоположения на теле.

Эпидермис состоит из многослойного чешуйчатого эпителия, т.е. состоит из слоев плоских клеток. Кожа, волосы и ногти кератинизированы, что означает, что они имеют мертвую твердую гидрофобную поверхность, состоящую из белка, называемого кератином. Эпидермис является непроницаемым благодаря тому, что он содержит внеклеточные липиды, связанные с кератиноцитами, особенно в среднем слое эпидермиса (блестящий слой). Слизистые оболочки (например, пищевода, полости рта, половых органов и другие) в основном некератинизированы и влажные. Эпидермис состоит из трех основных типов клеток, а именно из кератиноцитов (кожных клеток), меланоцитов (клеток, продуцирующих пигмент) и клеток Лангерганса (иммунных клеток). Клетки Меркеля представляют собой четвертые, менее распространенные, эпидермальные клетки.

Кератиноциты созревают и дифференцируются с накоплением кератина по мере их движения наружу. В итоге они отпадают или стираются. Они образуют четыре или пять различных слоев, которые, начиная с самого верхнего и заканчивая самым глубоким, представляют собой (i) Stratum corneum (роговой слой) с мертвыми, сухими жесткими клетками без ядер, (ii) Stratum granulosum (зернистый слой) с клетками, содержащими базофильные гранулы, и снаружи отделенными от рогового слоя тонким блестящим слоем, (iii) Stratum spinulosum (остистый, шиловидный или шиповатый клеточный слой), в котором клетки становятся все более и более плоскими по мере того, как они поднимаются вверх, и (iv) Stratum basale (базальный слой) с цилиндрическими (высокими) регенеративными клетками.

Непосредственно под эпидермисом располагается базальная мембрана, представляющая собой особую структуру, которая лежит между эпидермисом и дермой.

Дерма представляет собой волокнистую соединительную ткань, или поддерживающий слой кожи. Основными волокнами являются волокна коллагена и эластина, которые переплетены.

Подкожно-жировая клетчатка представляет собой жировой слой, расположенный непосредственно под дермой и эпидермисом. Ее также называют подкожной основой, гиподермой или подкожной клетчаткой. Подкожно-жировая клетчатка в основном состоит из жировых клеток (адипоцитов), нервов и кровеносных сосудов.

Новые эпителиальные клетки кожи образуются в нижнем слое кожи, в зернистом слое. Со временем клетки мигрируют к поверхности кожи и становятся более кислыми. Во время своего 30-дневного путешествия они умирают и насыщаются кератином. Кератин и связанные с ними липиды являются важными, так как они защищают кожу от внешних воздействий.

Болезни, травмы, экологические факторы, возраст, уровень гормонов, медикаментозное лечение, наносимые снаружи или поступающие с пищей вещества, генетические заболевания и множество других факторов может привести к нарушениям функции кожи, приводя к нарушению нормальной работы или аномалиям. Некоторые из этих нарушений или аномалий могут иметь чисто косметический характер, например, сухая кожа, морщины или измененная пигментация, или могут быть более серьезными, приводя к боли или дискомфорту, например, экзема и псориаз.

Сухая кожа является одним из наиболее распространенных кожных состояний или аномалий. Хотя некоторые люди более предрасположены к сухости кожи, указанное состояние может возникнуть у любого, независимо от возраста, пола или типа кожи.

Сухость кожи возникает когда внешний слой кожи (роговой слой с блестящим слоем) обедняется водой. Когда этот слой хорошо увлажнен, он сводит к минимуму потери воды через кожу и помогает препятствовать проникновению раздражающих веществ, аллергенов и микробов. Однако когда роговой слой высыхает, его защитные функции падают.Это приводит к большей потери воды, оставляя кожу уязвимой к действию факторов окружающей среды.

В нормальных условиях роговой слой имеет содержание воды от 10 до 30%. Эта вода придает коже мягкую, гладкую и гибкую текстуру. Вода поступает из атмосферы, нижележащих слоев кожи и пота. Жир, производимый кожными железами, и жировые вещества, производимые клетками кожи, действуют как природные увлажняющие средства, которые позволяют роговому слою удерживать воду.

Организм непрерывно теряет воду с поверхности кожи путем испарения. В нормальных условиях скорость потери невысокая, и вода замещается надлежащим образом. Характерные признаки и симптомы сухости кожи возникают тогда, когда потеря воды превышает замещение воды и содержание воды в роговом слое падает ниже 10%.

Крайне необходимы увлажняющие средства, которые улучшают или устраняют сухость кожи. Хотя в данной области техники известно много увлажняющих средств, все еще существует потребность в натуральных продуктах, которые эффективны и в тоже время деликатны.

Другая распространенная аномалия или патологическое состояние кожи представляет собой чрезмерное количество рогового слоя кожи. Это может происходить из-за недостаточного слущивания рогового слоя или из-за избыточного отложения кератина в роговом слое. Первое может иметь место тогда, когда естественный процесс слущивания кожи становится неравномерным, что придает коже сухой и грубый вид. Доброкачественные гиперпролиферативные расстройства включают эпидермолитический гиперкератоз (или растрескавшуюся кожу) и кератоз волосяного фолликула. Одним из распространенных доброкачественных гиперпролиферативных состояний является периферическая гипертрофия вокруг шрамов и/или формирование келоидных рубцов. Другими гиперпролиферативными состояниями являются мозоли, натоптыши, гиперкератозные бородавки (в частности, простые бородавки), ихтиозы и ладонно-подошвенные кератозы.

Современные методы лечения включают отшелушивание или в крайних случаях хирургию. Гиперкератоз обычно лечат путем смягчения рогового слоя и удаления утолщенной кожи.

Отшелушивание также можно применять для удаления поврежденных эпидермальных клеток, например эпидермальных клеток эпидермиса, проявляющего нарушение пигментации, например печеночные пятна.

Отшелушивание удаляет внешние слои эпидермиса, чтобы обнажить под ним новые клетки кожи. Отшелушивание можно осуществить при помощи физических средств (т.е. истирания кожи) или при помощи химических средств. Химические отшелушивающие средства включают скрабы, содержащие салициловую кислоту, гликолевую кислоту, фруктовые ферменты, лимонную кислоту или яблочную кислоту, и могут содержаться в высоких концентрациях в продуктах, применяемых дерматологамиов, или в более низких концентрациях в продуктах, продаваемых без рецепта. Химическое отшелушивание может включать применение продуктов, содержащих альфа-гидроксикислоты (АГК) или бета-гидроксикислоты (БГК), или ферментов, которые влияют на ослабление клееподобных веществ, которые удерживают клетки вместе в межклеточных контактах, что позволяет им легко удаляться. Данный тип отшелушивания рекомендуется для людей, проходящих лечение акне.

Самым большим недостатком отшелушивания является высокая цена некоторых продуктов и способов, применяемых для его достижения. Отшелушивание приводит к некоторому первоначальному покраснению кожи. Ближе к концу химического пилинга кожа немеет и имеет цвет, варьирующий от ярко-белого до серого на поверхности кожи. Таким образом, необходимы более эффективные способы, которые имеют более мягкое воздействие на кожу.

Следовательно, сохраняется потребность в средствах, подходящих для увлажнения кожи и/или для отшелушивания рогового слоя кожи.

Неожиданно было обнаружено, что некоторые полипептиды и пептиды (например, части полипептидов), обнаруженные в жидкости, образующейся при вылуплении рыб из икры, являются в высшей степени эффективными увлажняющими и отшелушивающими средствами. Вылупление эмбрионов яйцекладущих позвоночных организмов, например, рыб, амфибий, птиц и рептилий, облегчается благодаря различным ферментам, обычно известным как ферменты вылупления, которые способны частично или полностью разрушать белковые части яйцевой оболочки. Ооциты всех позвоночных имеют характерные внеклеточные оболочки, известные как желточные оболочки, яйцевые оболочки или хорион (применяется здесь взаимозаменяемо), которые состоят различных поперечно-сшитых полипептидов. Протеазы с различной специфичностью воздействуют на хорион для смягчения, разъедания и/или разрушения (т.е. распада) яйцевой оболочки и содействуют высвобождению эмбриона. Следовательно, жидкость, высвобождающаяся из яйца в процессе вылупления, и/или жидкость, в которой эмбрион вылупляется (т.е. жидкость, образующаяся при вылуплении), содержит множество полипептидов и частей полипептидов, т.е. продуктов распада.

Авторы настоящего изобретения установили, что конкретный состав ферментов вылупления и полипептидов яйцевой оболочки рыб, образующихся при разрушении яйцевой оболочки (в частности, части или фрагменты указанных полипептидов яйцевой оболочки), особенно подходит для увлажнения кожи и/или для отшелушивания рогового слоя кожи.

Вылупление эмбрионов достигается или облегчается, по меньшей мере частично, при помощи так называемых ферментов вылупления. Например, хориолизины рыб представляют собой типичные металлопротеиназы, обнаруживаемые в жидкости, образующейся при вылуплении. Хориолизины обычно находятся в двух формах, а именно, большой хориолитический фермент (хориолизин Н, НСЕ) и малый хориолитический фермент (хориолизин L, LCE), которые похожи по некоторым структурным и каталитическим характеристикам и принадлежат к семейству астацинов, но заметно отличается по предпочтению субстратов. Также были определены и охарактеризованы ферменты вылупления с другой каталитической активностью, например сериновые протеазы.

Без ограничения рамками какой-либо конкретной теории, в примерах показано, что композиции, содержащие комбинацию ферментов вылупления, как металлопротеиназы так и сериновой протеазы, и частей белков яйцевой оболочки из жидкости, образующейся при вылуплении Salmonidae, способны к увлажнению кожи и/или отшелушиванию рогового слоя кожи.

Жидкость, образующаяся при вылуплении других рыб, содержит полипептиды, которые функционально эквивалентны полипептидам, обнаруженных в жидкости, образующейся при вылуплении Salmonidae.

Полагают, что сочетание ферментов вылупления и продуктов распада полипептидов (например, полипептидов яйцевой оболочки и частей указанных полипептидов) в композициях, описанных в настоящей заявке, может взаимодействовать с различными типами белков, присутствующих в дерме и эпидермисе кожи. Полагают, что это уникальное сочетание полипептидов и частей полипептидов может иметь синергетическое действие, и что эти взаимодействия могут отвечать за действия композиции при лечении различных расстройств или состояний кожи.

В соответствии с его самым широким пониманием изобретение можно рассматривать как обеспечивающие композицию, получаемую из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, согласно способу, описанному ниже. Указанная композиция содержит металлопротеиназу, сериновую протеазу и один или более полипептид яйцевой оболочки и/или части указанных полипептидов. В частности, композиция предназначена для лечения или для способов лечения различных аномалий, расстройств или состояний кожи, увлажнения и/или отшелушивания кожи, как описано ниже. Другими словами, композиция описанная в настоящей заявке, предназначена для лечения или для способов лечения состояний или расстройств, таких как сухость кожи, кожи, у которой роговой слой толще, чем требуется, например, при гиперкератозных состояниях, или кожи с нежелательной пигментацией на эпидермисе, например с печеночными, возрастными, солнечными или коричневыми пятнами. В особенно предпочтительном аспекте изобретение можно рассматривать как обеспечивающие композицию, получаемую из жидкости, образующейся при вылуплении, как описано в настоящей заявке, для обработки или для способов косметической обработки нормальной, но сухой кожи или утолщенной кожи (например, натоптышей, мозолей или гиперкератозных бородавок) или косметической обработки нарушений пигментации, таких как печеночные пятна. В другом предпочтительном аспекте настоящее изобретение можно рассматривать как обеспечивающие композицию, получаемую из жидкости, образующейся при вылуплении, как описано в настоящей заявке, для применения или для способов терапевтического лечения расстройств или состояний кожи, таких как акне, экзема, псориаз или бородавок, приводящих к боли. Композиция, упомянутая выше, также упоминается в настоящей заявке как «экстракт жидкости, образующейся при вылуплении». В дополнение к ферментам вылупления и полипептидам яйцевой оболочки и пептидам, указанный экстракт может содержать природные небелковые вещества.

Из раскрытия ниже будет очевидно, что композиция, получаемая из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, как описано в настоящей заявке, может быть предложена в виде фармацевтической или косметической композиции, которая содержит один или более фармацевтически приемлемых наполнителей и/или разбавителей.

Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения фармацевтической или косметической композиции, как описано в настоящей заявке, из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, включающий по меньшей мере следующие стадии:

а) суспендирование икры в минимальном объеме воды (например, эквивалентном объему икры или менее);

b) индукцию синхронизированного быстрого вылупления указанной икры, предпочтительно таким образом, что вылупление завершается в течение менее 6 часов для более чем 80% эмбрионов;

c) необязательно, фильтрацию икры, из которой вышли мальки, с получением жидкости, образующейся при вылуплении; и

d) фильтрацию жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии b) или с) с получением композиции, при этом стадия фильтрации жидкости, образующейся при вылуплении, включает по меньшей мере следующие стадии:

(i) фильтрацию жидкости, образующейся при вылуплении, с применением фильтра с размером пор по меньшей мере 5 мкм, предпочтительно 5-15 мкм, и особенно предпочтительно с размером пор 7 мкм, и сбор фильтрата;

(ii) необязательно, фильтрацию фильтрата со стадии (i) с применением фильтра с размером пор 0,30-0,60 мкм, предпочтительно с размером пор 0,35-0,55 мкм, особенно предпочтительно 0,40-0,50 мкм, наиболее предпочтительно 0,45 мкм, и сбор фильтрата;

(iii) обработку фильтрата со стадии (i) или (ii) посредством ионообменной хроматографии, включающей:

(1) загрузку фильтрата на ионообменную колонку, такую как ДЭАЭ (диэтиламиноэтильную) колонку;

(2) промывку колонки подходящим буфером, например, забуференным промывочным раствором с pH 7-9, например, содержащим 20 мМ Трис-HCl, pH 8,5;

(3) элюирование полипептидов с колонки (в частности лейколектиновых полипептидов) с применением первого элюирующего буфера или растворителя (например, с ионной силой ниже второго элюирующего буфера на стадии (4)), такого как забуференный промывочный раствор, дополнительно содержащий соль, например, в концентрации 50-100 мМ, например 50 мМ NaCl;

(4) элюирование оставшихся полипептидов с колонки с применением второго элюирующего буфера или растворителя (например, с ионной силой выше первого элюирующего буфера на стадии (3)), такого как забуференный промывочный раствор, содержащий более высокую концентрацию соли, чем первый элюирующий буфер, например, в концентрации 500 мМ-2 М, например 1М NaCl;

(5) сбор элюата со стадии (4);

e) замену воды в элюате со стадии (5) на фармацевтически (или косметически) приемлемый буфер;

f) фильтрацию раствора, полученного на стадии (е) с применением фильтра с размером пор 0,15-0,30 мкм, предпочтительно с размером пор 0,22 мкм и сбор фильтрата; и

g) приготовление указанной фармацевтической или косметической композиции из фильтрата, полученного на стадии (f).

В настоящей заявке «жидкость, образующаяся при вылуплении» представляет собой жидкость, высвобождающуюся из икры в процессе вылупления, и она может быть в сырой, разбавленной или фильтрованной форме. Сырая жидкость, образующаяся при вылуплении, относится к неразбавленной, необработанной жидкости. Разбавленная жидкость, образующаяся при вылуплении, относится к жидкости, образующейся при вылуплении, которая может быть смешана с другой жидкостью во время или после вылупления, например, когда вылупление происходит в воде.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая или косметическая композиция, полученная или получаемая по способу, описанному в настоящей заявке.

Стадию обработки фильтрата посредством ионообменной хроматографии можно выполнять с применением любого подходящего способа, при котором получают фильтрат, в котором полипептиды композиции согласно изобретению (включая их части, как это определено ниже) обогащены по отношению к по меньшей мере одному из других полипептидов, присутствующих в экстракте жидкости, образующейся при вылуплении, до ее очистки (т.е. до ионообменной хроматографии). Например, ионообменная хроматография может привести к получению конечного элюата (т.е. элюата, полученного при помощи второго элюирующего буфера), в котором ферменты вылупления и полипептиды яйцевой оболочки в жидкости, образующейся при вылуплении, обогащены по меньшей мере на 5% по отношению к по меньшей мере одному из других полипептидов, присутствующих в жидкости, образующейся при вылуплении, предпочтительно ко всем другим полипептидам, присутствующим в экстракте жидкости, образующейся при вылуплении, до этой стадии очистки. Другие полипептиды могут быть определены как полипептиды, которые не входят в структурное и/или функциональное определение полипептида в композиции для применения в способах согласно изобретению (т.е. фермента вылупления или полипептида яйцевой оболочки или его части), как определено в настоящей заявке. Фармацевтическая или косметическая композиция согласно изобретению (т.е. полученная или получаемая по способу, описанному в настоящей заявке) не содержит лейколектиновые полипептиды, которые определены ниже. Предпочтительно, полипептиды обогащаются по меньшей мере на 10, 20, 30, 40 или 50% на данной стадии. Особенно предпочтительно полипептиды очищены до степени чистоты более 50 или 60%, например > 70, 80 или 90%, предпочтительно более 95 или 99% чистоты по отношению к по меньшей мере одному из других полипептидов, присутствующих в экстракте жидкости, образующейся при вылуплении, до очистки, например, лейколектину. Таким образом, элюат может содержать только следовые количества других полипептидов, таких как лейколектин, которые присутствуют в жидкости, образующейся при вылуплении, до ионообменной хроматографии, например, менее 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001% или 0,00001% мас/мас.

Ионообменная хроматография хорошо известна в данной области техники, и подходящие ионообменные колонки коммерчески доступны. В примере варианта реализации ионообменная колонка представляет собой ДЭАЭ (диэтиламиноэтилльную) колонку, т.е. колонку с инертной матрицей, такой как целлюлоза, силикагель, сефароза т.д., к которой присоединен ДЭАЭ. Тем не менее, другие ионообменные колонки могут быть пригодны для применения в описанном выше способе.

Стадия загрузки фильтрованной жидкости, образующейся при вылуплении, на ионообменную колонку включает нанесение жидкости, образующейся при вылуплении, на ионообменную колонку, которую подготовили или активировали таким образом, что она способна связывать полипептиды композиции согласно изобретению. Подготовка или активация ионообменной колонки обычно включает промывку колонки буфером, например, промывочным буфером, как определено ниже. Данная предварительная стадия промывки приводит ионообменную колонку к оптимальным условиям, например, pH, которые позволяют полипептидам связываться с колонкой. Таким образом, стадию загрузки можно рассматривать как стадию связывания полипептидов композиции согласно изобретению с ионообменной колонкой.

После стадии загрузки фильтрованной жидкости, образующейся при вылуплении, на ионообменную колонку, и в соответствии со стандартными протоколами колонку можно промывать подходящим буфером для удаления нежелательных компонентов, присутствующих в жидкости, образующейся при вылуплении, которые не связались с колонкой. Промывка включает нанесение объема промывочного буфера на колонку, обычно объем промывочного буфера, наносимый на колонку, по меньшей мере равен объему ионообменной колонки и может быть более, например, по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4 или 5-кратного объема колонки. В некоторых вариантах реализации стадия промывки может повторяться, например, 2, 3, 4, 5 или более раз. В способе согласно изобретению можно применять любой подходящий промывочный буфер. Подходящим промывочным буфером является буфер, который существенно не нарушает взаимодействие между целевыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, менее 10%, например, менее 5, 4, 3, 2 или 1%, полипептидов композиции согласно изобретению удаляется из ионообменной колонки каждой стадии промывки. В предпочтительном варианте реализации промывочный буфер представляет собой раствор Трис-HCl в диапазоне 10-100 мМ, предпочтительно 10-50 мМ, например 20-30 мМ, с pH в диапазоне 6-10, предпочтительно 7-9, например 8,5. Промывную жидкость со стадии промывки можно собирать, например, для определения необходимости дальнейших стадий отмывки (например, для испытаний на наличие полипептидов, полисахаридов, солей и т.д., которые представляют нежелательные компоненты, присутствующие в жидкости, образующейся при вылуплении, до очистки), и/или для выброса.

Стадию элюирования лейколектиновых полипептидов из ионообменной колонки («первую» стадию элюирования) можно выполнять при помощи любых подходящих средств, и обычно она включает нанесение растворителя или раствора на колонку для разрушения взаимодействия по меньшей мере между лейколектиновыми полипептидами и ионообменной колонкой, т.е. первого элюирующего раствора (например, буфера) или растворителя. Однако первого элюирующего растворителя или раствора недостаточно для разрушения взаимодействия между целевыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, менее 10%, например, менее 5, 4, 3, 2 или 1% в общей сложности полипептидов композиции согласно изобретению удаляется из ионообменной колонки на стадии элюирования для элюирования лейколектиновых полипептидов. Обычно объем первого элюирующего буфера или растворителя, наносимый на колонку, по меньшей мере равен объему ионообменной колонки и может быть более, например, по меньшей мере 1,5-, 2-, 3-, 4- или 5-кратного объема колонки. В некоторых вариантах реализации «первую» стадию элюирования (т.е. с применением первого элюирующего раствора или растворителя) можно повторять, например, 2, 3, 4, 5 или более раз. Элюат, содержащий лейколектиновые полипептиды (промывная жидкость из «первой» стадии элюирования), можно собирать на каждой стадии элюирования. Альтернативно или дополнительно, элюат, содержащий лейколектиновые полипептиды, отбрасывается. Подходящим первым элюирующим буфером или растворителем является такой, который нарушает взаимодействие между лейколектиновыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99% лейколектиновых полипептидов, связанных с колонкой, элюируется с колонки на каждой стадии элюирования.

В предпочтительном варианте реализации первый элюирующий буфер является таким же, как и промывочный буфер, также содержащий вещество, способное нарушать взаимодействие между лейколектиновыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, соль для обеспечения низкой ионной силы (по отношению ко второму элюирующему буферу). Соль может присутствовать в диапазоне 10-500 мМ, предпочтительно 20-400 мМ, 30-300 мМ, 40-200 мМ или 50-100 мМ, например 50 мМ NaCl. Таким образом, в некоторых вариантах реализации элюирующий буфер представляет собой раствор Трис-HCl в диапазоне 10-100 мМ, предпочтительно 10-50 мМ, например, 20-30 мМ, с pH в диапазоне 6-10, предпочтительно 7-9, например 8,5 также, содержащий соль, например NaCl, KCl и т.д. в диапазоне, описанном выше.

Стадию элюирования полипептидов композиции согласно изобретению из ионообменной колонки («вторую» или «окончательную» стадию элюирования) можно выполнять при помощи любых подходящих средств, и обычно она включает нанесение растворителя или раствора на колонку для разрушения взаимодействия между целевыми полипептидами и ионообменной колонкой. Обычно объем элюирующего буфера или растворителя, наносимый на колонку, по меньшей мере равен объему ионообменной колонки и может быть более, например, по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4 или 5-кратного объема колонки. В некоторых вариантах реализации «вторую» стадию элюирования (т.е. стадию с использованием второго элюирующего раствора или растворителя) можно повторять, например, 2, 3, 4, 5 или более раз. Элюат можно собирать на каждой стадии элюирования, и один или более элюатов можно объединять перед стадией обмена воды в элюате. Подходящим элюирующим буфером или растворителем является такой, который нарушает взаимодействие между полипептидами композиции согласно изобретению и ионообменной колонкой, например, по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, полипептидов композиции согласно изобретению, связанных с колонкой, элюируется из колонки на каждой «второй» стадии элюирования.

В предпочтительном варианте реализации второй элюирующий буфер является таким же, как и промывочный буфер, также содержащий вещество, способное нарушать взаимодействие между целевыми полипептидами и ионообменной колонкой, например, соль для обеспечения более высокой ионной силы, чем у первого элюирующего буфера. Соль может присутствовать в диапазоне 500-2000 мМ, предпочтительно 600-1800 мМ, 700-1700 мМ, 800-1500 мМ или 900-1200 мМ, например примерно 1000 мМ NaCl. Таким образом, в некоторых вариантах реализации элюирующий буфер представляет собой раствор Трис-HCl в диапазоне 10-100 мМ, предпочтительно 10-50 мМ, например, 20-30 мМ, с pH в диапазоне 6-10, предпочтительно 7-9, например 8,5, также содержащий соль, например NaCl, KCl и т.д., в диапазоне, описанном выше.

Стадию замены воды в фильтрате можно выполнять с применением любого подходящего способа, известного в данной области техники, например, диафильтрации или диализа. В особенно предпочтительном варианте реализации эту стадию выполняют с применением диафильтрации с использованием фильтра с размером пропускания менее 12 кДа, предпочтительно 10 кДа или менее, например 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 кДа или менее.

При диафильтрации применяют ультрафильтрационные мембраны для удаления, например, солей или других ненужных или нежелательных микроскопических растворенных частиц (microsolutes) из раствора, или как способ замены растворителя, например, буфера, в растворе. Маленькие молекулы отделяются от раствора, в то время как более крупные молекулы удерживаются в ретентате (материале, который не проходит через фильтр). Микроскопические растворенные частицы и растворители, например, вода, в основном легко вымываются через мембрану. Обычно примерно 3 объема диафильтрационного растворителя (например, фосфатно-солевого буферного раствора) устраняют 95% микроскопических растворенных частиц. Таким образом, вышеуказанный фильтрат, т.е. элюат со стадии (5) первоначально обрабатывают путем диафильтрации, и это приводит к концентрации ретентата пропорционально раствору (который содержит растворимые примеси/ненужные фракции жидкости, образующейся при вылуплении), прошедшему через мембрану. Ретентат затем разбавляют фармацевтически приемлемым буфером, например, 0,5 мМ натрия фосфата и 1 мМ натрия хлорида, фосфатно-солевом буферным раствором и т.д. При необходимости разбавленный ретентат можно повторно подвергать циклам диафильтрации. Обычно перед стадией (f) ретентат разбавляют таким образом, что фильтрат со стадии (f) имеет ферментативную активность 25000-45000 мЕ/л, предпочтительно 25000-35000 мЕ/л и наиболее предпочтительно примерно 30000 мЕ/л. Ферментативную активность фильтрата можно измерять по способности фильтрата расщеплять хромогенный субстрат фактора Ха (CH₃OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA-AcOH, Sigma Aldrich, код продукта: F3301-25MG). До стадии диафильтрации жидкость, образующаяся при вылуплении, может иметь ферментативную активность в диапазоне от 90 до 1300000 мЕ/л. Одна единица (1 Е) может быть определена как количество фермента, необходимого, чтобы катализировать превращение 1 мкмоль субстрата в минуту.

Хромогенный субстрат фактора Ха (Sigma-Aldrich) расщепляется ферментом сериновой протеазой, присутствующей в жидкости, образующейся при вылуплении, с получением желтого продукта, который удобно анализировать с применением спектрофотометрического анализа при длине волны 405 нм. Типичный анализ включает добавление 100 мкл раствора жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (d) или (е) вышеуказанного способа, к 600 мкл раствора субстрата, содержащего 10 мкл хромогенного субстрата фактора Ха (10 мг/мл в Milli Q или дистиллированной воде), 70 мкл 0,2 М Трис-HCl рН 8,5 и 520 мкл дистиллированной H₂O. Изменение оптической плотности можно удобно измерять в течение 5-20 мин (или до часа для образцов с низкой ферментативной активностью), обычно в течение 10 минут. Результат умножают на соответствующий коэффициент, например 10 (для 10 минутного анализа), для получения ферментативной активности на 1 мл образца. Другие подходящие и эквивалентные субстраты можно применять для определения активности жидкости, образующейся при вылуплении.

Как упоминалось выше, в некоторых вариантах реализации может быть предпочтительно синхронизировать стадию вылуплении яиц для максимизации полученного количества жидкости, образующейся при вылуплении, в частности, количества требуемых полипептидов или их частей в жидкости, образующейся при вылуплении, для очистки. Синхронизированное вылупление может быть достигнуто любым подходящим способом, известным в данной области техники. Например, некоторые яйца можно синхронизировать с помощью фото-манипуляции, например, при перемещении яиц со света (который ингибирует вылупление) в условия без освещения. Манипулирование температурой яиц, например, температурой раствора, в котором вылупляются яйца, удалением кислорода из среды вылупления, например удалением кислорода из раствора, в котором вылупляются яйца (Oppen-Berntsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430), увеличение количества углекислого газа в среде вылупления и стимулирование яиц с использованием электричества также можно применять для того, чтобы вызвать синхронизированное вылупление. В некоторых вариантах реализации синхронизированное вылупление может быть достигнуто при помощи феромонов, например, пептидных феромонов, способных влиять на, т.е. стимулировать, развитие эмбриона и вылупление. Как отмечалось выше, икру можно суспендировать в минимальном объеме воды, который может быть эквивалентен объему икры или менее, например, на каждый 1 мл икры можно использовать ≤ 1, 0,75, 0,5, 0,25 мл суспендирующей жидкости, например, от 0,5 до 1 мл. В некоторых вариантах реализации может быть выгодно разбавлять жидкость, образующуюся при вылуплении, для облегчения последующих этапов очистки, например, для уменьшения вязкости жидкость, образующейся при вылуплении. Таким образом, способ может включать дополнительную стадию разбавления жидкости, образующейся при вылуплении. Предпочтительно фильтрат можно разбавлять с учетом коэффициента по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 5000 или 10000.

В предпочтительных вариантах реализации синхронизированное быстрое вылупление икры таково, что вылупление завершается в течение менее 6 часов для более чем 80% эмбрионов. В особенно предпочтительных вариантах реализации, вылупление завершается в течение менее 5, 4, 3 или 2 часа, например, за 0,5-6 часов, 1-5 часов, 1,5-4 часа, 2-3 часов, например, за 1-2 часа. Кроме того, в некоторых вариантах реализации вылупление завершения в сроки, указанные выше, для более чем 85%, 90% или 95% эмбрионов, например, для более чем 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% эмбрионов.

Способ получения фармацевтической или косметической композиции, описанной выше, приводящий к получению обогащенного препарата, который предпочтительно по существу не содержит каких-либо загрязняющих компонентов, происходящих из исходного материала, или материалов, применяемых в процессе выделения, например, компонентов, кроме полипептидов или частей полипептидов, содержащихся в сырой жидкости, образующейся при вылуплении. Другие загрязняющие компоненты включают лейколектиновые полипептиды. В предпочтительном варианте реализации композиция может быть обогащена до степени чистоты более 30, 40, 50 или 60%, например, > 70, 80 или 90% чистоты в расчете мас /мас , (сухой вес) на целевые полипептиды и части полипептидов по сравнению с исходной жидкостью, образующейся при вылуплении, т.е. 90% чистоты относится к потере 90% от исходного материала (загрязняющих компонентов) в ходе процесса получения. Однако, можно применять композиции, которые имеют более низкую чистоту, например, сохраняют более 40, 50, 60, 70, 80 или 90% исходного материала. Тем не менее, даже композиции с низкой чистотой не содержат лейколектиновых пептидов, т.е. менее 0,0005% [мас ./мас ], предпочтительно менее 0,0001, 0,00005 или 0,00001% [мас ./мас ].

Хотя фильтрат со стадии (f) может сам по себе образовывать фармацевтическую или косметическую композицию, необязательно указанный продукт (фильтрат со стадии (f)), полученный или получаемый вышеуказанным способом, может быть разбавлен (или концентрирован) до соответствующей концентрации на стадии (g) для получения фармацевтической или косметической композиции и/или перед его использованием в способах и вариантах применения настоящего изобретения. Таким образом, способ может включать дополнительную стадию разбавления (или концентрирования) композиции. Предпочтительно фильтрат может быть разбавлен (или концентрирован) с учетом коэффициента по меньшей мере 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 1000, 5000 или 10000. Особенно предпочтительно конечная композиция содержит 0,5-10%, например 0,5-5%, предпочтительно 0,5-3% (например, 1 или 3%) фильтрата со стадии (f). В особенно предпочтительном варианте реализации раствор со стадии (е) описанного выше способа, разбавляют или концентрируют для получения раствора с ферментативной активностью 10000-100000 мЕ/л при измерении при помощи описанного выше способа. Предпочтительно раствор, и поэтому фильтрат со стадии (f), обладает активностью 20000-90000, 25000-80000, 25000-60000, 25000-50000, 25000-45000 25000-35000 или мЕ/л. Наиболее предпочтительно раствор имеет активность примерно 30000 мЕ/л.

Необязательно, одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и/или разбавителей могут быть добавлены к композиции, полученной или получаемой при помощи описанного выше способа. Таким образом, стадия (g) получения фармацевтической или косметической композиции из фильтрата со стадии (f) может включать стадию добавления одного или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и/или разбавителей в композицию, или объединение композиции с одним или более фармацевтически приемлемым вспомогательными веществами и/или разбавителями. Альтернативные или дополнительные стадии способа получения включают смену или модификацию растворителя, например pH, ионной концентрации и т.д.

Другие фармацевтически приемлемые компоненты или ингредиенты можно добавлять к композиции, полученной или получаемой при помощи описанного выше способа, например, во время стадии (g). Один или более других компонентов могут являться активными компонентами, т.е. компонентами, которые оказывают влияние на кожу, предпочтительно которые также пригодны для лечения состояния или расстройства кожи, например, состояний или расстройств, описанных в настоящей заявке. Таким образом, альтернативно или дополнительно, способ может включать дополнительную стадию добавления одного или более фармацевтически приемлемого активного компонента в композицию или объединение композиции с одним или более фармацевтически приемлемы активным компонентом на стадии (g). Фармацевтически приемлемые активные компоненты могут включать минеральные вещества, витамины, ферменты, белки, пептиды, аминокислоты, липиды, антиоксиданты, полисахариды, вещества, пригодные в качестве солнцезащитных фильтров, химические отшелушивающие средства, экстракты и их смеси, как описано более подробно ниже.

Фармацевтическая или косметическая композиция, полученная или получаемая при помощи описанных выше способов, подходит для использования в способах согласно изобретению, как описано другом месте настоящей заявки.

Фармацевтическая или косметическая композиция согласно изобретению содержит комбинацию ферментов вылупления и полипептидов яйцевой оболочки или частей полипептидов, которые особенно подходят для применения при лечении различных состояний или расстройств кожи.

В частности, композиции согласно изобретению содержат фермент вылупления с металлопротеиназной активностью, фермент вылупления с серинпротеазной активностью и один или более полипептидов яйцевой оболочки или их частей, предпочтительно в которых указанные части структурно эквивалентны частям, образующимся путем протеолитического расщепления полимеризованной и поперечно-сшитой яйцевой оболочки или хориона посредством ферментов вылупления во время вылупления. Полипептиды могут упоминаться в настоящей заявке как целевые полипептиды.

Последовательность металлопротеиназы, приводимая в качестве примера, которая может присутствовать в композициях согласно изобретению, представлена в SEQ ID №1.

Сериновая протеаза, приводимая в качестве примера, которая может присутствовать в композиции согласно изобретению, может быть охарактеризована как полипептид с молекулярной массой около 28 кДа, который имеет следующие свойства:

a) расщепляет хромозим X;

b) ингибируется бензамидином;

c) расщепляет пептидные связи с аргинином;

d) остается активным в присутствии 8 М мочевины, молярных концентраций соли, дистиллированной воды и органических растворителей, предпочтительно диоксана или пропанола; и

e) сохраняет ферментативную активность в растворе при комнатной температуре в течение 50 дней.

Предпочтительно сериновую протеазу можно получить в очищенном виде при помощи способа, включающего стадии:

a) суспендирование икры, например, лосося, в минимальном объеме воды;

b) индукцию синхронизированного быстрого вылупления указанной икры;

c) фильтрацию вылупившейся икры с получением жидкости, образующейся при вылуплении;

d) добавление твердой мочевины к указанной жидкости, образующейся при вылуплении, для диссоциации фрагментов яйцевой оболочки и обработку данной жидкости низкоскоростным центрифугированием;

e) дальнейшую очистку указанной сериновой протеазы путем обработки отцентрифугированного супернатанта посредством гель-фильтрации; и

f) дальнейшую очистку указанной сериновой протеазы путем аффинной хроматографии на бензамидин-модифицированной колонке Superose 6В®, где указанную аффинную хроматографию выполняют посредством промывки концентрированной солью с последующим элюированием диоксаном в концентрированном растворе соли для извлечения полипептидов с серинпротеазной активностью, связанных с хроматографической матрицей или макромолекулярными структурами.

Полипептиды яйцевой оболочки представляют собой структурные белки, которые поперечно сшиты с образованием хориона. Полипептиды яйцевой оболочки и их части присутствуют в жидкости, образующейся при вылуплении, из-за разрушения яйцевой оболочки. В некоторых вариантах реализации полипептиды яйцевой оболочки, обнаруживаемые в композиции согласно изобретению, предпочтительно являются кислыми или очень кислыми, например, имеют pI от 3 до 5,5, предпочтительно от 3,5 до 5,2.

Полипептиды яйцевой оболочки присутствуют в жидкости, образующейся при вылуплении, в различных формах, в частности, в виде частей или фрагментов полноразмерных полипептидов. Поскольку полноразмерные полипептиды яйцевой оболочки содержат части, которые присутствуют в жидкости, образующейся при вылуплении, предполагается, что и полноразмерные полипептиды яйцевой оболочки и их части найдут применение в настоящем изобретении. Кроме того, различные изоформы полипептидов яйцевой оболочки и их частей обнаружены в жидкости, образующейся при вылуплении.

В настоящей заявке раскрыты три примера полипептидов яйцевой оболочки, которые могут присутствовать в композициях согласно изобретению. Последовательности некоторых полипептидов яйцевой оболочки, найденные в жидкости, образующейся при вылуплении, определены с помощью масс-спектроскопии и представлены в SEQ ID №2-4. Данные последовательности представляют собой части или фрагменты полипептидов, полученных из полноразмерных полипептидов яйцевой оболочки, которые представлены в SEQ ID №8, 6 и 7, соответственно. Следовательно, SEQ ID №2-4 могут быть определены как части полипептидов яйцевой оболочки, как определено в настоящей заявке.

Как уже упоминалось выше, каждый полипептид яйцевой оболочки или его часть может существовать в различных изоформах.

Таким образом, компоненты фармацевтической или косметической композиции, полученной или получаемой описанным выше способом, могут быть определены как:

(i) металлопротеиназа, содержащая аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №1, или последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична указанной последовательности;

(ii) сериновая протеаза, получаемая описанным выше способом; и

(iii) полипептид яйцевой оболочки, выбранный из любого одного или более:

(a) полипептида яйцевой оболочки, содержащего аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, или последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична указанной последовательности;

(b) полипептида яйцевой оболочки, содержащего аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №3, или последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична указанной последовательности; и

(c) полипептида яйцевой оболочки, содержащего аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №4, или последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична указанной последовательности; или

(iv) часть любого полипептида, охарактеризованного в (i)-(iii), при этом часть имеет длину, как описано ниже;

и одного или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и/или разбавителей. (Указанная по меньшей мере 70% идентичность последовательности представляет собой предпочтительно по меньшей мере 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности.)

Как упоминалось выше, в некоторых вариантах реализации более длинные последовательности, чем те, что представлены в SEQ ID №2-4, могут присутствовать в композиции. Таким образом, в приведенном выше списке, SEQ ID №2-4 могут быть заменены на SEQ ID №5-7, соответственно, и где последовательность SEQ ID №2 в качестве альтернативы может быть заменена на SEQ ID №8.

Как уже упоминалось выше, фармацевтическая или косметическая композиция, описанная в настоящей заявке, не содержит функциональный лейколектиновый полипептид или его функциональную часть. Лейколектиновый полипептид может быть определен как полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, как указано в любой из SEQ ID №9-12, или последовательность, которая по меньшей мере на 50% идентична указанной последовательности, или как часть любой из указанных последовательностей.

Функциональный лейколектиновый полипептид представляет собой полипептид, который способен ингибировать высвобождение матричных металлопротеиназ (ММР), которые представляют собой цинк-зависимые эндопептидазы фибробластов кожи. Следовательно, полипептид, который попадает в структурное определение лейколектинового полипептида, определенного выше, можно рассматривать как нефункциональный лейколектиновый полипептид, если он имеет менее 50, 40, 30, 20, 10 или 5% активности функционального лейколектина, например, любой из SEQ ID №9-12, как определено способностью полипептидов ингибировать высвобождение матричных металлопротеиназ (ММР) в клеточных культурах in vitro. Другими словами, функциональный лейколектиновый полипептид должен иметь по меньшей мере 50, 70 или 90% активности функционального лейколектина, например, любого из SEQ ID №9-12, как определено способностью полипептидов ингибировать высвобождение матричных металлопротеиназ (ММР) в клеточных культурах in vitro.

Суммарная концентрация полипептидов или их частей в композициях, описанных в настоящей заявке, может изменяться. Однако, в предпочтительном варианте реализации доля каждого типа полипептидов или групп полипептидов постоянна для всех композиций, т.е. не зависит от суммарной концентрации полипептида. В особенно предпочтительных вариантах реализации доля полипептидов в композиции, как описано выше, в виде процента от суммарного количества полипептидов в композиции может быть определена как:

(i) примерно от 0,05 примерно до 0,20% [мас./мас.] металлопротеиназы, предпочтительно примерно от 0,100% примерно до 0,125%, так например примерно от 0,108% примерно до 0,112% металлопротеиназы;

(ii) примерно от 0,15% примерно до 0,40% [мас./мас.] сериновой протеазы, предпочтительно примерно от 0,255% примерно до 0,310%, так например примерно от 0,275% примерно до 0,290% сериновой протеазы; и

(iii) примерно от 99,40% примерно до 99,80% [мас./мас.] суммарных полипептидов яйцевой оболочки или части указанных полипептидов, предпочтительно примерно от 99,575% примерно до 99,645%, так, например, примерно от 99,598% примерно до 99,617% суммарных полипептидов яйцевой оболочки или части указанных полипептидов.

Как изложено в настоящей заявке, указанные суммарные полипептиды яйцевой оболочки или их части включают в себя полипептиды яйцевой оболочки, указанные выше, и другие очень кислые белки яйцевой оболочки, которые можно получить осаждением полипептидов, ассоциированных с яйцевыми оболочками, посредством 4-кратного объема ацетона, и имеют pI от 3 до 5,5.

Таким образом, доля любого полипептида яйцевой оболочки или части указанного полипептида в композиции согласно изобретению может составлять примерно 0-99,80% [мас /мас ] суммарных полипептидов в композиции, так например, 1-95%, 2-90%, 3-85%, 4-80%, 5-75%, 10-70%, 15-65%, 20-55%, 25-50% или 30-40%, при этом суммарная доля полипептидов яйцевой оболочки или части указанных полипептидов в композиции не превышает 99,80% суммарных полипептидов в композиции. Предпочтительно, суммарная доля полипептидов яйцевой оболочки или части указанных полипептидов в композиции не превышает 99,617% суммарных полипептидов в композиции.

Ссылки на фармацевтическую композицию в настоящей заявке, могут быть прочитаны как охватывающие косметические композиции.

«Полипептиды», как изложено в настоящей заявке, представляют собой молекулы с предпочтительно более 50, 100, 150, 200 или 250 остатками и/или менее 500, 400, 300, 200 или 100 остатками, или в выбранном из них диапазоне. Как изложено в настоящей заявке, «часть» предпочтительно включает по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 или более аминокислот последовательности, из которых она получена. Указанная часть может быть получена из центрального или N-концевого или С-концевого участков последовательности. Предпочтительно указанная часть получена из N-концевого участка, например, из первых 50, 100 или 150 остатков полипептида. Альтернативно, предпочтительные части получены из С-концевого участка, например, из последних 50, 100 или 150 остатков полипептида.

Предпочтительно полипептидные последовательности, описанные в настоящей заявке, по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны последовательности (SEQ ID №1-12), с которой их сравнивают.

Идентичность последовательности можно определить, например, с помощью базы данных белковых последовательностей SWISS-PROT с применением FASTA рер-cmp с варьируемым pam-фактором, и штрафом на внесение делеции (gap creation penalty) с установкой на 12,0 и штрафом на продолжение делеции (gap extension penalty) с установкой на 4,0, и окном из 2 аминокислот. Предпочтительно упомянутое сравнение производится по всей длине последовательности, но может быть выполнено на меньшем окне сравнения, например, менее 200, 100 или 50 смежных аминокислот.

Предпочтительно, например, родственные полипептиды с идентичностью последовательности функционально эквивалентны полипептидам, которые приведены в перечисленных ниже №последовательностей. Такие функционально эквивалентные полипептиды могут принимать форму производных, как изложено ниже.

Кроме того, «части», как описано в настоящей заявке, могут быть функционально эквивалентными. Предпочтительно данные части удовлетворяют условиям идентичности (относительно сопоставляемого участка), упомянутым в настоящей заявке.

Как изложено в настоящей заявке, для достижения «функциональной эквивалентности» полипептид может проявлять некоторое снижение эффективности при выполнении ферментативной активности и/или фармацевтической или косметической функции по отношению к родительской молекуле (т.е. молекуле, с которой он связан идентичностью последовательности), но предпочтительно является таким же эффективным или более эффективным. Таким образом, функциональная эквивалентность относится к полипептиду, который является эффективным при лечении расстройств или состояний кожи, как описано ниже. Это можно проверить путем сравнения действия производного (т.е. родственной последовательности) полипептида относительно полипептида, к которому он относится, в качественном или количественном выражении, например, путем выполнения анализов in vivo, указанных в примерах. Когда возможны количественные результаты, производное обладает по меньшей мере 30, 50, 70 или 90% эффективности родительского полипептида. Альтернативно или дополнительно, можно выполнять тестирование in vitro, например, при помощи анализа способности ферментов вылупления расщеплять подходящие полипептидные или пептидные субстраты, такие как фактор X, например, субстраты металлопротеиназы или сериновой протеазы.

Особенно предпочтительными функционально эквивалентными вариантами являются природные биологические вариации (например, аллельные варианты или географические вариации внутри видов или альтернативно в разных родах, например, рыб).

Соответственно, в предпочтительном варианте реализации подходящие рыбы, в частности икра, из которой можно получить композицию согласно изобретению (т.е. исходный материал, из которого могут быть получены полипептиды, содержащиеся в композициях, и композиции согласно изобретению), включают любых рыб инфракласса Teleostei, который является одним из трех инфраклассов класса Actinopterygii. Следовательно, рыба может быть выбрана из рыбы любого надотряда, выбранного из группы, состоящей из Osteoglossomorpha, Elopomorpha, Clupeomorpha, Ostariophysi, Protacanthopterygii, Stenopterygii, Cyclosquamata, Scopelomorpha, Lampridiomorpha, Polymyxiomorpha, Paracanthopterygii и Acanthopterygii.

В некоторых вариантах реализации рыба может быть выбрана из рыбы любого отряда, выбранного из группы, состоящей из Osteoglossiformes, Hiodontiformes, Elopiformes, Albuliformes, Notacanthiformes, Anguilliformes, Saccopharyngiformes, Clupeiformes, Gonorynchiformes, Cypriniformes, Characiformes, Gymnotiformes, Siluriformes, Argentiniformes, Salmoniformes, Esociformes, Osmeriformes, Ateleopodiformes, Stomiiformes, Aulopiformes, Myctophiformes, Lampriformes, Polymixiiformes, Percopsiformes, Batrachoidiformes, Lophiiformes, Gadiformes, Ophidiiformes, Mugiliformes, Atheriniformes, Beloniformes, Cetomimiformes, Cyprinodontiformes, Stephanoberyciformes, Beryciformes, Zeiformes, Gobiesociformes, Gasterosteiformes, Syngnathiformes, Synbranchiformes, Tetraodontiformes, Pleuronectiformes, Scorpaeniformes Perciformes и Acipenseriformes.

В предпочтительных вариантах реализации рыба может быть выбрана из рыбы любого отряда, выбранного из группы, состоящей из Salmoniformes, Cypriniformes, Perciformes, Siluriformes, Mugiliformes и Acipenseriformes.

В особенно предпочтительных вариантах реализации рыба может быть выбрана из рыбы любого семейства, выбранного из группы, состоящей из Salmonidae, Cyprinidae, Cichlidae, Pangasiidae, Sciaenidae, Serranidae, Carangidae, Sparidae, Lateolabracidae, Moronidae, Mugilidae, Latidae, Eleotridae и Acipenseridae.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации рыба может являться склеропагесом, серебристым гиодоном, сельдевидным гиодоном, корюшковидной силлагой, тарпоном, альбулой, галозавром, нотакантом, пресноводным угрем, мешкоротом, угрем-мешкоротом, сельдью, анчоусом, молочной рыбой, барбусом, карпом, данио, серебряным карасем, вьюном, гольяном, расборой, харацинидой, пецилобриконом, рыбой-топориком, пираньей, тетрой, электрическим угрем, спинопером, зубаткой, опистопроктом, гладкоголовом, лососем, форелью, щукой, корюшкой, галаксией, ателеопом, циклотоной, морской рыбой-топориком, индоокеанским бомбилем, алепизавром, миктофом, сельдяным королем, опахом, ремень-рыбой, полимиксией, слепоглазкой, лососеокунем, иглобрюхом, удильщиком, треской, карапусом, серебристой арованой, кефалью, атериной, гуппи, летучей рыбой, китовидковидной рыбой, живородящей рыбой, фундулюсом, меламфаем, саблезубом, австралийским шишечником, солнечником, прилипалой, колюшкой, морской иглой, морским коньком, рисовым угрем, спинорогом, рыбой-собакой, камбалой, скорпеной, подкаменщиком, анабасом, окунем, цихлидой, бычком, гурами, скумбрией, окунем, скатом, мерлангом или губаном.

В особенно предпочтительных вариантах реализации рыба может быть любого вида, выбранного из белого амура (Ctenopharyngodon idella), белого толстолобика (Hypophthalmichthys molitrix), катли (Catla catla), сазана (Cyprinus carpid), пестрого толстолобика {Hypophthalmichthys nobilis), золотого карася (Carassius carassius), нильской тилапии (Oreochromis niloticus niloticus), пангасиуса (Pangasius pangasius), poxy (Labeo rohitd), атлантического лосося (Salmo salar), большого желтого горбыля (Larimichthys croced), групера таувина (Epinephelus tauvina), кумжи (Salmo trutta trutta), японской лакедры (Seriola quinqueradiata), золотистого спара (Sparus aurata), судака морского японского (Lateolabrax japonicus), обыкновенного лаврака (Dicentrarchus labrax), австрало-новозеландского морского карася (Chrysophrys auratus), черной кефали (Mugil cephalus), баррамунди (Lates calcarifer), мраморного гоби (Oxyeleotris marmoratd), мозамбикской тилапии (Oreochromis mossambicus), микижи (Oncorhynchus mykiss), кижуча (Oncorhynchus kisutch), чавычи (Oncorhynchus tshawytscha), горбуши (Oncorhynchus gorbuscha), кеты (Oncorhynchus keta), нерки (Oncorhynchus nerka), сибирского осетра (Acipenser baerii) и русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii).

В некоторых вариантах реализации фармацевтические или косметические композиции могут быть получены или получаемыми из жидкости, образующейся при вылуплении, от более одного вида рыбы, в частности из более одного типа икры, т.е. икры от одной или более любой рыбы, описанной выше. Например, жидкость, образующаяся при вылуплении, от двух или более типов икры можно использовать в способе, описанном в настоящей заявке, для получения фармацевтической или косметической композиции согласно изобретению. Следовательно, способ согласно изобретению может включать стадию объединения жидкости, образующейся при вылуплении, собранной из вылупившихся яиц одного или более организмов, например, до или после фильтрации.

Термин «фармацевтически приемлемый», «физиологически приемлемый» или «косметически приемлемый» означает, что ингредиент должен быть пригоден для терапевтического и/или косметического применения и композиций. Ингредиенты также должны быть совместимы с другими ингредиентами композиции, а также физиологически приемлемы для потребителя.

Активные ингредиенты, т.е. полипептидные компоненты композиции, получаемой описанным выше способом, для введения могут быть соответствующим образом модифицированы для применения в фармацевтической или косметической композиции. Например, композицию, применяемую в соответствии с настоящим изобретением, можно стабилизировать против разрушения, например, при помощи применения соответствующих добавок, таких как соли или неэлектролиты, ацетат, ДСН, ЭДТА, цитратные или ацетатные буферы, маннит, глицин, HSA или полисорбат.

Полипептидные компоненты, полученные или получаемые при помощи способов, описанных в настоящей заявке, могут присутствовать в композициях для терапевтического или косметического применения в качестве единственного активного ингредиента или могут быть объединены с другими ингредиентами, в частности с другими активными ингредиентами, например, для усиления терапевтического или косметического эффекта (как описано выше) или для того, чтобы сделать композицию более привлекательной для потребителя.

Композиция, описанная в настоящей заявке, может также содержать примеси, например, после получения указанной композиции из одного из природных источников, описанных выше. В композициях, описанных в настоящей заявке, различные полипептиды или части полипептидов, получаемые из жидкости, образующейся при вылуплении рыб (т.е. суммарный полипептидный компонент), могут присутствовать (в комбинации) в диапазоне от 0,001 до 50% мас ./мас . композиции, полученной в соответствии с вышеописанным способом (или в 10-100 раз ниже, если композицию разбавили на стадии (g)). Предпочтительно указанные полипептиды или части полипептидов, получаемые из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, присутствуют (в комбинации) в диапазоне от 0,0005 до 10% мас ./мас . композиции (или не более 10-40%), например, от 0,001 до 5%, от 0,001 до 3%, от 0,001 до 2%, от 0,001 до 1%, от 0,001 до 0,5%, от 0,001 до 0,15% мас ./мас . композиции, полученной в соответствии с вышеописанным способом (например, 0,05-0,5% мас ./мас . или 0,0005-0,005% мас ./мас . при разбавлении на конечной стадии). Соответственно, отдельные полипептиды или части полипептидов, получаемые из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, могут присутствовать в диапазоне от 1×10^-5 до 10% мас ./мас . композиции. В некоторых вариантах реализации указанные отдельные полипептиды или части полипептидов, получаемые из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, могут присутствовать в диапазоне от 1×10^-5 до 5% мас ./мас . композиции, например, от 1×10^-5до 4%, от 1×10^-5 до 3%, от 1×10^-5 до 2%, от 1×10^-5 до 1%, от 1×10^-4 до 0,5%, от 1×10^-4 до 0,15%, от 1×10^-4 до 0,1% или от 1×10^-4 до 0,01% мас ./мас . фармацевтической или косметической композиции, если нет дальнейшего разбавления на стадии (g), или с уменьшением на коэффициент, например, например, 10-200, например, 30-100 при разбавлении на стадии (g).

Доля полипептидов или части полипептидов, получаемых из жидкости, образующейся при вылуплении рыб, в композициях может быть определена по отношению к другим растворенным веществам (solutes) в композиции, т.е. за исключением растворителей, например, воды. Таким образом, указанные полипептиды или части полипептидов, в комбинации, могут присутствовать в диапазоне 1-100% мас./мас. сухой мас ы композиции. В некоторых вариантах реализации полипептиды или части полипептидов, в комбинации, могут присутствовать в диапазоне 1-90% мас./мас. сухой мас ы композиции, например 5-80%, 10-75%, 20-70%, 30-65% мас./мас, например примерно 68 или 69% мас./мас. сухой мас ы композиции. Таким образом, отдельные полипептиды или части полипептидов могут присутствовать в диапазоне от 0,001 до 80% мас ./мас . сухой мас ы композиции, например, от 0,0001 до 75%, от 0,001 до 70%, от 0,01 до 60% мас./мас, от 0,05 до 50% мас./мас сухой мас ы композиции. Как описано в настоящей заявке, композицию можно разбавлять на стадии (g) для применения в соответствии с изобретением.

В другом аспекте настоящего изобретения, композиции, как описано в настоящей заявке, предназначены для терапевтического применения.

Как уже упоминалось выше, полипептиды или части указанных полипептидов в композиции согласно изобретению проявляют терапевтические свойства при лечении аномалий, расстройств или состояний кожи путем увлажнения и/или отшелушивания кожи.

Предпочтительные аномалии, состояния или расстройства кожи, подлежащие обработке, представляют собой сухую кожи, кожу, в которой роговой слой толще, чем требуется, например, при гиперкератозных состояниях, или кожу с нежелательной пигментацией на эпидермисе, например, печеночные, возрастные, солнечные или коричневые пятна. Обработка может быть косметической, например, обработка нормальной, но сухой кожи или утолщенной кожи (например, натоптышей, мозолей или гиперкератозных бородавок), или лечение нарушений пигментации, таких, как печеночные пятна, или лечение может быть терапевтическим, например лечение акне, экземы, псориаза или бородавок, которые приводят к боли.

Как изложено в настоящей заявке, термин «расстройство» относится к лежащему в основе патологическому симптоматическому или бессимптомному нарушению в организме по отношению к нормальному организму, которое может возникать, например, вследствие инфекции или приобретенного или врожденного генетического дефекта. «Аномалия» или «состояние» относится к нарушению или дефекту кожи относительно нормальной оптимальной кожи, которые не являются, однако, результатом патологического расстройства. Вместе с тем дефект/расстройство может происходить из-за возраста, травмы, факторов окружающей среды, уровня гормонов, медикаментозного лечения, нанесенных снаружи или поглощенных материалов, генетических заболеваний или множества других факторов, которые приводят к нарушению функции кожи, приводя к нарушениям.

Расстройство, аномалия или состояние может быть лишь косметическим или не косметическим, требующим медицинского лечения, или их комбинацией.

Как изложено в настоящей заявке, термин «косметический» предназначен для обозначения обработки, которая не вылечивает, лечит или предотвращает заболевание или расстройство, но вместо этого служит в качестве средства для ухода за кожей или для изменения или улучшения внешнего вида кожи, например, цвета, текстуры и содержания влаги в коже.

«Не косметический» (или медицинский) ингредиент, применяемый в медицинских процедурах, как описано в настоящей заявке, служит для вылечивания, уменьшения, лечения или предотвращения одного или более симптомов расстройства, например, боли или дискомфорта.

Основой обработок, описанных в настоящей заявке, является увлажняющие и отшелушивающее действие на кожу ферментов вылупления и полипептидов яйцевой оболочки, описанных в настоящей заявке. Эти эффекты показаны в примерах, представленных в настоящей заявке.

Таким образом, рассматриваются процедуры, основанные на увлажняющих и/или отшелушивающих свойствах композиции, содержащей ферменты вылупления и полипептиды яйцевой оболочки.

Таким образом, в изобретении предложен косметический или некосметический способ отшелушивания и/или увлажнения кожи животных, в котором косметическую или фармацевтическую композицию, как описано выше, вводят указанному животному.

Таким образом, ссылаясь на вышесказанное, в настоящем изобретении предложен косметический или некосметический способ отшелушивания и/или увлажнения кожи животного, в котором косметическую или фармацевтическую композицию вводят указанному животному, где указанная композиция получена или получаема по способу, описанному в настоящей заявке.

Как изложено в настоящей заявке, термин «отшелушивание» относится к удалению поверхностных клеток с поверхности эпителия, которое на коже приводит к шелушению или слущиванию рогового слоя эпидермиса. Термин «увлажняющий», как изложено в настоящей заявке, охватывает увлажняющие средства, которые предотвращают потерю воды из кожи, а также увлажняющие средства (увлажнители), которые притягивают и удерживают воду при нанесении на кожу, и смягчающие средства (которые улучшают неполноценное слущивание).

Иначе говоря, в настоящем изобретении предложена косметическая или фармацевтическая композиция, как описано в настоящей заявке, для применения для отшелушивания и или увлажнения кожи животных. (Композицию альтернативно можно применять для получения лекарственного средства для этой цели.)

Как уже упоминалось выше, такие отшелушивание и/или увлажняющие свойства являются предпочтительными для лечения или профилактики различных аномалий, расстройств или состояний кожи.

В предпочтительном аспекте аномалия, состояние или расстройство кожи, которое подлежит лечению или профилактике, представляет собой сухую кожу. Ее можно лечить путем увлажнения и/или отшелушивания.

Термин «сухая кожа», как изложено в настоящей заявке, относится к эпидермису, которому не хватает влаги или кожного сала, и который часто характеризуется сетью мелких морщин, шелушением и зудом. Сухая кожа может быть самостоятельным состоянием кожи (например, из-за возраста, повреждения теплом/холодом/сухостью) или может быть симптомом расстройства или состояния кожи, такого как повреждение солнцем, экзема, контактный дерматит, псориаз или ихтиоз (наследственное заболевание, вызывающее заметное шелушение кожи).

В другом предпочтительном аспекте аномалия, состояние или расстройство, которое подлежит лечению или профилактике, представляет собой утолщенный роговой слой кожи. Их можно лечить путем увлажнения и/или отшелушивания.

Такой утолщенный роговой слой кожи может присутствовать при состояниях, таких как натоптыши или мозоли, которые являются защитными подушками, состоящими из утолщенного верхнего слоя кожи из-за повторного натирания области, или при бородавках на коже. Такие методы также можно применять для лечения или профилактики акне, которое в своей патологии включает кератинизацию. Утолщенный роговой слой кожи может быть состоянием самим по себе или может быть симптомом состояния или расстройства кожи.

В другом предпочтительном аспекте аномалия, состояние или расстройство, которое подлежит лечению или профилактике, представляет собой нарушения пигментации или аномалии на коже. Их можно лечить путем отшелушивания.

Нарушения пигментации или аномалии на коже могут возникнуть в результате возраста, гормональных изменений, генетических факторов, болезни или солнца или других повреждений. Изменение пигментации может происходить в результате локального избытка меланоцитов или увеличения активности меланоцитов, или того и другого. Нарушения пигментации включают печеночные, солнечные или возрастные пятна (солнечное лентиго) и другие дефекты, такие как веснушки.

Иначе говоря, в настоящем изобретении, таким образом, предложен косметический или некосметический способ лечения или профилактики состояния или расстройства кожи животного, где указанная кожа является чрезмерно сухой, роговой слой кожи чрезмерно утолщен или кожа имеет нарушение пигментации, при котором косметическую или фармацевтическую композицию, описанную выше, вводят указанному животному. Указанные состояния или расстройства предпочтительно представляю собой такие, как описано выше.

Как изложено в настоящей заявке, «аномалия» определяется относительно нормальной оптимальной кожи, т.е. здоровой, увлажненной, нормально пигментированной и не возрастной кожи.

В другом альтернативном варианте в настоящем изобретении предложена косметическая или фармацевтическая композиция, описанная в настоящей заявке, для применения в косметическом или некосметическом способе лечения или профилактики состояния или расстройства кожи животного, где указанная кожа является чрезмерно сухой, роговой слой кожи чрезмерно утолщен или кожа имеет нарушение пигментации. (Соединение или композицию альтернативно можно применять для получения лекарственного средства для этой цели.)

Было установлено, что композиции согласно изобретению особенно пригодны для уменьшения размера пор кожи. В связи с этим, акне отчасти происходит из-за накопления мертвых клеток кожи в порах (гиперкератинизации протока сальной железы). Было обнаружено, что композиции согласно настоящему изобретению способствуют нормализации отслоения клеток кожи внутри поры и предотвращают ее закупорку, что наряду с жиром и бактериями может приводить к поражениям кожи, например, воспалительным поражениям, таким как папулы и пустулы, и невоспалительным поражениям, таким как черные точки и белые угри. Следовательно, композиции, описанные в настоящей заявке, можно применять для косметического или некосметического способа уменьшения размера пор кожи.

В альтернативном варианте композиции согласно изобретению можно применять для косметического или некосметического способа лечения или профилактики акне, например, воспалительных и/или невоспалительных поражений кожи, таких как папулы, пустулы, черные точки и/или белые угри. (Соединение или композицию альтернативно можно применять для получения лекарственного средства для этой цели.)

В предпочтительном аспекте медицинское и/или косметическое применение достигаются путем местного применения на коже.

Таким образом, в особенно предпочтительном аспекте косметические или фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, можно применять для лечения расстройств, при которых кожа является чрезмерно сухой, роговой слой кожи чрезмерно утолщен или при которых присутствует нарушение пигментации, например, для натоптышей, мозолей, бородавок, экземы, контактного дерматита, псориаза, ихтиоза, акне и печеночных пятен.

В другом особенно предпочтительном аспекте косметические или фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, можно применять для лечения расстройств, при которых кожа является чрезмерно сухой.

Как изложено в настоящей заявке, термин «лечение» относится к уменьшению, облегчению или устранению, предпочтительно до нормальных уровней, одного или более симптомов или воздействий указанного состояния или расстройства, например, наличия или степени сухой или утолщенной кожи, степени или области пигментация, зуда или боли т.д. по сравнению с симптомами или воздействиями, присутствующими на других частях тела указанного индивидуума, где кожа не страдает от указанного состояния или расстройства и не подвергалась указанному лечению, или у соответствующего нормального индивидуума, которого не подвергали указанному лечению.

«Профилактика» относится к абсолютному предотвращению, или уменьшению или облегчению степени или времени (например, задержке) указанного симптома или эффекта. Например, состояния, характерные для сухой, утолщенной или аномально пигментированной кожи, можно предотвратить регулярным применением композиции согласно изобретению до появления такого состояния.

Способ лечения или профилактики в соответствии с настоящим изобретением можно успешно сочетать с введением одного или более активных ингредиентов, которые эффективны при лечении или профилактике расстройств или состояний и/или для достижения увлажнения или отшелушивания. Таким образом, косметические или фармацевтические композиции согласно изобретению могут дополнительно содержать один или более таких активных ингредиентов.

Согласно еще одному аспекту изобретения, авторами предложены косметические или фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, и необязательно один или более дополнительных активных ингредиентов в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения людей или животных, предпочтительно, как описано в настоящей заявке.

Композиции согласно изобретению можно получить обычным способом с одним или более физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами и/или разбавителями в соответствии с методами, хорошо известными в данной области техники, с применением легко доступных ингредиентов.

Композиции, описанные в настоящей заявке, можно получить обычным способом с одним или более физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами и/или разбавителями в соответствии с методами, хорошо известными в данной области техники, с применением легко доступных ингредиентов. Композиции могут быть изготовлены на водной основе, на основе глицерина, на основе спирта (не более 20%), на основе акрилатных эмульсий масло в воде, на основе ксантановой камеди в виде эмульсий масло в воде или эмульсий вода в масле, например, с pH 3,5-11, предпочтительно с pH 5,5-9.

Таким образом, композиции можно объединять, необязательно вместе с другими активными веществами в виде комбинированного препарата, с одним или более обычными носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами для получения типичных галеновых препаратов, таких как таблетки, пилюли, порошки, пастилки, саше, крахмальные капсулы, эликсиры, суспензии (в виде инъекционных или инфузионных жидкостей), эмульсии, растворы, сиропы, аэрозоли (в виде твердого вещества или в жидкой среде), мази, мягкие и твердые желатиновые капсулы, суппозитории, стерильные растворов для инъекций, стерильные упакованные порошки и тому подобное. Биоразлагаемые полимеры (такие как полиэфиры, полиангидриды, полимолочная кислота или полигликолевая кислота) также можно применять для твердых имплантатов. Композиции можно стабилизировать при помощи сублимационной сушки, переохлаждения или Пермазима (Permazyme). Такие композиции образуют композиции согласно изобретению (т.е. полученные в соответствии с этапом (g)).

Подходящие вспомогательные вещества, носители или разбавители представляют собой лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, аравийскую камедь, фосфат кальция, карбонат кальция, кальций-лактозу, кукурузный крахмал, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, водный сироп, воду, воду/этанол, воду/гликоль, воду/полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоаты, пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния, минеральное масло или жирные вещества, такие как твердый жир или их подходящие смеси. Также можно использовать агенты для получения препаратов с замедленным высвобождением, такие как карбоксиполиметилен, карбоксиметилцеллюлозу, ацетат-фталат целлюлозы или поливинилацетат.

Композиции могут дополнительно содержать смазывающие агенты, смачивающие агенты, эмульгаторы, агенты, повышающие вязкость, гранулирующие агенты, дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты, осмотически активные агенты, суспендирующие агенты, консерванты, подсластители, вкусовые добавки, усилители адсорбции (например, агенты, улучшающие проникновение вещества через поверхность, например, соли желчных кислот, лецитины, поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, комплексообразователи), агенты, вызывающие покоричневение, органические растворители, антиоксиданты, стабилизирующие агенты, смягчающие вещества, силикон, альфагидроксикислоты, средство, уменьшающее раздражение, пеногаситель, увлажняющий агент, витамины, ароматизирующее вещество, ионогенные или неионогенные загустители, поверхностно-активные вещества, наполнитель, ионогенный или неионогенный загуститель, секвестрант, полимер, пропеллент, подщелачивающий или подкисляющий агент, замутнитель, окрашивающие агенты и жирные соединения и тому подобное. Некоторые из этих компонентов более подробно описаны ниже.

Другие активные ингредиенты или компоненты в косметической или фармацевтической композиции могут быть выбраны из любого одного или более минеральных веществ, витаминов, ферментов, белков, пептидов, аминокислот, липидов, полисахаридов, веществ, пригодных в качестве солнцезащитных фильтров, химических отшелушивающих средств, экстрактов, кондиционирующих добавок для кожи, антиоксидантов и их смеси.

Примеры дополнительных белков, которые могут быть включены в композицию согласно настоящему изобретению, включают коллаген и/или его производное (например, его части, как определено выше), белок или пептид, который способен стимулировать рост клеток, гликопротеин 1, гликопротеин 2 и ламинин.

Композиция согласно изобретению может содержать ферменты, включая, но не ограничиваясь, любой из одного или более фруктовых ферментов (например, бромелайн), супероксиддисмутазы, пероксидазы, гиалуронидазы и мукополисахаридазы.

Пептиды могут быть выбраны из любого одного или более D,L-карнозина, D-карнозина, L-карнозина, анзерина и Матриксила (пентапептидное производное), но не ограничиваясь перечисленным.

Аминокислоты могут быть выбраны из любого одного или более L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина, L-цистина, глицина, L-глутамина, L- глутаминовой кислоты, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина и их производных, включая неприродные аминокислоты, но не ограничиваясь перечисленным, как определено в таблице 1.

Особенно предпочтительно аминокислоты в качестве антиоксидантов могут быть выбраны из любого одного или более глицина, лизина, аргинина, цистеина, цистина, гистидина, тирозина и триптофана.

Композиция согласно изобретению может содержать один или более липидов, которые включают жиры, масла, воски и тому подобное. Подходящие полярные масла, например, из группы лецитинов и триглицеридов жирных кислот, а именно триглицеридные эфиры насыщенных и/или ненасыщенных, разветвленных и/или неразветвленных алканкарбоновых кислот с длиной цепи от 8 до 24, в частности от 12 до 18 атомов углерода. Триглицериды жирных кислот, например, могут быть выбраны преимущественно из группы синтетических, полусинтетических и натуральных масел, таких, как, например, оливковое масло, подсолнечное масло, соевое масло, арахисовое масло, рапсовое масло, миндальное масло, пальмовое масло, кокосовое масло, касторовое масло, масло из зародышей пшеницы, масло из виноградных косточек, масло расторопши, масло примулы вечерней, масло ореха макадамии и тому подобное.

Альтернативно или дополнительно масла могут быть выбраны из летучих масел, нелетучих масел или их смесей. Нелетучие масла включают масла, которые удовлетворяют по меньшей мере одному из следующих определений: (а) масла имеют давление паров не более 0,2 мм рт. ст. при 25°C и атмосферном давлении; (b) масло имеет точку кипения при атмосферном давлении по меньшей мере 300°C. Летучие масла включают материалы, которые не являются «нелетучими», как определено выше.

Нелетучие масла могут быть выбраны из нелетучих силиконовых масел, нелетучих углеводородных масел и их смеси. Подходящие нелетучие силиконовые масла включают линейные полиметилсилоксаны, предпочтительно, нелетучие силиконовые масла представляют собой высокомолекулярные диметиконы. Примеры коммерчески доступных линейных полиметилсилоксанов включают DC 200 Fluid 20 сСт, DC 200 Fluid 100 сСт, DC 200 Fluid 350 сСт от Dow Corning Corporation.

Подходящие нелетучие углеводородные масла включают разветвленные диглицерины или тригдицерины или сложные эфиры 1,2,3,4 бутантриола или эритрита, диэритрита или триэритрита. Предпочтительно, нелетучие углеводородные масла включают триэтилгексаноат эритрита (поставляется как Salacos Е-38 от Nisshin Oilio) и полиглицерил-2-триизостеарат (поставляется как Cosmol 43V от Nisshin Oilio), диэтилгексилкарбонат (поставляется как Tegosoft DEC от Degussa), дикаприловый эфир (поставляется как Cetiol ОЕ от Cognis AG), дикаприлкарбонат (поставляется как Cetiol СС от Cognis AG), изононилизононаноат (поставляется как Lanol 99 от Seppic), тридецилнеопентаноат (поставляется как Ceraphyl 55 от International Speciality Products) или их смеси.

Летучие масла могут быть выбраны из летучих силиконовых масел, как функционализированных так и не функционализированных, летучих углеводородных масел и их смеси. Летучее масло, применяемое в настоящем изобретении, может быть насыщенными или ненасыщенными, иметь прямую или разветвленную цепь или циклическую структуру, или обладать любой одой или более из этих функций.

Примеры летучих углеводородных масел включают полидеканы, такие как изододекан и изодекан (например, Permethyl-99A, который поставляется Presperse Inc.) и С7-С15 изопарафины (например, Isopar Series, который поставляется Exxon Chemicals).

Летучие силиконовые масла могут быть выбраны из циклопентасилоксана, циклогексасилоксана или их смеси. Примеры коммерчески доступных летучих циклических силиконовых масел включают DC 244, DC 245, DC 344 и DC 345 от Dow Corning Corp.; SF-1204 и SF-1202 Silicone Fluids от Momentive Performance Materials; GE 7207 и 7158 от General Electric Co.); и SWS-03314 от SWS Silicones Corp.

Линейное летучее силиконовое масло может представлять собой линейный полиметил сил океан. Пример коммерчески доступного линейного полиметилсилоксана включает DC 200 Fluid, 5 сСт от Dow Corning Corp.

Композиция согласно изобретению может дополнительно содержать, но не ограничиваясь перечисленным, один или более полисахарид, выбранный из любого одного или более анионных полисахаридов (например, альгиновой кислоты, пектина, ксантановой камеди, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, гуммиарабика, камеди карайи, трагакантовой камеди, карбоксиметилхитина, целлюлозной камеди, гликозаминогликанов), катионных полисахаридов (например, хитозана, ацетилированного хитозана, катионной гуаровой камеди, катионной гидроксиэтилцеллюлозы (ГЭЦ)), неионногеных полисахаридов (например, крахмала, декстринов, гуаровой камеди, эфиров целлюлозы, таких как гидроксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза и нитроцеллюлоза), амфотерных полисахаридов (например, карбоксиметилхитозана, N-гидроксидикарбоксиэтилхитозана, модифицированного картофельного крахмала) и гидрофобных полисахаридов (например, цетилгидроксиэтилцеллюлозы, поликватерниум 24).

Композиция может дополнительно содержать вещество, подходящее в качестве солнцезащитного фильтра, такое как органический солнцезащитный фильтр, например, циннамильное производное. Органические солнцезащитные активные фильтры могут быть выбраны из гидрофильного органического солнцезащитного фильтра, гидрофобного органического солнцезащитного фильтра или их смеси. Подходящие примеры солнцезащитных фильтров можно найти в CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7th edition volume 2, pp.1672, edited by Wenning and Mc Ewen (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. 1997).

Органический солнцезащитный фильтр может быть выбран из производных алкил-β,β- дифенилакрилата, производных α-циано-β,β-дифенилакрилата, производных антранилата, производных бензофенона, производных камфоры, производных дибензоилметана, п-аминобензойных производных, салициловых производных, производных триазина или их смеси. Например, гидрофобный органический солнцезащитный фильтр может быть выбран из 4-(1,1-диметилэтил)-4'-метоксидибензоилметана; 4-изопропилдибензоилметана 4-(1,1-диметилэтил)-4'-метоксидибензоилметана, 2-этилгексил-2-циано-3,3-дифенилакрилата или их смеси.

Пример коммерчески доступного 4-(1,1-диметилэтил)-4'-метоксидибензоилметана, также известного как бутилметоксидибензоилметан или Авобензон, включает Parsol ТМ 1789 от Givaudan Roure S. А. и Eusolex ТМ 9020 от Merck & Co., Inc. Пример коммерчески доступного 4-изопропилдибензоилметана, также известного как изопропилдибензоилметан, включает Eusolex ТМ 8020 от Merck & Co., Inc. Пример коммерчески доступного 2-этилгексил-2-циано-3,3-дифенилакрилата, также известного как Octocrylene, включает Uvinul N539 SG от BASF; и Eusolex OCR от Rona/Merck.

В некоторых вариантах реализации гидрофильный органический солнцезащитный фильтр может представлять собой 2-фенилбензимидазол-5-сульфоновой кислоты. Пример коммерчески доступного 2-фенилбензимидазол-5-сульфоновой кислоты, также известной как PBSA, включает Eusolex 232 от Rona/Merck.

Подходящие примеры циннамильных производных солнцезащитных фильтров можно найти в CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 7th edition volume 2, pp. 1672, edited by Wenning and Mc Ewen (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. 1997). Циннамильное производное может быть выбрано из 2-этилгексил-n-метоксициннамата, диэтаноламинметоксициннамата, 2-этоксиэтил-и-метоксициннамата или их смеси. Например, циннамильное производное может представлять собой 2-этилгексил-n-метоксициннамат.

Композиция может содержать химическое отшелушивающее вещество, выбранное из любой одной или более альфа-оксикислот (АГК), бета-гидроксикислот (БГК) или поли-гидроксикислот, таких как салициловая кислота, гликолевая кислота, лимонная кислота и яблочная кислота, но не ограничиваясь перечисленными.

Экстракты, которые могут быть включены в композицию, включают, но не ограничиваются, растительные экстракты, которые могут содержать фенольные соединения, такие как, например, флавоноиды (например, гликозилрутин, феруловую кислоту, кофейную кислоту), фурфурилиденглюцит, бутилированный гидрокситолуол, бутилированный гидроксианизол, нордигидрогвайаретовую смоляную кислоту, нордигидрогвайаретовую кислоту, тригидроксибутирофенон и их производные. Конкретные растительные экстракты для применения в композиции согласно изобретению включают экстракт алоэ вера, экстракт женьшеня и экстракт хвоща.

Экстракт женьшеня получают путем экстракции корня Panax ginseng с гидрофильным растворителем (в частности, водой, этанолом, гликолем или любыми их смесями). Экстракт содержит сапонины, стеролы, углеводы, пектин, витамины, минеральные вещества и липиды.

Экстракт хвоща получают путем экстракции целого растения Equisetum arvense с гидрофильным растворителем (в частности, водой, этанолом, гликолем или любыми их смесями). Экстракт содержит силикаты, флавиноиды, сапонозиды, кофейную кислоту и феруловую кислоту.

Композиция может дополнительно содержать кондиционирующую добавку для кожи. Кондиционирующая добавка для кожи может быть выбрана из увлажнителей, отшелушивающих средств, смягчающих средств или их смесей. Увлажнители включают многоатомные спирты, такие как глицерин, пропиленгликоль, дипропиленгликоль, полипропиленгликоль, полиэтиленгликоль, сорбит, гидроксипропилсорбит, гексиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, 1,2,6-гексантриол, этоксилированный глицерин, пропоксилированный глицерин или их смеси.

Примеры антиоксидантов, которые могут быть предложены в композиции согласно изобретению, включают, но не ограничиваются, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, каротиноиды, пептиды, тиолы, сульфоксиминные соединения, комплексообразователи, ненасыщенные жирные кислоты, фенольные соединения, растительные экстракты, стильбены, мочевую кислоту, маннозу, хлорогеновую кислоту, имидазолы (например, уроканиновая кислота), фурфурилиденсорбит, убихинон, убихинол, пластохинон, фитостеролы и их производные (например, соли, сложные эфиры, простые эфиры, сахара, нуклеотиды, нуклеозиды, пептиды и/или производные липидов), некоторые из которых описаны выше.

Витамины могут быть выбраны, но не ограничиваясь, из любого одного или более витамина А и его производных (например, ретиноидов или ретинола или их производных, таких как ретинилпальмитат или ретинилпропионат), биотина, фолиевой кислоты, пантотената кальция, никотинамида, пиридоксина HCl, пиридоксаля HCl, рибофлавина, тиамина HCl, тимидина, витамина В12, витамина В3 (например, никотинамид), витамина В5 (например, пантенол), витамина С и его производных (например, аскорбилпальмитат, Mg аскорбилфосфат, аскорбилацетат), токоферолов и их производных (например, ацетат витамина Е).

Минеральные вещества могут быть выбраны, но не ограничиваясь, из любой одной или более соли молибдената (например, (NH₄)OMo₇O₂₄) алюминия (например, AlCl₃), кальция (например, CACl₂), кобальта (например, CoCl₂), хрома (например, CrK(SO₄)), меди (например, CuSO₄), железа (например, Fe(NO₃)₃, FeSO₄), калия (например, KCl), магния (например, MgCl₂), марганца (например, MnCI₂, MnSO₄), фосфата (например, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄), карбоната (например, NaHCO₃), силиката (например, Na₂SiO₃), натрия (например, NaCl), ванадата (например, NH₄VO₃), никеля (например, NiCl₂), олова (например, SnCl₂), цинка (e.g., ZnO, ZnSO₄), селена (например, селенометионин, эбселен, H₂SeO₃, Na₂SeO₃), сульфата и нитрата.

Каротиноиды могут быть выбраны, но не ограничиваясь, из любого одного или более каротинов, например, α-каротина, β-каротина, γ-ликопена, фитоена и т.д., и их производных.

Тиолы могут быть выбраны, но не ограничиваясь, из любой одной или более ауротиоглюкозы, пропилтиоурацила, тиоредоксина, липоевой кислоты, глутатиона, цистеина, цистина, цистамина и их гликозильных, N-ацетильных, метальных, этильных, пропильных, амильных, бутильных и лаурильных, пальмитоильных, олеильных, γ-линолеильных, холестериловых и глицериловых сложных эфиров и их солей, дилаурилтиодипропионата, дистеарилтиодипропионата, тиодипропионовой кислоты и их производных.

Сульфоксиминные соединения могут быть выбраны, но не ограничиваясь, из любого одного или более гомоцистеин-сульфоксимина, бутионин сульфонов, пента-, гекса- гептатионин-сульфоксимина, которые могут быть включены в композицию так, что они представлены в очень низких дозах (например, от пмоль до мкмоль/кг).

Комплексообразователи могут быть выбраны, но не ограничиваясь, из любого одного или более апоферритина, десфераля, лактоферрина, α-гидрокси жирных кислот, пальмитиновой кислоты, фитиновой кислоты, α-гидроксикислот (например, лимонной кислоты, молочной кислоты, яблочной кислоты), гуминовой кислоты, желчной кислоты, желчных экстрактов, билирубина, биливердина, ЭДТА, ЭГТА и их производных.

Ненасыщенные жирные кислоты могут быть выбраны, но не ограничиваясь, из любой одной или более у-линоленовой кислоты, линолевой кислоты, олеиновой кислоты и их производных.

Стильбены и их производные включают, например, оксид стильбена и оксид транс-стильбена.

В композиции согласно настоящему изобретению могут быть включены разнообразные дополнительные необязательные активные ингредиенты. Неограничивающие примеры таких дополнительных ингредиентов включают дополнительные активные вещества ухода за кожей, такие как фарнезол, бисаболол, фитантриол, мочевина, гуанидин (например, аминогуанидин); соединения гексаминидина (hexaminidine), их соли или производные; аминосахара; агенты для автозагара (например, дегидроксиацетон); структурирующие агенты; гидрофильные гелеобразующие агенты; лекарственные средства против акне (резорцин, салициловая кислота и тому подобное); смягчающие и заживляющие кожу агенты, такие как аллантоин и т.п.; и агенты, подходящие для эстетических целей, такие как эфирные масла, ароматизаторы, агенты для чувствительности кожи (skin sensates), замутнители, ароматические соединения (например, гвоздичное масло, ментол, камфора, эвкалиптовое масло и эвгенол). Композиции, описанные в настоящей заявке, можно приготовить таким образом, чтобы обеспечить быстрое, замедленное или отсроченное высвобождение активных ингредиентов после введения в организм посредством применения методик, хорошо известных в данной области техники.

Композиция может быть в любой подходящей лекарственной форме, которая позволяет осуществлять доставку или нацеливание на конкретные клетки или ткани, например, в виде эмульсии или липосом, ниосом, микросфер, наночастиц и т.п., с которыми активный ингредиент может быть абсорбирован, адсорбирован, включен или связан. Они могут эффективно преобразовать продукт в нерастворимую форму. Формы в виде частиц могут преодолевать как проблемы со стабильностью (например, разрушение), так и с доставкой.

Применение растворов, суспензий, гелей и эмульсий является предпочтительным, например, активный ингредиент может быть введен в воду, газ, жидкость на водной основе, масло, гель, эмульсию, эмульсию масло в воде или вода в масле, дисперсию или их смесь.

Эмульгатор может быть выбран из неионных эмульгаторов, анионных эмульгаторов, катионных эмульгаторов, цвиттер-ионных эмульгаторов, амфотерных эмульгаторов или их смеси. Эмульгаторы известны в данной области техники. См., например, McCutcheon's, Detergents and Emulsifiers, North American Edition (1986), published by Allured Publishing Corporation.

Если косметически или фармацевтически приемлемый носитель представляет собой эмульсию типа вода в силиконе, эмульгаторы предпочтительно выбраны из полиоксиалкиленовых сополимеров, полиглицериловых сополимеров или их смесей. Полиоксиалкиленовые сополимеры, также известные как силиконовые полиэфиры, подробно описаны в патенте США №4268499. Пример коммерчески доступных полиоксиалкиленовых сополимеров включает DC5225C или DC2-5185C (PEG/PPG-18/18 диметикон, доступный в смеси с циклопентасилоксаном) от Dow Corning Corp.; и KF6017 или KF6028 (PEG-9 диметикон) от Shin-Etsu Inc. Примеры коммерчески доступных полиглицериловые эмульгаторов включают KF6100 и KF6104 от Shin-Etsu Inc.

Композиции предпочтительно представляют собой композиции для местного (т.е. для кожи) применения.

Композиции для местного применения включают гели, кремы, мази, спреи, лосьоны, бальзамы, палочки, мыла, порошки, пленки, аэрозоли, капли, пены, растворы, эмульсии, суспензии, дисперсии, например, неионогенные везикулярные дисперсии, молочко и любые другие широко применяемые косметические или фармацевтические формы, известные в данной области техники.

Мази, гели и кремы могут быть, например, приготовлены на водной или масляной основе с добавлением подходящих загустителей и/или гелеобразующих агентов. Лосьоны могут быть приготовлены на водной или масляной основе, и обычно также содержат один или более эмульгирующих, диспергирующих, суспендирующих, загущающих или окрашивающих агентов. Порошки могут быть приготовлены при помощи любой подходящей порошковой основы. Капли и растворы могут быть приготовлены на водной или неводной основе, также содержащей один или более диспергирующих, солюбилизирующих или суспендирующих агентов. Аэрозольные спреи удобно доставлять из упаковок под давлением с применением подходящего пропеллента.

В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящей заявке, можно местно вводить на кожу посредством продукта, устройства или материала, на который полипептид или композиция были нанесены, пропитаны или химически связаны. Для этой цели повязки, пластыри (например, липкие пластыри), марля, хирургические ленты, ватные тампоны или другие впитывающие материалы, например, слоеные, ворсовые, или губчатые, или поддерживающие матрицы могут быть покрыты, пропитаны или химически связаны с композицией, как описано в настоящей заявке. Например, многие композиции можно наносить на кожу с помощью кожных пластырей, которые хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в патентах US 2008/0038300, US 2009/0043236, WO 2005/067499 и WO 2009/085302, которые включены настоящую заявку посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации материал, содержащий композицию, как описано в настоящей заявке, может представлять собой устройство, которое может, например, носить субъект, подлежащий лечению. Например, композицию, как описано в настоящей заявке, можно наносить, пропитывать ими или химически связывать их с материалом или поддерживающей матрицей, которая образует весь или часть подгузника, перчатки, носка и т.д.

Следовательно, в другом аспекте настоящего изобретения предложен продукт, материал или устройство, которое покрыто, пропитано или химически связано с композицией, как описано в настоящей заявке. Изобретение также распространяется на такие продукты, материалы или устройства для применения, как описано в настоящей заявке. Предпочтительно указанный продукт представляет собой повязку, пластырь (например, липкий пластырь), марлю, хирургическую ленту или ватный тампон, или упомянутое устройство представляет собой подгузник, перчатку или носок.

Косметические или фармацевтические композиции можно помещать в контейнер, пакет или дозатор вместе с инструкциями для применения.

В некоторых вариантах реализации композиции могут быть представлены в форме, пригодной для перорального или парентерального введения. Альтернативные фармацевтические формы, таким образом, включают простые или покрытые оболочкой таблетки, капсулы, суспензии и растворы, содержащие активный компонент необязательно вместе с одним или более инертными широко применяемыми носителями и/или разбавителями, например, с кукурузным крахмалом, лактозой, сахарозой, микрокристаллической целлюлозой, стеаратом магния, поливинилпирролидон, лимонной кислотой, винной кислотой, водой, водой/ этанолом, водой/глицерином, водой/сорбитом, водой/полиэтиленгликолем, пропиленгликолем, стеариловым спирт, карбоксиметилцеллюлозой или жировыми веществами, такими как твердый жир, или их подходящими смесями.

Концентрация активных ингредиентов в композициях, описанных в настоящей заявке, может зависеть от источника композиции (т.е. исходного материала для способа, описанного выше), способа введения, курса лечения, возраста и веса пациента, косметического или терапевтического показания, тела или участка тела, подлежащего лечению, и может изменяться или регулироваться по необходимости. Однако, как правило, композиции получают в соответствии со способом согласно изобретению после стадии фильтрации (f) и разбавления на стадии (g) от 0,001, 0,005, 0,01 или 0,1 до 50%, например, 0,005-40%, например, от 0,1 до 25%, такие как от 0,1 или 0,5 до 5, например, 1-5% (мас ./мас . или об./об.) с получением конечного препарата для введения, в частности, для местного применения, например, 1% или 3% раствор композиции после стадии (f).

При добавлении дополнительных компонентов в композицию, полученную описанным выше способом, например, дополнительных увлажняющих агентов, как описано в настоящей заявке, дополнительный компонент может присутствовать в количествах 0,0001, 0,0005, 0,001 или от 0,01 до 50%, например 0,0005-40%, например от 0,01 до 25%, таких как от 0,1 или 0,5 до 5, например, 1-5% (мас ./мас. конечного препарата для введения, в частности, для местного применения). Эффективные однократные дозы композиции могут лежать в диапазоне от 0,0001-100 мг/см/день (суммарного белка в композиции), например, 0,1-100 мг/см²/день, предпочтительно 0,0001-10 мг/см²/день, например 0,1-10 мг/см²/день при местном применении в зависимости от млекопитающего, подлежащего лечению, при приеме в виде однократной дозы.

Введение можно осуществлять любым подходящим способом, известным в медицинской области, включая, например, пероральное, интестинальное, чрескожное, буккальное, ректальное или местное введение, или введение путем ингаляции. Предпочтительные лекарственные формы можно вводить перорально, или наиболее предпочтительно местно. Как должно быть понятно, пероральное введение имеет свои ограничения, если активный ингредиент переваривается. Для преодоления таких проблем, ингредиенты можно стабилизировать, как упоминалось ранее.

Предпочтительно для местного применения использовать жидкие растворы, кремы или суспензии.

Животные, к которым можно применять или вводить композиции, ограничены млекопитающими. Предпочтительно млекопитающие представляют собой приматов, домашних животных, сельскохозяйственных животных и лабораторных животных. Таким образом, предпочтительные млекопитающие включают мышей, крыс, кроликов, морских свинок, кошек, собак, обезьян, свиней, коров, коз, овец и лошадей. Особенно предпочтительно композиции наносят или вводят человеку.

Следующие примеры даны только в качестве иллюстрации, в которых фигуры представляют собой следующие:

На фигуре 1 представлены столбчатые диаграммы, показывающие (А) среднее уменьшение и (В) относительное уменьшение диаметра пор кожи по сравнению с необработанной кожей после 4 недель обработки два раза в день посредством геля (гель В), который содержит 1% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (f) в способе согласно изобретению.

На фигуре 2 представлены столбчатые диаграммы, показывающие (А) среднее уменьшение и (В) относительное уменьшение количества воспалительных поражений кожи по сравнению с необработанной кожей после 4 недель обработки два раза в день посредством геля (гель В), который содержит 1% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (f) в способе согласно изобретению.

На фигуре 3 представлены столбчатые диаграммы, показывающие (А) среднее уменьшение и (В) относительное уменьшение количества невоспалительных поражений кожи по сравнению с необработанной кожей после 4 недель обработки два раза в день посредством геля (гель В), который содержит 1% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (f) в способе согласно изобретению.

На фигуре 4 представлена столбчатая диаграмма, на которой (А) сравнивается отшелушивающее действие геля (активный гель), который содержит 3% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (f) в способе согласно изобретению, и 3% раствора гликолевой кислоты с применением теста D-Squame. Более низкий балл указывает на меньшее шелушение, т.е. увеличение отшелушивания. (В) показана фотография тестируемого участка, обработанного активным гелем в начальный момент времени t0 и после 5 минут.

На фигуре 5 представлены столбчатые диаграммы, показывающие (А) среднее увеличение и (В) относительное увеличение увлажнения кожи по сравнению с необработанной кожей после 3 недель обработки два раза в день посредством геля (гель В), который содержит 3% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (f) в способе согласно изобретению.

На фигуре 6 представлены столбчатые диаграммы, показывающие (А) средняя визуальная оценка и (В) относительная визуальная оценка тяжести экземы или акне по сравнению с необработанной кожей после 3 недель обработки два раза в день посредством геля, который содержит 3% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (f) в способе согласно изобретению.

На фигуре 7 представлены столбчатые диаграммы, показывающие (А) среднее уменьшение и (В) относительное уменьшение количества воспалительных и невоспалительных поражений кожи по сравнению с необработанной кожей после 3 недель обработки два раза в день посредством геля, который содержит 3% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, полученной на стадии (f) в способе согласно изобретению.

ПРИМЕРЫ

Пример 1; Получение композиции

Композицию получали из жидкости, образующейся при вылуплении лосося. Для повышения концентрации белка в жидкости, образующейся при вылуплении, перед вылуплением икру лосося переносили в минимальные объемы воды. Высоко синхронизированное вылупление можно вызывать повышенными (комнатными) температурами или удалением кислорода (Oppen-Berntsen et al. 1990, Aquaculture, 86, pp. 417-430), в результате чего образуется небольшой объем высококонцентрированного препарата из сырых полипептидов и частей полипептидов. Вылупление должно завершаться в течение 2 часов для более чем 95% эмбрионов.

Жидкость, образующуюся при вылуплении, фильтровали с применением стандартного фильтра с размером пор 7 мкм для удаления вещества, способного засорить фильтры в последующих стадиях фильтрации. Данный фильтрат, который представлял собой обработанную жидкость, образующуюся при вылуплении, можно замораживать на несколько лет без существенного разрушения, до его разморозки и использования для дальнейшей очистки белка. Данный факт значительно упрощал получение исходного материала для приготовления композиции из жидкости, образующейся при вылуплении.

Обработанную жидкость, образующуюся при вылуплении, загружали в диэтиламиноэтильную (ДЭАЭ) ионообменную колонку согласно инструкциям изготовителя и промывали раствором 20 мМ Трис HCl (pH 8,50). Промывную жидкость отбрасывали. Лейколектиновые белки элюировали с колонки промывочным раствором, содержащим 50 мМ NaCl. Элюат собирали для других применений. Целевые полипептиды (т.е. металлопротеиназы, сериновые протеазы и полипептиды яйцевой оболочки) элюировали с колонки промывочным раствором, содержащим 1 М NaCl. Элюат собирали и затем подвергали диафильтрации с использованием фильтра с размером пропускания 8 кДа для замены воды в жидкости, образующейся при вылуплении, на буфер. В этом случае буфер представлял собой фосфатно-солевой буфер, хотя другие буферы являются одинаково подходящими. Например, буфер, содержащий 0,5 мМ фосфата и 1 мМ NaCl, или буферы, содержащие миллимолярный Трис (например, 10 мМ) при pH, близком к нейтральному, или слегка щелочные буферы (pH 7,5-8,5), содержащие 5 мМ NaCl, также являются подходящими. Ретентат со стадии диафильтрации собирали и разбавляли посредством добавления буфера.

В довершение всего, фильтрат фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, и собирали конечный фильтрат. Данный фильтрат представлял собой высоко обогащенный препарат металлопротеиназы, сериновой протеазы и полипептидов яйцевой оболочки и частей полипептидов, обнаруживаемых в сырой жидкости при вылуплении, не содержащей или содержащей только следовые количества лейколектиновых полипептидов из жидкости, образующейся при вылуплении.

Пример 2: Воздействия композиции in vivo на размер пор кожи

Композицию из жидкости, образующейся при вылуплении, получали, как описано в примере 1. Композицию готовили как 1% гель [об./об.] (общий объем композиции на единицу объема геля) и сравнивали с контрольным гелем, который не содержал активный компонент, т.е. композицию из жидкости, образующейся при вылуплении (гель В на фигуре 1). Гель содержал консервант (0,8%), диглицерин (3,00%) и ксантановую камедь (0,8%) в воде.

Двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое испытание проводили на 23 добровольных пациентах женского пола. 23 пациента имели возраст между 22,4 и 58,7 годами (39,3±13,6 лет).

Испытание проводили в форме «сплит-фэйс» (split-face) исследования. Областями нанесения служили правая или левая половина лица. Активный гель распределяли на тестируемых областях случайным образом (справа/слева). Анализ размера пор проводили на порах в области щек выше носогубной складки.

Пациенты дома наносили активный гель два раза в день в течение 4-х недель. Гель наносили в обычном количестве на половину лица, тогда как другую половину лица не обрабатывали (распределение случайным образом).

Для визуализации размера пор, крем (Penaten®), содержащий оксид цинка, наносили на измеряемую область таким образом, чтобы крем попадал в поры. Излишки тщательно удаляли салфеткой. Микроизображения получали при помощи цифровой камеры Canon PowerShot G9 с применением приставки D-scope II (объектив с 40-кратным увеличением) и записывали с помощью программного обеспечения FotoFinder® 2007 mediscope. D-Scope был снабжен кольцом отражателя призмы и интегрированными светодиодными лампами, что гарантировало сбалансированное освещение области просмотра. Получали по одному изображению тестируемой области. После завершения исследования программное обеспечение ImageJ применяли для определения размера (диаметра) трех выбранных пор в тестируемой области. Те же поры измеряли при t0 и t1.

Изображения для анализа размера пор получали до начала первого применения геля (t0) и после 4-х недель обработки (t1). Все оценки проводили в комнате с контролируемым климатом при 21,5°C (±1°C) и 50% (±5%) относительной влажности. Оценку на момент времени t1 проводили спустя 10-20 часов после последней обработки средством.

Для оценки различий между тестируемыми областями в точке t0 анализировали исходные данные. Для оценки различий между тестируемыми областями после обработки (t1), анализировали данные относительно t0 и необработанного состояния. Двойные относительные данные (данные относительно t0 и необработанного состояния) вычисляли следующим образом: (обработанное состояние в t1/обработанное состояние в t0)/(необработанное состояние в t1/необработанное состояние в t0). Эти данные отражают изменения в параметрах с учетом изменений необработанного состояния (контроль) и различий между тестируемыми областями, прежде чем они были подвергнуты различным обработкам (включая контрольные тестируемые области).

Результаты

Состояние t0 было однородным. Тестируемая область, которая должна была быть обработана активным гелем, после оценки t0 существенно не отличалась по размеру пор от тестируемой области, которую не должны были обрабатывать (р=0,3811). В t0 размер пор составлял в среднем 0,60 (±0,19) мм для необработанной тестируемой области и 0,65 (±0,22) мм для тестируемой области, обработанной активным гелем.

Размер пор необработанной тестируемой области был однородным в течение исследуемого периода (р=0,5084). Что касается данных, относительно t0 и необработанного состояния t1, кожа, обработанная активным гелем (т.е. содержащим 1% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии (f)), показала статистически значимое уменьшение размера пор примерно на 22% по сравнению с необработанным состоянием после четырех недель ежедневной обработки (р=0,0005) (фигура 1). Не было зарегистрировано нежелательной кожной реакции.

Пример 3: Воздействия композиции in vivo на поражения кожи (акне)

Гель, содержащий композицию из жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии (f), получали как описано в примере 2 (гель В на фигуре 2).

Двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое испытание проводили на 21 подходящем добровольном пациенте женского пола. Пациенты имели возраст между 18,2 и 34,5 годами (26,3±5,0 лет). Пациенты, соответствующие требованиям для участия в исследовании, имели пятна на лбу, щеках и/или подбородке.

Испытание проводили в форме «сплит-фэйс» (split-face) исследования. Областями нанесения служили правая или левая половина лица, в том числе лоб, щеки и подбородок. Активный гель распределяли на тестируемых областях случайным образом (справа/слева).

Пациенты дома наносили активный гель два раза в день в течение 4 недель. Средство наносили в обычном количестве на половину лица, тогда как другую половину лица не обрабатывали (распределение случайным образом).

Количество воспаленных (папулы, пустулы) и невоспаленных (черные точки, белые угри) поражений визуально подсчитывали на обеих тестируемых областях как перед первым нанесением геля (t0), так и после 4 недель обработки (t1). Все оценки проводили в комнате с контролируемым климатом при 21,5°C (±1°C) и 50% (±5%) относительной влажности. Оценку на момент времени t1 проводили спустя 10-20 часов после последней обработки средством.

Подсчет поражений проводил тот же эксперт при обеих оценках для каждого пациента. Все подсчеты поражений выполняли в условиях стандартного освещения. Подсчеты проводили на лбу, щеках и подбородке (но не в области носа) для каждой из черных точек (открытые комедоны), белых угрей (закрытые комедоны), папул и пустул.

Результаты

Подсчет воспаленных поражений

Состояние t0 было не однородным. Тестируемая область, которая должна была быть обработана активным гелем, после базовой оценки существенно отличалась по числу воспаленных поражений от тестируемой области, которую не должны были обрабатывать (р=0,0217). В t0 число воспаленных поражений составляло в среднем 8,4 (±7,4) для необработанной тестируемой области и 7,0 (±6,5) для тестируемой области, обработанной активным гелем. Количество воспаленных поражений необработанной тестируемой области было однородным в течение периода исследования (р=0,0815).

Кожа, обработанная активным гелем, показала статистически значимое уменьшение числа воспаленных поражений по сравнению с необработанным состоянием после четырех недель ежедневной обработки (р=0,0086) (фигура 2). Не было зарегистрировано нежелательной кожной реакции.

Подсчет невоспаленных поражений

Состояние t0 было однородным. Тестируемая область, которая должна была быть обработана активным гелем, после базовой оценки существенно не отличалась по числу невоспаленных поражений от тестируемой области, которую не должны были обрабатывать (р=0,8753). В t0 количество невоспаленных поражений составляло в среднем 3,2 (±5,3) для необработанной тестируемой области и 2,8 (±3,2) для тестируемой области, обработанной гелем В. Количество невоспаленных поражений необработанной тестируемой области было однородным в период исследования (р=0,9057).

Кожа, обработанная активным гелем, показала статистически значимое уменьшение количества невоспаленных поражений по сравнению с необработанным состоянием после четырех недель ежедневной обработки (р=0,0215) (фигура 3). Не было зарегистрировано нежелательной кожной реакции.

Пример 4: Воздействия композиции in vivo на отшелушивание

Гель, содержащий 3% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии (f), получали как описано в примере 2.

Двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое испытание проводили на 3-х пациентах женского пола с видимыми признаками сухой и шелушащейся кожи на обеих икрах ног. 3 пациентки имели возраст между 38,4 и 57,8 годами (в среднем 48,1±9,7 лет).

Исследование применяли для анализа воздействия геля, содержащего композицию из жидкости, образующейся при вылуплении, на отшелушивание по сравнению с гликолевой кислотой (3%). На икрах было 8 тестируемых областей, т.е. по 4 на каждой икре для обработки или активным гелем или гликолевой кислотой. Распределение средств для обработки по тестовым областям было перетасовано. Среди четырех тестируемых областей одну оставили без обработки, тогда как три другие обрабатывали средством в течение 5 мин, 10 мин или 15 мин.

Непосредственно перед обработкой тестируемым средством (t0) получали образец D-Squame® на каждой икре (в области перекрытия четырех тестируемых областей).

Активный гель и гликолевую кислоту (3%) при помощи технического специалиста наносили один раз на соответствующую тестируемую область на икрах. Позволяли средству воздействовать на кожу в течение 5 мин, 10 мин и 15 мин, с одной необработанной тестируемой областью («0») мин. Затем все 4 тестируемые области промывали водой и позволяли высохнуть на воздухе, прежде чем брать образец D-Squame® на всех 4 тестируемых областях. Все диски D-Squame® переносили на черные учетные карточки и визуально оценивали относительно степени шелушения с применением следующих показателей:

Показатель 0: отсутствует

Показатель 1: небольшое

Показатель 2: умеренное

Показатель 3: тяжелое

Показатель 4: крайне тяжелое

Не было зарегистрировано нежелательных дискомфортных реакций. Результаты

Оценка отшелушивания у 3 пациентов с применением D-Squames® показала в среднем более сильное уменьшение шелушения для активного геля по сравнению с гликолевой кислотой при режиме обработки 5 мин, 10 мин или 15 мин (фигура 4).

Пример 5: Воздействия композиции in vivo на увлажнение кожи

Гель, содержащий 3% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии (f), получали как описано в примере 2.

Двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое испытание проводили на 4 пациентах. Пациенты, соответствующие требованиям для участия в исследовании, обладали сухой кожей на предплечьях. 4 пациента имели возраст между 56,3 и 70,9 годами (в среднем 64,3±6,3 лет).

Оба предплечья являлись тестируемыми областями для анализа увлажнения кожи. На предплечьях было четыре тестируемые области, а именно по две на каждой внутренней стороне предплечья. Две области обрабатывали активным гелем, содержащим композицию из жидкости, образующейся при вылуплении, одну обрабатывали глицерином (контроль), а четвертую не обрабатывали.

Пациенты дома проводили обработку два раза в день в течение трех недель. Средства наносили в количестве примерно 2 мг/см² на соответствующую тестируемую область предплечья (случайным образом, с одной необработанной тестируемой областью и другой областью, обработанной глицерином в качестве контроля).

До начала применения средства (t0) и после трех недель обработки (t1) измеряли увлажнение кожи на предплечье (Corneometer СМ825®, 10 повторных измерений).

Все измерения проводили в комнате с контролируемым климатом при 21,5°C (±1°C) и 50% (±5%) относительной влажности после того, как пациенты с непокрытыми тестируемыми областями кожи приспосабливались к данным климатическим условиям помещения по меньшей мере в течение 30 мин. Измерения и обработки в момент времени t1 происходили спустя 10-20 часов после последней обработки средством.

Результаты

Кожа, обработанная активным гелем (гель В), содержащим 3% об./об. композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии (f), показала среднее увеличение увлажнения кожи у 4 пациентов примерно на 21% по сравнению с необработанным состоянием после 3-х недель обработки средством два раза в день (фигура 5).

Пример 6: Воздействия композиции in vivo на экзему и акне

Гель, содержащий 3% композиции из жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии (f), получали как описано в примере 2.

Двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое испытание проводили на 4 пациентах, 2 пациентах с экземой и 2 с акне. Пациенты, соответствующие требованиям для участия в исследовании, имели экзему или акне (визуально оцененные экспертом). Влияние активного геля на степень экземы или акне анализировали на выбранной проблемной области, т.е. на кисти или руке (экзема) или лице (акне).

Пациенты дома наносили активный гель два раза в день утром и вечером в течение трех недель, применяя количество средства, соответствующее существующей практике.

Непосредственно перед началом применения средства (t0) и после трех недель обработки (t1) визуально оценивали степень экземы или акне посредством объективных дерматологических показателей и субъективной оценки самих пациентов. Подсчет поражений (количество и качество невоспаленных поражений (белых угрей и черных точек) и воспаленных поражений (папул и пустул) оценивали дерматологически (только для 2 пациентов с акне на лице)).

Визуальную экспертную оценку и субъективную оценку проводили согласно следующим показателям:

Показатель 0: отсутствует

Показатель 1: небольшая

Показатель 2: умеренная

Показатель 3: тяжелая

Показатель 4: крайне тяжелая

Визуальная экспертная оценка, а также субъективная оценка (данные не показаны) показали в среднем уменьшение степени выраженности экземы и акне у 2 пациентов после 3-х недельного курса лечения активным гелем (фигура 6). Подсчет поражений выявил в среднем уменьшение числа воспаленных и невоспаленных поражений у 2 пациентов после 3-х недельного курса лечения активным гелем (фигура 7).

Последовательности:

SEQ ID №1: Металлопротеиназа - Атлантический лосось

SEQ ID №2: Фрагмент полипептида яйцевой оболочки I - Атлантический лосось

SEQ ID №3: Фрагмент полипептида яйцевой оболочки II - Лосось

SEQ ID №4: Фрагмент полипептида яйцевой оболочки III - Лосось

SEQ ID №5: Полноразмерный zr-белок - Атлантический лосось

SEQ ID №6: Полноразмерный хориогонин H - Тихоокеанский лосось

SEQ ID №7: Полноразмерный хориогонин L - Тихоокеанский лосось

SEQ ID №8: Альтернативный zr-белок - Атлантический лосось

SEQ ID №9: Лейколектиновый полипептид из эмбриона лосося:

SEQ ID №10: Лейколектиновый полипептид из лейкоцитов лосося:

SEQ ID №11: Лейколектиновый полипептид-2 из лосося:

SEQ ID №12: Лейколектиновый полипептид-3 из лосося:

Реферат

Изобретение относится к косметической и фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения косметической композиции из жидкости, образующейся при вылуплении рыб из икры, включающий по меньшей мере следующие стадии: (a) суспендирование икры рыб в минимальном объеме воды; (b) индукцию синхронизированного быстрого вылупления указанной икры, предпочтительно таким образом, что вылупление завершается в течение менее 6 часов для более чем 80% эмбрионов; (c) фильтрацию жидкости, образующейся при вылуплении, со стадии (b) с получением композиции, при этом указанная стадия фильтрации жидкости, образующейся при вылуплении, включает фильтрацию жидкости, образующейся при вылуплении, с применением фильтра с размером пор по меньшей мере 5 мкм и сбор фильтрата; (d) обработку фильтрата со стадии (с) посредством ионообменной хроматографии, включающую: (1) загрузку фильтрата на ионообменную колонку, предпочтительно на ДЭАЭ (диэтиламиноэтильную) колонку; (2) промывку колонки подходящим буфером, предпочтительно забуференным промывочным раствором с рН 7-9; (3) элюирование из колонки лейколектиновых полипептидов с применением первого элюирующего буфера или растворителя, при этом предпочтительно первый элюирующий буфер содержит забуференный промывочный раствор, дополнительно содержащий соль в концентрации от 50 до 100 мМ; (4) элюирование из колонки оставшихся полипептидов с применением второго элюирующего буфера или растворителя, при этом предпочтительно второй элюирующий буфер содержит забуференный промывочный раствор, содержащий соль в концентрации от 500 мМ до 2 М; (5) сбор элюата со стадии (4); (e) замену воды в элюате со стадии (5) на косметически приемлемый

Формула