Способ модулирования фототоксичности - RU2301800C2
Код документа: RU2301800C2
Чертежи
Описание
Область, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к химическим соединениям и композициям, применимым в качестве модуляторов фототоксичности клеток кожи. Конкретно, "модуляторы" по данному описанию относятся к материалам, которые могут либо ускорять, либо замедлять поражение клеток, таких как клетки кожи, вызванное действием (экспозицией) света.
Предпосылки создания изобретения и уровень техники
Общеизвестно, что свет, UVA (УФ лучи типа А) в особенности, поражают клетки кожи. Фототоксическое поражение клеток происходит вследствие реакции света с некоторыми эндогенными соединениями кожи. Механизм, по которому происходит фотопоражение, хорошо понятен, и коротко его можно описать следующим образом. Участвующие в нем молекулы, которые можно назвать сенсибилизаторами или даже ускорителями, реагируют со светом и, в присутствии кислорода, образуют "реакционно-способные частицы кислорода" или "ROS". Именно эти молекулы, т.е. молекулы ROS, участвуют в каскадах реакций, ведущих к поражению клеток, включая канцерогенез и фотостарение, но не ограничиваясь этими явлениями. Подробное описание этого явления можно найти в статье Wondrak et al. J. Invest. Demiatol 119: 489-498 (2002).
Тот факт, что эндогенные молекулы, например кожи, принимают участие в ускоренной фототоксичности, наводит на мысль о нацеленной терапии. Если соединение является практически инертным в отсутствие света, но под действием света участвует в процессе клеточной деструкции, тогда такие соединения можно использовать в ситуациях, в которых желательна запланированная гибель клеток. Такие ситуации включают, но без ограничения, псориаз, угри, предраковые и злокачественные пролиферативные нарушения, такие как старческий кератоз и другие состояния, хорошо известные в технике.
Напротив, существование фотоактивируемых молекул предполагает существование молекул, которые ведут себя таким образом, что гасят или ингибируют действие света на клетки. Такие тушители или ингибиторы можно использовать в ситуациях, когда требуется реверсирование (обращение) и/или ингибирование вредного воздействия света. Такие тушители или ингибиторы можно применять профилактически, а также терапевтически.
Таким образом, модуляция фототоксичности клеток является целью данного изобретения. Модуляторы по данному изобретению относятся к молекулам, которые могут быть молекулами компонентов кожи, в частности коллагена.
Сущность изобретения
Указанная цель изобретения достигается с помощью способа модулирования фотопоражения, который заключается в нанесении на кожу модулятора фотопоражения, достаточного для модуляции фотопоражения, вызванного УФ, где модулятор выбран из группы, состоящей из 3-гидроксипиридинового фармакофора или пролина, 4-гидроксипролина или его алкилового эфира.
Указанный модулятор может усиливать фотопоражение и быть образован из коллагена.
В случае усиления фотопоражения модулятор имеет структуру, состоящую из 3-гидроксипиридинового фармакофора, и может представлять собой N-алкил-3-гидроксипиридин или его соль.
N-алкил-3-гидроксипиридин или его соль могут содержать алкильный фрагмент, имеющий 2-20 углеродных атомов, а алкильный фрагмент может представлять собой этильную группу.
Указанный модулятор может также представлять собой витамин В6, пиридинолин или 3-гидроксипиридин.
Модулятор может, напротив, ингибировать фотопоражение, и в этом случае он представляет собой пролин, 4-гидроксипролин или его алкиловый эфир.
Алкиловый эфир пролина может содержать алкильный фрагмент, включающий 1-24 углеродных атома, и представлять собой L-пролин-ОСН3 или 4-ОН-L-ОСН3.
Указанные модуляторы могут применяться в виде крема, лосьона, шампуня, спрея или пластыря.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 представлены структуры различных молекул, используемые в примерах.
На Фигуре 2 даны результаты, показывающие, что молекулы с основной 3-гидроксипиридиновой структурой под действием света эффективно вызывают ингибирование клеточной пролиферации.
На Фигуре 3 сравниваются результаты действия на свету соединений 3-гидроксипиридина, показанных на фигуре 1, на НаСаТ клетки, являющиеся кератиноцитами.
На Фигуре 4 показано действие N-этилпроизводных по данному изобретению на злокачественную меланому.
Фигура 5 аналогична Фигуре 4, но используются раковые клетки опухоли грудной железы.
На Фигуре 6 представлено, на примере FACS (проточно-цитометрического) анализа, доказательство того, что N-этилпроизводное ускоряет апоптоз клеток.
На Фигуре 7 схематически показан синтез комплексов BSA-B6.
На Фигуре 8 показано, что комплексы, приведенные на Фигуре 7, эффективно ингибируют пролиферацию клеток.
На Фигуре 9 представлен предполагаемый механизм ингибирования фотоактивированных молекул с помощью переноса энергии ("ЕТ" на фигуре). "S*" обозначает полностью возбужденный сенсибилизатор, тогда как "S" обозначает сенсибилизатор.
На Фигуре 10 представлены структуры производных пролина, проверенных в качестве ингибиторов.
На Фигуре 11 даны результаты анализов, показывающих эффективность производных пролина в качестве тушителей фотосенсибилизированного поражения ДНК.
На Фигуре 12 показано, как было определено, что соединения по данному изобретению ингибируют синглетный кислород.
На Фигуре 13 показан пролиферативный эффект различных молекул, которые ингибируют фотопоражение клеток кожи.
Подробное описание предпочтительных вариантов изобретений
ПРИМЕР 1
Как полагают, наиболее очевидно, что составляющие эндогенного компонента кожи, коллагена, являются возбудителями фототоксического поражения и/или его ингибирования. Поэтому изучаются такие молекулы.
Пиридинолин представляет собой аминокислоту, участвующую в сшивании молекул коллагена, и изучается его роль в фототоксичности. Структура пиридинолина хорошо известна и изображена на Фигуре 1 вместе со структурой других молекул по данному описанию.
Ряд экспериментов проводят на кератиноцитах НаСаТ и человеческих фибробластах CF3. В этих экспериментах образцы клеток контактируют с 500 мкМ пиридинолина, 500 мкМ десмозина, который является составляющим эластина, имеющим структуру, родственную пиридинолину, или 500 мкМ витамина В6 (пиридоксина). Контрольные образцы не содержат добавок. В одной серии экспериментов клетки не получают света от внешнего источника. В другой серии экспериментов их облучают UVA светом при 3.3 Дж/см2. Фибробласты CF3 получают имитированный (моделируемый) солнечный свет, или "SSL", который представляет собой совокупность 2.3 Дж/см2 света UVA и 0.12 Дж/см2 света UVB. Результаты показаны на Фигуре 2 в процентах клеточной пролиферации относительно контроля (без добавок, в отсутствие света). Измерения проводят через 3 дня после стимуляции.
Результаты показывают, что пиридинолин оказывает антипрофилеративное действие, но только при свете. Витамин В6 значительно более эффективно ингибирует клеточную пролиферацию.
Проводят вторую серию экспериментов, в которой добавляют 400 мкМ/мл каталазы, поглотителя пероксидных радикалов. Каталаза не оказывает совершенно никакого действия на сенсибилизацию витамина В6, это наводит на мысль, что эта молекула действует по другому механизму, нежели образование пероксида.
На основании этих результатов сравнивают структуры соединений, чтобы определить общие структурные особенности молекул, или чтобы можно было идентифицировать "фармакофор". Отмечают, что как витамин В6, так и 3-гидроксипиридин имеют общую основную (центральную) структуру, что, в свою очередь, предполагает следующую серию экспериментов.
ПРИМЕР 2
Изучают группу производных гидроксипиридина в экспериментах, аналогичных описанным выше. Коротко говоря, 2, 3 и 4-гидроксипиридин изучают так же, как N-этил-3-гидроксипиридин. Все структуры представлены на Фигуре 1.
Клетки НаСаТ, описанные выше, проверяют анализом ингибирования пролиферации. Образцы клеток получают равные количества одного из 4 перечисленных выше соединений и контактируют в присутствии или в отсутствие описанного выше света, имитирующего солнечный свет ("SSL"), или одного UVA света, также описанного выше.
Результаты показаны на Фигуре 3.
По сравнению с контрольными образцами 3-гидроксипиридин проявляет ингибирующий эффект там, где N-этилпроизводное вызывает цитолиз. N-этилпроизводное также действует при свете, как при UVA, так и при UVB, тогда как 3-гидроксипиридин при UVB свете действует как ингибитор клеточной пролиферации.
ПРИМЕР 3
Вслед за экспериментами, описанными выше, проводят дополнительные эксперименты, используя клетки злокачественной меланомы (клетки G-361) и раковые клетки опухоли молочной железы (MCF-7). В этих экспериментах описанное выше N-этилпроизводное испытывают как описано выше, при различных концентрациях, при облучении UVA светом 9.9 Дж/см2. Жизнеспособность определяют через два дня после обработки. В качестве контроля проводят эксперименты, используя N-этилпроизводное и только UVA свет.
Результаты, показанные на Фигуре 4 (клетки G-361) и 5 (клетки MCF7), говорят о том, что комбинация дает явную цитотоксичность.
Данные, полученные при анализе клеток G-361 с помощью FACS, показывают, что существует сдвиг в сторону запрограммированной гибели клеток, т.е. апоптоза. Это видно на Фигуре 6, где наблюдается резкое увеличение интенсивности окрашивания клеток маркером апоптоза аннексином V и пропидий йодидом при использовании N-этилпроизводного, особенно при UVA облучении с концентрацией 3.3 Дж/м2.
ПРИМЕР 4
Эффективными материалами по изобретению являются малые молекулы. Хотя малые молекулы применяют, иногда желательно получить комплексы таких молекул с молекулами большего размера, такими как белки. Это облегчает нацеливание малой молекулы, если она образует комплекс, например, с антителом против конкретного маркера на клетках, лигандом для конкретного рецептора, белком, ассоциированным с ядром и т.п.
Для проверки осуществимости этого подхода молекулы витамина В6 были связаны с альбумином бычьей сыворотки. Коротко говоря, боковую цепь лизина молекулы альбумина бычьей сыворотки (BSA) ковалентно модифицируют реакцией 350 мг BSA с витамином В6, который представляет собой альдегид пиридоксаль (64 мг), с образованием основания Шиффа. В свою очередь основание Шиффа восстанавливают, действуя NaCNBH3 (58 мг) в 1.5 мл 0.25 М фосфатного буфера (рН 7.4) в течение ночи при 37°С, и подвергают интенсивному диализу (48 час, 4°С). Полученный аддукт BSA-В6 подвергают масс- спектрометрии и флуоресцентной спектроскопии. Затем белок лиофилизируют и используют в последующих примерах. На фигуре 7 показан синтез. Результаты спектроскопии показывают, что в среднем каждая молекула BSA образует комплекс с 5-6 молекулами пиридоксаля.
ПРИМЕР 5
Антипролиферативный эффект комплексов, описанных в примере 4, изучают, либо ничего не добавляя (контроль), либо добавляя BSA или комплексы BSA-В6, и подвергая или не подвергая SSL облучению образцы НаСаТ кератиноцитов. BSA или BSA-В6 прибавляют в количестве 10 мг/мл, а концентрация SSL составляет 2.3 Дж/см2 UVA плюс 0.12 Дж/см2 UVB. Через три дня после обработки стандартными методами измеряют пролиферацию с помощью счетчика Коултера.
Из результатов, показанных на Фигуре 8, видно, что комплексы BSA-D6 очень эффективно ингибируют пролиферацию кератиноцитов.
ПРИМЕР 6
Данные, представленные в вышеприведенных примерах 5-6, относятся к молекулам, которые увеличивают клеточную деструкцию. Однако этот процесс не всегда желателен, и в данном примере и последующих примерах описаны эксперименты с молекулами, которые ингибируют этот процесс. Эти молекулы далее в данном описании называются ингибиторами фотовозбужденного состояния или "QPES". Такие соединения характеризуются способностью инактивировать фотовозбужденное состояние молекулы, что затем вызывает описанный выше тип гибели клеток.
Предполагаемый механизм действия этих молекул представлен на Фигуре 9, хотя следует заметить, что заявители не желают себя связывать этим предполагаемым механизмом. Коротко говоря, УФ-облучение молекулы вызывает возбуждение электронов (возбужденное состояние, как "S*" на фигуре) одновременно с образованием возбужденных синглетов, и после межсистемной конверсии (ISC), триплетных состояний. Они являются ключевыми интермедиатами при фотопоражении клеток. Соединения QPES подавляют (обнуляют) этот эффект, принимая энергию возбуждения соединений, связанных с фотопоражением, с помощью переноса энергии ("ЕТ"), нейтрализующего фототоксические интермедиаты, которые релаксируют в основное состояние, рассеивающее энергию через безвредную вибрационную энергию или тепло. Сами соединения QPES не истощаются в этом процессе и нейтрализуют многочисленные фотопоражающие молекулы.
ПРИМЕР 7
Общеизвестно, что плазмида ФХ174 расщепляется только при совместном действии облучения светом, имитирующим солнечный свет, и белком, обогащенным AGE-пигментом, который ведет себя как УФ-сенсибилизатор. AGE-BSA (альбумин бычьей сыворотки, модифицированный "конечным продуктом гликирования") представляет собой модель эндогенных сенсибилизаторов кожи типа, описанного выше. Подробное описание анализа можно найти в статье Wondrak et al., Photochem. Photobiol. Sci 1: 355-363. Этот анализ применяется в данном примере.
Расщепление плазмиды визуализируют, пропуская образцы на 1% агарозном геле, а поражение, т.е. образование редактированной, открытой кольцевой формы из закрытой кольцевой формы (непораженной), количественно определяют денситометрией, которая позволяет оценивать действие соединения.
AGE-расщепление происходит в отсутствие кислорода и его нельзя полностью подавить с помощью антиоксидантов. Поэтому, если соединение подавляет расщепление плазмиды, его нельзя просто рассматривать как антиоксидант. Напротив, следует предположить ингибирование за счет тушения (дезактивации) возбужденного состояния, как описано выше.
Результаты представлены в нижеприведенной Таблице 1. Цитотоксический NaN3, который известен как ингибитор фотовозбужденных состояний, эффективен, как тиольные соединения, включая глутатион ("GSH"), D-пеницилламин и N-ацетил-L-цистеин ('NAC").
Данный анализ доказывает основные положения, обсуждаемые в Примере 7.
Этим методом испытывают пролин и ряд соединений, родственных пролину. Строение соединений представлено на Фигуре 10. На Фигуре 11 представлены результаты этих экспериментов. Испытуемое соединение в количестве 100 мМ прибавляют и плазмиды контактируют с одним, обоими или ни с одним из двух: UVA свет (2.3 Дж/см2) и AGE-BSA (10 мг/мл).
L-Pro-ОСН3 является наиболее эффективным тушителем (дезактиватором), но эффективны все соединения.
ПРИМЕР 8
Как обсуждается выше, фотовозбужденный кислород, т.е. синглетный кислород, или "1O2", который гомологичен основному состоянию по спинам спаренных электронов, триплетный кислород, или "3О2", является наиболее важной известной молекулой в возбужденном состоянии, участвующей в процессе фототоксичности. Хорошо доказано участие синглетного кислорода в повреждениях, наносимых фотоокислением среди прочего, клеточной ДНК, мембранным липидам и структурным белкам, таким как кератин и коллаген. Анализ совершенствуют таким образом, чтобы определить эффективность соединений, таких как пролин и производные пролина, описанные выше, при дезактивации (тушении) синглетного кислорода (См. статью Lion et al., Nature 263: 442-443 (1976)).
Хорошо известно, что толуидиновый голубой ("ТВ") при облучении генерируетlO2. По известной методике1O2 улавливают с помощью 2,2,6,6-тетраметилпиперидина, или "TEMP". Образуется устойчивый свободный радикал, т.е. 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил, или "TEMPO", который затем можно измерять для определения образования1O2. В основе этого анализа лежит тот факт, что другие реакционно-способные частицы кислорода не реагируют с TEMP с образованием TEMPO, тем самым гарантируется, что анализ специфичен в отношении образования1O2.
Объединяют вместе TEMP, ТВ и одну из молекул, описанных выше, и облучают видимым светом в течение 5 минут, получают общую дозу 36 Дж/см2. Конкретно, 100 мкМ ТВ, 7 мМ TEMP и 20 мМ испытуемого соединения смешивают в фосфатно-солевом растворе, в капиллярной кварцевой пробирке объемом 100 мкл (1.5×90 мм), методом электронного парамагнитного резонанса в выпускаемом промышленно приборе измеряют сигнал свободного радикала TEMPO. Также проводят контрольные измерения сигнала в отсутствие испытуемого соединения, но при свете, и стандартного резонансного сигнала TEMPO.
В результате получают данные, представленные на Фигуре 12, панели A-G. На панели А показана полная система генерации синглетного кислорода с образованием сигнала TEMPO. На панели В показан сигнал спина промышленного эталона TEMPO. Панель С показывает, что эффекты, наблюдаемые на панелях D-G, не вызваны непосредственной реакцией испытуемых соединений с TEMPO. Панели D и С демонстрируют дезактивацию синглетного кислорода с помощью производных пролина и показывают, что дериватизация по карбоксильной группе пролина или 2-гидроксилирование не влияет на активность тушения (дезактивации). Кроме того, видно, что все соединения являются эффективными тушителями (дезактиваторами).
Чтобы показать, что дезактивирующие молекулы являются физическими тушителями (что дезактивация есть процесс физический) и не расходуются при реакции, содержание аминокислот в смеси ТВ и L-Pro в PBS определяют перед продолжительной экспозицией видимым светом (36 Дж/см2) и после нее стандартным анализом на аминокислоты методами обращенно-фазовой ВЭЖХ. Не наблюдают никакого изменения пика, времени удерживания или значений AUC, чти указывает на химическую инертность в отношении1О2, являясь доказательством скорее физического тушения (дезактивации), нежели расхода реагентов.
ПРИМЕР 9
Эти эксперименты предприняты для того, чтобы определить, эффективно ли защищают кожу соединения, являющиеся, как доказано, тушителями (дезактиваторами).
Культивированные фибробласты кожи (клетки CF3) экспонируют в условиях фотоокислительного стресса в присутствии1О2, который образуется in situ при сенсибилизации красителя.
50000 фибробластов засевают в чашку Петри 35 мм, а затем, спустя один день, обрабатывают видимым светом (экспозиция 90 секунд, 10.8 Дж/см2) в присутствии или в отсутствие ТВ (3.3 мкМ в сбалансированном солевом растворе Хэнкса). Через пять минут после обработки клетки отмывают фосфатно-солевым буферным раствором. Испытуемое соединение (10 мМ) присутствует или отсутствует в культуре при облучении. После 3 дней культивирования клетки собирают методом трипсинизации и считают счетчиком Коултера.
Результаты показывают, что клеточная пролиферация в высокой степени (70%) подавляется при комбинации ТВ и света, но этого не происходит под действием любого одного фактора из двух. Соединения L-Pro-ОСН3 и 4-OH-L-Pro-ОСН3 проявляют очень четкий протективный эффект, как изображено на Фигуре 13 и количественно показано в Таблице 2.
Защиту определяют по формуле:
Более активными соединениями в этих экспериментах являются сложные эфиры. Как показано на Фигуре 10, когда определяют значения log P этих соединений хорошо известными в технике методами, эфиры имеют значительно более высокие значения log P, чем неэтерифицированные соединения. Так как более высокие значения log P являются показателем большей липофильности, может быть в данном случае их более высокая эффективность вызвана тем, что они более продолжительное время пребывали в коже и взаимодействовали с клеточными мембранами. Предполагается, что особенно пригодными являются сложноэфирные производные пролина, имеющие значение log Р, примерно, от -1.00 до +8.00.
ПРИМЕР 10
Полагают, что метиловый эфир 4-ОН-L-пролина, описанный выше, является новым соединением, представителем новой группы соединений. Предлагается синтез соединения и руководство к синтезу других членов этого семейства.
4-Гидрокси-L-пролин реагирует с дитрет-бутилдикарбонатом в 1N NaOH при 5°С в течение 30 минут с последующим перемешиванием при комнатной температуре еще в течение 3.5 часов.
Полученный защищенный 4-гидроксипролин реагирует с диметилформамидом, карбонатом калия и йодистым метилом при 0° С в течение 30 минут, затем один час при перемешивании при комнатной температуре, получают метиловый эфир.
Затем снимают трет-бутилдикарбонатную защиту с помощью трифторуксусной кислоты стандартными методами.
Ключевым компонентом в этой реакции является йодистый метил. Варьируя алкилгалогениды, можно получать сложные эфиры с алкильными группами, содержащими 1-30, предпочтительно 1-26 углеродных атомов.
Вышеприведенные примеры отражают различные аспекты изобретения, которые относятся к способам модулирования фотопоражения путем введения, по меньшей мере, одного вещества, которое модулирует действие ультрафиолетового света на субъект. Термин "модулирует" по данному описанию относится в целом к способности либо повышать скорость фотопоражения, что применимо в ситуациях, когда требуется прекратить пролиферацию клеток, либо уменьшать скорость поражения. Примеры, относящиеся к первой категории, включают, например, псориаз, угри, предраковые и злокачественные гиперпролиферативные нарушения, такие как старческий кератоз, меланомный, немеланомный рак кожи, рак молочной железы и другие разновидности рака, а также другие состояния, хорошо известные специалистам в данной области техники как состояния, при которых требуется уменьшение клеточной пролиферации.
Предпочтительно, чтобы повышение фотопоражения, ведущее к уменьшению клеточной пролиферации, осуществлялось с применением, по меньшей мере, одного соединения, имеющего в качестве структуры "фармакофора" 3-гидроксипиридиновый цикл и образованного из компонента кожи, такого как коллаген. Примерами таких соединений являются сам 3-гидроксипиридин, витамин В6 и, наиболее предпочтительно, производные N-адкилпиридиния, такие как соли, в которых алкильная цепь производного содержит, по меньшей мере, 2 и больше 20 углеродных атомов в, предпочтительно, линейной (но оптимально разветвленной) цепи, которая может быть или может не быть замещенной. Более предпочтительно алкильная группа содержит 2-10 углеродных атомов в линейной цепи, и, наиболее предпочтительно, 2-5 углеродных атомов. Как видно из представленных выше данных, особенно предпочтительным является N-этилпроизводное. Более протяженные N-алкилпроизводные, которые продлевают время пребывания соединения в коже, могут быть предпочтительными в конкретных ситуациях, таких, при которых, но без исключения, требуется местная доставка соединения.
Эти молекулы можно объединять, например, со стандартными фармацевтическими ингредиентами и носителями, такими как ингредиенты и носители, применяемые в кремах, лосьонах, шампунях, спреях, пластырях или в любой из известных фармакологических систем доставки, которые используются для введения терапевтических агентов в кожу.
Если особенно требуется целевая терапия, активные ингредиенты могут быть присоединены ко второй молекуле, которая может быть больше, для усовершенствования целевой доставки. Такие молекулы большего размера включают, например, антитела, лиганды для рецепторов, гормоны и другие молекулы, которые нацелены и/или поглощаются селективно клетками.
Другим признаком изобретения является дезактивация (тушение) фотопоражения. Как показано выше, пролин и его производные являются эффективными тушителями (дезактиваторами) фотопоражения. Особенно эффективны алкиловые эфиры пролина, такие как L-Pro-ОСН3 и 4-ОН-L-пролин; однако, как показано, пригодными являются и другие соединения. Способы применения точно такие же, как описанные для обсуждаемых энхансеров (см. выше).
Реферат
Изобретение относится к химическим соединениям и композициям, применимым в качестве модуляторов фототоксичности клеток кожи. Конкретно, «модуляторы» по данному описанию относятся к материалам, которые могут либо ускорять, либо замедлять поражение клеток, таких как клетки кожи, вызванное действием (экспозицией) света, например УФ-лучами типа А. Модуляторы по настоящему изобретению выбраны из группы, состоящей из 3-гидроксипролинового фармакофора или пролина, 4-гидроксипролина или его алкилового эфира. Целью данного изобретения является модуляция фототоксичности клеток, где модуляторы относятся к молекулам, которые могут быть молекулами компонентов кожи, в частности, коллагена. 13 з.п. ф-лы, 2 табл., 13 ил.
