Жидкая фармацевтическая композиция ботулинического токсина - RU2440825C2

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится, в целом, к более стабильной жидкой фармацевтической композиции ботулинического токсина, и более конкретно, к жидкой фармацевтической композиции, включающей ботулинический токсин в комбинации с полисорбатом 20 и метионином, и необязательно, изолейцином.

Предшествующий уровень техники

Ботулинический токсин является нейротоксичным белком, продуцируемым бактерией Clostridium botulinum. Этот токсин блокирует пресинаптическое высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе, вызывая вялый (атонический) паралич мышц у млекопитающих. Подтверждена эффективность токсина при лечении косоглазия, идиопатического блефароспазма и гемифациального спазма. Кроме того, недавно было установлено, что он оказывает помощь при ряде моторных нарушений непроизвольно сокращающихся мышц, включая спастическую кривошею, оромандибулярную дистонию и спастическую дисфонию. Кроме того, ботулинический токсин утвержден Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для временного улучшения внешнего вида умеренных и резких межбровных морщин и для нехирургического лечения гипергидроза (избыточной подмышечной потливости).

Белки ботулинического токсина серотипов А и В в настоящее время входят в состав композиций лекарственных форм для применения в медицинской практике, такого как лечение кривошеи, блефароспазма, гипергидроза, и т.д., а также в косметической практике, например, для уменьшения морщин. Однако изготовление белковых лекарственных средств, включающих белки ботулинического токсина, связано с многими проблемами. Проблемы, большинство из которых обусловлено с нестабильностью белков, особенно выражены для белковых лекарственных средств, содержащих очень низкие концентрации активных белков, таких как ботулинические токсины.

Из-за неспецифического связывания с твердыми поверхностями, белки ботулинического токсина при помещении в емкости сорбируются на внутренних стенках, что приводит к потере активного ингредиента. Для предотвращения окисления белков или распада на фрагменты также требуется стабилизирующий агент.

В большинстве случаев в качестве стабилизатора в композиции ботулинического токсина выбирают альбумин. В дополнение к стабилизации активных белковых ингредиентов в фармацевтических композициях, преимуществом альбумина является его низкая иммуногенность при введении в организм. Однако сывороточные продукты, такие как альбумин, не полностью лишены возможности контаминации патогенами или микроорганизмами, и таким образом, могут быть медиаторами заболеваний, в частности вирусных заболеваний или болезни Крейтцфельда-Якоба.

Часто вместо альбумина используют желатин. Однако желатин не рекомендуется применять в качестве стабилизатора для лекарственных композиций, поскольку этот белок, подобно альбумину, также имеет животное происхождение и может переносить заболевания.

Стабилизатор, полученный из неживотных источников для фармацевтической композиции ботулинического токсина, предложен в Корейском патенте №10-0799400, в котором рекомбинантный сывороточный альбумин (rSA), продуцируемый дрожжами, применяется в фармацевтической композиции. Однако нельзя полностью избежать возможности генерации неоэпитопа, новой антигенной структуры, в ходе производства, выделения и получения рекомбинантного сывороточного альбумина (rSA), вызывающего иммунный ответ реципиента на лекарственное средство. Корейский патент №10-0665469 раскрывает фармацевтическую композицию, включающую ботулинический токсин, полисахариды (включая гидроксиэтил-крахмал) и аминокислоты, такие как лизин, глицин, гистидин или аргинин. Эта фармацевтическая композиция обеспечивается в лекарственной форме, приготовленной путем лиофилизации, и к сожалению, должна храниться при низкой температуре в холодильнике или морозильнике. Требование, чтобы лиофилизованный ботулинический токсин размораживался или разводился непосредственно перед применением, может приводить к погрешности белка. В дополнение к неудобству в применении, лиофилизированные ботулинические токсины трудно разработать в виде предварительно заполненного шприца.

Композиция для стабилизации белковых агентов в фармацевтических средствах предложена в Заявке на патент США №2007-0134199. Композиция включает неионный детергент, предпочтительно полисорбат, и комбинацию глутамина и глутаминовой кислоты или аспарагина и аспарагиновой кислоты. Ботулинический токсин, разведенный в жидкой композиции, был стабилен в течение 8 месяцев при хранении при 4°С. Однако, поскольку активность разведенного ботулинического токсина снижалась при хранении при 37°С в течение одного месяца, композиция имела ограниченное применение для стабилизации белковых агентов, таких как ботулинический токсин, в фармацевтических средствах, предназначенных для хранения при комнатной температуре. Этот недостаток, по мнению авторов настоящего изобретения, связан с присутствием полярных аминокислот, и в частности, таких аминокислот, как глютаминовая кислота или аспарагиновая кислота.

Краткое изложение сущности изобретения

Техническая проблема

Соответственно, настоящее изобретение было создано для преодоления вышеуказанных проблем предшествующего уровня техники. Задачей настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции, в которой активность ботулинического токсина может сохраняться даже при хранении в течение длительного периода времени при комнатной температуре, а также при низкой температуре, и в жидкой форме, более удобной для применения, чем лиофилизированная форма.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение жидкой фармацевтической композиции, в которой активность ботулинического токсина может стабильно сохраняться в условиях охлаждения или высокой температуры, без применения белка животного происхождения, такого как альбумин или желатин, в качестве стабилизатора ботулинического токсина, и без полярных или кислых аминокислот, таких как глутамин, глутаминовая кислота, аспарагин или аспарагиновая кислота.

Техническое решение

Интенсивные и всесторонние исследования, проведенные авторами данного изобретения со многими детергентами и аминокислотами для стабильной консервации ботулинического токсина в высокотемпературных условиях, привели к установлению того факта, что комбинация полисорбата 20 и метионина и необязательно изолейцина способна существенно повысить стабильность ботулинического токсина при хранении при комнатной или более высокой температуре.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, включающая ботулинический токсин, полисорбат 20 и метионин.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, включающая ботулинический токсин, полисорбат 20, метионин и изолейцин.

В жидкой фармацевтической композиции метионин присутствует в количестве от 0,5 до 100 мкмоль на 100 единиц ботулинического токсина, и предпочтительно находится в диапазоне концентрации от 0,5 до 100 мМ, и более предпочтительно от 25 до 75 мМ.

В жидкой фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением полисорбат 20 присутствует в количестве от 0,01 до 50 мг на 100 единиц ботулинического токсина и предпочтительно находится в диапазоне концентрации от 0,01 до 50 мг/мл, и более предпочтительно от 0,1 до 2,5 мг/мл.

В жидкой фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением ботулинический токсин выбран из группы, состоящей из серотипов ботулинического токсина А, В, С, D, Е, F и G, и может быть в не-комплексной форме или в форме комплекса с белком. Предпочтительно ботулинический токсин находится в диапазоне концентрации от 50 до 5,000 единиц/л.

Жидкая фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно имеет рН в диапазоне от 5,5 до 7,0.

Полезные эффекты

Благодаря применению в качестве стабилизаторов ботулинического токсина, вместо белка животного происхождения альбумина и желатина, комбинации полисорбата 20 и метионина и необязательно изолейцина, жидкая фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением исключает риск заражения организма патогенами или микроорганизмами сывороточного происхождения и может безопасно применяться.

Кроме того, жидкая фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть удобной для непосредственной инъекции пациенту. Далее, как и при температурах замораживания, с учетом стабильности при хранении ботулинического токсина при 25-37°С, жидкая фармацевтическая композиция настоящего изобретения очень полезна для хранения ботулинического токсина в чрезвычайных условиях, таких как условия без поддержания низкой температуры, превосходя обычные жидкие фармацевтические композиции, содержащие детергенты либо аминокислоты.

Жидкая фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть легко приготовлена, поскольку использует детергент и аминокислоту(ы) без лиофилизации.

Наилучший способ осуществления изобретения

В соответствии с настоящим изобретением обеспечивается жидкая фармацевтическая композиция, улучшающая стабильность ботулинического токсина. В частности, жидкая фармацевтическая композиция включает ботулинический токсин, полисорбат 20 и метионин, и необязательно изолейцин.

Жидкая фармацевтическая композиция, включающая ботулинический токсин, полисорбат 20 и метионин, или альтернативно ботулинический токсин, полисорбат 20, метионин и изолейцин в соответствии с настоящим изобретением, обеспечивает улучшение стабильности ботулинического токсина.

С применением полисорбата 20, метионина и необязательно изолейцина, вместо белков животного происхождения, таких как альбумин или желатин, в качестве стабилизаторов для ботулинического токсина, жидкая фармацевтическая композиция настоящего изобретения исключает возможный риск инфицирования реципиента патогенами или микроорганизмами сывороточного происхождения, и таким образом, она безопасна при введении в организм. Кроме того, применение стабилизаторов полисорбата 20, метионина и необязательно изолейцина в комбинации гарантирует более высокую стабильность ботулинического токсина при 25-37°С, чем их применение по отдельности.

Ботулинический токсин, компонент жидкой фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть выбран из серотипов А, В, С, D, Е, F и G. Термин ботулинический токсин является общим термином, охватывающим семейство токсинов, продуцируемых анаэробной бактерией Clostridium botulinum, и на сегодняшний день идентифицировано семь иммунологически различных серотипов нейротоксинов. Они были обозначены как А, В, С, D, Е, F и G, чтобы отличить один от другого по влиянию на целевых животных, и по степени и длительности паралича. Известно, что все серотипы ботулинического токсина действуют как нейротоксины, путем ингибирования нейротрансмиттера ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах.

Ботулинический токсин из жидкой фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть в некомплексной форме или в форме комплекса с другим белком. Серотипы ботулинического токсина А, В, С, D, Е, F или G по отдельности, синтезируемые Clostridium botulinum, сами по себе имеют молекулярную массу примерно 150 кДа. При экспрессии в Clostridium botulinum ботулинический токсин образует различные комплексы с белками-гемагглютининами и с белками негемагглютининами, поддерживающими и защищающими его активность. Природные комплексы ботулинического токсина типа А имеют молекулярную массу примерно 900 кДа, 500 кДа или 300 кДа. Измеренная молекулярная масса составляет примерно 500 кДа для комплексов ботулинического токсина типа В и типа С, примерно 300 кДа или 500 кДа для комплексов типа D, и примерно 300 кДа для комплексов типа Е и типа F.

Концентрация ботулинического токсина в жидкой фармацевтической композиции настоящего изобретения, хотя и не строго ограничиваемая, предпочтительно находится в диапазоне от 50 до 5,000 единиц/мл, в зависимости от ее основного применения.

Метионин присутствует в количестве от 0,5 до 100 мкмоль на 100 единиц ботулинического токсина, и предпочтительно находится в диапазоне концентрации от 0,5 до 100 мМ, и более предпочтительно от 25 до 75 мМ в жидкой фармацевтической композиции настоящего изобретения.

Одна единица (U) ботулинического токсина определяется как LD₅₀ при интраперитонеальном введении самцам мышей линии Swiss Webster весом 18-20 грамм каждый. LD₅₀ ботулинического токсина у мышей соответствует примерно 50 пикограммам.

Содержание метионина менее 0,5 мкмоль на 100 единиц ботулинического токсина не гарантирует стабилизации ботулинического токсина на необходимом уровне при долговременном хранении в условиях комнатной температуры. С другой стороны, когда метионин применяют в количестве, превышающем 100 мкмоль на 100 единиц ботулинического токсина, избыточное увеличение может не обеспечивать дополнительного эффекта стабилизации в дополнение к созданию экономического недостатка. В жидкой фармацевтической композиции настоящего изобретения метионин находится в подходящем диапазоне концентрации от 0,5 до 100 мМ, когда концентрация ботулинического токсина составляет 100 единиц/мл. Надлежащую концентрацию доводят до 25-75 мМ с учетом диапазона концентрации полисорбата 20. Когда концентрация метионина в жидкой фармацевтической композиции настоящего изобретения ниже 25 мМ, ее долговременный стабилизирующий эффект в отношении ботулинического токсина при комнатной температуре не достигает необходимого уровня, достигаемого при надлежащем диапазоне концентрации ботулинического токсина. С другой стороны, концентрация метионина, превышающая 75 мМ, не обеспечивает какого-либо дополнительного эффекта.

В жидкой фармацевтической композиции настоящего изобретения полисорбат 20 присутствует в количестве от 0,01 до 50 мг на 100 единиц ботулинического токсина, и предпочтительно в диапазоне концентрации от 0,01 до 50 мг/мл, и более предпочтительно от 0,1 до 2,5 мг/мл.

Полисорбаты являются классом эмульгаторов, используемых в некоторых фармацевтических средствах и при приготовлении продуктов питания. Они часто применяются в косметических средствах для растворения эфирных масел в продуктах на водной основе (масло-в-воде). Имеется много видов полисорбатов, классифицирующихся по номеру, относящемуся к общему числу оксиэтиленовых групп, таких как полисорбат 20, 40, 60 и 80. Жидкая фармацевтическая композиция настоящего изобретения использует полисорбат 20 (коммерчески доступный под торговой маркой Твин 20) в качестве стабилизатора для ботулинического токсина.

Если жидкая фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержит полисорбат 20 в количестве меньше 0,01 мг на 100 единиц ботулинического токсина, ее долговременный стабилизирующий эффект в отношении ботулинического токсина при комнатной температуре не достигает необходимого уровня, достигаемого при надлежащем диапазоне концентрации ботулинического токсина. С другой стороны, концентрация полисорбата 20, превышающая 50 мг/мл, не обеспечивает какого-либо дополнительного эффекта, в дополнение к созданию экономического недостатка. При концентрации 100 единиц/мл ботулинического токсина в жидкой фармацевтической композиции настоящего изобретения, полисорбат 20 присутствует в надлежащем количестве 0,01-50 мг/мл, и предпочтительно в количестве 0,1-2,5 мг/мл с учетом концентрации метионина. Когда концентрация полисорбата 20 в жидкой фармацевтической композиции настоящего изобретения ниже 0,1 мг/мл, ее долговременный стабилизирующий эффект в отношении ботулинического токсина при комнатной температуре не достигает необходимого уровня, достигаемого при целевой концентрации полисорбата 20. С другой стороны, концентрация полисорбата 20, превышающая 2,5 мг/мл, не обеспечивает какого-либо дополнительного эффекта.

В соответствии с настоящим изобретением жидкая фармацевтическая композиция имеет рН 5,5-7,0. Если рН жидкой фармацевтической композиции настоящего изобретения доведен до 5,5-7,0, ботулинический токсин стабильно сохраняется при комнатной температуре (в частности, при 40°С) в течение длительного периода времени.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Наилучшее понимание настоящего изобретения может быть достигнуто с помощью следующих примеров, которые приведены далее для иллюстрации, но не предназначены для истолкования как ограничивающие данное изобретение.

1. Экспериментальный способ

(1) Приготовление жидкой композиции ботулинического токсина.

Ботулинический токсин разбавляли до конечной концентрации 100 единиц/мл в стабилизирующем растворе.

(2) Анализ стабильности ботулинического токсина.

Когда приготовленную жидкую композицию ботулинического токсина хранили при определенной температуре, из нее отбирали образцы 1 мл с предварительно определенными интервалами. 1 мл взятого образца жидкой композиции разбавляли в 10 раз с применением 9 мл раствора для инъекций. Разбавленный образец вводили итраперитонеально пяти самкам мышей линии IRC (Институт исследования рака, США) (в дозе 0,3 мл на мышь, 3 единицы/мышь). При наблюдении мышей в течение 3 суток оценивали число погибших и процент смертности. Жидкую композицию ботулинического токсина оценивали на предмет сохранения активности ботулинического токсина, когда процент смертности составлял 50% или выше.

2. Выбор стабилизатора ботулинического токсина

Жидкие композиции ботулинического токсина, содержащие различные варианты стабилизаторов ботулинического токсина, приготовленные и анализированные на предмет стабильности ботулинического токсина на протяжении времени при хранении при 25°С и 37°С, приведены в таблицах 1 и 2, соответственно. В таблицах 1 и 2 HSA обозначает сывороточный альбумин человека, а ПЭГ8000 обозначает полиэтиленгликоль 8000.

При 25°С, как видно из таблицы 1, активность ботулинического токсина сохраняется в течение длительного периода времени в жидкой композиции, включающей L-метионин (20 мМ) + полисорбат 20 (2 мг/мл) + ботулинический токсин (100 единиц/мл), HSA (5 мг/мл) + полисорбат 20 (2 мг/мл) + ботулинический токсин (100 единиц/мл), L-изолейцин (50 мМ) + полисорбат 20 (2 мг/мл) + ботулинический токсин (100 единиц/мл), гидроксиэтил-крахмал (10 мг/мл) + полисорбат 20 (2 мг/мл) + ботулинический токсин (100 единиц/мл). Было установлено, что при 37°С жидкая композиция, включающая L-метионин (20 мМ) + полисорбат 20 (2 мг/мл) + ботулинический токсин (100 единиц/мл) или HSA (5 мг/мл) + полисорбат 20 (2 мг/мл) + ботулинический токсин (100 единиц/мл), сохраняет активность ботулинического токсина в течение длительного периода времени, как видно из таблицы 2.

Из этих результатов установлено, что комбинация метионина и полисорбата 20 действует как стабилизатор, заменяющий комбинацию HAS и полисорбата 20, или комбинацию гидроксиэтил-крахмала и полисорбата 20. Кроме того, комбинация изолейцина и полисорбата 20 является возможным стабилизатором для замены обычных стабилизаторов.

3. Стабильность ботулинического токсина при различных концентрациях метионина

Жидкие композиции ботулинического токсина, включающие различные концентрации метионина в комбинации с полисорбатом 20 в качестве стабилизаторов ботулинического токсина, анализировали на способность сохранять активность ботулинического токсина в условиях хранения при 37°С. Результаты экспериментов по стабильности ботулинического токсина в соответствии с изменениями концентрации метионина приведены в таблице 3 ниже.

Как видно из таблицы 3, активность ботулинического токсина стабильно сохранялась в течение 56 суток при концентрации метионина 0,5-20 мМ и в течение 70 суток при концентрации метионина 50-100 мМ. Применение в композиции и метионина, и полисорбата 20 значительно повышало стабильность ботулинического токсина по сравнению с композицией, в которой применялся только полисорбат 20.

4. Стабильность ботулинического токсина при различных концентрациях полисорбата 20

Анализировали способность жидких композиций ботулинического токсина, включающих метионин в комбинации с различными концентрациями полисорбата 20 в качестве стабилизаторов ботулинического токсина, поддерживать активность ботулинического токсина в условиях хранения при 37°С. Экспериментальные результаты стабильности ботулинического токсина в соответствии с изменениями концентрации полисорбата приведены в таблице 4 ниже.

Как видно из таблицы 4, активность ботулинического токсина стабильно сохранялась в течение 202 суток при концентрациях полисорбата 20 0,5-2,0 мг/мл, в течение 167 суток при концентрации полисорбата 20 0,01 мг/мл, и в течение 120 суток при концентрации полисорбата 20 10 мг/мл. В композиции с применением как метионина, так и полисорбата 20, стабильность ботулинического токсина существенно повышалась по сравнению с композицией, содержащей только метионин.

5. Стабильность ботулинического токсина при различных концентрациях метионина и полисорбата 20

Анализировали способность жидких композиций ботулинического токсина, включающих различные концентрации комбинаций метионина и полисорбата 20 в качестве стабилизаторов ботулинического токсина, поддерживать активность ботулинического токсина в условиях хранения при 37°С. Экспериментальные результаты (процент смертности, %) стабильности ботулинического токсина после хранения в течение 30 и 60 суток при различных концентрациях метионина и полисорбата 20 (пример 12) приведены в таблицах 5 и 6, соответственно. В жидких композициях ботулинического токсина, используемых в экспериментах, концентрация ботулинического токсина составила 100 единиц/мл.

Статистический анализ данных таблиц 5 и 6 позволил предположить, что комбинация 25-75 мМ метионина и 0,1-2,5 мг/мл полисорбата 20 стабилизирует ботулинический токсин с наибольшей эффективностью.

6. Стабильность ботулинического токсина в жидких композициях ботулинического токсина с различными рН

Готовили различные жидкие композиции ботулинического токсина (пример 13) с рН 5,5-7,0, в которых метионин и полисорбат 20 объединяли в соответствующих диапазонах концентрации, оптимальных для стабилизации ботулинического токсина, и анализировали их способность поддерживать активность ботулинического токсина в условиях хранения при 40°С. В жидких композициях ботулинического токсина регулировали рН с помощью HCl и NaOH. Концентрация ботулинического токсина в каждой композиции составила 100 единиц/мл. Результаты стабильности ботулинического токсина в соответствии с рН жидкой композиции приведены в таблице 7 ниже,

Как видно из таблицы 7, активность ботулинического токсина стабильно сохранялась в течение 90 суток в жидких композициях ботулинического токсина, содержащих 25-75 мМ метионина в комбинации с 0,25-0,75 мг/мл полисорбата 20 с рН в диапазоне от 5,5 до 7,0 в условиях хранения при 40°С.

7. Стабильность ботулинического токсина в жидких фармацевтических композициях, содержащих комбинацию метионина, изолейцина и полисорбата

Как описано выше, комбинация изолейцина и полисорбата 20, также как и комбинация метионина и полисорбата 20 является возможным кандидатом для стабилизации ботулинического токсина. На основании этого результата анализировали комбинацию метионина, изолейцина и полисорбата 20 на способность к стабилизации ботулинического токсина в условиях хранения при 37°С. В жидкой композиции ботулинический токсин имел концентрацию 100 единиц/мл.

Как видно из таблицы 8, активность ботулинического токсина сохранялась в течение долгого периода времени (примерно 200 суток) в условиях хранения при 37°С при комбинации метионина, изолейцина и полисорбата 20, но почти полностью исчезала до истечения 30 суток в жидких композициях, содержащих один изолейцин или в комбинации с метионином или полисорбатом 20.

Промышленная применимость

Жидкая фармацевтическая композиция ботулинического токсина по настоящему изобретению обеспечивает улучшенную стабильность ботулинического токсина. Она может быть использована для лечения дистонии, спастичности мышц, неврологических заболеваний (мигрени, люмбаго, заболевания шейного отдела позвоночника и т.д.), а также в косметических целях для лечения гипергидроза и уменьшения морщин. Кроме того, жидкая фармацевтическая композиция ботулинического токсина настоящего изобретения может непосредственно применяться в виде инъекции и обеспечивает активность ботулинического токсина в течение длительного периода времени даже при 25-37°С, также как и при температуре замораживания, что выгодно при транспортировке и реализации.

Реферат

Изобретение относится к области фармацевтики. Композиция содержит ботулинический токсин, полисорбат 20 и метионин, где метионин присутствует в количестве от 25 до 75 мМ, а полисорбат 20 присутствует в количестве от 0,1 до 2,5 мг/мл. Композиция обладает улучшенной стабильностью. Использование жидкой фармацевтической композиции в виде комбинации полисорбата 20 и метионина в качестве стабилизаторов ботулинического токсина, вместо белков животного происхождения альбумина и желатина, устраняет риск контаминации организма патогенами или микроорганизмами сывороточного происхождения и позволяет безопасно вводить в организм. Кроме того, композиция удобна для применения при непосредственном введении пациентам. 7 з.п. ф-лы, 8 табл.

Формула