Способы получения одноцепочечной рнк - RU2018136601A
Код документа: RU2018136601A
Формула
1. Способ получения одноцепочечной РНК (оцРНК), предусматривающий:
(i) получение препарата РНК, содержащего оцРНК, полученную с помощью in vitro транскрипции;
(ii) приведение препарата РНК в контакт с целлюлозным материалом при условиях, которые предусматривают возможность связывания двухцепочечной РНК (дцРНК) с целлюлозным материалом; и
(iii) отделение оцРНК от целлюлозного материала при условиях, которые предусматривают возможность связывания дцРНК с целлюлозным материалом.
2. Способ по п. 1, дополнительно предусматривающий стадию получения препарата РНК, содержащего оцРНК, с помощью in vitro транскрипции.
3. Способ по п. 1 или 2, при котором стадии (ii) и (iii) проводят при условиях, которые предусматривает возможность связывания дцРНК с целлюлозным материалом и не позволяют оцРНК связываться с целлюлозным материалом.
4. Способ по п. 3, при котором стадия (ii) предусматривает смешивание препарата РНК, содержащего оцРНК, с целлюлозным материалом при встряхивании и/или перемешивании, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 мин, более предпочтительно в течение по меньшей мере 10 мин.
5. Способ по п. 4, при котором на стадии (ii) препарат РНК обеспечивается в виде жидкости, содержащей оцРНК и первый буфер, и/или целлюлозный материал обеспечивается в виде суспензии в первом буфере, причем первый буфер содержит воду, этанол и соль, предпочтительно хлорид натрия, в концентрации, которая предусматривает возможность связывания дцРНК с целлюлозным материалом и которая не предусматривает оцРНК связываться с целлюлозным материалом.
6. Способ по п. 5, при котором концентрация этанола в первом буфере составляет 14-20% (об./об.), предпочтительно 14-16% (об./об.).
7. Способ по п. 5 или 6, при котором концентрация соли в первом буфере составляет 15-70 мM, предпочтительно 20-60 мM.
8. Способ по любому из пп. 5-7, при котором первый буфер дополнительно содержит буферное вещество, предпочтительно трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), и/или хелатирующее средство, предпочтительно EDTA.
9. Способ по любому из пп. 5-8, при котором на стадии (iii) обеспечивают наличие в пробирке смеси препарата РНК, целлюлозного материала и первого буфера, и стадия (iii) предусматривает (1) приложение силы тяжести или центробежной силы к пробирке так, чтобы разделить жидкую и твердую фазы; и (2) или сбор супернатанта, содержащего оцРНК, или удаление целлюлозного материала.
10. Способ по любому из пп. 5-8, при котором на стадии (iii) обеспечивают наличие в спин-колонке или фильтровальном устройстве смеси препарата РНК, целлюлозного материала и первого буфера, и стадия (iii) предусматривает (1') приложение силы тяжести, центробежной силы, давления или вакуума к спин-колонке или фильтровальному устройству с тем, чтобы разделить жидкую и твердую фазы; и (2') сбор фильтрата, содержащего оцРНК.
11. Способ по любому из пп. 3-10, при котором стадии (ii) и (iii) повторяют один раз или два или больше раз, причем препарат оцРНК, полученный после стадии (iii) одного цикла стадий (ii) и (iii), используют в качестве препарата РНК на стадии (ii) следующего цикла и на стадии (ii) каждого цикла стадий (ii) и (iii) используют свежий целлюлозный материал.
12. Способ по п. 1 или 2, при котором стадию (ii) проводят при условиях, которые предусматривают возможность связывания дцРНК и оцРНК с целлюлозным материалом; и стадию (iii) проводят при условиях, которые предусматривают возможность связывания дцРНК с целлюлозным материалом и не предусматривают оцРНК связываться с целлюлозным материалом.
13. Способ по п. 12, при котором стадия (ii) предусматривает (1) смешивание препарата РНК, содержащего оцРНК, с целлюлозным материалом при встряхивании и/или перемешивании, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 мин, более предпочтительно в течение по меньшей мере 10 мин; и (2) отделение целлюлозного материала, с которым связаны дцРНК и оцРНК, от остатка.
14. Способ по п. 13, при котором на стадии (ii) препарат РНК обеспечивается в виде жидкости, содержащей оцРНК и второй буфер, и/или целлюлозный материал обеспечивается в виде суспензии во втором буфере, причем второй буфер содержит воду, этанол и соль, предпочтительно хлорид натрия, в концентрации, которая предусматривает возможность связывания дцРНК и оцРНК с целлюлозным материалом.
15. Способ по п. 14, при котором концентрация этанола во втором буфере составляет по меньшей мере 35% (об./об.), предпочтительно 38-42% (об./об.).
16. Способ по п. 14 или 15, при котором концентрация соли во втором буфере составляет 15-70 мM, предпочтительно 20-60 мM.
17. Способ по любому из пп. 14-16, при котором второй буфер дополнительно содержит буферное вещество, предпочтительно трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), и/или хелатирующее средство, предпочтительно EDTA.
18. Способ по любому из пп. 14-17, при котором на стадии (ii)(2) обеспечивают наличие в пробирке смеси препарата РНК и целлюлозного материала, полученной на стадии (ii)(1), и стадия (ii)(2) предусматривает (2a) приложение силы тяжести или центробежной силы к пробирке с тем, чтобы разделить жидкую и твердую фазы; и (2b) либо удаление супернатанта, либо сбор целлюлозного материала, с которым связаны дцРНК и оцРНК.
19. Способ по любому из пп. 14-17, при котором на стадии (ii)(2) обеспечивают наличие в спин-колонке или фильтровальном устройстве смеси препарата РНК и целлюлозного материала, полученной на стадии (ii)(1), и стадия (ii)(2) предусматривает (2a') приложение силы тяжести, центробежной силы, давления или вакуума к спин-колонке или фильтровальному устройству с тем, чтобы разделить жидкую и твердую фазы; и (2b') сброс фильтрата.
20. Способ по любому из пп. 14-19, при котором стадия (ii) дополнительно предусматривает (3) добавление аликвоты второго буфера к целлюлозному материалу, с которым связаны дцРНК и оцРНК; (4) инкубацию полученной смеси при встряхивании и/или перемешивании, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 мин, более предпочтительно в течение по меньшей мере 10 мин; и (5) отделение целлюлозного материала, с которым связаны дцРНК и оцРНК, от жидкой фазы; и необязательно (6) повторение стадий (3) - (5) один раз или два или больше раз.
21. Способ по любому из пп. 12-20, при котором стадия (iii) предусматривает (1) смешивание целлюлозного материала, с которым связаны дцРНК и оцРНК, с первым буфером при встряхивании и/или перемешивании, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 мин, более предпочтительно в течение по меньшей мере 10 мин, причем первый буфер содержит воду, этанол и соль, предпочтительно хлорид натрия, в концентрации, которая предусматривает возможность связывания дцРНК с целлюлозным материалом и не позволяет оцРНК связываться с целлюлозным материалом; и (2) отделение жидкой фазы, содержащей оцРНК, от целлюлозного материала.
22. Способ по п. 21, при котором концентрация этанола в первом буфере составляет 14-20% (об./об.), предпочтительно 14-16% (об./об.).
23. Способ по п. 21 или 22, при котором концентрация соли в первом буфере составляет 15-70 мM, предпочтительно 20-60 мM.
24. Способ по любому из пп. 21-23, при котором первый буфер дополнительно содержит буферное вещество, предпочтительно трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), и/или хелатирующее средство, предпочтительно EDTA.
25. Способ по любому из пп. 21-24, при котором на стадии (iii) обеспечивают наличие в пробирке смеси целлюлозного материала и первого буфера, и стадия (iii)(2) предусматривает (2a) приложение силы тяжести или центробежной силы к пробирке с тем, чтобы разделить жидкую и твердую фазы; и (2b) или сбор супернатанта, содержащего оцРНК, или удаление целлюлозного материала.
26. Способ по любому из пп. 21-24, при котором на стадии (iii) обеспечивают наличие в спин-колонке или фильтровальном устройстве смеси целлюлозного материала и первого буфера, и стадия (iii)(2) предусматривает (2a') приложение силы тяжести, центробежной силы, давления или вакуума к спин-колонке или фильтровальному устройству; и (2b') сбор фильтрата, содержащего оцРНК.
27. Способ по любому из пп. 12-26, при котором стадии (ii) и (iii) повторяют один раз или два или больше раз, причем препарат оцРНК, полученный после стадии (iii) одного цикла стадий (ii) и (iii), используют в качестве препарата РНК на стадии (ii) следующего цикла и на стадии (ii) каждого цикла стадий (ii) и (iii) используют свежий целлюлозный материал.
28. Способ по п. 12, при котором на стадии (ii) обеспечивают наличие в колонке целлюлозного материала, стадия (ii) предусматривает загрузку препарата РНК на колонку при условиях, которые предусматривают возможность связывания дцРНК и оцРНК с целлюлозным материалом, и стадия (iii) предусматривает элюирование оцРНК из целлюлозного материала при условиях, которые предусматривают возможность связывания дцРНК с целлюлозным материалом и не позволяют оцРНК связываться с целлюлозным материалом.
29. Способ по п. 28, при котором на стадии (ii) препарат РНК получают и загружают на колонку в виде жидкости, содержащей оцРНК и второй буфер, причем второй буфер содержит воду, этанол и соль, предпочтительно хлорид натрия, в концентрации, которая предусматривает возможность связывания дцРНК и оцРНК с целлюлозным материалом.
30. Способ по п. 29, при котором концентрация этанола во втором буфере составляет по меньшей мере 35% (об./об.), предпочтительно 38-42% (об./об.).
31. Способ по п. 29 или 30, при котором концентрация соли во втором буфере составляет 15-70 мM, предпочтительно 20-60 мM.
32. Способ по любому из пп. 29-31, при котором второй буфер дополнительно содержит буферное вещество, предпочтительно трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), и/или хелатирующее средство, предпочтительно EDTA.
33. Способ по любому из пп. 28-32, при котором стадию (iii) проводят с использованием первого буфера в качестве элюента, причем первый буфер содержит воду, этанол и соль, предпочтительно хлорид натрия, в концентрации, которая предусматривает возможность связывания дцРНК с целлюлозным материалом и не позволяет оцРНК связываться с целлюлозным материалом.
34. Способ по п. 33, при котором концентрация этанола в первом буфере составляет 14-20% (об./об.), предпочтительно 14-16% (об./об.).
35. Способ по п. 33 или 34, при котором концентрация соли в первом буфере составляет 15-70 мM, предпочтительно 20-60 мM.
36. Способ по любому из пп. 33-35, при котором первый буфер дополнительно содержит буферное вещество, предпочтительно трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS), и/или хелатирующее средство, предпочтительно EDTA.
37. Способ по любому из пп. 1-36, при котором препарат РНК получают с использованием РНК-полимеразы, выбранной из группы, состоящей из РНК-полимераз T3, T7 и SP6.
38. Способ по любому из пп. 1-37, при котором перед стадией (ii) препарат РНК подвергают по меньшей мере одной обработке, предшествующей очистке.
39. Способ по п. 38, при котором по меньшей мере одна обработка, предшествующая очистке, предусматривает одно или несколько из следующего: осаждение нуклеиновых кислот, предпочтительно с использованием хлорида лития; связывание нуклеиновых кислот с магнитными гранулами; ультрафильтрация; и разложение ДНК, предпочтительно с использованием специфической для двойной спирали нуклеазы (DSN).
40. Способ по любому из пп. 1-39, при котором оцРНК представляет собой иРНК или ингибирующую РНК, такую как антисмысловая РНК, киРНК или микроРНК.
41. Способ по любому из пп. 1-40, при котором оцРНК характеризуется длиной, составляющей по меньшей мере 2700 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 3000 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 3500 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 4500 нуклеотидов.
42. Способ по любому из пп. 1-41, при котором целлюлозный материал содержит целлюлозные волокна, предпочтительно целлюлозные волокна степени чистоты, подходящей для применения в качестве реагента для распределительной хроматографии.
43. Способ по любому из пп. 1-42, при котором перед приведением в контакт с препаратом РНК на стадии (ii) целлюлозный материал обеспечивается в виде промытого целлюлозного материала.
44. Способ по п. 43, при котором промывка целлюлозного материала включает в себя (I) смешивание целлюлозного материала с промывочным раствором при встряхивании и/или перемешивании, предпочтительно в течение по меньшей мере 5 мин, более предпочтительно в течение по меньшей мере 10 мин; и (II) либо удаление жидкости, либо сбор целлюлозного материала; и необязательно (III) повторение стадий (I) и (II) один раз или два или больше раз.
45. Способ по п. 44, при котором промывочный раствор характеризуется композицией (A) первого буфера, определенного в любом из пп. 5-8, если стадию (ii) проводят при условиях, которые предусматривают возможность связывания дцРНК с промытым целлюлозным материалом и не позволяют оцРНК связываться с промытым целлюлозным материалом, или (B) второго буфера, определенного в любом из пп. 14-17, если стадию (ii) проводят при условиях, которые предусматривают возможность связывания дцРНК и оцРНК с промытым целлюлозным материалом.
46. оцРНК, получаемая с помощью способа по любому из пп. 1-45.
47. оцРНК по п. 46, которая по существу не содержит дцРНК, предпочтительно по существу не содержит дцРНК и ДНК.
48. оцРНК по п. 46 или 47 для применения в терапии.
