Способ лечения болезни альцгеймера и фармацевтическая композиция на основе клиохинола для ее лечения - RU2193406C2

Чертежи

Описание

Изобретение относится к способу лечения болезни Альцгеймера путем применения хелатирующего агента и к фармацевтической композиции для ее лечения на основе этого хелатирующего агента.

Болезнь Альцгеймера является хроническим нейродегенеративным заболеванием, распространенным, прежде всего, среди людей старшего возраста.

Клинический диагноз болезни Альцгеймера подтверждается наличием и накоплением отложений амилоида в головном мозге. Амилоид находят прежде всего в терминальных зонах нейронов в виде морфологически гетерогенных отложений, известных так же как сенильные бляшки. Образование сенильной бляшки связано с появлением симптомов и признаков этого заболевания, включая амнезию. После образования сенильной бляшки в телах нейронов образуются хаотичные сплетения нейрофибрилл. С образованием этих сплетений нейрофибрилл связано ухудшение памяти и другие симптомы деменции.

Главным компонентом отложений амилоида является полипептид, упоминаемый в настоящем документе как Aβ (амилоид-бета). Aβ в норме является растворимым компонентом спинномозговой жидкости, где он находится в концентрации около 3-5 нМ. Aβ в зрелой форме может иметь от 39 до 43 аминокислот, обычно 40 аминокислот, и выделяется в виде продукта протеолитического расщепления из белка клеточной поверхности, называемого белком-предшественником амилоида (БПА) (Kang et al., 1987). В настоящее время функция Aβ в норме неизвестна, но, может быть, он формирует катионные селективные каналы на клеточных мембранах (Kawachara et al., 1997).

Было показано, что преципитация синтетического Aβ вызывается несколькими внешними факторами, включая низкие значения рН, высокие концентрации солей и наличие металлов, например, цинка, меди и ртути (Bush et al., 1995). Сообщалось о том, что сам Aβ специфичным образом и до полного насыщения связывает цинк высокоаффинным связыванием (К_D=107 нМ) в молярном отношении 1:1 (цинк : Aβ) (Bush et al., 1994а). Это связывание имеет место при физиологических концентрациях цинка (Bush et al., 1994b).

Есть веские основания предполагать, что удаление отложений амилоида из организма пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, облегчит симптомы этого заболевания. Таким образом, было предпринято несколько попыток создания лекарственного средства для удаления отложений амилоида.

VO 93/10459 раскрывает способ лечения болезни Альцгеймера путем введения агента, связывающего цинк. В качестве предпочтительных соединений упоминаются фитиновая кислота, дезферриоксамин, цитрат натрия, ЭДТК, 1, 2-диэтил-3-гидроксипиридин-4-он и 1-гидроксиэтил-3-гидрокси-2-метилпиридин-4-он.

DE 3932338 раскрывает применение хелатирующего агента, такого как 8-гидроксихинолин, для лечения болезни Альцгеймера.

US 5373021 описывает дисульфирам и его соли и аналоги как соединения, способные проникать через гематоэнцефалический барьер. Описанные соединения могут применяться для уменьшения неврологических нарушений, вызванных, среди прочих, болезнью Альцгеймера.

Известные до сих пор соединения, предлагавшиеся для лечения болезни Альцгеймера, имеют несколько недостатков, которые мешают их широкому применению. Например, большинство этих соединений не способно проникать через гематоэнцефалический барьер и, следовательно, едва ли могут достигнуть тех областей, в которых имеются отложения амилоида. Дисульфирам, который способен проникать через гематоэнцефалический барьер, имеет тот недостаток, что он является также агентом, удерживающим от приема алкоголя.

Наиболее изученным хелатирующим агентом является ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота). Однако хелатирующий эффект ЭДТК в отношении цинка и меди является относительно слабым. Кроме того, ЭДТК не проникает через гематоэнцефалический барьер и считается относительно токсичной.

Целью настоящего изобретения является обеспечение нового применения известного фармацевтического соединения для производства фармацевтической композиции для лечения болезни Альцгеймера; указанное соединение обладает способностью проникать через гематоэнцефалический барьер, эффективно хелатировать тяжелые металлы для предупреждения агрегации амилоида и растворения имеющихся отложений амилоида. Эта цель достигается путем использования клиохинола для этого нового применения.

Термин "лечение болезни Альцгеймера", использующийся в настоящем документе, относится к профилактике, контролю и лечению болезни Альцгеймера на любой стадии ее развития.

Клиохинол имеет химическое название 5-хлор-7-иод-8-гидроксихинолин и относится к группе гидроксихинолинов. Известно применение клиохинола в качестве местного антисептического агента. Клиохинол в особенности применяется для лечения амебиаза и инфекционной диареи. Клиохинол почти нерастворим в воде при значениях рН 7-11. Вне этих значений возможно достижение нужных концентраций этого соединения. Известна хелатирующая способность клиохинола в отношении Fe, Со, Ni и Zn (Kidani et al., 1974 и Tateishi et al., 1973). По данным масс-спектрофотометрии, координационное число для клиохинола в случае Со(II), Ni(II), Сu(II) и Zn(II) равно 2, в то время как координационное число для Fe(III) равно 3. По сообщениям, инъецированные препараты клиохинола проникают через гематоэнцефалический барьер, создавая концентрации в головном мозге порядка 20 мкл/мл, при введении в дозах 10-20 мг/кг (Tateishi et al. , 1975 и Tamura 1975). Было установлено, что концентрация клиохинола высока также в таких участках головного мозга, как гиппокамп, который непосредственно поражается при болезни Альцгеймера.

С помощью методики микроауторадиографии на обезьянах было показано, что клиохинол образует хелаты с цинком в гиппокампе. Хелаты с Zn(II) были обнаружены, в основном, в аксонодендритических синаптических окончаниях мшистых волокон. Неконъюгированный клиохинол при внутривенном введении чрезвычайно быстро проникает в нервную систему, практически не задерживаясь гематоэнцефалическим барьером (Shivaki, 1979).

Несмотря на то, что клиохинол обладает известной хелатирующей способностью и способностью проникать через гематоэнцефалический барьер, невозможно было предположить, что он также обладает способностью растворять осажденный цинком Aβ. Согласно настоящему изобретению, новое применение клиохинола для производства фармацевтической композиции для лечения болезни Альцгеймера основано на этом неожиданном открытии.

В настоящее время полагают, что клиохинол и Aβ конкурентно хелатируют цинк и другие тяжелые металлы. Клиохинол считается сильнейшим хелатирующим агентом и будет, следовательно, доминировать при захвате ионов тяжелых металлов. Таким образом, Aβ из осажденного комплекса цинк-Aβ будет вновь растворяться в окружающей жидкости, поскольку клиохинол будет захватывать ионы цинка. Комплекс клиохинола и цинка будет проходить через гематоэнцефалический барьер и выводиться из организма.

Поскольку клиохинол является относительно сильным хелатирующим агентом, он может также хелатировать ионы металлов из ферментов или простетических групп. Следовательно, может быть желательным назначать пациентам, которых лечат клиохинолом, ионы металлов, относящихся к микроэлементам, или простетические группы, особенно при длительном курсе лечения этим соединением.

Витамин B₁₂ содержит кобальт. Предыдущие исследования подострой миелооптической нейропатии (ПМОН) у японских пациентов, которые принимали клиохинол в более высоких дозах, чем было рекомендовано и в течение длительного периода времени, показали, что существует связь между длительным лечением клиохинолом и дефицитом витамина B₁₂. В настоящей заявке взаимодействие между клиохинолом и витамином B₁₂ доказано в исследованиях in vitro и in vivo. Таким образом, чтобы предотвратить дефицит витамина B₁₂, может быть целесообразным введение этого витамина одновременно или последовательно с клиохинолом.

Клиохинол можно вводить в любом нужном количестве в виде любой удобной галеновой формы и согласно любой схеме введения.

Предпочтительно, суточное количество клиохинола должно составлять от 10 мг до 750 мг в зависимости от состояния пациента. Обычная суточная доза составляет 100 мг. Альтернативно, можно вводить от 10 мг до 250 мг клиохинола, предпочтительно, 100 мг, три раза в сутки. Суточная доза до 750 мг в течение двух недель считается безопасной с точки зрения нейротоксичности или других побочных эффектов.

Для предупреждения появления симптомов и признаков болезни Альцгеймера или для торможения симптомов и признаков при развитии этого заболевания, можно вводить суточные дозы клиохинола от 10 до 100 мг в течение продолжительного периода времени, а именно, до десяти лет.

Конкретное количество вводимого препарата должно определяться лечащим врачом и может зависеть от многих факторов, таких как возраст, состояние, анамнез и т.п., конкретного пациента. Результаты, представленные в настоящем документе, предполагают для вводимого количества клиохинола существование "окна", в рамках которого получены наилучшие результаты по растворению. Такое "окно" может определить врач, проведя обычные эксперименты.

Если клиохинол собираются вводить в течение длительного периода времени, предпочтительно, осуществлять прерывистую схему введения. В первый период клиохинол может вводиться, например, в течение одной-трех недель, после чего следует период, свободный от введения препарата, в течение которого может осуществляться восстановление организма от любых нежелательных побочных эффектов клиохинола. Продолжительность периода без введения препарата может составлять одну-четыре недели. В течение этого периода предпочтительно вводить витамин В₁₂ и другие простетические группы и/или металлы. После этого периода можно повторить первый период. Долгосрочная прерывистая терапия обеспечит не только повторное растворение агрегатов цинка и Aβ, но также и профилактическое ингибирование образования этих агрегатов.

Прерывистое введение клиохинола также снизит токсический потенциал этого лекарственного средства, что означает, что лечение можно расширять по мере эволюции болезни.

Фармацевтическая композиция, включающая клиохинол, может представлять из себя любую удобную галеновую форму для энтерального и парентерального введения, с целью обеспечения доставки клиохинола в головной мозг в достаточных концентрациях. Если нужно быстро получить высокие концентрации препарата в головном мозге, предпочтительно вводить клиохинол в виде внутривенных инъекций. Поскольку более удобно вводить фармацевтическую композицию перорально, этот способ введения можно использовать, если нет необходимости быстрого достижения высоких концентраций препарата в головном мозге. Эту фармацевтическую композицию можно также вводить внутрикожно.

Фармацевтическая композиция, включающая клиохинол, может содержать также другие активные ингредиенты. Конкретно, эта композиция может содержать металлы-микроэлементы или простетические группы, такие как витамин B₁₂, и/или любой другой терапевтический агент, который можно применять одновременно для лечения болезни Альцгеймера, с целью улучшения или облегчения симптомов и признаков болезни Альцгеймера, или задержки начала проявления любых симптомов и признаков болезни Альцгеймера. Альтернативно, другой активный ингредиент (ингредиенты) может вводиться в виде отдельной фармацевтической композиции (композиций) вместе с фармацевтической композицией, включающей клиохинол.

Согласно настоящему изобретению, новое применение клиохинола включает:
1) лечение пациентов, которым уже поставлен диагноз болезни Альцгеймера в любой клинической стадии,
2) предупреждение этого заболевания у пациентов, имеющих ранние или продромальные симптомы и признаки, и/или
3) торможение начала или эволюции или ухудшение симптомов или признаков болезни Альцгеймера.

На чертеже изображена солюбилизация β-амилоида клиохинолом.

Настоящее изобретение будет проиллюстрировано нижеследующими примерами.

Пример 1. 5,3 г клиохинола суспендировали при перемешивании в 200 мл н-декана. Нерастворившемуся материалу позволяли осесть. Взвешивание высушенного нерастворившегося клиохинола после выдувания н-декана показало, что только 2% клиохинола растворилось в декане. 100 мл (светло-желтой) надосадочной жидкости смешивали со 100 мл физиологического раствора с фосфатным буфером, рН 7,4, и фазам позволяли разделиться. Физиологический раствор с фосфатным буфером (нижняя фаза) собирали и фильтровали для удаления остатка, который образовался на границе раздела фаз после экстракции органического растворителя. Допуская, что 2% клиохинола растворились в н-декане и что коэффициент распределения составляет 1/1750, с физиологическим раствором с фосфатным буфером в смесях 1:1 декана и клнохинола, концентрация клиохинола в физиологическом растворе с фосфатным буфером составила 800 нМ.

Были получены образцы головного мозга, для которых диагноз болезни Альцгеймера был подтвержден гистологически. По два образца фронтальной доли неокортекса весом 0,5 г гомогенизировали в 3 мл раствора клиохинола в физиологическом растворе с фосфатным буфером при 100%, 10% и 1% конечного экстракта физиологический раствор с фосфатным буфером/клиохинол и только в физиологическом растворе с фосфатным буфером.

Полученные гомогенаты центрифугировали при 150000 х g в течение тридцати минут и надосадочную жидкость собирали и помещали в лед (фракция "S"). Центрифужные осадки подвергали идентичной гомогенизации и центрифугированию и вновь собирали надосадочную жидкость (фракция "Р").

1 мл Каждой надосадочной жидкости обрабатывали 200 мкл ледяной 10% ТХУ (трихлоруксусной кислоты) для осаждения всего белка, включая Aβ. Полученный осадок промывали 100% этанолом и ресуспендировали в 100 мкл TBS (трис 20 мМ, NaCl 150 mm, pH 7,4).

7,5 мкл Образца (S или Р) кипятили в течение 5 минут с равным объемом трис-трицинового буфера, содержащего 4% SDS (додецилсульфата натрия), и загружали в Novex pre-cast 10-20% трис-трициновый гель, после чего переносили на нитроцеллюлозу Western. Сигнал для Aβ фиксировали с помощью mAb W02 (повышение по сравнению с остатками Aβ 5-16) и визуализировали с помощью ЭХЛ (электрогенерированной хемолюминесценции). Чувствительность этой детекторной системы составила 5-10 пг.

Для калибровки осаждения Aβ посредством ТХУ, к 1 мл физиологического раствора с фосфатным буфером, содержащего 10% альбумина бычьей сыворотки, добавляли 1 мкг синтетического Aβ 1-40 и раствор обрабатывали, как описано выше. Сигнал для Aβ определяли в выпавшем осадке, но не в надосадочной жидкости.

Результат представлен на чертеже.

Клиохинол в изученных концентрациях был эффективен в отношении ускорения солюбилизации Aβ. Помимо этого, была установлена оптимальная концентрация - 10%, что указывает на большую растворимость в физиологическом растворе с фосфатным буфером одной из агрегационных форм Aβ по сравнению с другими.

В то время как на чертеже представлены данные только для одного образца, все данные для 19 остальных образцов указывают на ту же тенденцию, а именно, что клиохинол является эффективным в отношении ускорения солюбилизации Aβ.
Пример 2. В этом эксперименте сравнивается хелатирующая способность клиохинола и ЭДТК.

Образцы синтетического Aβ весом 10 нг помещали в микротитрационные лунки и вызывали агрегацию путем добавления 25 мкМ ZnCl. Агрегаты затем переносили путем фильтрации на нейлоновый фильтр с размером отверстий 0,2 мкм. Эти агрегаты промывали 200 мкл TBS, TBS, содержащим 2 мкМ ЭДТК, и TBS, содержащим 2 мкМ клиохинола. Фильтр фиксировали, испытывали моноклональными анти-Aβ антителами 6Е10 и переносили для экспозиции на пленку из ECL. Измеряли коэффициент пропускания пленки из ECL и относительную силу сигнала рассчитывали на основании 100% только для TBS. Относительная сила сигнала составляла 66% для ЭДТК и 49% для клиохинола.

Результаты указывают на то, что клиохинол является более эффективным хелатирующим агентом для осажденного цинком Aβ, чем ЭДТК.

Пример 3. В этом примере демонстрируется ресолюбилизирующий эффект клиохинола.

Приготавливали 2,5 мкМ раствор Aβ в TBS с рН 7,4. 95% Aβ поддерживали в растворенном состоянии. Добавление 30 мкМ цинка приводило к выпадению растворенного Aβ и только 43% оставалось в растворе. Последующее добавление 120 мкМ клиохинола к осажденному цинком Aβ приводило к возрастанию растворенного Aβ до 70%.

Эти результаты показывают, что клиохинол обладает способностью вновь растворять осажденный цинком Aβ.
Пример 4. В этом примере изучалось влияние клиохинола на витамин B₁₂ in vitro методом ЯМР-спектроскопии.

Поскольку клиохинол практически нерастворим в воде при рН 7-11, исследование проводилось при рН 13. Было приготовлено 3 пробирки. Первая содержала 1 мг клиохинола в 0,5 мл, вторая содержала 1,4 мг цианкобаламина (B₁₂) в 0,5 мл и третья содержала 0,5 мг клиохинола + 0,7 мг цианкобаламина в 0,5 мл (молярное соотношение 3:1).

Спектры¹H ЯМР регистрировали на спектрофотометре DRX 400 MHz при 20^oС. Сравнение третьего спектра с первым и вторым показало, что некоторые из резонансов цианкобаламина имели сдвиг, и то же самое наблюдалось для двух из резонансов клиохинола. Эти результаты предполагают, что существует взаимодействие между клиохинолом и цианкобаламином.

Пример 5. В этом примере изучалось влияние клиохинола на витамин B₁₂ in vivo.

Шестинедельным самцам мыши предварительно вводили клиохинол в течение трех дней (50 мг/кг/день). Мышей разделяли на две группы, контрольную группу и группу, получавшую инъекции [⁵⁷Со]-цианкобаламина. Через 48 часов после инъекции животных умерщвляли, вырезали головной мозг, печень и почку и подсчитывали на гамма-счетчике как тысячу импульсов в минуту на грамм ткани (сырой вес) ± СО среднего. Величины радиоактивности для каждой из групп приведены в таблице.

Сравнение результатов показывает, что значимых изменений в количестве накопления радиоактивности в головном мозге и печени не наблюдалось. Отчетливое снижение количества витамина B₁₂ наблюдалось в почках. Можно сделать вывод о том, что клиохинол оказывает воздействие на концентрацию B₁₂ в некоторых органах мышей.

Источники информации
1. Kang et al. (1987) Nature 325: 733-736.

2. Kirschner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 267: 6953-6957.

3. Kawahara M.; Arispe N.; Kuroda Y.; Rojas E. (1997), Biophysical Journal 13/1, 67-75.

4. Bush, A. I. , Moir, R.D., Rosenkranz, K.M./ and Tanzi, R.E. (1995) Science 268: 1921-1923.

5. Bush, A. I. , Pettingell Jr., W.H., Paradis, M.D., and Tanzi, R.E. (1994a) J. Biol. Chem. 269: 12152-12158.

6. Bush, A.I., Pettingell Jr., W.H., Multhaup, G., Paradis, M.D., Vonsattel, J.P., Gusella, J.F., Beyre- uther, K., Masters, C.L., and Tanzi, R. E. (1994b) Science 265: 1464-1467.

7. Esler, W.P., Stimson, E.R., Jennings, J.M., Ghilardi, J.R., Mantyh, P.W., and Maggio, J.E. (1996) Neurochem. 66:723-732.

8. Kidani Y et al., (1974) Jap. Analyst 23:1375-1378.

9. Tateishi J et аl., (1973) Psychiat. Neurol. Jap. 75:187-196.

10. Shirilogi H., et al., (1979) Handbook of Clinical Neurology, North Holland Publishing Company, 141-198.

11. Tamura Z, (1975), Jap. J. med. Sci.Biol. Suppl 28: 69-77.

Реферат

Изобретение относится к фармакологии и медицине, а именно к способу лечения болезни Альцгеймера и фармацевтической композиции на основе клиохинола для ее лечения. Технический результат данного изобретения заключается в обеспечении нового применения известного фармацевтического соединения для профилактики, контроля и лечения болезни Альцгеймера на любой стадии ее развития. 2 с. и 12 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

Формула