Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (als) - RU2716422C2

Чертежи

Показать все 12 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 62/079588, озаглавленной «Лечение бокового амиотрофического склероза (ALS) с использованием siRNA, нацеленных на SOD-1», поданной 14 ноября 2014 года, предварительной заявки на патент США № 62/211992, озаглавленной «Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (ALS)», поданной 31 августа 2015 года, предварительной заявки на патент США № 62/234466, озаглавленной «Композиции и способы лечения бокового амиотрофического склероза (ALS)», поданной 29 сентября 2015 года; причем содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла с названием 1011PCTSL.txt, созданного 12 ноября 2015 года, размер которого составляет 126873 байта. Информация из перечня последовательностей в электронном формате включена в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к композициям, способам и процессам конструирования, получения, производства, применения и/или составления модулирующих полинуклеотидов, например, молекул малых интерферирующих РНК (siRNA), которые нацелены на ген супероксиддисмутазы 1 (SOD1). В контексте настоящего описания «модулирующий полинуклеотид» представляет собой любую последовательность(последовательности) нуклеиновой кислоты, чьей функцией является модуляция (либо повышение, либо снижение) уровня или количества целевого гена, например, уровней мРНК или белка. Целенаправленное воздействие на ген SOD1 может препятствовать экспрессии гена SOD1 и продукции фермента SOD1. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу siRNA, внедряют в векторы на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV). Также раскрыты способы применения молекул siRNA для ингибирования экспрессии гена SOD1 у субъекта с нейродегенеративным заболеванием (например, боковым амиотрофическим склерозом (ALS)).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Боковой амиотрофический склероз (ALS), также известный как болезнь Лу Герига, является наиболее губительным прогрессирующим нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся преобладающей потерей двигательных нейронов (MN) в первичной двигательной коре, стволе головного мозга и спинном мозге. Потеря двигательных нейронов подавляет основные, фундаментальные движения, такие как дыхание, и, как правило, вызывает смерть пациентов в течение 2~5 лет после постановки диагноза. Прогрессирующее ухудшение двигательной функции у пациентов тяжело нарушает их способность к дыханию, требуя некоторых видов вспомогательных устройств для дыхания для выживания пациентов. Другие симптомы также включают мышечную слабость в кистях рук, руках, ногах или глотательных мышцах. У некоторых пациентов (например, с FTD-ALS) также может развиваться лобно-височная деменция.

Согласно данным Ассоциации по борьбе с ALS в Соединенных Штатах Америки каждый год ALS диагностируют примерно у 5600 людей. Заболеваемость ALS составляет два случая на 100000 людей, и оценивается, что примерно 30000 американцев могут иметь данное заболевание в любой момент времени.

Было описано две формы ALS: одна представляет собой спорадический ALS (sALS), который является наиболее распространенной формой ALS в Соединенных Штатах Америки, и на его долю приходится 90-95% от общего числа диагностированных случаев; другая представляют собой семейный ALS (fALS), который встречается в ряду поколений в семьях с преимущественно доминантным наследованием, и на его долю приходится лишь приблизительно 5-10% от всех случаев в Соединенных Штатах Америки. sALS и fALS являются клинически неразличимыми.

Исследования патологии выявили, что после дебюта заболевания возникает нарушение некоторых клеточных процессов, включающее повышенный ER-стресс, образование свободных радикалов (т.е. активных форм кислорода (ROS)), митохондриальную дисфункцию, агрегацию белков, апоптоз, воспаление и эксайтотоксичность глутамата, особенно в двигательных нейронах (MN).

Причины ALS сложны и различны. В целом, ALS считается сложным генетическим нарушением, при котором несколько генов в сочетании с воздействиями окружающей среды объединяются, делая личность чувствительной. Было обнаружено более дюжины генов, связанных с ALS, в том числе, SOD-1 (Cu2+/Zn2+ супероксиддисмутаза), TDP-43 (TARDBP, TAR-ДНК-связывающий белок-43), FUS (подвергающийся слиянию при саркоме/подвергающийся транслокации при саркоме), ANG (ангиогенин), ATXN2 (атаксин-2), валозин-содержащий белок (VCP), OPTN (оптиневрин) и распространение некодирующего гексануклеотидного повтора GGGGCC в открытой рамке считывания 72 в хромосоме 9 (C9ORF72). Тем не менее, точные механизмы дегенерации двигательных нейронов все еще являются неясными.

В настоящее время не существует радикального лечения для ALS. Единственным одобренным FDA лекарственным средством является рилузол, который противодействует реакции на глутамат, снижая патологическое развитие ALS. Тем не менее, сообщалось о продлении жизни лишь приблизительно на три месяца для пациентов с ALS на ранних стадиях, и не наблюдалось терапевтической пользы для пациентов с ALS на поздних стадиях, что указывает на недостаток возможных методов лечения для пациентов (Bensimon G et al., J Neurol. 2002, 249, 609-615). Таким образом, все еще востребована новая стратегия лечения, которая может эффективно предупреждать развитие заболевания.

Изучаются много разных стратегий для возможного лечения как спорадического, так и семейного ALS. Одна стратегия основывается на нейропротекторном и/или регенеративном эффекте нейротрофических факторов, таких как инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), коливелин и пептид, полученный из зависимого от активности нейротрофического фактора (ADNF), которые могут способствовать выживанию нейронов. Несколько исследований продемонстрировали, что нейротрофические факторы могут сохранять функциональность двигательных нейронов, тем самым улучшая двигательную активность у трансгенных по SOD1 мышей. Тем не менее, такое лечение часто оказывается неспособно продлить жизнь SOD1 мышей, что указывает на то, что нейротрофические факторы являются недостаточными для продления срока жизни нейронов (см. обзор за авторством Yacila and Sari, Curr Med Chem., 2014, 21(31), 3583-3593).

Другая стратегия для лечения ALS фокусировалась на терапии, основанной на стволовых клетках. Стволовые клетки имеют потенциал к образованию двигательных нейронов, тем самым заменяя дегенерирующие двигательные нейроны в пораженной ALS ЦНС (центральная нервная система), как например, в первичной двигательной коре, стволе головного мозга и спинном мозге. Исследовались стволовые клетки, полученные из многих источников, в том числе индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), мезенхимальные стромальные клетки (MSC) (например, мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (BMSC) и адипозные стволовые клетки (ASC)) и нервные стволовые клетки, происходящие из нервной ткани (например, фетальные спинномозговые нервные стволовые клетки (NSC), мультипотентные нервные клетки-предшественники (NPC)) (например, рассматриваемые в обзоре за авторством Kim C et al., Exp. Neurobiol., 2014, 23(3), 207-214).

Мутации в гене супероксиддисмутазы типа I (SOD1; Cu2+/Zn2+ супероксиддисмутаза типа I) являются наиболее распространенной причиной fALS, лежащей в основе приблизительно 20-30% всех случаев fALS. Недавние сообщения указывают на то, что мутации SOD1 также могут быть связаны приблизительно с 4% всех случаев sALS (Robberecht and Philip, Nat. Rev. Neurosci., 2013, 14, 248-264). Связанный с SOD1 fALS наиболее вероятно вызывается не потерей нормальной активности SOD1, а скорее приобретением токсической функции. Одна из гипотез для связанной с мутантным SOD1 токсичности при fALS предполагает, что аберрантный фермент SOD1 является причиной образования повреждающих свободных радикалов из малых молекул, таких как пероксинитрит или перекись водорода. Другие гипотезы для нейротоксичности мутантной SOD1 включают подавление активности протеасомы, повреждение митохондрий, нарушение процессинга РНК и образование внутриклеточных агрегатов. Аномальное накопление мутантных вариантов SOD1 и/или SOD1 дикого типа при ALS приводит к образованию нерастворимых фибриллярных агрегатов, которые идентифицируют как патологические включения. Агрегированный белок SOD1 может индуцировать митохондриальный стресс (Vehvilainen P et al., Front Cell Neurosci., 2014, 8, 126) и оказывать другие токсические эффекты в отношении клеток, в особенности, в отношении двигательных нейронов.

Эти данные указывают на то, что SOD1 может быть потенциальной терапевтической мишенью как в случае семейного, так и спорадического ALS. Терапия, которая может снизить количество белка SOD1, образующегося в центральной нервной системе пациентов с ALS, может ослабить симптомы ALS у пациентов, такие как дегенерация двигательных нейронов, а также мышечная слабость и атрофия. Средства и способы, целью которых является предупреждение образования агрегатов белка SOD1 дикого типа и/или мутантного белка SOD1, могут предупреждать развитие заболевания и обеспечивать ослабление симптомов ALS. Опосредованный РНК-интерференцией (RNAi) сайленсинг гена в последние годы привлек интерес исследователей. Молекулы малых двухцепочечных РНК (малых интерферирующих РНК), которые нацелены на ген SOD1, упоминались в уровне техники в отношении их потенциала в лечении ALS (см., например, патент США № 7632938 и публикацию патента США № 20060229268, содержание которых включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

Настоящим изобретением разработан подход на основе РНК-интерференции к ингибированию или предотвращению экспрессии SOD1 у пациентов с ALS для лечения заболевания.

Настоящим изобретением предусматриваются новые двухцепочечные РНК (dsRNA) конструкции и siRNA конструкции и способы их конструирования. Кроме того, эти новые siRNA конструкции могут представлять собой синтетические молекулы или могут быть закодированы в векторе экспрессии (одной или обеих цепях) для доставки в клетки. Такие векторы включают, без ограничения, векторы на основе аденоассоциированного вируса, такие как векторные геномы любого из серотипов AAV или другие средства доставки на основе вирусов, такие как лентивирус и т.д.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к опосредованному молекулой РНК ген-специфическому препятствованию экспрессии гена и продукции белка. Способы лечения заболеваний, связанных с дегенерацией двигательных нейронов, таких как боковой амиотрофический склероз, также включены в настоящее изобретение. siRNA, включенные в композиции, охарактеризованные в данном документе, охватывают dsRNA, имеющую антисмысловую цепь (определенную антисмысловую цепь) с участком, имеющим длину 30 нуклеотидов или менее, обычно 19-24 нуклеотидов, который практически комплементарен по меньшей мере части мРНК транскрипта гена SOD1.

Настоящим изобретением предусматриваются молекулы коротких двухцепочечных РНК, такие как дуплексы малых интерферирующих РНК (siRNA), которые целенаправленно воздействуют на мРНК SOD1, препятствуя экспрессии гена SOD1 и/или продукции белка SOD1. Дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению могут препятствовать обоим аллелям гена SOD1 независимо от какой бы то ни было конкретной мутации в гене SOD1 и, в частности, могут взаимодействовать с генами SOD1, обнаруживающимися при заболевании ALS.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления такие молекулы siRNA или одну цепь молекул siRNA внедряют в векторы на основе аденоассоциированного вируса, подлежащие введению в клетки, в частности, двигательные нейроны и/или другие окружающие клетки в центральной нервной системе.

Дуплекс siRNA согласно настоящему изобретению содержит антисмысловую цепь и смысловую цепь, гибридизированные друг с другом с образованием дуплексной структуры, в которой антисмысловая цепь комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты подвергающегося целенаправленному воздействию гена SOD1, и в которой смысловая цепь гомологична последовательности нуклеиновой кислоты подвергающегося целенаправленному воздействию гена SOD1. В некоторых аспектах 5ʹ-конец антисмысловой цепи имеет 5ʹ-фосфатную группу, и 3ʹ-конец смысловой цепи содержит 3ʹ-гидроксильную группу. В других аспектах на 3ʹ-конце каждой цепи не присутствуют выступающие концы или присутствуют выступающие концы из одного или 2 нуклеотидов.

Согласно настоящему изобретению каждая цепь дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, имеет длину приблизительно 19-25 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 21 нуклеотид, 22 нуклеотида, 23 нуклеотида, 24 нуклеотида или 25 нуклеотидов. В некоторых аспектах siRNA могут представлять собой немодифицированные молекулы РНК.

В других аспектах siRNA могут содержать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, как например, с модификацией основания, сахара или остова.

В соответствии с одним вариантом осуществления siRNA или dsRNA включает в себя по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. dsRNA включает в себя смысловую цепь, имеющую первую последовательность, и антисмысловую цепь, имеющую вторую последовательность. Антисмысловая цепь включает в себя нуклеотидную последовательность, которая практически комплементарна по меньшей мере части мРНК, кодирующей SOD1, и участок с комплементарностью имеет длину 30 нуклеотидов или менее и по меньшей мере 15 нуклеотидов. В целом, dsRNA имеет длину 19-24, например, 19-21 нуклеотид. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления dsRNA имеет длину от приблизительно 15 до приблизительно 25 нуклеотидов, и в соответствии с другими вариантами осуществления dsRNA имеет длину от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов.

dsRNA либо после контакта с клеткой, экспрессирующей SOD1, либо после транскрипции в клетке, экспрессирующей SOD1, ингибирует или подавляет экспрессию гена SOD1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35% или по меньшей мере на 40% или более, как например, при анализе с помощью способа, который описан в данном документе.

Согласно настоящему изобретению получают AAV-векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие дуплексы siRNA, одну цепь дуплекса siRNA или dsRNA, нацеленные на ген SOD1, при этом серотип AAV-вектора может представлять собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 и/или AAV-DJ, а также их варианты.

Согласно настоящему изобретению дуплексы siRNA или dsRNA, целенаправленно воздействующие на ген SOD1 при ALS, выбраны из дуплексов siRNA, перечисленных в таблице 3, 11 или 13. Предпочтительно, дуплексы siRNA или dsRNA, целенаправленно воздействующие на ген SOD1 при ALS, выбраны из группы, состоящей из дуплексов siRNA: D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 и D-2858.

Настоящим изобретением также предусматриваются фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один дуплекс siRNA, нацеленный на ген SOD1, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую дуплекс siRNA, внедряют в AAV-вектор.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы ингибирования/сайленсинга экспрессии гена SOD1 в клетке. Соответственно, дуплексы siRNA или dsRNA можно применять для значительного ингибирования экспрессии гена SOD1 в клетке, в частности, в двигательном нейроне. В некоторых аспектах ингибирование экспрессии гена SOD1 относится к ингибированию по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100%. Соответственно, белковый продукт подвергающегося целенаправленному воздействию гена может ингибироваться по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100%. Ген SOD1 может представлять собой либо ген дикого типа, либо мутантный ген SOD1 по меньшей мере с одной мутацией. Соответственно, белок SOD1 представляет собой либо белок дикого типа, либо мутантный полипептид по меньшей мере с одной мутацией.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы лечения или ослабления бокового амиотрофического склероза, ассоциированного с аномальным геном SOD1 и/или белком SOD1, у субъекта, нуждающегося в лечении, причем способ предусматривает введение субъекту фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, доставку указанного дуплекса siRNA в подвергающиеся целенаправленному воздействию клетки, ингибирование экспрессии гена SOD1 и продукции белка SOD1 и ослабление симптомов ALS у субъекта.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один дуплекс siRNA, нацеленный на ген SOD1, вводят субъекту, нуждающемуся в лечении и/или ослаблении ALS. Серотип AAV-вектора можно выбрать из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10 и AAV-DJ, а также их вариантов.

В некоторых аспектах ALS представляет собой семейный ALS, связанный с мутациями SOD1. В других аспектах ALS представляет собой спорадический ALS, который характеризуется аномальной агрегацией белка SOD1 или нарушением функции или локализации белка SOD1, при этом не обязательно в результате генетической мутации. Симптомы ALS, ослабляемые с помощью настоящего способа, могут включать денегерацию двигательных нейронов, мышечную слабость, ригидность мышц, невнятную речь и /или затрудненное дыхание.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA или dsRNA, нацеленные на ген SOD1, или AAV-векторы, содержащие такие кодирующие siRNA молекулы, можно вводить непосредственно в центральную нервную систему субъекта, например, с помощью внутричерепной инъекции.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве одиночной терапии. В соответствии с другими вариантами осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в комплексной терапии. Комплексная терапия может осуществляться в сочетании с одним или более нейропротекторными средствами, такими как соединения-малые молекулы, факторы роста и гормоны, которые были исследованы в том, что касается их нейропротекторного эффекта в отношении дегенерации двигательных нейронов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы лечения или ослабления бокового амиотрофического склероза посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества плазмиды или AAV-вектора, описанных в данном документе. ALS может представлять собой семейный ALS или спорадический ALS.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Вышеизложенные и другие цели, признаки и преимущества будут понятны из следующего описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, которые иллюстрируются в сопутствующих графических материалах, в которых аналогичные условные обозначения относятся к одним и тем же частям на разных видах. Графические материалы не обязательно сведены к определенному масштабу, вместо этого акцент сделан на иллюстрацию принципов различных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Фиг. 1 представляет собой гистограмму, показывающую активность конструкций, закодированных в AAV-векторе.

Фиг. 2 представляет собой гистограмму, показывающую активность направляющей цепи модулирующих полинуклеотидов, закодированных в AAV-векторе, в HEK293T клетках.

Фиг. 3 представляет собой гистограмму, показывающую активность сопровождающей цепи модулирующих полинуклеотидов, закодированных в AAV-векторе, в HEK293T клетках.

Фиг. 4 представляет собой гистограмму, показывающую активность направляющей цепи модулирующих полинуклеотидов, закодированных в AAV-векторе, в HeLa клетках.

Фиг. 5 представляет собой гистограмму, показывающую активность сопровождающей цепи модулирующих полинуклеотидов, закодированных в AAV-векторе, в HeLa клетках.

Фиг. 6 представляет собой гистограмму для ДНК внутриклеточного AAV.

Фиг. 7 представляет собой гистограмму, показывающую активность конструкций, закодированных в AAV-векторе в двигательных нейронах человека.

Фиг. 8 представляет собой график, показывающий дозозависимый сайленсинг SOD1 в U251MG клетках.

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий дозозависимый сайленсинг SOD1 в клетках астроцитов человека.

Фиг. 10 представляет собой график, показывающий длительность сайленсинга SOD1 в U251MG клетках.

Фиг. 11 содержит фиг. 11A, 11B и 11C, которые представляют собой графики, показывающие дозозависимые эффекты конструкции. Фиг. 11A показывает относительную экспрессию SOD1. Фиг. 11B показывает процент направляющей цепи. Фиг. 11C показывает процент сопровождающей цепи.

Фиг. 12 представляет собой диаграмму, показывающую положение модулирующего полинуклеотида (MP) по отношению к ITR, интрону (I) и полиA (P).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к модулирующим полинуклеотидам, например, молекулам РНК или ДНК, в качестве терапевтических средств. Опосредованный РНК-интерференцией сайленсинг гена может специфически ингибировать экспрессию гена, подвергающегося целенаправленному воздействию. Таким образом, настоящим изобретением предусматриваются молекулы малой двухцепочечной РНК (dsRNA) (малой интерферирующей РНК, siRNA), нацеленные на ген SOD1, фармацевтические композиции, содержащие такие siRNA, а также способы их конструирования. Настоящим изобретением также предусматриваются способы их применения для ингибирования экспрессии гена SOD1 и продукции белка SOD1 для лечения нейродегенеративного заболевания, в частности, бокового амиотрофического склероза (ALS).

Настоящим изобретением предусматриваются дуплексы малых интерферирующих РНК (siRNA) (и модулирующих полинуклеотидов, кодирующих их), которые целенаправленно воздействуют на мРНК SOD1, препятствуя экспрессии гена SOD1 и/или продукции белка SOD1. Дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению могут препятствовать обоим аллелям гена SOD1 независимо от какой бы то ни было конкретной мутации в гене SOD1 и, в частности, могут взаимодействовать с генами SOD1, обнаруживающимися при заболевании ALS.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую такие молекулы siRNA или одну цепь молекул siRNA, внедряют в векторы на основе аденоассоциированного вируса и вводят в клетки, в частности, двигательные нейроны и/или другие окружающие клетки в центральной нервной системе.

Кодируемый дуплекс siRNA согласно настоящему изобретению содержит антисмысловую цепь и смысловую цепь, гибридизированные друг с другом с образованием дуплексной структуры, в которой антисмысловая цепь комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты подвергающегося целенаправленному воздействию гена SOD1, и в которой смысловая цепь гомологична последовательности нуклеиновой кислоты подвергающегося целенаправленному воздействию гена SOD1. В некоторых аспектах 5ʹ-конец антисмысловой цепи имеет 5ʹ-фосфатную группу, и 3ʹ-конец смысловой цепи содержит 3ʹ-гидроксильную группу. В других аспектах на 3ʹ-конце каждой цепи не присутствуют выступающие концы или присутствуют выступающие концы из одного или 2 нуклеотидов.

Согласно настоящему изобретению каждая цепь дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, имеет длину приблизительно 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид, предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов, 20 нуклеотидов, 21 нуклеотид, 22 нуклеотида, 23 нуклеотида, 24 нуклеотида или 25 нуклеотидов. В некоторых аспектах siRNA могут представлять собой немодифицированные молекулы РНК.

В других аспектах siRNA могут содержать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, как например, с модификацией основания, сахара или остова.

В соответствии с одним вариантом осуществления siRNA или dsRNA включает в себя по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. dsRNA включает в себя смысловую цепь, имеющую первую последовательность, и антисмысловую цепь, имеющую вторую последовательность. Антисмысловая цепь включает в себя нуклеотидную последовательность, которая практически комплементарна по меньшей мере части мРНК, кодирующей SOD1, и участок с комплементарностью имеет длину 30 нуклеотидов или менее и по меньшей мере 15 нуклеотидов. В целом, dsRNA имеет длину 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления dsRNA имеет длину от приблизительно 15 до приблизительно 25 нуклеотидов, и в соответствии с другими вариантами осуществления dsRNA имеет длину от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов.

dsRNA, или непосредственно введенная, или закодированная в векторе экспрессии, после контакта с клеткой, экспрессирующей SOD1, ингибирует экспрессию SOD1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35% или по меньшей мере на 40% или более, как например, при анализе с помощью способа, который описан в данном документе.

Молекулы siRNA, включенные в композиции, охарактеризованные в данном документе, содержат dsRNA, имеющую антисмысловую цепь (антисмысловая цепь) с участком, имеющим длину 30 нуклеотидов или менее, обычно 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид, который практически комплементарен по меньшей мере части мРНК транскрипта гена SOD1.

В соответствии с настоящим изобретением получают AAV-векторы, содержащие нуклеиновые кислоты дуплексов siRNA, одну цепь дуплекса siRNA или dsRNA, нацеленные на ген SOD1, причем серотипы AAV-вектора могут представлять собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 и AAV-DJ, а также их варианты.

Согласно настоящему изобретению дуплексы siRNA или кодируемые dsRNA, целенаправленно воздействующие на ген SOD1 при ALS, выбраны из дуплексов siRNA, перечисленных в таблице 3. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA или dsRNA, целенаправленно воздействующие на ген SOD1 при ALS, выбраны из группы, состоящей из дуплексов siRNA: D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 и D-2858.

Настоящим изобретением также предусматриваются фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один дуплекс siRNA, нацеленный на ген SOD1, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых аспектах дуплекс siRNA кодируется AAV-вектором.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы ингибирования/сайленсинга экспрессии гена SOD1 в клетке. Соответственно, дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для значительного ингибирования экспрессии гена SOD1 в клетке, в частности, в двигательном нейроне. В некоторых аспектах ингибирование экспрессии гена SOD1 относится к ингибированию по меньшей мере приблизительно на 20%, как например, по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. Соответственно, белок-продукт подвергающегося целенаправленному воздействию гена может ингибироваться по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. Ген SOD1 может представлять собой либо ген дикого типа, либо мутантный ген SOD1 по меньшей мере с одной мутацией. Соответственно, белок SOD1 представляет собой либо белок дикого типа, либо мутантный полипептид по меньшей мере с одной мутацией.

В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для снижения экспрессии белка SOD1 по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. В качестве неограничивающего примера экспрессия белка SOD1 может быть снижена на 50-90%.

В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для снижения экспрессии мРНК SOD1 по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. В качестве неограничивающего примера экспрессия мРНК SOD1 может быть снижена на 50-90%.

В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для снижения экспрессии белка и/или мРНК SOD1 по меньшей мере в одной области ЦНС, такой как, без ограничения, спинной мозг, передний мозг, средний мозг или задний мозг. Экспрессия белка и/или мРНК SOD1 снижается по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100% по меньшей мере в одной области ЦНС. В качестве неограничивающего примера экспрессия белка и мРНК SOD1 в спинном мозге может быть снижена на 50-90%.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы лечения или ослабления бокового амиотрофического склероза, ассоциированного с аномальным геном SOD1 и/или белком SOD1, у субъекта, нуждающегося в лечении, причем способ предусматривает введение субъекту фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного дуплекса siRNA или нуклеиновой кислоты, кодирующей дуплекс siRNA, нацеленных на ген SOD1, доставку указанного дуплекса (или кодируемого дуплекса) siRNA в подвергающиеся целенаправленному воздействию клетки, ингибирование экспрессии гена SOD1 и продукции белка SOD1 и ослабление симптомов ALS у субъекта.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по меньшей мере одного дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, вводят субъекту, нуждающемуся в лечении и/или ослаблении ALS. Серотип AAV-вектора можно выбрать из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 (AAVDJ8) и AAV-DJ (AAVDJ), а также их вариантов. В соответствии с одним вариантом осуществления серотип AAV-вектора представляет собой AAV2. В соответствии с другим вариантом осуществления AAV-вектор представляет собой AAVDJ. В соответствии с еще одним вариантом осуществления серотип AAV-вектора представляет собой AAVDJ8.

В соответствии с одним вариантом осуществления серотип, который может быть пригодным в настоящем изобретении, может представлять собой AAV-DJ8. Аминокислотная последовательность AAV-DJ8 может содержать две или более мутации с целью удаления гепарин-связывающего домена (HBD). В качестве неограничивающего примера последовательность AAV-DJ, описанная как SEQ ID NO: 1 в патенте США № 7588772, содержание которого включено в данный документ в его полноте посредством ссылки, могут содержать две мутации: (1) R587Q, где аргинин (R; arg) в положении аминокислоты 587 заменен на глутамин (Q; Gln), и (2) R590T, где аргинин (R; Arg) в положении аминокислоты 590 заменен на треонин (T; Thr). В качестве другого неограничивающего примера может содержать три мутации: (1) K406R, где лизин (K; Lys) в положении аминокислоты 406 заменен на аргинин (R; Arg), (2) R587Q, где аргинин (R; Arg) в положении аминокислоты 587 заменен на глутамин (Q; Gln), и (3) R590T, где аргинин (R; Arg) в положении аминокислоты 590 заменен на треонин (T; Thr).

В некоторых аспектах ALS представляет собой семейный ALS, связанный с мутациями SOD1. В других аспектах ALS представляет собой спорадический ALS, который характеризуется аномальной агрегацией белка SOD1 или отклонением в функционировании и локализации белка SOD1. Симптомы ALS, ослабляемые с помощью настоящего способа, могут включать, без ограничения, денегерацию двигательных нейронов, мышечную слабость, ригидность мышц, невнятную речь и /или затрудненное дыхание.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA, нацеленные на ген SOD1, или AAV-векторы, содержащие такие молекулы siRNA, можно вводить непосредственно в центральную нервную систему субъекта, например, с помощью внутричерепной инъекции.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве одиночной терапии. В соответствии с другими вариантами осуществления фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в комплексной терапии. Комплексная терапия может осуществляться в сочетании с одним или более нейропротекторными средствами, такими как соединения-малые молекулы, факторы роста и гормоны, которые были исследованы в том, что касается их нейропротекторного эффекта в отношении дегенерации двигательных нейронов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящим изобретением предусматриваются способы лечения или ослабления бокового амиотрофического склероза посредством введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества плазмиды или AAV-вектора, описанных в данном документе. ALS может представлять собой семейный ALS или спорадический ALS.

Подробности одного один или более вариантов осуществления настоящего изобретения изложены в сопутствующем описании ниже. Несмотря на то что любые материалы и способы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, можно применять на практике или при исследовании настоящего изобретения, ниже описаны предпочтительные материалы и способы. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут понятны из описания. В описании формы единственного числа также включают множественное число, если контекст явно не предписывает иное. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно среднему специалисту в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. В случае конфликта настоящее описание будет иметь преимущество.

Боковой амиотрофический склероз (ALS)

Боковой амиотрофический склероз (ALS), нейродегенеративное нарушение, проявляющееся во взрослом возрасте, представляет собой прогрессирующее и смертельное заболевание, характеризующееся избирательной гибелью двигательных нейронов в двигательной коре, стволе головного мозга и спинном мозге. Заболеваемость ALS составляет приблизительно 1,9 на 100000. У пациентов, которым был поставлен диагноз ALS, развивается прогрессирующий мышечный фенотип, характеризующийся спастичностью, гиперрефлексией или гипорефлексией, фасцикуляциями, мышечной атрофией и параличем. Эти нарушения двигательных функций вызваны денервацией мышц вследствие потери двигательных нейронов. Основные признаки патологии ALS включают дегенерацию корково-спинномозговых путей и значительную потерю периферических двигательных нейронов (LMN) или клеток передних рогов спинного мозга (Ghatak et al., J Neuropathol Exp Neurol., 1986, 45, 385-395), дегенерацию и потерю клеток Беца и других пирамидальных клеток в первичной двигательной коре (Udaka et al., Acta Neuropathol, 1986, 70, 289-295; Maekawa et al., Brain, 2004, 127, 1237-1251) и реактивный глиоз в двигательной коре и спинном мозге (Kawamata et al., Am J Pathol., 1992, 140,691-707; и Schiffer et al., J Neurol Sci., 1996, 139, 27-33). ALS обычно приводит к смертельному исходу в течение 3-5 лет после диагностирования вследствие дефектов дыхания и/или воспаления (Rowland LP and Shneibder NA, N Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700).

Отличительным признаком ALS на клеточном уровне является присутствие белковых убиквитинированных цитоплазматических включений в дегенерирующих двигательных нейронах и окружающих клетках (например, астроцитах). Убиквитинированные включения (т.е. включения, подобные тельцам Леви, или клубкообразные включения) являются наиболее распространенным и специфическим типом включений при ALS и обнаруживаются в LMN спинного мозга и ствола головного мозга, а также в корково-спинномозговых центральных двигательных нейронах (UMN) (Matsumoto et al., J Neurol Sci., 1993, 115, 208-213; и Sasak and Maruyama, Acta Neuropathol., 1994, 87, 578-585). Несколько белков были идентифицированы как компоненты включений, в том числе убиквитин, Cu/Zn супероксиддисмутаза 1 (SOD1), периферин и дорфин. Нейрофиламентные включения часто обнаруживаются во включениях в виде гиалиновых конгломератов (HCI) и аксональных «сфероидах» в двигательных нейронах спинного мозга при ALS. Другие типы и менее специфические включения включают тельца Бунина (цистатин C-содержащие включения) и серповидные включения (SCI) в верхних слоях коры головного мозга. Другие невропатологические признаки, наблюдаемые при ALS, включают фрагментацию аппарата Гольджи, вакуолизацию митохондрий и аномалии ультраструктуры синаптических окончаний (Fujita et al., Acta Neuropathol. 2002, 103, 243-247).

Кроме того, при ALS с лобно-височной деменцией (FTD-ALS) также наблюдается атрофия коры головного мозга (включающая лобные и височные доли), которая может вызвать нарушение когнитивных функций у пациентов с FTD-ALS.

ALS является сложным и многофакторным заболеванием, и несколько гипотетических механизмов, ответственных за патогенез ALS, включают, без ограничения, дисфункцию разрушения белка, эксайтотоксичность глутамата, митохондриальную дисфунцию, апоптоз, окислительный стресс, воспаление, неправильное сворачивание и агрегацию белков, аберрантный метаболизм РНК и измененную экспрессию генов.

Приблизительно 10-15% случаев ALS имеют семейный анамнез заболевания, и этих пациентов называют пациентами с семейным ALS (fALS) или пациентами с наследственным ALS, обычно с доминантным типом менделевского наследования и высокой пенетрантностью. Остальную часть (примерно 85%-95%) классифицируют как спорадический ALS (sALS), поскольку они не связаны с документально подтвержденным семейным анамнезом, а скорее, как полагают, обусловлены другими факторами риска, включающими, без ограничения, факторы окружающей среды, генетические полиморфизмы, соматические мутации и, возможно, взаимодействия генов и окружающей среды. В большинстве случаев семейный (или наследственный) ALS наследуется как аутосомно-доминантное заболевание, но существуют генеалогические схемы с аутосомно-рецессивным и X-сцепленным наследованием, а также неполной пенетрантностью. Спорадическая и семейная формы являются клинически неразличимыми, что говорит об общем патогенезе. Точная причина избирательной гибели двигательных нейронов при ALS остается неясной. Прогресс в понимании генетических факторов при fALS может пролить свет на обе формы заболевания.

В последнее время бурное развитие изучения генетических причин ALS обнаружило мутации в более чем 10 разных генах, которые, как стало известно, вызывают fALS. Наиболее часто встречающиеся мутации находятся в генах, кодирующих Cu/Zn супероксиддисмутазу 1 (SOD1; ~ 20%) (Rosen DR et al., Nature, 1993, 362, 59-62), белок, подвергающийся слиянию при саркоме/транслируемый в липосаркоме (FUS/TLS; 1-5%), и TDP-43 (TARDBP; 1-5%). Недавно распространение гексануклеотидного повтора (GGGGCC)n в гене C9orF72 идентифицировали как наиболее частую причину fALS (~ 40%) у населения на Западе (в обзоре за авторством Renton et al., Nat. Neurosci., 2014, 17, 17-23). Другие гены, подверженные мутации при ALS включают в себя ген алсина (ALS2), сенатаксина (SETX), везикуло-ассоциированного мембранного белка (VAPB) и ангиогенина (ANG). Задействованные в fALS гены контролируют различные клеточные механизмы, что говорит о том, что патогенез ALS является сложным и может быть связан с несколькими различными процессами, в конечном итоге приводящими к дегенерации двигательных нейронов.

SOD1 является одной из трех супероксиддисмутаз человека, идентифицированных и охарактеризованных у млекопитающих: медь-цинковая супероксиддисмутаза (Cu/ZnSOD или SOD1), марганцевая супероксиддисмутаза (MnSOD или SOD2) и внеклеточная супероксиддисмутаза (ECSOD или SOD3). SOD1 представляет собой 32 кДа гомодимер полипептида из 153 остатков с одним медь-связывающим и одним цинк-связывающим сайтом на субъединицу, который кодируется геном SOD1 (номер доступа в GeneBank: NM_000454.4) на хромосоме 21 человека (см. таблицу 2). SOD1 катализирует реакцию супероксид-аниона (O2-) в молекулярный кислород (O2) и перекись водорода (H2O2) при связанном ионе меди. Внутриклеточная концентрация SOD1 является высокой (в диапазоне от 10 до 100 мкМ), составляя 1% от общего содержания белка в центральной нервной системе (ЦНС). Белок локализуется не только в цитоплазме, но также в ядре, лизосомах, пероксисомах и межмембранных пространствах митоходрий в эукариотических клетках (Lindenau J et al., Glia, 2000, 29, 25-34).

Мутации в гене SOD1 несут 15-20% пациентов с fALS и 1-2% всех случаев ALS. К настоящему времени было обнаружено по меньшей мере 170 различных мутаций, распределенных по 153-аминокислотному полипептиду SOD1, которые вызывают ALS, и дополненный перечень можно найти в базе данных ALS online Genetic Database (ALSOD) (Wroe R et al., Amyotroph Lateral Scler., 2008, 9, 249-250). В таблице 1 приведены некоторые примеры мутаций в SOD1 при ALS. Эти мутации преимущественно представляют собой замены одной аминокислоты (т.е. миссенс-мутации), хотя также встречаются делеции, вставки и C-концевые усечения. Различные мутации SOD1 проявляют различный характер географического распределения. Например, 40-50% всех американцев с ALS, вызванным мутациями в гене SOD1, имеют конкретную мутацию Ala4Val (или A4V). Мутация A4V, как правило, ассоциирована с более тяжелыми признаками и симптомами, и период дожития, как правило, составляет 2-3 года. Мутация I113T, однозначно, является наиболее распространенной мутацией в Великобритании. Наиболее распространенной мутацией в Европе является замена D90A, и период дожития обычно составляет более 10 лет.

Таблица 1. Примеры мутаций SOD1 при ALS

Для изучения механизма гибели нейронов, связанной с дефектами гена SOD1, в данной области было разработано несколько моделей ALS, связанного с SOD1, на грызунах, у которых экспрессировался человеческий ген SOD1 с различными мутациями, в том числе миссенс-мутации, небольшие делеции или вставки. Неограничивающие примеры мышиных моделей ALS включают SOD1G93A, SOD1A4V, SOD1G37R, SOD1G85R, SOD1D90A, SOD1L84V, SOD1I113T, SOD1H36R/H48Q, SOD1G127X, SOD1L126X и SOD1L126delTT. Существует две модели на основе трансгенных крыс, несущих две разные мутации SOD1 человека: SOD1H46R и SOD1G93R. В этих моделях ALS на грызунах может развиваться мышечная слабость, аналогичная таковой у пациентов-людей с ALS, а также другие патогенетические признаки, которые отражают несколько характеристик заболевания у человека, в частности, избирательная гибель двигательных нейронов спинного мозга, агрегация белковых включений в двигательных нейронах и микроглиальная активация. Из уровня техники хорошо известно, что трансгенные грызуны являются хорошими моделями ассоциированного с SOD1 заболевания ALS человека и обеспечивают модели для изучения патогенеза заболевания и разработки лечения заболевания.

Исследования в моделях на животных и клеточных моделях показали, что патогенные варианты SOD1 вызывают ALS за счет приобретения функции. Иными словами, фермент супероксиддисмутаза приобретает новые, но вредные свойства, когда он изменяется при мутациях SOD1. Например, некоторые мутантные варианты SOD1 при ALS повышают окислительный стресс (например, повышенное накопление токсичных супероксидных радикалов) за счет нарушения окислительно-восстановительного цикла. Другие исследования также указывают на то, что некоторые мутантные варианты SOD1 при ALS могут приобретать токсические свойства, которые не зависят от его нормальной физиологической функции (такие как аномальная агрегация неправильно свернутых вариантов SOD1). В модели с аберрантными окислительно-восстановительными химическими свойствами мутантная SOD1 нестабильна и вследствие аберрантных химических свойств взаимодействует с нетрадиционными субстратами, вызывая избыточную продукцию активных форм кислорода (ROS). В модели с токсичностью белка нестабильная, неправильно свернутая SOD1 агрегирует в цитоплазматические тельца включения, изолируя белки, критически важные для клеточных процессов. Эти две гипотезы не являются взаимоисключающими. Было показано, что окисление выбранных гистидиновых остатков, которые связывают металлы в активном центре, опосредует агрегацию SOD1.

Агрегированный мутантный белок SOD1 также может индуцировать митохондриальную дисфункцию (Vehvilainen P et al., Front Cell Neurosci., 2014, 8, 126), нарушение аксонального транспорта, аберрантный метаболизм РНК, патологию глиальных клеток и эксайтотоксичность глутамата. В некоторых случаях спорадического ALS неправильно свернутый белок SOD1 дикого типа обнаруживается в пораженных заболеванием двигательных нейронах, образуя «токсическую конформацию», которая аналогична наблюдаемой с вариантами SOD1, связанными с семейным ALS (Rotunno MS and Bosco DA, Front Cell Neurosci., 2013, 16, 7, 253). Такие данные говорят о том, что ALS представляет собой заболевание, связанное со сворачиванием белка, которое аналогично другим нейродегенеративным заболеваниям, таким как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

В настоящее время средства для радикального лечения не доступны пациентам, страдающим от ALS. Единственное одобренное FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) лекарственное средство - рилузол, ингибитор высвобождения глутамата, оказывает умеренный эффект в отношении ALS, продлевая жизнь лишь на 2-3 месяца при его приеме в течение 18 месяцев. К сожалению, пациенты, принимающие рилузол, не испытывают какого-либо замедления прогрессирования заболевания или улучшения функционирования мышц. Следовательно, рилузол не является средством для излечения или даже эффективным средством лечения. Исследователи продолжают поиск лучших терапевтических средств.

Ранее исследовались терапевтические подходы, которые могут предупреждать или ослаблять агрегацию SOD1. Например, аримокломол, гидроксиламинное производное, представляет собой лекарственное средство, которое целенаправленно воздействует на белки теплового шока, которые представляют собой защитные механизмы клеток от этих агрегатов. Исследования продемонстрировали, что лечение аримокломолом улучшает функционирование мышц в мышиных моделях SOD1. Другие лекарственные средства, которые целенаправленно воздействуют на один или более клеточных дефектов при ALS, могут включать антагонисты AMPA, такие как талампанел, бета-лактамные антибиотики, которые могут снижать индуцируемую глутаматом эксайтотоксичность в отношении двигательных нейронов; бромокриптин, который может ингибировать индуцируемую окислением гибель двигательных нейронов (например, публикация заявки на патент США № 20110105517; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки); производное 1,3-дифенилмочевины или мультикиназный ингибитор, которые могут снижать экспрессию гена SOD1 (например, публикация заявки на патент США № 20130225642; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки); дофаминовый агонист прамипексол и его энантиомер декспрамипексол, которые могут ослаблять окислительный ответ в митохондриях; нимесулид, который ингибирует фермент циклооксигеназу (например, публикация заявки на патент США № 20060041022; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки); лекарственные средства, которые действуют как поглотители свободных радикалов (например, патент США № 6933310 и PCT публикация патентной заявки № WO2006075434; причем содержание каждого из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

Другим подходом к ингибированию аномальной агрегации белка SOD1 является сайленсинг/ингибирование экспрессии гена SOD1 при ALS. Сообщалось, что малые интерферирующие РНК для специфического сайленсинга мутантного аллеля гена являются благоприятными с терапевтической точки зрения для лечения fALS (например, Ralgh GS et al., Nat. Medicine, 2005, 11(4), 429-433; и Raoul C et al., Nat. Medicine, 2005, 11(4), 423-428; и Maxwell MM et al., PNAS, 2004, 101(9), 3178-3183; и Ding H et al., Chinese Medical J., 2011, 124(1), 106-110; и Scharz DS et al., Plos Genet., 2006, 2(9), e140; причем содержание каждого из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

В уровне техники сообщается о многих других терапевтических средствах на основе РНК, которые целенаправленно воздействуют на ген SOD1 и модулируют экспрессию SOD1 при ALS. Такие средства на основе РНК включают антисмысловые олигонуклеотиды и двухцепочечные малые интерферирующие РНК. См., например, Wang H et al., J Biol. Chem., 2008, 283(23), 15845-15852); патенты США №№ 7498316; 7632938; 7678895; 7951784; 7977314; 8183219; 8309533 и 8586554; и публикации заявок на патент США № 2006/0229268 и № 2011/0263680; причем содержание каждого из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

Настоящим изобретением предусматриваются модулирующие полинуклеотиды, например, молекулы siRNA, нацеленные на ген SOD1, и способы их конструирования и производства. В частности, в настоящем изобретении используются вирусные векторы, такие как векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению. AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, могут повышать доставку активных средств в двигательные нейроны. Дуплексы siRNA или кодирующие dsRNA, нацеленные на ген SOD1, могут быть способны значительно ингибировать экспрессию гена SOD1 (например, уровень мРНК) внутри клеток; тем самым ослабляя индуцируемый экспрессией SOD1 стресс внутри клеток, такой как агрегация белка и образование включений, повышенный уровень свободных радикалов, митохондриальная дисфункция и метаболизм РНК.

Такое опосредованное siRNA ингибирование экспрессии SOD1 можно использовать для лечения ALS. Согласно настоящему изобретению способы лечения и/или ослабления ALS у пациента предусматривают введение пациенту в клетки эффективного количества AAV-вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению. После введения AAV-вектора, содержащего такую последовательность нуклеиновой кислоты, эта последовательность будет кодировать молекулы siRNA, которые вызывают ингибирование/сайленсинг экспрессии гена SOD1.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV, кодирующий модулирующий полинуклеотид, снижают экспрессию мутантной SOD1 у субъекта. Снижение уровня мутантной SOD1 также может снижать образование токсичных агрегатов, которые могут являться причиной механизмов токсичности, таких как, без ограничения, окислительный стресс, митохондриальная дисфункция, нарушенный аксональный транспорт, аберрантный метаболизм РНК, патология глиальных клеток и/или эксайтотоксичность глутамата.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-векторы, снижают количество SOD1 у субъекта, нуждающегося в этом, и, следовательно, обеспечивает терапевтическую полезность, как описано в данном документе.

Композиции согласно настоящему изобретению

Молекулы siRNA

Настоящее изобретение относится к индуцируемому РНК-интерференцией (RNAi) ингибированию экспрессии гена для лечения нейродегенеративных нарушений. В данном документе представлены дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, которые нацелены на ген SOD1 (собирательно называются в данном документе «молекулами siRNA»). Такие дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA могут снижать или подвергать саленсингу экспрессию гена SOD1 в клетках, например, двигательных нейронах, тем самым ослабляя симптомы ALS, такие как, без ограничения, гибель двигательных нейронов и мышечная атрофия.

RNAi (также известная как посттранскрипционный сайленсинг гена (PTGS), подавление или косупрессия) представляет собой процесс посттранскрипционного сайленсинга гена, при котором молекулы РНК специфическим в отношении последовательности образом ингибируют экспрессию гена, как правило, вызывая разрушение специфических молекул мРНК. Активные компоненты RNAi представляют собой короткие/малые двухцепочечные РНК (dsRNA), называемые малыми интерферирующими РНК (siRNA), которые, как правило, содержат 15-30 нуклеотидов (например, 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид) и 3ʹ выступающие концы из 2 нуклеотидов и которые совпадают с последовательностью нуклеиновой кислоты целевого гена. Эти короткие молекулы РНК могут продуцироваться в естественных условиях in vivo путем опосредованного Dicer расщепления больших dsRNA, и они являются функциональными в клетках млекопитающих.

Экспрессируемые в естественных условиях молекулы малых РНК, называемые микроРНК (miRNA), вызывают сайленсинг гена посредством регуляции экспрессии мРНК. miRNA, содержащие РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), целенаправленно воздействуют на мРНК, у которых присутствует полная комплементарность последовательности с нуклеотидами 2-7 в 5ʹ-участке miRNA, который называется затравочным участком, и которые образуют другие пары оснований с ее 3ʹ-участком. Опосредованная miRNA понижающая регуляция экспрессии гена может быть вызвана расщеплением целевых мРНК, ингибированием трансляции целевых мРНК или разрушением мРНК. Последовательности, подвергающиеся целенаправленному воздействию miRNA, обычно расположены в 3ʹ-UTR целевых мРНК. Одна miRNA может целенаправленно воздействовать более чем на 100 транскриптов с различных генов, и одна мРНК может подвергаться целенаправленному воздействию различных miRNA.

Дуплексы siRNA или dsRNA, нацеленные на конкретную мРНК, можно сконструировать, синтезировать in vitro и вводить в клетки для активации процессов RNAi. Elbashir et al. продемонстрировали, что 21-нуклеотидные дуплексы siRNA (называемые малыми интерферирующими РНК) были способны обеспечивать сильный и специфический нокдаун гена без индукции иммунного ответа в клетках млекопитающих (Elbashir SM et al., Nature, 2001, 411, 494-498). Со времени того первоначального сообщения посттранскрипционный сайленсинг гена с помощью siRNA быстро стал мощным инструментом для генетического анализа в клетках млекопитающих, и у него есть потенциал для получения новых терапевтических средств.

Синтезированные in vitro молекулы siRNA можно вводить в клетки с целью активации RNAi. Экзогенный дуплекс siRNA при введении его в клетки подобно эндогенным dsRNA может собираться с образованием РНК-индуцированного комплекса сайленсинга (RISC), комплекса из нескольких единиц, который облегчает поиск в геноме последовательностей РНК, которые комплементарны одной из двух цепей дуплекса siRNA (т.е. антисмысловой цепи). В ходе процесса смысловая цепь (или сопровождающая цепь) siRNA уходит из комплекса, тогда как антисмысловая цепь (или направляющая цепь) siRNA спаривается с комплементарной ей РНК. В частности, мишенями содержащего siRNA комплекса RISC являются мРНК, у которых присутствует полная комплементарность последовательности. Затем происходит опосредованный siRNA сайленсинг гена, заключающийся в расщеплении, разъединении и разрушении мишени.

Дуплекс siRNA, состоящий из смысловой цепи, гомологичной целевой мРНК, и антисмысловой цепи, которая комплементарна целевой мРНК, обеспечивает намного большее преимущество с точки зрения эффективности разрушения целевой РНК по сравнению с применением одноцепоченых (ss)-siRNA (например, антисмысловая цепь РНК или антисмысловые олигонуклеотиды). Во многих случаях требуются более высокая концентрация ss-siRNA для достижения эффективной действенности сайленсинга гена соответствующего дуплекса.

Любая из вышеупомянутых молекул может кодироваться AAV-вектором или векторным геномом.

Конструирование и последовательности дуплексов siRNA, нацеленных на ген SOD1

В уровне техники были предложены некоторые указания по конструированию siRNA. Эти указания обычно рекомендуют создание 19-нуклеотидного дуплексного участка, симметричных 3ʹ выступающих концов из 2-3 нуклеотидов, 5-фосфатной и 3-гидроксильной групп, нацеленных на участок в гене, подлежащем сайленсингу. Другие правила, которые могут обуславливать преимущество последовательности siRNA, включают, без ограничения, (i) A/U на 5′-конце антисмысловой цепи; (ii) G/C на 5′-конце смысловой цепи; (iii) по меньшей мере пять A/U остатков в 5′-концевой трети антисмысловой цепи и (iv) отсутствие какого-либо GC отрезка длиной более 9 нуклеотидов. Руководствуясь такими принципами, а также специфической последовательностью целевого гена, можно легко сконструировать высокоэффективные молекулы siRNA, необходимые для подавления экспрессии целевого гена у млекопитающих.

Согласно настоящему изобретению молекулы siRNA (например, дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA), которые нацелены на ген SOD1 человека, являются сконструированными. Такие молекулы siRNA могут специфически подавлять экспрессию гена SOD1 и продукцию белка SOD1. В некоторых аспектах молекулы siRNA конструируют и применяют для избирательного «нокаута» вариантов гена SOD1 в клетках, т.е. мутантных транскриптов SOD1, которые идентифицируют у пациентов с заболеванием ALS (например, мутации в таблице 1). В некоторых аспектах молекулы siRNA конструируют и применяют для избирательного «нокдауна» вариантов гена SOD1 в клетках. В других аспектах молекулы siRNA способны ингибировать или подавлять как аллель дикого типа, так и мутантные аллели гена SOD1 независимо от каких-либо конкретных мутаций в гене SOD1.

В соответствии с одним вариантом осуществления молекула siRNA согласно настоящему изобретению содержит смысловую цепь и комплементарную антисмысловую цепь, причем обе цепи гибридизированы друг с другом с образованием дуплексной структуры. Антисмысловая цепь характеризуется достаточной комплементарностью с последовательностью мРНК SOD1 для непосредственной мишень-специфической RNAi, т.е. молекула siRNA имеет последовательность, достаточную для запуска разрушения целевой мРНК с помощью аппарата или процесса RNAi.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления последовательности антисмысловой цепи и целевой мРНК комплементарны на 100%. Антисмысловая цепь может быть комплементарна любой части последовательности целевой мРНК.

В соответствии с другими вариантами осуществления последовательности антисмысловой цепи и целевой мРНК содержат по меньшей мере одно несовпадение. В качестве неограничивающего примера, последовательность антисмысловой цепи и целевой мРНК комплементарны по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-99%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-99%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-99%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-99%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-99%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-99%, 80-90%, 80-95%, 80-99%, 90-95%, 90-99% или 95-99%.

Согласно настоящему изобретению молекула siRNA имеет длину приблизительно 10-50 или более нуклеотидов, т.е. каждая цепь содержит 10-50 нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов). Предпочтительно, молекула siRNA имеет длину приблизительно 15-30, например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов в каждой цепи, где одна из цепей является в значительной степени комплементарной целевому участку. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула siRNA имеет длину приблизительно 19-25, 19-24 или 19-21 нуклеотид.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы siRNA согласно настоящему изобретению могут представлять собой дуплексы синтетических РНК, содержащие от приблизительно 19 нуклеотидов до приблизительно 25 нуклеотидов и два нуклеотида в виде выступающего конца на 3'-конце. В некоторых аспектах молекулы siRNA могут представлять собой немодифицированные молекулы РНК. В других аспектах молекулы siRNA могут содержать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, как например, с модификациями основания, сахара или остова.

В соответствии с другими вариантами осуществления молекулы siRNA согласно настоящему изобретению могут быть закодированы в плазмидных векторах, вирусных векторах (например, AAV-векторах), векторах экспрессии на основе генома или другой нуклеиновой кислоты для доставки в клетку.

Экспрессионные плазмиды на основе ДНК можно применять для устойчивой экспрессии дуплексов siRNA или dsRNA согласно настоящему изобретению в клетках, а также для достижения длительного ингибирования целевого гена. В одном аспекте смысловая и антисмысловая цепи дуплекса siRNA, как правило, связаны короткой спейсерной последовательностью, приводящей к экспрессии структуры по типу стебель-петля, называемой короткой шпилечной РНК (shRNA). Шпилька распознается и расщепляется Dicer с образованием таким образом зрелых молекул siRNA.

Согласно настоящему изобретению получают AAV-векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулы siRNA, нацеленные на мРНК SOD1, причем серотипы AAV-вектора могут представлять собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 и AAV-DJ, а также их варианты.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA согласно настоящему изобретению подавляют (или разрушают) целевую мРНК (т.е. SOD1). Соответственно, дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA можно применять для значительного ингибирования экспрессии гена SOD1 в клетке, например, двигательном нейроне. В некоторых аспектах ингибирование экспрессии гена SOD1 относится к ингибированию по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. Соответственно, белок-продукт подвергающегося целенаправленному воздействию гена может ингибироваться по меньшей мере приблизительно на 20%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100%. Ген SOD1 может представлять собой либо ген дикого типа, либо мутантный ген SOD1 по меньшей мере с одной мутацией. Соответственно, белок представляет собой либо белок дикого типа, либо мутантный полипептид по меньшей мере с одной мутацией.

Согласно настоящему изобретению, дуплексы siRNA или кодируемую dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, конструировали и исследовали в отношении их способности к снижению уровней мРНК SOD1 в культивируемых клетках. Такие дуплексы siRNA включают приведенные в таблице 3. В качестве неограничивающего примера, дуплексы siRNA могут представлять собой дуплекс siRNA с идентификационными номерами (ID): D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 и D-2858.

В соответствии с одним вариантом осуществления 3ʹ-ветвь стебля дуплексов siRNA или кодируемой dsRNA, нацеленных на ген SOD1 человека, может иметь 11 нуклеотидов ниже 3ʹ-конца направляющей цепи, которые комплементарны 11 из 13 нуклеотидов выше 5ʹ-конца сопровождающей цепи в 5ʹ-ветви стебля.

В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь цистеин, который находится на 6 нуклеотидов ниже 3ʹ-конца 3ʹ-ветви стебля модулирующего полинуклеотида.

В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, содержат затравочный сегмент miRNA для направляющей цепи. В соответствии с другим вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, содержат затравочный сегмент miRNA для сопровождающей цепи. В соответствии с еще одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, не содержат затравочный сегмент для направляющей цепи или сопровождающей цепи.

В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут почти не иметь значительных нецелевых мишеней полной длины для направляющей цепи. В соответствии с другим вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь почти не иметь значительных нецелевых мишеней полной длины для сопровождающей цепи. Дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь менее 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1-5%, 2-6%, 3-7%, 4-8%, 5-9%, 5-10%, 6-10% нецелевых мишеней полной длины для сопровождающей цепи. В соответствии с еще одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут почти не иметь значительных нецелевых мишеней полной длины для направляющей цепи или сопровождающей цепи. Дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь менее 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1-5%, 2-6%, 3-7%, 4-8%, 5-9%, 5-10%, 6-10% нецелевых мишеней полной длины для направляющей цепи или сопровождающей цепи.

В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь высокую активность in vitro. В соответствии с другим вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь низкую активность in vitro. В соответствии с еще одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, могут иметь высокую активность направляющей цепи и низкую активность сопровождающей цепи in vitro.

В соответствии с одним вариантом осуществления дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, имеют высокую активность направляющей цепи и низкую активность сопровождающей цепи in vitro. Нокдаун (KD) мишени направляющей цепью может составлять по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99,5% или 100%. Нокдаун мишени направляющей цепью может составлять 60-65%, 60-70%, 60-75%, 60-80%, 60-85%, 60-90%, 60-95%, 60-99%, 60-99,5%, 60-100%, 65-70%, 65-75%, 65-80%, 65-85%, 65-90%, 65-95%, 65-99%, 65-99,5%, 65-100%, 70-75%, 70-80%, 70-85%, 70-90%, 70-95%, 70-99%, 70-99,5%, 70-100%, 75-80%, 75-85%, 75-90%, 75-95%, 75-99%, 75-99,5%, 75-100%, 80-85%, 80-90%, 80-95%, 80-99%, 80-99,5%, 80-100%, 85-90%, 85-95%, 85-99%, 85-99,5%, 85-100%, 90-95%, 90-99%, 90-99,5%, 90-100%, 95-99%, 95-99,5%, 95-100%, 99-99,5%, 99-100% или 99,5-100%. В качестве неограничивающего примера, нокдаун (KD) мишени направляющей цепью составляет более 70%.

В соответствии с одним вариантом осуществления IC50 для сопровождающей цепи в отношении ближайшей нецелевой мишени превышает 100-кратное значение IC50 для направляющей цепи в отношении мишени. В качестве неограничивающего примера, если IC50 для сопровождающей цепи в отношении ближайшей нецелевой мишени превышает 100-кратное значение IC50 для направляющей цепи в отношении мишени, то считается, что дуплексы siRNA или кодируемая dsRNA, нацеленные на ген SOD1 человека, имеют высокую активность направляющей цепи и низкую активность сопровождающей цепи in vitro.

В соответствии с одним вариантом осуществления процессинг 5ʹ-конца направляющей цепи характеризуется корректной стартовой точкой (n) на 5ʹ-конце по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% времени in vitro или in vivo. В качестве неограничивающего примера, 5ʹ-процессинг направляющей цепи является точным и характеризуется корректной стартовой точкой (n) на 5ʹ-конце по меньшей мере 99% времени in vitro. В качестве неограничивающего примера, 5ʹ-процессинг направляющей цепи является точным и характеризуется корректной стартовой точкой (n) на 5ʹ-конце по меньшей мере 99% времени in vivo.

В соответствии с одним вариантом осуществления соотношение экспрессируемых направляющей цепи и сопровождающей цепи (G:P) составляет 1:99, 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5 или 99:1 in vitro или in vivo. В качестве неограничивающего примера, соотношение направляющей цепи и сопровождающей цепи составляет 80:20 in vitro. В качестве неограничивающего примера, соотношение направляющей цепи и сопровождающей цепи составляет 80:20 in vivo.

В соответствии с одним вариантом осуществления целостность векторного генома, кодирующего dsRNA, составляет по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более 99% полной длины конструкции.

Модификация siRNA

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы siRNA согласно настоящему изобретению в случае, когда их не доставляют в виде предшественника или ДНК, могут быть химически модифицированными для модуляции некоторых характеристик молекул РНК, как например, без ограничения, для повышения стабильности siRNA in vivo. Химически модифицированные молекулы siRNA можно использовать в терапевтических применениях у человека, при этом они являются улучшенными и не оказывают негативного влияния на активность RNAi молекул siRNA. В качестве неограничивающего примера, молекулы siRNA модифицированы и по 3′-, и по 5′-концу как смысловой цепи, так и антисмысловой цепи.

В некоторых аспектах дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, таких как, без ограничения, нуклеотиды с модифицированным сахаром, модификациями нуклеотидного основания и/или модификациями остова. В некоторых аспектах молекула siRNA может содержать комбинированные модификации, например, комбинированные модификации нуклеотидного основания и остова.

В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный нуклеотид может представлять собой нуклеотид с модифицированным сахаром. Нуклеотиды с модифицированным сахаром включают, без ограничения, 2′-фтор-, 2′-амино- и 2′-тио-модифицированные рибонуклеотиды, например, 2′-фтор-модифицированные рибонуклеотиды. Модифицированные нуклеотиды могут быть модифицированы в сахарном фрагменте, также как и нуклеотиды, имеющие сахара или их аналоги, которые не представляют собой рибозил. Например, сахарные фрагменты могут представлять собой или могут иметь в своей основе маннозы, арабинозы, глюкопиранозы, галактопиранозы, 4′-тиорибозу и другие сахара, гетероциклы или карбоциклы.

В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный нуклеотид может представлять собой нуклеотид с модифицированным нуклеотидным основанием.

В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный нуклеотид может представлять собой нуклеотид с модифицированным остовом. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие модификации на остове. Нормальный «остов» в контексте настоящего описания относится к последовательностям из повторяющихся чередующихся сахара и фосфата в молекуле ДНК или РНК. Дезоксирибозные/рибозные сахара соединены как 3'-гидроксильной, так и 5'-гидроксильной группами с фосфатными группами через сложноэфирные связи, также известные как «фосфодиэфирные» связи/линкер (PO мостик). PO остовы могут быть модифицированными в виде «фосфоротиоатного остова» (PS мостик). В некоторых случаях природные фосфодиэфирные связи могут быть заменены амидными связями, но четыре атома между двумя звеньями сохраняются. Такие амидные модификации могут облегчить твердофазный синтез олигонуклеотидов и повысить термодинамическую стабильность образованного дуплекса с комплементарной последовательностью siRNA. См., например, Mesmaeker et al., Pure & Appl. Chem., 1997, 3, 437-440; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

Модифицированные основания относятся к нуклеотидным основаниям, таким как, например, аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин, инозин и квеуозин, которые были модифицированы посредством замены или добавления одного или более атомов или групп. Некоторые примеры модификаций в фрагментах нуклеотидных оснований включают, без ограничения, алкилированные, галогенированные, тиолированные, аминированные, амидированные или ацетилированные основания по отдельности или в сочетании. Более конкретные примеры включают, например, 5-пропинилуридин, 5-пропинилцитидин, 6-метиладенин, 6-метилгуанин, N,N,-диметиладенин, 2-пропиладенин, 2-пропилгуанин, 2-аминоаденин, 1-метилинозин, 3-метилуридин, 5-метилцитидин, 5-метилуридин и другие нуклеотиды, имеющие модификацию в положении 5, 5-(2-амино)пропилуридин, 5-галогенцитидин, 5-галогенуридин, 4-ацетилцитидин, 1-метиладенозин, 2-метиладенозин, 3-метилцитидин, 6-метилуридин, 2-метилгуанозин, 7-метилгуанозин, 2,2-диметилгуанозин, 5-метиламиноэтилуридин, 5-метилоксиуридин, деазануклеотиды, такие как 7-деаза-аденозин, 6-азоуридин, 6-азоцитидин, 6-азотимидин, 5-метил-2-тиоуридин, другие тио-основания, такие как 2-тиоуридин, и 4-тиоуридин, и 2-тиоцитидин, дигидроуридин, псевдоуридин, квеуозин, археозин, нафтильные и замещенные нафтильные группы, любые O- и N-алкилированные пурины и пиримидины, такие как N6-метиладенозин, 5-метилкарбонилметилуридин, уридин-5-оксиуксусную кислоту, пиридин-4-он, пиридин-2-он, фенильные и модифицированные фенильные группы, такие как аминофенол или 2,4,6-триметоксибензол, модифицированные цитозины, которые действуют как нуклеотиды в G-зажиме, 8-замещенные аденины и гуанины, 5-замещенные урацилы и тимины, азапиримидины, карбоксигидроксиалкил-нуклеотиды, карбоксиалкиламиноалкил-нуклеотиды и алкилкарбонилалкилированные нуклеотиды.

В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированные нуклеотиды могут присутствовать только на смысловой цепи.

В соответствии с другим вариантом осуществления модифицированные нуклеотиды могут присутствовать только на антисмысловой цепи.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления модифицированные нуклеотиды могут присутствовать как в смысловой, так и в антисмысловой цепях.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления химически модифицированный нуклеотид не воздействует на способность антисмысловой цепи спариваться с последовательностью целевой мРНК, такой как последовательность мРНК SOD1.

Векторы

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы siRNA, описанные в данном документе, могут кодироваться векторами, такими как плазмиды или вирусные векторы. В соответствии с одним вариантом осуществления молекулы siRNA кодируются вирусными векторами. Вирусные векторы, могут представлять собой, без ограничения, векторы на основе герпесивируса (HSV), векторы на основе ретровируса, векторы на основе аденовируса, векторы на основе аденоассоциированного вируса, векторы на основе лентивируса и т.п. В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления вирусные векторы представляют собой AAV-векторы.

Векторы на основе ретровируса

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления дуплекс siRNA, нацеленный на ген SOD1, может кодироваться вектором на основе ретровируса (см., например, патенты США №№ 5399346; 5124263; 4650764 и 4980289; причем содержание каждого из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

Векторы на основе аденовируса

Аденовирусы представляют собой ДНК-вирусы эукариот, которые могут быть модифицированы для эффективной доставки нуклеиновой кислоты в ряд типов клеток in vivo и широко применялись в протоколах генной терапии, в том числе для целенаправленного воздействия на гены в нервных клетках. Различные векторы на основе дефектного по репликации аденовируса и векторы на основе минимального аденовируса были описаны для терапевтических средств на основе нуклеиновой кислоты (см., например, PCT публикации патентных заявок №№ WO199426914, WO 199502697, WO199428152, WO199412649, WO199502697 и WO199622378; содержание каждой из которых включено в своей полноте посредством ссылки). Такие векторы на основе аденовируса также можно применять для доставки молекул siRNA согласно настоящему изобретению в клетки.

Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV)

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой зависимый парвовирус (подобный другим парвовирусам), который представляет собой безоболочечный вирус с одноцепочечной ДНК, который имеет геном длиной приблизительно 5000 нуклеотидов и содержит две открытых рамки считывания, кодирующих белки, отвечающие за репликацию (Rep), и структурный белок капсида (Cap). Открытые рамки считывания фланкированы двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), которые служат в качестве точки начала репликации вирусного генома. Более того, геном AAV содержит упаковочную последовательность, обеспечивающую возможность упаковки вирусного генома в капсид AAV. AAV-вектор требует совместно действующий вирус-помощник (например, аденовирус) для того, чтобы обеспечить продуктивную инфекцию в инфицированных клетках. При отсутствии таких функций помощника вирионы AAV в основном проникают в клетки-хозяева и интегрируются в геном клеток.

AAV-векторы изучали в отношении доставки siRNA вследствие нескольких особенных признаков. Неограничивающие примеры признаков включают (i) способность к инфицированию как делящихся, так и неделящихся клеток; (ii) широкий спектр хозяев для инфицирования, в том числе клетки человека; (iii) AAV дикого типа не был ассоциирован с каким-либо заболеванием и не было показано, что он реплицируется в инфицированных клетках; (iv) отсутствие клеточно-опосредованного иммунного ответа на вектор и (v) природа, не предусматривающая интеграцию в хромосому хозяина, тем самым снижая возможность для длительной экспрессии. Более того, инфицирование AAV-векторами оказывает минимальное влияние на изменение характера экспрессии генов в клетке (Stilwell and Samulski et al., Biotechniques, 2003, 34, 148).

Как правило, AAV-векторы для доставки siRNA могут представлять собой рекомбинантные вирусные векторы, которые являются дефектными по репликации, поскольку они лишены последовательностей, кодирующих функциональные белки Rep и Cap в вирусном геноме. В некоторых случаях, у векторов на основе дефектных AAV могут отсутствовать большинство или все кодирующие последовательности, и они, по существу, содержат только одну или две последовательности ITR AAV и упаковочную последовательность.

AAV-векторы также могут содержать векторы на основе самокомплементарного AAV (scAAV). Векторы на основе scAAV содержат обе цепи ДНК, которые комплементарно соединены вместе с образованием двухцепочечной ДНК. За счет пропуска синтеза второй цепи scAAV обеспечивают возможность быстрой экспрессии в клетке.

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой scAAV.

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой ssAAV.

В уровне техники раскрыты способы получения и/или модификации AAV-векторов, таких как векторы на основе псевдотипированного AAV (PCT публикации патентных заявок №№ WO200028004; WO200123001; WO2004112727; WO 2005005610 и WO 2005072364, причем содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA, можно получить или доставить из различных серотипов AAV, в том числе, без ограничения, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 и AAV-DJ. В некоторых случаях разные серотипы AAV могут быть смешаны вместе или с другими типами вирусов с получением химерных AAV-векторов.

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить в клетки млекопитающих.

AAV-векторы можно модифицировать для повышения эффективности доставки. Такие модифицированные AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, могут быть эффективно упакованы, и их можно применять для успешного инфицирования целевых клеток с высокой частотой и минимальной токсичностью.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, может представлять собой вектор на основе человеческого серотипа AAV. Такой AAV-вектор человека можно получить из любого известного серотипа, например, из любого из серотипов AAV1-AAV11. В качестве неограничивающих примеров, AAV-векторы могут представлять собой векторы, содержащие полученный из AAV1 геном в полученном из AAV1 капсиде; векторы, содержащие полученный из AAV2 геном в полученном из AAV2 капсиде; векторы, содержащие полученный из AAV4 геном в полученном из AAV4 капсиде; векторы, содержащие полученный из AAV6 геном в полученном из AAV6 капсиде, или векторы, содержащие полученный из AAV9 геном в полученном из AAV9 капсиде.

В соответствии с другими вариантами осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты для кодирования молекул siRNA согласно настоящему изобретению, может представлять собой вектор на основе псевдотипированного гибридного или химерного AAV, который содержит последовательности и/или компоненты, происходящие по меньшей мере из двух разных серотипов AAV. Векторы на основе псевдотипированного AAV могут представлять собой векторы, содержащие геном AAV, полученный из одного серотипа AAV, и белок капсида, полученный по меньшей мере частично из отличающегося серотипа AAV. В качестве неограничивающих примеров, такие векторы на основе псевдотипированного AAV, могут представлять собой векторы, содержащие полученный из AAV2 геном в полученном из AAV1 капсиде; или векторы, содержащие полученный из AAV2 геном в полученном из AAV6 капсиде; или векторы, содержащие полученный из AAV2 геном в полученном из AAV4 капсиде или полученный из AAV2 геном в полученном из AAV9 капсиде. Подобным образом, настоящим изобретением предполагается любой вектор на основе гибридного или химерного AAV.

В соответствии с другими вариантами осуществления AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно применять для доставки молекул siRNA в центральную нервную систему (например, патент США № 6180613; содержание которого включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

В некоторых аспектах AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, могут дополнительно содержать модифицированный капсид, включающий пептиды невирусного происхождения. В других аспектах AAV-вектор может содержать ЦНС-специфический химерный капсид для облегчения доставки кодируемых дуплексов siRNA в головной мозг и спинной мозг. Например, выравнивание нуклеотидных последовательностей кэп-структуры у вариантов AAV, проявляющих тропизм в отношении ЦНС, можно выполнить для идентификации последовательности и структуры вариабельного участка (VR).

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, может кодировать молекулы siRNA, которые представляют собой полицистронные молекулы. Молекулы siRNA могут дополнительно содержать один или более линкеров между участками молекул siRNA.

В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться ниже промотора в векторе экспрессии, такого как, без ограничения, CMV, U6, CBA или CBA промотор с интроном SV40. Кроме того, кодируемая молекула siRNA также может располагаться выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более 30 нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 или 25-30 нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первого 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% или более 25% нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первых 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% или 20-25% ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии.

В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. Кроме того, кодируемая молекула siRNA может располагаться ниже промотора, такого как, без ограничения, CMV, U6, CBA или CBA промотор с интроном SV40, в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более 30 нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 или 25-30 нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первого 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% или более 25% нуклеотидов ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первых 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% или 20-25% ниже промотора и/или выше последовательности полиаденилирования в векторе экспрессии.

В соответствии с одним вариантом осуществления, кодируемая молекула siRNA может располагаться в scAAV.

В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться в ssAAV.

В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться возле 5ʹ-конца флип-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с другим вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться возле 3ʹ-конца флип-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с другим вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться возле 5ʹ-конца флоп-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с другим вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться возле 3ʹ-конца флоп-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться между 5ʹ-концом флип-ITR и 3ʹ-концом флоп-ITR в векторе экспрессии. В соответствии с одним вариантом осуществления кодируемая молекула siRNA может располагаться между (например, посередине между 5ʹ-концом флип-ITR и 3ʹ-концом флоп-ITR или 3ʹ-концом флоп-ITR и 5ʹ-концом флип-ITR) 3ʹ-концом флип-ITR и 5ʹ-концом флип-ITR в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более 30 нуклеотидов ниже 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более 30 нуклеотидов выше 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 или 25-30 нуклеотидов ниже 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве еще одного неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 1-25, 1-30, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-25, 20-30 или 25-30 нуклеотидов выше 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первого 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% или более 25% нуклеотидов выше 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии. В качестве другого неограничивающего примера, кодируемая молекула siRNA может располагаться в пределах первых 1-5%, 1-10%, 1-15%, 1-20%, 1-25%, 5-10%, 5-15%, 5-20%, 5-25%, 10-15%, 10-20%, 10-25%, 15-20%, 15-25% или 20-25% ниже 5ʹ- или 3ʹ-конца ITR (например, флип-ITR или флоп-ITR) в векторе экспрессии.

Вектор экспрессии

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор экспрессии (например, AAV-вектор) может содержать по меньшей мере один из модулирующих полинуклеотидов, содержащих по меньшей мере один из векторов экспрессии, описанных в данном документе.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор экспрессии может содержать, при перечислении от ITR к ITR в направлении от 5ʹ к 3ʹ, ITR, промотор, интрон, модулирующий полинуклеотид, полиA-последовательность и ITR.

Размер генома

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой одноцепочечный или двухцепочечный векторный геном. Размер векторного генома может быть небольшим, средним, большим или максимальным. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой небольшой одноцепочечный векторный геном. Небольшой одноцепочечный векторный геном может иметь размер от 2,7 до 3,5 т. о., как например, может иметь размер приблизительно 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4 и 3,5 т. о. В качестве неограничивающего примера, небольшой одноцепочечный векторный геном может иметь размер 3,2 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой небольшой двухцепочечный векторный геном. Небольшой двухцепочечный векторный геном может иметь размер от 1,3 до 1,7 т. о., как например, приблизительно 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 и 1,7 т. о. В качестве неограничивающего примера, небольшой двухцепочечный векторный геном может иметь размер 1,6 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, например, siRNA или dsRNA, может представлять собой средний одноцепочечный векторный геном. Средний одноцепочечный векторный геном может иметь размер от 3,6 до 4,3 т. о., как например, может иметь размер приблизительно 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2 и 4,3 т. о. В качестве неограничивающего примера, средний одноцепочечный векторный геном может иметь размер 4,0 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой средний двухцепочечный векторный геном. Средний двухцепочечный векторный геном может иметь размер от 1,8 до 2,1 т. о., как например, приблизительно 1,8, 1,9, 2,0 и 2,1 т. о. В качестве неограничивающего примера, средний двухцепочечный векторный геном может иметь размер 2,0 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой большой одноцепочечный векторный геном. Большой одноцепочечный векторный геном может иметь размер от 4,4 до 6,0 т. о., как например,приблизительно 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 и 6,0 т. о. В качестве неограничивающего примера, большой одноцепочечный векторный геном может иметь размер 4,7 т. о. В качестве другого неограничивающего примера, большой одноцепочечный векторный геном может иметь размер 4,8 т. о. В качестве еще одного неограничивающего примера, большой одноцепочечный векторный геном может иметь размер 6,0 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулирующие полинуклеотиды, описанные в данном документе, может представлять собой большой двухцепочечный векторный геном. Большой двухцепочечный векторный геном может иметь размер от 2,2 до 3,0 т. о., как например, может иметь размер приблизительно 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 и 3,0 т. о. В качестве неограничивающего примера, большой двухцепочечный векторный геном может иметь размер 2,4 т. о. Кроме того, векторный геном может содержать промотор и полиA-хвост.

Промоторы

Специалист в данной области техники может понять, что целевая клетка может требовать специфического промотора, включающего, без ограничения, промотор, который является видоспецифическим, индуцируемым, тканеспецифическим или специфическим в отношении фазы клеточного цикла; Parr et al., Nat. Med.3:1145-9 (1997); содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

В соответствии с одним вариантом осуществления промотор представляет собой промотор, считающийся эффективным для управления экспрессией модулирующего полинуклеотида.

В соответствии с одним вариантом осуществления промотор представляет собой промотор, характеризующийся тропизмом в отношении клетки, подвергающейся целенаправленному воздействию.

В соответствии с одним вариантом осуществления промотор представляет собой слабый промотор, который обеспечивает экспрессию полезного груза, например, модулирующего полинуклеотида, например, siRNA или dsRNA, в течение периода времени в тканях, подвергающихся целенаправленному воздействию, таких как, без ограничения, ткани нервной системы. Экспрессия может осуществляться в течение периода длительностью 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 7 часов, 8 часов, 9 часов, 10 часов, 11 часов, 12 часов, 13 часов, 14 часов, 15 часов, 16 часов, 17 часов, 18 часов, 19 часов, 20 часов, 21 час, 22 часа, 23 часа, 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 1 неделя, 8 суток, 9 суток, 10 суток, 11 суток, 12 суток, 13 суток, 2 недели, 15 суток, 16 суток, 17 суток, 18 суток, 19 суток, 20 суток, 3 недели, 22 суток, 23 суток, 24 суток, 25 суток, 26 суток, 27 суток, 28 суток, 29 суток, 30 суток, 31 суток, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 1 год, 13 месяцев, 14 месяцев, 15 месяцев, 16 месяцев, 17 месяцев, 18 месяцев, 19 месяцев, 20 месяцев, 21 месяц, 22 месяца, 23 месяца, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет, 6 лет, 7 лет, 8 лет, 9 лет, 10 лет или более 10 лет. Экспрессия может может осуществляться в течение 1-5 часов, 1-12 часов, 1-2 суток, 1-5 суток, 1-2 недель, 1-3 недель, 1-4 недель, 1-2 месяцев, 1-4 месяцев, 1-6 месяцев, 2-6 месяцев, 3-6 месяцев, 3-9 месяцев, 4-8 месяцев, 6-12 месяцев, 1-2 лет, 1-5 лет, 2-5 лет, 3-6 лет, 3-8 лет, 4-8 лет или 5-10 лет. В качестве неограничивающего примера, промотор представляет собой слабый промотор для устойчивой экспрессии полезного груза в нервных тканях.

В соответствии с одним вариантом осуществления промотор может представлять собой промотор, который имеет длину менее 1 т. о. Промотор может иметь длину 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 или боле 800. Промотор может иметь длину 200-300, 200-400, 200-500, 200-600, 200-700, 200-800, 300-400, 300-500, 300-600, 300-700, 300-800, 400-500, 400-600, 400-700, 400-800, 500-600, 500-700, 500-800, 600-700, 600-800 или 700-800.

В соответствии с одним вариантом осуществления промотор может представлять собой комбинацию двух или более компонентов, таких как, без ограничения, CMV и CBA. Каждый компонент может иметь длину 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 или более 800. Каждый компонент может иметь длину 200-300, 200-400, 200-500, 200-600, 200-700, 200-800, 300-400, 300-500, 300-600, 300-700, 300-800, 400-500, 400-600, 400-700, 400-800, 500-600, 500-700, 500-800, 600-700, 600-800 или 700-800. В качестве неограничивающего примера, промотор представляет собой комбинацию 382-нуклеотидной энхансерной последовательности CMV и 260-нуклеотидной промоторной последовательности CBA.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит по меньшей мере один элемент для повышения специфичности в отношении мишени и усиления экспрессии (см., например, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). Неограничивающие примеры элементов для повышения специфичности трансгена в отношении мишени и усиления экспрессии включают промоторы, эндогенные miRNA, посттранскрипционные регуляторные элементы (PRE), последовательности сигнала полиаденилирования (полиA) и вышележащие энхансеры (USE), энхансеры CMV и интроны.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит по меньшей мере один элемент для повышения специфичности в отношении мишени и усиления экспрессии (см., например, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки), такой как промоторы.

Промоторы, которые стимулируют экспрессию в большинстве тканей, включают, без ограничения, промотор 1α-субъединицы фактора элонгации (EF1α) человека, предранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотора β-актина курицы (CBA) и его производного CAG, β-глюкуронидазы (GUSB) или убиквитина C (UBC). Для ограничения экспрессии определенными типами клеток можно применять тканеспецифические экспрессионные элементы, такие как, без ограничения, промоторы, специфические в отношении нервной системы, которые можно применять для ограничения экспрессии нейронами, астроцитами или олигодендроцитами. Неограничивающий пример тканеспецифических экспрессионных элементов для нейронов включает промоторы нейрон-специфической енолазы (NSE), фактора роста тромобоцитов (PDGF), B-цепи фактора роста тромбоцитов (PDGF-β), синапсина (Syn), метил-CpG связывающего белка 2 (MeCP2), CaMKII, mGluR2, NFL, NFH, nβ2, PPE, Enk и EAAT2. Неограничивающий пример тканеспецифических экспрессионных элементов для астроцитов включает промоторы глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и EAAT2. Неограничивающий пример тканеспецифического экспрессионного элемента для олигодендроцитов включает промотор основного белка миелина (MBP).

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит убиквитарный промотор. Неограничивающие примеры убиквитарных промоторов включают CMV, CBA (в том числе производные CAG, CBh и т.д.), EF-1α, PGK, UBC, GUSB (hGBp) и UCOE (промотор HNRPA2B1-CBX3). Yu et al. (Molecular Pain 2011, 7:63; содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) оценивали экспрессию eGFP под контролем промоторов CAG, EFIα, PGK и UBC в крысиных DRG клетках и первичных DRG клетках с использованием векторов на основе лентивируса, и обнаружили, что UBC показывал более слабую экспрессию, чем 3 другие промотора, и для всех промоторов наблюдали экспрессию только в 10-12% глии. Soderblom et al. (E. Neuro 2015; содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) исследовали экспрессию eGFP в AAV8 с промоторами CMV и UBC и AAV2 с промотором CMV после инъекции в двигательную кору. Интраназальное введение плазмиды, содержащей промотор UBC или EFIα, показывало устойчивую экспрессию в дыхательных путях, большую, чем экспрессия с промотором CMV (см., например, Gene Therapy 2001, Vol. 8, 1539-1546; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). Husain et al. (Gene Therapy 2009; содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) оценивали конструкцию HβH с промотором hGUSB, промотором HSV-1LAT и промотором NSE и выяснили, что конструкция HβH показывала более слабую экспрессию в головном мозге мышей, чем NSE. Passini и Wolfe (J. Virol. 2001, 12382-12392, содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) оценивали долговременные эффекты вектора HβH после внутрижелудочковой инъекции у новорожденных мышей и выяснили, что присутствует устойчивая экспрессия в течение по меньшей мере 1 года. Низкая экспрессия во всех областях головного мозга была обнаружена Xu et al. (Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332; содержание которой включено в данный документ в своей полноте посредством ссылки) в случае, когда использовали промоторы NF-L и NF-H в сравнении с CMV-lacZ, CMV-luc, EF, GFAP, hENK, nAChR, PPE, PPE+wpre, NSE (0,3 т. о.), NSE (1,8 т. о.) и NSE (1,8 т. о.+wpre). Xu et al. выяснили, что активность промоторов убывала в следующем порядке: NSE (1,8 т. о.), EF, NSE (0,3 т. о.), GFAP, CMV, hENK, PPE, NFL и NFH. NFL представляет собой 650-нуклеотидный промотор, и NFH представляет собой 920-нуклеотидный промотор, причем оба из них отсутствуют в печени, но NFH является распространенным в проприоцептивных сенсорных нейронах, головном и спинном мозге, а NFH присутствует в сердце. Scn8a представляет собой 470-нуклеотидный промотор, который экспрессируется везде в DRG, спинном мозге и головном мозге, причем особенно высокая экспрессия наблюдается в нейронах гиппокампа и мозжечковых клетках Пуркинье, коре головного мозга, таламусе и гипоталамусе (см., например, Drews et al. 2007; и Raymond et al. 2004; причем содержание каждой из которых включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор UBC. Промотор UBC может иметь размер 300-350 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор UBC имеет размер 332 нуклеотида.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор GUSB. Промотор GUSB может иметь размер 350-400 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор GUSB имеет размер 378 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, конструкция может представлять собой AAV-промотор-интрон CMV/глобина-hFXN-RBG, где AAV может быть самокомплементарным, и AAV может представлять собой серотип DJ.

В соответствии с одним вариантом осуществления, векторный геном содержит промотор NFL. Промотор NFL может иметь размер 600-700 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор NFL имеет размер 650 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, конструкция может представлять собой AAV-промотор-интрон CMV/глобина-hFXN-RBG, где AAV может быть самокомплементарным, и AAV может представлять собой серотип DJ.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор NFH. Промотор NFH может иметь размер 900-950 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор NFH имеет размер 920 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, конструкция может представлять собой AAV-промотор-интрон CMV/глобина-hFXN-RBG, где AAV может быть самокомплементарным, и AAV может представлять собой серотип DJ.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор scn8a. Промотор scn8a может иметь размер 450-500 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, промотор scn8a имеет размер 470 нуклеотидов. В качестве неограничивающего примера, конструкция может представлять собой AAV-промотор-интрон CMV/глобина-hFXN-RBG, где AAV может быть самокомплементарным, и AAV может представлять собой серотип DJ.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор FXN.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор PGK.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор CBA.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор CMV.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит промотор, специфичный в отношении печени или скелетных мышц. Неограничивающие примеры промоторов, специфичных в отношении печени, включают hAAT и TBG. Неограничивающие примеры промоторов, специфичных в отношении скелетных мышц, включают десминовый промотор, MCK и C5-12.

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор содержит энхансерный элемент, промотор и/или интрон 5ʹUTR. Энхансер может представлять собой, без ограничения, энхансер CMV, промотор может представлять собой, без ограничения, промотор CMV, CBA, UBC, GUSB, NSE, синапсина, MeCP2 и GFAP, и 5ʹUTR/интрон может представлять собой, без ограничения, SV40 и CBA-MVM. В качестве неограничивающего примера, энхансер, промотор и/или интрон, применяемые в комбинации, могут представлять собой: (1) энхансер CMV, промотор CMV, интрон 5ʹUTR SV40; (2) энхансер CMV, промотор CBA, интрон 5ʹUTR SV 40; (3) энхансер CMV, промотор CBA, интрон 5ʹUTR CBA-MVM; (4) промотор UBC; (5) промотор GUSB; (6) промотор NSE; (7) промотор синапсина; (8) промотор MeCP2 и (9) промотор GFAP.

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор имеет сконструированный промотор.

Интроны

В соответствии с одним вариантом осуществления векторный геном содержит по меньшей мере один элемент для повышения специфичности трансгена в отношении мишени и усиления экспрессии (см., например, Powell et al. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки), такой как интрон. Неограничивающие примеры интронов включают MVM (67-97 п.о.), F.IX усеченный интрон 1 (300 п.о.), SD β-глобина /акцепторный сайт сплайсинга тяжелой цепи иммуноглобулина (250 п.о.), донорный сайт сплайсинга аденовируса/акцепторный сайт сплайсинга иммуноглобулина (500 п.о.), донорный сайт сплайсинга/акцепторный сайт сплайсинга поздних генов SV40 (19S/16S) (180 п.о.) и донорный сайт сплайсинга гибридного аденовируса/акцепторный сайт сплайсинга IgG (230 п.о.).

В соответствии с одним вариантом осуществления интрон может иметь длину 100-500 нуклеотидов. Интрон может иметь длину 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 или 500. Промотор может иметь длину 80-100, 80-120, 80-140, 80-160, 80-180, 80-200, 80-250, 80-300, 80-350, 80-400, 80-450, 80-500, 200-300, 200-400, 200-500, 300-400, 300-500 или 400-500.

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-векторный геном может содержать промотор, такой как, без ограничения, CMV или U6. В качестве неограничивающего примера, промотор для AAV, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, представляет собой промотор CMV. В качестве другого неограничивающего примера, промотор для AAV, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, представляет собой промотор U6.

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор может содержать промотор CMV и U6.

В соответствии с одним вариантом осуществления AAV-вектор может содержать промотор CBA.

Введение в клетки: синтетические dsRNA

Для обеспечения химической и биологической стабильности молекул siRNA (например, дуплексов siRNA и dsRNA) важно доставить молекулы siRNA внутрь целевых клеток. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетки могут включать, без ограничения, клетки, происходящие из млекопитающего, клетки, происходящие из человека, эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, нервные стволовые клетки и клетки-предшественники нервных клеток.

Нуклеиновые кислоты, в том числе siRNA, несут суммарный отрицательный заряд на сахаро-фосфатном остове в нормальных физиологических условиях. Для попадания в клетку молекула siRNA должна прийти в контакт с липидным бислоем клеточной мембраны, группы-«головки» в котором также имеют отрицательный заряд.

Дуплексы siRNA могут присутствовать в комплексе с носителем, который позволяет им проходить через клеточные мембраны, таким как упаковочные частицы, для облегчения поглощения siRNA клетками. Упаковочные частицы могут включать, без ограничения, липосомы, наночастицы, катионные липиды, производные полиэтиленимина, дендримеры, углеродные нанотрубки и комбинацию полученных из углерода наночастиц с дендримерами. Липиды могут представлять собой катионные липиды и/или нейтральные липиды. Помимо традиционных липофильных комплексов молекул siRNA с катионными носителями, молекулы siRNA можно конъюгировать с гидрофобным фрагментом, таким как холестерин (например, публикация заявки на патент США № 20110110937; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). Этот способ доставки имеет потенциал к улучшению поглощения клетками молекул siRNA in vitro и фармакологических свойств молекул siRNA in vivo. Молекулы siRNA согласно настоящему изобретению также можно ковалентно или нековалентно конъюгировать с определенными катионными пептидами, проникающими в клетку (CPP), такими как MPG, транспортан или пенетратин (например, публикация заявки на патент США № 20110086425; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

Введение в клетки: AAV-векторы

Молекулы siRNA (например, дуплексы siRNA) согласно настоящему изобретению можно вводить в клетки с применением ряда подходов, таких как, без ограничения, вирусные векторы (например, AAV-векторы). Эти вирусные векторы сконструированы и оптимизированы для облегчения прохождения молекулы siRNA в клетки, которые с трудом поддаются трансфекции. Также, некоторые синтетические вирусные векторы обладают способностью интегрировать shRNA в геном клетки, тем самым приводя к устойчивой экспрессии siRNA и длительному нокдауну целевого гена. Таким образом, вирусные векторы конструируют в качестве средств для специфической доставки при отсутствии вредных признаков репликации и/или интеграции, обнаруживаемых у вируса дикого типа.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулы siRNA согласно настоящему изобретению вводят в клетку посредством приведения клетки в контакт с композицией, содержащей липофильный носитель и вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению. В соответствии с другими вариантами осуществления молекулу siRNA вводят в клетку посредством трансфицирования или инфицирования клетки вектором, например, AAV-вектором, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, способные продуцировать молекулу siRNA в случае при транскрипции в клетке. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления молекулу siRNA вводят в клетку посредством инъекции в клетку вектора, например, AAV-вектора, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, способную продуцировать молекулу siRNA при транскрипции в клетке.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления перед трансфекцией вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, может трансфицироваться в клетки.

В соответствии с другими вариантами осуществления векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно доставлять в клетки с помощью электропорации (например публикация заявки на патент США № 20050014264; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

Другие способы введения векторов, например, AAV-векторов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA, описанных в данном документе, могут включать фотохимическую интернализацию, как описано в публикации заявки на патент США № 20120264807; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления составы, описанные в данном документе, могут содержать по меньшей мере один вектор, например, AAV-векторы, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA, описанные в данном документе. В соответствии с одним вариантом осуществления молекулы siRNA могут целенаправленно воздействовать на ген SOD1 в одном целевом сайте. В соответствии с другим вариантом осуществления состав содержит несколько векторов, например, AAV-векторов, причем каждый вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулу siRNA, целенаправленно воздействующую на ген SOD1 в различном целевом сайте. SOD1 может подвергаться целенаправленному воздействию в 2, 3, 4, 5 или более чем 5 сайтах.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, из любого соответствующего вида, такого как, без ограничения, человек, собака, мышь, крыса или обезьяна, можно вводить в клетки.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить в клетки, которые имеют отношение к заболеванию, подлежащему лечению. В качестве неограничивающего примера, болезнь представляет собой ALS, и целевые клетки представляют собой двигательные нейроны и астроциты.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить в клетки, которые характеризуются высоким уровнем эндогенной экспрессии целевой последовательности.

В соответствии с другим вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить в клетки, которые характеризуются низким уровнем эндогенной экспрессии целевой последовательности.

В соответствии с одним вариантом осуществления клетки могут представлять собой клетки, характеризующиеся высокой эффективностью трансдукции AAV.

Фармацевтические композиции и состав

В дополнение к фармацевтическим композициям (векторам, например, AAV-векторам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA) в данном документе предусматриваются фармацевтические композиции, которые являются подходящими для введения людям, причем специалисту в данной области техники будет понятно, что такие композиции обычно являются подходящими для введения любому другому животному, например, животным, отличным от человека, например, млекопитающим, отличным от человека. Модификация фармацевтических композиций, подходящих для введения людям, для того, чтобы сделать композиции подходящими для введения различным животным, является хорошо понятной, и средний специалист в области ветеринарной фармакологии может разработать и/или выполнить такую модификацию с использованием только стандартного экспериментирования, если оно вообще будет необходимо. Субъекты, для которых предполагается введение фармацевтических композиций, включают, без ограничения, людей и/или других приматов; млекопитающих, в том числе коммерчески значимых млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, кошки, собаки, мыши и/или крысы; и/или птиц, в том числе коммерчески значимых птиц, таких как домашняя птица, куры, утки, гуси и/или индейки.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композиции вводят людям, пациентам-людям или субъектам-людям. В контексте настоящего раскрытия фраза «активный ингредиент» обычно относится к любому из синтетических дуплексов siRNA, вектору, например, AAV-вектору, кодирующему дуплексы siRNA, или к молекуле siRNA, доставляемой с помощью вектора, как описано в данном документе.

Составы фармацевтических композиций, описанных в данном документе, можно получить с помощью любого способа, известного или который будет разработан в будущем в области фармакологии. В целом, такие способы получения включают стадию обеспечения объединения активного ингредиента со вспомогательным веществом и/или одним или более другими дополнительными ингредиентами, а затем, если необходимо и/или желательно, разделение, придание формы и/или упаковку продукта в предпочтительную единицу с однократной дозой или единицу с несколькими дозами.

Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением будут варьировать в зависимости от индивидуальных особенностей, размера и/или состояния субъекта, получающего лечение, а также в зависимости от пути, которым следует вводить композицию.

Векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно составить с применением одного или более вспомогательных веществ для (1) повышения стабильности; (2) повышения уровня трансфекции или трансдукции клеток; (3) обеспечения возможности длительного или замедленного высвобождения или (4) изменения биораспределения (например, нацеливания вирусного вектора на конкретные ткани или типы клеток, такие как головной мозг и двигательные нейроны).

Составы согласно настоящему изобретению могут включать, без ограничения, солевой раствор, липидоиды, липосомы, липидные наночастицы, полимеры, липоплексы, наночастицы по типу ядро-оболочка, пептиды, белки, клетки, трансфицированные вирусными векторами (например, для трансплантации субъекту), средства, имитирующие наночастицы, и их комбинации. Кроме того, вирусные векторы согласно настоящему изобретению можно составить с применением самособирающихся наночастиц нуклеиновой кислоты.

Составы фармацевтических композиций, описанных в данном документе, можно получить с помощью любого способа, известного или который будет разработан в будущем в области фармакологии. В целом, такие способы получения включают стадию объединения активного ингредиента со вспомогательным веществом и/или одним или более другими дополнительными ингредиентами.

Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим раскрытием можно получить, упаковать и/или реализовать нерасфасованной, в виде единичной стандартной дозы и/или в виде нескольких единичных стандартных доз. В контексте настоящего описания «стандартная доза» относится к дискретному количеству, фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозе активного ингредиента, которую можно вводить субъекту, и/или подходящей части такой дозы, такой как, например, половина или треть такой дозы.

Относительные количества активного ингредиента, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества и/или любых дополнительных ингредиентов в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим раскрытием могут варьировать в зависимости от индивидуальных особенностей, размера и/или состояния субъекта, получающего лечение, а также в зависимости от пути, которым следует вводить композицию. Например, композиция может содержать от 0,1% до 99% (вес/вес) активного ингредиента. В качестве примера, композиция может содержать от 0,1% до 100%, например, от 0,5 до 50%, 1-30%, 5-80%, по меньшей мере 80% (вес/вес) активного ингредиента.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может иметь чистоту по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вспомогательное вещество одобрено для применения у людей и для применения в ветеринарии. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вспомогательное вещество может быть одобрено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вспомогательное вещество может иметь фармацевтическую степень чистоты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления вспомогательное вещество может отвечать стандартам Фармакопеи США (USP), Европейской фармакопеи (EP), Британской фармакопеи и/или Международной фармакопеи.

Вспомогательные вещества, которые в контексте данного описания включают, без ограничения, любые и все растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие среды, вспомогательные средства для диспергирования или суспендирования, поверхностно-активные средства, средства для обеспечения изотоничности, загущающие или эмульгирующие средства, консерванты и т.п., которые подходят для конкретной необходимой лекарственной формы. Различные вспомогательные вещества для составления фармацевтических композиций и методики получения композиции известны из уровня техники (см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; включенную в данный документ в своей полноте посредством ссылки). Применение традиционной среды для лекарственного средства может предполагаться в объеме настоящего раскрытия, за исключением того случая, когда какая-либо традиционная среда для лекарственного средства может быть несовместима с веществом или его производными, как например, являясь причиной какого-либо нежелательного биологического эффекта или иным образом пагубно взаимодействуя с любым другим компонентом(компонентами) фармацевтической композиции.

Иллюстративные разбавители включают, без ограничения, карбонат кальция, карбонат натрия, фосфат кальция, фосфат дикальция, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, фосфат натрия, лактозу, сахарозу, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, сорбит, инозит, хлорид натрия, сухой крахмал, кукурузный крахмал, сахарную пудру и т.д. и/или их комбинации.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления составы могут содержать по меньшей мере один неактивный ингредиент. В контексте настоящего описания термин «неактивный ингредиент» относится к одному или более неактивным средствам, включенным в составы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления все, ни один или некоторые из неактивных ингредиентов, которые можно применять в составах согласно настоящему изобретению, могут быть одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA).

Составы с векторами, содержащими последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, могут включать катионы или анионы. В соответствии с одним вариантом осуществления составы включают катионы металлов, такие как, без ограничения, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ и их комбинации.

В контексте настоящего описания «фармацевтически приемлемые соли» относятся к производным раскрытых соединений, в которых исходное соединение модифицировано посредством превращения существующего кислотного или основного фрагмента в его солевую форму (например, путем осуществления реакции группы свободного основания с подходящей органической кислотой). Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, без ограничения, соли основных остатков, таких как амины, с минеральными или органическими кислотами; соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты, с щелочами или органическими основаниями и т.п. Типичные соли присоединения кислоты включают ацетат, соли уксусной кислоты, адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, соли бензолсульфоновой кислоты, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфорат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидробромид, гидрохлорид, гидройодид, 2-гидрокси-этансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, толуолсульфонат, ундеканоат, валерат и т.п. Типичные соли щелочных или щелочноземельных металлов включают катионы натрия, лития, калия, кальция, магния и т.п., а также нетоксичные катионы аммония, четвертичного аммония и амина, в том числе, без ограничения, катионы аммония, тетраметиламмония, тетраэтиламмония, метиламина, диметиламина, триметиламина, триэтиламина, этиламина и т.п. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему раскрытию включают традиционные нетоксичные соли, образованные исходным соединением, например, с нетоксичными неорганическими или органическими кислотами. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему раскрытию можно синтезировать из исходного соединения, которое содержит основный или кислотный фрагмент, посредством традиционных химических способов. Обычно такие соли можно получить посредством проведения реакции этих соединений в форме свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или же в их смеси; обычно предпочтительными являются неводные среды, подобные эфиру, этилацетату, этанолу, изопропанолу или ацетонитрилу. Перечень подходящих солей находится в Remingtonʹs Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, и Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977); причем содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

Термин «фармацевтически приемлемый сольват» в контексте настоящего описания означает соединение согласно настоящему изобретению, причем молекулы подходящего растворителя включены в кристаллическую решетку. Подходящий растворитель является физиологически переносимым во вводимой дозе. Например, сольваты можно получить посредством кристаллизации, перекристаллизации или осаждения из раствора, который включает органические растворители, воду или их смесь. Примерами подходящих растворителей являются этанол, вода (например, моно-, ди- и тригидраты), N-метилпирролидинон (NMP), диметилсульфоксид (DMSO), N,Nʹ-диметилформамид (DMF), N,Nʹ-диметилацетамид (DMAC), 1,3-диметил-2-имидазолидинон (DMEU), 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2-(1H)-пиримидинон (DMPU), ацетонитрил (ACN), пропиленгликоль, этилацетат, бензиловый спирт, 2-пирролидон, бензилбензоат и т.п. Если растворителем является вода, сольват называется «гидратом».

Согласно настоящему изобретению вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, можно составить для доставки в ЦНС. Можно применять средства, которые пересекают гемато-энцефалический барьер. Например, некоторые пептиды, проникающие в клетку, которые могут нацеливать молекулы siRNA на эндотелий гемато-энцефалического барьера, можно применять для составления дуплексов siRNA, нацеленных на ген SOD1 (например, Mathupala, Expert Opin Ther Pat., 2009, 19, 137-140; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

Введение

Вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить любым путем, который приведет к терапевтически эффективному результату. Они включают, без ограничения, энтеральное введение (в кишечник), желудочно-кишечное, эпидуральное (в твердую мозговую оболочку), пероральное (через рот), трансдермальное, перидуральное, интрацеребральное (в головной мозг), интрацеребровентрикулярное (в желудочки головного мозга), накожное (нанесение на кожу), интрадермальное (в саму кожу), подкожное (под кожу), интраназальное введение (через нос), внутривенное (в вену), внутривенное струйное, внутривенное капельное, внутриартериальное (в артерию), внутримышечное (в мышцу), внутрисердечное (в сердце), внутрикостную инфузию (в костный мозг), интратекальное введение (в спинномозговой канал), внутрибрюшинное (инфузия или инъекция в брюшную полость), интравезикальную инфузию, интравитреальное введение (через глаз), интракавернозную инъекцию (в патологическую полость), интракавитарное (в сонование полового члена), интравагинальное введение, внутриматочное, экстраамниотическое введение, трансдермальное (диффузия через интактную кожу для системного распространения), трансмукозальное (диффузия через слизистую оболочку), трансвагинальное введение, инсуффляцию (втягивание носом), сублингвальное введение, сублабиальное, введение клизмой, введение в глазных каплях (на конъюнктиву), в ушных каплях, ушное введение (в или через ухо), буккальное (по направлению к щеке), конъюнктивальное введение, кожное, дентальное (в зуб или зубы), электроосмос, эндоцервикальное введение, внутрипазушное, эндотрахеальное, экстракорпоральное введение, гемодиализ, инфильтрацию, введение в интерстициальную ткань, интраабдоминальное введение, интраамниотическое, интраартикулярное, интрабилиарное, интрабронхиальное, интрабурсальное, внутрихрящевое (в хрящ), интракаудальное (в конский хвост), интрацистернальное (в большую мозжечково-мозговую цистерну), внутрироговичное (в роговицу), введение в коронку зуба, интракоронарное (в коронарные артерии), введение в пещеристое тело (в расширяющиеся участки пешеристого тела полового члена), внутридисковое введение (в диск), внутрипротоковое (в проток железы), интрадуоденальное (в двенадцатиперстную кишку), интрадуральное (в или под твердую мозговую оболочку), интраэпидермальное (в эпидермис), внутрипищеводное (в пищевод), внутрижелудочное (в желудок), интрагингивальное введение (в десны), введение в подвздошную кишку (в дистальную часть тонкого кишечника), внутриочаговое введение (введение в очаг или введение непосредственно в локализованный очаг), введение в просвет (в просвет трубки), внутрилимфатическое (в лимфу), интрамедуллярное (в мозговую полость кости), интраменингеальное (в оболочки головного мозга), внутриглазное (в глаз), внутрияичниковое (в яичник), интраперикардиальное (в перикард), интраплевральное (в плевру), внутрипростатное (в предстательную железу), внутрилегочное (в легкие или их бронхи), внутрипазушное (в носовые или окологлазничные пазухи), интраспинальное (в позвоночный столб), внутрисуставное (в синовиальную полость сустава), внутрисухожильное (в сухожилье), интратестикулярное (в яичко), интратекальное (в спинномозговую жидкость на любом уровне цереброспинальной оси), интраторакальное (в грудную клетку), интратубулярное (в канальцы органа), внутриопухолевое (в опухоль), интратимпанальное (в ушную среду), внутрисосудистое (в сосуд или сосуды), внутрижелудочковое введение (в желудочек), ионофорез (с помощью электрического тока, под действием которого ионы растворимых солей мигрируют в ткани тела), промывание (для обмывания или промывания открытых ран или полостей тела), ларингеальное (непосредственно на гортань), назогастральное введение (через нос и в желудок), методику наложения окклюзионной повязки (местный путь введения, при котором область введения затем накрывают повязкой, которая герметизирует область), глазное введение (на наружную поверхность глаза), орофарингеальное (непосредственно в рот и глотку), парентеральное, чрескожное, периартикулярное, перидуральное, периневральное, периодонтальное, ректальное, респираторное (в дыхательные пути посредством пероральной или назальной ингаляции для локального или системного эффекта), ретробульбарное введение (за варолиев мост или за глазное яблоко), введение в мягкие ткани, субарахноидальное введение, субконъюнктивальное, субмукозальное, местное, трансплацентарное (через плаценту или в плаценту), транстрахеальное (через стенку трахеи), транстимпанальное введение (через барабанную полость или в барабанную полость), введение в мочеточник (в мочеточник), уретральное введение (в мочеиспускательный канал), вагинальное введение, каудальную блокаду, диагностику, блокаду нерва, перфузию желчных протоков, перфузию сердца, фотоферез или спинальное введение.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления композиции с вектором, например, AAV-вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить путем, который облегчает попадание векторов или молекул siRNA в центральную нервную систему и проникновение их в двигательные нейроны.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить посредством внутримышечной инъекции. Rizvanov et al. впервые продемонстрировали, что молекулы siRNA, нацеленные на мРНК мутантной SOD1 человека, поглощаются седалищным нервом, транспортируются в обратном направлении к перикарионам двигательных нейронов и ингибирует мРНК мутантной SOD1 у трансгенных по SOD1G93A мышей с ALS (Rizvanov AA et al., Exp. Brain Res., 2009, 195(1), 1-4; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). Другое исследование также демонстрирует, что доставка в мышцы AAV, экспрессирующего малые шпилечные РНК (shRNA), действующие против мутантного гена SOD1, приводит к значительному нокдауну мутантной SOD1 в мышцах, а также иннервирующих двигательных нейронах (Towne C et al., Mol Ther., 2011; 19(2): 274-283; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления AAV-векторы, которые экспрессируют дуплексы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить субъекту посредством инъекций в периферические ткани и/или интраназальной доставки. В уровне техники было раскрыто, что при введении в периферические ткани AAV-векторов для дуплексов siRNA они могут транспортироваться в центральную нервную систему, например, к двигательным нейронам (например, публикации заявок на патент США № 20100240739 и № 20100130594; причем содержание каждой из них включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

В соответствии с другими вариантами осуществления композиции, содержащие по меньшей мере один вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить субъекту посредством внутричерепной доставки (см., например, патент США № 8119611; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

Вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить в любой подходящей форме, либо в виде жидкого раствора или суспензии, либо в твердой форме, подходящей для получения жидкого раствора или суспендирования в жидком растворе. Дуплексы siRNA можно составить с любым соответствующим и фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Вектор, например, AAV-вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно вводить в «терапевтически эффективном» количестве, т.е. в количестве, которое является достаточным для смягчения и/или предупреждения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с заболеванием, или для обеспечения улучшения состояния субъекта.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить в ЦНС в терапевтически эффективном количестве для улучшения функционирования и/или обеспечения выживания субъекта с ALS. В качестве неограничивающего примера, вектор можно вводить интратекально.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить субъекту (например, в ЦНС субъекта посредством интратекального введения) в терапевтически эффективном количестве для целенаправленного воздействия дуплексов siRNA или dsRNA на двигательные нейроны и астроциты в спинном мозге и/или стволе головного мозга. В качестве неограничивающего примера, дуплексы siRNA или dsRNA могут снижать экспрессию белка или мРНК SOD1. В качестве другого неограничивающего примера, дуплексы siRNA или dsRNA могут подавлять SOD1 и снижать опосредованную SOD1 токсичность. Снижение уровня белка и/или мРНК SOD1, а также опосредованной SOD1 токсичности может достигаться практически без усиленного воспаления.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить субъекту (например, в ЦНС субъекта) в терапевтически эффективном количестве для замедления ухудшения функционального состояния у субъекта (например, определенного с использованием известного способа оценки, такого как функциональная шкала оценки состояния больных ALS (ALSFRS)) и/или продления жизни субъектов без зависимости от аппарата искусственной вентиляции легких (например, уменьшенная смертность или потребность в поддержке искусственной вентиляцией легких). В качестве неограничивающего примера, вектор можно вводить интратекально.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить в мозжечково-мозговую цистерну в терапевтически эффективном количестве для трансдукции двигательных нейронов и/или астроцитов спинного мозга. В качестве неограничивающего примера, вектор можно вводить интратекально.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, можно вводить с применением интратекальной инфузии в терапевтически эффективном количестве для трансдукции двигательных нейронов и/или астроцитов спинного мозга. В качестве неограничивающего примера, вектор можно вводить интратекально.

В соответствии с одним вариантом осуществления можно получить с состав с вектором, например, AAV-вектором, содержащим модулирующий полинуклеотид. В качестве неограничивающего примера баричность и/или осмоляльность состава можно оптимизировать для обеспечения оптимального распределения лекарственного средства в центральной нервной системе или в области или компоненте центральной нервной системы.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, можно доставлять субъекту посредством одного пути введения.

В соответствии с одним вариантом осуществления вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, можно доставлять субъекту посредством пути введения в несколько мест. Субъекту можно вводить вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид в 2, 3, 4, 5 или более чем 5 сайтах.

В соответствии с одним вариантом осуществления субъекту можно вводить вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, описанный в данном документе, с применением струйной инфузии.

В соответствии с одним вариантом осуществления субъекту можно вводить вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, описанный в данном документе, с применением длительной доставки в течение периода времени, составляющего минуты, часы или сутки. Скорость инфузии можно изменять в зависимости от субъекта, распределения, состава или другого параметра доставки.

В соответствии с одним вариантом осуществления катетер может быть расположен в более чем одном участке в позвоночнике для доставки в несколько участков. Вектор, например, AAV-вектор, содержащий модулирующий полинуклеотид, можно доставлять посредством продолжительной и/или струйной инфузии. Каждый участок может иметь отличающийся режим дозирования, или один и тот же режим дозирования можно применять для каждого участка доставки. В качестве неограничивающего примера, участки доставки могут находиться в шейной и поясничной области. В качестве другого неограничивающего примера, участки доставки могут находиться в шейной области. В качестве еще одного неограничивающего примера, участки доставки могут находиться в поясничной области.

В соответствии с одним вариантом осуществления субъект может подвергаться анализу в отношении анатомии и патологии позвоночника перед доставкой вектора, например, AAV-вектора, содержащего модулирующий полинуклеотид, описанный в данном документе. В качестве неограничивающего примера, субъект со сколиозом может иметь отличающийся режим дозирования и/или расположение катетера по сравнению с субъектом без сколиоза.

В соответствии с одним вариантом осуществления ориентация позвоночника субъекта в ходе доставки вектора, например, AAV-вектора, содержащего модулирующий полинуклеотид, может быть вертикальной относительно поверхности земли.

В соответствии с другим вариантом осуществления ориентация позвоночника субъекта в ходе доставки вектора, например, AAV-вектора, содержащего модулирующий полинуклеотид, может быть горизонтальной относительно поверхности земли.

В соответствии с одним вариантом осуществления позвоночник субъекта может находиться под углом относительно поверхности земли в ходе доставки вектора, например, AAV-вектора, содержащего модулирующий полинуклеотид. Угол позвоночника субъекта относительно поверхности земли может составлять по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 или 180 градусов.

В соответствии с одним вариантом осуществления способ и длительность доставки выбирают для обеспечения свободной трансдукции в спинной мозг. В качестве неограничивающего примера, интратекальную доставку применяют для обеспечения свободной трансдукции по всей длине спинного мозга в рострально-каудальном направлении. В качестве другого неограничивающего примера, инфузии в несколько мест обеспечивают более равномерную трансдукцию по всей длине спинного мозга в рострально-каудальном направлении. В качестве еще одного неограничивающего примера, пролонгированные инфузии обеспечивают более равномерную трансдукцию по всей длине спинного мозга в рострально-каудальном направлении.

Дозировка

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту с применением любого количества, эффективного для сокращения, предупреждения и/или лечения нарушения, ассоциированного с SOD1 (например, ALS). Точное необходимое количество будет варьировать от субъекта к субъекту в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести заболевания, конкретной композиции, способа ее введения, механизма ее действия и т.п.

Композиции согласно настоящему изобретению, как правило, составляют в единичной лекарственной форме для облегчения введения и равномерности дозировки. Тем не менее, будет понятно, что общее суточное потребление композиций согласно настоящему изобретению может определяться лечащим врачом по результатам тщательной клинической оценки. Конкретная терапевтическая эффективность для каждого конкретного пациента будет зависеть от ряда факторов, в том числе от нарушения, подлежащего лечению, и тяжести нарушения; активности конкретного используемого соединения; конкретной используемой композиции; возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и рациона пациента; времени введения, пути введения, а также скорости выведения из организма используемых дуплексов siRNA; длительности лечения; лекарственных средств, применяемых в сочетании или совместно с конкретным используемым соединением; и подобных факторов, хорошо известных в области медицины.

В соответствии с одним вариантом осуществления возраст и пол субъекта можно использовать для определения дозы композиций согласно настоящему изобретению. В качестве неограничивающего примера, субъект, чей возраст больше, может получать большую дозу (например, на 5-10%, 10-20%, 15-30%, 20-50%, 25-50% большую или по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более чем 90% большую) композиции по сравнению с младшим субъектом. В качестве другого неограничивающего примера, субъект, чей возраст меньше, может получать большую дозу (например, на 5-10%, 10-20%, 15-30%, 20-50%, 25-50% большую или по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более чем 90% большую) композиции по сравнению со старшим субъектом. В качестве еще одного неограничивающего примера, субъект, являющийся женщиной, может получать большую дозу (например, на 5-10%, 10-20%, 15-30%, 20-50%, 25-50% большую или по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более чем 90% большую) композиции по сравнению с субъектом-мужчиной. В качестве еще одного неограничивающего примера, субъект, являющийся мужчиной, может получать большую дозу (например, на 5-10%, 10-20%, 15-30%, 20-50%, 25-50% большую или по меньшей мере на 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более чем 90% большую) композиции по сравнению с субъектом-женщиной.

В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления дозы AAV-векторов для доставки дуплексов siRNA согласно настоящему изобретению можно адаптировать в зависимости от болезненного состояния, субъекта и стратегии лечения.

В соответствии с одним вариантом осуществления доставка композиций в соответствии с настоящим изобретением в клетки предусматривает скорость доставки, определяемую выражением [вг/час= мл/час * вг/мл], где вг представляет собой количество вирусных геномов, вг/мл представляет собой концентрацию композиции, и мл/час представляет собой скорость пролонгированной доставки.

В соответствии с одним вариантом осуществления доставка композиций в соответствии с настоящим изобретением в клетки может предусматривать общую концентрацию у субъекта от приблизительно 1×106 вг до приблизительно 1×1016 вг. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления доставка может предусматривать концентрацию композиции приблизительно 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 2,1×1011, 2,2×1011, 2,3×1011, 2,4×1011, 2,5×1011, 2,6×1011, 2,7×1011, 2,8×1011, 2,9×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 7,1×1011, 7,2×1011, 7,3×1011, 7,4×1011, 7,5×1011, 7,6×1011, 7,7×1011, 7,8×1011, 7,9×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 1,1 x1012, 1,2×1012, 1,3×1012, 1,4×1012, 1,5×1012, 1,6×1012, 1,7×1012, 1,8×1012, 1,9×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 4,1×1012, 4,2×1012, 4,3×1012, 4,4×1012, 4,5×1012,4,6×1012, 4,7×1012, 4,8×1012, 4,9×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 8,1×1012, 8,2×1012, 8,3×1012, 8,4×1012, 8,5×1012, 8,6×1012, 8,7×1012, 8,8 x1012, 8,9×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 6,7×1013, 7×1013, 8×1013, 9×1013, 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 9×1014, 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 9×1015 или 1×1016 вг/субъект.

В соответствии с одним вариантом осуществления доставка композиций в соответствии с настоящим изобретением в клетки может предусматривать общую концентрацию у субъекта от приблизительно 1×106 вг/кг до приблизительно 1×1016 вг/кг. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления доставка может предусматривать концентрацию композиции приблизительно 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 2,1×1011, 2,2×1011, 2,3×1011, 2,4×1011, 2,5×1011, 2,6×1011, 2,7×1011, 2,8×1011, 2,9×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 7,1×1011, 7,2×1011, 7,3×1011, 7,4×1011, 7,5×1011, 7,6×1011, 7,7×1011, 7,8×1011, 7,9×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 1,1 x1012, 1,2×1012, 1,3×1012, 1,4×1012, 1,5×1012, 1,6×1012, 1,7×1012, 1,8×1012, 1,9×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 4,1×1012, 4,2×1012, 4,3×1012, 4,4×1012, 4,5×1012,4,6×1012, 4,7×1012, 4,8×1012, 4,9×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 8,1×1012, 8,2×1012, 8,3×1012, 8,4×1012, 8,5×1012, 8,6×1012, 8,7×1012, 8,8 x1012, 8,9×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 6,7×1013, 7×1013, 8×1013, 9×1013, 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 9×1014, 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 9×1015 или 1×1016 вг/кг.

В соответствии с одним вариантом осуществления можно доставлять от приблизительно 105 до 106 вирусных геномов (единиц) на дозу.

В соответствии с одним вариантом осуществления доставка композиций в соответствии с настоящим изобретением в клетки может предусматривать общую концентрацию от приблизительно 1×106 вг/мл до приблизительно 1×1016 вг/мл. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления доставка может предусматривать концентрацию композиции приблизительно 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 1,1×1012, 1,2×1012, 1,3×1012, 1,4×1012, 1,5×1012, 1,6×1012, 1,7×1012, 1,8×1012, 1,9×1012, 2×1012, 2,1×1012, 2,2×1012, 2,3×1012, 2,4×1012, 2,5×1012, 2,6×1012, 2,7×1012, 2,8×1012, 2,9×1012, 3×1012, 3,1×1012, 3,2×1012, 3,3×1012, 3,4×1012, 3,5×1012, 3,6×1012, 3,7×1012, 3,8×1012, 3,9×1012, 4×1012, 4,1×1012, 4,2×1012, 4,3×1012, 4,4×1012, 4,5×1012, 4,6×1012, 4,7×1012, 4,8×1012, 4,9×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 6,7×1013, 7×1013, 8×1013, 9×1013, 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 9×1014, 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 9×1015 или 1×1016 вг/мл.

В соответствии с определенными вариантами осуществления необходимую дозу дуплекса siRNA можно доставить с помощью нескольких введений (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати или большего числа введений). Если используют несколько введений, можно применять режимы дозирования с разделением дозы, такие как описанные в данном документе. В контексте настоящего описания «раздельная доза» представляет собой разделение единичной стандартной дозы или общей суточной дозы на две или более доз, например, два или более введений единичной стандартной дозы. В контексте настоящего описания «единичная стандартная доза» представляет собой дозу любого терапевтического средства на основе модулирующего полинуклеотида, вводимого в одной дозе/в одно время/одним путем/через одну точку контакта, т.е. при одном событии введения. В контексте настоящего описания «общая суточная доза» представляет собой количество, которое дают или прописывают на 24 часовой период. Его можно вводить в виде единичной стандартной дозы. В соответствии с одним вариантом осуществления вирусные векторы, содержащие модулирующие полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, вводят субъекту раздельными дозами. Их можно составить только в буфере или в составе, описанном в данном документе.

Способы лечения ALS

Настоящим изобретением обеспечиваются способы введения векторов, например, AAV-векторов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, в клетки, причем способ предусматривает введение в указанные клетки любого из векторов в количестве, достаточном для того, чтобы происходило разрушение целевой мРНК SOD1, тем самым активируя мишень-специфическую RNAi в клетках. В некоторых аспектах клетки могут представлять собой стволовые клетки, нейроны, такие как двигательные нейроны, мышечные клетки и глиальные клетки, такие как астроциты.

В настоящем изобретении раскрыты способы лечения ALS, ассоциированного с аномальным функционированием SOD1, у субъекта, нуждающегося в лечении. Способ необязательно предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению. В качестве неограничивающего примера, молекулы siRNA могут подавлять экспрессию гена SOD1, ингибировать продукцию белка SOD1 и снижать интенсивность одного или более симптомов ALS у субъекта, тем самым осуществляя терапевтическое лечение ALS.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композицию, содержащую векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, вводят в центральную нервную систему субъекта. В соответствии с другими вариантами осуществления композицию, содержащую векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, вводят в мышцы субъекта

В частности, векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно доставлять в конкретные типы клеток, подвергающихся целенаправленному воздействию, в том числе в двигательные нейроны; глиальные клетки, в том числе олигодендроцит, астроцит и микроглию; и/или другие клетки, окружающие нейроны, такие как T-клетки. В исследования у пациентов-людей с ALS и в животных моделях ALS, связанного с SOD1, вовлекались глиальные клетки как играющие роль на начальных этапах дисфункции и гибели двигательных нейронов. Нормальная SOD1 в окружающей среде, защищающие глиальные клетки могут предотвратить гибель двигательных нейронов, даже если мутантная SOD1 присутствует в двигательных нейронах (например, в обзоре за авторством Philips and Rothstein, Exp. Neurol., 2014, May 22. pii: S0014-4886(14)00157-5; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

В соответствии с некоторыми конкретными вариантами осуществления векторы, например, AAV-векторы, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую молекулы siRNA согласно настоящему изобретению, можно применять в качестве терапевтического средства для ALS.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композицию согласно настоящему изобретению вводят как средство для одиночной терапии или как средство в рамках комплексной терапии для лечения ALS.

Векторы, например, AAV-векторы, кодирующие дуплексы siRNA, нацеленные на ген SOD1, можно применять в сочетании с одним или более другими терапевтическими средствами. Под выражением «в сочетании с» не подразумевается, что средства нужно вводить одновременно и/или составлять для совместной доставки, хотя эти способы доставки находятся в пределах объема настоящего раскрытия. Композиции можно вводить одновременно с одним или более другими необходимыми терапевтическими средствами или медицинскими процедурами, до или после них. В целом, каждое средство будут вводить в дозе и/или по временному графику, определенным для каждого средства.

Терапевтические средства, которые можно применять в сочетании с векторами, например, AAV-векторами, кодирующими последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, могут представлять собой соединения-малые молекулы, которые являются антиоксидантами, противовоспалительными средствами, антиапоптотическими средствами, регуляторами уровня кальция, антиглутаматергическими средствами, ингибиторами структурных белков и соединениями, вовлеченными в регуляцию ионов металлов.

Соединения, исследуемые в отношении лечения ALS, которые можно применять в сочетании с векторами, описанными в данном документе, включают, без ограничения, антиглутаматергические средства: рилузол, топирамат, талампанел, ламотригин,декстрометорфан, габапентин и антагонист AMPA; антиапоптотические средства: миноциклин, фенилбутират натрия и аримокломол; противовоспалительное средство: ганглиозид, целекоксиб, циклоспорин, азатиоприн, циклофосфамид, плазмаферез, глатирамер ацетат и талидомид; цефтриаксон (Berry et al., Plos One, 2013, 8(4)); бета-лактамные антибиотики; прамипексол (дофаминовый агонист) (Wang et al., Amyotrophic Lateral Scler., 2008, 9(1), 50-58); нимесулид в публикации заявки на патент США № 20060074991; диазоксид, раскрытый в публикации заявки на патент США № 20130143873); пиразолоновые производные, раскрытые в публикации заявки на патент США № 20080161378; поглотители свободных радикалов, которые ингибируют индуцируемую окислительным стрессом гибель клетки, такие как бромокриптин (публикация заявки на патент США № 20110105517); фенилкарбаматные соединения, обсуждаемые в PCT публикации патентной заявки № 2013100571; нейропротекторные соединения, раскрытые в патентах США № 6933310 и № 8399514 и в публикациях заявок на патент США № 20110237907 и № 20140038927; и гликопептиды, обсуждаемые в публикации заявки на патент США № 20070185012; причем содержание каждого из этих источников включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

Терапевтические средства, которые можно применять в комплексной терапии с векторами, например, AAV-векторами, кодирующими последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, могут представлять собой гормоны или варианты, которые могут защищать от потери нейронов, такие как адренокортикотропный гормон (ACTH) или его фрагменты (например, публикация заявки на патент США № 20130259875); эстроген (например, патенты США № 6334998 и № 6592845); причем содержание каждого из этих источников включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

Нейротрофические факторы можно использовать в комплексной терапии с векторами, например, AAV-векторами, кодирующими последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению, для лечения ALS. В целом, нейротрофический фактор определяется как вещество, которое способствует выживанию, росту, дифференцировке, пролиферации и/или созреванию нейрона или стимулирует повышенную активность нейрона. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способы согласно настоящему изобретению дополнительно предусматривают доставку одного или более трофических факторов субъекту, нуждающемуся в лечении. Трофические факторы могут включать, без ограничения, IGF-I, GDNF, BDNF, CTNF, VEGF, коливелин, ксалипроден, тиреотропин-рилизинг гормони ADNF, а также их варианты.

В одном аспекте вектор, например, AAV-вектор, кодирующий последовательность нуклеиновой кислоты для по меньшей мере одного дуплекса siRNA, нацеленного на ген SOD1, можно вводить совместно с AAV-векторами, экспрессирующими нейротрофические факторы, такие как AAV-IGF-I (Vincent et al., Neuromolecular medicine, 2004, 6, 79-85; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки) и AAV-GDNF (Wang et al., J Neurosci., 2002, 22, 6920-6928; содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки).

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления композицию согласно настоящему изобретению для лечения ALS вводят нуждающемуся субъекту внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, интратекально и/или внутрь желудочка, что позволяет молекулам siRNA или векторам, содержащим молекулы siRNA, проходить через один из или оба из гемато-энцефалического барьера и гемато-спинномозгового барьера. В некоторых аспектах способ включает введение (например, внутрижелудочковое введение и/или интратекальное введение) непосредственно в центральную нервную систему (ЦНС) субъекта (при использовании, например, инфузионного насоса и/или каркаса для доставки) терапевтически эффективного количества композиции, содержащей векторы, например, AAV-векторы, кодирующие последовательность нуклеиновой кислоты для молекул siRNA согласно настоящему изобретению. Векторы можно применять для осуществления сайленсинга или подавления экспрессии гена SOD1 и/или для снижения интенсивности одного или более симптомов ALS у субъекта, тем самым осуществляя терапевтическое лечение ALS.

В определенных аспектах симптомы ALS, включающие, без ограничения, дегенерацию двигательных нейронов, мышечную слабость, мышечную атрофию, ригидность мышц, затрудненное дыхание, невнятную речь, развитие фасцикуляций, лобно-височную деменцию и/или преждевременную смерть, улучшены у субъекта, получающего лечение. В других аспектах композицию согласно настоящему изобретению применяют в одном из или обоих из головного мозга и спинного мозга. В других аспектах улучшены одна или обе из мышечной координации и мышечной функции. В других аспектах жизнь субъекта продлевается.

В соответствии с одним вариантом осуществления введение субъекту векторов, например, AAV-векторов, кодирующих siRNA согласно настоящему изобретению, может снизить уровень мутантной SOD1 в ЦНС субъекта. В соответствии с другим вариантом осуществления введение субъекту векторов, например, AAV-векторов, может снизить уровень SOD1 дикого типа в ЦНС субъекта. В соответствии с еще одним вариантом осуществления введение субъекту векторов, например, AAV-векторов, может снизить уровень как мутантной SOD1, так и SOD1 дикого типа в ЦНС субъекта. Уровень мутантной SOD1 и/или SOD1 дикого типа может снижаться приблизительно на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% или по меньшей мере на 20-30%, 20-40%, 20-50%, 20-60%, 20-70%, 20-80%, 20-90%, 20-95%, 20-100%, 30-40%, 30-50%, 30-60%, 30-70%, 30-80%, 30-90%, 30-95%, 30-100%, 40-50%, 40-60%, 40-70%, 40-80%, 40-90%, 40-95%, 40-100%, 50-60%, 50-70%, 50-80%, 50-90%, 50-95%, 50-100%, 60-70%, 60-80%, 60-90%, 60-95%, 60-100%, 70-80%, 70-90%, 70-95%, 70-100%, 80-90%, 80-95%, 80-100%, 90-95%, 90-100% или 95-100% в ЦНС, области ЦНС или конкретной клетке ЦНС субъекта. В качестве неограничивающего примера, векторы, например, AAV-векторы, могут снижать экспрессию SOD1 дикого типа по меньшей мере на 50% в двигательных нейронах (например, двигательных нейронах передних рогов) и/или астроцитах. В качестве другого неограничивающего примера, векторы, например, AAV-векторы, могут снижать экспрессию мутантной SOD1 по меньшей мере на 50% в двигательных нейронах (например, двигательных нейронах передних рогов) и/или астроцитах. В качестве еще одного неограничивающего примера, векторы, например, AAV-векторы, могут снижать экспрессию SOD1 дикого типа и мутантной SOD1 по меньшей мере на 50% в двигательных нейронах (например, двигательных нейронах передних рогов) и/или астроцитах.

В соответствии с одним вариантом осуществления введение векторов, например, AAV-векторов, субъекту будет снижать экспрессию мутантной SOD1 и/или SOD1 дикого типа в спинном мозге, и снижение экспрессии мутантной SOD1 и/или SOD1 дикого типа будет снижать эффекты ALS у субъекта.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить субъекту, который находится на ранних стадиях ALS. Симптомы каждой стадии включают, без ограничения, мышцы, которые являются слабыми и мягкими или жесткими, плотными и спастическими, судороги и подергивания (фасцикуляции) мышц, потерю мышечной массы (атрофию), утомляемость, плохую способность удерживать равновесие, невнятную речь, слабый контроль и/или спотыкание при ходьбе. Симптомы могут ограничиваться одной областью тела, или слабо выраженный симптом может затрагивать более чем одну область. В качестве неограничивающего примера, введение векторов, например, AAV-векторов, могут снижать тяжесть и/или распространенность симптомов ALS.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить субъекту, который находится на промежуточных стадиях ALS. Промежуточная стадия ALS включает, без ограничения, более распространенные мышечные симптомы по сравнению с ранней стадией, некоторые мышцы являются парализованными, тогда как остальные являются ослабленными или незатронутыми, продолжающиеся подергивания мышц (фасцикуляции), неиспользуемые мышцы могут вызывать контрактуры там, где суставы стали ригидными, болезненными и иногда деформированными, слабость в глотательных мышцах может вызвать поперхивание и большую сложность при приеме пищи и контроле слюноотделения, слабость в дыхательных мышцах может вызвать дыхательную недостаточность, которая может быть проявляться при лежании, и/или субъект может иметь приступы неконтролируемого и неуместного смеха или плача (псевдобульбарный аффект). В качестве неограничивающего примера, введение векторов, например, AAV-векторов, могут снижать тяжесть и/или распространенность симптомов ALS.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно вводить субъекту, который находится на поздних стадиях ALS. Поздняя стадия ALS включает, без ограничения, произвольно сокращающиеся мышцы, которые в основном парализованы, мышцы, которые помогают перемещать воздух в и из легких, имеют сильные нарушения, подвижность крайне ограничена, слабое дыхание может вызвать утомляемость, спутанные мысли, головные боли и чувствительность к инфекции или заболеваниям (например, пневмонии), речь затруднительна, а принятие пищи или питья через рот может быть невозможно.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно применять для лечения субъекта с ALS, который имеет мутацию C9orf72.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно применять для лечения субъекта с ALS, который имеет мутации TDP-43.

В соответствии с одним вариантом осуществления векторы, например, AAV-векторы, можно применять для лечения субъекта с ALS, который имеет мутации FUS.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если не указано иное, следующие термины и фразы имеют значения, описанные ниже. Определения не считаются ограничивающими по своей природе и служат для обеспечения более четкого понимания определенных аспектов настоящего изобретения.

В контексте настоящего описания термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» относятся к любым полимерам нуклеиновой кислоты, состоящим или из полидезоксирибонуклеотидов (содержащих 2-дезокси-D-рибозу), или из полирибонуклеотидов (содержащих D-рибозу), или из любого другого типа полинуклеотида, который представляет собой N-гликозид пуринового или пиримидинового основания или модифицированных пуриновых или пиримидиновых оснований. Не предполагаются различия по длине между терминами «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид», и эти термины используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся только к первичной структуре молекулы. Таким образом, эти термины включают двух- и одноцепочечную ДНК, а также двух- и одноцепочечную РНК.

В контексте настоящего описания термины «РНК», или «молекула РНК», или «молекула рибонуклеиновой кислоты» относятся к полимеру из рибонуклеотидов; термин «ДНК», или «молекула ДНК», или «молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты» относится к полимеру из дезоксирибонуклеотидов. ДНК и РНК могут синтезироваться в естественных условиях, например, при репликации ДНК и транскрипции ДНК, соответственно; или их можно химически синтезировать. ДНК и РНК могут быть одноцепочечными (т.е. ssRNA или ssDNA, соответственно) или многоцепочечными (например, двухцепочечными, т.е. dsRNA и dsDNA, соответственно). Термины «мРНК» или «информационная РНК», которые используются в данном документе, относятся к одноцепочечной РНК, которая кодирует аминокислотную последовательность одной или более полипептидных цепей.

В контексте настоящего описания термины «РНК-интерференция» или «RNAi» относятся к специфическому в отношении последовательности регуляторному механизму, опосредованному молекулами РНК, который приводит в результате к ингибированию, или препятствованию, или «сайленсингу» экспрессии соответствующего гена, кодирующего белок. RNAi наблюдалась во многих типах организмов, в том числе в растениях, животных и грибах. RNAi происходит в клетках в естественных условиях для удаления чужеродных РНК (например, вирусных РНК). Природная RNAi происходит посредством фрагментов, отщепляемых от свободной dsRNA, которая управляет разрушающим механизмом для других подобных последовательностей РНК. RNAi контролируется РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC) и инициируется молекулами короткой/малой dsRNA в цитоплазме клетки, где они взаимодействуют с каталитическим компонентом RISC - белком Argonaute. Молекулы dsRNA можно вводить в клетки из экзогенных источников. Экзогенная dsRNA инициирует RNAi посредством активации белка-рибонуклеазы Dicer, который связывает и расщепляет dsRNA с образованием двухцепочечных фрагментов из 21-25 пар оснований с выступающими концами из нескольких неспаренных оснований на каждом конце. Эти короткие двухцепочечные фрагменты называются малыми интерферирующими РНК (siRNA).

В контексте настоящего описания термины «короткая интерферирующая РНК», «малая интерферирующая РНК» или «siRNA» относятся к молекуле РНК (или аналога РНК), содержащей приблизительно 5-60 нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов), которая способна управлять или опосредовать RNAi. Предпочтительно, молекула siRNA содержит приблизительно 15-30 нуклеотидов или нуклеотидных аналогов, как например, приблизительно 16-25 нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов), приблизительно 18-23 нуклеотида (или нуклеотидных аналога), приблизительно 19-22 нуклеотида (или нуклеотидных аналога) (например, 19, 20, 21 или 22 нуклеотида или нуклеотидных аналога), приблизительно 19-25 нуклеотидов (или нуклеотидных аналогов) и приблизительно 19-24 нуклеотида (или нуклеотидных аналога). Термин «короткая» siRNA относится к siRNA, содержащей 5-23 нуклеотида, предпочтительно 21 нуклеотид (или нуклеотидный аналог), например, 19, 20, 21 или 22 нуклеотида. Термин «длинная» siRNA относится к siRNA, содержащей 24-60 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 24-25 нуклеотидов, например, 23, 24, 25 или 26 нуклеотидов. Короткие siRNA в некоторых случаях могут включать в себя менее 19 нуклеотидов, например, 16, 17 или 18 нуклеотидов, или всего лишь 5 нуклеотидов при условии, что более короткая siRNA сохраняет способность опосредовать RNAi. Аналогичным образом, длинные siRNA в некоторых случаях могут включать в себя более 26 нуклеотидов, например, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или даже 60 нуклеотидов, при условии, что более длинная siRNA сохраняет способность опосредовать RNAi или трансляционную репрессию при отсутствии дополнительного процессинга, например, ферментативного процессинга, в короткие siRNA. siRNA могут представлять собой молекулы одноцепочечной РНК (ss-siRNA) или молекулы двухцепочечной РНК (ds-siRNA), содержащие смысловую цепь и антисмысловую цепь, которые гибридизируются с образованием дуплексной структуры, называемой дуплексом siRNA.

В контексте настоящего описания термины «антисмысловая цепь», или «первая цепь», или «направляющая цепь» молекулы siRNA относится к цепи, которая практически комплементарна участку приблизительно из 10-50 нуклеотидов, например, приблизительно из 15-30, 16-25, 18-23 или 19-22 нуклеотидов, в мРНК гена, подвергающегося целенаправленному воздействию с целью сайленсинга. Антисмысловая цепь или первая цепь имеет последовательность, в достаточной степени комплементарную последовательности необходимой целевой мРНК для непосредственного мишень-специфического сайленсинга, например, комплементарную в достаточной степени для запуска разрушения необходимой целевой мРНК с помощью аппарата или процесса RNAi.

В контексте настоящего описания термины «смысловая цепь», или «вторая цепь», или «сопровождающая цепь» молекулы siRNA относятся к цепи, которая комплементарна антисмысловой цепи или первой цепи. Антисмысловая и смысловая цепи молекулы siRNA гибридизируются с образованием дуплексной структуры. В контексте настоящего описания «дуплекс siRNA» включает в себя цепь siRNA, характеризующуюся достаточной комплементарностью с участком приблизительно из 10-50 нуклеотидов в мРНК гена, подвергающегося целенаправленному воздействию с целью сайленсинга, и цепь siRNA, характеризующуюся достаточной комплементарностью для образования дуплекса с цепью siRNA.

В контексте настоящего описания термин «комплементарный» относится к способности полинуклеотидов к образованию пар оснований друг с другом. Пары оснований, как правило, образуются с помощью водородных связей между нуклеотидными звеньями в антипараллельных полинуклеотидных цепях. Комплементарные полинуклеотидные цепи могут образовывать пару оснований посредством образования уотсон-криковских пар (например, A с T, A с U, C с G) или любым другим способом, который обеспечивает возможность образования дуплексов. Поскольку специалисты в данной области техники осведомлены, что при использовании РНК в отличие от ДНК урацил, а не тимин является основанием, которое считается комплементарным аденозину. Тем не менее, если U обозначен в контексте настоящего изобретения, предполагается возможность замены T, если не указано иное. Полная комплементарность или 100% комплементарность относится к ситуации, в которой каждое нуклеотидное звено в одной полинуклеотидной цепи может образовать водородную связь с нуклеотидным звеном во второй полинуклеотидной цепи. Менее чем полная комплементарность относится к ситуации, в которой некоторые, но не все нуклеотидные звенья в двух цепях могут образовывать водородную связь друг с другом. Например, в случае двух последовательностей из 20 мономерных звеньев, если только две пары оснований на каждой цепи могут образовывать водородные связи друг с другом, полинуклеотидные цепи проявляют 10% комплементарность. В том же примере, если 18 пар оснований на каждой цепи могут образовывать водородные связи друг с другом, полинуклеотидные цепи проявляют 90% комплементарность.

В контексте настоящего описания термин «практически комплементарный» означает, что siRNA имеет последовательность (например, в антисмысловой цепи), которая является достаточной для связывания необходимой целевой мРНК и для запуска РНК-сайленсинга целевой мРНК.

В контексте настоящего описания «нацеливание» означает процесс конструирования и выбора последовательности нуклеиновой кислоты, которая будет гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой и индуцировать желаемый эффект.

Термин «экспрессия гена» относится к процессу, при котором последовательность нуклеиновой кислоты подвергается успешной транскрипции и, в большинстве случаев, трансляции с образованием белка или пептида. Для ясности, в случае, когда упоминается измерение «экспрессии гена», это следует понимать как означающее, что измерения могут относиться к продукту транскрипции нуклеиновой кислоты, например, РНК или мРНК, или к состоящему из аминокислот продукту трансляции, например, полипептидам или пептидам. Способы измерения количества или уровней РНК, мРНК, полипептидов и пептидов хорошо известны в уровне техники.

В контексте настоящего описания термин «мутация» относится к любому изменению структуры гена, приводящему в результате к вариантной (также называемой «мутантной») форме, которая может передаваться дальнейшим поколениям. Мутации в гене могут быть вызваны изменением отдельных оснований в ДНК, или делецией, вставкой или перегруппировкой более крупных участков генов или хромосом.

В контексте настоящего описания термин «вектор» означает любую молекулу или фрагмент, который транспортирует, трансдуцирует или иным образом действует как носитель гетерологичной молекулы, такой как молекула siRNA согласно настоящему изобретению. «Вирусный вектор» представляет собой вектор, который содержит один или более полинуклеотидных участков, кодирующих или содержащих молекулу, представляющую интерес, например, трансген, полинуклеотид, кодирующий полипептид или несколько полипептидов, или модулирующую нуклеиновую кислоту, такую как малая интерферирующая РНК (siRNA). Вирусные векторы обычно используются для доставки генетических материалов в клетки. Вирусные векторы часто модифицируют для конкретных применений. Типы вирусных векторов включают векторы на основе ретровируса, векторы на основе лентивируса, векторы на основе аденовируса и векторы на основе аденоассоциированного вируса.

Термины «аденоассоциированный вирус», или «AAV», или «AAV-вектор», которые используются в данном документе, относятся к любому вектору, который содержит или получен из компонентов вектора на основе аденоассоциированного вируса и является подходящим для инфицирования клеток млекопитающего, предпочтительно клеток человека. Термином «AAV-вектор», как правило, обозначают вирусную частицу или вирион AAV типа, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую дуплекс siRNA. AAV-вектор может быть получен из различных серотипов, в том числе из комбинаций серотипов (т.е. «псевдотипированный» AAV), или из различных геномов (например, одноцепочечный или самокомплементарный). Кроме того, AAV-вектор может быть дефектным по репликации и/или подвергшимся целенаправленному воздействию.

Используемая в данном документе фраза «ингибирует экспрессию гена» означает, что это приводит к снижению количества продукта экспрессии гена. Продукт экспрессии может представлять собой молекулу РНК, транскрибируемую с гена (например, мРНК), или полипептид, транслируемый с мРНК, которая транскрибируется с гена. Как правило, снижение уровня мРНК приводит в результате к снижению уровня полипептида, транслируемого с нее. Уровень экспрессии можно определить с применением стандартных методик для измерения уровня мРНК или белка.

В контексте настоящего описания термин «in vitro» относится к событиям, которые происходят в искусственной среде, например, в исследуемой пробирке или реакционном сосуде, в клеточной культуре, в чашке Петри и т.д., а не внутри организма (например, животного, растения или микроба).

В контексте настоящего описания термин «in vivo» относится к событиям, которые происходят внутри организма (например, животного, растения или микроба или в их клетке или ткани).

В контексте настоящего описания термин «модифицированный» относится к измененному состоянию или структуре молекулы согласно настоящему изобретению. Молекулы можно модифицировать разнообразными путями, в том числе химически, структурно и функционально.

В контексте настоящего описания термин «синтетический» означает полученный, приготовленный и/или произведенный руками человека. Синтез полинуклеотидов, или полипептидов, или других молекул согласно настоящему изобретению может быть химическим или ферментативным.

В контексте настоящего описания термин «трансфекция» относится к способам введения в клетку экзогенных нуклеиновых кислот. Способы трансфекции включают, без ограничения, химические способы, физическую обработку и обработку катионными липидами или смесями. Перечень средств, которые могут быть трансфицированы в клетку, является большим и включает, без ограничения, siRNA, смысловые и/или антисмысловые последовательности, ДНК, кодирующую один или более генов и организованную в экспрессионную плазмиду, белки, белковые фрагменты и т.д.

В контексте настоящего описания «нецелевой» относится к любому непредусмотренному эффекту в отношении любой одной или более мишени, гена или клеточного транскрипта.

В контексте настоящего описания фраза «фармацевтически приемлемый» используется в данном документе для обозначения тех соединений, материалов, композиций и/или лекарственных форм, которые, по результатам тщательной клинической оценки, являются подходящими для применения в контакте с тканями человеческих организмов и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или другой проблемы или осложнения, соизмеримых с разумным соотношением выгоды и риска.

В контексте настоящего описания термин «эффективное количество» средства, представляет собой такое количество, достаточное для обеспечения полезных или желаемых результатов, например, клинических результатов, и само по себе «эффективное количество» зависит от контекста, в котором это выражение употребляется. Например, в контексте введения средства, которое обеспечивает лечение ALS, эффективное количество средства представляет собой, например, количество, достаточное для осуществления лечения ALS, которое определено в данном документе, по сравнению с ответом, полученным без введения средства.

В контексте настоящего описания термин «терапевтически эффективное количество» означает количество средства, подлежащего доставке (например, нуклеиновой кислоты, лекарственного средства, терапевтического средства, диагностического средства, профилактического средства и т.д.), которое при введении субъекту, страдающему от инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния или подверженному их развитию, является достаточным для лечения, улучшения симптомов, диагностики, предупреждения и/или задержки проявления инфекции, заболевания, нарушения и/или состояния.

В контексте настоящего описания термины «субъект» или «пациент» относятся к любому организму, которому можно вводить композицию в соответствии с настоящим изобретением, например, для экспериментальных, диагностических, профилактических и/или терапевтических целей. Типичные субъекты включают животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, приматы, за исключением человека, такие как шимпанзе, и другие виды высших обезьян и низших обезьян, и люди) и/или растения.

В контексте настоящего описания термины «предупреждающий» или «предупреждение» относятся к задержке или препятствованию появлению, развитию или прогрессу состояния или заболевания в течение периода времени, включающего недели, месяцы или годы.

Термины «лечение» или «осуществление лечения» при использовании в данном документе относятся к применению одной или более конкретных процедур, применяемых для излечения или ослабления заболевания. В соответствии с определенными вариантами осуществления конкретная процедура представляет собой введение одного или более фармацевтических средств. В контексте настоящего изобретения конкретная процедура представляет собой введение одного или более дуплексов siRNA или кодируемой dsRNA, нацеленных на ген SOD1.

В контексте настоящего описания термины «ослабление» или «ослабляющий» относятся к снижению тяжести по меньшей мере одного показателя состояния или заболевания. Например, в контексте нейрогенеративного заболевания, ослабление включает уменьшение потери нейронов.

В контексте настоящего описания термин «введение» относится к обеспечению субъекта фармацевтическим средством или композицией.

В контексте настоящего описания термин «нейродегенерация» относится к патологическому состоянию, результатом которого является гибель нервных клеток. Большое число неврологических нарушений характеризуются нейродегенерацией как обычным патологическим состоянием. Например, все из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и бокового амиотрофического склероза (ALS) вызывают хроническую нейродегенерацию, которая характеризуется медленной прогрессирующей гибелью нервных клеток в течение периода нескольких лет, тогда как острая нейродегенерация характеризуется внезапным началом гибели нервных клеток в результате ишемии, как например, при инсульте, или травмы, как например, при травматическом повреждении головного мозга, или в результате перерезки аксона вследствие демиелинизации или травмы, например, повреждения спинного мозга или рассеянного склероза. При некоторых неврологических нарушениях дегенерируют преимущественно клетки одного типа нейронов, например, дегенерация двигательных нейронов при ALS.

ЭКВИВАЛЕНТЫ И ОБЪЕМ

Специалисты в данной области техники поймут или будут способны установить с использованием не более чем стандартного экспериментирования многие эквиваленты конкретным вариантам осуществления в соответствии с настоящим изобретением, описанным в данном документе. Не предполагается, чтобы объем настоящего изобретения ограничивался вышеизложенным описанием, вместо этого он изложен в прилагаемой формуле изобретения.

В пунктах формулы изобретения формы единственного числа, такие как «некоторый», «некий» и «данный», могут означать один или более чем один, если не указано обратное, или это иным образом очевидно из контекста. Пункты формулы изобретения или описания, которые включают «или» между одним или более членами группы, считаются удовлетворительными, если один, более чем один или все из членов группы присутствуют в, используются в или иным образом относятся к заданному продукту или процессу, если не указано обратное, или это иным образом очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты осуществления, в которых именно один член группы присутствует в, используется в или иным образом относится к заданному продукту или процессу. Настоящее изобретение включает варианты осуществления, в которых более чем один или все члены группы присутствуют в, используются в или иным образом относятся к заданному продукту или процессу.

Также отмечается, что термин «содержащий» предполагается открытым и позволяет, но не требует включения дополнительных элементов или стадий. Если термин «содержащий» используется в данном документе, термин «состоящий из», следовательно, также охватывается и раскрывается.

В случае, если приведены диапазоны, конечные значения включены. Более того, следует понимать, что если не указано иное, или это в иных условиях не является очевидным из контекста и понимания специалиста в данной области техники, величины, которые выражены в виде диапазонов, могут предполагать любое конкретное значение или поддиапазон в приведенных диапазонах в разных вариантах осуществления настоящего изобретения, до десятой части единицы измерения на нижней границе диапазона, если контекст явно не предписывает иное.

Кроме того, следует понимать, что любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения, который попадает в уровень техники, может быть явно исключен из любого одного или более пунктов формулы изобретения. Поскольку такие варианты осуществления считаются известными специалисту в данной области техники, их можно исключить, даже если исключение явно не изложено в данном документе. Любой конкретный вариант осуществления композиций согласно настоящему изобретению (например, любой антибиотик, терапевтическое средство или активный ингредиент; любой способ получения; любой способ применения и т.д.) может быть исключен из любого одного или более пунктов формулы изобретения по любой причине, связанной или не связанной с его присутствием в уровне техники.

Следует понимать, что слова, которые использовались, представляют собой слова для описания, а не для ограничения, и что в рамках прилагаемой формулы изобретения можно выполнить изменения, не отходя от истинного объема и сущности настоящего изобретения в его широких аспектах.

Хотя настоящее изобретение было описано в некотором объеме и с некоторыми подробностями в отношении нескольких описанных вариантов осуществления, не предполагается, что оно должно ограничиваться любыми такими подробностями или вариантами осуществления или любым конкретным вариантом осуществления, а его следует толковать с учетом прилагаемой формулы изобретения для того, чтобы обеспечить наиболее широкую возможную интерпретацию таких пунктов формулы изобретения в связи с уровнем техники и, следовательно, чтобы эффективно охватить предусмотренный объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Конструирование и синтез siRNA для SOD1

Конструирование siRNA для SOD1

Конструирование siRNA выполняли для идентификации siRNA, нацеленных на ген SOD1 человека. В конструировании использовали транскрипты SOD1 для человека ((номер доступа в Genebank: NM_ 000454.4 (SEQ ID NO: 1)), яванского макака ((номер доступа в Genebank: XM_005548833.1) из собрания NCBI Refseq (выпуск 63) (SEQ ID NO: 2)) и макака-резуса (транскрипт SOD1 ENSMMUT00000002415 (SEQ ID NO: 3) из проекта Ensembl (выпуск 75)), которые описаны в таблице 2.

Таблица 2. Последовательности гена SOD1

Конструировали дуплексы siRNA, имеющие 100% идентичность с транскриптом SOD1 человека для положений 2-18 в антисмысловой цепи, и частичную или 100% идентичность с транскриптом SOD1 примата, помимо человека, для положений 2-18 в антисмысловой цепи. Во всех дуплексах siRNA в положении 1 в антисмысловой цепи с помощью методов генной инженерии помещали U, и в положение 19 в смысловой цепи с помощью методов генной инженерии помещали C для того, чтобы в этом положении в дуплексе не образовывалась пара.

Подбор последовательности siRNA для SOD1

Исходя из прогнозируемой селективности антисмысловой цепи в отношении генов SOD1 человека, яванского макака и макака-резуса и отсутствия совпадения затравочной последовательности в положениях 2-7 в антисмысловой цепи с последовательностями человека в miRBase20.0, всего 169 антисмысловых и 169 смысловых олигонуклеотидов, полученных из SOD1 человека, синтезировали и из них образовывали дуплексы (таблица 3). Дуплексы siRNA затем исследовали в отношении ингибирующей активности in vitro по отношению к экспрессии эндогенного гена SOD1 (уровни мРНК SOD1).

Таблица 3. Последовательности смысловой и антисмысловой цепей dsRNA для SOD1 человека

Синтез siRNA для SOD1

Олигорибонуклеотиды собирали на синтезаторе ABI 3900 (Applied Biosystems) в соответствии с фосфорамидитным химическим процессом олигомеризации. Твердая подложка представляла собой полистрирол, нагруженный 2ʹ-дезокси-тимидином (приобретен у Glen Research, Серлинг, Виргиния, США), с получением масштаба синтеза 0,2 мкмоля. Вспомогательные реактивы для синтеза, фосфорамидиты ДНК и РНК, получали от SAFC Proligo (Гамбург, Германия). В частности, 5ʹ-O-(4,4ʹ-диметокситритил)-3ʹ-O-(2-цианоэтил-N,N-диизопропил)фосфорамидитные мономеры уридина (U), тимидина (dT), 4-N-ацетилцитидина (CAc), 6-N-бензоиладенозина (Abz) и 2-N-изобутилгуанозина (GiBu) с 2ʹ-O-t-бутилдиметилсилилом использовали для построения последовательности олигомеров(13). Время связывания для всех фосфорамидитов (70 мМ в ацетонитриле) составляло 3 мин. При использовании 5-этилтио-1H-тетразола (ETT) в качестве активатора (0,5 М в ацетонитриле). Последовательности синтезировали с удалением конечной диметокситритильной защитной группы на синтезаторе (синтез «с удалением DMT»). По завершении твердофазного синтеза олигорибонуклеотиды отщепляли от твердой подложки и удаляли защитную группу с использованием смеси 1:1 (об./об.) водного метиламина (40%) и метиламина в этаноле (33%). Спустя 90 минут при 45°C раствор разбавляли N,N-диметилформамидом (DMF) и добавляли триэтиламин-тригидрофторид (TEA.HF). После инкубирования при 45°C в течение 2 часов олигорибонуклеотиды осаждали с использованием 1 М NaOAc и смеси ацетона и этанола 4:1 (об./об.). Осадки растворяли в 1 М водном растворе NaCl и обессоливали с помощью гель-хроматографии. Это обеспечивалось применением системы очистки AKTA Purifier HPLC System (GE Healthcare, Фрайбург, Германия), оснащенной 5 мл колонкой HiTrap (GE Healthcare). Отличительные свойства олигорибонуклеотидов подтверждали с помощью масс-спектрометрии с использованием MALDI или масс-спектрометрии с использованием ESI. Для получения siRNA из отдельных цепей РНК эквимолярные количества комплементарных смысловой и антисмысловой цепей смешивали и проводили их гибридизацию в 20 мМ NaCl, 4 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 6,8. siRNA хранили замороженными до применения.

Пример 2. In vitro скрининг siRNA для SOD1 в отношении супрессии мРНК SOD1 человека

siRNA, нацеленные на SOD1 человека (описаны в таблице 3) анализировали в отношении ингибирования экспрессии эндогенной SOD1 в HeLa клетках с помощью анализа с использованием bDNA (разветвленная ДНК) для количественного определения мРНК SOD1. Результаты анализов с использованием двух доз использовали для выбора подгруппы дуплексов dsRNA для SOD1 для экспериментов по определению зависимости доза-эффект у 4 типов культивируемых клеток для расчета IC50.

Клеточная культура и трансфекция

HeLa клетки получали в ATCC (ATCC в партнерстве с LGC Standards, Везель, Германия) и культивировали в среде HAM F-12 (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), дополненной таким образом, чтобы она содержала 10% фетальной телячьей сыворотки (со сверхнизким содержанием IgG от GIBCO/Life Technologies) и 1% Pen/Strep (пенициллин/стрептомицин) (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), при 37°C в атмосфере с 5% CO2 в увлажняемом инкубаторе.

Для трансфекции siRNA HeLa клетки высевали с плотностью 19000-20000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты. Трансфекцию siRNA выполняли с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen/Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Для скрининга с двумя дозами использовали концентрации siRNA для SOD1, составляющие 1 нМ или 0,1 нМ. Эксперименты по определению зависимости доза-эффект выполняли с концентрациями siRNA для SOD1, составляющими 10, 2,5, 0,6, 0,16, 0,039, 0,0098, 0,0024, 0,0006, 0,00015 и 0,000038 нМ. Контрольные лунки трансфицировали siRNA для люциферазы, siRNA для Aha-1, siRNA для PLGF или контрольной смесью неродственных siRNA.

Анализы с использованием разветвленной ДНК - QuantiGene 2.0

Спустя 24 часа инкубирования с siRNA среду удаляли и клетки лизировали в 150 мкл лизирующей смеси (1 объем лизирующей смеси, 2 объема воды, не содержащей нуклеазы), затем инкубировали при 53°C в течение 60 минут. 80 мкл рабочего набора зондов для SOD1 (целевой ген), и 90 мкл рабочего набора зондов для GAPDH (эндогенный контроль), и 20 мкл или 10 мкл клеточного лизата затем добавляли на планшеты для захвата. Планшеты для захвата инкубировали при 55°C (для SOD1) и 53°C (для GAPDH) (примерно 16-20 часов). На следующие сутки планшеты для захвата промывали 3 раза по меньшей мере 300 мкл 1X промывочного буфера (вода, не содержащая нуклеазы, компонент 1 буфера и компонент 2 промывочного буфера) (после последнего промывания переворачивали планшет и промакивали его чистыми бумажными полотенцами). 100 мкл рабочего реактива для воздействия перед амплификацией добавляли в планшеты для захвата SOD1, которые запечатывали алюминиевой фольгой и инкубировали в течение 1 часа при 55°C. Спустя 1 час инкубирования стадию промывания повторяли, затем добавляли 100 мкл рабочего реактива для амплификации как в планшеты для захвата SOD1, так и GAPDH. Спустя 1 час инкубирования при 55°C (SOD1) или 53°C (GAPDH) повторяли стадии промывания и высушивания и добавляли 100 мкл меченого зонда. Планшеты для захвата инкубировали при 50°C (SOD1) или 53°C (GAPDH) в течение 1 часа. Планшеты затем промывали 1X промывочным буфером и сушили, а затем 100 мкл субстрата добавляли в планшеты для захвата. Люминисценцию считывали с использованием люминесцентного счетчика 1420 Luminescence Counter (WALLAC VICTOR Light, Perkin Elmer, Родгау-Югесхайм, Германия) после 30 минут инкубирования в темноте.

Анализ данных, полученных с помощью bDNA

Для каждой siRNA для SOD1 или контрольной siRNA трансфицировали четыре лунки в параллели, и отдельные экспериментальные точки собирали из каждой лунки. Для каждой лунки уровень мРНК SOD1 нормализовали к уровню мРНК GAPDH. Активность заданной siRNA для SOD1 выражали в процентах концентрации мРНК SOD1 (нормализованной к мРНК GAPDH) в обработанных клетках в сравнении с концентрацией мРНК SOD1 (нормализованной к мРНК GAPDH), усредненной по контрольным лункам.

В таблице 4 представлены результаты in vitro скрининга HeLa, при котором siRNA для SOD1, последовательности которых приведены в таблице 3, исследовались в концентрациях либо 1 нМ, либо 0,1 нМ. Среднее процентное содержание мРНК SOD1 (нормализованной к мРНК GAPDH), оставшейся в обработанных клетках в сравнении с контролями, а также стандартное отклонение, показаны в таблице 4 для каждой siRNA для SOD1. Ряд siRNA для SOD1 в концентрации 1 нМ были эффективны при снижении уровней мРНК SOD1 более чем на 80% в HeLa клетках. Более того, ряд siRNA для SOD1 в концентрации 0,1 нМ были эффективны при снижении уровней мРНК SOD1 более чем на 80% в HeLa клетках.

Таблица 4. Результаты in vitro скрининга с двумя дозами siRNA для SOD1 в HeLa клетках в отношении активности ингибирования экспрессии гена SOD1

Двенадцать наиболее активных siRNA для SOD1 в концентрации 0,1 нМ в HeLa клетках оценивали в экспериментах по определению зависимости доза-эффект. В таблице 5 представлены концентрации IC50, приводящие в результате к 50% супрессии мРНК SOD1 относительно контроля для этих двенадцати выбранных siRNA для SOD1 в HeLa клетках. Эти двенадцать siRNA для SOD1 были особенно сильнодействующими в этой экспериментальной системе, и проявляли значения IC50 от 1 до 8 pM.

Таблица 5. Результаты IC50 in vitro анализа siRNA для SOD1 в HeLa клетках в отношении активности ингибирования экспрессии гена SOD1

Данные определения зависимости доза-эффект от HeLa клеток, используемые для определения IC50 для этих двенадцати siRNA для SOD1, подробно представлены ниже в таблице 6. Все двенадцать siRNA, как было определено, имели IC50 порядка пМ в HeLa клетках. Данные IC50 для siRNA для SOD1 в таблице 5 представляют собой обобщение данных, представленных в таблице 6 ниже.

Таблица 6. Данные зависимости доза-эффект для 12 siRNA для SOD1 в HeLa клетках

Пример 3. In vitro скрининг выбранных siRNA для SOD1 в отношении экспрессии эндогенной мРНК SOD1 в SH-SY5Y клетках, U87 клетках и первичных астроцитах человека

SH-SY5Y клетки получали в ATCC (ATCC в партнерстве с LGC Standards, Везель, Германия) и культивировали в среде MEM в модификации Дульбекко (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), дополненной таким образом, чтобы она содержала 15% FCS (со сверхнизким содержанием IgG от GIBCO/Life Technologies), 1% L-глутамина (Biochrom GmbH, Берлин, Германия) и 1% Pen/Strep (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), при 37°C в атмосфере с 5% CO2 в увлажняемом инкубаторе.

U87MG клетки получали в ATCC (ATCC в партнерстве с LGC Standards, Везель, Германия) и культивировали в составленной ATCC минимальной среде Игла (ATCC в партнерстве с LGC Standards, Везель, Германия), дополненной таким образом, чтобы она содержала 10% FCS (со сверхнизким содержанием IgG от GIBCO/Life Technologies) и 1% Pen/Strep (Biochrom GmbH, Берлин, Германия), при 37°C в атмосфере с 5% CO2 в увлажняемом инкубаторе.

Первичные астроциты человека получали от LONZA (Lonza Sales Ltd, Базель, Швейцария) и культивировали в базовой среде ABM (Lonza Sales Ltd, Базель, Швейцария), дополненной набором AGM SingleQuot Kit (Lonza Sales Ltd, Базель, Швейцария), при 37°C в атмосфере с 5% CO2 в увлажняемом инкубаторе.

Трансфекцию SH-SY5Y клеток, U87MG клеток и первичных астроцитов человека двенадцатью выбранными siRNA (D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823, D-2858) и количественное определение уровней мРНК SOD1 и GAPDH с использованием bDNA осуществляли аналогично тому, как описано для HeLa клеток, за исключением того, что реактивы для трансфекции представляли собой Lipofectamine2000 (Invitrogen/Life Technologies) для SH-SY5Y клеток, RNAiMAX (Invitrogen/Life Technologies) для U87 клеток и Lipofectamine2000 (Invitrogen/Life Technologies) для первичных астроцитов человека.

Данные зависимости доза-эффект от SH-SY5Y клеток, U87MG клеток и первичных астроцитов человека, используемые для определения IC50 для этих двенадцати siRNA для SOD1 (D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823, D-2858), подробно представлены ниже в таблицах 7, 8 и 9, соответственно. Все двенадцать siRNA, как было определено, имели IC50 порядка пМ в U87 клетках.

Значения IC50 представлены в таблице 10. В первичных астроцитах человека IC50 были, в целом, выше, чем в SH-SY5Y и U87MG клетках.

Таблица 7. Данные зависимости доза-эффект для 12 siRNA для SOD1 в SH-SY5Y клетках

Таблица 8. Данные зависимости доза-эффект для 12 siRNA для SOD1 в U87MG клетках

Таблица 9. Данные зависимости доза-эффект для 12 siRNA для SOD1 в первичных астроцитах человека

Данные IC50 для siRNA для SOD1 в таблице 10 представляют собой обобщение данных, представленных в таблицах 7, 8 и 9.

Таблица 10. Результаты IC50 in vitro анализов siRNA для SOD1 в SH-SY5Y клетках, U87MG клетках и первичных астроцитах человека в отношении активности ингибирования экспрессии гена SOD1

Пример 4. Целенаправленное воздействие siRNA на SOD1

Дуплексы из сопровождающей цепи и направляющей цепи siRNA для SOD1, оказавшиеся эффективными, встраивали в векторы экспрессии с помощью методов генной инженерии и трансфицировали в клетки центральной нервной системы или линии нервных клеток. Даже если выступающий конец, используемый в исследовании нокдауна под действием siRNA, являлся каноническим dTdT для siRNA, выступающий конец в конструкциях может содержать любой динуклеотидный выступающий конец.

Используемые клетки могут представлять собой первичные клетки, или их можно получить из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS клеток).

Нокдаун SOD1 затем измеряли и осуществляли глубокое секвенирование для определения точных сопровождающей цепи и направляющей цепи, получаемых в результате процессинга из каждой конструкции, введенной в векторе экспрессии.

Соотношение направляющей цепи и сопровождающей цепи рассчитывали для определения эффективности нокдауна, например, обработки РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC).

N-конец секвенировали для определения сайта расщепления и для определения процента равномерного расщепления мишени. Ожидалось, что расщепление составит более 90 процентов.

HeLa клетки подвергали совместной трансфекции в параллельном исследовании для in vitro анализа нокдауна SOD1. Конструкцию для люциферазы использовали в качестве контроля для определения нецелевых эффектов.

Снова осуществляли глубокое секвенирование.

Пример 5. Последовательности сопровождающей цепи и направляющей цепи, нацеленные на SOD1

Согласно настоящему изобретению конструировали siRNA для SOD1. Они приведены в таблицах 11A и 11B. Сопровождающие цепи и направляющие цепи описаны в таблицах. В таблицах 11A и 11B составляющая «miR» в названии последовательности не обязательно соответствует нумерации последовательности генов miRNA (например, VOYmiR-101 является названием последовательности и не обязательно означает, что miR-101 является частью последовательности).

Пример 6. Конструкции siRNA для SOD1 в AAV-miRNA векторах

Дуплексы из сопровождающей цепи и направляющей цепи siRNA для SOD1, приведенные в таблице 11, встраивали с помощью методов генной инженерии в AAV-miRNA векторы экспрессии. Конструкция при перечислении от ITR к ITR в направлении от 5ʹ к 3ʹ содержит мутантный ITR, промотор (любой из промотора CMV, U6 или CB6 (который включает в себя энхансер CMVie, промотор CBA и интрон SV40), сопровождающая цепь и направляющая цепь (с петлей между сопровождающей цепью и направляющей цепью, 5ʹ-фланкирующим участком перед сопровождающей цепью и 3ʹ-фланкирующим участком после направляющей цепи) из таблицы 11, полиA из гена глобина кролика и ITR дикого типа. In vitro и in vivo исследования осуществляли для оценки эффективности AAV-miRNA векторов экспрессии.

Пример 7. Активность конструкций в HeLa клетках

Семь конструкций с siRNA для SOD1, описанных в примере 6 (VOYmiR-103, VOYmiR-105, VOYmiR-108, VOYmiR-114, VOYmiR-119, VOYmiR-120 и VOYmiR-127), и контроль в виде двухцепочечного вектора с mCherry трансфицировали в HeLa для исследования активности конструкций.

A. Активность сопровождающей цепи и направляющей цепи

Семь конструкций с siRNA для SOD1 и контроль в виде двухцепочечного вектора с mCherry трансфицировали в HeLa клетки. Спустя 48 часов оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Все семь из конструкций с siRNA для SOD1 показывали высокую активность направляющей цепи с 75-80% нокдауном и низкую или отсутствующую активность сопровождающей цепи. Направляющие цепи в векторах-кандидатах с siRNA для SOD1 показывали высокую активность, обеспечивая результат с 75-80% нокдауном SOD1, тогда как сопровождающие цепи демонстрировали незначительную активность или ее отсутствие.

B. Активность конструкций в отношении SOD1

Семь конструкций с siRNA для SOD1 и контроль в виде двухцепочечного вектора с mCherry (dsCherry) трансфицировали в HeLa клетки при MOI (множественность заражения) 1e4 вг/клетку, 1e3 вг/клетку или 1e2 вг/клетку. Спустя 72 часа оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Все семь из конструкций с siRNA для SOD1 показывали эффективный нокдаун при 1e3 вг/клетку. Большинство конструкций с siRNA для SOD1 показывали высокую активность (75-80% нокдаун), что показано на фиг. 1.

Пример 8. Активность конструкций в HEK клетках

Тридцать из конструкций с siRNA для SOD1, описанных в примере 6 (VOYmiR-102.860, VOYmiR-102.861, VOYmiR-102.866, VOYmiR-102.870, VOYmiR-102.823, VOYmiR-104.860, VOYmiR-104.861, VOYmiR-104.866, VOYmiR-104.870, VOYmiR-104.823, VOYmiR-109.860, VOYmiR-109.861, VOYmiR-109.866, VOYmiR-109.870, VOYmiR-109.823, VOYmiR-114.860, VOYmiR-114.861, VOYmiR-114.866, VOYmiR-114.870, VOYmiR-114.823, VOYmiR-116.860, VOYmiR-116.861, VOYmiR-116.866, VOYmiR-116.870, VOYmiR-116.823, VOYmiR-127.860, VOYmiR-127.861, VOYmiR-127.866, VOYmiR-127.870, VOYmiR-127.823) и контроль в виде VOYmiR-114 и двухцепочечного вектора с mCherry трансфицировали в клетки для исследования активности конструкций.

A. Активность сопровождающей цепи и направляющей цепи в HEK293

Тридцать конструкций и два контроля трансфицировали в HEK293T клетки. Спустя 24 часа оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Большинство из конструкций показывали высокую активность направляющей цепи (фиг. 2) и низкую или отсутствующую активность сопровождающей цепи (фиг. 3).

B. Активность сопровождающей цепи и направляющей цепи в HeLa

Тридцать конструкций и два контроля трансфицировали в HeLa клетки. Спустя 48 часов оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Большинство из конструкций показывали высокую активность направляющей цепи (фиг. 4) и низкую или отсутствующую активность сопровождающей цепи (фиг. 5).

C. Корреляция HeLa и HEK293

Нокдауны для тридцати конструкций были подобными у HeLa и HEK293 клеток. Тридцать конструкций показывали нокдаун для направляющей цепи для конструкций (см. фигуры 2 и 4). Большинство направляющих цепей в конструкциях показывали 70-90% нокдаун.

D. Выбор капсида

Лучшие конструкции из HeLa и HEK293 упаковывали в AAV и инфицированию ими подвергали HeLa. Для определения лучшего AAV для упаковки конструкций вектор с mCherry, упакованный либо в AAV2, либо в AAV-DJ8, инфицировали в HeLa при MOI 10 вг/клетку, 1e2 вг/клетку, 1e3 вг/клетку, 1e4 вг/клетку или 1e5 вг/клетку и экспрессию оценивали через 40 часов. AAV2 выбрали в качестве капсида для упаковки лучших конструкций.

E. Получение AAV2

Лучшие конструкции из HeLa и HEK293 упаковывали в AAV2 (1,6 т. о.), также упаковывали и контроль в виде двухцепочечного вектора с mCherry (dsmCherry). Упакованные конструкции подвергали очистке с использованием йодиксанола перед анализом. Титр AAV показан в таблице 12.

Таблица 12. Титр AAV

Влияние трансдукции на нокдаун SOD1 в HeLa клетках показано на фигуре 6. Кроме того, в HeLa клетках большая MOI (1,0E+04 по сравнению с 1,0E+05) не показывала повышенный нокдаун для каждой конструкции.

F. Активность конструкций в предшественниках двигательных нейронов человека (HMNP)

Лучшие 18 конструкций с pri-miRNA, которые описаны в примере 8E, и контроль с mCherry инфицировали в клетки-предшественники двигательных нейронов человека (HMNP) при MOI 10E5. Спустя 48 часов оценивали экспрессию эндогенной мРНК. Приблизительно половина конструкций давали более чем 50% сайленсинг SOD1 в HMNP, и 4 из них давали более чем 70% сайленсинг (фигура 7).

G. Выбор конструкции для in vivo исследований

Выбирали лучшие двенадцать конструкций, которые оказывали значительное влияние на целевую последовательность и незначительное влияние на кассету. Эти конструкции, упакованные в капсиды AAV-rh10, составляли для инъекции и вводили млекопитающим для изучения in vivo эффектов конструкций.

Пример 9. In vitro исследование конструкций

18 конструкций и контроль с mCherry, описанные в примере 8D, упакованные в AAV2, использовали для этого исследования. Для этого исследования HEK293T клетки (Fisher Scientific, кат. № HCL4517) в среде культивирования (500 мл DMEM/F-12 с добавкой GLUTAMAXTM (Life Technologies, кат. № 10565-018), 50 мл FBS (Life Technologies, кат. № 16000-044, партия:1347556), 5 мл раствора заменимых аминокислот в MEM (100x) (кат. № 11140-050) и 5 мл HEPES (1 М) (Life Technologies, кат. № 15630-080)), U251MG клетки (P18) (Sigma, кат. № 09063001-1VL) в среде культивирования (500 мл DMEM/F-12 с добавкой GLUTAMAXTM (Life Technologies, кат. № 10565-018), 50 мл FBS (Life Technologies, кат. № 16000-044, партия:1347556), 5 мл раствора заменимых аминокислот в MEM (100x) (кат. № 11140-050) и 5 мл HEPES (1 М) (Life Technologies, кат. № 15630-080)) или нормальные астроциты человека (HA) (Lonza, кат. № CC-2565) в среде культивирования (базовая среда ABM, 500 мл (Lonza, кат. № CC-3186), дополненной набором AGM SingleQuot Kit Suppl. и ростовыми факторами (Lonza, кат. № CC-4123)) использовали для исследования конструкций. Высевали HEK293T клетки (5×10E4 клеток/лунку в 96-луночном планшете), U251MG клетки (2×10E4 клеток/лунку в 96-луночном планшете) и HA клетки (2×10E4 клеток/лунку в 96-луночном планшете) и значение MOI, используемое для инфицирования клеток, составляло 1,0E+05. Спустя 48 часов клетки анализировали, и результаты показаны в таблице 13.

Таблица 13. Относительный уровень мРНК SOD1

Более чем 80% нокдаун наблюдали в HEK293T клетках для большинства конструкций. Более чем половина конструкций показывала более чем 80% нокдаун в U251MG клетках и в HA клетках.

Пример 10. Дозозависимое снижение уровня SOD1

Четыре из лучших 18 конструкций с pri-miRNA, которые описаны в примере 8E, и контроль с mCherry трансфицировали в клеточную линию астроцитов человека (U251MG) или первичные астроциты человека (HA) при MOI 1,0E+02, 1,0E+03, 1,0E+04, 1,0E+05 или 1,0E+06. Спустя 48 часов оценивали экспрессию эндогенной мРНК, и дозозависимый сайленсинг показан на фиг. 8 (U251MG) и фиг. 9 (HA). Для всех конструкций повышение дозы также коррелировало с повышением количества мРНК SOD1, которая подверглась нокдауну.

Пример 11. Длительность нокдауна SOD1

Две конструкции с pri-miRNA (VOYmiR-120 и VOYmiR-122), отрицательный контроль и положительный контроль с siRNA для SOD1 трансфицировали в клеточную линию астроцитов человека (U251MG). Относительное количество мРНК SOD1 определяли в течение 60 часов, как показано на фиг. 10. 70-75% нокдаун hSOD1 наблюдали в случае обеих конструкций с pri-miR после трансфекции с использованием нуклеофектора, причем наибольший нокдаун наблюдали во временном интервале 12-24 часа.

Пример 12. Нокдаун SOD1 и процентные соотношения цепей

VOYmiR-104 трансфицировали в HeLa клетки в концентрации 50 пМ, 100 пМ и 150 пМ и сравнивали с необработанными (UT) клетками. Относительное количество мРНК SOD1, процент направляющей цепи и процент сопровождающей цепи определяли через 36, 72, 108 и 144 часа, как показано на фиг. 11A-11C. Наиболее высокая концентрация (150 пМ) показывала наибольшее снижение экспрессии, но все три дозы показывали значительное снижение экспрессии SOD1.

Пример 13. Конструкции, нацеленные на SOD1

Разрабатывали конструкции для SOD1 собаки, и конструкции приведены в таблице 14. SOD1 собаки является на 100% консервативной с человеческой в участке, подвергающемся целенаправленному воздействию согласно настоящему изобретению. Последовательности сопровождающих цепей и направляющих цепей описаны в таблице. В таблице 14 составляющая «miR» в названии последовательности не обязательно соответствует нумерации последовательности генов miRNA (например, dVOYmiR-102 является названием последовательности и не обязательно означает, что miR-102 является частью последовательности).

Пример 14. Эффект положения модулирующих полинуклеотидов

A. Эффект в отношении титров вируса

Молекулу siRNA (VOYmiR-114 или VOYmiR-126) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 2400 нуклеотидов; scAAV) в шести разных положениях, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Титры вируса оценивали с использованием ПЦР TaqMan для 6 положений и для контроля (конструкция без модулирующего полинуклеотида; scAAV), и результаты показаны в таблице 15.

Таблица 15. Титры вируса

B. Эффект в отношении целостности генома

Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 2400 нуклеотидов; scAAV) в шести разных положениях, а также использовали контроль без модулирующего полинуклеотида (scAAV), как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Вирусные геномы экстрагировали из очищенных препаратов AAV и разгоняли на нейтральном агарозном геле. Усеченные геномы наблюдали во всех конструкциях, и примерный процент усеченных геномов (процент от общего числа) показан в таблице 16.

Таблица 16. Усеченные геномы

Положение 6 характеризовалось наибольшим числом усеченных геномов, в то время как положения 4 и 5 характеризовались наименьшим количеством усеченных геномов.

C. Эффект в отношении эффективности нокдауна

Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (AAV2) (размер генома 2400 нуклеотидов; scAAV) в шести разных положениях, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Трансдукцию HeLa клеток проводили при 1×104 вг/клетку, 1×103 вг/клетку и 1×102 вг/клетку. Экспрессию мРНК SOD1 (в виде % от контроля (eGFP)) определяли через 72 часа после инфицирования и результаты показаны в таблице 17.

Таблица 17. Экспрессия SOD1

Положение 3 характеризовалось наивысшей экспрессией мРНК SOD1 (в виде % от контроля), а положение 4 характеризовалось самой низкой экспрессией мРНК SOD1 (в виде % от контроля).

Пример 15. Эффект в отношении размера генома

A. Эффект в отношении титров вируса

Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 2 т. о.; scAAV) в положениях 1, 2, 5 и 6, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Сравнивали контроль в виде двухцепочечного вектора без молекулы siRNA (размер генома 1,6 т. о.; scAAV ctrl) и двухцепочечный вектор экспрессии (scAAV miR114; ITR (105 нуклеотидов) -промотор (~900 нуклеотидов)-модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA (158 нуклеотидов)- последовательность полиA (127 нуклеотидов) и ITR), а также контроль (eGFP; scAAV) без молекулы siRNA. Титры вируса оценивали с использованием ПЦР TaqMan, и результаты показаны в таблице 18.

Таблица 18. Титры вируса

Самые низкие титры вируса наблюдали с конструкцией в положении 5, а самые высокие - с конструкцией в положении 2.

B. Эффект в отношении целостности генома

Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 2 т. о.; scAAV) в положениях 1, 2, 5 и 6, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Сравнивали контроль в виде двухцепочечного вектора без молекулы siRNA (размер генома 1,6 т. о.; scAAV ctrl) и двухцепочечный вектор экспрессии (scAAV miR114; ITR (105 нуклеотидов) -промотор (~900 нуклеотидов)-модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA (158 нуклеотидов)- последовательность полиA (127 нуклеотидов) и ITR), а также контроль (eGFP; scAAV) без молекулы siRNA. Усеченные геномы наблюдали во всех конструкциях, и примерный процент усеченных геномов (процент от общего числа) показан в таблице 19.

Таблица 19. Усеченные геномы

Было определено, что у все конструкции имели некоторое количество усеченных геномов.

Проводили дополнительное исследование для определения эффекта разных молекул siRNA. VOYmiR-114 и VOYmiR-126 внедряли в отдельные векторы экспрессии (размер генома 1,6 т. о.; scAAV) в положении 3, как показано на фиг. 12. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. В случае конструкции с VOYmiR-114 расстояние между 5ʹ-концом векторного генома (1526 нуклеотидов) и центром модулирующего полинуклеотида (серединой гибкой петли) составляло 1115 нуклеотидов. В случае конструкции с VOYmiR-126 расстояние между 5ʹ-концом векторного генома (1626 нуклеотидов) и центром модулирующего полинуклеотида (серединой гибкой петли) составляло 1164 нуклеотидов.

В случае конструкции с VOYmiR-114 титр вируса (вг на 15 см чашку) составлял приблизительно 1,1E+11. В случае конструкции с VOYmiR-126 титр вируса с зондом-интроном (вг на 15 см чашку) составлял приблизительно 1,2E+12. У контроля он составлял приблизительно 2,1E+11 (вг на 15 см чашку). VOYmir-114 имел приблизительно 20% усеченных геномов, VOYmiR-126 имел приблизительно 15% усеченных геномов, и контроль имел приблизительно 5% усеченных геномов.

Пример 16. Эффект одноцепочечных конструкций

A. Эффект в отношении титров вируса

Полинуклеотид siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 4,7 т. о.; ssAAV) в положениях 1, 3 и 5, как показано на фиг. 12, также исследовали контроль без полинуклеотида siRNA (размер генома 2 т. о.; ssAAV). На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Титры вируса оценивали с использованием ПЦР TaqMan, и результаты показаны в таблице 20.

Таблица 20. Титры вируса

Положение 3 показывало наибольшие титры вируса, за ним следовало положение 1, а затем положение 5.

B. Эффект в отношении целостности генома

Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 4,7 т. о.; ssAAV) в положениях 1, 3 и 5, как показано на фиг. 12, также исследовали контроль без модулирующего полинуклеотида (размер генома 2 т. о.; ssAAV). На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Вирусные геномы экстрагировали из очищенных препаратов AAV и разгоняли на нейтральном агарозном геле. Усеченные геномы наблюдали во всех конструкциях, и примерный процент усеченных геномов (процент от общего числа) показан в таблице 21.

Таблица 21. Усеченные геномы

Положение 5 характеризовалось наибольшим числом усеченных геномов, в то время как положение 3 характеризовалось наименьшим количеством усеченных геномов.

C. Эффект в отношении эффективности нокдауна

Молекулу siRNA (VOYmiR-114) внедряли в вектор экспрессии (размер генома 4,7 т. о.; ssAAV) в положениях 1, 3 и 5, как показано на фиг. 12, и присутствовал контроль в виде одноцепочечного вектора без молекулы siRNA (размер генома 2 т. о.; ssAAV ctrl), контроль в виде двухцепочечного вектора без молекулы siRNA (размер генома 1,6 т. о.; scAAV ctrl) и двухцепочечный вектор экспрессии (размер генома 2,4 т. о.; scAAV miR114) с молекулой siRNA. На фиг. 12 «ITR» представляет собой инвертированный концевой повтор, «I» представляет собой интрон, «P» представляет собой полиA, и «MP» представляет собой модулирующий полинуклеотид, содержащий молекулу siRNA. Трансдукцию HeLa клеток проводили при 1×104 вг/клетку, 1×103 вг/клетку и 1×102 вг/клетку. Экспрессию мРНК SOD1 (в виде % от контроля (eGFP)) определяли через 72 часа после инфицирования и результаты показаны в таблице 22.

Таблица 22. Экспрессия SOD1

Положение 3 характеризовалось наивысшей экспрессией мРНК SOD1 (в виде % от контроля), затем следовало положение 1, и у одноцепочечных конструкций самая низкая экспрессия мРНК SOD1 (в виде % от контроля) была в положении 5. Ни одна из одноцепочечных конструкций не характеризовалась эффективностью нокдауна, которая была больше чем у контроля в виде двухцепочечного вектора с полинуклеотидом siRNA.

Пример 17. Нокдаун SOD1 in vivo

Для оценки in vivo биологической активности pri-miRNA самокомплементарные pri-miRNA (VOYmiR-114.806, VOYmiR127.806, VOYmiR102.860, VOYmiR109.860, VOYmiR114.860, VOYmiR116.860, VOYmiR127.860, VOYmiR102.861, VOYmiR104.861, VOYmiR109.861, VOYmiR114.861, VOYmiR109.866, VOYmiR116.866 или VOYmiR127.866) упаковывали в AAV-DJ с промотором CBA.

У мышей эти упакованные pri-miRNA или контроль, содержащий только среду (фосфатно-солевой буферный раствор с 5% сорбита и 0,001% F-68), вводили посредством 10-минутной интрастриарной инфузии. Самки или самцы Tg(SOD1)3Cje/J мышей (Jackson Laboratory, Бар Харбор, Мэн), у которых экспрессировалась SOD1 человека и которые имели массу тела примерно 20-30 г, получали односторонние инъекции 5 мкл исследуемого препарата, которые были нацелены на стриатум (+0,5 мм в передне-заднем направлении,+2 мм в срединно-боковом направлении относительно брегмы; 3,8 мм в спинно-брюшном направлении относительно поверхности черепа). Исследуемые препараты вводили инъекцией (5 животных на исследуемый препарат) со скоростью 0,5 мкл/мин. с использованием предварительно заполненных, регулируемых насосом микрошприцов Hamilton (модель 1701, 10 μмкл) с иглами 33 калибра. Через 1, 2, 3, 4 или 6 недель после инъекции животных умерщвляли, головной мозг удаляли и ипсилатеральный стриатум, охватывающий места инфузии из 1 мм слоя в коронарной проекции, а также ткань стриатума из смежных 1 мм слоев в коронарной проекции, вырезали и подвергали быстрой заморозке. Образцы ткани мышей лизировали и проводили количественное определение уровней белка SOD1 человека и уровней мРНК SOD1 и GAPDH мыши (mGAPDH). Уровни белка SOD1 количественно определяли с помощью ELISA (eBioscience (Affymetrix, Сан-Диего, Калифорния)) и уровни общего белка количественно определяли с помощью BCA анализа (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Для каждого образца ткани уровень белка SOD1, нормализованный к общему белку, рассчитывали в виде среднего значения от 2 определений. Эти нормализованные уровни белка SOD1 дополнительно нормализовали к группе, получавшей среду, затем усредняли с получением среднего значения для группы (подвергавшейся обработке). Уровни мРНК SOD1 и mGAPDH количественно определяли с помощью qRT-PCR (количественная ПЦР в реальном времени). Для каждого образца ткани соотношение SOD1/mGAPDH (нормализованный уровень мРНК SOD1) рассчитывали в виде среднего значения от 3 определений. Эти соотношения затем усредняли с получением среднего значения для группы (подвергавшейся обработке). Эти средние значения для групп дополнительно нормализовали к группе, получавшей среду.

У приматов, за исключением человека, исследуемые препараты (1×1013-3×1013вг с pri-miRNA, упакованных в AAV-DJ с промотором CBA) или среду вводили посредством интратекальной струйной инъекции в позвоночный отдел. Самкам яванского макака (Macaca fascicularis, CR Research Model Houston, Хьюстон, Техас) с массой тела примерно 2,5-8,5 кг имплантировали один интратекальный катетер, причем кончик катетера располагался в поясничном отделе позвоночника. Вводили исследуемые препараты (4 животных на исследуемый препарат), причем введение предусматривало три струйные инъекции 1 мл (1 мл/минуту) с интервалами примерно 60 минут. Через 4-6 недель после введения животных умерщвляли и выбранные ткани собирали для биоаналитической и гистологической оценки. Уровни белка SOD1 и мРНК оценивали в отношении супрессии после обработки pri-miRNA, упакованной в AAV-DJ с промотором CBA в сравнении с группой, получавшей среду.

Пример 18. Нокдаун SOD1 in vivo с использованием VOYmiR-114.806

У Tg(SOD1)3Cje/J мышей VOYmiR-114.806 была упакована в AAVDJ с промотором CBA, как описано в примере 17. Мышам вводили посредством одностороннего интрастриатарного введения дозу 3,7×109 вг. Спустя 1 или 2 недели не наблюдалось существенного снижения нормализованных уровней белка SOD1; нормализованные уровни белка SOD1 составляли 98+11% (стандартное отклонение) и 98+10% от уровня у контрольной группы, получавшей среду, спустя 1 и 2 недели, соответственно. К 3 неделе VOYmiR-114.806 снижала нормализованный уровень белка SOD1 до 84+9,0% относительно контрольной группы, получавшей среду, что было статистически значимым (p<0,05, однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным анализом с использованием критерия Даннетта). К 4 и 6 неделям VOYmiR-114.806 снижала нормализованный уровень белка SOD1 до 73+7,9% (p < 0,0001) и 75+7,4% (p<0,0001), соответственно, от уровня у контрольной группы, получавшей среду. Эти результаты демонстрируют, что VOYmiR-114.806, упакованная в AAV-DJ с промотором CBA, является эффективной in vivo в понижающей модуляции уровней белка SOD1. Кроме того, эти результаты демонстрируют, что суммарная интрастриарная доза от 3,7×109 вг с VOYmiR-114.806, упакованной в AAVDJ с промотором CBA, приводила в результате к значительной понижающей модуляции уровней белка SOD1.

Хотя настоящее изобретение было описано в некотором объеме и с некоторыми подробностями в отношении нескольких описанных вариантов осуществления, не предполагается, что оно должно ограничиваться любыми такими подробностями или вариантами осуществления или любым конкретным вариантом осуществления, а его следует толковать с учетом прилагаемой формулы изобретения для того, чтобы обеспечить наиболее широкую возможную интерпретацию таких пунктов формулы изобретения в связи с уровнем техники и, следовательно, чтобы эффективно охватить предусмотренный объем настоящего изобретения.

Все публикации, патентные заявки, патенты и другие источники, упомянутые в данном документе, включены во всей своей полноте посредством ссылки. В случае конфликта настоящее описание, в том числе определения, будет иметь преимущество. Кроме того, заголовки разделов, материалы, способы и примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен векторный геном на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для ингибирования или подавления экспрессии гена супероксиддисмутазы 1 (SOD1) в клетке млекопитающего, а также соответствующая частица, способ ингибирования экспрессии гена, фармацевтическая композиция, способ лечения бокового амиотрофического склероза и дуплекс siРНК. Изобретения могут быть использованы в медицине для расширения спектра средств борьбы с боковым амиотрофическим склерозом. 7 н. и 16 з.п. ф-лы, 12 ил., 22 табл., 18 пр.

Формула