Получение терминально дифференцированных дофаминергических нейронов из эмбриональных стволовых клеток человека - RU2005131581A

Реферат

1. Дифференцированная клеточная популяция в культуре in vitro, полученная путем дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток приматов, где по крайней мере 60% дифференцированных клеток являются дофаминергическими нейронами.

2. Клеточная популяция по п.1, где плюрипотентные стволовые клетки приматов являются эмбриональными стволовыми клетками человека.

3. Дифференцированная клеточная популяция в культуре in vitro, полученная путем дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток приматов, где по крайней мере 60% клеток экспрессируют тирозингидроксилазу.

4. Клеточная популяция по п.3, где плюрипотентные стволовые клетки приматов являются эмбриональными стволовыми клетками человека.

5. Способ получения дифференцированной популяции нейронов из плюрипотентных стволовых клеток приматов, предусматривающий следующие стадии:

(а) рост культуры плюрипотентных стволовых клеток приматов;

(b) культивирование плюрипотентных стволовых клеток и селекцию нейрональных клеток-предшественниц, положительных по нестину;

(с) сортировка нестин-положительных нейрональных клеток-предшественниц для обогащения NCAM-положительными клетками;

(d) дифференцировка нестин-положительных, NCAM-положительных клеток и получение дифференцированной популяции нейронов путем культивирования клеток в среде для дифференцировки, которая содержит TGF-в3 или интерлейкин-1или оба этих фактора.

6. Способ по п.5, где плюрипотентные стволовые клетки получали с помощью метода лазерного разрушения.

7. Способ по п.5, где плюрипотентные стволовые клетки являются эмбриональными стволовыми клетками человека.

8. Способ по п.7, где эмбриональные стволовые клетки человека выделяли с помощью метода лазерного разрушения.

9. Способ по п.5, где дифференцированная нейрональная клеточная популяция содержит по крайней мере около 60% дофаминергических нейронов.

10. Способ по п.5, где дифференцированная нейрональная клеточная популяция содержит по крайней мере около 30% серотонинергических нейронов.

11. Способ по п.5, где дифференцированная нейрональная клеточная популяция содержит по крайней мере около 25% олигодендроцитов.

12. Способ по п.5, предусматривающий дополнительное культивирование плюрипотентных стволовых клеток на стадии (b) для образования эмбриоидных тел.

13. Способ по п.12, где эмбриоидные тела культивируют для селекции нейрональных клеток-предшественниц, которые являются положительными по нестину.

14. Способ по п.5, где нейрональные клетки-предшественницы, которые являются положительными по нестину, отбирают путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде без сыворотки.

15. Способ по п.14, где средой без сыворотки является без сывороточная среда ITSFn.

16. Способ по п.14, где среда без сыворотки включает один или несколько растворимых факторов, выбранных из группы, включающей инсулин, селенит натрия, трансферрин и фибронектин.

17. Способ по п.16, где среда без сыворотки включает инсулин, селенит натрия, трансферрин и фибронектин.

18. Способ по п.13, где нейрональные клетки-предшественницы, которые являются положительными по нестину, отбирают путем культивирования эмбриоидных тел в среде без сыворотки.

19. Способ по п.18, где средой без сыворотки является среда без сыворотки ITSFn.

20. Способ по п.18, где среда без сыворотки содержит один или несколько растворимых факторов, выбранных из группы, включающей инсулин, селенит натрия, основной фактор роста фибробластов, трансферрин и фибронектин.

21. Способ по п.20, где среда без сыворотки содержит инсулин, селенит натрия, трансферрин и фибронектин.

22. Способ по п.21, где нейрональные клетки-предшественницы содержат по крайней мере около 95% нестин-положительных клеток.

23. Способ по п.5, где нестин-положительные нейрональные клетки-предшественницы на стадии (с) сортируют для обогащения NCAM-положительными клетками с помощью магнитной клеточной сортировки (MACS).

24. Способ по п.23, где нестин-положительные нейрональные клетки-предшественницы содержат по крайней мере около 50-60% NCAM-положительных клеток.

25. Способ по п.5, предусматривающий дополнительный рост нестин-положительных, NCAM-положительных нейрональных клеток-предшественниц на стадии (с) в среде для роста.

26. Способ по п.25, где среда для роста содержит один или несколько растворимых факторов, выбранных из группы, включающей инсулин, селенит натрия, трансферрин, ламинин, путресцин, прогестерон, основной фактор роста фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста (EGF), "звуковой ежик" (SHH), фактор роста фибробластов-8 (FGF-8) и мозговой нейротрофический фактор (BDNF).

27. Способ по п.26, где клетки выращивают в среде для роста в течение 6-10 дней.

28. Способ по п.26, где клетки культивируют и периодически пассируют для удвоения или увеличения в несколько раз популяции.

29. Способ по п.26, где клетки хранятся замороженными в жидком азоте.

30. Способ по п.5, где среда для дифференцировки содержит нейробазальную среду, включающую эмбриональную сыворотку теленка, В27, аскорбиновую кислоту и N-ацетилцистеин.

31. Способ по п.5, где среда для дифференцировки дополнительно включает один или несколько агентов для дифференцировки, выбранных из группы, включающей аскорбиновую кислоту, N-ацетилцистеин, глиальный нейротрофический фактор (GDNF), дибутирил-циклический АМФ (db-cAMP), мозговой нейротрофический фактор (BDNF), неутурин, белок "звуковой ежик" (SHH) и фактор роста фибробластов-8 (FGF-8).

32. Способ по п.5, где нестин-положительные, NCAM-положительные клетки выращивают в среде для дифференцировки в течение 30-50 дней.

33. Способ получения дофаминергических нейронов из нейрональных клеток-предшественниц, предусматривающий обогащение нейрональных клеток-предшественниц клетками, которые являются положительными по нестину, и дифференцировку нестин-положительных клеток с получением дофаминергических нейронов путем культивирования клеток в присутствии TGF-в3 или интерлейкина-1или обоих этих факторов.

34. Способ по п.33, где по крайней мере около 40% нестин-положительных клеток дифференцируются в дофаминергические нейроны.

35. Способ по п.33, дополнительно предусматривающий обогащение нейрональных клеток-предшественниц клетками, положительными по NCAM.

36. Способ по п.34, где нестин-положительные, NCAM-положительные клетки дифференцируются с получением дофаминергических нейронов.

37. Способ по п.36, где по крайней мере 60% нестин-положительных, NCAM-положительных клеток дифференцируются в дофаминергические нейроны.

38. Способ получения серотонинергических нейронов из нейрональных клеток-предшественниц, предусматривающий обогащение нейрональных клеток-предшественниц клетками, положительными по нестину и NCAM, и дифференцировку нестин-положительных, NCAM-положительных клеток с получением серотонинергических нейронов путем культивирования клеток в присутствии TGF-или интерлейкина-1или обоих этих факторов.

39. Способ по п.38, где по крайней мере около 30% нестин-положительных, NCAM-положительных клеток дифференцируются в серотонинергические нейроны.

40. Способ лечения пациентов с нейродегенеративными расстройствами и неврологическими заболеваниями, предусматривающий следующие стадии:

(а) рост культуры плюрипотентных стволовых клеток приматов;

(b) культивирование плюрипотентных стволовых клеток для отбора нейрональных клеток-предшественниц, которые являются положительными по нестину;

(с) сортировку нестин-положительных нейрональных клеток-предшественниц для обогащения NCAM-положительными клетками;

(d) дифференцировку нестин-положительных, NCAM-положительных клеток с получением популяции дифференцированных нервных клеток путем культивирования клеток в среде для дифференцировки, которая включает TGF-или интерлейкин-1или оба этих фактора;

(е) трансплантацию терапевтически эффективных количеств дифференцированной нервной клеточной популяции в центральную нервную систему пациента.

41. Способ по п.40, где плюрипотентные стволовые клетки приматов являются эмбриональными клетками человека.

42. Способ по п.40, дополнительно предусматривающий выделение дофаминергических нейронов из популяции дифференцированных нервных клеток и введение дофаминергических нейронов пациенту.

43. Способ по п.40, где нейродегенеративными расстройствами и неврологическими заболеваниями являются заболевания, выбранные из группы, включающей болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, хорею Гентингтона, повреждение спинного мозга, амиотрофический боковой склероз (ALS), эпилепсию, инсульт и ишемию.

44. Способ по п.40, где популяцию дифференцированных нейрональных клеток трансплантируют в мозг пациента.