Композиции, образующие перкислоту - RU2581906C2

Чертежи

Показать все 114 чертежа(ей)

Описание

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка притязает на приоритет заявки на патент США № 61/577499, поданной 19 декабря 2011 г., которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Уровень техники

Существует потребность в отбеливающих полосках, предназначенных для использования в домашних условиях, которые характеризуются более низким общим содержанием пероксида и при этом обладают более высокой отбеливающей способностью.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к отбеливающим полоскам, содержащим гранулированный отбеливающий ингредиент в комбинации с ферментом, обладающим пергидролитической активностью (“пергидролаза”), который включает консервативный структурный фрагмент семейства карбогидрат-эстераз 7 и донор ацильной группы, благодаря чему в процессе использования полоски пероксид, высвобождаемый гранулированным отбеливающим ингредиентом, взаимодействует с донором ацильной группы в присутствии пергидролазы с образованием перкислоты в непосредственной близости от зубов без значительного разбавления наполнителями препарата, что обеспечивает лучшее отбеливание зубов при значительно меньших общих количествах пероксида.

Полоски включают однослойную или многослойную (например, состоящую из двух слоев) адгезивную пленку, которая, гидратируя в присутствии воды или слюны, становится достаточно адгезивной и прилипает к зубам. Гранулированный отбеливающий ингредиент нанесен на пленку со стороны, контактирующей с зубами. В процессе использования полоски отбеливающий ингредиент непосредственно соприкасается с зубами (то есть располагается между зубами и адгезивным слоем). Гранулы высвобождают пероксид, быстро растворяющийся в воде. Отбеливающий ингредиент может быть необязательно покрыт быстро растворяющимся веществом, таким как сульфат натрия, кукурузный крахмал или аравийская камедь. На полоски может быть необязательно нанесен второй слой, позволяющий продлить время воздействия. Указанный второй слой может быть нерастворимым в воде, что требует удаления полоски после воздействия, или растворимым в воде, что вызывает растворение полоски после достаточного воздействия. Далее полоска включает пергидролазу (фермент, способный катализировать взаимодействие сложного эфира карбоновой кислоты и пероксида водорода с образованием перкислоты), которая также может быть нанесена в виде гранул на поверхность пленки, и донор ацильной группы, например, выбираемый из карбоновых кислот и ацильных соединений, таких как триацетин или гексаацетат сорбита, который взаимодействует с источником пероксида на полоске в присутствии пергидролазы с образованием перкислоты, усиливающей отбеливающее действие полоски.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к отбеливающей зубы полоске, включающей двухстороннюю гидратируемую адгезивную пленку, на одну сторону которой нанесен гранулированный отбеливающий ингредиент, при этом отбеливающая зубы полоска далее включает нижеследующие вещества, которые находятся внутри или снаружи пленки либо нанесены на одну сторону пленки в виде гранул:

а) фермент, обладающий пергидролитической активностью и содержащий сигнатурный фрагмент семейства карбогидрат-эстераз 7 (СЕ-7), соответствующий эталонной последовательности SEQ ID NO:1, который включает:

i) фрагмент RGQ в положениях, соответствующих положениям 118-120 SEQ ID NO:1;

ii) фрагмент GXSQG в положениях, соответствующих положениям 186-190 SEQ ID NO:1, и

iii) фрагмент НЕ в положениях, соответствующих положениям 303-304 SEQ ID NO:1;

b) по меньшей мере один субстрат донора ацильной группы, выбираемый из группы, состоящей из:

i) сложных эфиров формулы

[X]_mR_5,

где Х означает сложноэфирную группу формулы R₆C(O)O;

R₆ означает C1-C7 гидрокарбильную часть с линейной, разветвленной или циклической структурой, необязательно замещенную гидроксильными группами или С1-С4 алкоксильными группами, при этом R₆, означающий С2-С7 часть, необязательно имеет одну или несколько простых эфирных связей;

R₅ означает С1-С6 гидрокарбильную часть с линейной, разветвленной или циклической структурой, пятичленную циклическую гетероароматическую часть или шестичленную циклическую ароматическую или гетероароматическую часть, необязательно замещенную гидроксильными группами, при этом каждый атом углерода в R₅ независимо включает не более одной гидроксильной группы, не более одной сложноэфирной группы или группы карбоновой кислоты и R₅ необязательно включает одну или несколько простых эфирных связей;

m является целым числом от 1 до числа атомов углерода в R₅, и растворимость указанных сложных эфиров в воде равна по меньшей мере 5 частям на миллион при 25°С;

ii) глицериды формулы:

где R₁ означает С1-С7 алкил с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или С1-С4 алкоксильной группой, R₃ и R₄ независимо означают Н или R₁C(O);

iii) один или несколько сложных эфиров формулы:

где R₁ означает С1-С7 алкил с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или С1-С4 алкоксильной группой, и R₂ означает С1-С10 алкил с прямой или разветвленной цепью, алкенил, алкинил, арил, алкиларил, алкилгетероарил, гетероарил, (СН₂СН₂О)_nили (СН₂СН(СН₃)-О)_nH, и n равно 1-10;

iv) ацетилированные сахариды, выбираемые из группы, состоящей из ацетилированных моносахаридов, ацетилированных дисахаридов и ацетилированных полисахаридов:

гидратируемая адгезивная пленка при гидратации высвобождает пероксид водорода из гранулированного отбеливающего ингредиента и указанный фермент катализирует образование эффективного количества перкислоты.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу отбеливания зубов, который включает получение упаковочной системы, содержащей отбеливающую зубы полоску по любому из вышеуказанных пунктов, удаление отбеливающей зубы полоски из упаковочной системы и осуществление контактирования отбеливающей зубы полоски с зубами в течение периода времени, достаточного для отбеливания зубов, при этом отбеливающая зубы полоска гидратирует в присутствии влаги, находящейся в полости рта или на поверхности зубов, после стадии (b), но до стадии (с).

Другие области применения настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже подробного описания изобретения. Следует отметить, что подробное описание изобретения и конкретные примеры, хотя и относятся к предпочтительному варианту осуществления изобретения, предназначены только для иллюстрации изобретения и не ограничивают объем изобретения.

Краткое описание биологических последовательностей

Нижеследующие последовательности соответствуют разделу 37 Свода федеральных правил, §§ 1.821-1.825 (“Требования к заявкам на патенты, содержащим описания нуклеотидных последовательностей и/или аминокислотных последовательностей - Правила представления последовательностей”), совместимы со стандартом ST.25 (2009) Всемирной организации интеллектуальной собственности (WIPO) и отвечают требованиям, предъявляемым к списку последовательностей, Европейской патентной конвенции (ЕРС) и Договора о патентной кооперации (РСТ), правила 5.2 и 49.5(а-bis), раздел 208 и приложение С административных инструкций. Символы и форма представления нуклеотидных и аминокислотных последовательностей соответствуют правилам, изложенным в разделе 37 Свода федеральных правил, § 1.822.

SEQ ID NO:1 является аминокислотной последовательностью варианта пергидролазы Thermotoga maritima C277S.

SEQ ID NO:2 является аминокислотной последовательностью гибридного белка, включающего вариант пергидролазы Thermotoga maritima C277S, связанной с доменом связывания с зубами (также известной как “EZ-7” в публикации международной заявки на патент № WO 2012/087970 A2, Butterick et al.).

SEQ ID NO:3 является последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей деацетилазу цефалоспорина С из Bacillus subtilis ATCC® 31954™.

SEQ ID NO:4 является аминокислотной последовательностью деацетилазы цефалоспорина С из Bacillus subtilis ATCC® 31954™.

SEQ ID NO:5 является аминокислотной последовательностью деацетилазы цефалоспорина С из Bacillus subtilis, штамм 168 подвида subtilis.

SEQ ID NO:6 является аминокислотной последовательностью деацетилазы цефалоспорина С из B. subtilis ATCC® 6633™.

SEQ ID NO:7 является аминокислотной последовательностью деацетилазы цефалоспорина С из B. licheniformis ATCC® 14580™.

SEQ ID NO:8 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы из B. pumilus PS213.

SEQ ID NO:9 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы из Clostridium thermocellum ATCC® 27405™.

SEQ ID NO:10 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы из Thermotoga neapolitana.

SEQ ID NO:11 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы из Thermotoga maritima MSB8.

SEQ ID NO:12 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы из Thermoanaerobacterium sp. JW/SL YS485.

SEQ ID NO:13 является аминокислотной последовательностью деацетилазы цефалоспорина С из Bacillus halodurans C-125.

SEQ ID NO:14 является аминокислотной последовательностью деацетилазы цефалоспорина С из Bacillus clausii KSM-K16.

SEQ ID NO:15 является аминокислотной последовательностью варианта ацетилксиланэстеразы Thermotoga neapolitana из публикации заявки на патент США № 2010-0087529 (которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки), где остаток Хаа в положении 277 является Ala, Val, Ser или Thr.

SEQ ID NO:16 является аминокислотной последовательностью варианта ацетилксиланэстеразы Thermotoga maritima MSB8 из публикации заявки на патент США № 2010-0087529, где остаток Хаа в положении 277 является Ala, Val, Ser или Thr.

SEQ ID NO:17 является выведенной аминокислотной последовательностью варианта ацетилксиланэстеразы Thermotoga lettingae из публикации заявки на патент США № 2010-0087529, где остаток Хаа в положении 277 является Ala, Val, Ser или Thr.

SEQ ID NO:18 является аминокислотной последовательностью варианта ацетилксиланэстеразы Thermotoga petrophila из публикации заявки на патент США № 2010-0087529, где остаток Хаа в положении 277 является Ala, Val, Ser или Thr.

SEQ ID NO:19 является аминокислотной последовательностью варианта ацетилксиланэстеразы Thermotoga sp. RQ2, выделенного из “RQ2(a)”, из публикации заявки на патент США № 2010-0087529, где остаток Хаа в положении 277 является Ala, Val, Ser или Thr.

SEQ ID NO:20 является аминокислотной последовательностью варианта ацетилксиланэстеразы Thermotoga sp. RQ2, выделенного из “RQ2(b)”, из публикации заявки на патент США № 2010-0087529, где остаток Хаа в положении 278 является Ala, Val, Ser или Thr.

SEQ ID NO:21 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы Thermotoga lettingae.

SEQ ID NO:22 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы Thermotoga petrophila.

SEQ ID NO:23 является аминокислотной последовательностью первой ацетилксиланэстеразы из Thermotoga sp. RQ2, описанной как “RQ2(a)”.

SEQ ID NO:24 является аминокислотной последовательностью второй ацетилксиланэстеразы из Thermotoga sp. RQ2, описанной как “RQ2(b)”.

SEQ ID NO:25 является аминокислотной последовательностью деацетилазы цефалоспорина С Thermoanearobacterium saccharolyticum.

SEQ ID NO:26 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы из Lactococcus lactis (номер доступа GENBANK® АВХ75634.1).

SEQ ID NO:27 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы из Mesorhizobium loti (номер доступа GENBANK® ВАВ53179.1).

SEQ ID NO:28 является аминокислотной последовательностью ацетилксиланэстеразы из Geobacillus stearothermophilus (номер доступа GENBANK® AAF70202.1).

SEQ ID NO:29-163 являются аминокислотными последовательностями пептидов, обладающих сродством к поверхности полости рта.

SEQ ID NO:164-177 являются аминокислотными последовательностями пептидных линкеров/спейсеров.

SEQ ID NO:178-197 являются аминокислотными последовательностями разных целенаправленных гибридных конструкций пергидролазы, включающих пергидролитический фермент, связанный пептидным линкером со связывающим доменом, обладающим сродством к поверхности полости рта (см. публикацию международной заявки на патент № WO 2012/087970 A2, Butterick et al.).

Подробное описание изобретения

Приведенное ниже описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения является по сути иллюстративным и никоим образом не ограничивает изобретение или его применения.

В использованном здесь значении форма единственного числа элемента или компонента по настоящему изобретению не ограничивает количество элементов или компонентов. Поэтому форму единственного числа следует читать как один или по меньшей мере один, при этом форма единственного числа также включает множественное число за исключением случаев очевидного использования единственного числа.

В использованном здесь значении термин ”включающий” означает наличие указанных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, приведенных в формуле изобретения, но не исключает наличия или добавления одного или нескольких других признаков, целых чисел, стадий, компонентов или групп. Термин “включающий” означает варианты, определяемые терминами “по существу состоящий из” и “состоящий из”. Аналогичным образом термин “по существу состоящий из” включает варианты, определяемые термином “состоящий из”.

В использованном здесь значении термин “примерно”, модифицирующий количество использованного ингредиента или реагента, означает варьирование количества, выраженного числовым значением, которое может иметь место, например, при использовании обычных методов измерения и работы с жидкостями, применяемых для получения концентратов или растворов, в результате возникновения непреднамеренной ошибки, различий в производственном процессе, источнике или чистоте ингредиентов, использованных при создании композиций, методах и тому подобного. Термин “примерно” также означает количества, отличающиеся из-за разных условий уравновешивания композиции вследствие использования определенной исходной смеси. Независимо от использования термина “примерно” в формуле изобретения представлены эквиваленты указанных количеств.

В указанные диапазоны входят все значения с возможностью комбинирования. Например, диапазон “1-5” включает диапазоны “1-4”, “1-3”, “1-2”, “1-2 и 4-5”, “1-3 и 5” и тому подобные.

В использованном здесь значении термины “субстрат”, “приемлемый субстрат”, “донор ацильной группы” и “субстрат сложного эфира карбоновой кислоты” взаимозаменяемо означают:

(а) один или несколько сложных эфиров формулы:

[X]_mR₅,

где Х означает сложноэфирную группу формулы R₆C(O)O;

R₆ означает C1-C7 гидрокарбильную часть с линейной, разветвленной или циклической структурой, необязательно замещенную гидроксильной группой или С1-С4 алкоксильной группой, при этом R₆, означающий С2-С7 часть, необязательно имеет одну или несколько простых эфирных связей;

R₅ означает С1-С6 гидрокарбильную часть с линейной, разветвленной или циклической структурой, пятичленную циклическую гетероароматическую часть или шестичленную циклическую ароматическую или гетероароматическую часть, необязательно замещенную гидроксильной группой, при этом каждый атом углерода в R₅ включает не более одной гидроксильной группы или не более одной сложноэфирной группы и R₅ необязательно включает одну или несколько простых эфирных связей;

m является целым числом от 1 до числа атомов углерода в R₅, и растворимость одного или нескольких указанных сложных эфиров в воде равна по меньшей мере 5 частям на миллион при 25°С;

(b) один или несколько глицеридов формулы:

где R₁ означает С1-С7 алкил с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или С1-С4 алкоксильной группой, R₃ и R₄ независимо означают Н или R₁C(O);

(с) один или несколько сложных эфиров формулы:

где R₁ означает С1-С7 алкил с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или С1-С4 алкоксильной группой, и R₂ означает С1-С10 алкил с прямой или разветвленной цепью, алкенил, алкинил, арил, алкиларил, алкилгетероарил, гетероарил, (СН₂СН₂О)_nили (СН₂СН(СН₃)-О)_nH, и n равно 1-10;

(d) один или несколько ацетилированных моносахаридов, ацетилированных дисахаридов или ацетилированных полисахаридов; либо

(е) любую комбинацию веществ по пунктам (а)-(d).

В использованном здесь значении термин “перкислота” является синонимом пероксикислоты, пероксикарбоновой кислоты, перкарбоновой кислоты и пероксоевой кислоты.

В использованном здесь значении термин “перуксусная кислота” обозначен аббревиатурой “РАА” и является синонимом пероксиуксусной кислоты, этанпероксоевой кислоты и всех других синонимов, представленных под регистрационным номером CAS 79-21-0.

В использованном здесь значении термин “моноацетин” является синонимом глицеролмоноацетата, моноацетата глицерина и глицерилмоноацетата.

В использованном здесь значении термин “диацетин” является синонимом глицеролдиацетата, диацетата глицерина, глицерилдиацетата и всех других синонимов, представленных под регистрационным номером CAS 25395-31-7.

В использованном здесь значении термин “триацетин” является синонимом триацетата глицерина, глицеролтриацетата, глицерилтриацетата, 1,2,3-триацетоксипропана, 1,2,3-пропантриолтриацетата и всех других синонимов, представленных под регистрационным номером CAS 102-76-1.

В использованном здесь значении термины “ацетилированный сахар” и “ацетилированный сахарид” означают моно-, ди- и полисахариды, включающие по меньшей мере одну ацетильную группу. Примеры указанных соединений включают, не ограничиваясь ими, пентаацетат глюкозы, тетраацетат ксилозы, ацетилированный ксилан, фрагменты ацетилированного ксилана, β-D-рибофураноза-1,2,3,5-тетраацетат, три-О-ацетил-D-галакталь и три-О-ацетилглюкаль.

В использованном здесь значении термины “гидрокарбил”, “гидрокарбильная группа” и “гидрокарбильная часть” означают прямую цепь, разветвленную цепь или циклическое расположение атомов углерода, соединенных простыми, двойными или тройными углерод-углеродными связями и/или простыми эфирными связями и замещенных соответствующим образом атомами водорода. Такие гидрокарбильные группы могут быть алифатическими и/или ароматическими. Примеры гидрокарбильных групп включают метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, циклопропил, циклобутил, пентил, циклопентил, метилциклопентил, гексил, циклогексил, бензил и фенил. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гидрокарбильная часть представляет собой прямую цепь, разветвленную цепь или циклическое расположение атомов углерода, соединенных простыми углерод-углеродными связями и/или простыми эфирными связями и замещенных соответствующим образом атомами водорода.

В использованном здесь значении термины “сложные моноэфиры” и “сложные диэфиры” 1,2-этандиола, 1,2-пропандиола, 1,3-пропандиола, 1,2-бутандиола, 1,3-бутандиола, 2,3-бутандиола, 1,4-бутандиола, 1,2-пентандиола, 2,5-пентандиола, 1,5-пентандиола, 1,6-пентандиола, 1,2-гександиола, 2,5-гександиола, 1,6-гександиола и их смесей означают указанные соединения, включающие по меньшей мере одну сложноэфирную группу формулы RC(O)O, где R означает С1-С7 гидрокарбильную часть с линейной цепью. В одном варианте осуществления изобретения субстрат сложного эфира карбоновой кислоты выбирают из группы, состоящей из диацетата пропиленгликоля (PGDA), диацетата этиленгликоля (EDGA) и их смесей.

В использованном здесь значении термин “диацетат пропиленгликоля” является синонимом 1,2-диацетоксипропана, пропилендиацетата, 1,2-пропандиолдиацетата и всех других синонимов, представленных под регистрационным номером CAS 623-84-7.

В использованном здесь значении термин “диацетат этиленгликоля” является синонимом 1,2-диацетоксиэтана, этилендиацетата, диацетата гликоля и всех других синонимов, представленных под регистрационным номером CAS 111-55-7.

В использованном здесь значении термины “приемлемая реакционная смесь ферментов”, “компоненты, пригодные для образования перкислоты in situ”, “приемлемые реакционные компоненты”, “приемлемая водная реакционная смесь”, “реакционная смесь” и “компоненты, образующие перкислоту” означают вещества и воду (из слюны и/или наносимую пользователем на гидратируемую адгезивную пленку перед использованием), обеспечивающие контактирование реагентов и катализатора, являющегося пергидролитическим ферментом. Компоненты, образующие перкислоту, включают по меньшей мере один фермент, обладающий пергидролитической активностью, при этом пергидролитический фермент предпочтительно является по меньшей мере одной пергидролазой СЕ-7 (необязательно в виде гибридного белка, направленно воздействующего на поверхность тела), по меньшей мере одним приемлемым субстратом сложного эфира карбоновой кислоты, источником перкислорода, и воду (из слюны и/или наносимую пользователем на гидратируемую адгезивную пленку перед использованием).

В использованном здесь значении термин “пергидролиз” означает взаимодействие выбранного субстрата с пероксидом с образованием перкислоты. Неорганический пероксид обычно взаимодействует с выбранным субстратом в присутствии катализатора с образованием пероксикарбоновой кислоты. В использованном здесь значении термин “химический пергидролиз” означает реакции пергидролиза, при выполнении которых субстрат (предшественник пероксикарбоновой кислоты) объединяют с источником пероксида водорода, в результате чего пероксикарбоновая кислота образуется при отсутствии ферментного катализатора. В использованном здесь значении термин “ферментативный пергидролиз” означает реакции пергидролиза, при выполнении которых субстрат сложного эфира карбоновой кислоты (предшественник перкислоты; “донор ацильной группы”) объединяют с источником пероксида водорода и водой, в результате чего ферментный катализатор катализирует образование перкислоты.

В использованном здесь значении термин ”активность пергидролазы” означает активность катализатора на единицу массы (например, миллиграмм) белка, массу клетки в сухом состоянии или массу иммобилизованного катализатора.

В использованном здесь значении термин “одна единица активности фермента”, “одна единица активности” или “ед.” означает величину активности пергидролазы, необходимую для образования 1 мкмоль продукта пероксикарбоновой кислоты в минуту при определенной температуре.

В использованном здесь значении термины “ферментный катализатор” или “пергидролазный катализатор” означает катализатор, который включает фермент, обладающий активностью пергидролазы, и может представлять собой цельную микробную клетку, проницаемую микробную клетку, один или несколько компонентов экстракта микробных клеток, частично очищенный фермент или очищенный фермент. Ферментный катализатор может быть также химически модифицирован (например, путем пегилирования или взаимодействия с перекрестносшивающими реагентами). Пергидролазный катализатор может быть также иммобилизован на растворимом или нерастворимом носителе методами, хорошо известными специалистам в данной области; см., например, публикацию Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997. В одном варианте осуществления изобретения пергидролазный катализатор может быть нековалентно иммобилизован внутри или снаружи полоски для ухода за полостью рта (например, отбеливающей полоски) или на стоматологической оттискной ложке. В другом варианте осуществления изобретения нековалентная иммобилизация на полоске или стоматологической оттискной ложке может быть произведена при помощи пептидного связывающего домена, обладающего сильным сродством к материалу полоски или оттискной ложки (например, гибридный белок, включающий пергидролитический фермент, связанный при помощи необязательного пептидного спейсера с пептидным связывающим доменом). В другом варианте осуществления изобретения стоматологическая оттискная ложка является деформируемой оттискной ложкой. В другом варианте осуществления изобретения пергидролазный катализатор иммобилизован внутри или снаружи деформируемой оттискной ложки после получения оттиска зубов.

В использованном здесь значении термин “ацетилксиланэстераза” означает фермент (E.C. 3.1.1.72; AXE), который катализирует деацетилирование ацетилированных ксиланов и других ацетилированных сахаридов.

В использованном здесь значении термины “деацетилаза цефалоспорина С” и “ацетилгидролаза цефалоспорина С” означают фермент (Е.С. 3.1.1.41), который катализирует деацетилирование цефалоспоринов, таких как цефалоспорин С и 7-аминоцефалоспорановая кислота (Mitsushima et al., (1995) Appl. Env. Microbiol. 61(6): 2224-2229). Настоящее изобретение относится к аминокислотным последовательностям нескольких деацетилаз цефалоспорина С, обладающих значительной пергидролитической активностью.

В использованном здесь значении термин “Bacillus subtilis ATCC® 31954™” означает бактериальную клетку, депонированную в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) под номером доступа международного депозитария ATCC® 31954™. Как указано в настоящем описании изобретения, фермент, обладающий значительной активностью пергидролазы из B. subtilis ATCC® 31954™, представлен в виде SEQ ID NO:4 (см. публикацию заявки на патент США № 2010-0041752).

В использованном здесь значении термин “Thermotoga maritima MSB8” означает бактериальную клетку, которая, как известно, обладает активностью ацетилксиланэстеразы (GENBANK® NP_227893.1; см. публикацию заявки на патент США № 2008-0176299). Аминокислотная последовательность фермента, обладающего активностью пергидролазы из Thermotoga maritima MSB8, представлена в виде SEQ ID NO:11. Варианты пергидролазы Thermotoga maritima MSB8 представлены в виде SEQ ID NO:1 и 16.

В использованном здесь значении термины “молекула выделенной нуклеиновой кислоты”, “выделенный полинуклеотид” и “фрагмент выделенной нуклеиновой кислоты” имеют взаимозаменяемые значения и означают полимер РНК или одноцепочечной или двухцепочечной ДНК, необязательно содержащей синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты в форме полимера ДНК может состоять из одного или нескольких сегментов кДНК, геномной ДНК или синтетической ДНК.

Термин “аминокислота” означает основную химическую структурную единицу белка или полипептида. В настоящем описании изобретения использованы следующие аббревиатуры для идентификации определенных аминокислот:

В использованном здесь значении термин “примерно”, модифицирующий количество использованного ингредиента или реагента, означает варьирование количества, выраженного числовым значением, которое может иметь место, например, при использовании обычных методов измерения и работы с жидкостями, применяемых для получения концентратов или растворов.

В использованном здесь значении термины “сигнатурный фрагмент” и “диагностический фрагмент” означают консервативные структуры, присутствующие в семействе ферментов, обладающих определенной активностью. Сигнатурный фрагмент может быть использован для определения и/или идентификации семейства структурно родственных ферментов, обладающих ферментативной активностью, подобной определенному семейству субстратов. Сигнатурный фрагмент может представлять собой одну непрерывную аминокислотную последовательность или совокупность прерывающихся консервативных фрагментов, совместно образующих сигнатурный фрагмент. Консервативный фрагмент обычно представлен аминокислотной последовательностью. В одном варианте осуществления изобретения пергидролитические ферменты, использованные в композициях и способах по настоящему изобретению, включают сигнатурный фрагмент карбогидрат-эстеразы СЕ-7.

В использованном здесь значении термин “программное обеспечение анализа последовательностей” означает любой компьютерный алгоритм или программу, используемую для анализа нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. “Программное обеспечение анализа последовательностей” может быть коммерчески доступным или независимо разработанным. Типичное программное обеспечение анализа последовательностей может включать, не ограничиваясь ими, комплект программ GCG (Wisconsin Package Version 9.0, Accelrys Software Corp., San Diego, CA), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA), CLUSTALW (например, версия 1.83; Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22(22): 4673-4680 (1994)), программу FASTA, включающую алгоритм Смита-Ватермана (W.R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, NY), Vector NTI (Informax, Bethesda, MD) и Sequencher v. 4.05. В контексте настоящей заявки следует отметить, что результаты анализа, выполненного при помощи программного обеспечения анализа последовательностей, будут основаны на “значениях по умолчанию” используемой программы за исключением особо оговоренных случаев. В использованном здесь значении термин “значения по умолчанию” означает любую совокупность значений или параметров, заданную изготовителем программного обеспечения, которая была введена в программное обеспечение при начальной загрузке.

Термин “поверхность тела” означает любую поверхность тела человека, которая может служить в качестве мишени для благоприятно воздействующего агента, такого как перкислота. Способы и композиции по настоящему изобретению относятся к продуктам для ухода за полостью рта и их применениям. Таким образом, поверхность тела включает вещество/поверхность полости рта. В одном варианте осуществления изобретения веществом полости рта является зубная эмаль.

В использованном здесь значении термины “отбеливание зубов” и “обесцвечивание зубов” имеют взаимозаменяемые значения и означают придание зубу или зубам большей яркости (например, отбеливание). Отбеливающие полоски по настоящему изобретению включают ингредиенты, пригодные для ферментативного образования эффективного количества перкислоты для отбеливания зубов в гидратированном состоянии.

В использованном здесь значении термин “внутренние пятна” на зубах означает изменение цвета зубов под воздействием хромогенов в эмали и дентине. У человека цвет зубов желтеет в процессе старения из-за истончения эмали и потемнения желтого дентина. Удаление внутреннего пятна обычно требует использования пероксидов или других окисляющих химических веществ, которые проникают в эмаль и обесцвечивают внутренние хромогены.

В отличие от внутренних пятен “наружные пятна” образуются на поверхности зубов при связывании экзогенных хромогенных веществ с эмалью, обычно в тонкой пленке, покрывающей зубы. У большинства людей на зубах с течением времени образуется некоторое количество некрасивых наружных пятен. Процесс образования пятен стимулируется такими факторами как: (1) потребление содержащих таннин продуктов и напитков, таких как кофе, чай или красное вино; (2) использование табачных изделий и/или (3) воздействие определенных катионных веществ (например, олова, железа и хлоргексидина). Указанные вещества сцепляются с гидроксиапатитной структурой эмали, что вызывает изменение цвета и сопутствующее уменьшение белизны зубов. В течение многих лет наружные пятна могут проникать через слой эмали и образовывать внутренние пятна.

В использованном здесь значении термин “удаление пятен” означает процесс удаление пятна с поверхности полости рта. Пятна могут быть внутренними пятнами, наружными пятнами или их комбинацией.

В использованном здесь значении термин “эффективное количество фермента пергидролазы” означает количество фермента пергидролазы, необходимое для достижения ферментативной активности, требуемой в конкретном применении. Такие эффективные количества, которые могут быть легко определены специалистом в данной области, базируются на многих факторах, таких как конкретный вариант используемого фермента.

В использованном здесь значении термин “источник перкислорода” означает соединения, способные образовывать пероксид водорода в концентрации около 1 мМ или более в водном растворе, которые включают, не ограничиваясь ими, пероксид водорода, аддукты пероксида водорода (например, аддукт мочевины и пероксида водорода (пероксид карбамида)), пербораты и перкарбонаты. Как указано в настоящем описании изобретения, источник перкислорода в отбеливающих полосках по настоящему изобретению имеет форму гранулированных частиц, которые должны быть гидратированы пользователем для высвобождения эффективного количества пероксида водорода. Как указано в настоящем описании изобретения концентрация пероксида водорода, обеспечиваемая перкислородным соединением в водном реакционном препарате, первоначально равна по меньшей мере 0,1 мМ или больше при объединении реакционных компонентов. В одном варианте осуществления изобретения концентрация пероксида водорода в водном реакционном препарате равна по меньшей мере 0,5 мМ. В одном варианте осуществления изобретения концентрация пероксида водорода в водном реакционном препарате равна по меньшей мере 1 мМ. В другом варианте осуществления изобретения концентрация пероксида водорода в водном реакционном препарате равна по меньшей мере 10 мМ. В другом варианте осуществления изобретения концентрация пероксида водорода в водном реакционном препарате равна по меньшей мере 100 мМ. В другом варианте осуществления изобретения концентрация пероксида водорода в водном реакционном препарате равна по меньшей мере 200 мМ. В другом варианте осуществления изобретения концентрация пероксида водорода в водном реакционном препарате равна 500 мМ или больше. В другом варианте осуществления изобретения концентрация пероксида водорода в водном реакционном препарате равна 1000 мМ или больше. Молярное отношение пероксида водорода к субстрату для фермента, например, триглицериду (Н₂О₂:субстрат) в препарате может составлять примерно 0,002:20, предпочтительно примерно 0,1:10 и наиболее предпочтительно примерно 0,5:5.

В использованном здесь значении термин “олигосахарид” означает соединения, содержащие от 2 до по меньшей мере 24 моносахаридных звеньев, связанных гликозидными связями. Термин “моносахарид” означает соединение эмпирической формулы (СН₂О)_n, где n≥3, углеродный остов является неразветвленным, каждый атом углерода, за исключением одного атома, содержит гидроксильную группу и оставшийся атом углерода является альдегидом или кетоном в положении атома углерода 1. Термин ”моносахарид” также означает внутриклеточные циклические формы гемиацеталей или гемикеталей.

В использованном здесь значении термин “гидратируемый адгезив” означает адгезивное вещество, способное гидратировать. Гидратируемый адгезив является по существу сухим и неадгезивным до гидратации. После гидратации гидратируемый адгезив становится достаточно липким для связывания отбеливающей зубы полоски/пленки с поверхностью зубов. Гидратируемая адгезивная пленка также включает гранулированный отбеливающий ингредиент, который в результате гидратации высвобождает эффективное количество пероксида водорода, используемого для ферментативного образования перкислотного отбеливающего агента. Отбеливающая полоска/пленка обычно является тонкой (толщиной менее 2 мм), имеет форму и размер, соответствующие полости рта, и обладает достаточной гибкостью для соответствия форме зубов, при этом гидратируемый адгезив помогает удерживать пленку/полоску на поверхности зубов в течение периода времени, достаточного для отбеливания зубов перкислотным отбеливающим агентом.

В использованном здесь значении термин “эффективное количество” означает количество вещества, необходимое для достижения требуемого эффекта.

В использованном здесь значении термин “по существу неадгезивный до гидратации” означает отсутствие адгезивной прочности, достаточной для сцепления отбеливающей зубы пленки с поверхностью зубов до гидратации. В таком состоянии пользователь может легко обращаться с гидратируемой адгезивной пленкой до применения/гидратации.

Термин “идентичность последовательности” означает идентичность аминокислот, определяемую при использовании программы сравнительного анализа последовательностей, например, ClustalW или BLAST, описанных в публикациях Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ, “Basic local alignment search tool”, J. Mol. Biol. (1990) 215 (3): 403-410, и Goujon M, McWilliam H, Li W, Valentin F, Squizzato S, Paern J, Lopez R, Nucleic Acids Research (2010) 38 Suppl: W695-9.

Доноров ацильных групп, используемые в настоящем изобретении для образования перкислот при взаимодействии с пероксидом, выбирают из одного или нескольких следующих веществ: (i) С_2-18 карбоновых кислот, например, С_2-6 карбоновых кислот (таких как, например, уксусная кислота), включающих низшие алкилкарбоновые кислоты с линейной или разветвленной цепью, необязательно замещенные гидроксильной и/или С_1-4 алкоксильной группой; (ii) их гидролизуемых и приемлемых сложных эфиров (например, моно-, ди- и триглицеридов и ацилированных сахаридов) и (iii) их смесей. Например, доноры ацильных групп включают 1,2,3-триацетоксипропан (иногда определяемый в настоящем описании изобретения как триацетин или триацетат глицерина) и ацилированные сахариды, например, ацетилированные сахариды. В конкретном варианте осуществления изобретения сложные эфиры, предназначенные для указанного применения, могут быть сложными эфирами, растворимость которых в воде равна по меньшей мере 5 частям на миллион при 25°С.

Доноры ацильных групп и/или ферменты могут быть необязательно инкапсулированы. В данной области известен целый ряд вариантов естественной и искусственной инкапсуляции. Модифицированные крахмалы и аравийская камедь являются особенно пригодными веществами благодаря пищевому качеству, относительной дешевизне, быстрой растворимости и адсорбции достаточно больших количеств жидких масел. При этом необходимо учитывать любое влияние на конечную вязкость.

В некоторых вариантах осуществления изобретения гранулы включают агент, уменьшающий чувствительность, способный снижать чувствительность нервов или дентинных канальцев. В некоторых вариантах осуществления изобретения уменьшающий чувствительность агент выбирают из источника ионов калия, силиката, источника ионов олова, основных аминокислот, глины и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения источник ионов калия является приемлемой для полости рта солью калия, используемой в количестве, достаточном для уменьшения чувствительности дентина. В некоторых вариантах осуществления изобретения источник ионов калия выбирают из хлорида калия, нитрата калия и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения основная аминокислота является аргинином. В некоторых вариантах осуществления изобретения основную аминокислоту выбирают из фосфата аргинина, бикарбоната аргинина и гидрохлорида аргинина. В некоторых вариантах осуществления изобретения силикат является силикатом кальция.

Пергидролазы СЕ-7

В композициях и способе по настоящему изобретению использованы ферменты, обладающие пергидролитической активностью, которые в структурном отношении классифицированы как члены семейства карбогидрат-эстераз 7 (семейство СЕ-7) (см. публикацию Coutinho, P.M., Henrissat, B. “Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach” in Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12). Установлено, что семейство СЕ-7 ферментов особенно эффективно продуцирует пероксикарбоновые кислоты из целого ряда субстратов сложного эфира карбоновых кислот при объединении с источником перкислорода (патенты США №№ 7794378, 7951566, 7723083 и 7964378 и публикации заявок на патенты США №№ 2008-0176299, 2010-0087529, 2011-0081693 и 2011-0236335, DiCosimo et al., которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки).

Члены семейства СЕ-7 включают деацетилазы цефалоспорина С (САН, Е.С. 3.1.1.41) и ацетилксиланэстеразы (АХЕ, Е.С. 3.1.1.72). Члены семейства эстераз СЕ-7 содержат консервативный сигнатурный фрагмент (Vincent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606 (2003)). В композициях и способах по настоящему изобретению могут быть использованы пергидролазы, содержащие сигнатурный фрагмент СЕ-7 (“пергидролазы СЕ-7”) и/или имеющие по существу подобную структуру. В настоящей области хорошо известны методы идентификации по существу подобных биологических молекул (например, методы сравнительного анализа последовательностей, методы гибридизации нуклеиновых кислот и/или определения наличия консервативного сигнатурного фрагмента). В соответствии с одним объектом изобретения пергидролаза представляет собой фермент, включающий сигнатурный фрагмент СЕ-7 и имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, более предпочтительно по меньшей мере на 33%, более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 42%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична одной из последовательностей, приведенных в настоящем описании изобретения.

В использованном здесь значении фраза “фермент классифицирован в структурном отношении как фермент СЕ-7”, “пергидролаза СЕ-7” или “классифицированный в структурном отношении как фермент семейства карбогидрат-эстераз 7” служит для определения ферментов, обладающих пергидролитической активностью, которые классифицированы в структурном отношении как карбогидрат-эстераза СЕ-7. Указанное семейство ферментов может быть идентифицировано по наличию сигнатурного фрагмента (Vincent et al., см. выше). Сигнатурный фрагмент для эстераз СЕ-7 включает три консервативных фрагмента (нумерация положений остатков соответствут эталонной последовательности SEQ ID NO:1; вариант C277S пергидролазы Thermotoga maritima).

Arg118-Gly119-Gln120;

Gly186-Xaa187-Ser188-Gln189-Gly190 и

His303-Glu304.

Хаа в положении аминокислотного остатка 187 обычно является глицином, аланином, пролином, триптофаном или треонином. Два из трех аминокислотных остатков, относящихся к каталитической триаде, выделены жирных шрифтом. В одном варианте осуществления изобретения Хаа в положении аминокислотного остатка 187 выбирают из группы, состоящей из глицина, аланина, пролина, триптофана и треонина.

Последующий анализ консервативных фрагментов в семействе карбогидрат-эстераз СЕ-7 указывает на наличие дополнительного консервативного фрагмента (LXD в положениях аминокислот 272-274 SEQ ID NO:1), который может быть использован для дальнейшей идентификации пергидролазы, принадлежащей к семейству карбогидрат-эстераз СЕ-7. В другом варианте осуществления изобретения вышеуказанный сигнатурный фрагмент может включать дополнительный (четвертый) консервативный фрагмент, определяемый как:

Leu272-Xaa273-Asp274.

Хаа в положении аминокислотного остатка 273 обычно является изолейцином, валином или метионином. Четвертый фрагмент включает остаток аспарагиновой кислоты (выделен жирным шрифтом), относящийся к каталитической триаде (Ser188-Asp274-His303).

Пергидролазы СЕ-7 могут представлять собой гибридные белки, содержащие по меньшей мере один пептидный компонент, обладающий сродством по меньшей мере к одной поверхности тела. В одном варианте осуществления изобретения все методы сравнительного анализа, используемые для определения наличия в пергидролазе (гибридном белке) сигнатурного фрагмента СЕ-7, основаны на исследовании аминокислотной последовательности пергидролитического фермента без пептидного компонента, обладающего сродством к поверхности тела.

Для сравнения двух или более аминокислотных последовательностей, представляющих ферменты, обладающие активностью пергидролазы, с целью определения наличия в ферменте вышеуказанного сигнатурного фрагмента может быть использован целый ряд хорошо известных алгоритмов глобального сравнительного анализа (то есть программное обеспечение анализа последовательностей). Исследуемые последовательности сравнивают с эталонной последовательностью (SEQ ID NO:1) для определения наличия сигнатурного фрагмента. В одном варианте осуществления изобретения для идентификации пергидролаз, относящихся к семейству эстераз СЕ-7, использована программа сравнительного анализа CLUSTAL (такая как CLUSTALW), содержащая эталонную аминокислотную последовательность (аналогичную последовательности пергидролазы, использованной в настоящем описании изобретения (SEQ ID NO:1)). Соответствующая нумерация консервативных аминокислотных остатков основана на нумерации остатков в эталонной аминокислотной последовательности с учетом небольших инсерций или делеций (например, обычно пять аминокислот или меньше) в сравниваемой последовательности.

Примеры других приемлемых алгоритмов, которые могут быть использованы для идентификации последовательностей, содержащих сигнатурный фрагмент по настоящему изобретению (при сравнении с эталонной последовательностью), включают, не ограничиваясь ими, алгоритм Нидлмана и Ванша (J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970), программа глобального сравнительного анализа) и алгоритм Смита-Ватермана (J. Mol. Biol. 147: 195-197 (1981), программа локального сравнительного анализа). В одном варианте осуществления изобретения сравнительный анализ Смита-Ватермана выполняют с использованием параметров по умолчанию. Пример приемлемых параметров по умолчанию включает использование оценочной матрицы BLOSUM62, в которой штраф за открытый разрыв = 10 и штраф за удлинение разрыва = 0,5.

В одном варианте осуществления изобретения приемлемые пергидролазы включают ферменты, содержащие сигнатурный фрагмент СЕ-7 и аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO:1.

Примеры приемлемых карбогидрат-эстераз СЕ-7, обладающих пергидролитической активностью, включают, не ограничиваясь ими, ферменты, имеющие аминокислотную последовательность, подобную SEQ ID NO:1 и 4-28. В одном варианте осуществления изобретения фермент включает аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящую из последовательностей 1, 10, 11, 15 и 16.

В использованном здесь значении термин “вариант СЕ-7”, “вариант пергидролазы” или “вариант” означает пергидролазы СЕ-7 с генетической модификацией, вызывающей добавление, делецию и/или замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с соответствующим ферментом (обычно ферментом дикого типа), из которого был получен данный вариант, при сохранении сигнатурного фрагмента СЕ-7 и ассоциированной с ним пергидролитической активности. Варианты пергидролаз СЕ-7 также могут быть использованы в композициях и способах по настоящему изобретению. Примеры вариантов СЕ-7 представлены в виде SEQ ID NO:1, 15, 16, 17, 18, 19 и 20. В одном варианте осуществления изобретения варианты могут включать SEQ ID NO:1 и 16.

Квалифицированному специалисту должно быть понятно, что в композициях и способах по настоящему изобретению могут быть также использованы по существу подобные последовательности пергидролаз СЕ-7 (сохраняющие сигнатурные фрагменты). В одном варианте осуществления изобретения по существу подобные последовательности определяют по способности гибридизировать в строгих условиях с молекулами нуклеиновых кислот, ассоциированными с последовательностями, приведенными в настоящем описании изобретения. В другом варианте осуществления изобретения алгоритмы сравнительного анализа последовательностей могут быть использованы для определения по существу подобных ферментов на основании процентного значения идентичности с ДНК или аминокислотными последовательностями, приведенными в настоящем описании изобретения.

Как указано в настоящем описании изобретения, молекула нуклеиновой кислоты способна гибридизировать с другой молекулой нуклеиновой кислоты, такой как кДНК, геномная ДНК или РНК, если одна цепь первой молекулы может гибридизировать с другой молекулой в условиях определенной температуры и ионной силы раствора. Условия гибридизации и промывки хорошо известны и описаны в публикации Sambrook, J. and Russell, D., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Условия температуры и ионной силы определяют ”строгость” гибридизации. Условия строгости гибридизации могут быть отрегулированы для скрининга от умеренно подобных молекул, таких как гомологичные последовательности у отдаленно родственных организмов, до высоко подобных молекул, таких как гены, дуплицирующие функциональные ферменты близко родственных организмов. Промывки после гибридизации обычно определяют условия строгости. В одной совокупности предпочтительных условий использована серия промывок, включающая первоначальную промывку 6-кратным объемом SSC, 0,5% SDS при комнатной температуре в течение 15 минут, повторную промывку 2-кратным объемом SSC, 0,5% SDS при 45°С в течение 30 минут и затем дважды выполняемую промывку 0,2-кратным объемом SSC, 0,5% SDS при 50°С в течение 30 минут. В более предпочтительной совокупности условий использованы более высокие температуры, при которых промывки идентичны вышеуказанным промывкам за исключением повышения температуры до 60°С двух конечных 30-минутных промывок в 0,2-кратном объеме SSC, 0,5% SDS. В соответствии с другой предпочтительной совокупностью строгих условий гибридизации промывку выполняют в 0,1-кратном объеме SSD, 0,1% SDS, 65°С, затем в 2-кратном объеме SSC, 0,1% SDS, и конечную промывку выполняют в 0,1-кратном объеме SSC, 0,1% SDS, 65°С.

Для гибридизации необходимо, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя в зависимости от строгости гибридизации возможны ошибочные спаривания оснований. Соответствующая строгость гибридизации нуклеиновых кислот зависит от длины нуклеиновых кислот и степени комплементарности, которые являются переменными параметрами, хорошо известными в данной области. Чем выше степень подобия или гомологии двух нуклеотидных последовательностей, тем больше значение Tm для гибридов нуклеиновых кислот, содержащих указанные последовательности. Относительная устойчивость (соответствующая более высокому значению Tm) гибридизации нуклеиновых кислот уменьшается в следующем порядке: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Для гибридов, длина которых превышает 100 нуклеотидов, выведены уравнения для вычисления значения Tm (Sambrook and Russell, см. выше). При гибридизации более коротких нуклеиновых кислот, то есть олигонуклеотидов, более важное значение имеет положение ошибочных спариваний, при этом длина олигонуклеотида определяет его специфичность (Sambrook and Russell, см. выше). В соответствии с одним объектом изобретения длина гибридизируемой нуклеиновой кислоты равна по меньшей мере примерно 10 нуклеотидам. Минимальная длина гибридизируемой нуклеиновой кислоты предпочтительно равна по меньшей мере примерно 15 нуклеотидам, более предпочтительно по меньшей мере примерно 20 нуклеотидам, еще предпочтительнее по меньшей мере 30 нуклеотидам, еще предпочтительнее по меньшей мере 300 нуклеотидам и наиболее предпочтительно по меньшей мере 800 нуклеотидам. Кроме того, квалифицированному специалисту должно быть понятно, что температуру и концентрацию соли в промывочном растворе можно при необходимости отрегулировать в соответствии с такими факторами как длина зонда.

В использованном здесь значении термин “процентное значение идентичности” означает взаимосвязь между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определенную путем сравнения указанных последовательностей. В данной области термин “идентичность” также означает степень родства полипептидных или полинуклеотидных последовательностей, определяемую путем совмещения цепей таких последовательностей. “Идентичность” и “подобие” можно легко вычислить известными методами, которые включают, не ограничиваясь ими, методы, описанные в публикациях: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991).

Методы определения идентичности и подобия кодифицированы в общедоступных компьютерных программах. Сравнительные анализы последовательностей и вычисления процентных значений идентичности могут быть выполнены при помощи программы Megalign пакета вычислительных программ по биоинформатике LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), программы AlignX Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD) или комплекта открытого программного обеспечения EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6): 276-277 (2000)). Многие сравнительные анализы последовательностей могут быть выполнены методом CLUSTAL (таким как CLUSTALW; например, версия 1.83) (Higgins and Sharp, CABIOS, 5: 151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680 (1994) and Chenna et al., Nucleic Acids Res. 31 (13): 3497-500 (2003)), разработанным Европейской лабораторией молекулярной биологии при содействии Европейского института биоинформатики) с использованием параметров по умолчанию. Приемлемые параметры для сравнительного анализа белков методом CLUSTALW включают штраф за наличие разрыва = 15, удлинение разрыва = 0,2, матрицу = Gonnet (например, Gonnet250), концевой разрыв белка = -1, расстояние разрыва белка = 4 и кортеж = 1. В одном варианте осуществления изобретения с использованием установок по умолчанию выполняют быстрый или медленный сравнительный анализ, при этом медленный сравнительный анализ является предпочтительным. Альтернативно параметры, используемые в методе CLUSTALW (например, версия 1.83), могут быть изменены следующим образом: кортеж = 1, штраф за разрыв = 10, удлинение разрыва = 1, матрица = BLOSUM (например, BLOSUM64), окно = 5 и сохраненные верхние диагонали = 5.

В соответствии с одним объектом изобретения приемлемые молекулы выделенной нуклеиновой кислоты кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотным последовательностям, приведенным в настоящем описании изобретения. В соответствии с другим объектом изобретения приемлемые молекулы выделенной нуклеиновой кислоты кодируют полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотным последовательностям, приведенным в настоящем описании изобретения. Приемлемые молекулы нуклеиновых кислот не только обладают вышеуказанной гомологией, но также обычно кодируют полипептид длиной примерно 210-340 аминокислот, примерно 300-340 аминокислот, предпочтительно примерно 310-330 аминокислот и наиболее предпочтительно примерно 318-325 аминокислот, при этом каждый полипептид обладает пергидролитической активностью.

Пергидролазы направленного действия

В использованном здесь значении термины “пергидролаза направленного действия” и “фермент направленного действия, обладающий пергидролитической активностью” означают гибридные белки, включающие по меньшей мере один пергидролитический фермент (дикого типа или его вариант), гибридизированный/связанный по меньшей мере с одним пептидным компонентом, обладающим сродством к поверхности-мишени, предпочтительно к поверхности тела, подвергаемой направленному воздействию. Пергидролитический фермент, представляющий собой пергидролазу направленного действия, может быть любой карбогидрат-эстеразой СЕ-7, обладающей пергидролитической активностью. Пергидролаза СЕ-7 может быть идентифицирована по наличию сигнатурного фрагмента СЕ-7, соответствующего эталонной последовательности SEQ ID NO:1, который включает:

i) фрагмент RGQ в положениях, соответствующих положениям 118-120 SEQ ID NO:1;

ii) фрагмент GXSQG в положениях, соответствующих положениям 186-190 SEQ ID NO:1, и

iii) фрагмент НЕ в положениях, соответствующих положениям 303-304 SEQ ID NO:1.

В одном варианте осуществления изобретения пергидролитические ферменты могут быть ферментами, имеющими аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 20%, предпочтительно по меньшей мере на 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична любой из аминокислотных последовательностей, приведенных в настоящем описании изобретения (то есть SEQ ID NO:1 и 4-28).

В другом варианте осуществления изобретения гибридный белок включает пергидролитический фермент, имеющий аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 и 4-28.

В использованном здесь значении термины “пептидный компонент”, “пептидный компонент, обладающий сродством к поверхности полости рта”, “домен, связывающийся с полостью рта” и “OCBD” означают компонент гибридного белка, который не является частью пергидролитического фермента и включает по меньшей мере один полимер, состоящий из двух или более аминокислот, связанных пептидной связью, при этом указанный компонент обладает сродством к поверхности-мишени полости рта. В соответствии с предпочтительным объектом изобретения OCBD обладает сродством к зубной эмали.

В одном варианте осуществления изобретения пептидный компонент, обладающий сродством к поверхности тела, может быть антителом, Fab-фрагментом антитела, фрагментом вариабельной области одноцепочечного антитела (scFv), антителом Camelidae (Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol. (2001) 74: 277-302), остовным белком, отличным от антитела (см. публикации Hosse et al., Prot. Sci. (2006) 15(1): 14-27 и Binz, H. et al. (2005) Nature Biotechnology 23, 1257-1268 для ознакомления с разными методами использования остовных белков), или одноцепочечным полипептидом без укладки цепи, характерной для иммуноглобулинов. В соответствии с другим объектом изобретения пептидный компонент, обладающий сродством к ткани/поверхности полости рта (такой как зубная эмаль), является одноцепочечным пептидом без укладки цепи, характерной для иммуноглобулинов.

Пептидный компонент, обладающий сродством к поверхности полости рта, может быть отделен от пергидролитического фермента необязательным пептидным линкером. Определенные пептидные линкеры/спейсеры состоят из 1-100 или 1-50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидные спейсеры имеют длину от около 1 до около 25, от 3 до около 40 или от 3 до около 30 аминокислот. В других вариантах осуществления изобретения использованы спейсеры длиной от около 5 до около 20 аминокислот. Может быть использовано несколько пептидных линкеров. В одном варианте осуществления изобретения присутствует по меньшей мере один пептидный линкер, который может быть повторно использован до 10 раз.

В одном варианте осуществления изобретения гибридный пептид включает по меньшей мере один пептид, связывающийся с поверхностью полости рта, который выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:178-197.

В другом варианте осуществления изобретения поверхность-мишень является материалом, представляющим собой часть продукта, такого как отбеливающая полоска или полимерная подложка (при использовании полимерной подложки, на которую наносится гидратируемый адгезив). Пептидный компонент выбирают с учетом его сродства к используемому материалу или материалам, таким как полимеры, пластики и пленки. Конформация гибридного белка, включающего пергидролазу направленного действия, делает возможной контролируемую доставку и удаление пергидролазы с поверхности тела пользователя благодаря нанесению гибридного белка на удаляемое устройство, которое включает, не ограничиваясь ими, оттискную ложку или полоску.

Пептидный компонент, обладающий сродством к поверхности полости рта, может быть отделен от пергидролазы СЕ-7 необязательным пептидным линкером. Определенные пептидные линкеры/спейсеры состоят из 1-100 или 1-50 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления изобретения пептидные спейсеры имеют длину от около 1 до около 25, от 3 до около 40 или от 3 до около 30 аминокислот. В других вариантах осуществления изобретения использованы спейсеры длиной от около 5 до около 20 аминокислот. Может быть использовано несколько пептидных линкеров. Примеры пептидных линкеров представлены в виде SEQ ID NO:164-177.

Примеры пергидролаз СЕ-7 направленного действия могут включать, не ограничиваясь ими, любые пергидролазы СЕ-7, имеющие аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 и 4-28, которая связана с пептидным компонентом, обладающим сродством к поверхности полости рта. В предпочтительном варианте осуществления изобретения примеры пергидролаз направленного действия могут включать, не ограничиваясь ими, любые пергидролазы СЕ-7, имеющие аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 и 28, которая связана с одним или несколькими пептидами, связывающимися с поверхностью тела и обладающими сродством к поверхности полости рта (необязательно при помощи пептидного спейсера). В предпочтительном варианте осуществления изобретения пергидролаза направленного действия является пергидролазой СЕ-7, имеющей аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 и 16.

В одном варианте осуществления изобретения пергидролаза является пергидролазой СЕ-7 в форме гибридного белка, имеющего следующую общую структуру:

PAH-[L]y-OCBD или OCBD-[L]y-PAH,

где РАН означает фермент, обладающий пергидролитической активностью, например, содержащий сигнатурный фрагмент СЕ-7, например, SEQ ID NO:1, OCBD означает пептидный компонент, обладающий сродством к поверхности полости рта, L означает необязательный линкер и y является целым числом от 0 до 10. В одном варианте осуществления изобретения присутствует линкер (L), который является пептидным линкером длиной от 1 до 100 аминокислот.

Например, SEQ ID NO:2 является гибридным белком, в котором последовательность перогидролазы SEQ ID NO:1 связана с С-концевым доменом, обладающим сродством к тканям полости рта.

Пергидролазы, используемые в продуктах и способах по настоящему изобретению, могут быть свободными соединениями, защищенными (например, ацетилированными) соединениями или солями.

В другом варианте осуществления изобретения поверхность-мишень является материалом, представляющим собой часть продукта, доставляемого в полость рта. Пептидный компонент выбирают с учетом его сродства к используемому материалу или материалам, таким как полимеры, пластики и пленки. Конформация гибридного белка, включающего пергидролазу направленного действия, делает возможной контролируемую доставку и удаление пергидролазы с поверхности тела пользователя благодаря нанесению гибридного белка на удаляемое устройство, такое как оттискная ложка или полоска.

Сродство связывания

Пептидный компонент, обладающий сродством к поверхности полости рта, характеризуется сродством связывания с поверхностью полости рта, равным 10^-5 моль (М) или меньше. В определенных вариантах осуществления изобретения пептидный компонент представляет собой один или несколько пептидов, связывающихся с поверхностью полости рта, и/или связывающийся домен, обладающий сродством связывания с зубной эмалью, равным 10^-5 моль (М) или меньше. В некоторых вариантах осуществления изобретения связывающиеся пептиды или домены обладают сродством связывания, равным 10^-5 М или меньше, в присутствии по меньшей мере 50-500 мМ соли. Термин “сродство связывания” означает силу взаимодействия связывающегося пептида с соответствующим субстратом. Сродство связывания может быть определено или измерено в виде константны диссоциации (“K_D”) связывающегося пептида или “МВ₅₀”.

“K_D” соответствует концентрации пептида, при которой сайт связывания мишени занят наполовину, то есть, когда концентрация мишени со связанным пептидом (связанным веществом мишени) равна концентрации мишени без связанного пептида. Чем меньше константа диссоциации, тем сильнее связан пептид. Например, пептид с константой диссоциации в наномолярном (нМ) диапазоне связывается прочнее, чем пептид с константой диссоциации в микромолярном (мкМ) диапазоне. В определенных вариантах осуществления изобретения значение K_Dравно 10^-5 или меньше.

“МВ₅₀” означает концентрацию связывающегося пептида, при которой возникает сигнал, соответствующий 50% от максимального сигнала, полученного при выполнении анализа связывания методом ELISA. См., например, пример 3 в публикации заявки на патент США 2005/022683, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. МВ₅₀ является показателем силы взаимодействия связывания или сродства компонентов комплекса. Чем ниже значение МВ₅₀, тем сильнее, то есть “лучше” взаимодействует пептид с соответствующим субстратом. Например, пептид со значением МВ₅₀ в наномолярном (нМ) диапазоне связывается прочнее, чем пептид со значением МВ₅₀ в микромолярном (мкМ) диапазоне. В определенных вариантах осуществления изобретения значение МВ50 равно 10^-5 М или меньше.

В определенных вариантах осуществления изобретения пептидный компонент обладает сродством к поверхности полости рта, измеренным в единицах K_Dили МВ₅₀, которое меньше или равно примерно 10^-5 М, меньше или равно примерно 10^-6 М, меньше или равно примерно 10^-7 М, меньше или равно примерно 10^-8 М, меньше или равно примерно 10^-9 М либо меньше или равно примерно 10^-10 М.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пептиды, связывающиеся с поверхностью полости рта, и/или домены, связывающиеся с поверхностью полости рта, могут обладать сродством связывания, измеренным в единицах K_Dили МВ₅₀, которое меньше или равно примерно 10^-5 М, меньше или равно примерно 10^-6 М, меньше или равно примерно 10^-7 М, меньше или равно примерно 10^-8 М, меньше или равно примерно 10^-9 М либо меньше или равно примерно 10^-10 М.

В использованном здесь значении термин “сильное сродство” означает сродство связывания, соответствующее значению K_D или МВ₅₀, которое меньше или равно примерно 10^-5 М, предпочтительно меньше или равно примерно 10^-6 М, более предпочтительно меньше или равно примерно 10^-7 М, более предпочтительно меньше или равно примерно 10^-8 М, меньше или равно примерно 10^-9 М либо наиболее предпочтительно меньше или равно примерно 10^-10 М.

Порошкообразные ферменты

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции для индивидуального ухода за полостью рта могут содержать ферментный катализатор в форме стабилизированного порошкообразного фермента. Методы получения и стабилизации препаратов, содержащих порошкообразный фермент, описаны в публикациях заявок на патент США №№ 2010-0086534 и 2010-0086535.

В одном варианте осуществления изобретения фермент может представлять собой порошкообразный фермент в количестве от около 0,5 массового процента (мас.%) до около 75 мас.%, например, от 1 мас.% до около 60 мас.%, в расчете на массу порошкообразного фермента в сухом состоянии. Предпочтительное процентное содержание фермента в порошкообразном ферменте/высушенной распылением смеси составляет от 10 мас.% до 50 мас.%, и более предпочтительное процентное содержание фермента в порошкообразном ферменте/высушенной распылением смеси составляет от около 20 мас.% до 33 мас.%.

В одном варианте осуществления изобретения порошкообразный фермент может далее включать наполнитель. В соответствии с одним объектом изобретения наполнитель используют в количестве от около 95 мас.% до около 25 мас.% в расчете на массу порошкообразного фермента в сухом состоянии. Предпочтительное процентное содержание наполнителя в порошкообразном ферменте составляет от около 90 мас.% до 50 мас.%, и более предпочтительное процентное содержание наполнителя в порошкообразном ферменте составляет от около 80 мас.% до 67 мас.%.

В одном варианте осуществления изобретения наполнитель, используемый для получения порошкообразного фермента, может быть олигосахаридным наполнителем. В одном варианте осуществления изобретения среднечисловая молекулярная масса олигосахаридного наполнителя равна по меньшей мере примерно 1250 и средневесовая молекулярная масса равна по меньшей мере примерно 9000. В некоторых вариантах осуществления изобретения олигосахарный наполнитель имеет среднечисловую молекулярную массу, равную по меньшей мере примерно 1700, и средневесовую молекулярную массу, равную по меньшей мере примерно 15000. Конкретные олигосахариды могут включать, не ограничиваясь ими, мальтодекстрин, ксилан, маннан, фукоидан, галактоманнан, хитозан, раффинозу, стахиозу, пектин, инсулин, леван, граминан, амилопектин, сахарозу, лактулозу, лактозу, мальтозу, трегалозу, целлобиозу, нигеротриозу, мальтотриозу, мелезитозу, мальтотриулозу, раффинозу, кестозу и их смеси. В предпочтительном варианте осуществления изобретения олигосахаридный наполнитель является мальтодекстрином. Наполнители на основе олигосахаридов могут также включать, не ограничиваясь ими, водорастворимые неионогенные простые эфиры целлюлозы, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и их смеси. В другом варианте осуществления изобретения наполнитель может быть выбран из одного или нескольких следующих соединений, не ограничиваясь ими: трегалозы, лактозы, сахарозы, маннита, сорбита, глюкозы, целлобиозы, α-циклодекстрина и карбоксиметилцеллюлозы.

Приемлемые сложноэфирные субстраты/доноры ацильных групп

Приемлемые субстраты сложных эфиров карбоновых кислот могут включать сложные эфиры следующей формулы:

(а) один или несколько сложных эфиров формулы:

[X]_mR₅,

где Х означает сложноэфирную группу формулы R₆C(O)O;

R₆ означает C1-C7 гидрокарбильную часть с линейной, разветвленной или циклической структурой, необязательно замещенную гидроксильной группой или С1-С4 алкоксильной группой, при этом R₆, означающий С2-С7 часть, необязательно имеет одну или несколько простых эфирных связей;

R₅ означает С1-С6 гидрокарбильную часть с линейной, разветвленной или циклической структурой, пятичленную циклическую гетероароматическую часть или шестичленную циклическую ароматическую или гетероароматическую часть, необязательно замещенную гидроксильной группой, при этом каждый атом углерода в R₅ включает не более одной гидроксильной группы, не более одной сложноэфирной группы или группы карбоновой кислоты, и R₅ необязательно включает одну или несколько простых эфирных связей;

m является целым числом от 1 до числа атомов углерода в R₅, и растворимость указанных сложных эфиров в воде равна по меньшей мере 5 частям на миллион при 25°С;

(b) один или несколько глицеридов формулы:

где R₁ означает С1-С7 алкил с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или С1-С4 алкоксильной группой, R₃ и R₄ независимо означают Н или R₁C(O);

(с) один или несколько сложных эфиров формулы:

где R₁ означает С1-С7 алкил с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или С1-С4 алкоксильной группой, и R₂ означает С1-С10 алкил с прямой или разветвленной цепью, алкенил, алкинил, арил, алкиларил, алкилгетероарил, гетероарил, (СН₂СН₂О)_nили (СН₂СН(СН₃)-О)_nH, и n равно 1-10;

(d) один или несколько ацетилированных моносахаридов, ацетилированных дисахаридов или ацетилированных полисахаридов; либо

(е) любую комбинацию веществ по пунктам (а)-(d).

Приемлемые субстраты могут также включать один или несколько ацилированных сахаридов, выбираемых из группы, состоящей из ацилированных моно-, ди- и полисахаридов. В другом варианте осуществления изобретения ацилированные сахариды выбирают из группы, состоящей из ацетилированного ксилана, фрагментов ацетилированного ксилана, ацетилированной ксилозы (такой как тетраацетат ксилозы), ацетилированной глюкозы (такой как пентаацетат α-D-глюкозы, пентаацетат β-D-глюкозы, 1-тио-β-D-глюкозо-2,3,4,6-тетраацетат), пентаацетата β-D-галактозы, гексаацетата сорбита, октаацетата сахарозы, β-D-рибофуранозо-1,2,3,5-тетраацетата, β-D-рибофуранозо-1,2,3,4-тетраацетата, три-О-ацетил-D-галакталя, три-О-ацетил-D-глюкаля, тетраацетата β-D-ксилофуранозы, пентаацетата β-D-глюкопиранозы, β-D-глюкопиранозо-1,2,3,4-тетраацетата, β-D-глюкопиранозо-2,3,4,6-тетраацетата, 2-ацетамидо-2-дезокси-1,3,4,6-тетрацетил-β-D-глюкопиранозы, 2-ацетамидо-2-дезокси-3,4,6-триацетил-1-хлорид-α-D-глюкопиранозы, пентаацетата β-D-маннопиранозы и ацетилированной целлюлозы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения ацетилированный сахарид выбирают из группы, состоящей из β-D-рибофуранозо-1,2,3,5-тетраацетата, три-О-ацетил-D-галакталя, три-О-ацетил-D-глюкаля, октаацетата сахарозы и ацетилированной целлюлозы.

В другом варианте осуществления изобретения дополнительные приемлемые субстраты могут также включать 5-ацетоксиметил-2-фуральдегид, 3,4-диацетокси-1-бутен, 4-ацетоксибензойную кислоту, ацетат ванилина, ацетат метилового эфира пропиленгликоля, метиллактат, этиллактат, метилгликолят, этилгликолят, метилметоксиацетат, этилметоксиацетат, метил-3-гидроксибутират, этил-3-гидроксибутират и триэтил-2-ацетилцитрат.

В другом варианте осуществления изобретения приемлемые субстраты выбирают из группы, состоящей из моноацетина, диацетина, триацетина, монопропионина, дипропионина, трипропионина, монобутирина, дибутирина, трибутирина, пентаацетата глюкозы, тетроацетата ксилозы, ацетилированного ксилана, фрагментов ацетилированного ксилана, β-D-рибофуранозо-1,2,3,5-тетраацетата, три-О-ацетил-D-галакталя, три-О-ацетил-D-глюкаля, сложных моноэфиров или сложных диэфиров 1,2-этандиола, 1,2-пропандиола, 1,3-пропандиола, 1,2-бутандиола, 1,3-бутандиола, 2,3-бутандиола, 1,4-бутандиола, 1,2-пентандиола, 2,5-пентандиола, 1,5-пентандиола, 1,6-пентандиола, 1,2-гександиола, 2,5-гександиола, 1,6-гександиола и их смесей. В другом варианте осуществления изобретения субстрат является С1-С6 полиолом, включающим одну или несколько сложноэфирных групп. В предпочтительном варианте осуществления изобретения одна или несколько гидроксильных групп в С1-С6 полиоле замещены одной или несколькими ацетоксигруппами (такими как диацетат 1,3-пропандиола, диацетат 1,2-пропандиола, диацетат 1,4-бутандиола, диацетат 1,5-пентандиола и т.д.). В другом варианте осуществления изобретения субстрат является диацетатом пропиленгликоля (PGDA), диацетатом этиленгликоля (EGDA) или их смесью.

В другом варианте осуществления изобретения приемлемые субстраты выбирают из группы, состоящей из моноацетина, диацетина, триацетина, монопропионина, дипропионина, трипропионина, монобутирина, дибутирина и трибутирина. В соответствии с еще одним объектом изобретения субстрат выбирают из группы, состоящей из диацетина и триацетина. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения приемлемым субстратом является триацетин.

Сложный эфир карбоновой кислоты присутствует в концентрации, достаточной для обеспечения требуемой концентрации пероксикарбоновой кислоты в процессе катализируемого ферментом пергидролиза. Сложный эфир карбоновой кислоты не должен полностью растворяться в реакционном препарате, но должен обладать достаточной растворимостью для превращения сложного эфира в соответствующую пероксикарбоновую кислоту под воздействием пергидролазного катализатора. Сложный эфир карбоновой кислоты присутствует в реакционном препарате в концентрации от 0,05 мас.% до 40 мас.% от массы реакционного препарата, предпочтительно в концентрации от 0,1 мас.% до 20 мас.% от массы реакционного препарата и более предпочтительно в концентрации от 0,5 мас.% до 10 мас.% от массы реакционного препарата.

Источником перкислорода являются гранулы, находящиеся внутри или снаружи гидратируемой адгезивной пленки, которые могут включать аддукты пероксида водорода (например, аддукт мочевины и пероксида водорода (пероксид карбамида)), соли пербората, соли перкарбоната и соли пероксида. Концентрация перкислородного соединения в реакционном препарате может составлять от 0,0033 мас.% до около 50 мас.%, предпочтительно от 0,033 мас.% до около 40 мас.%, более предпочтительно от 0,1 мас.% до около 30 мас.%.

Известно, что многие пергидролазные катализаторы (цельные клетки, проницаемые цельные клетки и частично очищенные экстракты цельных клеток) обладают активностью каталазы (ЕС 1.11.1.6). Каталазы катализируют превращение пероксида водорода в кислород и воду. В соответствии с одним объектом изобретения у катализатора пергидролиза отсутствует активность каталазы. В соответствии с другим объектом изобретения в реакционный препарат может быть добавлен ингибитор каталазы. Специалист в данной области при необходимости может отрегулировать концентрацию ингибитора каталазы. Концентрация ингибитора каталазы обычно составляет от 0,1 мМ до около 1 М, предпочтительно от около 1 мМ до около 50 мМ, более предпочтительно от около 1 мМ до около 20 мМ.

В другом варианте осуществления изобретения у ферментного катализатора отсутствует значительная активность каталазы, или такой катализатор может быть создан с возможностью уменьшения или устранения активности катализы. Активность каталазы в клетке-хозяине может быть уменьшена или устранена путем подавления экспрессии гена, ответственного за активность каталазы, при помощи хорошо известных методов, которые включают, не ограничиваясь ими, транспозонный мутагенез, антисмысловую экспрессию РНК, направленный мутагенез и неспецифический мутагенез.

Концентрация пероксикарбоновой кислоты (например, перуксусной кислоты), образованной в результате пергидролиза по меньшей мере одного сложного эфира карбоновой кислоты, равна по меньшей мере примерно 0,1 части на миллион, предпочтительно по меньшей мере 0,5 части на миллион, 1 части на миллион, 5 частям на миллион, 10 частям на миллион, 20 частям на миллион, 100 частям на миллион, 200 частям на миллион, 300 частям на миллион, 500 частям на миллион, 700 частям на миллион, 1000 частей на миллион, 2000 частей на миллион, 5000 частей на миллион или 10000 частей на миллион перкислоты в течение 10 минут, предпочтительно в течение 5 минут после инициации реакции пергидролиза. Совершенно ясно, что специалист в данной области может отрегулировать реакционные компоненты для достижения требуемой концентрации перкислоты.

В соответствии с одним объектом изобретения время, необходимое для достижения требуемой концентрации перкислоты, составляет не более примерно двух часов, предпочтительно не более примерно 30 минут, более предпочтительно не более примерно 10 минут и наиболее предпочтительно составляет примерно 5 минут или меньше. В соответствии с другими объектами изобретения поверхность полости рта контактирует с пероксикарбоновой кислотой, образовавшейся вследствие процессов, рассмотренных в настоящем описании изобретения, в течение 5 минут гидратации и объединения реакционных компонентов. В одном варианте осуществления изобретения зубная эмаль контактирует с пероксикарбоновой кислотой, образовавшейся вследствие процессов с использованием композиций по настоящему изобретению, в течение периода времени от около 5 минут до около 24 часов или от около 5 минут до 2 часов после объединения (в результате гидратации, осуществляемой пользователем) указанных реакционных компонентов, присутствующих внутри или снаружи отбеливающей полоски/пленки.

Определение концентрации пероксикарбоновой кислоты и пероксида водорода при помощи анализа методом ВЭЖХ

Анализ реагентов и продуктов может быть произведен разными аналитическими методами, которые включают, не ограничиваясь ими, титрование, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), газовую хроматографию (GC), масс-спектроскопию (MS), капиллярный электрофорез (СЕ), аналитический метод, описанный в публикации U. Pinkernell et al. (Anal. Chem., 69(17): 3623-3627 (1997)), и анализ с использованием 2,2′-азинобис(3-этилбензотазолин)-6-сульфоната (ABTS) (U. Pinkernell et al., Analyst, 122: 567-571 (1997) and Dinu et al., Adv. Funct. Mater., 20: 392-398 (2010), описанные в нижеследующих примерах.

Типичные варианты осуществления изобретения

Вариант осуществления изобретения 1. Отбеливающая зубы полоска (полоска 1), включающая двухстороннюю гидратируемую адгезивную пленку, на одну сторону которой нанесен гранулированный отбеливающий ингредиент, при этом отбеливающая зубы полоска далее содержит внутри или снаружи пленки либо в гранулах, нанесенных на одну сторону пленки:

(i) белок, обладающий пергидролитической активностью, который содержит сигнатурный фрагмент члена семейства карбогидрат-эстераз 7;

(ii) донор ацильной группы, например, выбираемый из сложных эфиров карбоновой кислоты и ацильных соединений.

Вариант осуществления изобретения 2. Полоска 1, в которой белок, обладающий активностью пергидролазы, включает аминокислотную последовательность, выбираемую из:

b) аминокислотной последовательности, содержащей i) фрагмент RGQ в положениях, соответствующих положениям 118-120 SEQ ID NO:1; ii) фрагмент GXSQG в положениях, соответствующих положениям 186-190 SEQ ID NO:1; и iii) фрагмент НЕ в положениях, соответствующих положениям 303-304 SEQ ID NO:1;

с) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:1.

Вариант осуществления изобретения 3. Отбеливающая зубы полоска по варианту осуществления изобретения 1 или 2, в которой белок, обладающий пергидролитической активностью, включает аминокислотную последовательность, которая обладает сродством связывания или образования комплекса с поверхностями полости рта или альтернативно обладает сродством связывания или образования комплекса с одним или несколькими компонентами отбеливающей полоски.

Вариант осуществления изобретения 4. Любая из вышеуказанных полосок, включающая белок, обладающий активностью пергидролазы, который связывается или образует комплекс с поверхностями полости рта (такими как, например, тонкая пленка, покрывающая зубы, или зубная эмаль) и включает аминокислотную последовательность, выбираемую из:

b) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:2.

Вариант осуществления изобретения 5. Любая из вышеуказанных полосок, в которой белок, обладающий пергидролитической активностью, нанесен в гранулированной форме на одну сторону пленки.

Вариант осуществления изобретения 6. Любая из вышеуказанных полосок, в которой вторая сторона гидратируемой адгезивной пленки присоединена к слою, препятствующему растворению гидратируемой адгезивной пленки.

Вариант осуществления изобретения 7. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гранулированный отбеливающий ингредиент покрыт быстро растворяющимся веществом, таким как кукурузный крахмал, сульфат натрия, аравийская камедь и их комбинации.

Вариант осуществления изобретения 8. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гранулированный отбеливающий ингредиент выбирают из гранул, включающих органические и/или неорганические окислители, такие как, например, пероксид водорода, пероксид мочевины, перкарбонаты, пербораты, пероксимонофосфаты, пероксидисульфаты, пероксикислоты и перуксусная кислота.

Вариант осуществления изобретения 9. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гранулированный отбеливающий ингредиент выбирают из твердых пероксидов и доноров твердых пероксидов, таких как, например, соли или комплексы пероксидов (такие как пероксифосфат, пероксикарбонат, перборат, пероксисиликат или персульфат, например, пероксифосфат кальция, перборат натрия, пероксид карбоната натрия, пероксифосфат натрия и персульфат калия), гипохлориты, пероксид мочевины, полимерные комплексы пероксида водорода, такие как полимерные комплексы пероксида водорода с поливинилпирролидоном, пероксиды металлов, например, пероксид цинка и пероксид кальция, перкислоты и их комбинации.

Вариант осуществления изобретения 10. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гранулированный отбеливающий ингредиент включает пероксид мочевины, полимерный комплекс пероксида водорода с поливинилпирролидоном, перкарбонат натрия или комбинацию двух или более ингредиентов.

Вариант осуществления изобретения 11. Любая из вышеуказанных полосок, в которой размер (D₅₀) гранул на одной стороне пленки, например, гранулированного отбеливающего ингредиента, пергидролазы или донора ацильной группы в гранулированной форме равен 0,1-300 микронам, например, 10-275 микронам, например, 100-250 микронам.

Вариант осуществления изобретения 12. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гранулированный отбеливающий ингредиент составляет более 0,01%, например, 0,01-0,1%, например, 0,02-0,08% от общей массы гидратируемой адгезивной пленки и нанесенного на нее гранулированного отбеливающего ингредиента.

Вариант осуществления изобретения 13. Любая из вышеуказанных полосок, в которой количество гранулированного отбеливающего агента на одной стороне гидратируемой адгезивной пленки равно 0,001-10 мг/см², например, 0,001-1 мг/см², например, 0,005-0,015 мг/см².

Вариант осуществления изобретения 14. Любая из вышеуказанных полосок, в которой донор ацильной группы выбирают из (i) одного или нескольких сложных эфиров С_2-18 карбоновой кислоты, например, сложных эфиров С_2-6 карбоновой кислоты (например, сложных ацетиловых эфиров), включающих сложные эфиры низшей алкилкарбоновой кислоты с линейной или разветвленной цепью, необязательно замещенные гидроксильной и/или С_1-4 алкоксильной группой; (ii) одного или нескольких ацилированных глицеридов (например, моно-, ди- и триглицеридов), (iii) ацилированных сахаридов и (iv) их смесей.

Вариант осуществления изобретения 15. Любая из вышеуказанных полосок, в которой донор ацильной группы выбирают из 1,2,3-триацетоксипропана (иногда определяемого в настоящем описании изобретения как триацетин или триацетат глицерина) и ацилированных сахаридов.

Вариант осуществления изобретения 16. Любая из вышеуказанных полосок, которая содержит донор ацильной группы, включающий соединение сложного эфира с растворимостью в воде, равной по меньшей мере 5 частям на миллион при 25°С.

Вариант осуществления изобретения 17. Любая из вышеуказанных полосок, которая включает перкислоту или образует перкислоту при использовании.

Вариант осуществления изобретения 18. Любая из вышеуказанных полосок, в которой указанные ингредиенты присутствуют в количествах, достаточных для образования при смешивании отбеливающего агента в количестве и концентрации, обеспечивающей эффективное отбеливание зубов.

Вариант осуществления изобретения 19. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гидратируемая адгезивная пленка включает один или несколько водорастворимых полимеров, выбираемых из простых эфиров гидрофильной целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы), поливинилацетатов, карбомеров (например, CARBOPOL® 971Р), полисахаридных камедей (например, ксантановой камеди), модифицированных пищевых крахмалов, желатина (например, животного или рыбьего желатина), перекрестносшитых карбоксивиниловых сополимеров, перекрестносшитых поливинилпирролидонов, полиэтиленоксида (например, POLYOX™), полиакриловых кислот и полиакрилатов, поливиниловых спиртов, альгината, казеина, пуллулана и их комбинаций.

Вариант осуществления изобретения 20. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гидратируемая адгезивная пленка включает один или несколько водорастворимых полимеров, выбираемых из простых эфиров гидрофильной целлюлозы (например, гидроксипропилметилцеллюлозы или гидроксипропилцеллюлозы), полиэтиленоксида, поливинилацетатов и карбомеров (например, CARBOPOL® 971Р) и их комбинаций.

Вариант осуществления изобретения 21. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гидратируемая адгезивная пленка включает гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилацетаты и карбомер, например, в соотношении массы в сухом состоянии, равном 10-20 НРМС: 2-10 PVAc: 1 карбомера.

Вариант осуществления изобретения 22. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гидратируемая адгезивная пленка далее включает пластификатор, например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль или триацетин.

Вариант осуществления изобретения 23. Любая из вышеуказанных полосок, в которой на одну сторону гидратируемой адгезивной пленки до применения нанесено защитное покрытие.

Вариант осуществления изобретения 24. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гидратируемая адгезивная пленка имеет вязкость, равную по меньшей мере 100000 сантипуаз при активации, например, 100000-200000 сантипуаз.

Вариант осуществления изобретения 25. Любая из вышеуказанных полосок, в которой гидратируемая адгезивная пленка является по существу сухой до применения.

Вариант осуществления изобретения 26. Любая из вышеуказанных полосок, в которой толщина гидратируемой адгезивной пленки равна 0,1-5 мм, например, 0,5-5 мм.

Вариант осуществления изобретения 27. Любая из вышеуказанных полосок, которая имеет примерно следующие общие размеры: длина 2-10 см × ширина 0,5-2 см × толщина 0,1-10 мм, например, 1-10 мм, при этом площадь поверхности одной стороны равна 5-20 см², например, примерно 5-15 см², например, примерно 10 см².

Вариант осуществления изобретения 28. Любая из вышеуказанных полосок, которая включает покрытые гранулы полимерного комплекса пероксида водорода с поливинилпирролидоном, пероксида мочевины и/или перкарбоната натрия и гранулы пергидролазы на одной стороне пленки, а также триацетин, диспергированный в пленке.

Вариант осуществления изобретения 29. Любая из вышеуказанных полосок, которая далее включает гранулы уменьшающего чувствительность агента, например, нитрата калия или аргинина.

Вариант осуществления изобретения 30. Способ (способ 2) отбеливания зубов, который включает прикладывание вышеописанной полоски, например, полоски 1 и последующих полосок, одной стороной непосредственно к зубам и удерживание полоски в указанном положении в течение периода времени, например, по меньшей мере 5 минут, например, 10-60 минут, например, 10-30 минут, достаточного для отбеливания зубов.

Вариант осуществления изобретения 31. Способ (способ 3) изготовления полоски для отбеливания зубов, например, вышеописанной полоски 1 и последующих полосок, который включает получение полусухой гидратируемой адгезивной пленки, например, вышеописанной пленки, которую отливают из воды и не полностью сушат или увлажняют, нанесение на одну поверхность пленки гранул гранулированного отбеливающего ингредиента, например, вышеописанного ингредиента, и сушку пленки с нанесенными на одну поверхность гранулами.

Например, полоски могут быть изготовлены путем создания гидратируемой адгезивной пленки стандартными методами и последующего нанесения гранулированного отбеливающего ингредиента на одну поверхность пленки. Полоски с гидратируемой адгезивной пленкой могут быть отлиты из воды разными методами, известными в данной области, такими как экструзия, или отлиты из водной суспензии (например, с содержанием твердых веществ, равным 10-30%) на нагретую ленту, из которой выпаривают воду. Альтернативно пленку сушат и затем повторно увлажняют. Гранулы могут быть нанесены на поверхность пленки в полусухом состоянии, то есть достаточно влажную, чтобы быть липкой, благодаря чему гранулы прилипают к поверхности пленки. После полного высыхания пленки и охлаждения до комнатной температуры гранулы продолжают сцепляться с поверхностью пленки. Поэтому до использования гидратируемая адгезивная пленка и полоска в целом являются по существу сухими. Так как пероксид находится только на поверхности пленки, для достижения эффективной концентрации на данной поверхности необходимо относительно небольшое количество гранул.

Предпочтительные варианты осуществления изобретения

Под воздействием слюны или других источников влаги (таких как водопроводная вода) гранулы растворяются и высвобождают реакционные компоненты для ферментативного образования требуемой перкислоты. Гидратация гидратируемого адгезивного слоя увеличивает липкость пленки, благодаря чему отбеливающая пленка/полоска связывается с поверхностью-мишенью (например, зубной эмалью).

Гидратируемая адгезивная пленка включает один или несколько водорастворимых полимеров, приемлемых для полости рта, которые выбирают из простых эфиров гидрофильной целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы), поливинилацетатов, карбомеров (например, CARBOPOL® 971Р), полисахаридных камедей (например, ксантановой камеди), модифицированных пищевых крахмалов, желатина (например, животного или рыбьего желатина), перекрестносшитых карбоксивиниловых сополимеров, перекрестносшитых поливинилпирролидонов, полиэтиленоксида (например, POLYOX™), полиакриловых кислот и полиакрилатов, поливиниловых спиртов, альгината, казеина, пуллулана и их комбинаций. В данной области известны адгезивные гелевые препараты, предназначенные для использования с отбеливающими зубы агентами, например, описанные в патентах США №№ 7862801, 5746598, 6730316 и 7128899, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Адгезивная пленка позволяет перкислотному отбеливающему агенту оставаться в соприкосновении с зубами в течение длительных периодов времени и защищает мягкие ткани, поэтому адгезивная пленка должна обладать высокой вязкостью, например, вязкостью, равной по меньшей мере 100000 сантипуаз (примерно 100 паскаль-секунду (Па·сек)), предпочтительно 100000-200000 сантипуаз (100-200 Па·сек).

Носитель или подложка, используемые для защиты гидратируемой адгезивной пленки от быстрого разрушения или растворения, могут быть изготовлены из текстильного материала, ткани, древесного композиционного материала, смолы, эластомера, бумаги, нерастворимых или менее растворимых производных целлюлозы, таких как этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы, поливинилхлорида, воска, PARAFILM™, полиэтилена, поливинилового спирта, тефлона (TEFLON™), поливинилхлорида, поливинилацетата и их производных.

Гранулированный отбеливающий ингредиент может быть твердым пероксидом и донором твердого пероксида, выбираемым из солей или комплексов пероксида (таких как пероксифосфат, пероксикарбонат, перборат, пероксисиликат или персульфат, например, пероксифосфат кальция, перборат натрия, пероксид карбоната натрия, пероксифосфат натрия и персульфат калия), гипохлоритов, пероксида мочевины, полимерных комплексов пероксида водорода, таких как полимерные комплексы пероксида водорода с поливинилпирролидоном, пероксидов металлов, например, пероксида цинка и пероксида кальция, твердой перкислоты и их комбинаций. В конкретных вариантах осуществления изобретения гранулированный отбеливающий ингредиент является пероксидом мочевины или полимерным комплексом пероксида водорода с поливинилпирролидоном. На гранулированный отбеливающий ингредиент может быть необязательно нанесено покрытие, обеспечивающее лучшую устойчивость при хранении (например, покрытие из сульфата натрия, кукурузного крахмала или аравийской камеди).

Список предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 1. Отбеливающая зубы полоска, включающая двухстороннюю гидратируемую адгезивную пленку, на одну сторону которой нанесен гранулированный отбеливающий ингредиент, при этом отбеливающая зубы полоска далее содержит внутри или снаружи пленки либо в виде гранул, нанесенных на одну сторону пленки:

а) фермент, обладающий пергидролитической активностью и содержащий сигнатурный фрагмент семейства карбогидрат-эстераз 7 (СЕ-7), соответствующий эталонной последовательности SEQ ID NO:1, который включает:

i) фрагмент RGQ в положениях, соответствующих положениям 118-120 SEQ ID NO:1;

ii) фрагмент GXSQG в положениях, соответствующих положениям 186-190 SEQ ID NO:1 и

iii) фрагмент НЕ в положениях, соответствующих положениям 303-304 SEQ ID NO:1;

b) по меньшей мере один субстрат донора ацильной группы, выбираемый из группы, состоящей из:

i) сложных эфиров формулы

[X]_mR₅,

где Х означает сложноэфирную группу формулы R₆C(O)O;

R₆ означает C1-C7 гидрокарбильную часть с линейной, разветвленной или циклической структурой, необязательно замещенную гидроксильными группами или С1-С4 алкоксильными группами, при этом R₆, означающий С2-С7 часть, необязательно имеет одну или несколько простых эфирных связей;

R₅ означает С1-С6 гидрокарбильную часть с линейной, разветвленной или циклической структурой, пятичленную циклическую гетероароматическую часть или шестичленную циклическую ароматическую или гетероароматическую часть, необязательно замещенную гидроксильными группами, при этом каждый атом углерода в R₅ включает не более одной гидроксильной группы, не более одной сложноэфирной группы или группы карбоновой кислоты И R₅ необязательно включает одну или несколько простых эфирных связей;

m является целым числом от 1 до числа атомов углерода в R₅, и растворимость указанных сложных эфиров в воде равна по меньшей мере 5 частям на миллион при 25°С;

ii) глицериды формулы:

где R₁ означает С1-С7 алкил с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или С1-С4 алкоксильной группой, R₃ и R₄ независимо означают Н или R₁C(O);

iii) один или несколько сложных эфиров формулы:

где R₁ означает С1-С7 алкил с прямой или разветвленной цепью, необязательно замещенный гидроксилом или С1-С4 алкоксильной группой, и R₂ означает С1-С10 алкил с прямой или разветвленной цепью, алкенил, алкинил, арил, алкиларил, алкилгетероарил, гетероарил, (СН₂СН₂О)_nили (СН₂СН(СН₃)-О)_nH, и n равно 1-10;

iv) ацетилированные сахариды, выбираемые из группы, состоящей из ацетилированных моносахаридов, ацетилированных дисахаридов и ацетилированных полисахаридов:

гидратируемая адгезивная пленка при гидратации высвобождает пероксид водорода из гранулированного отбеливающего ингредиента и указанный фермент катализирует образование эффективного количества перкислоты.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 2. Отбеливающая зубы полоска по предпочтительному варианту осуществления изобретения 1, в которой фермент, обладающий пергидролитической активностью, включает аминокислотную последовательность, выбираемую из:

а) SEQ ID NO:1 и

b) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:1.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 3. Отбеливающая зубы полоска по предпочтительному варианту осуществления изобретения 1, в которой фермент, обладающий пергидролитической активностью, далее включает связывающий домен, гибридизированный с N- или С-концом фермента, который обладает сродством к ткани полости рта или к отбеливающей зубы полоске.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 4. Отбеливающая зубы полоска по предпочтительному варианту осуществления изобретения 3, в которой связывающий домен, обладающий сродством к ткани полости рта, включает аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:178-197.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 5. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой фермент, обладающий пергидролитической активностью, характеризуется сродством к ткани полости рта и содержит аминокислотную последовательность, выбираемую из:

а) SEQ ID NO:2 и

b) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO:2.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 6. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, далее включающая подложку, присоединенную к другой стороне гидратируемой адгезивной пленки, которая препятствует растворению гидратируемой адгезивной пленки.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 7. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой на гранулированный отбеливающий ингредиент нанесено водорастворимое покрытие, способное растворяться при гидратации.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 8. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой гранулированный отбеливающий ингредиент выбирают из твердых пероксидов и доноров твердых пероксидов.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 9. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой гранулированный отбеливающий ингредиент выбирают из солей пероксида, комплексов пероксида, пероксифосфата, пероксикарбоната, пербората, пероксисиликата, персульфатов, пероксифосфата кальция, пербората натрия, пероксида карбоната натрия, пероксифосфата натрия, персульфата калия, гипохлоритов, пероксида мочевины, полимерных комплексов пероксида водорода, полимерных комплексов пероксида водорода с поливинилпирролидоном, пероксидов металлов, пероксида цинка, пероксида кальция и их комбинаций.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 10. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой гранулированный отбеливающий ингредиент включает пероксид мочевины. В некоторых вариантах осуществления изобретения гранулированный отбеливающий ингредиент включает полимерный комплекс пероксида водорода с поливинилпирролидоном. В некоторых вариантах осуществления изобретения полимерный комплекс пероксида водорода с поливинилпирролидоном является полимерным комплексом пероксида водорода с перекрестносшитым поливинилпирролидоном.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 11. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента составляет от 10 микрон до 300 микрон, например, от 10 микрон до 200 микрон.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 12. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, которая включает от около 0,01 мас.% до около 0,1 мас.% перкислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения гранулированный отбеливающий ингредиент включает от около 0,1 мас.% до около 30 мас.% источника перкислорода.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 13. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой количество гранулированного отбеливающего агента на одной стороне гидратируемой адгезивной пленки составляет от 0,001 мг/см² до 10 мг/см², например, от 0,001 мг/см² до 1 мг/см².

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 14. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой субстрат донора ацильной группы является 1,2,3-триацетоксипропаном.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 15. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой гидратируемая адгезивная пленка включает один или несколько водорастворимых полимеров, выбираемых из простого эфира гидрофильной целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилацетата, карбомера, полисахаридной камеди, ксантановой камеди, модифицированного пищевого крахмала, желатина, животного или рыбьего желатина, перекрестносшитого карбоксивинилового сополимера, перекрестносшитого поливинилпирролидона, полиэтиленоксида, полиакриловой кислоты, полиакрилата, поливинилового спирта, альгината, казеина, пуллулана и комбинации двух или более указанных веществ.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 16. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой гидратируемая адгезивная пленка включает один или несколько водорастворимых полимеров, выбираемых из простого эфира гидрофильной целлюлозы, поливинилацетата, карбомера и комбинации двух или более указанных веществ.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 17. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой гидратируемая адгезивная пленка включает гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), поливинилацетат (PVAc) и карбомер в соотношении массы в сухом состоянии НРМС:PVAc:карбомер, равном 10-20:2-10:1.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 18. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в которой гидратируемая адгезивная пленка далее включает пластификатор.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 19. Отбеливающая зубы полоска по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, которая далее включает пропиленгликоль.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 20. Способ отбеливания зубов, который включает:

а) получение упаковочной системы, включающей отбеливающую зубы полоску по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения;

b) удаление отбеливающей зубы полоски из упаковочной системы; и

с) осуществление контактирования отбеливающей зубы полоски непосредственно с зубами в течение периода времени, достаточного для отбеливания зубов, при этом отбеливающая зубы полоска гидратируется влагой, присутствующей в полости рта или на поверхности зубов, после стадии (b), но до стадии (с).

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 21. Способ по предпочтительному варианту осуществления изобретения 20, в котором отбеливающая полоска далее включает подложку, присоединенную к другой стороне гидратируемой адгезивной пленки, которая препятствует растворению гидратируемой адгезивной пленки.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 22. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента составляет от 10 микрон до 200 микрон.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 23. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором гранулированный отбеливающий ингредиент составляет более 0,01 мас.% от общей массы гидратируемой адгезивной пленки и нанесенного на нее гранулированного отбеливающего ингредиента. В некоторых вариантах осуществления изобретения гранулированный отбеливающий ингредиент составляет более 0,05 мас.% от общей массы гидратируемой адгезивной пленки и нанесенного на нее гранулированного отбеливающего ингредиента. В некоторых вариантах осуществления изобретения гранулированный отбеливающий ингредиент составляет от около 0,01 мас.% до около 0,1 мас.% от общей массы гидратируемой адгезивной пленки и нанесенного на нее гранулированного отбеливающего ингредиента.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 24. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором количество гранулированного отбеливающего агента на одной стороне гидратируемой адгезивной пленки составляет от 0,001 мг/см² до 1 мг/см².

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 25. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором субстрат донора ацильной группы является 1,2,3-триацетоксипропаном.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 26. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором гидратируемая адгезивная пленка включает один или несколько водорастворимых полимеров, выбираемых из простого эфира гидрофильной целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилацетата, карбомера, полисахаридной камеди, ксантановой камеди, модифицированного пищевого крахмала, желатина, животного или рыбьего желатина, перекрестносшитого карбоксивинилового сополимера, перекрестносшитого поливинилпирролидона, полиэтиленоксида, полиакриловой кислоты, полиакрилата, поливинилового спирта, альгината, казеина, пуллулана и комбинации двух или более указанных веществ.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 27. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором гидратируемая адгезивная пленка включает один или несколько водорастворимых полимеров, выбираемых из простого эфира гидрофильной целлюлозы, поливинилацетата, карбомера и комбинации двух или более указанных веществ.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 28. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором гидратируемая адгезивная пленка включает гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), поливинилацетат (PVAc) и карбомер в соотношении массы в сухом состоянии НРМС:PVAc:карбомера, равном 10-20:2-10:1.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 29. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором гидратируемая адгезивная пленка далее включает пластификатор.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 30. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором гидратируемая адгезивная пленка далее включает пропиленгликоль.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 31. Способ по любому из вышеуказанных предпочтительных вариантов осуществления изобретения, в котором на гранулированный отбеливающий ингредиент нанесено водорастворимое покрытие, способное растворяться при гидратации.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения 32. Способ создания отбеливающей зубы полоски, включающий:

а) получение полусухой гидратируемой адгезивной пленки;

b) нанесение на одну поверхность пленки гранул гранулированного отбеливающего ингредиента, которые сцепляются в поверхностью пленки; и

с) сушку пленки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента составляет от 10 микрон до 300 микрон. В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента составляет от 25 микрон до 200 микрон. В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента составляет от 35 микрон до 150 микрон. В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента составляет от 50 микрон до 125 микрон. В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента составляет от 60 микрон до 100 микрон. В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента равен примерно 64 микронам. В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц гранулированного отбеливающего ингредиента равен примерно 94 микронам.

В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц фермента, обладающего пергидролитической активностью, составляет от 100 микрон до 300 микрон. В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц фермента, обладающего пергидролитической активностью, составляет от 150 микрон до 275 микрон. В некоторых вариантах осуществления изобретения средний диаметр (D50) частиц фермента, обладающего пергидролитической активностью, составляет от 175 микрон до 250 микрон.

Все ингредиенты, предназначенные для использования в полосках по настоящему изобретению, должны быть перорально приемлемыми. Термин “перорально приемлемый” в значении, использованном в настоящем описании изобретения, означает, что ингредиент присутствует в полоске по настоящему изобретению в количестве и форме, которые не делает указанную полоску опасной для использования в полости рта.

Диапазоны, использованные в настоящем описании изобретения, служат для краткого описания каждого значения в указанном диапазоне. Любое значение в диапазоне может быть выбрано в качестве конца диапазона. Кроме того, все процитированные материалы полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. В случае возникновения противоречия в определении, приведенном в настоящем описании изобретения и процитированном материале, преимущество имеет настоящее описание изобретения.

За исключением особо оговоренных случаев все процентные значения и количества, приведенные в настоящем описании изобретения, являются массовыми процентами. Количества указаны на основании активной массы вещества.

Примеры

Приведенные ниже примеры демонстрируют предпочтительные объекты изобретения. Специалистам в данной области должно быть понятно, что способы, описанные в примерах, хорошо зарекомендовали себя при применении настоящего изобретения и, таким образом, могут считаться предпочтительными вариантами осуществления изобретения. Однако специалистам в данной области должно быть понятно в свете настоящего описания изобретения, что в конкретные варианты осуществления изобретения могут быть внесены многие изменения с достижением подобных или аналогичных результатов, не выходящие за пределы существа и объема способов, рассмотренных в настоящем описании изобретения, и приведенных примеров.

Все реагенты и вещества были приобретены в компаниях DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), TCI America (Portland, OR), Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN), Thermo Scientific (Pierce Protein Research Products) (Rockford, IL) или Sigma/Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO) за исключением особо оговоренных случаев.

Аббревиатуры, приведенные в настоящем описании изобретения, соответствуют единицам измерения, методам, свойствам или соединениям и имеют следующие значения: “сек” означает секунды, “мин” означает минуты, “ч” означает часы, “мкл” означает микролитры, “мл” означает миллилитры, “л” означает литры, “мМ” означает миллимолярный, “М” означает молярный, “ммоль” означает миллимоли, “ч.н.м.” означает части на миллион, “мас.” означает массу, “мас.%” озачает массовые проценты, “г” означает граммы, “мг” означает миллиграммы, “мкг” означает микрограммы и “нг” означает нанограммы.

Пример 1

Полоску получают вышеописанным способом путем создания гидратируемой адгезивной пленки, после чего на одну сторону пленки, которая все еще остается липкой, наносят гранулированный отбеливающий агент и гранулированный фермент, используя ингредиенты, указанные в таблице 1. Указанная полоска медленно разрушается во рту во время применения и не требует удаления.

Полоску, описанную в примере 1, отливают из воды путем экструзии или отливают из водной суспензии (например, при 10-30% содержании твердых веществ) на нагретую ленту, с которой вода испаряется. Гранулы наносят на поверхность указанной пленки, когда пленка находится в полусухом или сухом состоянии и все еще остается липкой. При охлаждении до комнатной температуры гранулы прилипают к поверхности пленки. Для полоски площадью 10 см² и массой 10 мг/см², указанная формула позволяет получить 5 мг триацетина. С учетом того, что на полоске распределено 1,4 мг отбеливающих гранул и 0,3 мг гранул фермента, указанная доза является достаточной для образования необходимого количества перкислоты непосредственно на поверхности зубов, благодаря чему указанная полоска значительно превосходит отбеливающую полоску, содержащую только пероксид. (Общая доза пероксида на полосках, содержащих только пероксид, обычно равна примерно 3-10 мг пероксида).

Под воздействием слюны или других источников воды (таких как водопроводная вода) гранулы сразу же растворяются и становятся активными. Адгезивный слой также активируется и плотно прилипает к зубам. Полоска по примеру 1 медленно разрушается во рту с течением времени, поэтому пользователю не нужно удалять указанную полоску.

Пример 2

Полоску получают вышеописанным способом путем создания гидратируемой адгезивной пленки, после чего на одну сторону полоски, которая все еще остается липкой, наносят гранулированные агенты, а к другой стороне присоединяют защитную подложку, используя ингредиенты, указанных в таблице 2. Так как подложка не растворяется, пользователь должен удалить полоску по истечении времени, достаточного для отбеливания зубов, обычно примерно через 10-30 минут. Два указанных слоя могут быть также образованы одновременно путем экструзии или литья из растворителя, после чего на поверхность гидратируемой адгезивной пленки может быть нанесен гранулированный отбеливающий агент.

Пример 3

Частицы разного размера комплекса пероксида водорода с поливинилпирролидоном и фермента, обладающего пергидролитической активностью (“фермент”), оценивали в отношении их способности образовывать перуксусную кислоту равномерно по всей поверхности гидратируемой адгезивной полоски, содержащей триацетин.

Для оценки образования перуксусной кислоты из указанного продукта из пленки вырезали диски размером 0,9 см (3/8 дюйма). Каждый диск гидратировали 20 мкл 50 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,2, и инкубировали при 37°С в течение 15 минут. К пленке добавляли 380 мкл 0,1 М раствора фосфорной кислоты, чтобы погасить ферментативную реакцию и растворить образец для выполнения анализа. Раствор анализировали в отношении содержания перуксусной кислоты при помощи ВЭЖХ, используя метод, описанный в патенте США № 7829315, выданный DiCosimo et al. Для каждого исследования из полоски с длиной пленки 60 см (24 дюйма) вырезали минимум три образца.

Образцы полосок с покрытием из фермента и комплекса пероксида водорода с поливинилпирролидоном были получены путем введения фермента в полимерную пленку на основе пуллулана. Сухую пленку, содержащую фермент, измельчали и просеивали, получая частицы размером 60-80 меш (177-250 мкм). Фермент в виде частиц затем смешивали с комплексом пероксида водорода с поливинилпирролидоном (PEROXYDONE™ XL-10, Ashland Inc., Wilmington, DE). Указанную смесь осаждали на двухслойную пленку с гидратируемым адгезивным слоем, содержащим полиэтиленоксид и триацетин, и подложкой из поливинилового спирта, образующей нерастворимый опорный слой. Результаты оценки образования перуксусной кислоты в двух последующих исследованиях приведены в таблице 3. Образцы, которые оценивали в начале и конце серийного испытания, характеризуются неоднородным содержанием перуксусной кислоты.

PEROXYDONE™ XL-10 подвергали дальнейшей обработке с образованием более крупных частиц методом грануляции в этаноле с большим сдвигающим усилием. После грануляции образец просеивали, получая частицы размером 60-200 меш (75-250 мкм). Распределение по размерам частиц PEROXYDONE™ XL-10, используемого для получения образцов, показанных в таблице 3, и частиц PEROXYDONE™ XL-10 после грануляции с большим сдвигающим усилием и просеивания показано в таблице 4. Образцы измеряли в устройстве Beckman Coulter LS13320, оснащенном питателем для сухого материала Tornado. Порошки анализировали без диспергирования в жидкости.

Для серийного испытания другой полоски сначала был получен образец фермента, погруженный в матрицу из пуллулана при концентрации, которая в два раза превышала концентрацию образцов, показанных в таблице 3. Пленку из пуллулана измельчали и просеивали с получением частиц размером 60-80 меш (177-250 мкм) и объединяли с гранулированным PEROXYDONE™ XL-10. Полученную смесь наносили на аналогичную двухслойную пленку, описанную выше. Данные оценки указанного образца в отношении образования перуксусной кислоты представлены в таблице 4, и полученные результаты показывают более высокое и более однородное образование перуксусной кислоты на протяжении всего серийного испытания.

Реферат

Изобретение относится к области биохимии. Предложена отбеливающая зубы полоска, включающая двустороннюю гидратируемую адгезивную пленку, на одну сторону которой нанесен гранулированный отбеливающий ингредиент, при этом отбеливающая зубы полоска далее включает нанесенные на ту же сторону пленки: а) фермент, который обладает пергидролитической активностью и находится в форме гранул; и b) субстрат донора ацильной группы, представляющий собой триацетин, где триацетин не находится в форме гранул. Изобретение позволяет предоставлять перкислоту в непосредственной близости к зубам и, таким образом, обеспечивает лучшее отбеливание зубов при значительно меньших общих количествах пероксида. 20 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.

Формула