Олигонуклеотиды, содержащие модифицированные нуклеозиды - RU2019102588A
Код документа: RU2019102588A
Формула
1. Аптамер, содержащий по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, причем первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами;
при этом первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и причем второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин; или
при этом первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин;
причем модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo; и при этом модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.
2. Аптамер по п. 1, в котором фрагмент модифицированного в 5-положении уридина ковалентно связан посредством линкера, содержащего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
3. Аптамер по п. 1 или п. 2, в котором фрагмент модифицированного в 5-положении цитидина ковалентно связан посредством линкера, содержащего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
4. Аптамер по любому из пп. 1-3, в котором модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.
5. Аптамер по любому из пп. 1-4, в котором модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
6. Аптамер по п. 1, в котором по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU.
7. Аптамер по п. 1, в котором по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU и ThrdU.
8. Аптамер по п. 6 или п. 7, в котором по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.
9. Аптамер по любому из пп. 1-8, который содержит участок на 5'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, причем участок на 5'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов.
10. Аптамер по любому из пп. 1-9, который содержит участок на 3'-конце аптамера, который составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину, причем участок на 3'-конце аптамера не содержит модифицированных в 5-положении пиримидинов.
11. Аптамер по любому из пп. 1-10, который составляет от 20 до 100 или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
12. Композиция, содержащая множество полинуклеотидов, в которой каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, причем первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами;
при этом первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и причем второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин; или
при этом первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин;
причем модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo; и при этом модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.
13. Композиция по п. 12, в которой каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида.
14. Композиция по п. 13, в которой фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
15. Композиция по любому из пп. 12-14, в которой каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида.
16. Композиция по п. 15, в которой фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
17. Композиция по любому из пп. 12-16, в которой фрагмент модифицированного в 5-положении уридина ковалентно связан посредством линкера, содержащего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
18. Композиция по любому из пп. 12-17, в которой фрагмент модифицированного в 5-положении цитидина ковалентно связан посредством линкера, содержащего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
19. Композиция по любому из пп. 12-18, в которой модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.
20. Композиция по любому из пп. 12-19, в которой модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
21. Композиция по любому из пп. 12-16, в которой по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
22. Композиция по любому из пп. 12-16, в которой по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU.
23. Композиция по п. 21 или п. 22, в которой по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой TyrdU.
24. Композиция по любому из пп. 12-23, в которой каждый полинуклеотид содержит произвольный участок.
25. Композиция по п. 24, в которой произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину.
26. Композиция по любому из пп. 12-25, в которой каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
27. Композиция, содержащая аптамер и мишень, причем аптамер и мишень способны к образованию комплекса, и при этом аптамер представляет собой аптамер по любому из пп. 1-11.
28. Композиция, содержащая первый аптамер, второй аптамер и мишень,
причем первый аптамер содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин;
при этом второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин или причем второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин;
при этом первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса; и
причем первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами; и
при этом первый аптамер представляет собой аптамер по любому из пп. 1-11.
29. Композиция по п. 28, в которой мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
30. Способ, включающий:
(a) приведение в контакт аптамера, способного к связыванию с молекулой-мишенью в образце;
(b) инкубирование аптамера с образцом с обеспечением образования комплекса аптамер-мишень;
(c) обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень в образце и
(c) выявление наличия аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени,причем обнаружение аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень присутствует в образце, и при этом отсутствие обнаружения аптамера, комплекса аптамер-мишень или молекулы-мишени указывает на то, что молекула-мишень отсутствует в образце;
при этом аптамер представляет собой аптамер по любому из пп. 1-11.
31. Способ по п. 30, включающий по меньшей мере одну дополнительную стадию, выбранную из: добавления молекулы конкурента к образцу; захвата комплекса аптамер-мишень на твердую подложку; и добавления молекулы конкурента и разбавления образца; причем по меньшей мере одну дополнительную стадию проводят после стадии (a) или стадии (b).
32. Способ по п. 30, в котором молекула конкурента выбрана из полианионного конкурента.
33. Способ по п. 32, в котором полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ.
34. Способ по п. 33, в котором полидекстран представляет собой сульфат декстрана; а ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося.
35. Способ по любому из пп. 30-34, в котором молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
36. Способ по любому из пп. 30-35, в котором образец выбран из цельной крови, лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, плазмы, сыворотки, мокроты, выдыхаемого воздуха, мочи, семенной жидкости, слюны, менингеальной жидкости, околоплодной жидкости, жидкости из желез, лимфатической жидкости, аспирата из сосков, бронхиального аспирата, синовиальной жидкости, суставного аспирата, клеток, клеточной вытяжки, кала, ткани, тканевого биопсийного материала и спинномозговой жидкости.
37. Способ выявления мишени в образце, включающий
a) приведение в контакт образца с первым аптамером с образованием смеси, причем первый аптамер способен к связыванию с мишенью с образованием первого комплекса;
b) инкубирование смеси в условиях, которые обеспечивают образование первого комплекса;
c) приведение в контакт смеси со вторым аптамером, при этом второй аптамер способен к связыванию с первым комплексом с образованием второго комплекса;
d) инкубирование смеси в условиях, которые обеспечивают образование второго комплекса;
e) выявление наличия или отсутствия первого аптамера, второго аптамера, мишени, первого комплекса или второго комплекса в смеси, причем присутствие первого аптамера, второго аптамера, мишени, первого комплекса или второго комплекса указывает на то, что мишень присутствует в образце;
при этом первый аптамер представляет собой аптамер по любому из пп. 1-11; причем второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин или при этом второй аптамер содержит по меньшей мере один третий модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один четвертый модифицированный в 5-положении пиримидин.
38. Способ по п. 37, в котором молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
39. Способ по п. 37 или 38, в котором первый аптамер, второй аптамер и мишень способны к образованию тримерного комплекса.
40. Способ идентификации одного или нескольких аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью, включающий:
(a) приведение в контакт библиотеки аптамеров с молекулой-мишенью с образованием смеси и обеспечение образования комплекса аптамер-мишень, причем комплекс аптамер-мишень образуется, когда аптамер обладает аффинностью по отношению к молекуле-мишени;
(b) отделение комплекса аптамер-мишень от остальной части смеси (или обогащение в отношении комплекса аптамер-мишень);
(c) диссоциацию комплекса аптамер-мишень и
(d) идентификацию одного или нескольких аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью;
при этом библиотека аптамеров содержит множество полинуклеотидов, причем каждый полинуклеотид содержит по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин, при этом первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин являются различными модифицированными в 5-положении пиримидинами;
причем первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин; или
причем первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении цитидин, и при этом второй модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой модифицированный в 5-положении уридин;
причем модифицированный в 5-положении уридин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента, индольного фрагмента и фрагмента морфолинo; и при этом модифицированный в 5-положении цитидин содержит фрагмент в 5-положении, выбранный из нафтильного фрагмента, бензильного фрагмента, тирозильного фрагмента и фрагмента морфолинo.
41. Способ по п. 40, в котором каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 5'-конце полинуклеотида.
42. Способ по п. 41, в котором фиксированный участок на 5'-конце каждого полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
43. Способ по любому из пп. 40-42, в котором каждый полинуклеотид содержит фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида.
44. Способ по п. 43, в котором фиксированный участок на 3'-конце полинуклеотида составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 или по меньшей мере 30 нуклеотидов в длину, или от 5 до 30, от 10 до 30, от 15 до 30, от 5 до 20 или от 10 до 20 нуклеотидов в длину.
45. Способ по любому из пп. 40-44, в котором фрагмент модифицированного в 5-положении уридина ковалентно связан посредством линкера, содержащего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
46. Способ по любому из пп. 40-45, в котором фрагмент модифицированного в 5-положении цитидина ковалентно связан посредством линкера, содержащего группу, выбранную из амидного линкера, карбонильного линкера, пропинильного линкера, алкинового линкера, сложноэфирного линкера, мочевинного линкера, карбаматного линкера, гуанидинового линкера, амидинового линкера, сульфоксидного линкера и сульфонового линкера.
47. Способ по любому из пп. 40-46, в котором модифицированный в 5-положении цитидин выбран из NapdC, 2NapdC, TyrdC и PPdC.
48. Способ по любому из пп. 40-47, в котором модифицированный в 5-положении уридин выбран из NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
49. Способ по любому из пп. 40-44, в котором по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой NapdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TrydU, TrpdU и ThrdU.
50. Способ по любому из пп. 40-44, в котором по меньшей мере один первый модифицированный в 5-положении пиримидин представляет собой PPdC, и по меньшей мере один второй модифицированный в 5-положении пиримидин выбран из NapdU, 2NapdU, PPdU, MOEdU, TyrdU, TrpdU и ThrdU.
51. Способ по любому из пп. 40-50, в котором каждый полинуклеотид содержит произвольный участок.
52. Способ по п. 51, в котором произвольный участок составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 20 до 40, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 30 до 40 нуклеотидов в длину.
53. Способ по любому из пп. 40-52, в котором каждый полинуклеотид составляет от 20 до 100, или от 20 до 90, или от 20 до 80, или от 20 до 70, или от 20 до 60, или от 20 до 50, или от 30 до 100, или от 30 до 90, или от 30 до 80, или от 30 до 70, или от 30 до 60, или от 30 до 50, или от 40 до 100, или от 40 до 90, или от 40 до 80, или от 40 до 70, или от 40 до 60, или от 40 до 50 нуклеотидов в длину.
54. Способ по любому из пп. 40-53, в котором каждый полинуклеотид представляет собой аптамер, который связывает мишень, и при этом библиотека содержит по меньшей мере 1000 аптамеров, причем каждый аптамер содержит различные нуклеотидные последовательности.
55. Способ по любому из пп. 40-54, в котором стадии (a), (b) и/или (c) повторяют по меньшей мере один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз или десять раз.
56. Способ по любому из пп. 40-55, в котором один или несколько аптамеров, способных к связыванию с молекулой-мишенью, являются амплифицированными.
57. Способ по любому из пп. 40-56, в котором смесь содержит молекулу полианионного конкурента.
58. Способ по п. 57, в котором полианионный конкурент выбран из олигонуклеотида, полидекстрана, ДНК, гепарина и дНТФ.
59. Способ по п. 58, в котором полидекстран представляет собой сульфат декстрана; а ДНК представляет собой ДНК молок сельди или ДНК молок лосося.
60. Способ по любому из пп. 40-59, в котором молекула-мишень выбрана из белка, пептида, углевода, малой молекулы, клетки и ткани.
61. Аптамер по любому из пп. 1-11 или композиция по любому из пп. 12-29, или способ по любому из пп. 30-60, в которых первый модифицированный в 5-положении пиримидин и второй модифицированный в 5-положении пиримидин способны к встраиванию посредством фермента полимеразы.
62. Аптамер по любому из пп. 1-11, который характеризуется улучшенной стабильностью в присутствии нуклеаз и/или более длительным периодом полувыведения из сыворотки человека по сравнению с аптамером такой же длины и с нуклеотидной последовательностью, которая содержит немодифицированный пиримидин вместо каждого из первых модифицированных в 5-положении пиримидинов или немодифицированный пиримидин вместо каждого из второго модифицированного в 5-положении пиримидина.
