Клетки-хозяева и способы использования - RU2015135980A
Код документа: RU2015135980A
Формула
1. Клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую протеазу Killer Expression (Kex2p), или ее фрагмент, и/или вариант, и по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую протеин-дисульфидизомеразу (Pdi1), или ее фрагмент, и/или вариант.
2. Клетка-хозяин по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую оксидоредуктин эндоплазматического ретикулума (Ero1), или его фрагмент, и/или вариант.
3. Клетка-хозяин по п. 1 или 2, в которой указанная клетка-хозяин экспрессирует или сверхэкспрессирует по меньшей мере один генный продукт по меньшей мере одной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или его фрагмент и/или вариант, выбранный из Kex2p, Pdi1 и Ero1, когда указанную клетку-хозяина выращивают в культуре.
4. Клетка-хозяин по п. 1, в которой указанная клетка-хозяин представляет собой клетку гриба.
5. Клетка-хозяин по п. 4, в которой указанной клеткой гриба является дрожжевая клетка.
6. Клетка-хозяин по п. 5, в которой род указанной дрожжевой клетки выбирают из группы, состоящей из Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces и Yarrowia.
7. Клетка-хозяин по п. 6, в которой указанная клетка-хозяин представляет S. cerevisiae.
8. Клетка-хозяин по п. 1, в которой указанная клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего.
9. Клетка-хозяин по п. 1 или 2, в которой указанная по меньшей мере одна гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Kex2p, или ее фрагмент, и/или вариант, функционально связана по меньшей мере с одним промотором, выбранным из группы: TEF1, PRB1, ADH1, ADH2, PYK1, PGK1, ENO, GAL1.10.7, GALS, МЕТ25, CUP1, PHО5, tetО-CYC1, CaMV, HXT6, HXT7 и ARE.
10. Клетка-хозяин по п. 1 или 2, в которой указанная по меньшей мере одна гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Pdi1, функционально связана по меньшей мере с одним промотором, выбранным из группы: TEF1, PRB1, ADH1, ADH2, PYK1, PGK1, ENO, GAL1.10.7, GALS, МЕТ25, CUP1, PHО5, tetО-CYC1, CaMV, HXT6, HXT7 и ARE.
11. Клетка-хозяин по п. 2, в которой указанная по меньшей мере одна гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая Ero1, функционально связана по меньшей мере с одним промотором, выбранным из группы: TEF1, PRB1, ADH1, ADH2, PYK1, PGK1, ENO, GAL1.10.7, GALS, МЕТ25, CUP1, PHО5, tetО-CYC1, CaMV, HXT6, HXT7 и ARE.
12. Клетка-хозяин по п. 1 или 2, в которой указанная клетка-хозяин дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих генетических модификаций: нокаут протеазы рер4, сниженная активность ubc4 и/или ubc5 по сравнению с клеткой-хозяином дикого типа, нокаут yps1, нокаут hsp150 и нокаут pmt1.
13. Клетка-хозяин по п. 1 или 2, содержащая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный полипептид.
14. Клетка-хозяин по п. 13, в которой указанная по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный полипептид, содержится в плазмиде.
15. Клетка-хозяин по п. 13, в которой указанная по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный полипептид, встроена в геном указанной клетки-хозяина.
16. Клетка-хозяин по п. 13, в которой указанный рекомбинантный полипептид имеет по меньшей мере одну дисульфидную связь.
17. Клетка-хозяин по п. 13, в которой указанный рекомбинантный полипептид является белком, слитым с альбумином.
18. Клетка-хозяин по п. 13, в которой указанный рекомбинантный полипептид содержит по меньшей мере один терапевтический полипептид, имеющий активность GLP-1, генетически слитый с альбумином.
19. Клетка-хозяин по п. 13, в которой указанный рекомбинантный полипептид содержит полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности по последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:1.
20. Клетка-хозяин по п. 13, в которой рекомбинантный полипептид содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1.
21. Клетка-хозяин по п. 13, в которой указанный рекомбинантный полипептид содержит лидерную последовательность.
22. Клетка-хозяин по п. 21, в которой указанная лидерная последовательность является лидерной последовательностью KEX2 или модифицированной лидерной последовательностью KEX2.
23. Клетка-хозяин по п. 13, в которой рекомбинантный белок содержит модифицированную лидерную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:10.
24. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 13.
25. Способ по п. 24, дополнительно включающий выделение указанного рекомбинантного полипептида из культуральной среды.
26. Рекомбинантный полипептид, изготовленный способом по п. 24 или 25.
27. Рекомбинантный полипептид по п. 26, в котором указанный рекомбинантный полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую 99% идентичности по последовательности с SEQ ID NO:1.
28. Рекомбинантный полипептид по п. 27, в котором указанный рекомбинантный полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.
29. Фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный полипептид по п. 27 или 28.
30. Способ лечения пациента, нуждающегося в этом, включающий введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 29.
31. Способ по п. 30, в котором указанный пациент имеет заболевание или состояние, выбранное из диабета I типа, диабета II типа, нарушения толерантности к глюкозе, гипергликемии, болезни Альцгеймера, ожирения, сердечно-сосудистого заболевания, застойной сердечной недостаточности и ретинопатии.
32. Клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую протеазу Killer Expression (Kex2p), или ее функциональный фрагмент, и/или вариант, по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую протеин-дисульфидизомеразу (Pdi1), или ее функциональный фрагмент, и/или вариант, и по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую оксидоредуктин эндоплазматического ретикулума (Ero1), или его функциональный фрагмент, и/или вариант.
33. Клетка-хозяин по п. 32, в которой указанная Kex2p, или ее функциональный фрагмент, и/или вариант представляет собой функциональный генный продукт SEQ ID NO:3.
34. Клетка-хозяин по п. 32, в которой указанная Pdi1, или ее функциональный фрагмент, и/или вариант представляет собой функциональный генный продукт SEQ ID NO:5.
35. Клетка-хозяин по п. 32, в которой указанный Ero1, или его функциональный фрагмент, и/или вариант представляет собой функциональный генный продукт SEQ ID NO:7.
36. Клетка-хозяин по любому одному из пп. 32-35, в котором указанная клетка-хозяин представляет собой S. cerevisiae.
37. Клетка-хозяин по п. 32, дополнительно содержащая по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный полипептид.
38. Клетка-хозяин по п. 37, в которой указанный рекомбинантный полипептид содержит полипептид, имеющий по меньшей мере 99% идентичности по последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:1.
39. Клетка-хозяин по п. 37 или 38, в которой указанная клетка-хозяин увеличивает итоговый титр указанного рекомбинантного полипептида при выращивании в культуре по сравнению с клеткой-хозяином, относящейся к тому же виду и имеющей такие же генетические модификации, но которая не содержит по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую протеазу Killer Expression (Kex2p), или ее функциональный фрагмент, и/или вариант, по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую протеин-дисульфидизомеразу (Pdi1), или ее функциональный фрагмент, и/или вариант, и по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую оксидоредуктин эндоплазматического ретикулума (Ero1), или его функциональный фрагмент, и/или вариант.
40. Клетка-хозяин, которая сверхэкспрессирует по меньшей мере два белка, или их фрагмента, и/или варианта, выбранных из Kex2p, Pdi1 и Ero1, когда указанную клетку-хозяина выращивают в культуре по сравнению с клеткой-хозяином дикого типа, где указанная клетка-хозяин дикого типа принадлежит к тому же биологическому виду и выращивается при тех же условиях культивирования, но не сверхэкспрессирует по меньшей мере два генных продукта, выбранных из Kex2p, Pdi1 и Ero1.
