Способ получения вакцины против таежного весенне-летнего энцефалита - SU1318149A3

Описание

Изобретение oTrUici-rrcyi к ме/ильии- ской Ь икро0ио.погии ч к;1с;1 : гс:;; iijK-ir Ho;;i - i iin 15 исц1пп ых ni;: eiir; ):

Пель нпобретеиия - no ibniic-ii : .: чистоты целевого продукта ;i;: счс-г Ni iju:-- (l),HH NreTo;j,a очистк и.

Способ осл шествляют cjTCv iyKii Hir-i о - разом.

Эмбрио1и5. клсткн кур (ус:пе:Нг :и- в среде культуры клеток (ТОМ 199) (Tissue C-lture Medium S99), иь ф.ч 1ируит вирусом и держат в с-.ус- п виз ИИ при аэробных услови5гх при температуре, в пределах 23-38 С в течение 5 дней, Затем клетки и остач - ки клеток отделяют путем 1:;е гтриф ги- рования. Полученн то суспензию вирус, ,к гивиру от с поьюитыс cbopi4.u-:Hu;i рчпропиолактона к после этого концентрируют путем ультрафильтрацик .Стлдя --: тиваиип и концентрирования тгккже проводить в обратЕЕОЙ последов.- тельг-о( ти. Суспензия наряду с ТБИЭ-вируссь содержит различные примеск, которые сс.тн Меитируют частично быстрее HJ и медленнее, чем ТБЛЭ-з:1Ируе. Предпсч-: -г тельно отделяют быстрее сед: п- сл;тт ру: : щне части путем осаждения с rii:)Moir,b(j Протаминсудьфата,, преж,де ем осуп сг г нляют соиственный ненреры(н-,гн сисссО ультрацентрифугирования с расп ре;: cjii: иием градиентов нлотност};.

При ос ществлении предлаг-ас-;- ого снособа в роторе ультрацентрифуТ ; наполненном раствором бу(|;ера„ растл; ) рог-1 (|;(1сфат}гаго буфера при 3000 оГ/; i ноловила буферного раствора вытесняс/ ся 50%-нь м раствором сахарозь и r6i;:j зуется „ благодаря зтоку 1 ради1ч; т ил::- Hoci H 0-50% сахарозы.

После этого суспензии,, г;од(:ржл 1;с-;; нирус, /vnoT стечь герез ро/ пг- -fn i г;.- рости Браще н- я ротора 3500L с()прп lч, в мипз ту со скоростью исте п 1и-::- почтительно 3 л/ч. При выбрл -:Г:о v;-- большая Bnpyciibix чаг- лу пходит в Г радиеиты нлотности. Как TOJibKO весь материал нроше/т атгчар,/ , центрифугируют еще i ч, Hp i iei; одно- Бременпо дают протекать растп; ру фог diaTHor o буфера. Затем осторожно нро- водят ротор в состояние докггя и cor Ci жимой ротора разделялт тта :)тдс. фракции. После этого в каждой фраки;;: определяют экстинц,) нри 2.60 Н.У ;: ;.:.- пов пеменно устанавливают C :;ieрта;;;-:; сахарозы во фракции. Лока. И1:1а1; -гл вк- ovca в гоадиергтах плотности вск можн;:

: ч рц ода ;ш егг. -к .: ri:;iiu H npri 260 нм . Т Ирус с i:i- ii ia(T(-( и об:гас ;. при i::(viep , - 1;н{и с .: X а ;M:I 3 ы поммерно :0% и обус- дорлинает с г етли: |С)е ут едиче; ке эксти :;n:j 26С нм.

В об. тасти OKO iC 40% сахарозы фракции 10; 11 и 12 г-пчеют новьппенную, а сЬракдия 11 - ,- акс гмальную экстинцию. В этой рракщ и находятся в OCIUOBHOM -гастицы вируса с константой седит-1ента цни 200 S без седГ Гментирующих быстрее или медленнгр-е 5 чем вирус, примесей. Пик соответствует конгтентрагцли сахаро 39%. 71ругой пик у фракции }гомер 25, который соотв€ тствует коннентра- сахарозы :монее, чем 10%, ука- па 1:;алнчие примесей, которые

О 6paCF: : aiOTi:.4. ,

Фракп1-;я : 1 имеет самое высокое от- носитель ше защитное действие,

Собранные содержащие вирус фрак- н,1-;и разбав,г:яют буд;ером, содержащим человеческий альбуми, для того, что- бь. улучшить стабяпьпость нирус - ан- Ч игена. а з;1тем обычным способом не- рерабатывают далее: в вакцир ы.

иолучент; е вакцины имеют более вы- ;:оку о ччстО гу и переносятся тсчовеком,; тс гараты, изготовленное известны - сггособоМ; что чредстав- лепо о ;:-аблицс ,

В случае нривиБок с номощь о вак- ;д:н, тюлу -енных согласно изобретению,, ;с наблюдались никакие че:г;:елательг{ые ;):: акции: ни :гок;и:;ьные, ни сис1 емн;)1е,

Сравгн -гс;1ьн1:те результаты лереноси- :0сти преиарато;;,, полученных извест- .i;iiT4 и Н оедл;лгае;;ьп--: способами

25

313181

Полученные согласно предаагаемому способу вакцины отличаются незначительным содержанием протеина, не принимая во внимание добавленньш человеческий альбумин. Это содержание про- теина при равном антиге гаом действии во много раз, по меньшей мере в 10 раз, меньше, чем в случае применяеь-гых известных препаратов.

Приме р. Суспензию эмбриональ-Ю ных клеток кур в ТСМ 199 (Г/SSVF - культура - среда) инфицируют ТВЛЭ-ви- русом. После вьщержки в течение 4 сут при 33°С содержащую вирус суспензию собирают и центрифугир гТот при 3000 г 5 в течение 15 мин при отделяют клетки,

К полученной суспензии вируса прибавляют формалин в таком количестве, чтобы конечное разбавление составля-20 ло 1:2000, а затем суспензию вьщержи- вагот в течение 30 ч при 37°С и 48 ч при комнатной температуре.

Затем инактивированную суспензию вируса смешивают с 0,5 мг/л протамин- сульфата и смесь выдерлсивают в течение ночи .при 4°С. Образовавшийся осз- док отделяют посредством центрифугирования при 10000 г в течение 30 мин

при 4°С. Предварительно обработанная предлагаемым способом суспензия представляет собой исходный материал для непрерывного ультрацентрифугирования в градиенте плотности. , 35

Суспензию вируса со скоростью потока 3 л/ч пропускают с помощью насоса через центрифугу, в которой в качестРедактор Е.Копча

;Составитель Г.Смирнова ТехредН.Глущенко Корректор А.Зимокосов

Заказ 348.3 Тираж 595Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и -открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, . д. 4/5

.Производственно-полиграфическое пре,дприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5

0

5

494

ве сахарозного градиента плотности содержится 0-50% сахарозы в фосфатном буферном солевом растворе при р 7,6,

Обьем составляет 4,5 л, время центрифугирования - 1,5 ч. После остановки центрифуги содержимое ротора выкачивают и при этом разделяют на 16 фракций по 100 мл. Для каждой отдельной фракции определяют экстинк- цию при 260 нм на спектрофотометре и удельную плотность на рефрактометре. Пиковые фракции 10, II и 12 с концент- рациел сахара около 40% объединяют и разбавляют до 1:10 фосфатным буферным солевым раствором при значении рП 7,6, в котором содержится 0,1% человеческого альб т-1ина.

Защитную активность препарата, полученного предлагаемьм способом опре- деляют в прямом защитном опыте на Mbmiax.

Предлагаемьш исследованию препарат разбавляют (1:3, 1:9, 1:27, 1:81, 1:243) и смешивают с 0,2% пвдроокиси алюминия, примененной в качестве средства, усиливающего действие препарата . При применении в каждом случае 0,2 мл указанных разбавленных растворов 2 раза с промел утком в 1 неделю подкожно йммунизир аот ..по Ю мышей (весом примерно по 10 г). Через две последующие недели мышей инфицируют ГОО - 1000 ZDjg ТВЛЭ-вирусом и рас-; считывают защитную дозу методу Рида и -Мюнха после наблюдения в течение 3 недель.

Защитную дозу ZDgg определяют при разбавлении 1:30.

Реферат

Формула