Растения конопли с модифицированной экспрессией thca-синтазы - RU2017146186A
Код документа: RU2017146186A
Формула
1. Способ изменения содержания одного или более каннабиноидов в растении конопли, где способ включает даунрегуляцию активности синтазы тетрагидроканнабиноловой кислоты (THCA) в растении конопли.
2. Способ по п.1, где изменение содержания каннабиноидов включает уменьшение содержания дельта-9-тетрагидроканнабинола (THC) или увеличение содержания каннабидиола (CBD) в растении конопли.
3. Способ по п.1, где указанное снижение включает введение в растение выбранной ДНК, кодирующей антисмысловую РНК или миРНК, эффективно подавляющие экспрессию THCA-синтазы, где выбранная ДНК функционально связана с гетерологичным промотором.
4. Способ по п.2, дополнительно включающий отбор растения конопли с требуемым сниженным содержанием THC, повышенным содержанием CBD, или сниженным содержанием THC и повышенным содержанием CBD по сравнению с растением конопли подобного генотипа, которое не включает выбранную ДНК.
5. Способ по п.3, где введение выбранной ДНК включает генетическую трансформацию.
6. Способ по п.3, где миРНК кодируется:
(a) полинуклеотидной последовательностью, обладающей по меньшей мере 85-процентной идентичностью последовательности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:61, 63, 64, 69, 71, 72, 68 и их коплементарной последовательности;
(b) полинуклеотидной последовательностью, включающей по меньшей мере 21 непрерывный нуклеотид из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:61, 63, 64, 69, 71, 72, 68 и их коплементарной последовательности; или
(c) полинуклеотидной последовательностью, включающей по меньшей мере 21 непрерывный нуклеотид THCA-синтазы или их коплементарной последовательности, где THCA обладает по меньшей мере 85-процентной идентичностью последовательности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-47.
7. Способ по п.3, где антисмысловая РНК кодируется:
(a) полинуклеотидной последовательностью, включающей SEQ ID NO:81 или ее фрагмент, способной к снижению экспрессии THCA-синтазы; или
(b) полинуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 85 процентов идентична по меньшей мере 200 непрерывным нуклеотидам из SEQ ID NO:81; и
где транскрипция выбранной ДНК подавляет экспрессию THCA-синтазы.
8. Способ по п.1, где даунрегуляция активности THCA-синтазы включает:
(a) введение в растение конопли или его клетку: (i) по меньшей мере одной РНК-направляемой эндонуклеазы, включающей по меньшей мере один сигнал ядерной локализации, или нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере одну РНК-направляемую эндонуклеазу, включающую по меньшей мере один сигнал ядерной локализации, (ii) по меньшей мере одной направляющей РНК или ДНК, кодирующей по меньшей мере одну направляющую РНК, и, необязательно, (iii) по меньшей мере одного донорного полинуклеотида; и
(b) культивирование растения конопли или его клетки таким образом, что каждая направляющая РНК направляет РНК-направляемую эндонуклеазу к целевому участку в хромосомной последовательности, где РНК-направляемая эндонуклеаза вводит двухцепочечный разрыв в целевой участок, и двухцепочечный разрыв восстанавливается в процессе репарации ДНК, таким образом, что хромосомная последовательность изменяется, где целевой участок расположен в гене THCA-синтазы, и хромосомная модификация прерывает или нарушает транскрипцию и/или трансляцию гена THCA-синтазы.
9. Способ по п.8, где РНК-направляемая эндонуклеаза получена из кластерных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR)/CRISPR-ассоциированной (Cas) системы.
10. Способ по п.8, где даунрегуляция активности THCA-синтазы не встраивает экзогенный генетический материал и приводит к получению не существующего в природе растения конопли или его клетки.
11. Способ по п.1, где даунрегуляция активности THCA-синтазы включает:
(a) идентификацию по меньшей мере одного локуса гена THCA-синтазы в последовательности ДНК в растении конопли или его клетки;
(b) идентификацию по меньшей мере одной специфичной последовательности распознавания эндонуклеазы по меньшей мере в одном локусе гена THCA-синтазы;
(c) введение в растение конопли или его клетку по меньшей мере первой сконструированной эндонуклеазы, где растение конопли или его клетка включают последовательность распознавания для сконструированной эндонуклеазы в или вблизи от локуса гена THCA-синтазы, и сконструированная эндонуклеаза транзиентно или стабильно экспрессируется;
(d) анализ растения конопли или его клетки на наличие опосредованной сконструированной эндонуклеазой модификации в ДНК, составляющей или фланкирующей локус гена THCA-синтазы; и
(e) идентификацию растения конопли, его клетки или клетки его потомства как включающих модификацию в локусе гена THCA-синтазы.
12. Трансгенное растение конопли, полученное способом по п.1.
13. Семя трансгенного растения по п.12, где семя включает выбранную ДНК.
14. Растение конопли с пониженным содержанием дельта-9-тетрагидроканнабинола (THC), повышенным содержанием каннабидиола (CBD) или пониженным содержанием THC и повышенным содержанием CBD, включающее пониженную экспрессию синтазы тетрагидроканнабиноловой кислоты (THCA).
15. Растение конопли по п.14, включающее выбранную ДНК, кодирующую антисмысловую РНК или миРНК, эффективно подавляющие экспрессию THCA-синтазы, где выбранная ДНК функционально связана с гетерологичным промотором, где растение конопли включает пониженное содержание THC, повышенное содержание CBD, или пониженное содержание THC и повышенное содержание CBD по сравнению с растением конопли подобного генотипа, которое не включает выбранную ДНК.
16. Семя, клетка или часть растения конопли по п.14.
17. Продукт из растения конопли, полученный из растения по п.14.
18. Продукт из растения конопли по п.17, включающий суммарную концентрацию каннабидиоловой кислоты и каннабидиола от приблизительно 18% до приблизительно 60% или от приблизительно 7% до приблизительно 30% по весу.
19. Продукт из растения конопли по п.17, включающий суммарную концентрацию дельта-9-тетрагидроканнабинола и тетрагидроканнабиноловой кислоты от приблизительно 0% до приблизительно 3% по весу.
20. Продукт из растения конопли по п.17, включающий конопляное масло, настойку конопли, высушенные цветки конопли и/или высушенные листья конопли.
21. Продукт из растения конопли по п.17, адаптированный для ингаляции, употребления внутрь, подъязычного применения или наружного применения.
22. Способ получения медицинской композиции на основе конопли, где способ включает
(a) получение растения конопли по п.14;
(b) выращивание растения конопли при условиях роста растения, с получением растительной ткани из растения конопли; и
(c) изготовление медицинской композиции на основе конопли из растительной ткани.
