Биоинженерный коллагеновый конструкт, модифицированный кишечный коллагеновый слой, переработанный тканевый матрикс и способ восстановления или замещения поврежденной ткани - RU2481114C2

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Это изобретение относится к области регенеративной медицины и тканевой инженерии. Изобретение направлено к биоинженерным конструктам, получаемым из переработанного тканевого материала или матрикса, которые происходят из животных источников. Биоинженерные конструкты изобретения получают, используя способы, при которых сохраняется биосовместимость, клеточная совместимость, прочность обрабатываемого тканевого матрикса и ее биореконструируемость. Противомикробные свойства придают биоинженерным конструктам, которые используют для приживления трансплантата, имплантации, восстановления ткани, заживления раны и реконструкции, или применяют с другой целью в организме млекопитающего.

Уровень техники

Область регенеративной медицины и тканевой инженерии сочетает в себе методы инженерии с принципами науки о жизни для понимания структурных и функциональных взаимосвязей в нормальных и патологических тканях млекопитающих. Целью регенеративной медицины и тканевой инженерии является разработка биологических заменителей и доведение их до конечного применения с целью восстановления, поддержания и улучшения тканевых функций.

Коллаген представляет собой основной структурный белок в теле организма, который составляет приблизительно одну третью часть от всех белков организма. Он составляет основную часть органического вещества кожи, сухожилий, костей и зубов и встречается в виде волокнистых включений в большей части других структур тела. К некоторым из свойств коллагена относятся высокая прочность на разрыв, низкая антигенность, отчасти благодаря маскированию потенциальных антигенных детерминант за счет спиральной структуры, и низкая растяжимость, полупроницаемость и растворимость. Более того, коллаген является природным веществом для клеточной адгезии. Эти и другие свойства делают коллаген подходящим материалом для тканевой инженерии и изготовления имплантируемых биосовместимых структур и биореконструируемых протезов.

Способы получения коллагеновой ткани и тканевых стурктур из эксплантируемых тканей млекопитающих и способы конструирования протеза из этих тканей и тканевых структур уже широко исследованы с целью применения их при заживлении ран, хирургическом восстановлении и при замене тканей или органов. Продолжающейся целью исследователей является разработка биоинженерных конструктов, которые можно успешно использовать, с целью повышения стандартов ухода за здоровьем пациентов.

Раскрытие изобретения

Коллагеновые материалы биологического происхождения, такие как подслизистая оболочка кишечника, используют при восстановлении тканей или их замене, эти материалы продолжают разрабатывать и совершенствовать. В настоящее время новым биоинженерным, биореконструируемым конструктам придают противомикробные свойства с целью улучшения их эксплуатационных характеристик при использовании в регенеративной медицине, включая заживление ран, восстановление тканей и их замену. Раскрываются способы механической и химической переработки проксимальной свиной тощей кишки для получения одиночного, бесклеточного слоя кишечного коллагена (СКК), получаемого из кишечной подслизистой оболочки, который может использоваться для формирования слоистых материалов с противомикробными свойствами для заживления, восстановления и замены тканей. При переработке клетки и продукты распада клеток удаляются, в то время как матриксная структура нативной коллагеновой ткани сохраняется. Конечный слой переработанного тканевого матрикса используют для получения однослойных и многослойных листовых, поперечно-сшитых конструктов с желаемыми характеристиками. Исследованы эффективность однослойных продуктов для перевязки ран, листовых многослойных лоскутов для восстановления мягких тканей, а также использование интубируемых конструктов в качестве сосудистого имплантата. Такой тканевый материал, получаемый при переработке кишки, обеспечивает необходимую физическую опору при минимальном образовании спайков и способен интегрироваться в окружающую нативную ткань, становясь инфильтрованным клетками-хозяевами. In vivo биореконструирование не подвергает риску механическую целостность этих конструктов. Внутренние и функциональные свойства имплантата, такие как модуль эластичности, способность поддерживать состоятельность шва и конечная прочность на разрыв, являются важными параметрами, которыми можно манипулировать при специфических требованиях путем варьирования количества слоев и условий перекрестного сшивания. Теперь этим конструктам придают противомикробные свойства с целью контролирования или уменьшения микробной активности в обрабатываемом участке, где используются конструкты.

Целью изобретения является биоинженерный коллагеновый конструкт с противомикробными свойствами, который содержит листовой слой очищенного коллагенового тканевого матрикса, получаемого из источника ткани, такого как подслизистая оболочка тонкой кишки, или переработанный кишечный коллагеновый слой, получаемый из подслизистой оболочки тонкой кишки, обработанной противомикробным агентом. При использовании биоинженерного коллагенового конструкта изобретения в качестве повязки на рану при лечении ран млекопитающего, конструкт наносят на раненую поверхность с целью частичного покрытия раны так, чтобы собственная кожная ткань больного обеспечивалась влажной средой, что способствует восстановлению кожной ткани, тогда как противомикробный агент в конструкте регулирует или снижает микробную активность на ране. Конструкт является биосовместимым, это означает, что конструкт не является цитотоксичным, не вызывает снижение чувствительности кожи и не вызывает первичное раздражение кожи.

В одном варианте осуществления повязка на рану содержит слой переработанного кишечного коллагена, полученного из подслизистой оболочки тонкой кишки, толщина которого составляет примерно от 0,05 до 0,07 мм, и противомикробный агент. За счет листовой геометрии очищенного тканевого матрикса ее можно покрывать слоями, а затем химически связать слои друг с другом с получением многослойного конструкта. Поэтому другим вариантом осуществления является конструкт, содержащий два или более двух слоев очищенного тканевого матрикса, которые уже связаны вместе и обработаны противомикробным агентом. Конструкты изобретения можно выполнить в виде сетки, перфорировать или фенестрировать либо для более лучшего согласования с поверхностной формой раны или для более лучшего дренирования экссудатов раны, либо для обоих целей.

Дополнительной целью в этом аспекте изобретения является обработка раны в случае необходимости ухода или лечения, в частности в том случае, когда необходимы противомикробное вмешательство и защита, при этом к ранам относится любая из следующих видов ран: поверхностные или глубокие раны, пролежени, венозные язвы, диабетические язвы, хронические сосудистые язвы, туннельные раны/раны с нависающими краями, хирургические раны, раны донорского участка при аутотрансплантации, раны пост-Моховской хирургии, раны пост-лазерной хирургии, расхождение краев раны, травматические раны, ссадины, разрывы, ожоги второй степени, кожные разрывы или дренажные раны.

Другой целью изобретения является предоставление хирургического восстанавливающего приспособления, такого как лоскут или сетка, для обработки и восстановления мягких тканей и органов, которое содержит два или более двух слоев, например, от двух до десяти слоев, переработанного кишечного коллагена, полученного из подслизистой оболочки тонкой кишки, эти слои связывают и поперечно сшивают друг с другом для формирования многослойного конструкта, который является биосовместимым и биореконструируемым и который при имплантации на поврежденной или нездоровой мягкой ткани подвергается контролируемой биодеградации, которая происходит с адекватным замещением живыми клетками, так что исходный имплантируемый протез реконструируется за счет живых клеток пациента. Дополнительной целью в этом аспекте изобретения является предоставление способа обработки поврежденной или нездоровой мягкой ткани при необходимости восстановления или противомикробного вмешательства, включающего имплантацию протеза, который содержит два или более двух наложенных друг на друга, химически связанных слоев переработанного кишечного коллагена, полученного из подслизистой оболочки тонкой кишки и обработанные противомикробным агентом, который при имплантации на поврежденной или нездоровой мягкой ткани подвергается контролируемой биодеградации, происходящей с адекватным замещением живыми клетками, так что исходный имплантируемый протез реконструируется за счет живых клеток пациента. Случаи, когда поврежденная или нездоровая мягкая ткань нуждается в восстановлении включают, например, раны, дефекты брюшной и грудной стенки, необходимость усиления мышечного лоскута, ректальный и вагинальный пролапс, реконструкция тазового дна, грыжа, необходимость усиления линии шва и восстановительные процедуры.

Осуществление изобретения

Целью изобретения являются биоинженерные коллагеновые конструкты (например, протезы, имплантат), который содержит листовой слой очищенного коллагенового тканевого матрикса, переработанный тканевый материал, полученный из нативных тканей, например, переработанный кишечный коллагеновый слой, полученный из подслизистой оболочки тонкой кишки, которая обработана противомикробным агентом. Биоинженерным коллагеновым конструктом может являться либо одиночный слой переработанного тканевого матрикса, либо несколько наложенных друг на друга, связанных слоев переработанного тканевого матрикса. В том случае, когда биоинженерный коллагеновый конструкт изобретения используют для лечения раны больного млекопитающего, его наносят на поверхность раны с целью частичного покрытия раны так, чтобы собственная кожная ткань больного обеспечивалась как влажной средой, что способствует восстановлению кожной ткани, так и противомикробной композицией для регулирования или снижения микробной активности в ране и по краям раны. В том случае, когда биоинженерный конструкт используют в качестве хирургического приспособления, его имплантируют на участок имплантации организма млекопитающего так, чтобы он служил для восстановления функции, заживления или замены части тела или тканевой структуры. Противомикробный агент регулирует или снижает микробную активность на ране или участке имплантата посредством предотвращения адгезии или пролиферации бактерий на конструкте. Противомикробные конструкты изобретения являются биосовместимыми, это означает, что конструкт не является цитотоксичным, не вызывает снижение чувствительности кожи и не вызывает первичное раздражение кожи.

Протезы изобретения также являеются "биореконструируемыми", что означает, что они будут подвергаться контролируемой биодеградации, которой сопутствует реконструирование и замена новым эндогенным матриксом, предоставляемым клетками организма-хозяина или больного, с образованием новой ткани. Таким образом, протез этого изобретения при снабжении его противомикробным агентом и при использовании в качестве замещающей ткани, обладает множеством свойств. Во-первых, он функционирует в качестве замены части тела или в качестве покрытия для раны. Во-вторых, когда он функционирует в качестве заменяемой части тела, он выполняет роль реконструируемого шаблона для прорастания внутрь клеток-хозяев. В-третьих, он обеспечивает противомикробный эффект локально в обрабатываемом месте.

Материал протеза в соответствии с настоящим изобретением представляет собой очищенный, переработанный коллагеновый тканевый матрикс, полученный из коллагеновой ткани млекопитающего, который можно связывать сам с собой или с другим переработанным, очищенным тканевым матриксом, и которому можно придать противомикробные свойства для получения протеза для вживления или имплантации на участок тела организма, который нуждается в лечении.

Изобретение включает способы изготовления тканно-инженерных протезов из переработанного тканевого материала, где в способах связывания слоев друг с другом не требуются клеи, швы или скрепки, при этом способность протезов биологически реконструироваться сохраняется. Под терминами "переработанный тканевый матрикс" и "переработанный тканевый материал" подразумевается нативная, нормальная клеточная ткань, которая была извлечена из животного источника, предпочтительно из млекопитающего, и механически очищена от сопутствующих тканей, а также химически очищена от клеток, продуктов распада клеток и представлена частично свободной от неколлагеновых компонентов внеклеточного матрикса. Переработанный тканевый матрикс, в то время как является частично свободным и очищенным от неколлагеновых компонентов, по существу сохраняет свою нативную матриксную структуру, организацию, прочность и форму. Композиции переработанного тканевого материала для получения биоинженерных имплантатов изобретения получают из животных тканей, содержащих коллаген, к таким коллагеновым источникам относятся (но этим перечень не ограничивается): кишечник, дерма, широкая фасция, перикард, твердая мозговая оболочка, плацента и другие плоские или планарно-структурированные ткани, которые содержат коллагеновый тканевый матрикс. Структура и геометрия этих тканевых матриксов позволяет легко очищать их, манипулировать с ними и составлять их таким образом, чтобы можно было получать биоинженерные имплантаты изобретения. Другие подходящие источники тканей с аналогичной плоской структурой, геометрией и матриксным составом могут быть идентифицированы, извлечены и обработаны квалифицированным специалистом из других источников животного происхождения в соответствии с изобретением.

Одной такой переработанной тканевой матриксной композицией для получения биоинженерных имплантатов изобретения является кишечный коллагеновый слой, полученный из подслизистой оболочки тонкой кишки. Подходящими источниками тонкой кишки являются организмы млекопитающих, таких как человек, корова, свинья, овца, собака, коза или лошадь, при этом тонкая кишка свиньи является легкодоступным источником. Протезы изобретения можно получить из переработанного кишечного коллагенового слоя (иногда обозначаемого термином "кишечный коллагеновый слой" или "СКК"), которым является переработанный тканевый материал, полученный из подслизистой оболочки тонкой кишки свиньи. В одном способе для получения этого кишечного коллагенового слоя тонкую кишку извлекают из млекопитающего, а сопутствующие мезентериальные ткани грубо отрезают от кишечника. Подслизистую оболочку отделяют или отслаивают от других слоев тонкой кишки посредством механического сжатия исходного кишечного материала, например, устанавливая его между противостоящими валами, аналогичными тем, что применяются в аппарате для выдавливания колбас, чтобы отделить мышечные слои (мышечную оболочку) и оболочку (слизистую оболочку). Поскольку подслизистая оболочка тонкой кишки тверже и прочнее окружающей ткани, валы выдавливают более мягкие компоненты подслизистой, в результате механически очищая тканевый матрикс. В следующих примерах, свиную тонкую кишку механически очищают с использованием аппарата для очистки кишков, а затем химически очищают путем последовательных растворений, что дает в результате переработанный тканевый матрикс. Такой механически и химически очищенный кишечный коллагеновый слой, полученный из подслизистой оболочки тонкой кишки, в настоящем документе обозначают как "СКК", этот слой является одним из видов переработанных тканевых матриксов или материалов, из которых получают противомикробные конструкции изобретения.

В композиции переработанный СКК тканевый материал - это бесклеточный телопептидный коллаген типа I, который примерно на 93% по массе является сухим, при этом менее 5% от массы сухого остатка составляют гликопротеины, гликозаминокликаны, протеогликаны, липиды, неколлагеновые белки и нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, этот материал в основном свободен от клеток и продуктов распада клеток. Переработанный СКК тканевый материал по большей части сохраняет структуру и прочность своего матрикса. Существенно, что биосовместимость и биореконструируемость тканевого матрикса частично сохраняется в процессе очистки, поскольку она свободна от связывающих детергентных остатков, которые могли бы неблагоприятно повлиять на биореконструируемость коллагена. Кроме того, молекулы коллагена сохраняют свои телопептидные участки, поскольку ткань не подвергают обработке ферментами во время проведения процесса очистки.

Для получения переработанного тканевого матрикса определяют подходящий источник животного происхождения и тканевый источник. Ткань обрабатывают как механически, так и химически, для того чтобы удалить сопутствующие ткани и отделить неколлагеновые компоненты от ткани, получив в результате переработанный тканевый матрикс. В качестве примера, СКК является одним видом переработанного тканевого матрикса, используемого для получения биоинженерных имплантируемых протезов изобретения. В описанных ниже способах проводят обработку ткани для получения переработанного тканевого матрикса и для изготовления биоинженерных имплантируемых протезов, содержащих СКК и противомикробный агент.

Для получения свиного СКК, подслизистую оболочку тонкой кишки свиньи используют в качестве исходного материала для биоинженерного имплантируемого протеза изобретения. После изъятия тонкой кишки свиньи, сопутствующие ткани удаляют, а затем кишечник механически очищают, используя аппарат для очистки кишки, в котором энергично отделяется жировая клетчатка, мышцы и слои слизистой от подслизистой оболочки при использовании комбинации механического воздействия и водной промывки. Механическое воздействие осуществляется набором валов, которые сжимают и выдавливают последовательные слои подслизистой оболочки при пропускании через эти валы цельного кишечника. Подслизистая оболочка тонкой кишки сравнительно прочнее и тверже окружающей ткани, и поэтому валы выдавливают более мягкие компоненты отдельно от подслизистой. Другие средства механической очистки, используемые в данной области техники, которые может определить квалифицированный специалист, включают прочие физические манипуляции, такие как соскабливание, выдавливание, сжатие и растирание. Результат механической очистки таков, что остается исключительно подслизистый слой кишечника - механически очищенный кишечник.

После механической очистки используют процедуру химической очистки для отделения клеточных и матриксных компонентов от механически очищенного кишечника, предпочтительно проводя ее при асептических условиях и при комнатной температуре. Механически очищенный кишечник вырезают в продольном направлении вниз от полости, а затем вырезают в виде отрезков длиной приблизительно от 15 см до 50 см. Материал взвешивают и помещают в контейнеры при соотношении раствора к кишечному материалу примерно 100:1 по объему. В наиболее предпочтительной процедуре химической очистки, например по способу, раскрываемому в патентах США №№5993844 и 6599690 под авторством Abraham (эти ссылки означают, что сведения из упомянутых патентов в полном объеме включены в этот документ) коллагеновую ткань обрабатывают с эффективным количеством хелатирующего агента, такого как тетранатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в щелочных условиях, например, посредством добавления гидроксида натрия (NaOH); с последующей обработкой эффективным количеством кислоты, где кислота содержит соль, например соляная кислота (HCl), содержащая хлорид натрия (NaCl); с последующей обработкой эффективным количеством буферного солевого раствора, например, с 1 мМ раствором хлорида натрия (NaCl) с концентрацией фосфатно-солевого буфера (PBS - от англ. phosphate buffered saline) 10 мМ; в конце проводят стадию промывки водой. Каждую стадию обработки предпочтительно проводят с использованием качающейся или вибрирующей платформы для улучшения воздействия химических и промывочных растворов. В результате проведения процессов очистки получается переработанный кишечный коллагеновый слой, или СКК, механически и химически очищенный переработанный тканевый матрикс, полученный из подслизистой оболочки тонкой кишки. После промывки СКК вынимают из очистных контейнеров и умеренно отжимают или промокают тканью для удаления избытка воды. На этой стадии его можно хранить в замороженном виде при -80°С, при 4°С в стерильном фосфатном буфере, либо в сухом виде до изготовления из него протеза. Если хранить в сухом виде, то листы СКК разглаживают на поверхности, например на плоской пластине, предпочтительно на пористой пластине или мембране, такой как поликарбонатная мембрана, а любые лимфатические наросты с очищенной стороны материала удаляют при помощи скальпеля, после этого листы СКК можно поставить сушиться в ламинаре при комнатной температуре и влажности окружающей среды.

СКК представляет собой плоскую, листовую структуру, которую можно использовать как однослойный материал для изготовления различных типов конструктов, используемых в качестве протезов, при этом форма протезов зависит только от предполагаемого назначения. Для получения многослойных протезов изобретения листы СКК ламинируют способом, в котором по-прежнему сохраняется биосовместимость и биореконструируемость переработанного матриксного материала, при этом в данном способе может сохраняться прочность и структурные характеристики материала, необходимые для эффективной эксплуатации его в качестве замещающей ткани. Переработанный тканевый матрикс, полученный из ткани, сохраняет структурную целостность нативного тканевого матрикса, то есть коллагеновая матриксная структура исходной ткани остается в основном незатронутой, а также сохраняет физические свойства так, что при имплантации будут проявляться многие функциональные и присущие ей свойства. При получении многослойных ламинатов СКК, листы СКК наслаивают для контактирования с другими листами. Площадь контакта представляет собой область связывания, где слои контактируют друг с другом, либо слои непосредственно накладываются друг на друга или частично находятся в контакте или перекрываются с образованием более сложных структур. В готовых конструктах область связывания должна быть устойчивой к наложению швов и растяжению при эксплуатации их в клинических условиях, во время имплантации и во время начальной стадии заживления при функционировании конструктов в качестве замещающей части тела. Область связывания также должна поддерживать достаточную прочность до тех пор, пока клетки больного не заполнят и впоследствии не биореконструируют протез с образованием новой ткани.

Переработанный тканевый матрикс используют в качестве однослойного протеза или получают из него многослойный, связанный протез плоской, трубчатой или сложной формы. В том случае, когда протезы изобретения содержат два или более двух слоев переработанного тканевого матрикса, слои связывают посредством химического сшивания с помощью перекрестносшивающего агента (для краткости также называемого здесь сшивающим агентом). При использовании химического сшивания для связывания нескольких слоев переработанного тканевого матрикса друг с другом, степень химического перекрестного сшивания можно варьировать для модулирования скоростей биореконструирования на всем протяжении протеза, т.е. скоростей, с которыми протез рассасывается и/или замещается клетками-хозяевами и тканью организма-хозяина. Другими словами, чем выше степень перекрестного сшивания в протезе, тем с более низкой скоростью протезы будут подвергаться биореконструированию; наоборот, чем ниже степень перекрестного сшивания, тем быстрее протезы будут подвергаться биореконструированию. В соответствии с показаниями к хирургическому вмешательству устанавливается степень и/или скорость биореконструирования, необходимая для протеза. Например, при использовании однослойного конструкта в качестве повязки на рану протез можно химически сшивать или можно не сшивать. Например, при использовании в качестве хирургического восстанавливающего лоскута, или сетки, протез представляет собой многослойный конструкт, который имеет низкую степень перекрестного сшивания с тем, чтобы протез биореконструировался с более высокой скоростью. Например, при использовании в качестве мочепузырного лоскута для поддержания гипермобильного мочевого пузыря с целью предотвращения недержания мочи, протез представляет собой многослойный конструкт, который имеет высокую степень перекрестного сшивания с тем, чтобы он не биореконструировался быстро, т.е. он по существу сохраняет ту же самую форму, которую он имел при имплантации, на протяжении длительного периода времени.

Коллагеновый матрикс или конструкт в том случае, когда имеет форму листа, как правило, имеет две противоположные поверхности большой площади. Для обработки переработанного коллагенового матрикса противомикробным агентом, этот агент наносят посредством введения его в контакт с какой-либо из сторон переработанного коллагенового матрикса, или этот агент связывают с обоими сторонами. В качестве альтернативы, можно достигнуть волокнистых, абсорбционных свойств переработанного коллагенового матрикса, нанося противомикробный агент на внутреннюю часть переработанного коллагенового материала, как в пустоты волокнистого переработанного тканевого матрикса, например, посредством погружения коллагенового матрикса в раствор, содержащий противомикробный агент, которое проникает в матрикс путем абсорбции. Другим способом введения противомикробного агента внутрь многослойного конструкта является первоначальная обработка одиночных слоев переработанной тканевого матрикса, а затем нанесение слоев и связывание их друг с другом. В случае многослойных конфигураций способ включает проведение следующих стадий изготовления: матриксные листы обрабатывают противомикробным агентом, матриксные листы наслаивают для образования составных слоев и сшивают конструкт сшивающим агентом; указанные стадии можно проводить в любом порядке, включая следующие: матриксные листы обрабатывают противомикробным агентом, матриксные листы наслаивают для образования составных слоев с последующим сшиванием посредством сшивающего агента; матриксные листы обрабатывают противомикробным агентом, сшивают посредством сшивающего агента с последующим наслаиванием матриксных листов для образования составных слоев; сшивают посредством сшивающего агента, обрабатывают матриксные листы противомикробным агентом, а затем наслаивают матриксные листы для образования составных слоев; сшивают посредством сшивающего агента, наслаивают матриксные листы для образования составных слоев, а затем обрабатывают матриксные листы противомикробным агентом; наслаивают матриксные листы для образования составных слоев, сшивают посредством сшивающего агента, а затем обрабатывают матриксные листы противомикробным агентом; или, наслаивают матриксные листы для образования составных слоев, обрабатывают матриксные листы противомикробным агентом, а затем сшивают посредством сшивающего агента. В некоторых случаях, сшивание матрикса после покрытия противомикробным агентом может оказаться непрактичным, поскольку некоторые противомикробные агенты могут смываться сшивающим агентом.

Необработанные и обработанные слои можно наслаивать друг на друга в различном порядке чередования для получения протеза с локализованным противомикробным агентом. Способы изготовления таких многослойных конфигураций включают наслаивание листов переработанного тканевого матрикса, которые предварительно были обработаны противомикробным агентом, и необработанных матриксных листов друг на друга для составления многослойного конструкта, и сшивание слоев друг с другом, например, по меньшей мере, два матриксных листа можно наслаивать, сшивать и обрабатывать противомикробным агентом для составления обработанного матриксного конструкта, а затем один или несколько матриксных листов можно наслоить либо на верхнюю или нижнюю поверхность, либо на обе поверхности обработанного матриксного конструкта, а затем полученный конструкт можно сшить для получения объединенного конструкта. В качестве альтернативы, по меньшей мере, два необработанных матриксных листа можно наслоить или перекрестно сшить для получения необработанного матриксного конструкта, а затем один или несколько матриксных листов можно наслоить либо на верхнюю или нижнюю поверхность, либо на обе поверхности необработанного матриксного конструкта, после чего полученный в результате конструкт можно перекрестно сшить для получения комбинированного матриксного конструкта. В другом примере обработанные и необработанные матриксные листы можно наслоить поочередно, а затем перекрестно сшить для составления комбинированного конструкта. В еще одном примере обработанные матриксные листы, которые были предварительно обработаны двумя различными противомикробным агентами можно расположить в чередующемся или в ином порядке для получения комбинированного конструкта. В еще одном примере ориентация обработанных и необработанных листов относительно друг друга, или относительно обработанных или необработанных матриксных конструктов в комбинорованном матриксном конструкте может быть выбрана с учетом такого выгодного качества СКК материала, как многосторонность.

Для обработки только выбранных частей или областей протеза эти части поверхности материала можно обработать противомикробным агентом путем маскирования обрабатываемых частей так, чтобы при маскировании блокировался контакт противомикробным агентом с материалом во время обработки других областей поверхности. Другим способом локализации противомикробного агента на коллагеновом матриксе является частичное погружение коллагенового материала в ванну или резервуар так, чтобы в контакте с противомикробным агентом находилась только часть коллагенового матрикса, а оставшиеся части не вступали в контакт. Еще одним способом локализации противомикробного агента на поверхности материала является распыление, или какое-либо иное продвижение, противомикробного агента на поверхности материала, при котором противоположная поверхность остается необработанной.

Однослойные и многослойные конструкты обрабатывают противомикробным агентом для придания ему противомикробных свойств. По меньшей мере, одно противомикробный агент наносят на конструкты изобретения посредством введения его в контакт с противомикробным агентом целиком или только с некоторой частью. К предпочтительным противомикробным агентам относятся противомикробные агенты на основе серебра и на химической основе. Также в композицию может быть включен антибиотический агент. Для обработки коллагенового материала с целью придания ему широкого спектра противомикробной активности можно использовать комбинацию агентов, например комбинацию противомикробных агентов на основе серебра и на химической основе; противомикробного агента на химической основе и антибиотического агента; противомикробного агента на основе серебра и антибиотического агента; или комбинацию всех трех типов агентов.

Для придания противомикробных свойств протезам, содержащим переработанный тканевый матрикс можно выбрать противомикробные агенты на основе серебра. Серебро можно наносить на коллагеновые конструкты в нескольких формах. Противомикробные агенты на основе серебра содержат серебро или соединения, содержащие серебро, эти соединения обладают некоторой степенью антимикробной активности и совместимы как с коллагеновым конструктом, так и с организмом больного. Чистое серебро, которое также называют элементарным или благородным серебром, химически сравнительно неактивно и не взаимодействует с водой или кислородом при обычных температурах, а также не растворяется в разбавленных кислотах и основаниях.

Можно также использовать ионы серебра. Предполагается, что в ионной форме серебро еще не придает устойчивость к микробам и маловероятно, чтобы оно действовало также как и другие противомикробные агенты. Не стремясь связать это с какой-либо теорией, серебро в этой ионной форме эффективно действует против бактерий, дрожжей и грибков, а также против внеклеточных вирусов за счет прямого воздействия на дыхание и транспорт клеток и клеточной оболочки, а также за счет прямого влияния на клеточное размножение. Также можно использовать серебро в других формах, включая (но этим перечень не ограничивается): оксид серебра; нитрат серебра; сульфадиазин серебра (сульфадиазин серебра (I) содержит нерастворимое полимерное соединение, которое медленно высвобождает ионы серебра при использовании его в качестве противомикробного и противогрибкового агента, это соединение можно использовать локально при лечении сильных ожогов с целью предотвращения бактериальной инфекции), имидазолят серебра, Arglaes® от Giltech Limited, Великобритания (арглэис, также условно обозначаемый как AgKaPO₄), коллоидное серебро, серебряные кристаллы, например нанокристаллы серебра, которые также называют "нанокристаллическим серебром", - все эти средства относятся к альтернативному способу доставки и замедленного высвобождения катиона серебра и его радикалов к раненному участку или участку имплантации.

Композиции нанокристаллического серебра ("наносеребра") изготавливают согласно нескольким различным способам. В одном способе - импульсном плазменном методе - получают нанокристаллы с организованной структурой кристаллической решетки и без неупорядоченности атомов, размеры частиц распределены в узком диапазоне и имеется высокая степень однородности их морфологии. В импульсном плазменном процессе используют в качестве сырья два проводящих стержня. Стержни загружают в реакционную камеру, которая контролируемо заполняется газом, наиболее вероятно, инертным газом, таким как аргон, при атмосферном давлении. Стержни соединяют с очень мощным, импульсным источником электропитания (разрядником). Наноматериал синтезируют посредством быстрого электрического разряда от источника импульсной мощности вдоль стержней, используемых как сырье. Мощный разряд удаляет сырой материал, создавая высокотемпературную, металлсодержащую плазму высокого давления. Благодаря использованию уникальной газодинамики плазма быстро расширяется в окружающий газ, создавая гомогенную газофазную суспензию наночастиц. Получаемые наночастицы непрерывно собирают при помощи системы с замкнутым контуром. Нагнетательный вентилятор рециркулирует контролируемые газы, перенося частицы к системе сбора. В этом способе получают нанокристаллические частицы серебра диаметром от 10 нм до 100 нм в зависимости от параметров процесса. Как правило, для использования в изобретении выбирают частицы с размером от 15 нм до 40 нм или от 20 нм до 25 нм.

К другим способам изготовления наносеребряных композиций относятся те, что описаны в патенте США №6719987 (Барелл). В этих способах получают кристаллы, кристаллическая решетка которых характеризуется неупорядоченностью атомов. В процессе Барелл осаждаемый материал получают в паровой фазе, например посредством испарения или распыления, и переносят в большой объем, в котором регулируется температура. Атомы материала сталкиваются с атомами атмосферы рабочего газа, теряют энергию и быстро конденсируются из газовой фазы на холодной подложке, например на так называемом пальце, охлаждаемом жидким азотом. Неупорядоченность атомов создается при условиях, которые ограничивают диффузию так, чтобы в материале поддерживалась достаточная неупорядоченность атомов. В случае с серебром осаждение проводят при пониженных температурах подложки, от -10°С до 100°С, используют такие значения давления рабочих газов, которые выше обычных, угол падения примерно ниже 30°, а также используют более высокие скорости осаждения, что создает более высокий поток атомов по сравнению с обычным. Неупорядоченность атомов может также достигаться при введении различных атомов или молекул в металлическую матрицу по процессу, называемому "легированием" (англ. "doping"), или посредством введения химически активных газов (а именно кислорода) в камеру. Согласно этому способу кислород является компонентом технологического газа.

Противомикробные агенты на химической основе можно наносить на коллагеновые конструкты для придания им противомикробных свойств. Химические противомикробные агенты могут выбираться из следующего перечня (но список их не исчерпывается этим): гидрохлорид поли(гексаметиленбигуанида) (РНМВ - от англ. poly(hexamethylene biguanide) hydrochloride), глюконат хлоргексидина, бис-амидо полибигуаниды, например, те, что описываются в патенте США №6316669 (ссылка предусматривает, что сведения из него включены в этот документ), мед, бензалкониум хлорид, триклозан (2,4,4'-трихлоро-2'-гидродифениловый эфир) и диметил-октадецил-(3-тиметоксисилилпропил)азаниума хлорид.

Вдобавок к противомикробному агенту коллагенновый конструкт может дополнительно содержать антибиотический агент. Антибиотический агент представляет собой средство, которое вырабатывается микроорганизмами для уничтожения или подавления роста других микроорганизмов. Как правило, антибиотиками (небелковыми) являются молекулы с низкой молекулярной массой, которые продуцируются как вторичные метаболиты, главным образом микроорганизмами, обитающими в почве. Большая часть этих микроорганизмов формируют некий тип спор или другие виды покоящихся клеток, и полагают, что существует некоторая взаимосвязь между продуцированием антибиотиков и процессами спорообразования. Среди плесеней примечательными продуцентами антибиотиков являются род плесневых грибов Penicillium и Cephalosporium, которые являются основным источником бета-лактамных антибиотиков, к которым относятся пенициллин и соответствующие соединения. В случае бактерий, актиномицеты, в особенности виды Streptomyces, продуцируют различные типы антибиотиков, включая аминогликозиды, например стрептомицин, макролиды, например этиртромицин, и тетрациклины. Бацциловые виды, образующие эндоспоры, продуцируют полипетидные антибиотики, такие как полимиксин и бацитрацин. Антибиотики могут оказывать цидальное действие, т.е. "умерщвляющее" действие, или статическое действие, т.е. "ингибирующее" действие, на ряд микробов. Спектр действия антибиотического агента охватывает диапазон бактерий и других микроорганизмов, поражаемых им. Антибиотики, эффективные против прокариотов, которые уничтожают или ингибируют широкий диапазон грамположительных и грамотрицательных бактерий называют антибиотиками "широкого спектра"; те, что эффективны главным образом против грамположительных и грамотрицательных бактерий, называют антибиотиками "узкого спектра"; а те, что эффективны против определенных организмов или заболеваний, называют антибиотиками "ограниченного спектра" действия. Предпочтительно используемым антибиотическим соединением является антибиотик широкого спектра действия. Антибиотические агенты, предусмотренные в коллагеновых конструктах, могут быть в комбинации, например в комбинации грамположительного соединения узкого спектра и грамотрицательного соединения узкого спектра; однако, можно использовать любую комбинацию антибиотиков с различным спектром действия - широким, узким и ограниченным.

К антибиотикам, предназначенным для использования в изобретении, относятся: бета-лактамы (пенициллины и цефалоспорины), такие как пенициллин G, цефалотин; полусинтетический пенициллин (который также может включать клавулановую килоту), такой как ампициллин, амоксициллин и метициллин; монобактамы, например, азтреонам; карбоксипенемы, например, имипенем; аминогликозиды, например стрептомицин, гентамицин; гликопептиды, например ванкомицин; линкомицины, например клиндамицин; макролиды, например этитромицин; полипептиды, например полимиксин, бацитрацин; полиены, например амфотерицин; нистатин; рифамицины, например рифампицин; тетрациклины, например тетрациклин; полусинтетический тетрациклин, такой как доксициклин; и хлорамфеникол.

Переработанный тканевый матрикс может использоваться только как одиночный слой в однослойном протезе или может использоваться для изготовления протезов, имеющих два или более двух слоев. Если она используется как одиночный слой, то противомикробный агент вводят в контакт с переработанным тканевым матриксом для придания противомикробных свойств матриксу. Перед или после контактирования с противомикробным агентом переработанный тканевый матрикс можно химически сшить для регулирования скорости биореконструирования и биодеградации материала. Другими словами, к однослойным противомикробным конструктам относится: одиночный слой и обработанный противомикробным агентом; одиночный слой, химически сшитый сшивающим агентом, а затем обработанный противомикробным агентом; или одиночный слой, обработанный противомикробным агентом, а затем химически сшитый сшивающим агентом.

Способы изготовления многослойных протезов, содержащих два или более двух слоев переработанного тканевого матрикса, описываются с использованием СКК.

Один вариант осуществления изобретения направлен на плоские листовые протезы и способы изготовления и использования плоских листовых протезов, состоящих из двух или более двух слоев СКК, который связан и поперечно сшит, в качестве имплантируемого биоматериала, который обладает способностью биореконструироваться клетками больного. Благодаря плоской листовой форме СКК, протез легко изготавливается в виде формы, содержащей любое количество слоев, предпочтительно от 2 до 10 слоев, более предпочтительно от 2 до 6 слоев, количество их подбирается в зависимости от прочности и объема, необходимых для конечного предполагаемого использования конструкта. СКК имеет структурные матриксные волокна, которые тянутся в одинаковом общем направлении. При наслаивании ориентации слоев могут варьироваться с целью достижения общей ориентации тканевых волокон в переработанных тканевых слоях. Листы можно наслаивать так, чтобы ориентация их волокон была параллельной или чтобы они располагались под различными углами. Слои можно накладывать друг на друга с получением конструкта, имеющего непрерывные слои на всем протяжении площади протеза. В качестве альтернативы, поскольку конечный размер выполнения с наложением ограничивается окружностью кишечника, слои можно расположить в шахматном порядке, такое расположения делается для того, чтобы сформировать листовой конструкт с площадью поверхности, превышающей размеры исходного материала, но без непрерывных слоев вдоль площади протеза. К примеру, можно ввести сложные детали, например трубку или сеть трубок и каналов, проходящих между слоями или пересекающих их.

При изготовлении многослойного конструкта, содержащего СКК, предпочтительно используют асептическую среду и стерильные условия для поддержания стерильности конструкта в том случае, когда начинают со стерильного СКК материала. Для получения многослойного конструкта СКК, первое стерильное неподвижное опорное звено, например неподвижную пластину из поликарбоната, помещают в стерильную область камеры ламинара. Если после процессов механической и химической очистки листы СКК еще не находятся в гидратированном состоянии, то их гидратируют в водном растворе, например в воде или в фосфатно-солевом буфере. Листы СКК промокают стерильными абсорбирующими тканями для поглощения избыточной воды из материала. Если это еще не проделано, то СКК материал зачищают, отсекая любые лимфатические наросты на серозной поверхности, от промытой стороны. Первый лист зачищенного СКК кладут на поликарбонатную пластину и вручную разглаживают по поликарбонатной пластине для удаления любых воздушных пузырей, складок и сгибов. Второй лист зачищенного СКК кладут на верхнюю часть первого листа, снова вручную удаляя воздушные пузыри, складки и сгибы. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не получат желаемое количество слоев для специфического применения, предпочтительно пока не получат от 2 до 10 слоев.

СКК обладает таким качеством, как многосторонность, от своего нативного трубчатого состояния, в котором внутренняя слизистая поверхность обращена в сторону кишечной полости в нативном состоянии, а противоположная внешняя серозная поверхность обращена в сторону очищенной стороны. Было найдено, что эти поверхности имеют характеристики, которые могут воздействовать на послеоперационные показатели протеза, но при этом можно также достигнуть улучшенных показателей устройства. В настоящее время при использовании синтетических устройств образование спайки может вызвать необходимость проведения повторной операции для отделения спаек от окружающей ткани. При формировании перикардиального лоскута или протеза для восстановления грыжи, состоящего из двух слоев СКК, предпочитают, чтобы область связывания двух слоев находилась между серозными поверхностями, поскольку продемонстрировано, что слизистые поверхности обладают способностью противодействовать образованию послеоперационной спайки после имплантации. В других вариантах осуществления предпочитают, чтобы одна поверхность СКК лоскутного протеза являлась неадгезивной, нелипкой, а другая поверхность обладала сродством (липкостью) к ткани организма-хозяина. В этом случае одна поверхность протеза будет слизистой, а другая серозной. Кроме того, в других вариантах предпочитают, чтобы на противоположных поверхностях имелась возможность для создания спаек для сращивания друг с другом тканей, эти спайки контактируют с тканями на каждой стороне, таким образом протез содержит серозные поверхности на обоих сторонах конструкта. Поскольку только два внешних листа потенциально контактируют с другими структурами тела при имплантации, ориентация внутренних слоев в том случае, когда конструкт состоит из более двух слоев, приобретает меньшее значение, поскольку они, вероятно, не будут вносить вклад в образование послеоперационных спайков.

После наслаивания требуемого количества листов СКК, их связывают посредством дегидратации вместе в области их связывания, а именно там, где листы находятся в контакте. Не стремясь связывать это как-то с теорией, дегидратация приводит к тому, что коллагеновые волокна СКК слоев соединяются вместе при удалении воды из области, расположенной между волокнами матрикса СКК. Слои можно дегидратировать либо у открытого слоя на первом элементе подложки, либо между первым элементом подложки и другим элементом подложки, например второй пластиной из поликарбоната, располагаемой перед высушиванием на верхним слое СКК и закрепляемой на первом опорном звене для удержания всех слоев в плоскопланарном расположении при приложении или без приложения небольшого давления. Для содействия протеканию дегидратации, элемент подложки может быть пористым, что позволяет воздуху и влаге проходить сквозь дегидратированные слои. Слои можно высушивать на воздухе, под вакуумом или при помощи химических средств, таких как ацетон или спирт, например этиловый спирт или изопропиловый спирт. Дегидратацию можно провести до комнатного значения влажности, в диапазоне примерно от 10% до 20% от относительной влажности, или менее; или влагосодержание примерно составляет от 10% до 20% по массе, или менее. Дегидратацию можно легко провести путем разворота держателя, фиксирующего поликарбонатный лист и СКК слои, вплоть до поворота его лицевой стороной ко встречной струе воздуха ламинара, по меньшей мере, на протяжении 1-24 часов при температуре окружающей среды, составляющей приблизительно 20°С, и при комнатной влажности.

Несмотря на то, что в этом нет необходимости, в одном варианте осуществления дегидратированные слои повторно гидратируют перед сшиванием. Дегидратированные слои СКК совместно снимают с пористого опорного звена и повторно гидратируют водным регидратирующим агентом, предпочтительно водой, путем перенесения их в контейнер, содержащий водный регидратирующий агент, и выдерживания в нем примерно в течение 10-15 минут примерно при температуре 4°С- 20°С для того, чтобы повторно гидратировать слои без их разделения или расслаивания.

Дегидратированные или дегидратированные и повторно гидратированные, связываемые слои затем сшивают друг с другом в области связывания посредством введения обработки слоистого СКК сшивающим агентом, предпочтительно химическим сшивающим агентом, который сохраняет способность СКК материала к биореконструированию. Как упомянуто выше, при дегидратации коллагеновые волокна матриксов смежных слоев СКК слипаются, а при сшивании этих слоев друг с другом образуются химические связи между компонентами, посредством которых слои связываются. Сшивание связанного протезного устройства придает прочность и долговечность устройству, улучшая его эксплуатационные свойства. Различные типы сшивающих агентов известны в данной области техники и могут использоваться, такими агентами являются рибоза и другие сахара, окислители и дегидротермические (DHT - от англ. dehydrothermal) методы. Предпочтительным сшивающим агентом является гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (ЭДК). В другом предпочтительном методе сульфо-N-гидроксисукцинимид добавляют к ЭДК сшивающему агенту так, как это описывается в Staros, J.V., Biochem. 21, 3950-3955, 1982. Помимо химических сшивающих агентов, слои можно связывать друг с другом при помощи клеев на основе фибрина или адгезивов медицинского качества, таких как полиуретан, винилацетат или полиэпоксид. В наиболее предпочительном способе ЭДК растворяют в воде предпочтительно до концентрации примерно в диапазоне от 0,1 мМ до 100 мМ, более предпочтительно в диапазоне от 1,0 мМ до 10 мМ, наиболее предпочтительно до концентрации 1,0 мМ. Кроме воды, можно использовать фосфатно-солевой буфер или буфер из 2-[N-морфолин]этансульфоновой кислоты (МЭСК) для растворения ЭДК. К раствору можно добавлять и другие агенты, такие как ацетон или спирт, вплоть до объемной концентрации 99% в воде, как правило, 50%, для того чтобы провести сшивку более равномерно и эффективно. Эти агенты удаляют воду из слоев, сближая матриксные волокна, что способствует сшиванию между этими волокнами. Путем регулирования соотношения этих агентов к воде в сшивающем агенте можно регулировать поперечную сшивку. ЭДК раствор для сшивания получают непосредственно перед использованием, поскольку ЭДК теряет свою активность со временем. Для введения сшивающего агента в контакт с СКК, гидратированные, связанные СКК слои переносят в контейнер, например в плоскую кювету, а сшивающий агент осторожно декантируют в кювету, удостоверившись в том, что СКК слои как покрыты, так и находятся в свободно-плавающем состоянии, и в том, что под слоями СКК конструктов и внутри них отсутствуют воздушные пузыри. Контейнер покрывают, а слоям СКК дают возможность поперечно сшиться в течение примерно 4-24 часов, более предпочтительно - в течение примерно 8-18 часов при температуре от 4°С до 20°С. Поперечное сшивание можно регулировать варьированием температуры: при пониженных температурах поперечное сшивание протекает более эффективно, поскольку реакция замедляется; при повышенных температурах поперечное сшивание протекает менее эффективно, поскольку ЭДК при этом менее стабилен.

После сшивания сшивающий агент декантируют и удаляют, а конструкты промывают в кювете посредством введения их в контакт с промывным агентом для удаления остаточного сшивающего агента. Предпочтительным промывным агентом является вода или другой водный раствор. Предпочтительно, эффективная промывка достигается при трехкратном введении химически связанного конструкта в контакт с равными объемами стерильной воды на протяжении пяти минут при каждой промывке. Как описано в этом документе, конструктам придают противомикробные свойства путем введения их в контакт с противомикробным агентом: либо посредством введения в контакт, или обработки, каждого слоя переработанного тканевого матрикса либо посредством введения в контакт, или обработки, многослойного промежуточного конструкта. Способ обработки переработанного тканевого матрикса в однослойной и многослойной форме будет варьироваться в зависимости от типа используемого противомикробного агента, но при этом должны сохраняться биореконструирумые, биомеханические и биосовместимые свойства переработанного тканевого матрикса.

В том случае, когда в качестве противомикробного агента выбирают нанокристаллическое серебро, его наносят на коллагеновый матриксный материал посредством введения в контакт коллагенового матриксного материала с нанокристаллическим серебром. Противомикробный агент можно наносить покрытием переработанного матриксного материала посредством суспендирования агента в растворе. Нанокристаллическое серебро диспергируют в воде, водном растворе или в растворителе с образованием раствора диспергированного нанокристаллического серебра. СКК погружают в лоток с неким количеством раствора нанокристаллического серебра так, чтобы при погружении СКК нанокристаллическое серебро прилипало к СКК. Раствор можно также взбалтывать или перемешивать во время погружения.

После этого СКК вынимают из раствора и помещают в среду, в которой воде или растворителю дается возможность испариться из СКК со связанным серебром, что приводит в результате к получению СКК конструкта со слоем нанокристаллического серебра. Другие способы покрытия СКК дисперсией, содержащей нанокристаллическое серебро, включают распыление и предоставление растворителю возможности для испарения из СКК.

В том случае, когда в качестве противомикробного агента выбирают РНМВ, то РНМВ добавляют к раствору, используя его 0,09%-0,5% (по объему) раствор в воде, в котором переработанный тканевый матрикс погружают так, чтобы РНМВ раствор насыщал матрикс. После прохождения времени, достаточного для насыщения раствором переработанного тканевого матрикса, матрикс вынимают из раствора и дают ему возможность просохнуть так, что при испарении раствора на матриксе остается РНМВ.

Переработанные тканевые матриксы и конструкты могут быть обработаны или модифицированы, либо физически, либо химически, до или после изготовления многослойного, связанного имплантируемого протеза. Можно провести физические модификации на очищенных тканевых матриксах и конструктах, такие как формование, кондиционирование посредством растяжения и расслабления, или перфорирование, выполнение в виде сетки или фенестрация. Кондиционирование сокращает суммарную деформацию материала, в то время как перфорирование, изготовление отверстий или фенестрация обеспечивает более лучшее соответствие формы поверхности раны и лучшее прохождение или дренирование экссудатов, либо обеспечивает оба упомянутых свойства. Также можно провести химические модификации, такие как иммобилизация факторов роста, некоторых компонентов внеклеточного матрикса, генетического материала и других агентов, которые могли бы повлиять на биореконструирование или заживление части тела, которую излечивают, восстанавливают или заменяют.

Способы физической модификации тканевого матрикса и конструктов изобретения могут быть подобраны тем, кто сведущ в данной области техники, при принятии во внимание эксплуатационных характеристик, требуемых от конструкта. Конструкты могут быть выполнены имеющими раппортную перфорацию, которая пронизывает весь слой конструкта, посредством использования пресса со штампом, имеющим иглы, лезвия или штифты, выполненные раппортно на рабочей поверхности штампа. Конструкт помещают на платформу, и нажимают штамп так, чтобы иглы, лезвия или штифты выдавливались сквозь конструкт к платформе, при этом конструкт прокалывается. В способе выполнения щелей или сетчатой структуры используется установка для изготовлению отверстий в коже, аналогичный тому, что обычно используют в процедурах аутотрансплантации кожи. Одной такой установкой для выполнения отверстий в коже является устройство Zimmer. Конструкты можно просверлить лазером для создания пор микронного размера в готовом протезе, чтобы помочь клеткам прорастать внутрь, используя эксимерный лазер (например, при длинах волн KrF или ArF). Конструкты можно перфорировать, сверлить лазером или проделывать в них отверстия на любом этапе процесса изотовления процесса, но лучше сделать это до обеззараживания или термической стерилизации. Для некоторых показаний предпочитают, чтобы перфорации или отверстия, просверленные лазером, проходили через все слои протеза для содействия прохождению клеток или жидкого дренажа. В случае других показаний предпочитают, чтобы они не проходили сквозь все слои так, чтобы отверстия обеспечивали доступ клеток к внутренней части многослойного конструкта или содействовали образованию новых сосудов конструкта.

Другими физическими модификациями однослойного конструкта являются перфорации и фенестрации, которые являются сквозными. Другой физической модификацией применительно к однослойному конструкту является изготовление из конструкта сетки, т.е. выполнение регулярно расположенных прорезей на конструкте так, что он становится похожим на сетку. Прорези выполняют с соотношением размеров ячейки, аналогичным тому, что получают при использовании установки по проделыванию кожных отверстий, например производимого фирмой Zimmer. Соотношение размеров ячейки можно установить на величину 1:1,5 или 2:1. Для изготовления однослойного СКК конструкта с противомикробными свойствами, СКК разравнивают слизистой стороной вниз на гладкой поликарбонатной пластине, обеспечив устранение складок, воздушных пузырей и видимых лимфатических наростов. Разравнивание СКК по поликарбонатной пластине проводится для оптимизации размеров. Материал необязательно высушивают в достаточной мере по всей его поверхности. На материал наносят, по меньшей мере, один противомикробный агент. Материал необязательно физически модифицируют путем перфорирования или изготовления ячеек, а затем обрезают до определенного размера, упаковывают и окончательно стерилизуют согласно техническим требованиям стерилизации. В альтернативном варианте осуществления противомикробную обработку материала проводят после того, как он был физически модифицирован посредством выполнения в виде сетки, и проделывания перфораций и фенестраций.

После приготовления переработанного тканевого матрикса и покрытия его противомикробным агентом, конструкты укорачивают до желаемого размера. Для иллюстрации, практичный размер составляет порядка 6 квадратных дюймов (приблизительно 15,2 см²), но можно получать и использовать для имплантации в организм больного конструкты любого размера.

Противомикробно-обработанный коллагеновый матрикс затем упаковывается в контейнер, который герметизируется для окончательной стерилизации, хранения и распределения. Противомикробно-обработанный коллагеновый матрикс можно упаковать в контейнер в сухом или влажном состоянии. Предпочтительные упаковочные материалы совместимы с противомикробной обработкой, коллагеновым матриксом, и при упаковывании во влажном состоянии также совместимы с любыми агентами, которые сохраняют продукт во влажном состоянии. Для конструктов, обрабатываемых светочувствительными противомикробными агентами, например противомикробными агентами на основе серебра, для упаковки продукта используют упаковочные материалы, которые предотвращают прохождение света или отфильтровывают его для того, чтобы не допустить снижения противомикробной активности и обесцвечивания конструктов.

В конце конструкты стерилизуют, используя средства, известные в области стерилизации медицинских приспособлений. Предпочтительным способом стерилизации является введение конструктов в контакт со стерильным 0,1% раствором надуксусной кислоты с последующей нейтрализацией достаточным количеством 10-ти нормального раствора гидроксида натрия (NaOH), согласно патенту США №5460962, раскрытие которого включено в этот документ. Обеззараживание проводят в контейнере на вибрирующей платформе, например в 1-литровых контейнерах Nalge, примерно в течение 18 часов + 2 часа. Конструкты затем промывают посредством введения их в контакт с тремя объемами стерильной воды на протяжении 10 минут для каждой промывки. В более предпочтительном варианте СКК конструкты стерилизуют, используя гамма-облучение в диапазоне 25-37 кГр. Гамма-облучение в значительной степени, но не пагубно, снижает модуль Юнга, предел прочности на разрыв и усадочную температуру. Механические свойства после гамма-облучения еще достаточны для использования в диапазоне приложений, а также гамма-облучение является предпочтительным средством для стерилизации, поскольку оно широко используется в области имплантируемых медицинских приспособлений. Предусматривается использование дозиметрического контроля при проведении каждой стерилизации для проверки того, что доза излучения находится в установленном диапазоне. Конструкты упаковывают, используя упаковочный материал и модель, которая совместима с композицией конструкта и обеспечивает стерильность при хранении. Предпочтительными упаковочными средствами являются двухслойная легкоотслаивающаяся упаковка, где основной упаковкой является термоклейкая, блистерная упаковка, состоящая из полиэтилентерефталатного, модифицированного гликолем (ПЭТГ - от англ. polyethylene terephtalate, glycol modified) лотка с крышкой, покрытой фольгой с бумажной поверхностью, который помещают во второй термоплавкий мешок, состоящий из полиэтилен/полиэтилентерефталатной (ПЭТ) пленки. Все это совместно, т.е. как основную, так и вторичную упаковку и СКК конструкт, содержащийся в них, стерилизуют, используя гамма-облучение.

Протезы этого изобретения могут быть плоскими, трубчатыми или иметь сложную геометрию. Форма получаемого протеза будет зависеть от предполагаемого использования. Таким образом, при получении связывающих слоев протеза данного изобретения, элементы шаблона и подложки могут конфигурироваться, под желаемую форму. Плоские многослойные протезы могут имплантироваться для восстановления, наращивания или замены больных или поврежденных органов, таких как брюшная стенка, перикард, грыжи и другие различные органы и структуры, включая (но этим перечень не ограничивается) кости, надкостницу, перихондрий, межпозвонковый диск, суставной хрящ, дерму, кишку, связки и сухожилия. Вдобавок, плоские многослойные протезы можно использовать в качестве сосудистого или внутрисердечного лоскута, или в качестве замены сердечного клапана.

Плоские листовые протезы, либо однослойные, либо многослойные, используют при заживлении ран для покрытия раны больного для образования гидроизолирующей прокладки, для предоставления покоя и комфорта раненному участку и для обеспечения противомикробной активности, поскольку участок раны стабилизируют перед началом лечения.

Плоские листы можно также использовать для поддержки органов, например для поддержки выпавших или гипермобильных органов, посредством использования листов в качестве поддерживающей повязки для органов, таких как мочевой пузырь или матка. Трубчатые протезы можно использовать, например, для замены поперечных срезов трубчатых органов, таких как сосудистая сеть, пищевод, трахея, кишечник и фаллопиевы трубки. Эти органы имеют основную трубчатую форму с внешней поверхностью и внутренней люминальной поверхностью. Вдобавок, плоские листы и трубчатые структуры можно соединить вместе для образования сложной структуры, предназначенной для замены или наращивания сердечных или венозных клапанов.

Материалы СКК, используемые при изготовлении противомикробных конструктов изобретения, являются биосовместимыми. Испытания на биосовместимость проведены на протезах, изготовленных из СКК, согласно Трехстороннему и ISO-10993 руководствам по биологической оценке медицинский приспособлений. Термин "биосовместимые" означает, что протезы нецитотоксичны, гемосовместимы, непирогенны, свободны от эндотоксинов, негенотоксичны, неантигенны и не вызывают реакции кожной сенсибилизации, не вызывают острую систематическую токсичность. Эти биосовместимые качества далее обсуждаются более подробно. Тестируемые изделия конструктов, полученных из СКК, не проявляют биологическую реакционноспособность (Сорт 0) или цитотоксичность, наблюдаемую в клетках L929 после определенного периода времени, когда тестируемое изделие подвергали воздействию, используя тест под названием "Тест L929 агаровой накладки на цитотоксичность in vitro". Наблюдаемая клеточная реакция на положительное контрольное изделие (Сорт 3) и отрицательное контрольное изделие (Сорт 0) подтвердила надежность тестируемой системы. Испытание и оценки проводили согласно рекомендациям фармакопеи США. Считается, что протезы изобретения нецитотоксичны и удовлетворяют требованиям Теста L929 агаровой накладки на цитотоксичность in vitro.

Испытание на гемосовместимость (тест на in vitro гемолиз с использованием in vitro модифицированного способа экстракции ASTM) протезов изобретения проводился согласно модифицированному способу экстракции ASTM. В условиях исследования значение гемолитического индекса для экстракта приспособления составило 0%, при этом положительный и отрицательный контроли представлены как рецидивированные. Результаты исследования указываются на то, что протезы изобретения негемолитичны и гемосовместимы.

Протезы изобретения подвергали испытанию на пирогенность согласно текущему протоколу USP по проведению испытания на пирогенность в кроликах. В условиях изучения суммарное повышение температуры кроликов в течение периода наблюдения находится в пределах, приемлемых согласно USP. Результаты подтвердили, что протезы изобретения непирогенны. Протезы изобретения свободны от эндотоксинов, предпочтительно на уровне ≤0,06 единиц/мл (на см² продукта). Эндотоксин относится к отдельному пирогену, который является частью клеточной оболочки грамотрицательных бактерий, он выбрасывается бактериями и загрязняет материалы.

Протезы изобретения не вызывают реакцию кожной сенсибилизации. В литературе нет сообщений, которые бы указывали на то, что химикаты, используемые для очистки свиного кишечного коллагена, вызывают реакцию сенсибилизации или могут модифицировать коллаген, вызвав ответную реакцию. Результаты испытания протезов изобретения, полученных из химически очищенного СКК, указывают на то, что протезы не вызывают реакцию сенсибилизации.

Протезы изобретения не вызывают реакцию первичного раздражения кожи. Результаты испытания химически очищенного СКК на предмет раздражения указывают на то, что протезы изобретения, составленные из химически очищенного СКК, не вызывают реакцию первичного раздражения кожи.

Испытание на острую системную токсичность и внутрикожную токсичность проводились на химически очищенном СКК, используемым для получения протезов изобретения, результаты теста показывают отсутствие токсичности среди тестируемых протезов. Дополнительно, при изучении животных имплантатов не обнаружено доказательств того, что химически очищенный свиной кишечный коллаген вызывает острую системную токсичность.

Испытания на подострую токсичность протезов изобретения, содержащих свиной кишечный коллаген, подтвердили отсутствие у устройства подострой токсичности.

В литературе не существует сообщений, которые бы указывали на то, что химикаты, используемые для очистки свиного кишечного коллагена, могли бы потенциально иметь генотоксическое внимание, или могли бы модифицировать коллаген, вызвав такую реакцию. Испытания на генотоксичность протезов изобретения, содержащих свиной кишечный коллаген, подтвердили отсутствие у устройства генотоксичности.

Целью процесса химической очистки свиного кишечного коллагена, используемого для получения протезов изобретения, является минимизация антигенности за счет удаления клеток, клеточных остатков, неколлагеновых и неэластичных матриксных компонентов. Подтверждено, что у протезов изобретения, содержащих свиной кишечный коллаген, отсутствует такой недостаток, как антигенность устройства, это подтверждено посредством имплантационных исследований, проводимых с использованием химически очищенного свиного кишечного коллагена.

СКК конструкты изобретения предпочтительно обладают антивирусной активностью. В процессе изготовления протестирована эффективность двух процедур химической очистки, с использованием хелатирующего щелочного раствора NaOH/ЭДТА (рН 11-12) и кислотного раствора соли HCl/NaCl (рН 0-1), для инактивации четырех релевантных и модельных вирусов. Модельные вирусы выбирались на основе источника свиного материала и для представления широкого диапазона физико-химических свойств (ДНК, РНК, оболочечный и безоболочечный вирусы). Вирусы включали вирус псевдобешенства, вирус вирусной диареи быка, реовирус-3 и свиной парвовирус. Исследования проводились на основе инструкций FDA и ICH, включая следующие документы: CBER/FDA "Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (1993)"; ICH "Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products: Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products, derived Cell Lines of Human or Animal Origin" (CPMP/ICH/295/95); и документ CPMP биотехнологической рабочей группы "Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses" (CPMP/BWP/268/95). Результаты исследования демонстрируют, что совокупная вирусная инактивация двух стадий химической очистки имеет коэффициент очищения выше 10⁶ для всех четырех модельных вирусов. Данные указывают на то, что процедуры химической очистки являются устойчивым и эффективным процессом, который обладает потенциалом для инактивации большого количество разнообразных вирусных агентов.

Протезы изобретения являются биореконструируемыми. При функционировании в качестве замещающей части тела или опоры протезы изобретения также функционируют в качестве биореконструируемой матриксного каркаса для врастания вовнутрь клеток организма-хозяина. Термин "биореконструирование" используют в этом документе для обозначения продуцирования эндогенного структурного коллагена, васкуляризации и вторичного заселения клеток посредством врастания вовнутрь клеток-хозяев со скоростью, примерно равной скорости биодеградации, преобразования и замены матриксных компонентов имплантируемого протеза клетками-хозяевами и ферментами. Имплантируемые протезы сохраняют свои структурные характеристики во время реконструирования организмами, в которых их имплантируют во всю, или практически во всю, ткань организма-хозяина, и по существу, функционируют в качестве аналога ткани, которую они восстанавливают или заживляют. В дополнение к этим биореконструируемым качествам получают протезы изобретения, полученные из двух или более двух слоев переработанного тканевого матрикса, для придания им желаемых биомеханических свойств.

Модуль Юнга (МПа) определяется как постоянный коэффициент линейной зависимости между нагрузкой и деформацией. Предел прочности на разрыв (Н/мм) - это мера прочности на всем протяжении протеза. Оба этих свойства зависят от количества слоев СКК в протезе. При использовании в качестве нагружаемой опоры или поддерживающего устройства протез должен выдерживать неравномерность физической активности во время начальной стадии заживления и на всем протяжении реконструирования.

Прочность наслоения связывающих областей измеряется при помощи теста на отслаивание. Непосредственно после проведения хирургической имплантации важно, чтобы слои не отслаивались при физических нагрузках. При исследованиях на животных эксплантируемые материалы не проявляли какие-либо признаки отслоения. Перед имплантацией прочность адгезии между противоположными слоями составляет около 8,1+2,1 Н/мм для многослойного конструкта, сшитого в 1 мМ растворе ЭДК.

Усадочная температура (°С) представляет собой показатель степени сшивки матрикса. Чем выше усадочная температура, тем более сшитым является матрикс в материале. Несшитый, гамма-облученный СКК имеет усадочную температуру около 60,5±1,0°С. В предпочтительном варианте осуществления протезы сшитые ЭДК будут предпочтительно иметь температуру примерно в диапазоне от 64,0±0,2°С до 72,5±1,1°С в случае устройств, которые сшивались в растворе ЭДК в 50% ацетоне с концентрацией ЭДК примерно от 1 мМ до 100 мМ соответственно.

Механические свойства включают механическую целостность, под которой понимается, что протез должен быть устойчивым к сползанию во время биореконструирования, и, кроме того, гибким и пригодным для наложения швов. Термин "гибкий" означает хорошие эксплуатационные свойства в смысле легкости использования в клинических условиях.

Термин "пригодный для наложения швов" означает, что механические свойства слоя включают способность удерживать шов, давая возможность иглам и шовным материалам проходить сквозь материал протеза во время пришивания протеза к разрезам нативной ткани. Во время зашивания такие протезы не должны разрываться в результате растягивающих усилий, которые оказывает на них шов, а также они не должны разрываться при замыкании шва в виде узла. Пригодность протезов к наложению швов, т.е. способность протезов оказывать сопротивление разрыву при зашивании, относится к собственной механической прочности протезного материала, толщине имплантата, растягивающему усилию, прилагаемому ко шву, и скорости, с которой замыкают узел. Способность удерживать шов для плоского, 6-слойного протеза с высокой степенью сшивки, химически сшитого в 100 мМ ЭДК и 50% растворе ацетона, составляет около 6,7±1,6 Н. Способность удерживать шов для 2-слойного протеза, сшитого в 1 мМ растворе ЭДК в воде, составляет около 3,7 Н ± 0,5 Н. Предпочтительный нижний предел прочности на удержание шва составляет около 2 Н для сшитого, плоского, 2-слойного протеза, поскольку хирургическое усилие при наложении шва составляет около 1,8 Н.

Используемый здесь термин "несползающий" означает, что биомеханические свойства протеза придают ему износостойкость так, что протез не растягивается, вспучивается или расширяется выше обычных пределов после имплантации. Как описывается ниже, суммарное удлинение имплантируемого протеза данного изобретения находится в приемлемых пределах. Протез данного изобретения приобретает устойчивость к растяжению, как функции пост-имплантационного клеточного биореконструирования посредством замены структурного коллагена клетками-хозяевами, с более высокой скоростью, чем происходит потеря механической прочности имплантируемых материалов из-за биодеградации и биореконструирования.

Переработанный тканевый материал настоящего изобретения является "полупроницаемым", даже если его наслаивают и связывают. Полупроницаемость дает возможность для врастания вовнутрь клеток-хозяев для биореконстрирования и для осаждения агентов и компонентов, которые могли бы повлиять на биореконструирование, клеточное врастание, предотвращение или содействие адгезии, или на кровоток. "Непористое" качество протеза предотвращает протекание жидкостей, предназначаемых для удержания имплантируемого протеза. Наоборот, поры, перфорации, фенестрации, прорези и отверстия можно сформировать в протезе, если для его применения требуются пористое и перфорированное свойство.

Механическая целостность протеза данного изобретения также зависит от его способности драпироваться или складываться, а также от возможности его вырезания или зачистки с получением чистой грани без отслаивания или истирания граней конструкта.

Лист переработанного кишечного коллагена, полученный из подслизистой оболочки тонкой кишки, обычно имеет толщину в диапазоне примерно от 0,05 до 0,07 мм. Придав листовую геометрию очищенному тканевому матриксу, ее можно наслаивать, а затем химически связывать листы вместе для получения многослойного конструкта с большей толщиной. Переработанные тканевые матриксные слои многослойного протезного устройства изобретения могут происходить из того же самого коллагенового материала, например, два или более двух слоев СКК, или из различных коллагеновых материалов, например, один или несколько слоев СКК и один или несколько слоев широкой фасции.

Конструкты с противомикробными свойствами можно использовать для обработки ран, включая: поверхностные и глубокие раны, пролежни, венозные язвы, диабетические язвы, хронические сосудистые язвы, туннельные раны, раны с нависающими краями, хирургические раны (например, раны донорского участка при аутотрансплантации, раны пост-Моховской хирургии, раны пост-лазерной хирургии, расхождение краев раны), травматические раны (такие как ссадины, разрывы, ожоги второй степени и кожные разрывы) и дренажные раны. Повязка на рану представляет собой однослойный лист или многослойный конструкт из механически и химически очищенного кишечного коллагена свиньи, который содержит, по меньшей мере, один противомикробный агент, каждый лист переработанного тканевого матрикса имеет толщину в диапазоне примерно от 0,05 до 0,07 мм, содержат фенестрации, которые устанавливают сквозную связь между обоими сторонами листа. Продукт содержит первично свиной коллаген типа I (примерно в количестве >95%) в его нативной форме, липиды в количестве примерно менее 0,7%, гликозоаминогликаны на необнаруживаемом уровне (примерно <0,6%) и ДНК (примерно в концентрации <0,1 нг/мкл). Свиной кишечный коллаген в основном свободен от клеток и клеточных остатков. Изобретенная повязка на рану может химически сшиваться или может не сшиваться, но в случае сшивки, ее сшивают до такой степени, чтобы можно было регулировать и контролировать биодеградацию, биореконструирование или замену повязки клетками больного. Физические модификации можно провести на повязке для раны для того, чтобы обеспечить возможность протекания жидкостей. Повязка на рану предоставляет влажную лечебную среду, преграду для контролирования и минимизации бактериального заражения, и облегчает боль пациента за счет покрытия чувствительных нервных окончаний. Противомикробный агент обеспечивает эффективную защиту против микробного заражения в самом участке раны и вокруг него.

Повязку на рану наносят больному, у которого имеется рана, нуждающаяся в лечении. Перед нанесением площадь раны можно продезинфецировать и очистить от омертвевших тканей, используя стандартные методики нанесения повязки на рану. Предпочтительно, санация раневой полости проводится там, где края раны содержат жизнеспособную ткань. Для нанесения повязки изобретения, ее вырезают по контуру площади раны. Если рана больше кусочка повязки на рану, то можно использовать несколько кусочков, частично накладывая их друг на друга для обеспечения покрытия всей раны. Если повязка находится в сухом состоянии, то ее можно повторно гидратировать, используя стерильный солевой раствор или другой изотонический раствор. Край повязки должен находиться в контакте с неповрежденной тканью, после чего ее разглаживают по площади для того, чтобы гарантировать, что повязка находится в контакте с нижележащим слоем раны. Если под листом собирается избыточное количество экссудата, то вырезать небольшие прорези в листе для того, чтобы дать возможность экссудату вытечь.

Изобретенную противомикробную повязку на рану можно использовать в качестве поверхности раздела между раной и традиционной, или вторичной, повязкой на рану. Альтернативно, противомикробную повязку на рану изобретения можно использовать в качестве наружного слоя для замены кожи, например, в качестве аутотрансплантата, аллотрансплантата или конструкт искусственно выращенной кожи. При использовании в качестве наружного слоя повязка на рану снабжает влагой окружение раны так, что клетки из любой кожной замены могут заселять раненную поверхность для более быстрого закрытия раны.

После приложения предпочтительно наносят нелипкую, вторичную повязку для того, чтобы поддерживать влажную среду раны. Оптимальная вторичная повязка определяется местонахождением раны, ее размером и глубиной, а также предпочтением пользователя. При необходимости вторичную повязку можно заменить для поддержания площади раны во влажном, чистом состоянии. Частота смены повязок будет варьироваться в зависимости от типа, размера и глубины обрабатываемой раны, объема экссудатов и типа используемой повязки. При протекании заживления может понадобиться замена повязки на рану, в этом случае можно проводить дополнительные наложения повязок на рану до тех пор, пока не будет достигнуто полное заживление.

Другие варианты осуществления изобретения относятся к многослойным конструктам, наделенным противомикробными свойствами. Протезное устройство данного изобретения содержит два или более двух перекрывающихся коллагеновых слоя, которые связаны вместе. Используемый здесь термин "связанные коллагеновые слои" означает, что конструкт состоит из двух или более двух слоев одинакового или различного коллагенового материала, который обрабатывается так, чтобы слои накладывались друг на друга и удерживались вместе в достаточной мере посредством самонаслоения и образования поперечных химических связей. Более конкретно, протезное устройство - это хирургическая сетка или имплантат, предназначенная для использования при имплантации с целью усиления мягкой ткани, включая (но этим перечень не ограничивается): дефекты брюшной и грудной стенки, усиления мышечного клапана, ректальный и вагинальный пролапс, восстановление тазового дна, грыжи, мостиковые разрывы при фасциальных дефектах, расхождение швов и восстановительные процедуры. Одна протезная сетка и имплантат изобретения содержит пятислойный лист свиного СКК и противомикробный агент, толщина ее составляет примерно от 0,20 мм до 0,25 мм. Продукт состоит первично из свиного коллагена (примерно в количестве >95%) в его нативной форме, из липидов в количестве примерно менее 0,7%, содержит гликозоаминогликаны на необнаруживаемом уровне (примерно <0,6%) и ДНК (примерно в концентрации <0,1 нг/мкл). Свиной кишечный коллаген в основном свободен от клеток и клеточных остатков. Предусмотрен протез в стерильной форме с размерами, варьирующимися от 5×5 см до 12×36 см в двухслойной легкооткрывающейся упаковке. Температура денатурации протеза составляет около 58±5°С; прочность на разрыв превышает 15 Н; прочность удержания шва выше 2 Н при использовании 2-0 плетенного шелкового шва; а уровень эндотоксина составляет <0,06 единиц/мл (на см² продукта). В частности, протез из плоского листового конструкта состоит из пяти слоев СКК и противомикробного агента, его связывают и сшивают 1 мМ раствором гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (ЭДК) в воде. Для формирования этого конструкта первый лист СКК распределяют слизистой стороной вниз на гладкой поликарбонатной пластине; обеспечив отсутствие складок, воздушных пузырей и видимых лимфатических наростов. Разглаживание СКК проводят для оптимизации размеров. Три листа СКК наслаивают (слизистой стороной вниз) на верхнюю часть первого листа, обеспечив отсутствие складок, воздушных пузырей и видимых лимфатических наростов при наслаивании каждого листа. Пятый лист наслаивают так, чтобы слизистая сторона являлась лицевой, обеспечив отсутствие складок и воздушных пузырей. Видимые лимфатические наросты удаляют перед наслаиванием этого пятого листа. Слои совместно высушивают на протяжении 24±8 часов. Теперь слои высушивают вместе, а затем сшивают в 1 мМ растворе ЭДК в воде в течение 18±2 часов, сшивающий раствор берется в количестве 500 мл на 30 см пятислойного листа. Каждый продукт промывают стерильной водой, а затем обрезают до требуемого конечного размера, пока он находится в гидратированном состоянии.

В альтернативном варианте осуществления протезное устройство представляет собой хирургический ремень, по меньшей мере, с одним противомикробным агентом, который предназначен для имплантации с целью усиления и поддержки мягких тканей там, где существует необходимость в этом, включая (но перечень этим не ограничивается) следующие процедуры: лоно-уретральная опора, восстановление пролапса (уретрального, вагинального, ректального и относящего к толстой кишке), реконструкция тазового дна, мочепузырная опора, поддерживание в крестцово-влагалищной области, восстановительные процедуры и восстановление ткани. В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления протезное устройство представляет собой хирургический ремень, состоящий из трех-пяти слоев связанного, поперечно сшитого СКК, обработанного, по меньшей мере, одним противомикробным агентом. Для изготовления пятислойного устройства СКК разравнивают слизистой стороной вниз на гладкой поликарбонатной пластине, обеспечив отсутствие складок, воздушных пузырей и видимых лимфатических наростов. Разравнивание СКК проводят для оптимизации размеров. Второй, третий и четвертый листы СКК наслаивают (слизистой стороной вниз) на верхнюю часть первого листа, обеспечив отсутствие складок, воздушных пузырей и видимых лимфатических наростов при наслаивании каждого листа. Пятый лист наслаивают так, чтобы слизистая сторона являлась лицевой, обеспечив отсутствие складок и воздушных пузырей. Видимые лимфатические наросты следует удалить перед наслаиванием этого пятого листа (Трехслойный конструкт изготавливают, разравнивая первый лист СКК слизистой стороной вниз на гладкой поликарбонатной пластине; обеспечив отсутствие складок, воздушных пузырей и видимых лимфатических наростов; второй лист СКК наслаивают (слизистой стороной вниз) на верхнюю часть первого листа, а третий лист наслаивают на верхнюю часть второго листа так, чтобы слизистая сторона являлась лицевой). Слои высушивают на протяжении 24±8 часов и после высушивания сшивают в 90% растворе ацетона с концентрацией ЭДК 10 мМ в течение 18±2 часов, сшивающий раствор берется в количестве 500 мл на 30 см пятислойного листа. Каждый связанный, поперечно сшитый конструкт промывают стерильной водой, а затем вырезают до требуемого конечного размера, пока он находится в гидратированном состоянии. Посредством предоставления лонно-уретральной опоры ремень можно использовать для лечения недержания мочи, являющейся результатом уретральной гипермобильности или недостатка собственного сфинктера. Хирургический ремень состоит из пятислойного ламинированного листа свиного кишечного коллагена, толщина его составляет примерно от 0,20 мм до 0,25 мм, и из противомикробного агента. Устройство сшивают гидрохлоридом 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (ЭДК). Устройство состоит главным образом из свиного коллагена типа I (примерно в количестве >95%) в его нативной форме, из липидов в количестве примерно менее 0,7%, содержит гликозоаминогликаны на необнаруживаемом уровне (примерно <0,6%) и ДНК (примерно в концентрации <0,1 нг/мкл). Свиной кишечный коллаген в основном свободен от клеток и клеточных остатков. Температура денатурации протеза примерно выше 63°С, прочность на разрыв превышает 15 Н, прочность удержания шва выше 2 Н при использовании 2-0 плетенного шелкового шва, а конечный уровень эндотоксина составляет ≤0,06 единиц/мл (на см² продукта). В то время как биореконструируемые аспекты ремня можно варьировать и использовать для достижения цели, перевязочный протез изобретения не может быть заменой для части тела, но представляет собой опорное устройство для органа, имплантируемого в качестве вспомогательной структуры. Предпочитают, чтобы СКК слои ремня сшивались более высокосшитыми для снижения биореконструируемости ремня (перевязи). Перевязочный протез является биосовместимым, гибким, его коллагеновая структура при имплантации поддерживает необходимую структурную опору и прочность при функционировании в качестве опорного устройства для органа.

В еще одном альтернативном варианте осуществления протезное устройство представляет собой лоскут для восстановления мозга, который предназначен для имплантации с целью восстановления твердой мозговой оболочки, плотной мембраны, которая предохраняет центральную нервную систему. Устройство изобретения для восстановления мозга состоит из четырех слоев связанного, поперечно сшитого СКК, и содержит противомикробный агент. Для изготовления четырехслойного устройства СКК разравнивают слизистой стороной вниз на гладкой поликарбонатной пластине, обеспечив отсутствие складок, воздушных пузырей и видимых лимфатических наростов. Разравнивание СКК проводят для оптимизации размеров. Второй и третий лист СКК наслаивают (слизистой стороной) на верхнюю часть первого, обеспечив отсутствие складок, воздушных пузырей и видимых лимфатических наростов при наслаивании каждого листа. Четвертый лист наслаивают так, чтобы слизистая сторона являлась лицевой, обеспечив отсутствие складок и воздушных пузырей. Видимые лимфатические наросты следует удалить перед наслаиванием данного четвертого листа. Слои высушивают на протяжении 24±8 часов, и после того как они становятся сухими, их поперечно сшивают в буферном растворе 2-[N-морфолин]этансульфоновой кислоты (МЭСК) с концентрацией ЭДК примерно от 0,1 мМ до 1 мМ в течение 18±2 часов, сшивающий раствор берется в количестве 500 мл на 30 см четырехслойного листа. Каждый связанный, поперечно сшитый конструкт промывают стерильной водой, а затем вырезают до требуемого конечного размера, пока он находится в гидратированном состоянии. Устройство для восстановления твердой мозговой оболочки состоит из четырехслойного ламинированного листа свиного кишечного коллагена, толщина его составляет примерно от 0.14 мм до 0,21 мм, и из противомикробного агента. Устройство сшивают гидрохлоридом 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (ЭДК). Устройство состоит главным образом из свиного коллагена типа I (примерно в количестве >95%) в его нативной форме, из липидов в количестве примерно менее 0,7%, содержит гликозоаминогликаны на необнаруживаемом уровне (примерно <0,6%) и ДНК (примерно в концентрации <0,1 нг/мкл). Свиной кишечный коллаген в основном свободен от клеток и клеточных остатков. Температура денатурации протеза примерно выше 63°С; его прочность на разрыв превышает 15 Н, его прочность удержания шва выше 2 Н при использовании 2-0 плетенного шелкового шва, а конечный уровень эндотоксина составляет ≤0,06 единиц/мл (на см² продукта). Устройство для восстановления твердой мозговой оболочки биосовместимо и биореконструируемо так, что при имплантации в организм больного при необходимости восстановления твердой мозговой оболочки, оно функционирует в качестве замены твердой мозговой оболочки на протяжении времени, в течение которого происходит биореконструирование клетками-хозяевами, которые как разрушают, так и замещают устройство так, что новая ткань организма-хозяина со временем замещает устройство.

Например, многослойный конструкт СКК используют для восстановления структур стенок тела. Его можно также использовать, например, в качестве перикардиального лоскута, миокардиального лоскута, сосудистого лоскута, лоскута для стенки мочевого пузыря, или устройства для восстановления грыжи (в качестве лоскута, свободного от напряжений, или пробки) или использовать в качестве ремня для поддержки гипермобильных и выпадающих органов (при выпадении прямой кишки, пролапсе свода, грыже мочевого пузыря). Многослойный конструкт пригоден для лечения соединительной ткани, в мышцах, отвечающих за вращение плечами или восстановлении капсулы. Многослойный конструкт пригоден для восстановления твердой мозговой оболочки при черепных дефектах после процедур краниотомии или для восстановления мозговых каналов вдоль спинного мозга. Материал пригоден для кольцеобразного восстановления волокнистого кольца в том случае, когда оно выходит за пределы полости (т.е. при грыже межпозвонкового диска), а также материал используют в качестве пробки для углубления, образованного соскользнувшим диском или в качестве покрытия для углубления, или в обоих случаях. Материал пригоден в процедурах пластической хирургии, таких как мастопексия, абдоминальная хирургия и в пластической хирургии лица (надбровные дуги и щеки). Как однослойные, так и многослойные СКК материалы можно использовать в качестве покрытия или повязки для раны для содействия заживлению раны. Более того, его можно также имплантировать в плоской, свернутой или складчатой форме для увеличения объема и наращивания ткани. Несколько слоев СКК можно включить в конструкт в случае, когда имеются показания к увеличению объема и прочности. Перед имплантацией слои можно вдобавок обработать или покрыть коллагеном или другими внеклеточными матриксными компонентами, гиалуроновой кислотой, гепарином, факторами роста, пептидами или культивируемыми клетками.

Следующие примеры предоставлены для лучшего объяснения практической части настоящего изобретения, и их не следует интерпретировать каким-либо образом как ограничивающие объем настоящего изобретения. Стоит оценить, что схема устройства в плане его композиции, формы и толщины выбирается в зависимости от конечного указания по применению конструкта. Те, кто сведущ в данной области медицины, распознают различные модификации, которые можно провести над способами, описанными в этом документе, не уклоняясь от сути и объема настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Химическая очистка механически очищенной тонкой кишки свиньи

Тонкую кишку свиньи изымают и механически очищают, используя подогреваемую установку для очистки Bitterling (Nottingham, UK), которая принудительно отделяет жир, мышцы и слизистые слои от подслизистой оболочки, используя комбинацию механического воздействия и водной промывки. Механическое воздействие можно описать как набор валиков, которые сжимают и выдавливают последовательные слои из подслизистой оболочки при пропускании цельного кишечника между ними. Подслизистая оболочка тонкой кишки сравнительно тверже и прочнее по сравнению с окружающей тканью, поэтому валики выдавливают более мягкие компоненты из подслизистой. Результат машинной очистки таков, что исключительно остается подслизистый слой кишечника.

Оставшуюся часть процедуры химической очистки согласно международной РСТ заявке под номером WO 98/49969 под авторством Abraham, et al., раскрытие которой включено в этот документ по ссылке, проводят в асептических условиях и при комнатной температуре. Все химические растворы используют при комнатной температуре. Кишечник затем вырезают в продольном направлении вниз от полости, а затем разрезают на 15 см отрезки. Материал взвешивают и помещают в контейнеры при объемном соотношении раствора к кишечному материалу 100:1.

В каждый контейнер, содержащий кишечник, добавляют приблизительно 1 л раствора, простерилизованного через фильтр с размером 0,22 мкм (микрон) и содержащего тетранатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в концентрации 100 мМ, гидроксид натрия (NaOH) - 10 мМ. Контейнеры затем размещают на вибрирующем столе, выдерживая на протяжении 18 часов при частоте около 200 оборотов в минуту. После встряхивания раствор ЭДТА/NaOH удаляют из каждой колбы.

В каждый контейнер затем добавляют приблизительно 1 л раствора, простерилизованного через фильтр с размером 0,22 мкм и содержащего соляную кислоту (HCl) в концентрации 1 М, хлорид натрия (NaCl) - 1 М. Контейнеры затем размещают на вибрирующем столе, выдерживая на протяжении 6-8 часов при частоте около 200 оборотов в минуту. После встряхивания раствор HCl/NaCl удаляют из каждого контейнера. В каждый контейнер затем добавляют приблизительно 1 л раствора, простерилизованного через фильтр с размером 0.22 мкм и содержащего хлорид натрия (NaCl) в концентрации 1 М, фосфатно-солевой буфер (PBS) - 10 мМ. Контейнеры затем размещают на вибрирующем столе, выдерживая на протяжении 18 часов при частоте около 200 оборотов в минуту. После встряхивания раствор NaCl/PBS удаляют из каждого контейнера.

В каждый контейнер затем добавляют приблизительно 1 л 10 мМ раствора PBS, простерилизованного через фильтр с размером 0,22 мкм. Контейнеры затем размещают на вибрирующем столе, выдерживая на протяжении 2 часов при частоте около 200 оборотов в минуту. После встряхивания фосфатно-солевой буфер удаляют из каждого контейнера. В заключение, к каждому контейнеру добавляют приблизительно 1 л воды, простерилизованной через фильтр с размером 0,22 мкм. Контейнеры затем размещают на вибрирующем столе, выдерживая на протяжении 1 часа при частоте около 200 оборотов в минуту. После встряхивания воду удаляют из каждого контейнера.

Переработанные СКК образцы отрезают и фиксируют для гистологического анализа. Проводят окрашивание гемотоксилин-эозином (Н&Е) и трихромное окрашивание Массона как на поперечном сечении, так и на продольном сечении образцов как контрольной, так и обработанной ткани. Образцы переработанной СКК ткани выглядят свободными от клеток и продуктов распада клеток, тогда как необработанные контрольные образцы выглядят обычно, и, как и следовало ожидать, имеют очень выраженное клеточное строение.

Этот однослойный материал СКК можно использовать в качестве одиночного слоя или использовать для составления связанных многослойных конструктов, трубчатых конструктов или конструктов со сложной трубчатой структурой и с плоскими сторонами.

Пример 2. Способ изготовления многослойного СКК конструкта СКК, обработанный согласно способу Примера 1, используют для составления многослойного конструкта, содержащего 2 слоя СКК. Стерильный лист из пористого поликарбоната закладывают в стерильную область ламинара. СКК промокают стерильной тканью TEXWIPES (LYM-TECH Scientific, Chicopee, MA) для поглощения избыточной воды из материала. СКК материал зачищают от его лимфатических наростов с очищенной стороны, а затем нарезают на кусочки длиной около 6 дюймов (приблизительно 15,2 см). Первый лист зачищенного СКК кладут на поликарбонатную пластину, слизистой стороной вниз, вручную удаляют любые воздушные пузыри, изгибы и складки. Второй лист зачищенного СКК кладут на верхнюю часть лицевой стороной, или очищенной стороной, первого листа, при этом очищенная сторона второго листа находится в контакте с очищенной стороной первого листа; снова удаляют любые воздушные пузыри, изгибы и складки. Поликарбонатную пластину с СКК слоями поворачивают, обращая СКК слои против встречной воздушной струи ламинара. Слоям дают возможность высушиваться в течение примерно 18±2 часов в кабине при комнатной температуре, составляющей приблизительно 20≤С. Высушенные слои СКК затем совместно снимают с поликарбонатной пластины без их разделения или отслаивания, и переносят при комнатной температуре в водяную баню, выдерживая в ней на протяжении около для гидратации слоев. Химически сшивающий 100 мМ раствор ЭДК в 50% ацетоне получают непосредственно перед сшиванием, поскольку ЭДК со временем теряет свою активность. Гидратированные слои затем переносят в плоскую кювету, а сшивающий агент осторожно декантируют в кювету, удостоверившись в том, что слои покрыты и свободно плавают и в том, что под конструктами или в пределах них отсутствуют воздушные пузыри. Кювету покрывают и оставляют в вытяжном шкафу на протяжении примерно 18±2. Сшивающий раствор декантируют и отбрасывают. Конструкты промывают в кювете три раза стерильной водой на протяжении пяти минут для каждой промывки. Используя скальпель и линейку конструкты зачищают до желаемого размера.

Конструкты обеззараживают стерильной обработкой 0,1% раствором надуксусной кислоты (НУК), нейтрализуя ее 10-нормальным раствором гидроксида натрия NaOH согласно патенту США №5460962, раскрытие которого включено в этот документ. Конструкты обеззараживают в 1 л контейнерах Nalge на вибрационной платформе в течение 18±2 часов. Конструкты затем промывают тремя объемами стерильной воды на протяжении 10 минут для каждой промывки, и наблюдают за активностью НУК посредством теста Миннкаре на образце ткани в форме ленты для того, чтобы удостовериться в отсутствии этой активности у конструктов.

Конструкты затем упаковывают в пластиковые пакеты, используя вакуумный уплотнитель, который, в свою очередь, помещают в герметичные пакеты для гамма-облучения в диапазоне от 25,0 до 35,0 кГр.

Пример 3. Анализ зоны ингибирования

Целью этого Примера является иллюстрация того, как определить эффективное количество противомикробного вещества для однослойных конструктов, полученных из переработанного тканевого материала - производного подслизистой оболочки свиной кишки (СКК), полученного по способу Примера 1, которое создает микробный барьер, и убивает микробы. Несколько противомикробных веществ наносят на СКК либо посредством растворения, либо посредством суспендирования в растворе, как изложено ниже:

1. 0,5% раствор нитрата серебра;

2. 1% раствор нитрата серебра;

3. 1-2% раствор нанокристаллического серебра в изопропиловом спирте (IPA);

4. 1-2% раствор нанокристаллического серебра в однократном PBS;

5. 1-2% раствор поли(гексаметиленбигуанида) (РНМВ) в фосфатно-солевом буфере;

6. 1-2% раствор поли(гексаметиленбигуанида) (РНМВ) в очищенной воде.

Химически очищенный СКК разрезают на кусочки размером 4 см × 6 см, и каждый кусок помещают как в гидратированном, так и в дегидратированном состоянии, приблизительно в 100 мл каждого раствора и оставляют на ночь. Переработанный СКК затем вынимают из растворов и высушивают. В качестве контрольного условия используют необработанные образцы СКК. Вырезают круглые куски из каждого кусочка образца. На агаровые пластины наносят полосу бактерий. Образцы размещают на пластинах и выдерживают их на протяжении 24 часов с целью наблюдения.

Нанокристаллическое серебро (НКС) полностью диспрегируют в растворах, приготовленных в IPA, и оставляют в растворе, тогда как НКС в однократном PBS не остается в растворе и для него требуется встряхивание перед добавлением к СКК. IPA, упаренный на протяжении ночи, выглядит гладким и однородным на обоих, гидратированных и дегидратированных, кусочках СКК, дегидратированный кусок сохраняет более четкую форму и с ним легче обращаться. Оба кусочка возвращают цвет газовой сажи. Сторона СКК, которая обращена вниз на лоток, обладает различием сторон, несмотря на отсутсвие признаков влияния на покрытие СКК или на эффективность материала при создании большой зоны ингибирования (ЗИ - от англ. зона ингибирования). НКС продукты создают самую лучшую ЗИ и также создают ЗИ, которая не позволят бактериям расти в 24-часовой ЗИ после 4 дней, как это происходит с несколькими другими образцами. Хотя образцы нитрата серебра проявляют ЗИ, которая меньше по сравнению с результатом для НКС, но большую по сравнению с другими образцами, сообщение о токсичности нитрата серебра не позволяет использовать его в качестве идеальной добавки к СКК. Известные противомикробные свойства нитрата серебра делают его пригодным для сравнения с НКС, и, как установлено, НКС превосходит эффективность нитрата серебра.

Оба раствора РНМВ выглядят равными, в то время как СКК после пропитывания не выглядит таковым. PBS растворы оставляют СКК на том уровне, что наблюдался для неравномерного остатка соли, в то время как WFI растворы оставляют СКК без видимых изменений. Оба они дают аналогичные ЗИ. Они оказываются меньшими и не создают их по тому же способу, как в случае с ЗИ НКС.

Обнаружено, что как нанокристаллическое серебро, так и РНМВ являются эффективными противомикробными агентами, которые можно применять на СКК конструктах, что подтверждается их бактерицидным эффектом, обнаруженным в данном методе анализа.

Пример 4. Обработка 2-слойных коллагеновых конструктов, содержащих противомикробное нанокристаллическое серебро или РНМВ

Получают ламинированные 2-слойные СКК конструкты (как ламинированные, так и поперечно сшитые), а затем обрабатывают противомикробным агентом для получения двухслойных конструктов с противомикробными свойствами.

Двенадцать 2-слойных СКК конструктов, каждый приблизительно размером 9 см × 9 см, получают согласно Примеру 2. При их получении эти СКК конструкты поперечно сшивают, используя буфер 10 мМ ЭДК / 0,1 М МЭСК [2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты] (Pierce, Rockford, IL), на протяжении 16-20 часов и промывают три раза в стерильной отфильтрованной воде на протяжении 30 минут. Полученные конструкты затем обрабатывают противомикробным агентом.

Противомикробные агенты получают либо в виде растворов, либо в виде дисперсий. Пять дисперсий нанокристаллического серебра получают посредством смешивания 10, 1,0, 0,1, 0,01, 0,001 грамм нанокристаллического серебра (Nanotechnologies (Ag-20) или эквивалент, Austin, ТХ) в 1 л диспергирующего агента, коим является изопропиловый спирт (стерильная отфильтрованная вода также является приемлемым диспергирующим агентом). 0,2%, 0,1%, 0,02%, 0,002% раствор РНМВ получают посредством смешивания Cosmocil CQ (20% раствор РНМВ, ArchChemicals, Inc., Norwalk, СТ) с RODI/WFI.

Для покрытия ламинированных и поперечно сшитых конструктов противомикробным агентом гидратированные конструкты помещают в лотки размером 9,5 см × 9,5 см. 50 мл каждого агента декантируют в лотки, и лотки размещают на вибрирующем столе. Временные интервалы нанесения покрытия составляют 10 секунд, 1 час, 3 часа и всю ночь (около 18 часов). По завершению установленного времени нанесения покрытия образцам дают возможность высушиться на поликарбонатных пластинах под стерильной воздушной струей биологически безопасной кабины ламинара до значения относительной влажности 10-20%.

Полученные в результате конструкты представляют собой 2-слойные СКК конструкты, которые уже ламинированы, сшиты и обработаны противомикробным агентом с целью придания конструктам противомикробных свойств.

Пример 5. Обработка однослойного коллагенового матрикса противомикробным нанокристаллическим серебром или РНМВ, которая используется для изготовления 2-слойных противомикробных конструктов

Получают однослойные СКК конструкты, поперечно сшивают их, обрабатывают противомикробным агентом, а затем наслаивают для составления двухслойных конструктов с целью получения двухслойных обработанных тканево-матриксных конструктов с противомикробными свойствами. Большее количество противомикробного агента внедряют между слоями СКК обработанного тканевого матрикса посредством ламинирования конструктов после обработки их противомикробным агентом.

СКК получают согласно Примеру 1, распределяя на поликарбонатных пластинах и удаляя лимфатические наросты. Вырезают кусочки приблизительно размером 10 см × 9 см. Каждый кусок СКК затем поперечно сшивают в буфере 10 мМ ЭДК / 0,1 М МЭСК [2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты] (Pierce, Rockford, IL), беря его в расчете - 2 литра на 26 кусочков, и встряхивают на вибрационном столе, устанавливая до 4 образцов, в течение 16-20 часов, а затем промывают три раза, как минимум, 2 л стерильной отфильтрованной воды на протяжении, как минимум, 20 минут для каждой промывки.

Противомикробные агенты получают либо в виде растворов, либо в виде дисперсий. Три дисперсии нанокристаллического серебра получают посредством смешивания 1,0, 0,1, 0,01 грамм композиции нанокристаллического серебра, (Nanotechnologies (Ag-20) или эквивалент, Austin, ТХ) в 1 л диспергирующего агента, такого как изопропиловый спирт (стерильная отфильтрованная вода также является приемлемым диспергирующим агентом). 0,2%, 0,1%, 0,02% растворы РНМВ получают посредством смешивания Cosmocil CQ (20% раствор РНМВ, ArchChemicals, Inc. Norwalk, СТ) с RODI/WFI.

Для покрытия СКК противомикробным агентом кусочки помещают в квадратные 125 мл стерильные контейнеры (Nalgene), в расчете - 4 кусочка на контейнер. 100 мл раствора или дисперсии, содержащей противомикробный агент, декантируют в каждый контейнер с целью погружения конструктов. СКК оставляют погруженным в течение 3-6 часов, в это время контейнеры встряхивают на вращающейся вибрационной платформе.

Противомикробно-обработанный СКК затем наслаивают для составления двухслойных конструктов, помещая один обработанный кусок СКК ровно на поликарбонатную пластину. Второй обработанный кусок СКК затем помещают непосредственно на верхнюю часть и распределяют по первому слою так, чтобы между слоями отсутствовали воздушные пузыри. Поликарбонатные пластины с конструктами затем помещают под стерильную воздушную струю биологически безопасной кабины ламинарного потока для высушивания их до 10-20% от относительной влажности, как минимум, на протяжении 12 часов.

Полученные в результате конструкты представляют собой 2-слойные СКК конструкты, которые уже сшиты и обработаны противомикробным агентом с целью придания конструктам противомикробных свойств, а затем наслоены для того, чтобы внедрить противомикробный агент не только на внешние поверхности конструктов, но также и между слоями конструктов.

Пример 6. Обработка 2-слойных коллагеновых конструктов, содержащих противомикробное нанокристаллическое серебро

Получают ламинированные 2-слойные СКК конструкты (как ламинированные, так и поперечно сшитые), а затем обрабатывают противомикробным средством для получения двухслойных конструктов с противомикробными свойствами.

Получают двенадцать 2-слойных СКК конструктов согласно Примеру 2, размеры каждого приблизительно составляют 35-40 см × 9 см. Во время их получения эти СКК конструкты поперечно сшивают, используя буферный раствор 10 мМ ЭДК/0,1 М МЭСК [2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты] (Pierce, Rockford, IL) в воде, на протяжении 16-20 часов и промывают три раза в стерильной отфильтрованной воде в течение 30 минут. Полученные конструкты затем обрабатывают противомикробным агентом.

Противомикробные агенты получают в виде дисперсий. Три дисперсии нанокристаллического серебра получают посредством смешивания 10,0, 5,0, 1,0 грамм нанокристаллического серебра (Nanotechnologies (Ag-20) или эквивалент, Austin, ТХ) в 1 л изопропилового спирта, выступающего в качестве диспергирующего агента для нанокристаллического серебра (стерильная отфильтрованная вода также является приемлемым диспергирующим агентом).

Для покрытия конструктов противомикробным агентом конструкты помещают в 1-литровые контейнеры (Nalgene) в соотношении - 4 конструкта на контейнер. Декантируют в каждый контейнер 200 мл раствора или дисперсии, содержащей противомикробный агент, для погружения конструктов. Конструкты оставляют погруженными на протяжении 3-6 часов, при этом контейнеры встряхивают на качающейся вибрационной платформе. Конструкты, которые вводили в контакте дисперсиями нанокристаллического серебра, промывают один раз в 1 л стерильной отфильтрованной воды. Противомикробно-обработанные конструкты затем помещают ровно на поликарбонатные пластины, устанавливая их под стерильную воздушную струю биологически безопасной кабины ламинарного потока для высушивания до значения 10-20% от относительной влажности, как минимум, на протяжении 12 часов.

Полученные в результате конструкты представляют собой 2-слойные СКК конструкты, которые уже ламинированы, сшиты и обработаны противомикробным агентом с целью придания конструктам противомикробных свойств.

Пример 7. Обработка однослойного коллагенового матрикса противомикробным нанокристаллическим серебром для изготовления 2-слойных противомикробных конструктов

Получают сшитые однослойные СКК конструкты, сшивают, обрабатывают противомикробным агентом, а затем наслаивают для составления двухслойных конструктов с целью получения двухслойных конструктов с противомикробными свойствами. Посредством ламинирования конструктов вслед за обработкой противомикробным агентом можно внедрить большее количество противомикробного агента в конструкты за счет покрытия внешних поверхностей и за счет наличия агента между слоями конструкта.

СКК получают согласно Примеру 1. Затем СКК распределяют на поликарбонатных пластинах длиной 35-40 см и шириной 9 см, и удаляют лимфатические наросты. Каждый кусок СКК затем поперечно сшивают в буфере 10 мМ ЭДК/ 0,1 М МЭСК [2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты] (Pierce, Rockford, IL), беря его в расчете 3 литра на 30 кусочков, встряхивают на вибрационном столе, устанавливая до 4 образцов, в течение 16-20 часов, а затем промывают три раза в 3-5 л стерильной отфильтрованной воды на протяжении 30 минут для каждой промывки.

Противомикробные агенты получают в виде дисперсий. Четыре дисперсии нанокристаллического серебра получают посредством смешивания 10,0, 5,0, 1,0 грамм нанокристаллического серебра (Nanotechnologies (Ag-20) или эквивалент, Austin, ТХ) в 1 л диспергирующего агента, такого как изопропиловый спирт. Приготавливают также раствор 5,0 г нанокристаллического серебра в 1 л RODI.

Для покрытия СКК противомикробным агентом кусочки СКК помещают в 250 мл стерильные контейнеры (Nalgene), в расчете - 4 кусочка на контейнер. Декантируют в каждый контейнер 200 мл раствора или дисперсии, содержащей противомикробный агент, с целью погружения конструктов. СКК оставляют погруженным на протяжении 3-6 часов, в это время контейнеры встряхивают на вращающейся вибрационной платформе. СКК, которые были введены в контакт с дисперсиями нанокристаллического серебра, промывают один раз в 1 л стерильной отфильтрованной воды.

Каждый противомикробно-обработанный СКК затем наслаивают для составления двухслойных конструктов, помещая один обработанный кусок СКК ровно на поликарбонатную пластину. Второй обработанный кусок СКК затем помещают непосредственно на верхнюю часть и распределяют по первому слою так, чтобы между слоями отсутствовали воздушные пузыри. Поликарбонатные пластины вместе с конструктами затем устанавливают под стерильную воздушную струю биологически безопасной кабины ламинарного потока для высушивания до 10-20% от относительной влажности, как минимум, в течение 12 часов.

Полученные в результате конструкты представляют собой 2-слойные СКК конструкты, которые поперечно сшиты и обработаны противомикробным агентом с целью придания конструктам противомикробных свойств, а затем наслоены с целью введения большего количества противомикробного агента между слоями конструкта.

Пример 8. Покрытие после поперечного сшивания и перед ламинированием

Получают поперечно сшитые однослойные СКК конструкты, сшивают, а затем обрабатывают противомикробным агентом, после чего наслаивают для составления двухслойных конструктов с целью получения двухслойных конструктов с противомикробными свойствами. Посредством ламинирования конструктов после обработки их противомикробным агентом внедряют более высокое количество противомикробного агента между слоями СКК.

СКК получают согласно Примеру 1. Кусочки СКК затем распределяют на поликарбонатных пластинах, удаляя лимфатические наросты, после чего размеры их составляют около 35-40 см в длине и 9 см по ширине. Каждый кусок СКК затем поперечно сшивают с помощью 10 мМ раствора ЭДК в 0,1 М буфере МЭСК [2-(N-морфолин)этансульфоновой кислоты] (Pierce, Rockford, IL), беря его в расчете 3 литра на 30 кусочков, встряхивают на вибрационном столе, устанавливая до 4 образцов, в течение 16-20 часов, а затем промывают три раза в 3-5 л стерильной отфильтрованной воды на протяжении 30 минут для каждой промывки.

Противомикробные агенты получают либо в виде растворов, либо в виде дисперсий. Дисперсии нанокристаллического серебра получают посредством смешивания 5,0 грамм нанокристаллического серебра (Nanotechnologies (Ag-20) или эквивалент, Austin, ТХ) в 1 л диспергирующего агента, RODI. 0,1% раствор РНМВ получают посредством смешивания 5,0 мл Cosmocil CQ (20% раствор РНМВ) на 1000 мл RODI/WFI.

Для покрытия СКК с помощью РНМВ агента помещают 28-30 кусочков СКК в 5-литровую чистую колбу из стекла Pyrex. Добавляют 3000 мл 0.1% раствора РНМВ. СКК оставляют погруженным в течение 3-6 часов, в этом время контейнеры встряхивают на вращающейся вибрационной платформе.

Для покрытия СКК дисперсией нанокристаллического серебра добавляют 200 мл дисперсии в 250 мл стерильные контейнеры (Nalgene). Четыре кусочка СКК помещают в каждый контейнер и встряхивают в течение 3-6 часов. СКК, которые были введены в контакт с дисперсией нанокристаллического серебра, промывают один раз в 250 мл RODI в течение 15 минут и один раз в 500 мл RODI, как минимум, в течение 5 минут до ламинирования. СКК, которые были введены в контакт с раствором РНМВ не промывают.

Противомикробно-обработанный СКК затем наслаивают для составления двухслойных конструктов, помещая один обработанный кусок СКК ровно на поликарбонатную пластину. Второй обработанный кусок СКК затем помещают непосредственно на верхнюю часть и распределяют по первому слою, чтобы между слоями отсутствовали воздушные пузыри. Поликарбонатные пластины с конструктами затем помещают под стерильную воздушную струю биологически безопасной кабины ламинарного для высушивания до 10-20% от относительной влажности, как минимум, на протяжении 12 часов.

Полученные в результате конструкты представляют собой 2-слойные СКК конструкты, которые поперечно сшиты и обработаны противомикробным агентом с целью придания конструктам противомикробных свойств, а затем наслоены с целью внедрения более высокого количества противомикробного агента между слоями конструкта.

Пример 9. Оценка трех противомикробных повязок на пролиферацию метицилин устойчивого золотистого стафилококка (MRSA) в поверхностной раны

Оценивают антибактериальную активность трех противомикробных повязок на поверхностные раны, которые колонизируются метициллин-устойчивым стафилококком золотистым (MRSA - от англ. methicilline resistant staphylococcus aureus).

Используют одну свинью в качестве экспериментального исследуемого животного, поскольку кожа свиньи морфологически аналогична человеческой коже. Свинью взвешивают, ее масса составляет приблизительно 25-30 кг, содержат в домашних условиях в течение двух недель перед началом эксперимента. Эту свинью кормят по диете, соответствующей по калорийности основному обмену, ad libitum и содержат в одиночестве в благоприятных для животного условиях (удовлетворяя требованиям министерства сельского хозяйства США) при контролируемой температуре (19-21°С) и уровне света (12 ч/12 ч световой день). Свинью анестезируют Телазолом (5 мг/кг), Ксилазином (2 мг/кг), Атропином (0,05 мг/кг) I.M. и ингаляцией изофлураном в комбинации с кислородом. Волосы на спине свиньи состригают стандартными ножницами для животных. Кожу на обоих сторонах спины свиньи приготавливают, промываю ее неантибиотическим мылом (Neutrogena®) и стерильной водой. Животное пропитывают сухой стерильной марлей. Проделывают тридцать шесть (36) поверхностных ран (10×7×0,3 мм) на дорсальной коже при помощи специализированного электрокератотома. Затем раны заражают метициллин устойчивым золотистым стафилококком АТСС 33593.

Для приготовления бактериального заражения используют свежую культуру патогенного штамма, полученную непосредственно из американской коллекции типовых культур (АТСС), Rockville, Maryland. Инокулятом является Метициллин устойчивый, золотистый стафилококк АТСС 33593. Лиофилизированную бактериальную культуру восстанавливают по стандартному АТСС протоколу восстановления. Все суспензии инокулята готовят посредством соскабливания на протяжении ночи произрастания в культуральном планшете в 5 мл изотонического раствора до тех пор, пока мутность суспензии не будет эквивалента мутности стандарта MacFarland #8. Это приведет в результате к тому, что концентрация суспензии составит приблизительно 10⁸ колониеобразующих единиц/мл (CFU/мл). Суспензию с концентрацией 10⁸ последовательно разбавляют для приготовления суспензии инокулята с концентрацией приблизительно 10⁶ CFU/мл. Небольшое количество суспензии инокулята покрывают тонким слоем на культуральных средах для измерения точной концентрации жизнеспособных организмов. Суспензию инокулята используют непосредственно для заражения каждого раненного участка. 0,025 мл (25 мкл) аликвоту суспензии осаждают в стерильный стеклянный цилиндр (диаметром 22 мм) в центре каждой раны. Суспензию слегка соскребают в каждый тестируемый участок в течение десяти секунд, используя стерильный тефлоновый шпатель и оставляют сушиться в течение 3 минут. На протяжении 10 минут инокуляции все зараженные раны покрывают повязкой из полиуретановой пленки на 24 часа перед началом обработки для того, чтобы дать бактериям время для заселения ран.

Создают и заражают три дополнительные раны для получения базовой линии CFU/мл перед началом обработок. Инокулят: Log 4,24 CFU/мл; подсчеты базовой линии: Log 5,38 CFU/мл. Шесть ран определяют к различным группам обработки, как это видно по нижеуказанной экспериментальной схеме. Организм животного мониторируют ежедневно на предмет любых наблюдаемых указаний на боль или недомогание. Для того чтобы способствовать минимизации возможного недомогания используют болеутоляющее средство (Duragesic - фентанил трансдермальная система, которую элюируют со скоростью 25 мкг/ч) в начале полного эксперимента.

1) Повязка А представляет собой 2-слойный конструкт, обработанный РНМВ и приготовленный согласно Примеру 8.

2) Повязка В представляет собой 2-слойный конструкт, обработанный нанокристаллическим серебром и приготовленный согласно Примеру 8.

3) Повязка С представляет собой 1-слойный конструкт, обработанный нанокристаллическим серебром и приготовленный согласно Примеру 8.

4) Контроль (ткань на нефтяной основе или полиуретановая пленка только).

5) Положительный контроль (конкурентная противомикробная повязка или мазь Bactroban).

6) Необработанный, незащищенный от воздуха контроль.

Все группы обработки, за исключением необработанного контроля, покрывают полиуретановой пленкой. Группам обработки в случайном порядке назначают либо область 1, 2, 3, 4, 5 либо 6. Оценивают сумму 3 ран на группу обработки в день.

Три раны культивируют из каждой группы обработки на 24 или 72 ч после обработки. При каждом времени отбора образца участки культивируются количественно. Область, охватываемую стерильным стеклянным цилиндром (диаметром 22 мм), удерживают на своем месте посредством двух рукоятей. Один мл промывного раствора отбирают пипеткой в стеклянный цилиндр, а участок зачищают стерильным тефлоновым шпателем в течение 30 секунд. Проводят последовательные разбавления и определяют количество промывного раствора, используя систему спирального гальваника, которая осаждает небольшое количество (40 мкл) суспензии на поверхности вращающейся агаровой пластинки.

MRSA выращивают на селективных питательных средах, полученных с помощью агара Mueller Hinton, 4% NaCl и оксациллина с концентрацией 6 мкг/мл. Оксациллин используют вместо метициллина, потому что он более устойчив. После инкубационного периода (24 часа), подсчитывают колонии на пластинках и рассчитывают значение колониеобразующих единиц на мл (CFU/мл).

Результаты данного исследования представлены в Таблице 1. Результаты показывают, что 2-слойные конструкты, обработанные РНМВ и нанокристаллическим серебром, и 1-алойный конструкт, обработанный нанокристаллическим серебром, являются эффективными для освобождения ран от бактерий.

Пример 10. Методики механического испытания и механические свойства многослойных СКК протезов

Тестируют предпочтительные варианты многослойных СКК накладных конструктов. Конструкты из 2, 4, и 6 слоев СКК, сшитые 100 мМ раствором ЭДК в 50% ацетоне (100/50), и 6-слойные конструкты, сшитые 7 мМ раствором ЭДК в 90% (по объему) растворе ацетона в воде (7/90) и 1 мМ раствором ЭДК в воде (1/0) оценивают в соответствии с количеством измерений. Результаты суммируют в Таблице 2.

Испытание на разрушение при растяжении проводят, используя сервогидравлическую MTS систему тестирования с программным обеспечением TestStar-SX. Полосы шириной 1,25 см растягивают до разрушения при одноосном растяжении с постоянной скоростью деформации 0,013 с^-1. Расчитывают наклон линейной области (EY) и предел прочности на разрыв (UTS) из кривых деформации напряжения.

Прочность адгезии между слоями тестируют, используя стандартный протокол по испытанию адгезивов (ASTM D1876-95). Прочность адгезии - это средние усилие, требуемое для снятия двух слоев ламинированного СКК с постоянной скоростью 0,5 см/с.

Дифференциальный сканирующий калориметр используют для измерения теплового потока по направлению к и от образца при термически контролируемых условиях. Усадочную температуру определяют как температуру появления пика денатурации на диаграмме температура-энергия. Способность удерживать шов не проявляется для 2- или 4-слойных конструктов, сшитых в 100 мМ растворе ЭДК в 50% ацетоне, тогда как способность удерживать шов (3,7 Н+0,5 Н) для 2-слойного конструкта, сшитого в 1 мМ растворе ЭДК и без ацетона (который уменьшает степень сшивки), оказывается хорошей и превышает минимальный предел в 2 Н. Прочность ламинирования между СКК слоями и температура усадки зависят от концентрации сшивающего агента и добавления ацетона в большей степени, чем от количества слоев в конструкте.

Пример 11. Способ обработки раны противомикробно-обработанным конструктом

Для обработки глубокой раны кожи используют либо одиночный слой СКК из Примера 1, либо связанный многослойный листовой конструкт СКК, составленный по способу Примера 2. В пластинах проделывают отверстия или фенестрации для создания небольших прорезей, которые дают возможность просачиваться экссудатам раны.

С кожными ранами, включая ожоги второй степени, рваные раны, разрывы и ссадины; хирургическая эксцизия, раны, возникающие при удалении раковых опухолей, или аутотрансплантатные участки кожи донора; кожные язвы, например венозные, диабетические и пролежни, и другие хронические язвы, обращаются, используя СКК в однослойной или многослойной форме. Коллагеновый СКК матрикс защищает поверхность раны, поддерживая влагу и давая ей возможность дренироваться из раны. Перед нанесением СКК на рану, поверхность раны подготавливают для его применения.

Выбирают пациентов с ожоговыми ранами, которым требуется трансплантация. СКК помещают либо непосредственно на иссеченной поверхности раны, либо на сетчатом аутотрансплантате, нерастянутом или растянутом в соотношении 2:1 или более. Тестируемые участки (СКК) и контрольные участки (аутотрансплантат) при использовании имеют одинаковое соотношение размеров ячейки. Трансплантируемые участки ожоговой раны подготавливают, например, посредством санации раневой полости, первичной обработкой согласно общепринятой практике так, что обожженная площадь кожи полностью отсекается. Отсеченные участки выглядят чистыми и клинически незараженными.

Пациентам, которые подвергаются хирургической эксцизии, вводят локально обезболивающее средство. Предоперационную площадь дезинфицируют противомикробным/антисептическим дезинфицирующим средством для кожи (Hibielens®) и промывают изотоническим раствором. Проделывают глубокие неполные раны на коже и проводят трансплантацию кожи из другого места, если оно не является злокачественным. СКК наносят на поверхность раны, применяя стерильные бинты.

В случае какой-либо раны при оценке, очистке, замене бинтов обрабатываемых ран пациенту обеспечивают соответствующий послеоперационный уход. Проводят полную запись условий обрабатываемых участков, записывая в документы все процедуры, необходимые лекарственные средства, частоту смены повязок и любые проделанные наблюдения. Поверхность раны остается защищенной от внешней среды и влажной, что содействует обработке раны и ее заживлению.

Повязку на рану проверяют на модели животного организма. Изобретенный конструкт для перевязки раны представляет собой либо однослойный, либо многослойный листовой конструкт, изготавливаемый из СКК, составленного по способам Примеров 1 и 2. Используют модель заживления глубокой раны крысы (модель, широко применяемая для перевязочных продуктов на рану) для оценки эксплуатационных качеств перевязочного конструкта на рану, изготовленного из однослойного материала СКК. Все 20 животных, по четыре на оцениваемый момент времени, имеют две (2) полные иссеченные раны размером 2 см × 2 см, которые созданы на их спине. Тестируемые и контрольные изделия вырезают в виде кусков, слегка превышающих по размеру периферию, и наносят в сухом виде на любую рану, следуя рандомизированной схеме нанесения. Повязки повторно гидратируют жидкостью раны и стерильным соляным раствором при необходимости. Вторичные повязки из петролатумной марли наносят на каждое тестируемое и контрольное изделие и заменяют еженедельно или во время каждой оценки. Раны оценивают на 3, 7, 14, 28 и 42 день после обработки. Оценивают такие параметры, как скорость закрытия раны и процентное отношение закрытой раны (на основе записей о состоянии раны), эритема, экссудат и гистология эксплантируемых участков раны.

Согласно результатам анализа процентного отношения и скорости закрытия раны, участки, обработанные конструктом для перевязки ран, демонстрируют незначительно более быстрое закрытие раны, хотя и статистически невыраженное, по сравнению с контрольными участками. При анализе времени полного закрытия раны не обнаружено различий между тестируемыми и контрольными обработанными участками. Результаты анализа эритемы, экссудата и гистологического анализа одинаковы для двух продуктов. Гистологический анализ показывает, что конструкт для перевязки раны, изготовленный из одиночного слоя СКК, проявляет требуемые лечебные характеристики на протяжении времени, такие как повторная эпителизация раны и рассасывание коллагенового материала. Нет доказательств того, что у тестируемых организмов возникает неблагоприятная реакция на конструкт.

Несмотря на то, что вышеизложенное изобретение было описано в некоторых деталях в виде иллюстрации и примера с целью более ясного изложения и понимания, тому, кто сведущ в данной области медицины, будет очевидно, что на практике можно осуществить определенные изменения и модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и представляет собой биоинженерный коллагеновый конструкт для восстановления или замещения поврежденной ткани, отличающийся тем, что он включает слой очищенного коллагенового тканевого матрикса, полученного из подслизистой оболочки тонкой кишки, при этом упомянутый очищенный коллагеновый тканевый матрикс является обработанным фармацевтически приемлемым противомикробным агентом и обладает противомикробными свойствами. Изобретение обеспечивает биоинженерный коллагеновый конструкт с улучшенными противомикробными свойствами. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 11 пр., 2 табл.

Формула