Имплантируемая паста и ее применение - RU2678590C2

Описание

Представленное изобретение относится к имплантируемой пасте, содержащей биологически активное стекло, для использования в качестве импланта или покрытия импланта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Биологически активное стекло представляет собой известный биологически активный и биосовместимый материал. Виды биологически активного стекла десятилетиями изучали в качестве заполняющих кости материалов, которые могут связываться с костью, даже химически. С недавними открытиями превосходных качеств биологически активного стекла были изготовлены материалы, значительно более интересные для данных вариантов применения. Некоторые виды биологически активного стекла коммерчески продаются под торговыми названиями, напр., BonAlive®, NovaBone® и Biogran®. Виды биологически активного стекла используют в различных формах для медицинских вариантов применения, таких как гранулы и пластины для ортопедического и челюстно-лицевого заполнения полости кости и реконструкции кости.

Основное преимущество использования биологически активного стекла в качестве заменителя костного трансплантанта состоит в том, что можно избежать взятия костных трансплантантов из вторичного участка. В пределах некоторого диапазона составов биологически активное стекло стимулирует рост кости и демонстрирует свойства ингибирования роста бактерий.

Для того, чтобы стекло было биологически активным и обладало упомянутыми выше свойствами, необходимо, чтобы стекло растворялось и обладало определенной скоростью растворения, а также имело определенный состав. Взаимосвязь между составом и биологической активностью было описано у Hench L. Bioactive ceramics: Theory and clinical applications. Bioceramics 1994; 7:3-14 способом, который дает квалифицированному специалисту в данной области достаточно инструментов для разработки биологически активного стекла.

Одним фактором, влияющим на скорость растворения и, вследствие этого, на общее время разрушения частиц стекла, является размер частиц, или соотношение площади поверхности и объема (A/V). Другими словами, чем меньше частица, тем выше соотношение A/V и быстрее растворение и короче общее время разрушения. Например, коммерчески доступное стекло 45S5/Bioglass® доступно с диапазоном размеров 90-710 мкм, и утверждается, что оно растворяется в организме менее чем за год. Стекло S53P4, продаваемое под торговым названием BonAlive®, имеет химический состав 53 м% SiO2, 23 м% Na2O, 20 м% CaO и 4 м% P2O5, и это явно более медленно растворяющееся стекло, чем 45S5 стекло, которое имеет состав 45 м% SiO2, 24,5 м% Na2O, 24,5 м% CaO и 6 м% P2O5.

Для того, чтобы улучшить использование и расширить хирургическую сферу действия биологически активного стекла, были разработаны формуемые типы составов пасты или замазки. В идеальном случае готовую форму замазки должно быть легко дозировать, обрабатывать и вводить непосредственно в дефект кости без риска перекрестного загрязнения, утечки или избыточного дозирования. На практике при дозировании и формовании замазки врачи используют свои руки и пальцы и/или шпатель или аналог для заполнения полостей кости. Однако подобная готовая форма обладает рядом практических недостатков вследствие, напр., рисков загрязнения в процессе обращения, что не является оптимальным для пациента или врача.

Одна готовая форма синтетической замазки/пасты известна из US 2008/0226688 и коммерчески известна как NovaBone® Putty. Документ описывает наполнитель пустот в кости типа пасты или замазки, т.е. состав стерильного формуемого импланта для нанесения на участок дефекта кости, содержащий биологически активные стеклянные частицы в водном растворе носителя. Биологически активные стеклянные частицы добавляют в вязкий носитель в концентрации, варьирующей от приблизительно 68% до приблизительно 76% (м/м). Носитель содержит смесь глицерина и полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой (ПЭГ), варьирующей от 24% до 32% (м/м) с соотношением глицерина и полиэтиленгликоля, варьирующим от приблизительно 45:55 до приблизительно 65:35.

В дополнение к полностью синтетическим замазкам или пастам, наполнителям пустот в кости, в данной области широко использовались и были известны некоторые полусинтетические смеси в виде готовых форм замазок или паст, такие как смеси матрикса из аллогенных костей, деминерализованных костей и бычьего коллагена/гидроксиапатита. Однако подобные готовые формы аллогенных трансплантантов обладают рядом недостатков, из которых наибольшим недостатком является риск передачи заболевания, который никогда не может быть исключен полностью.

Кроме того, инфекции искусственных суставов (PJI) и других небиологических имплантов являются важной проблемой для системы здравоохранения и связаны с большим неудобством для пациентов, таким как продолжительная госпитализация, дополнительная операция, связанная с повышенным риском осложнений и длительным противомикробным лечением. Несмотря на относительно низкую частоту PJI (1-2%), связанный с ними экономический эффект остается огромным. Большое множество микроорганизмов способны создавать биопленку на материалах для протезирования, вызывая во многих случаях фатальный курс терапии. Staphylococcus aureus, коагулазонегативные стафилококки и грамотрицательные палочки являются наиболее часто участвующими в PJI патогенами.

Первой стадией в патогенезе PJI является адгезия бактериальных клеток к импланту с последующим образованием матрицы биопленки. Биопленка представляет собой заключенную в матрице микробную популяцию, отличающуюся межклеточной адгезией между микроорганизмами и небиологической поверхностью. Образование биопленки является древним и неотъемлемым компонентом прокариотического клеточного цикла и важным фактором для выживания бактерий в окружающей среде. Общей чертой связанных с биопленкой инфекций является их устойчивость к иммунитету хозяина, обычным противомикробным агентам и биоцидам. Известно, что бактерии, заключенные в структурах биопленки, фактически переносят уровни антибиотиков в 10-1000 раз выше, чем минимальные ингибирующие концентрации соответствующей планктонной формы.

Еще одной проблемой, связанной с бактериальными инфекциями, обычно является способность бактерий становиться резистентными к антибиотикам. Это не новое явление, но сегодня оно является крайне важной проблемой для здоровья. В течение нескольких десятилетий, в разной степени, бактерии, вызывающие общие инфекции, вырабатывают резистентность к каждому новому антибиотику, и развивается устойчивость к противомикробным препаратам, становясь глобальной угрозой здоровью согласно Центру по контролю и профилактике заболеваний в США и Всемирной организации здравоохранения.

Действительно, в настоящее время инфекции в результате резистентных бактерий являются весьма распространенными, и некоторые патогены стали резистентными даже к многочисленным типам или классам антибиотиков. Сегодня с резистентностью к антибиотикам сталкиваются в большинстве больниц и, по оценкам, 70% всех бактерий будут резистентными к антибиотикам к 2020 году. Была продемонстрирована активность подавления роста бактерий in-vitro BAG S53P4 по отношению к резистентному к метицилину S. aureus (MRSA), резистентному к метицилину Staphylococcus epidermidis (MRSE), Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, которые были выделены у пациентов, страдающих хроническим осетомиелитом (Drago L, Romanò D, De Vecchi E, et al. Bioactive glass BAG-S53P4 for the adjunctive treatment of chronic osteomyelitis of the long bones. An in vitro and prospective clinical study. BMC Infect. Dis. 10, 13:584 (2013)). Однако, хотя известно, что небольшие частицы данного биологически активного стекла обладают антибактериальным действием, не известно их взаимодействие с другими компонентами смеси, используемыми на практике.

Документ ʺAntibacterial effect of bioactive glasses on clinically important anaerobic bacteria in vitroʺ, J. Mat. Sc.: Mat. in Medicine, Vol 19, no. 2, 10 July 2007, раскрывает, что порошок биологически активного стекла S53P4 с размером частиц, равным или менее 45 микрометров, обладает хорошим антибактериальным действием. Документ EP 2322134 автора представленной заявки раскрывает имплантируемые пасты, содержащие различные типы полиэтиленгликолей и шарики биологически активного стекла. Однако, как показано ниже, данные пасты не являются антибактериальными.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Терминами, используемыми в данной заявке, если не определено иное, являются термины, согласованные на конференции по достижению консенсуса по биоматериалам в 1987 и 1992 гг., см. Williams, DF (ed.): Definitions in biomaterials: Proceedings of a consensus conference of the European Society for Biomaterials, Chester, England. March 3-5, 1986. Elsevier, Amsterdam 1987, и Williams DF, Black J, Doherty PJ. Second consensus conference on definitions in biomaterials. In: Doherty PJ, Williams RL, Williams DF, Lee AJ (eds). Biomaterial-Tissue Interfaces. Amsterdam: Elsevier, 1992.

В данной заявке под биологически активным материалом подразумевается материал, который был разработан, чтобы вызывать или модулировать биологическую активность. Биологически активным материалом часто является поверхностно-активный материал, который способен химически связываться с тканями млекопитающих.

Термин «резорбируемый» в данном контексте означает, что материал распадается, т.е. разлагается при продолжительной имплантaции при вставке в организм млекопитающего и когда он входит в контакт с физиологической средой. В частности, термин резорбируемое стекло подразумевает богатое кремнием стекло, которое не образует слоя гидроксил-карбонат-апатита на своей поверхности при контакте с физиологической средой. Резорбируемое стекло исчезает из организма посредством резорбции и не значительно активирует клетки или клеточный рост в процессе своего разложения.

Под биоматериалом подразумевается материал, предназначенный для взаимодействия с биологическими системами для оценки, лечения, приращения или замены любой ткани, органа или функции организма. Под биосовместимостью подразумевается способность материала, используемого в медицинском устройстве, функционировать безопасно и надлежащим образом, вызывая соответствующую реакцию хозяина в определенном месте. Под резорбцией подразумевается разложение биоматериала по причине простого растворения. Под композитным подразумевается материал, содержащий по меньшей мере две различных составляющих, например, органический полимер и керамический материал, такой как стекло.

ЦЕЛИ И СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цель представленного изобретения состоит в предоставлении композиций, используемых в качестве наполнителя пустот в костях, с которыми легко и безопасно обращаться и которые обладают требуемыми свойствами в отношении эффекта заполнения костей, являясь в то же время антибактериальными. Еще одна цель изобретения состоит в предоставлении композиции, которая используется для предотвращения образования биопленки на поверхности импланта. Таким образом, цель изобретения также состоит в том, чтобы предоставить материал для использования в имплантационной хирургии для предотвращения местной инфекции. Дополнительная цель изобретения состоит в предоставлении материала, к которому бактерии не станут резистентными.

Представленное изобретение относится к имплантируемой пасте, содержащей биологически активные стеклянные гранулы, имеющие распределение размеров 0,5-45 мкм, и биологически активные стеклянные гранулы, имеющие распределение размеров 100-4000 мкм. Композицией биологически активного стекла является 45-55 м% SiO2, 20-25 м% Na2O, 18-25 м% CaO и 3-6 м% P2O5. Паста дополнительно содержит полиэтиленгликоль с низкой молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 200-700 г/моль, полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 700-2500 г/моль, полиэтиленгликоль с высокой молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 2500-8000 г/моль, и глицерин, с оговоркой, что молекулярная масса полиэтиленгликоля с низкой молекулярной массой и полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой отличаются друг от друга по меньшей мере на 80 г/моль и что молекулярная масса полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой и полиэтиленгликоля с высокой молекулярной массой отличаются друг от друга по меньшей мере на 300 г/моль.

Изобретение также относится к применению пасты согласно данному изобретению при изготовлении импланта для использования при формировании кости. Изобретение дополнительно относится к применению пасты согласно данному изобретению при нанесении покрытия на имплант. Изобретение также относится к импланту, покрытому пастой согласно данному изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представленное изобретение относится к имплантируемой пасте, содержащей

(a) биологически активный стеклянный порошок, имеющий распределение размеров, составляющее 0,5-45 мкм в количестве 10-30 м% общей массы биологически активного стекла,

(b) биологически активные стеклянные гранулы, имеющие распределение размеров между 100 и 4000 мкм в количестве 90-70 м% общей массы биологически активного стекла в пасте,

(c) полиэтиленгликоль с низкой молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 200-700 г/моль,

(d) полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 700-2500 г/моль,

(e) полиэтиленгликоль с высокой молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 2500-8000 г/моль и

(f) глицерин,

при этом композиция биологически активного стекла содержит 45-55 м% SiO2, 20-25 м% Na2O, 18-25 м% CaO и 3-6 м% P2O5 с оговоркой, что молекулярная масса полиэтиленгликоля с низкой молекулярной массой и полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой отличаются друг от друга по меньшей мере на 80 г/моль и что молекулярная масса полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой и полиэтиленгликоля с высокой молекулярной массой отличаются друг от друга по меньшей мере на 300 г/моль.

Таким образом, представленное изобретение предоставляет композицию, которая является остеокондуктивной, биологически активной, антибактериальной и формуемой. Паста содержит биологически активные стеклянные гранулы в растворе или матрице вязкого органического носителя. Таким образом, паста состоит из частиц силиката кальция-фосфора-натрия, перемешанных с синтетическим связующим веществом, состоящим из полиэтиленгликоля, который выступает в качестве временного связующего агента для частиц. Частицы и связующее вещество обычно предоставляют в качестве предварительно перемешанного связующего материала. При имплантaции связующее вещество абсорбируется, обеспечивая возможность ткани инфильтрировать между частицами и обеспечивая возможность нормального процесса заживления кости, связанного с частицами (резорбции биологически активного стекла и регенерации кости). После того, как связующее вещество вскоре после имплантaции абсорбируется, остаются только биологически активные стеклянные частицы. Все данные компоненты хорошо известны и являются широко используемыми и переносимыми в медицинской, фармацевтической и косметической областях, а также в продуктах и напитках.

Таким образом, с помощью представленного изобретения и его различных вариантов осуществления достигается по меньшей мере часть, если не все упомянутые выше цели. На самом деле, когда порошок небольших биологически активных частиц объединяют со смесью полиэтиленгликолей, полученный в результате материал неожиданно обладает антибактериальным действием, при этом в то же время улучшает прорастание кости.

Патент EP 2322134 раскрывает аналогичную композицию, содержащую биологически активные стеклянные шарики и смесь различных полиэтиленгликолей (ПЭГ с низкой, средней и высокой молекулярной массой). Однако наблюдалось, что такая композиция, где биологически активным стеклом является биологически активное стекло BonAlive®, не обладат значительным антибактериальным действием. С другой стороны, было подтверждено, что только биологически активное стекло BonAlive® обладает антибактериальным действием независимо от размера его частиц, даже против устойчивых к антибиотикам бактерий. Однако порошок из небольших биологически активных частиц (средний диаметр ниже 45 мкм) сам по себе не может быть включен в ткани млекопитающих (т.е. отдельно), поскольку скорость его реакции является слишком высокой и может быть даже опасно высокой. Это также не способствует росту кости вследствие его высокой скорости реакции.

При сравнении с биологически активным стеклянным порошком аналогичного размера частиц, представленный материал, содержащий полиэтиленгликоли, обладает дополнительным преимуществом в том, что его можно наносить через трубку, обеспечивая ее применение также при минимально инвазивной операции. Материал является вязким и, таким образом, заполняет дефект регулируемым, постепенным образом, в отличие от свободно текущего сухого порошка. Таким образом, можно управлять даже распределением пасты на дефекте.

Также может быть возможно комбинировать биологически активное стекло в форме порошка с частицами небольшого размера с более крупными гранулами, которые будут оказывать влияние как на свойства протекания материала, так и на свойства прорастания кости. Выбор полиэтиленгликолей также может быть подобран с учетом соответствия потребностям свойств протекания.

В представленном описании сокращение м% означает массовую долю и обычно выражается в виде массовой доли от общей массы. Молекулярной массой является средняя молекулярная масса, которой в данном случае является среднечисленная молекулярная масса и выражается как г/моль. Распределение размеров биологически активных стеклянных частиц определяется просеиванием.

Под гранулами подразумеваются частицы, которые обладают любой правильной или неправильной формой, не являющейся шариками. Порошок биологически активного стекла также изготовлен из гранул.

Согласно предпочтительному варианту осуществления паста также содержит

(g) терапевтически активный агент.

Согласно варианту осуществления биологически активные стеклянные гранулы имеют распределение размеров, составляющее 500-800 мкм. Согласно еще одному варианту осуществления биологически активные стеклянные гранулы имеют распределение размеров, составляющее 100-350 мкм. Согласно еще одному варианту осуществления биологически активные стеклянные гранулы имеют распределение размеров, составляющее 315-500 мкм. Согласно еще одному варианту осуществления биологически активные стеклянные гранулы имеют распределение размеров между 1000 и 2000 мкм. Композиция может, например, содержать биологически активное стекло в порошковой форме и гранулах, имеющее распределение размеров, составляющее 315-500 мкм. Подобная композиция может использоваться, например, для стоматологической хирургии. Еще одной возможной комбинацией является порошок и гранулы, имеющие распределение размеров, составляющее 500-800 мкм. Данная композиция может использоваться для черепно-челюстно-лицевой хирургии и хирургии кисти. Дополнительно возможной комбинацией является порошок с гранулами, имеющими распределение размеров, составляющее 1000-2000 мкм. Данная композиция может использоваться для ортопедической, травматической хирургии и хирургии позвоночника.

Таким образом, композиция может содержать биологически активное стекло в порошковой форме, т.е. в гранулах, имеющих распределение размеров, составляющее 1-44 мкм. Распределение размеров может быть, например, от 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 мкм до 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или 45 мкм. Композиция дополнительно содержит более крупные гранулы, которые могут иметь распределение размеров, составляющее, например, 100-350 мкм, или 100-200 мкм, или 150-250 мкм, или 200-300 мкм, или 250-350 мкм. Распределение размеров данных более крупных гранул может также быть, например, 315-500 мкм, или 350-500 мкм, или 400-500 мкм. Распределение размеров более крупных гранул может даже дополнительно быть, например, 500-800 мкм, или 500-700 мкм, или 550-800 мкм, или 600-800 мкм, или 650-750 мкм. В некоторых вариантах осуществления распределение размеров может также быть, например, 1000-2000 мкм, или 1000-1500 мкм, или 1300-1800 мкм, или 1500-2000 мкм, или 2000-3150 мкм. Распределение размеров стеклянных гранул определяется просеиванием.

Распределение размеров стеклянных гранул может также быть, например, от 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2900, 3000 или 3150 мкм до 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2900, 3000, 3100, 3150, 3200, 3300, 3400, 3450, 3550, 3600, 3700, 3800, 3900 или 4000 мкм.

Полиэтиленгликоли (ПЭГ), также известные как полиэтиленоксиды, содержат повторяющуюся единицу (-CH2CH2O-), и их получают с помощью пошагового добавления этиленоксида к соединению, содержащему реакционно-способный атом водорода. Полиэтиленгликоли получают посредством добавления этиленоксида к этиленгликолю для получения бифункциональной полиэтиленовой структуры HO(CH2CH2O)nH, где n является целым числом изменяющейся величины в зависимости от молекулярной массы полиэтиленгликоля.

Полиэтиленгликоли, используемые в представленном изобретении, представляют собой в общем линейные полиэтиленгликоли, т.е. имеющие молекулярную массу от 100 до 8000 г/моль. Также могут использоваться разветвленные полиэтиленгликоли и полиэтиленгликоли звездообразной формы для уменьшения или дополнительной подгонки вязкости пасты. Полиэтиленгликоли обычно называют ПЭГ с цифрой, при этом цифра обозначает среднюю молекулярную массу в г/моль. Таким образом, ПЭГ 400 подразумевает полиэтиленгликоль, имеющий среднюю молекулярную массу, равную 400 г/моль, а ПЭГ 2000 подразумевает полиэтиленгликоль, имеющий среднюю молекулярную массу, равную 2000 г/моль.

Полиэтиленгликоли (ПЭГ) используют для образования пастообразного материала посредством связывания и смачивания биологически активных стеклянных частиц. Для того, чтобы добиться подходящей вязкости пасты, по меньшей мере два ПЭГ должны быть смешаны вместе. При выборе подходящих молекулярных масс для ПЭГ необходимо помнить, что ПЭГ с низкой молекулярной массой (< 600 г/моль) является жидким при комнатной температуре, но ПЭГ с более высокой молекулярной массой являются воскообразными или твердыми.

Для того, чтобы иметь пасту, которая остается пастообразной при температурах ее применения (комнатной температуре и температуре тела), по меньшей мере три ПЭГ смешивают вместе, обычно при повышенных температурах. Так как ПЭГ с более высокой молекулярной массой представляют собой кристаллические материалы, их использование будет поднимать верхний предел температуры использования пасты, а также повышать вязкость пасты и предотвращать в процессе хранения осаждение биологически активных стеклянных частиц при комнатной температуре. Для того, чтобы уменьшить нижний предел температуры использования, т.е. расширить диапазон температур использования, ПЭГ с низкими молекулярными массами являются полезными, чтобы избежать застывания, т.е. затвердевания пасты при низких температурах, так как ПЭГ с высокими молекулярными массами имеют тенденцию к кристаллизации при низких температурах.

Если бы использовался только один ПЭГ с молекулярной массой для воскообразного или твердого состояния, температура использования была бы слишком узкой для практического использования. ПЭГ 600 (т.е. полиэтиленгликоль, имеющий 600 г/моль в качестве средней молекулярной массы) показывает диапазон плавления, составляющий приблизительно 17-22°C, поэтому он может быть жидким при комнатной температуре, но пастообразным при низких окружающих температурах, в то время как ПЭГ со средними молекулярными массами от 800 до 2000 представляют собой пастообразные материалы с низким диапазоном плавления. Выше молекулярной массы 3000 полиэтиленгликоли обычно являются твердыми.

Глицерин, т.е. пропан-1,2,3-триол, обычно называют glycerin или glycerine. Он представляет собой вязкую жидкость без цвета и без запаха, которая широко используется в фармацевтических готовых формах. Глицерин можно добавлять в пасту для улучшения ее гладкости и для предоставления дополнительного смазывания за счет усиления тепловых свойств и свойств вязкости вследствие физических взаимодействий между ПЭГ и глицерином. ПЭГ и глицерин совместимы друг с другом.

ПЭГ 400 способен смешиваться во всех пропорциях с глицерином, но растворяющая способность и растворимость ПЭГ в глицерине уменьшается по мере того, как повышается молярная масса. Однако, оба данных свойства могут быть улучшены посредством умеренного нагревания, а вещества, которые растворяются при комнатной температуре в ПЭГ 400, растворимы приблизительно в той же степени в расплавленном ПЭГ 4000 (т.е. При температуре, равной 60-70°C).

Согласно одному варианту осуществления изобретения общее количество биологически активного стекла составляет 50-80 м% общей массы пасты. Количество биологически активных стеклянных частиц, имеющих распределение размеров, составляющее 0,5-45 мкм (a), составляет 10-30 м% общей массы биологически активного стекла, а количество биологически активных стеклянных гранул, имеющих распределение размеров, составляющее 100-4000 мкм (b), составляет 90-70 м% общей массы биологически активного стекла в пасте.

Предпочтительно, общее количество полиэтиленгликолей составляет 20-50 м% общей массы пасты. Например, количество ПЭГ с низкой молекулярной массой (c) составляет 2-15 м%, а количество ПЭГ со средней молекулярной массой (d) составляет 8-48 м% общей массы пасты. Количество ПЭГ с высокой молекулярной массой (e) составляет 1-10 м% общей массы пасты.

В варианте осуществления, где используется глицерин, его количество составляет до 10 м% общей массы пасты. Некоторые подходящие пасты имеют следующую композицию:

- ПЭГ (c+d+e) 23-45 м%,

- глицерин (f) 0-10 м% и

- биологически активное стекло (a+b) 55-67 м%.

Некоторые предпочтительные пасты имеют следующий диапазон композиций:

- ПЭГ с низкой молекулярной массой (c) 4-10 м%

- ПЭГ со средней молекулярной массой (d) 13-18 м%

- ПЭГ с высокой молекулярной массой (e) 1-8 м%

- Глицерин (f) 8-10 м%

- Небольшие биологически активные стеклянные гранулы (a) 8-12 м%

- Более крупные биологически активные стеклянные гранулы (b) 48-52 м%.

Согласно варианту осуществления изобретения количество терапевтически активного агента (g) составляет до 30 м% общей массы пасты. Терапевтически активный агент может быть выбран из группы, состоящей из факторов роста, белков, пептидов, антибиотиков, мукополисахаридов, т.е. гиалуроновой кислоты, стволовых клеток нечеловеческого происхождения (т.е. исключая человеческие стволовые клетки), пероксидов и их смесей, и использоваться для содействия росту кости или чтобы иметь дополнительное противомикробное, например, антибактериальное действие. Однако необходимо заметить, что представленный материал является эффективным также в отсутствии антибиотиков.

В варианте осуществления изобретения композиция биологически активного стекла содержит 45-54 м% SiO2, 22-25 м% Na2O, 19-25 м% CaO и 3,5-6 м% P2O5. В еще одном варианте осуществления изобретения композиция биологически активного стекла содержит 53 м% SiO2, 23 м% Na2O, 20 м% CaO и 4 м% P2O5. Подобное биологически активное стекло также известно как S53P4 и продается под торговым названием BonAlive®. Данный вариант осуществления предоставляет композицию с быстро растворяющимся in vivo связующим веществом, которая обеспечивает процесс нормального заживления кости, связанный с гранулами S53P4 (резорбция биологически активного стекла и регенерация кости), и порошком. Вследствие низкой скорости растворения химической композиции с биологически активным стеклом S53P4 и размера частиц будет натуральным образом достигаться долгосрочный эффект роста кости. Согласно еще одному варианту осуществления, композиция биологически активного стекла содержит 45 м% SiO2, 24,5 м% Na2O, 24,5 м% CaO и 6 м% P2O5. Данное биологически активное стекло также известно как 45S5 и продается под торговым названием NovaBone®.

Пасты, содержащие все ингредиенты на крайних концах диапазонов, необязательно могут демонстрировать оптимальные характеристики текучести и продукта. Например, комбинирование ПЭГ с высокой молекулярной массой в высокой концентрации без достаточного количества ПЭГ с низкой молекулярной массой и/или глицерина может давать продукт с высокой вязкостью, который не подходит для инъецирования при комнатной температуре или температуре тела. Однако квалифицированный специалист в данной области будет способен найти идеальное соотношение ингредиентов с помощью проведения некоторых легких экспериментов для каждого набора требуемых свойств. Некоторые примеры подходящих комбинаций также приведены в экспериментальной части ниже.

Изобретение также предоставляет способ получения формуемой пасты, наполнителя пустот в кости, обладающей противомикробными свойствами, который включает плавление и перемешивание исходных материалов в регулируемых условиях, а также охлаждение, упаковывание и обработку итоговых продуктов.

Пасту обычно изготавливают посредством перемешивания и/или плавления ингредиентов вместе в порционном смесителе при температуре 25-95°C в защитном газе или при разрежении или в атмосферных условиях в течение 5-60 мин. Затем смесь охлаждают до 25-45°C и перемещают в машину для нанесения покрытий и/или сохраняют для дальнейшего использования. В качестве альтернативы, перемешивание, плавление и/или перемещение могут быть проделаны с помощью использования любого типа перемешивающего оборудования, напр., открытого или закрытого порционного смесителя, реактора или смесителя с постоянным перемешиванием в резервуаре, экструдера, литьевой машины для литья под давлением, трубчатого реактора или другого стандартного оборудования для обработки в расплаве или для перемешивания в расплаве, известного в данной области техники.

Изобретение также обеспечивает использование представленной пасты при изготовлении импланта для использования при формировании кости, например, на участке дефекта кости, т.е. в качестве пасты-наполнителя пустот в кости. Изобретение дополнительно обеспечивает использование представленной пасты для покрытия импланта. Действительно, было определено, что представленная паста обладает способностью предотвращения и лечения образования биопленки на поверхности имплантов. Ее также можно использовать при лечении инфекций протезов, связанных с биопленкой, поскольку она обладает антибактериальной эффективностью против наиболее проблемных бактерий инфекций протезирования. Кроме того, паста согласно данному описанию может использоваться для лечения ран, где пасту наносят на открытую рану и закрывают.

Изобретение также предоставляет имплант, покрытый представленной пастой. Имплантом может быть, например, тазобедренный имплант, коленный имплант или любой другой искусственный сустав или любой другой имплант, инкорпорированный млекопитающим. Имплант покрывают представленной пастой перед имплантaцией в тело человека или животного.

В дополнение, изобретение предоставляет противомикробные, способствующие росту костей композиции, содержащие упомянутую выше готовую форму с активными агентами. Активным агентом может быть любой фармацевтически активный агент для применения у животных или человека.

Далее будут более подробно описаны различные варианты осуществления представленного изобретения в следующей экспериментальной части.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Обобщенный способ изготовления замазки

Глицерин и ПЭГ 400 добавляли в нагретый реактор (60°C) с использованием скорости перемешивания 100 об/мин (оборотов в минуту) с последующим добавлением ПЭГ 1500 и ПЭГ 3000. ПЭГ поставлялся Clariant, а глицерин поставлялся Uniqema или Sigma-Aldrich. В расплавленную смесь добавляли биологически активные стеклянные гранулы и перемешивали до гомогенной смеси. Полученную замазку охлаждали до комнатной температуры (RT) при перемешивании и сосуд разгружали, упаковывали и сохраняли в осушителе для дальнейшего использования и тестирования.

Противомикробная активность эталонных биологически активных стекол

Способность биологически активного стекла отдельно и с матрицей, как описано в данном описании, уничтожать бактерии тестировали следующим образом, в виде сравнительных примеров. В таблице 1 перечислены бактерии, используемые в тесте. MetR означает устойчивость к метициллину. В таблице 2 перечислены различные тестируемые стекла. Стекло S53P4 и стекло BonAlive® имеют одинаковый состав, который описан выше.

Композиция Замазки BonAlive®

Глицерин 16 г

ПЭГ 400 12,8 г

ПЭГ 1500 25,6 г

ПЭГ 3000 9,6 г

Гранулы S53P4 500-800 мкм 76,8 г

Шарики S53P4 90-425 мкм 19,2 г

ПЭГ означает полиэтиленгликоль, а цифра позади обозначает среднюю молекулярную массу в г/моль. Для эталонных образцов от Замазки 1 до Замазки 6 использовали одинаковую смесь глицерина, ПЭГ 400, ПЭГ 1500 и ПЭГ 3000 (т.е. пастообразного связующего вещества), как для Замазки BonAlive®.

Таблица 1. Штаммы бактерий

Таблица 2. Тестируемые продукты, контрольные образцы и эталонные материалы

Композиции Замазка 1 - Замазка 6 тестировали с Staphylococcus epidermidis и Pseudomonas aeruginosa, все другие композиции тестировали для всех штаммов, перечисленных в таблице 1.

Тестирование In vitro (Сравнительные примеры 1-4, 11-14)

Бактерии инкубировали (5 мл стерильные тестовые пробирки, Becton Dickinson) вместе с различными продуктами в стерильном триптон-соевом бульоне (TSB, содержащем ферментативный гидролизат казеина, ферментативный гидролизат жмыха соевых бобов, хлорид натрия, дикалий фосфат и декстрозу). В таблице 3 перечислены концентрации продуктов, используемых в исследовании. Гранулы, эталонные материалы и контрольные образцы взвешивали (Mettler AE 50) и должным образом перемешивали с 2 мл TSB. Взвешивали три повторения каждого продукта за исключением шести повторений продукта замазки. Три повторения продукта замазки инкубировали 2 часа при комнатной температуре, после чего TSB с растворенным полимером заменяли новой 2 мл партией TSB. В заключение в смесь добавляли бактериальные инокулюмы (известное количество, определенное посредством оптической денсиометрии, Thermo GeneSys 20). В качестве контрольных образцов служили культуры бактерий без добавленных продуктов и чистый TSB. В качестве положительного контроля выступал порошок S53P4, поскольку из более ранних исследований известно, что концентрация порошка, равная 100 мг/мл, является достаточной для эффективного подавления бактерий. В качестве эталонных материалов включали стекло Iittala и трикальций фосфат (TCP). Перед исследованием инертное биологически неактивное стекло Iittala измельчили на небольшие гранулы (точный размер гранул не определен).

Таблица 3. Концентрации продуктов, используемых в исследовании

Жизнеспособность суспензий бактерий, инкубированных с различными продуктами, оценивали посредством использования коммерческих твердых пластин с кровяным агаром (Trypticase Soy Agar II с 5% Sheep Blood, Becton Dickinson). В последовательных через 24 ч точках культивирования образцы 10 мкл, взятые непосредственно из суспензий, высевали (как описано в Vuorenoja K, Jalava J, Lindholm L. et al. (2011) Detection of Streptococcus pneumoniae carriage by the Binax NOW test with nasal and nasopharyngeal swabs in young children. Eur J Clin Microbial Infect. EPub PMID: 21800217). В дополнение, одну повторение разведений 1:10000 образцов и контрольных образцов бактерий высевали, чтобы убедиться в количественно определяемом образовании единой колонии.

Рост бактерий оценивали посредством сравнения с контрольным образцом после культивирования (+37°C в течение 16 ч) на агаровых пластинках. Отсутствие роста на пластинках было индикатором способности данного продукта предотвращения микробной колонизации. Культивирование In vitro выполняли в течение периода, составляющего 7 дней, за исключением того, что для P. aeruginosa не мог быть превышен период, равный 5 дней, вследствие образования мути, которая препятствовала точному сбору 10 мкл образца.

pH образцов из тестовых пробирок оценивали с помощью использования pH индикаторной бумаги (диапазон pH 7,5-14 Merck Alkalit 81.09532, а диапазон 6,4-8,0 Nacherey-Nagel, REF 90210). Кусок бумаги погружали в бульон, после чего значение pH оценивали посредством сравнения цвета бумаги со шкалой, предоставленной изготовителями. Оценку pH проводили после 8 дней культивирования для S. aureus и S. epidermidis, после 7 дней для MRSA и 5 дней для P. aeruginosa.

Тестирование In vitro (Сравнительные примеры 5-10)

Использовали один штамм Staphylococcus epidermidis и один штамм Pseudomonas aeruginosa. Обработку получали посредством инкубирования каждого продукта (итоговая концентрация 400 мг/мл) в ростовой среде в течение 48 часов при 37°C. Значения pH измеряли с регулярными интервалами. Считается, что значение pH, равное или выше 10, позволяет предположить оптимальную обработку.

Антибактериальную активность оценивали посредством кривых уничтожения. Аликвоту бактериальных суспензий инокулировали в тестовые пробирки, содержащие обработанные продукты. Контрольные измерения роста проводили, инокулируя бактерии отдельно в ростовую среду. Пробирки инкубировали при 37°C в аэробной атмосфере. Микробные подсчеты проводили после 0, 24, 48 и 72 часа инкубирования посредством посева соответствующего разведения бактериальной суспензии на агаровые пластинки, которые инкубировали в течение 24 часов при 37°C.

Результаты эталонных материалов (сравнительные примеры)

Сравнительные примеры 1-4, 11-14

Отрицательные контрольные образцы последовательно дали результат, слишком многочисленный для подсчета после посева. Было видно со всеми штаммами и во все временные точки, которые показали, что бактерии были жизнеспособными в течение всего периода исследования. Чистый TSB без инокулята использовали в качестве контроля, чтобы продемонстрировать, что вся работа была проведена в асептических условиях. В любой из временных точек не было бактериального роста в чистом TSB.

Все протестированные (отдельно) продукты, гранулы BonAlive®, влияли на бактериальный рост. Время и уровень, необходимые для результата, варьировали в зависимости от размера гранул. Результат также варьировал между видами бактерий. Порошок, просеянный по размеру частиц <45 мкм, был способен противодействовать росту всех исследованных бактерий. Продукт, замазка BonAlive®, не влиял на рост какого-либо из исследованных патогенов. Результаты S. epidermidis, S. aureus MetR и P. aeruginosa показали недостаточный результат в середине тестового периода, но замазка BonAlive® не оказывала никакого действия на S. aureus ATCC 29213. День за днем имелись изменения во время тестового периода. Чистый полимер (связующее вещество замазки) оказывал некоторое действие на S. epidermidis и S. aureus MetR в конце тестового периода, но день за днем имелись изменения роста. TCP не оказывал никакого действия в какой-либо день на грамотрицательную P. aeruginosa, не оказывал никакого действия на S. aureus ATCC 29213 в конце тестового периода. Наблюдался небольшие воздействия на два других грамположительных кокка.

Таким образом, можно заключить, что продукт, замазка BonAlive®, был неспособен предотвращать образование колоний четырех клинически важных патогенов в процессе данного тестового периода. Изменение день за днем и переменчивые результаты замазки и полимера по меньшей мере частично могут быть объяснены используемой тестовой установкой in vitro. В дополнение, физические и химические особенности полимера могут оказывать некоторое действие на качество капания из пипетки.

В таблицах 4-7 перечислены все результаты бактериального роста. Перечисленные количества показывают отличие (log10) между бактериальным контролем и бактериями, инкубированными с образцом (0=нет отличия от бактериального контроля, 1=log10 отличие от бактериального контроля, 5 представляет собой отличие или более чем 4 логарифмов), при этом 0 означает отсутствие подавления бактериального роста.

Таблица 4. S epidermidis

Таблица 5. S. aureus

Таблица 6. S. aureus MetR

Таблица 7. P. aeruginosa

Таблица 8 суммирует значения pH в конце периода инкубирования (8 дней для S. epidermidis и S. aureus, 7 дней для S. aureus MetR, 5 дней для P. aeruginosa).

Таблица 8. Значения pH

Сравнительные примеры 5-10

В таблице 9 показаны результаты для сравнительных примеров 5-10. Композиции замазки показали небольшое изменение pH (pH 8), но не обладают противомикробным действием ни против S. Aureus, ни против P. aeruginosa.

Таблица 9. Результаты для сравнительных примеров 5-10

Противомикробная активность пасты согласно изобретению

Пасту, имеющую композицию, указанную в таблице 10 (композиция 1), тестировали на ее антибактериальную активность. Эталонными образцами были порошок биологически активного стекла с размером фракции менее 45 мкм (композиция 2) и биологически активные стеклянные гранулы с размером фракции 500-800 мкм (композиция 3), стерилизованные гамма-излучением, как описано выше.

В качестве отрицательного контроля использовали три образца инертного стекла аналогичного размера (R1350 Iittala clear, Iittala, Finland): гранулы < 45 мкм с ПЭГ и глицерином, как указано в таблице 9 (Эталон 1), гранулы < 45 мкм (Эталон 2) и гранулы 500-800 мкм (Эталон 3). Все образцы получали с итоговой концентрацией, равной 400 мг/мл (соответствующей 5% клиническому рабочему раствору) в трипсиновом соевом бульоне (TSB; Biomerieux, Marcy l'Etoile, France), и 4,8 мл каждого раствора помещали в стерильные 6-луночные полистироловые микропланшеты (Jet Biofil; Guangzhou, China). Образцы биологически активного стекла инкубировали при 37°C в течение 4 часов для композиции 1, 7 часов для композиции 2 и 24 часа для композиции 3. Значения pH измеряли pH-метром с регулярными интервалами для определения высвобождения ионов и изменений pH, позволяющие предположить обработку. Считалось, что значение pH, равное или выше 11, позволяет предположить оптимальную обработку. После того, как была достигнута оптимальная обработка, содержимое каждой лунки было готово для использования.

Таблица 10. Композиция тестируемой пасты изобретения

Использовали один штамм устойчивого к метициллину S. aureus и один P. aeruginosa выделили в микробиологической лаборатории IRCCS Института Ортопедии им. Галеацци из инфицированных протезов коленного сустава пациентов, обратившихся в центр для реконструктивной хирургии костно-суставных инфекций (C.R.I.O.) того же института для проверки имплантов. Данные штаммы выбрали с учетом их сильной способности продуцировать in vitro на материалах для протезирования биопленку.

Стерильные обработанные песткоструйным аппаратом титановые диски с диаметром, равным 25 мм, и толщиной, равной 5 мм (Adler Ortho, Cormano (Milan), Italy; BATCH J04051) использовали в качестве субстрата для образования и роста биопленки. Выдержанные в течение ночи культуры S. aureus и P. aeruginosa ресуспендировали при итоговой плотности, равной 1,0×108 КОЕ/мл в TSB, и аликвоты (200 мкл) каждого рабочего раствора инокулировали в 6-луночные полистироловые микропланшеты, содержащие титановые диски и 4,8 мл свежего TSB. После инкубирования в течение 24 ч при 37°C в аэробных условиях отработанную ростовую среду, содержащую неприлипшие бактерии, удаляли и заменяли 5 мл свежей среды. Планшеты инкубировали в течение дальнейших 48 ч для получения зрелой биопленки, затем среду и оставшиеся неприлипшие бактерии, если имеются, удаляли посредством промывания три раза стерильным физиологическим раствором.

Спустя время обработки титановые диски, покрытые бактериальной биопленкой, помещали в новые стерильные 6-луночные полистироловые микропланшеты, содержащие либо обработанное биостекло, либо отрицательный контроль (инертное стекло). Количество биопленки на каждом титановом диске оценивали после 24, 48 и 72 часов инкубирования.

Анализ с Кристаллическим фиолетовым

Анализ с Кристаллическим фиолетовым использовали в качестве предварительного теста для того, чтобы оценить наилучшую готовую форму и наилучшее время инкубирования стекла S53P4 для использования против биопленок S. aureus и P. aeruginosa. Для оценки действия тестируемых стекол на структуру биопленки, после обработки, как описано у Christensen et al. (Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, et al. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J. Clin. Microbiol. 22(6), 996-1006 (1985)) измеряли всю имеющуюся на каждом диске биомассу. В конце времени инкубирования биопленку, выросшую на титановых дисках, сушили воздухом и окрашивали посредством погружения диска в 5% раствор Кристаллического фиолетового в течение 15 минут. Затем, после нескольких промываний, диски снова сушили воздухом и помещали в 3 мл 96% этанола для смывания Кристаллического фиолетового, связанного с биопленкой. Три аликвоты (100 мкл) каждого раствора этанола с красителем помещали в 96-мультилуночный планшет и с помощью считывающего устройства для микропланшетов считывали поглощения при 595 нм (Multiskan FC, Thermo Scientific; Milan, Italy) в трех повторениях для каждого диска.

Статистический анализ

Количества биопленки, которые измеряли с помощью анализа с Кристаллическим фиолетовым, представлены как среднее ± СО. Статистический анализ проводили посредством двухфакторного дисперсионного анализа с последующим t-критерием Бонферрони и t-критерием Стьюдента в зависимости от обстоятельств. Предел значимости для P значений установили менее 0,05.

Результаты

В таблицах 11 и 12 показана активность S53P4 против биопленки в виде значения поглощения при 595 нм для двух бактерий. Количество биопленки, имеющейся на всех титановых дисках после обработки, значительно различалось (P<0,05) между дисками, обработанными S53P4, и дисками, обработанными инертным стеклом (контрольные образцы). Хотя, казалось, время воздействия биологически активного стекла не влияет значительно на количество биопленки после 72 часов обработки, наблюдалось уменьшение биопленки по сравнению с уменьшением биопленки, наблюдаемым после 24 и 48 часов. Активность S53P4 против биопленки не различалась значительно между тремя тестируемыми готовыми формами.

Таблица 11. Поглощение при 595 нм для S. aureus MetR

Таблица 12. Поглощение при 595 нм для P. aeruginosa

Таким образом, результаты показывают, что независимо от противомикробной активности самого биологически активного стекла, когда его перемешают с гликолем и ПЭГ, оно не обладает антибактериальным действием, если оно не используется в форме порошка, имеющего распределение размеров, составляющее 0,5-45 мкм. Следовательно, комбинация идеи EP 2322134 и того факта, что данный вид биологически активного стеклянного порошка обладает противомикробной активностью, не была бы очевидна квалифицированному специалисту в данной области, поскольку это единственная форма биологически активного стекла (т.е. порошок), которая не имеет данного неожиданного действия.

Реферат

Группа изобретений относится к медицине, конкретно к имплантируемой пасте, содержащей биологически активный стеклянный порошок, имеющий распределение размеров, составляющее 0,5-45 мкм, биологически активные стеклянные гранулы, имеющие распределение размеров между 100 и 4000 мкм, полиэтиленгликоль с низкой молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 200-700 г/моль, полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 700-2500 г/моль, полиэтиленгликоль с высокой молекулярной массой, имеющий диапазон молекулярной массы, составляющий 2500-8000 г/моль, и глицерин. Имплантируемая паста улучшает прорастание кости. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 табл.

Формула