Способ получения монодисперсных полимерных микросфер с альдегидными группами - RU2751881C1

Описание

Предполагаемое изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к способам получения синтетического полимерного латекса с альдегидными группами на поверхности, которые могут быть использованы в создании диагностических препаратов для реакции латекс-агглютинации в клинических диагностических и иммунологических исследованиях.

В настоящее время реакция латекс-агглютинации (РЛА) получила широкое распространение, как в клинических диагностических тестах, так и в биохимических и иммунологических исследованиях. Особенно широкое применение РЛА наблюдается в диагностике инфекционных заболеваний [1-4]. В этих тестах используют монодисперсные суспензии сенсибилизированных полимерных микросфер. С помощью латексных тест-систем можно определять более ста возбудителей инфекционных заболеваний, в том числе бактериальных, вирусных, грибковых и других. Кроме тою, существует более шестидесяти различных латексных тест-систем, позволяющих определять резус-фактор, группу крови, наличие лекарственных средств, ядов и наркотиков в исследуемых образцах [2-6]

Известны способы получения полимерных микросфер методами безэмульгаторной, эмульсионной, затравочной, суспензионной, осадительной, дисперсионной полимеризации. Выбор метода синтеза определяется необходимостью получения суспензий с заданными свойствами.

Кроме того, к частицам, используемым в имунодиагностических тестах результат которых оценивают по скорости оседания аглютинатов, могут предъявляться специальные требования, связанные с плотностью полимера. Полимерные дисперсии могут содержать на поверхности группы, способные непосредственно реагировать с биомолекулами или образовывать с ними химическую связь после реакции активации микросфер. При выборе микросфер, метода их синтеза и сенсибилизации на них биомолекул необходимо учитывать, что многие реакционные группы теряются за счет гидролиза как при их синтезе, так и при сенсибилизации. Особое место в биотехнологии занимают полиакролеиновые носители. Их важным достоинством является наличие на поверхности микрочастиц альдегидных групп. Эти группы устойчивы в широком диапазоне рН среды и в мягких условиях легко образуют химическую связь с биологическими молекулами, что является принципиальным при изготовлении диагностических препаратов.

Известно несколько способов получения полиакролеиновых латексов с альдегидными группами на поверхности (7 - 10).

Известен способ получения полиакролеиновых латексов анионной осадительной полимеризацией акролеина в щелочной среде (8), где рН более 11 при постепенном введении раствора щелочи в раствор акролеина и только в присутствии специально синтезированного эмульгатора-продукта взаимодействия олигомеров полиглютарового альдегида с бисульфитом натрия. Полимеризация продолжается 10 часов при комнатной температуре.

Однако, способ отличается плохой воспроизводимостью, что связано с особенностью полимеризации акролеина в водной щелочной среде, сложностью контроля скорости введения щелочного раствора и нестандартностью используемого эмульгатора, кроме того этот метод слишком длителен.

Известен способ введения в поверхностный слой монодисперсных полимерных частиц альдегидных групп путем безэмульгаторной эмульсионной сополимеризации стирола или метилметакрилата с акролеином (11).

Недостатком способа является то, что он не позволяет вводить в поверхностные слои частиц аминогруппы, поскольку присутствие незащищенных аминогрупп в составе реакционной смеси вызывает обрыв свободного радикального процесса роста цепи.

За прототип выбран способ получения полиакролеиновых частиц с альдегидными группами на поверхности с повышенной химической стабильностью путем двухстадийной полимеризации (9). На первом этапе осуществляют традиционную анионную осадительную полимеризацию акролеина в водно-щелочной среде с добавлением раствора 0,2N КОН до рН 10,5-11,0. Реакционную смесь перемешивают при постепенно повышающейся температуре до 35°С в течение 1,5-2,5 часов пока рН не понизится до 7,5-8,0. Далее, на второй стадии проводят радикальную дополимеризацию. Для этого в реакционную смесь добавляют радикальные инициаторы (персульфат калия, динатрий изобисизомасянная кислота, пероксид бензоила) в количестве 3-6% от массы акролеина и процесс продолжают еще 2-3 часа при температуре от 40 до 90°С в атмосфере аргона. Для получения окрашенных латексов первую стадию процесса осуществляют в присутствии 0,02-1,5% от массы акролеина водорастворимого органического красителя.

Недостатком способа является необходимость контроля оптической плотности реакционной смеси в условиях быстро протекающего процесса и момента введения в нее эмульгатора.

Кроме того способ достаточно сложный, длительный, двухстадийный и по сути является поверхностной модификацией акролеиновых латексов, полученных анионной полимеризацией в водно-щелочной среде.

Общим недостатком полиакролеиновых латексов полученных анионной осадительной полимеризацией является низкая химическая стабильность и значительная загрязненность олигомерами.

Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка нового способа создания синтетического полимерного латекса, отвечающего требованиям предъявляемым к носителям иммунореагентов, который позволяет в короткие сроки (не более 3 часов) получать качественные монодисперсные полимерные микросферы с альдегидными группами на поверхности для конструирования иммунодиагностических препаратов.

Поставленная задача достигается тем что, в способе получения монодисперсных полимерных микросфер с альдегидными группами, включающем постановку реакции полимеризации с применением акролеина, осадительную дисперсную полимеризацию проводят в условиях одномоментно протекающих анионной и радикальной полимеризации путем предварительной подготовки реагентов с отмывкой и перегонкой акролеина в присутствии гидрохинона из расчета 0,2 г последнего на 100 мл акролеина при температуре (52-54)°С, затем осуществляют синтез полимерных микросфер, для этого в реактор емкостью 50 мл загружают 20 мл дистиллированной воды, в которую при постоянном перемешивании на электромагнитной мешалке вносят 0,1 г поливинилпирролидона (получая 0,5% водный раствор), 0,05 г персульфата калия (1% от массы акролеина), 6 мл (5 г) свежеперегнанного акролеина, далее при перемешивании в реакционную смесь по каплям добавляют 1 мл 5% раствора тетраметилэтилендиамина (ТЭМЭД), для получения бесцветных микросфер или 0,5 мл для получения окрашенных микросфер, после введения которого начинается процесс полимеризации, причем весь процесс проводят при перемешивании в течение 2,5 - 3 часов при комнатной температуре, получая бесцветные или окрашенные микросферы размером 1,3 - 2 мкм с содержанием альдегидных групп 1,3 ммоль\1г полимера.

При этом для подготовки реагента ТЭМЭД, последний в количестве 0,05 мл растворяют в 1 мл дистиллированной воды, получая 5% раствор.

Кроме того альдегидные группы определяют путем инкубации полимерной дисперсии с n-нитрофенилгидразином в 0,05М фосфатном буфере с рН 5,8, используя фотометр КФК-3, при этом анализ проводят путем смешивания 1 мл раствора n-нитрофенилгидразина и 100 мкл 5% суспензии полимера, пробы инкубируют в течение 6 часов при постоянном перемешивании и центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 15 мин, а с помощью калибровочной кривой определяют конечную концентрацию n-нитрофенилгидразина в супернатанте, затем по разнице между исходной и конечной концентрацией, полученной после инкубации, рассчитывают количество альдегидных групп.

Причем для приготовления 0,05М фосфатного буферного раствора (рН 5,8) 4 мл 0,2М двузамещенного фосфата натрия смешивают с 46 мл 0,2М однозамещенного фосфата натрия и доводят дистиллированной водой до 200 мл.

Кроме того для получения окрашенных микросфер, предварительно готовят 1% - водный раствор одного из красителей сафранина или тионина, а затем перед добавлением в реакционную смесь тетраметилэтилендиамина в эту смесь вносят 2 мл раствора сафранина или 1 мл раствора тионина.

При этом диаметр полимерных микросфер определяют методом электронной трансмиссионной микроскопии, для этого материал полимерной дисперсии наносят петлей на сетку подложку, избыток удаляют фильтровальной бумагой и высушивают, затем образцы просматривают при различном увеличении на трансмиссонном электронном микроскопе, используя программу для расчета диаметра частиц.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно проводят подготовку необходимых для синтеза реагентов. Для полимеризации используют виниловый мономер - акролеин, который - первоначально очищают, для этого готовят водный раствор при массовом соотношении фаз мономер:вода = 1:4. Затем проводят перегонку полученной смеси в присутствии гидрохинона из расчета 0,2 г. гидрохинона на 100 мл акролеина. При этом перегонку проводят в вытяжном шкафу с подогревом. В работе используют фракцию, кипящую при 52-54°С.

Далее 0,05 мл тетраметилэтилендиамина (ТЭМЭД) растворяют в 1 мл дистиллированной воды, получая 5% раствор. Навески персульфата калия 0,10 г и поливинилпирролидона 0,10 г готовят на лабораторных весах с точностью до 0,01 г. Готовят водные растворы красителей - сафранина, и тионина.

Кроме того заранее готовят 0,005М раствор однозамещенного фосфата калия для последующего исследования физико-химических свойств.

После этого проводят непосредственно процесс полимеризации винилового мономера - акриламида. Полимеризацию проводят в присутствии окислительно-восстановительной системы (персульфат калия - поливинилпирролидон - ТЭМЭД).

Д ля этого в реактор емкостью 50 мл загружают 20 мл дистиллированной воды, в которую при постоянном перемешивании на электромагнитной мешалке вносят 0,1 г поливинилпирролидона (получая 0,5% водный раствор), 0,05 г персульфата калия (1% от массы акролеина), 6 мл (5 г) свежеперегнанного акролеина, далее при перемешивании в реакционную смесь по каплям добавляют 1 мл 5% раствора ТЭМЭДа, (для получения бесцветных микросфер) или 0,5 мл для получения окрашенных микросфер, после введения которого начинается процесс полимеризации. Весь процесс проводят при перемешивании в течение 2,5 - 3 часов при комнатной температуре. Заключительный этап предложенной технологии складывается из определения физико-химических характеристик полимерных микросфер, а именно:

- Диаметр полимерных микросфер определяют методом электронной трансмиссионной микроскопии. Для этого нативный материал полимерной дисперсии наносят петлей на сетку-подложку, избыток удаляют фильтровальной бумагой и высушивают. Образцы рассматривают при различном увеличении на трансмиссионном электронном микроскопе, используя программу для расчета диаметра частиц.

- Для определения содержания активных аьдегидных групп проводят инкубацию полимерной дисперсии с n-нитрофенилгидразином в 0,05М фосфатном буфере с рН 5,8. Калибровочную зависимость поглощения на длине волны 392 нм от концентрации n-нитрофенилгидразина в присутствии 0,05М фосфатного буфера рН 5,8 получают с использованием фотометра КФК-3 (ЗОМЗ, РОССИЯ). Анализ исследуемых образцов путем смешивания 1 мл раствора n-нитрофенилгидразина и 100 мкл 5% суспензии полимера. Пробы инкубируют в течение 6 часов при постоянном перемешивании и центрифугируют при 6 тыс.об/мин. в течение 15 мин. С помощью калибровочной кривой определяют конечную концентрацию n-нитрофенилгидразина в супернатанте. По разнице между исходной и конечной концентрацией, полученной после инкубации, рассчитывают количество альдегидных групп.

Предлагаемая технология, заявляемого способа, как совокупность существенных признаков обеспечивает достижение технического результата, а именно:

- получение монодисперсного полимерного латекса с размером частиц 1,3-2,0 мкм оптимальными для носителя иммунореагентов;

- химическую и механическую стабильность за счет присутствия реакционных альдегидных групп на поверхности частиц (1,3 ммоль\1 г полимера);

- в одностадийном процессе полимеризации в течение 2,5-3 часов при комнатной температуре.

Отличительными признаками заявляемого способа от прототипа являются: - технология осуществляется в одну стадию, полимеризация инициируется окислительно-восстановительной системой персульфат калия-поливинилпирролидон-тетраметилэтилендиамин. Эта система генерирует образование радикалов, а органическое основание ТЭМЭД (промотор) является источником гидроксил-ионов. Таким образом, одномоментно осуществляется радикальная и анионная полимеризация акролеина со сшивкой полимера во всем объеме образующихся латексных частиц.

Пример 1.

Подтверждающий практическое получение полиакролеинового латекса.

В 20 мл 0,5% поливинилпирролидона растворяют последовательно 0,05 г персульфата калия и 6 мл свежеперегнанного акролеина. К полученному раствору при постоянном перемешивании на электромагнитной мешалке добавляют 1 мл 5% водного раствора тетраметилэтилендиамина. Реакционную смесь перемешивают 3 часа при комнатной температуре. Получают бесцветные частицы со средним диаметром 1,4 мкм. Выход полимерного латекса составляет 80%.

Пример 2.

Демонстрирующий получение окрашенных полимерных микросфер.

Процесс полимеризации проводят по описанной в примере 1 технологии, но в раствор акролеина перед полимеризацией вводят 2 мл 1% водного раствора красителя - сафранина-Т и полимеризацию инициируют добавлением в реакционную смесь 0,5 мл 5% водного раствора промотора-тетраметилэтилендиамина. Получают частицы красного цвета размером 2 мкм.

Пример 3.

Демонстрирующий получение окрашенных полимерных микросфер.

Процесс полимеризации проводят по описанной в примере 1 технологии, но в раствор акролеина перед полимеризацией вводят 1 мл 1% водного раствора тионина и полимеризацию инициируют добавлением в реакционную смесь 0,5 мл 5% водного раствора промотора-тетраметилэтилендиамина. Получают фиолетовые частицы с размером частиц 1,3 мкм.

Пример 4.

Подтверждающий практическое использование полимерного латекса в иммунодиагностике. Приготовление полимерного антигенного псевдотуберкулезного диагностикума.

Дя получения псевдотуберкулезного полимерного антигенного диагностикума использовали бесплазмидный штамм H14/84 Y.pseudotuberculosis (из коллекции музея живых культур ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института). Готовят сенситин с использованием белков наружной мембраны Y.pseudotuberculosis. В качестве сенситина используют пул из 10 белковых антигенов с молекулярными массами в пределах 28-80 кДа, с концентрацией общего белка 0,9-1,3 мг/мл, который растворяют в 1 мл 0,1 М бикарбонатного буферного раствора (рН 9,2).

Затем проводят иммобилизацию сенситина на полимерный носитель, представляющий собой суспензию микросфер из расчета 1 мг белка на 100 мг носителя. В качестве носителя используют сферические полимерные частицы окрашенные сафранином-Т (красные), размером 2 мкм, содержащие 1,3 мМ/г альдегидных групп. Инкубацию сенситина на носителе проводят в течение 2 часов при комнатной температуре при перемешивании на электромагнитной мешалке, после чего суспензию оставляют на 16-18 часов при температуре 4-6°С, затем блокируют несвязавшиеся аьдегидные группы, трижды отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. при комнатной температуре, после чего суспендируют в желатозо-сахарозной среде, создавая в разведение 1:1 и разливают в инсулиновые флаконы по 1 мл, после чего лиофилизируют. Полученный диагностикум дает возможность проводить исследования по выявлению антител к возбудителю псевдотуберкулеза в один этап с визуальным учетом цветной реакции. Результаты исследования получают ы течение 2 часов, что позволяет отнести полученный на полиакролеиновых микросферах препарат к средствам экспресс-диагностики.

Пример 5.

Подтверждающий практическое использование полимерного латекса в иммунодиагностике. Приготовление полимерного иммуноглобулинового антитоксического диагностикума для количественного определения токсинопродукции холерного вибриона.

Для получения диагностикума по определению токсинопродукции холерным вибрионом первоначально получают экспериментальные антитоксические иммунные кроличьи сыворотки. Для приготовления сенситина выделяют иммуноглобулины из кроличьих сывороток. Затем проводят иммобилизацию сенситина на полимерный носитель, представляющий собой фиолетовую суспензию микросфер размером 1,3 мкм окрашенную красителем тионин.

Сенсибилизируют полимерный носитель полученными иммуноглобулинами. Для иммобилизации сенситина осадок отмытого носителя суспендируют в боратном буфере (рН8,4), добавляют к нему иммуноглобулины к холерному токсину и оставляют для контакта при перемешивании в течение 2 часов при 20°С. В результате альдегидные реакционные группы на поверхности частиц специфически взаимодействуют с аминогруппами белковых молекул иммуноглобулинов. После этого суспензию охлаждают до 4-5°С. и выдерживают при этой температуре 16-18 часов.

Блокируют свободные альдегидные группы путем введения в суспензию 0,5%-ного раствора желатозы на забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1) и инкубацией в течение 2-х часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании. В результате стабилизации желатоза позволяет блокировать не связавшиеся в процессе сенсибилизации с иммуноглобулинами реакционные группы на поверхности частиц.

Суспензию диагностикума центрифугируют и трижды отмывают забуференным физиологическим раствором (рН 7,0-7,1) от избытка желатозы, а конечный осадок суспендируют в 0,1%-ном растворе желатозы в забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,1).

Диагностикум предназначен для выявления холерного токсина и определения уровня токсинопродукции Vibrio cholerae серогруппы O1 в бульонных культурах при выделении из объектов внешней среды и от человека с помощью реакции латекс-агглютинации. Результаты исследования получают в течение 2 часов, что позволяет отнести полученный на полиакролеиновых микросферах препарат к средствам экспресс-диагностики.

Использование предполагаемого изобретения позволяет за счет нового способа в короткие сроки получать качественные монодисперсные полимерные микросферы с альдегидными группами на поверхности микросфер в одностадийном процессе осадительно дисперсной полимеризации.

Полученные по предложенному способу микросферы могут быть использованы при получении иммобилизованных ферментов, антител, токсинов, лекарственных препаратов и других соединений с целью применения их в научной и практической деятельности, в частности, в качестве аффинных сорбентов. Кроме того на их основе могут разрабатываться суспензионные иммунодиагностические препараты.

Источники информации

1 Camargos Р.А.М., Almeida M.S., Cardoso I.,-Latex Particle Agglutination-Test in the Diagnosis of Haemophilus Influenzae Type B, Streptococcus Pneumoniae and Neisseria Meningitis A and Neisseria Meningitis С Meningitis in Infants and Children // J. Clin Epidemiol. 1995, Vol. 48, Iss. 10, P. 1245-1250. Gualano M.P., Grundy M.A., Coacley W.T. Ultrasound Enhansed Latex Agglutination of Bacteria Antigen in Urine // Brithish Journal of Biomedical Science. Vol. 52. Iss. 3. 1995. P. 178-183.).

2. Peula-Garsia J.M., Molina-Bolivar J.A., Velasco J., Rojas A., Galisteo-Gonzalez F. Journal of Colloid and Interface Science. 2002. V. 245. №2. P. 230-236

3. Bang L.B.W The Latex Course. Bang Laboratories Inc. Carmel. Indianapolis. USA 1996. V4

4. KawaguchiH. \\ Prog. Polym. Sci. 2000. V.25. H.1171-1210

5. Ishii K., Kumagai Т., Kurihara M., Shiozawa Т., Noguchi H., Tozuka M., Ota H., Katsuyama T. // Clinica Chimica Acta. 2001. V. 312. №1. P. 231-233).

6. Santos R.M., Forcada J. // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2001 V. 12. №2. P. 173-180

7. Прокопов Н.И. Грицкова, В.Р.Черкасов, A.E. Чалых \\ Успехи химии 1996 т. 65 (2) с. 179)

8. B. Schlund, T. PithM. Lambla\\Macromol.Chem.Suppl. 10/11 419 (1985).

9. Авторское Свидетельство 1565846 СССР 1990 Бюл. изобретений(19), 108(1990)

10. «Способ получения монодисперсного синтетического полимерного латекса с карбоксилированной поверхностью частиц», пат. №2164919, кл. C08F 2/22, опубл. 10.04.2001 Бюл. №31

11. Меньшикова А.Ю. Евсеева Т.Р. Чекина Н.А. и др. «Монодисперсные микросферы на основе сополимеров акролеина» \\ Журнал прикладная химия. 2001. Т.1.74 №10. С. 1677.

12. «Способ получения псевдотуберкулезного антигенного полимерного диагностикума»,пат. №2430376, кл. G01N 33/53, опубл. 27.09.2011 г. Бюл. №27

13. »Способ получения диагностикума для определения токсина холерного вибриона, выделенного из объектов окружающей среды», пат. №2703282, кл. A61K 39/106, опубл. 16.10.2019 Бюл. №29.

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу получения монодисперсных полимерных микросфер с альдегидными группами, которые могут быть использованы в создании диагностических препаратов для реакции латекс-агглютинации в клинических диагностических и иммунологических исследованиях. Способ включает постановку реакции полимеризации с применением акролеина, при этом осадительную дисперсную полимеризацию проводят в условиях одномоментно протекающих анионной и радикальной полимеризаций путем предварительной подготовки реагентов с отмывкой и перегонкой акролеина в присутствии гидрохинона, далее осуществляют синтез полимерных микросфер, для чего в реактор загружают дистиллированную воду, в которую при постоянном перемешивании на электромагнитной мешалке вносят поливинилпирролидон, персульфат калия и свежеперегнанный акролеин, далее при перемешивании в реакционную смесь по каплям добавляют 5%-ный раствор тетраметилэтилендиамина (ТЭМЭД) для получения микросфер. Заявленный способ позволяет получать в короткие сроки качественные монодисперсные полимерные микросферы с альдегидными группами размером 1,3-2,0 мкм, содержание альдегидных групп в которых составляет 1,3 ммоль/1г полимера. 5 з.п. ф-лы, 5 пр.

Формула