Устройства для осаждения частиц - RU2764775C1

Чертежи

Показать все 17 чертежа(ей)

Описание

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Для настоящей заявки в соответствии с разделом 35 Кодекса США §119(e) испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/659 295, поданной 18 апреля 2018 г. и относящейся к заявке на патент США №15/586 902, поданной 4 мая 2017 г., которая является частично продолжающейся заявкой на патент США. №15/324 062, поданной 5 января 2017 г., и по заявке PCT № PCT/US2015/063195 с датой международной подачи 1 декабря 2015 г., в которой указаны США. Настоящая заявка также связана с предварительной заявкой на патент США №62/332 546, поданной 6 мая 2016 г., и с предварительной заявкой на патент США №62/459 509, поданной 15 февраля 2017 г. Патентная заявка №15/324 062, согласно разделу 35 Кодекса США §371, является национальным этапом заявки PCT № PCT/US2015/039723 с датой международной подачи 9 июля 2015 г. и указанием США, в указанной заявке PCT испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США №62/022276, поданной 9 июля 2014 г. и по предварительной заявке на патент США №62/037,513, поданной 14 августа 2014 г. В заявке РСТ № PCT/US2015/063195 испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США №62/086,122, поданной 1 декабря 2014 г. Содержание указанных заявок полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем изобретении предлагаются устройства для осаждения клеток или частиц, имеющие многоуровневые наклонные поверхности, улучшающие процесс осаждения клеток или частиц. Устройства согласно настоящему изобретению могут применяться в целом ряде областей, относящихся к: (i) культурам клеток (млекопитающих, микробов, растений или водорослей), имеющих высокую плотность и секретирующих полипептиды, гормоны, белки или гликопротеины, продукты для вакцин или вирусоподобные частицы, либо к другим химическим продуктам, таким как этанол, изобутанол, изопреноиды, ароматические и вкусо-ароматические соединения и т.д.; (ii) сепарации и рециркуляции пористых или непористых твердых частиц катализатора, катализирующих химические реакции в жидкой или газовой фазе, окружающей твердые частицы; (iii) сепарации и сбору новообразованных из окружающей жидкой фазы твердых веществ в результате физических превращений, таких как кристаллизация, флокуляция, агломерация, осаждение и т.д.; (iv) улавливанию и очистке секретируемых белков, в частности, моноклональных антител и т.д. на аффинных лигандах, например белка А, иммобилизованного в микросферах; (v) размножению in vitro различных клеток млекопитающих, таких как мезенхимальные стволовые клетки человека, дифференцированные клетки человека (например, кардиомиоциты или эритроциты), модифицированные клетки человека (например, Т-лимфоциты, трансфицированные химерным антигенным рецептором, или CAR-T-клетки и т.д.), для применения в аутологичной или аллогенной клеточной терапии); и (vi) очистке технологической воды на крупномасштабных муниципальных или коммерческих очистных сооружениях сточных вод путем осаждения и удаления сложных биологических консорциумов или активного ила, либо других твердых частиц.

Известный уровень техники

Из всех перечисленных выше областей применения осадительных устройств наиболее известной областью является продуцирование биологических белков, полипептидов или гормонов, секретируемых рекомбинантными клетками микробов или клетками млекопитающих из суспензионных культур. Наиболее распространенные способы продуцирования биологических белков в рекомбинантных клетках млекопитающих и микробов основаны на использовании культивирования с периодической подпиткой, при этом клетки выращивают до достижения высокой плотности клеток, а затем обычно подвергают воздействию индукционной среды или индуктора для запуска продуцирования белков. Если требуемые белки секретируются из клеток, целесообразнее перейти от культивирования с периодической подпиткой к культивированию с непрерывной перфузией, которая может поддерживать высокую плотность клеток и высокую продуктивность в течение гораздо более длительного периода культивирования. Во время культивирования при непрерывной перфузии живые и продуктивные клетки удерживаются или возвращаются обратно в биореактор, в то время как секретируемые белки непрерывно отбираются из биореактора для последующих процессов очистки.

Использование культивирования с непрерывной перфузией по сравнению с культивированием с периодической подпиткой обеспечивает ряд ключевых преимуществ: (1) секретируемые белковые продукты непрерывно удаляются из биореактора без риска потенциальной деградации под действием протеолитических и или гликолитических ферментов, высвобождаемых в культуральную среду из мертвых клеток; (2) живые и продуктивные клетки сохраняются и обратно рециклируются для достижения высокой плотности клеток в биореакторах с непрерывной перфузией, при этом указанные клетки не уничтожаются и не удаляются из биореактора в конце каждого культивирования с периодической подпиткой, а в течение более длительного периода культивирования продолжают продуцировать ценные белки в контролируемой среде биореактора; (3) состояние среды в перфузионном биореакторе можно поддерживать приближенным к стационарному (что позволяет гарантировать стабильное качество продукта) при постоянном добавлении свежей питательной среды и удалении продуктов жизнедеятельности вместе с собранными белковыми продуктами, в отличие от динамического изменения концентрации питательных веществ и продуктов жизнедеятельности в культуре с непрерывной подпиткой; и (4) с помощью комплекта устройств удержания клеток мелкие мертвые или отмирающие клетки могут быть селективно удалены из перфузионного биореактора до того, как эти клетки лизируются и высвобождают свои внутриклеточные ферменты, благодаря чему поддерживается высокая жизнеспособность клеток и высокое качество собираемых секретируемых белковых продуктов.

В области промышленного культивирования клеток млекопитающих было разработано множество устройств удержания клеток млекопитающих, в частности, устройства со встроенным центробежным фильтром (Himmelfarb et al., Science 164: 555-557, 1969), с наружными модулями фильтрации (Brennan et al., Biotechnol. Techniques, 1 (3): 169-174, 1987), с половолоконными модулями (Knazek et al., Science, 178: 65-67, 1972), а также наклонные осадительные устройства (Batt et al., Biotechnology Progress, 6: 458-464, 1990) и разработаны способы удержания клеток, в частности, способ: гравитационного осаждения в циклоне (Kitano et al., Appli. Microbiol. Biotechnol. 24, 282-286, 1986), непрерывного центрифугирования (Johnson et al., Biotechnology Progress, 12, 855-864, 1999) и акустической фильтрации (Gorenflo et al., Biotechnology Progress, 19, 30-36, 2003). Циклоны, как было установлено, неспособны создавать достаточную центробежную силу для надежной сепарации клеток при скорости потока сбора клеток и размерах устройства, которые были использованы в экспериментах с культурами клеток млекопитающих (Kitano et al., 1986), а при более высоких скоростях потока (и центробежных силах), необходимых для эффективной сепарации клеток, клетки млекопитающих существенно повреждаются (Elsayed, et al., Eng. Life Sci., 6: 347-354, 2006). Большинство других устройств надежно удерживают все клетки млекопитающих из сбора, однако эти устройства неспособны должным образом отделить мертвые клетки от живых клеток, требуемых для биореактора. Следовательно, мертвые клетки продолжают накапливаться внутри перфузионного биореактора, засоряя мембранные фильтры, что приводит к приостановке, как правило, на три или четыре недели процесса культивирования клеток млекопитающих в непрерывном перфузионном биореакторе.

Среди всех устройств удержания клеток, имеющихся в настоящее время, только наклонные осадительные устройства (Batt et al., 1990, см. выше и Searles et al., Biotechnology Progress, 10: 198-206, 1994) способны селективно удалять мелкие мертвые клетки и клеточные дебрисы в верхнем потоке или потоке сбора, при этом более крупные, живые и продуктивные клетки млекопитающих постоянно рециркулируют посредством нижнего потока обратно в перфузионный биореактор. Таким образом, перфузионный биореактор может функционировать неограниченно, при этом обеспечивается высокая жизнеспособность и высокая плотность клеток, в то время как белковый продукт постоянно собирают с верхней части наклонного осадительного устройства.

Наклонное осадительное устройство ранее масштабировался как многопластинчатый или ламельное осадительное устройство (Probstein, R. F., патент США №4151084, апрель 1979 г.) и широко использовался в нескольких крупномасштабных промышленных процессах, таких как очистка сточных вод, очистка питьевой воды, финишная обработка металлов, добыча полезных ископаемых и рециркуляция катализаторов (например, Odueyngbo et al., патент США №7 078 439, июль 2006 г.).

Со ссылкой на представленную авторами первую демонстрацию однопластинчатого наклонного осадительного устройства (Batt et al., 1990), был запатентован многопластинчатый или ламельное осадительное устройство (Thompson and Wilson, патент США 5817505, октябрь 1998 г.), направленный на повышение продуктивности секретируемых белков при культивировании клеток млекопитающих и масштабирование наклонных осадительных устройств, используемых для культивирования гибридомных клеток. Указанные ламельные наклонные осадительные устройства использовались для культивирования рекомбинантных клеток млекопитающих в перфузионных биореакторах непрерывного действия при высокой производительности биореактора (благодаря высокой плотности клеток) и высокой жизнеспособности (более 90%) клеток в течение длительного периода времени (например, на протяжении нескольких месяцев без необходимости завершения перфузионного культивирования). В патентной публикации №2011/0097800, Kauling et al. описан масштабно увеличенный вариант наклонного осадительного устройства, в котором используются наклонные цилиндрические трубки, скрученные под углом. Устройство описано как эффективное при культивировании более крупных клеток млекопитающих, таких как CHO, BHK, HEK, HKB, клетки гибридомы, инфузорий и насекомых.

Ни одно из указанных устройств удержания клеток не было продемонстрировано для сбора секретируемых белковых продуктов в перфузионных биореакторных культурах мелких и, следовательно, более сложных микробных клеток. Ламельные осадительные устройства при испытании на осаждение дрожжевых клеток показали ограниченный успех (Bungay and Millspaugh, Biotechnology and Bioengineering, 23: 640-641, 1984). Гидроциклоны при проведении испытаний на дрожжевых суспензиях, главным образом для отделения дрожжевых клеток от пива, тоже показали ограниченный успех (Yuan et al., Bioseparation, 6: 159-163, 1996; Cilliers and Harrison, Chemical Engineering Journal, 65: 21-26, 1997).

Модифицированный циклон, содержащий спиральную пластину, вертикально установленную внутри циклона, был предложен для повышения эффективности сепарации при очистке сточных вод (Болдырев В.В., Давыдов Е.И., Settling tanks, как описано в патенте России №2182508), причем ранее устройство было описано для декантации твердых частиц в жидкой суспензии (патент США №4048069, сентябрь 1977 г.). Модифицированный циклон, раскрытый в патенте России № 2182508, включает спирально-навитую пластину, размещенную в вертикальном цилиндрическом корпусе с коническим дном. Прорезь предусмотрена по всей высоте центральной впускной трубы для сточной воды, которая закупорена внизу для отвода сточных вод из впускной трубы в вертикальную спирально-навитую пластину. Спираль начинается в центральной трубе и заканчивается у стенки цилиндрического корпуса с образованием канала, по которому протекает вода с твердыми частицами. Частицы оседают в вертикальной осадочной колонне спирального канала. Высота осаждающей зоны определяется высотой вертикальной спиральной пластины, а ширина канала ограничивается стенками спирально-навитой пластины и поддерживается постоянной на всем протяжении. В верхней части цилиндрического корпуса установлен патрубок для отвода очищенной воды. Внизу конической донной части имеется патрубок для удаления осадка. При работе осадительного устройства сточная вода поступает через центральную трубу и попадает в спиральную зону через прорезь или отверстие. Поскольку канал имеет спиральную конфигурацию, путь потока увеличивается и, таким образом, увеличивается продолжительность пребывания жидкости внутри осадительного устройства. Спиральная конфигурация канала, к тому же, обеспечивает большую контактную поверхность с жидкостью. Основной движущей силой процесса осветления является сила тяжести, действующая на частицы суспензии, когда суспензия перемещается вокруг спирально-навитой вертикальной осадительной колонны. Шлам, оставшийся на стенке спирали или в канале, падает на коническое дно осадительного устройства и периодически удаляется из осадительного устройства. Очищенная вода выпускается через патрубок, предусмотренный в верхней части цилиндрического корпуса.

Как описано в российском патентном документе, характер движения потока сточной воды, содержащей твердые частицы, по сравнению с характером движения потока в обычном циклоне, является противоположным, поскольку грязная вода, поступающая по центральной трубе, входит через прорези в спиральный канал, а очищенная вода удаляется по патрубку для очищенной воды, установленному на периферии или наружной поверхности вертикального цилиндрического корпуса. Указанное модифицированное циклонное устройство с реверсивным потоком не предлагалось и не применялось в каких-либо областях, кроме очистки сточных вод.

Таким образом, требуется устройство для осаждения частиц, в котором эффективно используются центробежные силы и гравитационные силы, действующие на частицы в жидкой суспензии, при этом осадительное устройство занимает относительно небольшое пространство.

Раскрытие изобретения

Согласно изобретению, предлагаются устройства для осаждения клеток или частиц, содержащие внутри корпуса многоуровневые наклонные поверхности, улучшающие процесс осаждения клеток или частиц. Корпусом может являться корпус циклона. Устройства для осаждения частиц согласно настоящему изобретению могут применяться в разнообразных областях и существенно превосходят устройства известного уровня техники. В указанных осадительных устройствах наклонные поверхности могут быть связаны с множеством вертикальных цилиндрических пластин. Осадительные устройства могут включать спиральную коническую поверхность или несколько наклонных пластин, расположенных вблизи наклонной конической поверхности, соединенной с нижней частью спирали. Множество многоуровневых наклонных пластин повышают эффективность осаждения частиц из объема жидкости, перемещающейся либо вниз, либо вверх внутри конической сборки, в которой объем жидкости постепенно перемещается от периферии конической или спиральной поверхности осаждения к центру осадительного устройства.

Осадительные устройства согласно настоящему изобретению могут иметь корпус, который вмещает стопку конусов, вставленных один в другой и сужающихся в направлении центрального отверстия, при этом отсутствуют вертикальные пластины. Согласно указанному варианту осуществления изобретения, конусы в стопке конусов поддерживаются опорами один над другим с заданным интервалом (определяющим ширину канала) между последовательными конусами в стопке конусов. Опоры могут представлять собой три или большее количество выступов, закрепленных на верхней и/или нижней поверхности одного или нескольких конусов для создания между последовательными конусами требуемого интервала (определяющего ширину канала). Если требуется, опоры могут содержать по меньшей мере три L-образных элемента, закрепленных на поверхности каждого конуса в отдалении от усеченной вершины конуса. L-образные элементы имеют первую сторону, верхний конец которой соединен со второй стороной элемента, причем первая сторона элемента поддерживает смежный конус в стопке конусов. Вторая сторона элемента, по существу, параллельна поверхности конуса. Если требуется, вторая сторона элемента может выступать за пределы конуса, отделяя конус от внутренней поверхности корпуса. Согласно указанным вариантам осуществления изобретения, между вставленными друг в друга конусами предотвращается возникновение пробки или иной преграды, препятствующей течению жидкости или взвешенных частиц к центральному отверстию.

Осадительные устройства согласно настоящему изобретению могут содержать корпус, который вмещает:

1) первую стопку из двух или более конусов, вставленных один в другой и имеющих центральное отверстие, и

2) если требуется, вторую стопку из двух или более конусов, вставленных один в другой и имеющих на дне или вблизи дна центральное отверстие, образованное поверхностями конуса, сужающегося к центральному отверстию в дне корпуса.

Образующие стопку конусы (как первую стопку, так и необязательную вторую стопку из двух или более конусов, вставленных один в другой) содержат по меньшей мере три выступа, поддерживающих в стопке конусы, выступающие один из другого смежные. Выступы, предпочтительно, расположены, по существу, с одинаковым интервалом и имеют, как правило, одинаковый размер, благодаря чему между последовательно установленными в стопке конусами поддерживается примерно одинаковый интервал. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, каждый конус имеет по меньшей мере три выступа, чтобы каждый последующий конус поддерживался в стопке надлежащим образом, однако для создания более эффективной и надежной опоры каждый конус может иметь более трех выступов. Например, каждый конус может иметь четыре выступа или восемь выступов, поддерживающих смежные конусы в стопке.

Выступы или «вертикальные опоры» могут создавать препятствия для осаждаемых частиц или клеток, скользящих по поверхности конуса к центральному отверстию или зазору между внутренней периферией корпуса и конусами. Эти выступы закреплены на поверхности одного конуса, при этом эти выступы необязательно должны быть закреплены на другом конусе в стопке конусов. Точнее говоря, не требуется закрепление этих выступов на двух конусах, и в большинстве вариантов осуществления изобретения отсутствует необходимость в закреплении выступов на одном или более конусах в стопке один за другим.

Предпочтительно, между поверхностями последовательно установленных конусов создается, по существу, постоянный интервал, обеспечиваемый выступами, поддерживающими каждый последующий конус в стопке конусов. Интервал между последовательно установленными конусами может изменяться от примерно 1 мм до примерно 2,5 см.

Указанное расположение поверхностей осаждения, обеспечиваемое последовательными конусами в стопках конусов, каждый из которых поддерживается смежным конусом и не связан с ним постоянно, является особенно предпочтительным в осадительных системах, в которых осадительное устройство для частиц и его конические поверхности требуют регулярного или очень частого обслуживания, такого как разборка и очистка внутренних конических поверхностей осаждения в осадительном устройстве.

Указанное расположение первой стопки конусов и необязательной второй стопки конусов значительно повышает эффективность осаждения частиц из объема жидкости в процессе прохождения жидкости через осадительное устройство. По мере того, как жидкость, содержащая частицы, например клетки, проходит через вставленные один в другой конусы осадительного устройства согласно настоящему изобретению, более крупные частицы (например, живые и продуктивные клетки) оседают на поверхностях конусов. Клетки, скользящие вниз с верхнего или первого в стопке конуса, перемещаются вниз по коническим поверхностям к наружным краям конусов и падают вертикально вниз в коническую секцию корпуса. Кроме того, клетки, скользящие по нижней или второй стопке конусов, скользят вниз по коническим поверхностям к центральному отверстию конусов и падают вертикально вниз к центральному отверстию корпуса.

Указанные устройства можно масштабировать в большую или меньшую сторону в соответствии с потребностями разделения в различных отраслях или сферах применения или габаритами, поскольку осаждающая поверхность увеличивается или уменьшается в трех измерениях, по сравнению с более типичным одномерным или двухмерным масштабированием известных осадительных устройств.

Масштабирование устройств согласно настоящему изобретению может быть выполнено всего лишь за счет увеличения диаметра корпуса (и, соответственно, увеличения диаметра конусов, образующих внутри корпуса стопку) и/или увеличения высоты корпуса (что позволяет увеличить количество конусов в одной стопке, либо в обеих стопках, а именно, в первой стопке и во второй стопке). Эффективная расчетная площадь осаждения клеток увеличивается пропорционально квадрату диаметра корпуса и пропорционально высоте внутренних цилиндров. Эффективная площадь осаждения компактного осадительного устройства согласно настоящему изобретению масштабируется пропорционально кубу диаметра корпуса (при условии, что высота внутреннего пространства осадительного устройства также увеличивается пропорционально) или эквивалентно объему корпуса. Такое трехмерное или объемное увеличение эффективной площади осаждения позволяет создать осадительное устройство согласно настоящему изобретению, который будет более компактным, по сравнению с существующими наклонными осадительными устройствами.

Радиальный интервал в кольцевых областях между разными цилиндрами или конусами может составлять от около 1 см до около 10 см, при этом оптимальный интервал составляет около 2,5 см. Небольшой зазор около 1 мм между наклонной поверхностью осаждения конуса и внутренней поверхностью смежного конуса обеспечивает полезное пространство для осаждаемых частиц (например, клеток), позволяющее им скользить вниз по поверхности конусов и выходить сбоку конусов, а не скользить к основанию конуса. Выходящие сбоку конуса клетки осаждаются вертикально вдоль внутренней поверхности каждого цилиндра. Когда осаждающиеся клетки достигают конической поверхности в нижней части каждого цилиндра, они скользят вниз по наклонной поверхности конуса к центральному отверстию в нижней части корпуса циклона. Преимущество увеличения скорости жидкости при спуске по наклонной конической поверхности к центральному отверстию заключается в том, что все большее количество оседающих клеток, скользящих по конусу, уносится вниз к центральному отверстию, вместо того чтобы накапливаться из-за более высоких скоростей жидкости.

Угол наклона поверхностей осаждения может быть постоянным, а может быть непостоянным и составлять от примерно 15° до примерно 75° относительно вертикали. Если частицы являются более липкими частицами (в частности, клетками млекопитающих), может быть предусмотрен угол наклона близкий к вертикальному (то есть около 15° относительно вертикали). Если частицы представляют собой нелипкие твердые частицы катализатора, может быть предусмотрен угол наклона более далекий от вертикального (например, около 75° относительно вертикали). Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, конические поверхности имеют дугообразное продольное сечение, в результате чего угол наклона изменяется относительно продольной оси от примерно 10° до примерно 80° или от примерно 15° до примерно 75°.

Все осадительные устройства согласно настоящему изобретению могут содержать укупорочное средство или крышку, расположенную поверх по меньшей мере одного участка корпуса на конце корпуса, противоположном первому отверстию. В указанных вариантах осуществления изобретения укупорочное средство или крышка может также иметь выпускное отверстие или порт для удаления жидкостей или ввода жидкостей в осадительное устройство. Отверстие и дополнительные порты или выпускные отверстия корпуса и/или крышки находятся в жидкостной связи с наружной и внутренней частью корпуса, благодаря чему обеспечивается прохождение жидкостей в и/или из корпуса осадительного устройства, при этом указанное отверстие или впускной/выпускной каналы, обеспечивающие прохождение жидкости в корпус и из корпуса, могут содержать клапаны или другие механизмы, которые можно открывать или закрывать для остановки или ограничения потока жидкостей в или из осадительного устройства согласно настоящему изобретению.

Устройства для осаждения частиц согласно настоящему изобретению могут содержать корпус и по меньшей мере одну вертикальную трубу, расположенную внутри корпуса, причем один конец по меньшей мере одной вертикальной трубы соединен с поверхностью конуса, сужающего к первому отверстию в корпусе циклона. В корпусе имеется по меньшей мере одно дополнительное отверстие, по существу, напротив первого отверстия.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, угол наклона конических поверхностей составляет примерно 45° относительно вертикали или может изменяться от примерно 15° до примерно 75° относительно вертикали. Если требуется, конические поверхности и/или верхняя часть или нижняя часть корпуса могут быть вогнутыми либо выгнутыми, в связи с чем угол наклона изменяется от примерно 15° до примерно 75° относительно вертикали.

Ширина кольцевого канала, образованного между смежными вертикальными трубами, составляет от около 1 мм до около 50 мм. Осадительное устройство может содержать от 2 до 30 вертикальных труб.

Осадительное устройство может содержать крышку, расположенную поверх по меньшей мере одного участка корпуса на конце корпуса, противоположном первому отверстию. Корпус может содержать по меньшей мере одно дополнительное отверстие, которое может открываться со стороны корпуса, тангенциальной по меньшей мере к одной вертикальной трубе, и находится в жидкостной связи с наружной и внутренней частью корпуса.

Для сбора жидкости в укупорочном средстве может быть выполнено выпускное отверстие, которое находится в жидкостной связи с наружной и внутренней частью корпуса.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к устройству для осаждения частиц, который может иметь, но не ограничиваясь этим, корпус, содержащий одно или несколько из: (1) первого конического участка; (2) второго конического участка; (3) цилиндрического участка, расположенного между первым коническим участком и вторым коническим участком; (4) по меньшей мере, одного впускного отверстия для ввода жидкости в корпус; (5) первого выпускного порта; (6) второго выпускного порта; и (7) первой стопки конусов, расположенную внутри корпуса. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, первый выпускной порт связан с первым коническим участком, а второй выпускной порт связан со вторым коническим участком. Если требуется, жидкость, которая вводится в корпус, может быть жидкой суспензией, содержащей частицы. Частицы могут иметь множество размеров.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, первый выпускной порт может быть предназначен для сбора осветленной жидкости. Осветленная жидкость может содержать первую подгруппу частиц. Первая подгруппа частиц может включать клеточный дебрис, мертвые клетки и тому подобное. Если требуется, первый выпускной порт может быть образован в укупорочном устройстве корпуса. Первый выпускной порт находится в жидкостной связи с наружной и внутренней частью корпуса.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, второй выпускной порт, если требуется, может использоваться для сбора концентрированной жидкости. Концентрированная жидкость может содержать вторую подгруппу частиц, таких как живые клетки. Как правило, частицы второй подгруппы обычно больше, чем частицы первой подгруппы. Масса каждой частицы второй подгруппы обычно больше массы частиц первой подгруппы. Второй выпускной порт находится в жидкостной связи с наружной и внутренней частью корпуса.

Первая стопка конусов занимает по меньшей мере некоторую часть первого конического участка. Если требуется, первая стопка конусов занимает по меньшей мере некоторую часть цилиндрического участка. Если требуется, один или несколько конусов в первой стопке конусов имеют усеченную вершину, ориентированную к первому выпускному порту. Дополнительно или альтернативно, по меньшей мере, один конус в первой стопке конусов не имеет центрального отверстия. Согласно другому варианту осуществления изобретения, каждый конус в первой стопке конусов имеет открытое основание, ориентированное ко второму выпускному порту. Конусы в первой стопке конусов обычно центрированы в корпусе, например, конусы в первой стопке конусов могут быть центрированы вокруг, по существу, центрального отверстия, образованного в усеченной вершине одного или нескольких конусов.

Если требуется, корпус может, к тому же, вмещать вторую стопку конусов. Вторая стопка конусов может занимать по меньшей мере некоторую часть второго конического участка и может занимать по меньшей мере некоторую часть цилиндрического участка. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, вторая стопка конусов ориентирована противоположно первой стопке конусов.

Если требуется, угол наклона поверхности конуса в первой стопке конусов может изменяться от примерно 15° до примерно 75° относительно вертикали. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, поверхность конуса является выгнутой или вогнутой, в результате чего поперечное сечение поверхности конуса имеет вид дугообразной линии. Согласно другому варианту осуществления изобретения, угол наклона поверхности конуса может быть постоянным и может иметь любую величину от 15° до 75° относительно вертикали. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, угол наклона поверхности конуса составляет около 45°.

Согласно другому варианту осуществления изобретения, каждый конус во второй стопке конусов имеет усеченную вершину, ориентированную ко второму выпускному порту. Каждый конус во второй стопке конусов, к тому же, может иметь открытое основание, ориентированное к первому выпускному порту. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конусы во второй стопке конусов, как правило, центрированы в корпусе. Согласно другому варианту осуществления изобретения, конусы во второй стопке конусов, как правило, центрированы приблизительно вокруг центрального отверстия, образованного в усеченной вершине одного или нескольких конусов.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, угол наклона поверхности конуса во второй стопке конусов составляет от примерно 15° до примерно 75° относительно вертикали. Угол наклона поверхности конусов во второй стопке конусов может составлять примерно 45°.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конусы в первой стопке конусов расположены, по существу, с одинаковым интервалом. Конусы во второй стопке конусов также могут быть расположены, по существу, с одинаковым интервалом. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, интервал между конусами в первой стопке конусов отличается от интервала между конусами во второй стопке конусов.

По меньшей мере одно впускное отверстие выполнено в виде впускного порта, находящегося в жидкостной связи с наружной и внутренней частью корпуса. По меньшей мере, одно впускное отверстие может быть связано по меньшей мере с одним из участков корпуса, а именно, с первым коническим участком, вторым коническим участком или цилиндрическим участком. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, по меньшей мере первое из впускных отверстий связано с цилиндрическим участком корпуса. Согласно другому варианту осуществления изобретения, по меньшей мере второе из впускных отверстий связано с одним из конических участков, а именно, с первым коническим участком или вторым коническим участком. Согласно еще одному из вариантов осуществления изобретения, второе впускное отверстие связано со вторым коническим участком. Согласно другому варианту осуществления изобретения, по меньшей мере одно впускное отверстие выполнено с возможностью сопряжения с одноразовым мешком биореактора. Одноразовый мешок биореактора может быть изготовлен из пластика.

Устройства для осаждения частиц согласно настоящему изобретению конструктивно могут иметь корпус, содержащий: (а) первый конический участок; (б) второй конический участок; (c) цилиндрический участок, расположенный между первым коническим участком и вторым коническим участком; (d) по меньшей мере, одно впускное отверстие для ввода жидкой суспензии в корпус; (e) первый выпускной порт для сбора осветленной жидкости; (f) второй выпускной порт для выпуска концентрированной жидкой суспензии; и (g) первую стопку конусов, размещенную внутри корпуса. В указанном устройстве первая стопка конусов может занимать по меньшей мере некоторую часть первого конического участка, а также может занимать по меньшей мере некоторую часть цилиндрического участка. Каждый конус в первой стопке конусов имеет: (i) усеченную вершину, расположенную в отдалении от второго конического участка и (ii) открытое основание, расположенное рядом со вторым коническим участком. Если требуется, конусы в первой стопке конусов центрируются вокруг, по существу, центрального отверстия, образованного в усеченной вершине каждого конуса в первой стопке.

Угол наклона поверхности конуса в первой стопке может изменяться от примерно 15° до примерно 75° относительно вертикали. Например, поперечное сечение поверхности конуса имеет вид дугообразной линии. Указанные конусы могут иметь выгнутую или вогнутую поверхность. Согласно другим вариантам осуществления изобретения угол наклона поверхности конусов является постоянным и может составлять, например, около 45°. Интервал между конусами в первой стопке конусов является, по существу, одинаковым.

Угол наклона поверхности конуса во второй стопке конусов может изменяться от примерно 15° до примерно 75° относительно вертикали. Согласно другому варианту осуществления изобретения, угол наклона поверхности конусов во второй стопке конусов составляет около 45°.

Другим аспектом настоящего изобретения является устройство для осаждения частиц, содержащий: (A) корпус; (B) по меньшей мере две конические пластины, расположенные внутри корпуса; (C) первое отверстие в корпусе; и (D) второе отверстие в корпусе. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, по меньшей мере две конические пластины уложены в стопку. Предпочтительно, корпус вмещает примерно от 3 до примерно 30 конических пластин. По меньшей мере, две конические пластины могут быть расположены, по существу, с постоянным интервалом. Если требуется, ширина канала, образованного между смежными поверхностями по меньшей мере двух конических пластин, составляет примерно от 1 мм до примерно 50 мм. Три или более опор могут удерживать каждую из конических пластин в стопке.

Каждая из конических пластин может занимать позицию, при которой усеченная вершина приближена к первому отверстию, а открытое основание отдалено от первого отверстия. Конические пластины, как правило, могут быть центрированы в корпусе и находятся, по существу, в вертикальном положении внутри корпуса. Угол наклона поверхности по меньшей мере каждой из двух конических пластин может изменяться примерно от 15° до примерно 75° относительно вертикали. Конические пластины могут иметь вогнутую форму относительно продольной оси. Конические пластины могут иметь выгнутую форму относительно продольной оси. Соответственно, поперечное сечение конической пластины может иметь вид дугообразной линии. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конические пластины имеют форму, определяемую по меньшей мере одним радиусом кривизны.

В указанных устройствах корпус содержит цилиндрический участок и конический участок. Первое отверстие может быть связано с коническим участком. Если требуется, второе отверстие может быть связано с цилиндрическим участком. Второе отверстие может быть расположено в боковой стенке цилиндрического участка. Второе отверстие может быть расположено в крышке, связанной с открытым концом цилиндрического участка. Второе отверстие может быть расположено в коническом участке.

Другим аспектом настоящего изобретения является осадительное устройство, которое содержит, но не ограничиваясь этим: (1) верхний корпус, имеющий: первый конический участок; первый цилиндрический участок; и по меньшей мере один порт; (2) нижний корпус, соединяемый с верхним корпусом и имеющий: второй конический участок; второй цилиндрический участок; и по меньшей мере один порт; (3) стопку конусов, расположенную внутри осадительного устройства, причем каждый конус в стопке конусов имеет малое отверстие, ориентированное к первому коническому участку, и большое отверстие, ориентированное ко второму коническому участку, причем первая стопка конусов, как правило, центрирована вокруг продольной оси осадительного устройства. Если требуется, верхний корпус дополнительно содержит первый фланец, приспособленный для сопряжения со вторым фланцем нижнего корпуса. Верхний корпус может быть неразъемно соединен с нижним корпусом.

В указанных устройствах поверхность конуса в первой стопке конусов расположена под углом приблизительно от 15° до приблизительно 85° относительно продольной оси. Если требуется, первый и второй конический участок вогнуты по направлению к продольной оси. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, продольное сечение корпуса конуса имеет вид дугообразной линии.

Дополнительно или в качестве альтернативы, первый конический участок вогнут к продольной оси, а второй конический участок выгнут наружу от продольной оси. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, осадительное устройство вмещает вторую стопку конусов, расположенную внутри осадительного устройства. Согласно другому варианту осуществления изобретения, каждый конус во второй стопке конусов имеет малое отверстие, ориентированное от первого конического участка, и большое отверстие, ориентированное к первому коническому участку. Если требуется, конусы во второй стопке конусов имеют корпус, который выгнут в сторону от продольной оси.

В любом из осадительных устройств согласно настоящему изобретению корпус и/или конусы и/или любые другие элементы устройства могут быть изготовлены из металла или пластика. Пластический материал может представлять собой один или несколько из перечисленных: полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, полистирол и т.п. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, осадительное устройство полностью изготовлен из пластика. Согласно другому варианту осуществления изобретения, по меньшей мере один конус в стопке конусов изготовлен по меньшей мере частично из нержавеющей стали. Металлические поверхности (особенно из нержавеющей стали) могут быть подвергнуты электрополировке для получения гладкой поверхности. Кроме того, в любом из осадительных устройств согласно настоящему изобретению на поверхность корпуса и/или конусов и/или любых других элементов устройства может быть нанесено покрытие, содержащее один или несколько нелипких материалов, являющихся пластиками, таких как тефлон или силикон.

В любом из осадительных устройств согласно настоящему изобретению корпус может, если требуется, содержать рубашку для текучей среды, связанную с одним или несколькими из перечисленных: первым коническим участком, вторым коническим участком и/или цилиндрическим участком. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, рубашка для текучей среды связана со вторым коническим участком и цилиндрическим участком. Рубашка для текучей среды может иметь по меньшей мере один порт для приема текучей среды с заданной температурой. Если требуется, рубашка для текучей среды может иметь второй порт для выпуска текучей среды из рубашки. Вода или другая текучая среда, подаваемая в рубашку для текучей среды, обеспечивает поддержание в требуемом диапазоне температуры корпуса циклона и всего содержимого. На наружной стенке корпуса циклона могут быть предусмотрены порты, обеспечивающие доступ к рубашке. Порты могут функционировать как впускные и выпускные порты для циркулирующей в рубашке охлаждающей или нагревающей текучей среды.

Любой из осадительных устройств согласно настоящему изобретению может содержать один или несколько датчиков для контроля физических условий внутри осадительного устройства. Дополнительно или альтернативно может быть предусмотрен по меньшей мере один датчик для мониторинга условий внутри трубопровода, соединенного с осадительными устройствами согласно настоящему изобретению. Трубопровод может быть возвратным трубопроводом, соединенным с нижним выпускным портом осадительного устройства.

Указанные датчики могут быть предназначены для определения одного или нескольких из перечисленных параметров: pH, растворенного кислорода (DO), глюкозы, температуры и CO₂ (включая растворенный CO₂, известный как «парциальный» CO₂) внутри корпуса или трубопровода. Датчики могут включать один или несколько зондов, контактирующих с раствором внутри корпуса или трубопровода. Зонд может быть закреплен на внутренней поверхности осадительного устройства или трубопровода. Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения по меньшей мере один датчик и/или зонд может быть расположен внутри нижнего конического участка осадительного устройства на некотором расстоянии от одного или нескольких из перечисленных: бокового порта и нижнего порта.

Указанные зонды могут передавать данные, не вступая в контакт со считывателем. Таким образом, зонд может определять условия внутри осадительного устройства и/или трубопровода и передавать данные считывателю, расположенному за пределами осадительного устройства. Один или несколько зондов могут являться флуоресцентными зондами. Посредством зонда могут быть определены внутри корпуса циклона один или несколько из перечисленных параметров: pH, DO, глюкоза, температура и pCO₂. Зонд может быть закреплен на некотором участке корпуса. Указанный участок корпуса может пропускать свет, исходящий от флуоресцентного зонда. Как описано выше, указанный участок корпуса может быть прозрачным или полупрозрачным. Считыватель (или измеритель) принимает свет от флуоресцентного зонда. Считыватель может содержать оптическое волокно, которое собирает свет, передаваемый флуоресцентным зондом. Подходящие зонды и считыватели предлагаются рядом поставщиков, включая PreSens Precision Sensing GmbH. Установленный в осадительном устройстве зонд другой конструкции может передавать данные на считыватель, расположенный за пределами осадительного устройства частиц, с помощью сетевого соединения. Например, зонд может связываться со считывателем посредством WiFi, Bluetooth или посредством любого другого вида беспроводной связи.

Согласно настоящему изобретению, на основании данных, полученных от указанного датчика(ов), в процессе работы осадительных устройств корректируется температура текучей среды внутри рубашки для текучей среды. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, на основании данных, полученных от указанных датчиков, в процессе работы устройства для осаждения частиц корректируется один или несколько из перечисленных параметров: pH, температура, концентрация растворенного кислорода, растворенного диоксида углерода и питательной среды.

Следующий аспект настоящего изобретения относится к способам осаждения частиц или клеток в жидкой суспензии. Способ согласно изобретению включает, но не ограничивается этим, (i) введение жидкой суспензии частиц в осадительное устройство согласно настоящему изобретению; (ii) сбор частиц через первое отверстие в корпусе осадительного устройства; и (iii) сбор жидкости через другое отверстие в осадительном устройстве. Для сбора жидкости может быть использовано отверстие в укупорочном устройстве, которое покрывает по меньшей мере один участок на конце корпуса, противоположном первому отверстию. Для сбора жидкости может быть использовано по меньшей мере через одно дополнительное отверстие в корпусе, причем указанное отверстие может открываться сбоку корпуса. Согласно указанным способам, на этапе введения жидкой суспензии жидкая суспензия из пластикового мешка биореактора может направляться в устройство для осаждения частиц.

Согласно одному из взаимосвязанных аспектов настоящего изобретения, предлагается способ осаждения частиц в суспензии. Способ включает один или несколько из перечисленных этапов: (а) введение жидкой суспензии частиц в осадительное устройство, которое содержит: (i) верхний корпус, имеющий первый конический участок, первый цилиндрический участок и по меньшей мере один порт; (ii) нижний корпус, соединяемый с верхним корпусом и имеющий второй конический участок, второй цилиндрический участок и по меньшей мере один порт; (iii) стопку конусов, расположенную внутри осадительного устройства, причем каждый конус в стопке конусов имеет малое отверстие, ориентированное к первому коническому участку, и имеет корпус, который вогнут к продольной оси осадительного устройства; (b) сбор осветленной жидкости по меньшей мере через один порт верхнего корпуса; и (c) сбор концентрированной жидкой суспензии по меньшей мере через один порт нижнего корпуса.

Согласно указанным способам, осветленная жидкость может включать первое подмножество частиц суспензии. Первое подмножество частиц может содержать клеточный дебрис, мертвые клетки и т.п.

Концентрированная жидкость может также включать второе подмножество частиц суспензии, при этом второе подмножество частиц может содержать живые клетки. Размер частиц второго подмножества может быть больше размера частиц первого подмножества. Масса каждой частицы второго подмножества может быть больше массы каждой частицы первого подмножества.

Согласно указанным способам, вторая стопка конусов, если требуется, может быть размещена внутри осадительного устройства. Указанные конусы, образующие вторую стопку конусов, могут иметь корпус, который выгнут наружу от продольной оси осадительного устройства.

В любом из указанных способов жидкая суспензия может включать по меньшей мере одно из перечисленных: суспензию рекомбинантных клеток, спиртовую ферментацию, раствор осаждающегося белка, водную смесь, содержащую клетки, органический слой, содержащий экстрагированные органические продукты, продуцируемые клетками, суспензию твердых частиц катализатора в жидкой смеси, содержащей в основном продукты и обедненные реагенты, суспензию микросфер, покрытых молекулами белка А, которые могут связывать моноклональные антитела из бульона клеточной культуры, суспензию гранул-микроносителей с выращиваемыми клетками млекопитающих, городские сточные воды и промышленные сточные воды. В указанных способах жидкая суспензия может содержать по меньшей мере одно из перечисленных: эукариотические клетки, клетки млекопитающих, бактериальные клетки, дрожжевые клетки, клетки растений, клетки водорослей, стволовые клетки человека или дифференцированные клетки человека, например, предшественники эритроцитов и зрелые эритроциты, и/или клетки насекомых. В указанных способах жидкая суспензия может содержать по меньшей мере одно из перечисленных: клетки водорослей, производящие биодизель, рекомбинантные клетки млекопитающих и/или мышей, метаболически сконструированные дрожжевые клетки, продуцирующие секретируемые органические продукты, и пивные дрожжи. В указанных способах жидкая суспензия может содержать рекомбинантные микробные клетки, выбранные из перечисленных: Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger, Escherichia coli и Bacillus subtilis.

В указанных способах жидкость, собранная из осадительного устройства, может содержать по меньшей мере одно из перечисленных: биологические молекулы, органические или неорганические соединения, химические реагенты и продукты химической реакции. В указанных способах жидкость, собранная из осадительного устройства, содержит по меньшей мере одно из перечисленных: углеводороды, полипептиды, белки, спирты, жирные кислоты, гормоны, углеводы, антитела, антитела, терпены, изопреноиды, биодизель, полипреноиды и пиво. В указанных способах жидкость, собранная из осадительного устройства, содержит по меньшей мере одно из перечисленных: компоненты биодизеля, секретируемые терапевтические белки или гормоны, такие как инсулин или его аналоги, антитела, моноклональные антитела, факторы роста, субъединичные вакцины, вирусы, вирусоподобные частицы, колониестимулирующие факторы, эритропоэтин (ЭПО), секретируемые ароматические или вкусо-ароматические соединения, включая гераниол, мирцен, бразцеин (белковый подсластитель) и т.д.

В указанных способах осадительные устройства согласно настоящему изобретению могут функционировать как автономный перфузионный биореактор для выращивания in vitro клеток млекопитающих, таких как стволовые клетки и CAR-T-клетки, для аутологической клеточной терапии. В указанных примерах осадительных устройств согласно настоящему изобретению среда, вводимая для культивирования клеток и не содержащая сыворотки или животного белка, может непрерывно подаваться в осадительное устройство/перфузионный биореактор через нижний порт и/или боковой порт. Также может подаваться контролируемая смесь O₂, CO₂ и N₂ для регулирования pH и DO супернатанта клеточной культуры внутри осадительного устройства/биореактора. По окончании выращивания клеток in vitro концентрированные осевшие клетки, которые скапливаются на дне, можно собирать через нижний порт.

Выше приведено упрощенное краткое изложение изобретения, которое предназначено для облегчения понимания некоторых особенностей осадительных устройств согласно настоящему изобретению. Указанное краткое изложение не следует рассматривать как исчерпывающий обзор изобретения и его различных аспектов, вариантов осуществления и конфигураций. Оно не предназначено ни для определения ключевых или критических элементов изобретения, ни для очерчивания объема изобретения, а для представления избранных концепций изобретения в упрощенной форме в качестве введения к более подробному описанию, представленному ниже. Следует принять во внимание, что другие аспекты, варианты осуществления и конфигурации изобретения возможны с использованием, по отдельности или в комбинации одного или нескольких признаков, изложенных выше или подробно описываемых ниже. Следует принять во внимание, что другие варианты осуществления изобретения возможны с использованием, по отдельности или в комбинации одной или нескольких функций, изложенных выше или описываемых ниже. Например, предполагается, что различные функции и устройства, показанные и/или описанные в отношении одного варианта осуществления изобретения, могут быть объединены или заменены функциями или устройствами других вариантов осуществления изобретения, независимо от того, показана или описана такая комбинация или замена конкретно в настоящем документе. Дополнительные аспекты настоящего изобретения станут более очевидными из подробного описания со ссылкой на прилагаемые чертежи.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - вид спереди в перспективе одной из конфигураций осадительного устройства согласно настоящему изобретению.

Фиг. 2 - вид спереди в перспективе с частичным разрезом осадительного устройства, представленного на фиг. 1, причем внутри осадительного устройства показана стопка выпуклых конусов.

Фиг. 3 - другой вид спереди в перспективе с частичным разрезом осадительного устройства, показанного на фиг. 2.

Фиг. 4 - вид спереди в перспективе в разобранном виде осадительного устройства, представленного на фиг. 1.

Фиг. 5A - вид в перспективе корпуса осадительного устройства, представленного на фиг. 1.

Фиг. 5B - вид сверху корпуса, показанного на фиг. 5A.

Фиг. 5C - вид сбоку корпуса, показанного на фиг. 5A.

Фиг. 6 - вид сверху осадительного устройства, представленного на фиг. 1.

Фиг. 7 - вид спереди в разрезе осадительного устройства по линии 7-7 (фиг. 6) с удаленной стопкой конусов для упрощения чертежа.

Фиг. 8A - детализированный вид спереди в разрезе участка, показанного на фиг. 7.

Фиг. 8B - еще один детализированный вид спереди в разрезе участка, показанного на фиг. 7.

Фиг. 9А - вид сверху конуса осадительного устройства, показанного на фиг. 1.

Фиг. 9В - вид снизу конуса осадительного устройства, показанного на фиг. 1.

Фиг. 9С - вид сбоку конуса осадительного устройства, показанного на фиг. 1.

Фиг. 9D - вид сбоку в разрезе конуса осадительного устройства по линии 9D-9D (фиг. 9A).

Фиг.10 - вид спереди в перспективе еще одной конфигурации осадительного устройства согласно настоящему изобретению.

Фиг.11 - вид спереди с частичном разрезом осадительного устройства, представленного на фиг.10.

Фиг. 12 - еще один вид спереди в перспективе с частичным разрезом осадительного устройства, представленного на фиг. 10, причем внутри осадительного устройства показана верхняя стопка конусов и нижняя стопка конусов.

Фиг. 13 - вид в перспективе с частичным разрезом нижнего корпуса осадительного устройства, представленного на фиг. 10, причем показана нижняя стопка конусов.

Фиг. 14 и 15 - виды нижних конусов осадительного устройства, представленного на фиг.10.

Фиг. 16 - вид спереди в перспективе другой конфигурации осадительного устройства согласно настоящему изобретению, причем внутренние элементы осадительного устройства показаны пунктирными линиями.

Фиг. 17 - вид спереди в разрезе осадительного устройства, представленного на фиг. 16.

Фиг. 18 - вид спереди в перспективе в разобранном виде осадительного устройства, представленного на фиг. 16, причем показан дополнительный второй набор конусов, приспособленный для размещения внутри осадительного устройства.

Фиг. 19A и 19B - виды в перспективе конусов согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, конфигурированных для использования в осадительном устройстве, представленном на фиг. 16.

Фиг. 20А и 20В - виды в перспективе необязательной трубки, используемой в осадительных устройствах согласно настоящему изобретению.

Фиг. 21A и 21B - виды в перспективе диффузора согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, конфигурированного для использования в осадительных устройствах.

Фиг. 22 - вид спереди в перспективе другого осадительного устройства согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, причем некоторые внутренние элементы осадительного устройства показаны пунктирными линиями.

Фиг. 23 - вид спереди в разрезе осадительного устройства, представленного на фиг.22.

Фиг. 24 - схема подсоединения компактного осадительного устройства клеток/частиц согласно настоящему изобретению к модульному биореактору.

Фиг. 25 - график, иллюстрирующий результаты культивирования в перфузионном биореакторе дрожжевых клеток P. pastoris с полностью заполненным компактным устройством для осаждения клеток в качестве устройства для удержания клеток, которое смонтировано, как показано на фиг. 24.

Фиг. 26 - график распределения частиц по размерам в образцах из биореактора и из вытекающей из осадительного устройства жидкости (биореактор и осадительное устройство соединены, как показано на фиг. 24).

Подробное описание изобретения

Термин, обозначающий элемент в единственном числе, следует интерпретировать как относящийся к одному или нескольким из указанных элементов. Таким образом, термины «один», «один или несколько» и «по меньшей мере один» в описании могут использоваться взаимозаменяемо. Термины «содержащий», «включающий» и «имеющий» могут использоваться взаимозаменяемо.

Словосочетания «по меньшей мере один», «один или несколько» и «и/или» являются выражениями открытого типа и при использовании являются как конъюнктивными, так и дизъюнктивными. Например, каждое из выражений «по меньшей мере один из A, B и C», «по меньшей мере один из A, B или C», «один или несколько из A, B и C», «один или несколько из A, B или C» и «A, B и/или C» означает только A, только B, только C, A и B вместе, A и C вместе, B и C вместе или A, B и C вместе.

Переходный термин «содержащий» является синонимом «включающий», «имеющий» или «характеризующийся», является инклюзивным или открытым и не исключает наличия дополнительных, не перечисленных элементов или этапов способа.

Переходная фраза «состоящий из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в формуле изобретения, но не исключает наличия дополнительных компонентов или стадий, не имеющих отношения к изобретению, например, связанных обычно с примесями.

Переходная фраза «состоящий по существу из» ограничивает объем формулы изобретения указанными материалами или этапами, а также теми, которые существенно не влияют на основную или новую характеристику(и) заявленного изобретения.

На фиг. 1 представлен осадительное устройство 300 согласно настоящему изобретению, конфигурация которого особенно эффективна для осаждения частиц или клеток. Осадительное устройство 300, как правило, имеет верхний корпус 301А и нижний корпус 301В. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, верхний корпус 301A и нижний корпус 301B, по существу, идентичны. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, корпуса 301A, 301B являются взаимозаменяемыми.

Как показано на фиг. 2-9, корпуса 301A, 301B обычно включают конический участок 303A, 303B, цилиндрический участок 308A, 308B, первый порт 353A, 353B и второй порт 354A, 354B.

Если требуется, первый порт 353 может быть концентрически выровнен с продольной осью корпуса 301. Первый порт 353 может использоваться как впускное, так и выпускное отверстие. В иллюстративных вариантах осуществления изобретения второй порт 354 продолжается через конический участок 303. Второй порт 354 также может использоваться для ввода или удаления жидкостей, газов и твердых частиц из осадительного устройства 300. Если требуется, второй порт 354 может быть выровнен параллельно продольной оси 350 осадительного устройства клеток. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, второй порт 354 может продолжаться через цилиндрический участок 308. Возможны другие конфигурации первого и второго портов 353, 354. Корпус 301 может иметь более двух портов. Порты 353, 354 приспособлены для соединения с трубопроводом.

Трубопровод может быть соединен с любым из компактных осадительных устройств клеток согласно настоящему изобретению. Трубопровод может иметь подходящий диаметр или иным образом может быть приспособлен для соединения с любым портом осадительного устройства согласно вариантам осуществления настоящего изобретения. Трубопровод, к тому же, может содержать по меньшей мере один датчик, расположенный во внутренней полой части. Датчики могут контактировать с текучей средой и/или частицами внутри трубопровода. Если требуется, датчики могут быть смонтированы на внутренней поверхности трубопровода, хотя возможны и другие конфигурации. Датчики предназначены осуществлять мониторинг в трубопроводе одного или нескольких из перечисленных параметров: pH, DO, глюкозы, температуры и CO₂ (включая растворенный или «парциальный» CO₂). Если требуется, один или несколько датчиков могут содержать флуоресцентный зонд, излучающий свет, который изменяется в зависимости от состояния, определяемого зондом. Свет может улавливаться считывателем или измерителем. Если требуется, может применяться необязательный оптоволоконный кабель, собирающий и передающий свет на измеритель. Измеритель может фиксировать или отображать уровень по меньшей мере одного из перечисленных параметров: pH, DO, глюкозы, температуры и CO₂, в соответствии с данными флуоресцентных зондов. Трубопровод может быть изготовлен из прозрачного или по меньшей мере полупрозрачного материала. Таким образом, трубопровод может пропускать свет, генерируемый датчиком. В качестве альтернативы, по меньшей мере, некоторый участок трубопровода является прозрачным или полупрозрачным, формируя окно. Следовательно, свет, генерируемый датчиком, может проникать через участок в виде окна и улавливаться измерителем.

Конусы 309 могут быть позиционированы внутри осадительного устройства 300. Как показано на фиг. 2 и 3, конусы 309 могут образовывать стопку с открытой вершиной 342, ориентированной к первому отверстию 353A верхнего корпуса 301A, и основанием или большим отверстием 346, ориентированным к первому отверстию 353A нижнего корпуса 301B. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, стопка, расположенная внутри осадительного устройства 300, может содержать от трех до двадцати пяти конусов 309. Количество конусов, размещенных в осадительном устройстве 300, собранном, как показано на фиг. 4, зависит от размера корпусов 301.

Элементы осадительного устройства 300, такие как корпуса 301 и конусы 309, могут быть изготовлены из пластика для одноразового применения. В качестве альтернативы, один или несколько из перечисленных: корпусов 301 и конусов 309 могут быть изготовлены из металла, например из нержавеющей стали, либо из стекла. Поверхности конусов 309 и внутренние поверхности корпусов 301 могут быть целиком или частично покрыты одним или несколькими нелипкими видами пластика, такими как тефлон, силикон и подобные материалы, известные специалистам в данной области техники. Дополнительно или в качестве альтернативы поверхности (особенно из нержавеющей стали) могут быть подвергнуты электрополировке для получения гладкой поверхности. Указанные осадительные устройства можно легко масштабировать до любого требуемого размера.

Корпуса 301, к тому же, могут содержать рубашку для текучей среды (не показана). В рабочем режиме вода или другая текучая среда, подаваемая в рубашку для текучей среды через один или несколько портов, обеспечивает поддержание в требуемом диапазоне температуры корпуса 301 и содержимого осадительного устройства 300.

Как показано фиг. 5A-5C, предусмотрено множество разделителей 315, продолжающихся от внутренней поверхности корпусов 301 во внутреннее пространство. Разделители 315 предназначены предотвращать прилегание стопки конусов 309, размещенных внутри осадительного устройства 300, к внутренней поверхности корпусов 301A, 301B. Если требуется, разделители 315 могут быть приблизительно параллельны продольной оси 350 осадительного устройства 300. Возможны другие конфигурации разделителей 315. Разделители 315 могут иметь, по существу, тонкое поперечное сечение, чтобы не создавались или минимизировались помехи движению или течению жидкости и взвешенных частиц внутри осадительного устройства 300.

Как показано на фиг. 7, разделители 315 могут включать множество первых разделителей 315A, вторых разделителей 315B и третьих разделителей 315C. Как в целом проиллюстрировано, согласно одному из вариантов осуществления изобретения каждый из первых разделителей 315A продолжается по меньшей мере вдоль некоторой части внутренней поверхности цилиндрического участка 308. Вторые разделители 315B продолжаются от внутренней поверхности конического участка 303 вблизи цилиндрического участка 308. Третьи разделители 315C могут быть отдалены от вторых разделителей 315B. В частности, согласно одному из вариантов осуществления изобретения, третьи разделители 315C расположены ближе к первому порту 353, чем к цилиндрическому участку 303.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, верхний корпус 301A и нижний корпус 301B прочно соединены. Например, верхний и нижний корпуса 301 могут быть склеены, термически сварены, либо сварены с помощью ультразвуковой сварки.

В качестве альтернативы, и как показано на фиг. 1, фланец 318, как правило, выступает из цилиндрического участка 308 корпусов 301. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, фланец продолжается приблизительно перпендикулярно продольной оси 350. Дополнительный фланец 318A верхнего корпуса 301A приспособлен для соединения с фланцем 318B нижнего корпуса 301B. Фланцы 318A, 318B могут, если требуется, иметь выступы 320, которые лучше всего показаны на фиг. 5A. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, на свободном конце каждого выступа 320 сформирован фиксатор или крючок 322.

Также на фланце 318 может быть сформирован по меньшей мере один выступ 324. Форма выступа 324 в целом является цилиндрической. Выступ 324 может вмещаться в соответствующее углубление 326 другого фланца. Дополнительно или альтернативно, фланец 318 может иметь элементы 332, 334, обеспечивающие совмещение верхнего и нижнего корпусов 301A, 301B. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, элементы содержат выступы 332 и соответствующие углубления 334. Как показано на фиг. 1, при совмещении верхнего и нижнего корпусов 301A, 301B выступы 332 входят в углубления 334 противоположного фланца.

Если требуется, выступ 324 фланца и выемка 326 могут иметь отверстия. Отверстия выступа и выемки совмещаются, когда выступ 324 верхнего корпуса 301A входит в выемку 326 нижнего корпуса 301B (как показано на фиг. 8A) Таким образом, в совмещенные отверстия можно вставить фиксатор 328, например болт. Затем на фиксатор 328 навертывается гайка 330 для создания разъемного соединения корпусов 301A, 301B. Как показано на фиг. 8B, выступы 320 фланца 318 обеспечивают блокировку при совмещении верхнего корпуса 301A с нижним корпусом 301B. В частности, согласно одному из вариантов осуществления изобретения, крючки 322 выступов 320 обеспечивают фиксацию с возможностью разъединения.

В необязательном фланце 318 может быть сформирована канавка 336. Канавка 336 предназначена удерживать шайбу или прокладку 338, расположенную между верхним и нижним корпусами 301A, 301B, как в целом показано на фиг. 8A и 8B.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, образующая конического участка 303 корпусов 301 не является прямолинейной. В частности, конический участок 303 сужается по дугообразной траектории от максимального диаметра вблизи цилиндрического участка 308 до минимального диаметра вблизи первого порта 353. В частности, как показано на фиг. 5C и 7, продольное сечение конического участка 303 корпуса 301 определяет линию дугообразной формы между цилиндрическим участком 308 и первым портом 353. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конический участок 303 вогнут к центру осадительного устройства 300. Согласно другому варианту осуществления изобретения, конический участок 303 может иметь постоянный радиус кривизны. Если требуется, согласно другому варианту осуществления изобретения, конический участок 303 может иметь два радиуса кривизны или более. Например, конический участок 303 может иметь первую кривизну вблизи цилиндрического участка 308 и вторую кривизну вблизи первого порта 353. Центры первой и второй кривизны расположены внутри корпуса. Если требуется, угол наклона конического участка 308 может изменяться от приблизительно 15° до приблизительно 85° относительно продольной оси 350. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конический участок 303 включает выгнутую область вблизи первого порта 353. Выгнутая область имеет кривизну, центр которой находится за пределами корпуса.

Как показано на фиг. 9A-9D, конусы 309 обычно имеют корпус 340 с малым отверстием 344 на вершине 342 и большим отверстием 346 в основании. Если требуется, конусы формуются по отдельности. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, конусы, по существу, имеют одинаковый размер и форму.

Согласно некоторым из вариантов осуществления изобретения, образующая конического корпуса 340 между малым и большим отверстиями 344, 346 может быть нелинейной. Как показано на фиг. 9D, продольное сечение корпуса 340 имеет вид линии дугообразной формы. Дугообразная форма продольного сечения конуса 309 и форма продольного сечения конического участка 303 корпуса 301 могут быть примерно одинаковыми.

Согласно некоторым из вариантов осуществления изобретения, корпус 340 вогнут внутрь к продольной оси 350. Таким образом, линия, соединяющая точку на большом отверстии 346 с точкой на малом отверстии 344, проходит внутри корпуса.

Если требуется, корпус 340 может быть изготовлен с постоянным радиусом кривизны. В качестве альтернативы корпус может иметь два радиуса кривизны или более. Таким образом, корпус может иметь первую кривизну вблизи малого отверстия 344 и вторую кривизну вблизи большого отверстия 346. Центры первой и второй кривизны расположены внутри конуса 309. Таким образом, угол наклона участка корпуса 340 вблизи малого отверстия 344 может отличаться от угла наклона участка корпуса вблизи большого отверстия. Например, вблизи малого отверстия 344 угол наклона корпуса может составлять по меньшей мере приблизительно 40° относительно продольной оси 350. Вблизи большого отверстия 346 угол наклона корпуса может быть приближен к вертикали (или приближен к продольной оси). В частности, в точке, ближайшей к большому отверстию 346, угол наклона корпуса может составлять менее приблизительно 45° относительно продольной оси. Если требуется, корпус 340 может иметь угол наклона, изменяющийся от приблизительно 5° до приблизительно 85° относительно продольной оси.

Как показано на фиг. 9B, 9D, каждый конус 309 может содержать выступы 313, контактирующие со смежным конусом, чтобы в стопке между последовательно установленными конусами 309 поддерживался, по существу, на одинаковый интервал. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, выступы 313 продолжаются внутрь от внутренней поверхности корпуса 340. Выступы 313 выполнены с возможностью контакта с внешней поверхностью корпуса 340 смежного конуса. В качестве альтернативы, выступы 313 могут продолжаться от внешней поверхности корпуса 340.

Выступы 313 могут иметь размер, обеспечивающий требуемый интервал между смежными конусами. Если требуется, выступы 313 могут обеспечивать между смежными конусами интервал от приблизительно 1 мм до приблизительно 2,5 см. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, каждый конус 309 имеет по меньшей мере три выступа 313.

Как показано на фиг. 2 и 3, если конусы 309 расположены внутри верхнего корпуса 301A осадительного устройства, корпус 340 нижнего конуса 309A поддерживается вторыми разделителями 315B нижнего корпуса 301B осадительного устройства. По меньшей мере конический участок 303 нижнего корпуса 301B и некоторые области цилиндрических участков 308A, 308B могут не содержать конусов. Соответственно, клетки, присутствующие в культуре могут задерживаться в осадительном устройстве 300.

Во время работы осадительного устройства 300, согласно вариантам осуществления изобретения, представленным на фиг. 1-9D, среда для культивирования клеток, не содержащая сыворотки или животного белка, может подаваться в осадительное устройство 300 через один или несколько портов, а именно, через первый порт 353 и второй порт 354 нижнего корпуса 301B. Среда для культивирования клеток может подаваться в осадительное устройство 300 как непрерывно, так и периодически. Осадительное устройство 300 может функционировать в периодическом, либо в непрерывном режиме.

В осадительное устройство 300 также может подаваться регулируемая смесь O₂, CO₂ и N₂ для контроля pH и DO культурального супернатанта внутри осадительного устройства 300. Если требуется, один или несколько портов, а именно, вторые порты 354A, 354B и первый порт 353B нижнего корпуса 301B могут использоваться для отбора проб содержимого биореактора, например, с целью проверки жизнеспособности клеток и непрерывного измерения параметров: pH жидкости и DO для ввода данных в управляемый компьютером мультигазовый контроллер массового расхода.

По завершении культивирования клеток in vitro концентрированные осевшие клетки, накапливающиеся на дне осадительного устройства 300 в нижнем корпусе 301B, могут быть собраны через первый порт 353B нижнего корпуса. Осветленная культуральная жидкость, содержащая любые метаболические отходы, такие как аммиак и лактат, или газы, вместе с любыми еще не осевшими более мелкими мертвыми клетками и клеточными дебрисами, может быть удалена через первый порт 353A верхнего корпуса 301A.

Если требуется, осадительное устройство 300 может использоваться как автономная комбинация биореактор/сортировщик клеток. Среда для роста клеток может добавляться в осадительное устройство через один или несколько портов, а именно, через первый и второй порт 353, 354. Соответственно, осадительное устройство 300 может использоваться без перфузионного биореактора.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, внутри осадительного устройства 300 могут быть установлены датчики. Если требуется, датчики могут быть установлены на внутренней поверхности одного или нескольких корпусов 301A, 301B. По меньшей мере, один участок корпуса 301 может быть изготовлен из пластика. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, корпус целиком может быть изготовлен из пластика. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, пластик является прозрачным или, по меньшей мере, полупрозрачным. Если требуется, по меньшей мере, один участок корпуса 301 является прозрачным или полупрозрачным. Например, участок из прозрачного или полупрозрачного материала может прилегать к отверстию в корпусе 301, формируя окно. Прозрачный участок может быть выполнен из стекла, пластика или любого другого подходящего материала. Прозрачный участок может быть сформирован из материала, пропускающего свет определенной длины волны или определенного диапазона длин волн.

Если установлены датчики, они могут контактировать со средой внутри осадительного устройства 300. Датчики могут осуществлять мониторинг одного или нескольких из перечисленных параметров: pH, DO, глюкозы, температуры и CO₂ (включая растворенный или «парциальный» CO₂) внутри осадительного устройства 300.

Если требуется, один или несколько датчиков могут содержать флуоресцентный зонд, излучающий свет, который изменяется в зависимости от состояния, определяемого флуоресцентным зондом. Флуоресцентные зонды могут занимать всевозможные позиции внутри осадительного устройства 300. Более конкретно, флуоресцентные зонды могут быть установлены в разных областях внутри осадительного устройства клеток для определения условий и их изменений. Если требуется по меньшей мере один флуоресцентный зонд может быть смонтирован на внутренней поверхности конического участка 303B нижнего корпуса 301B.

Свет, излучаемый флуоресцентными зондами, проходит через поверхность корпуса 301 (или прозрачный участок корпуса) и может улавливаться считывателем или измерителем. Как описано в настоящем документе, измеритель может фиксировать или отображать уровень по меньшей мере одного из перечисленных параметров: pH, DO, глюкозы, температуры и CO₂, в соответствии с данными флуоресцентных зондов, установленных в осадительном устройстве 300. Если требуется, может применяться необязательный оптоволоконный кабель, собирающий излучаемый флуоресцентным зондом свет и передающий на измеритель.

На фиг. 10-15 показана другая конфигурация осадительного устройства 400 согласно настоящему изобретению, которая является эффективной для осаждения клеток или частиц. Осадительное устройство 400, как правило, имеет верхний корпус 301 и нижний корпус 401. Верхний корпус 301 содержит первую стопку конусов 309, а нижний корпус 401 содержит вторую стопку конусов 409. Верхний корпус 301 и конусы 309 аналогичны корпусам 301 и конусам 309, описанным со ссылкой на фиг. 1-9D.

Нижний корпус 401, как правило, имеет конический участок 403, цилиндрический участок 408, первый порт 453 и второй порт 454. Порты 453, 454 приспособлены для соединения с трубопроводом.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, нижний корпус 401 прочно соединен с верхним корпусом 301. Например, нижний корпус и верхний корпус могут быть сварены (в частности, с применением термической сварки), склеены или соединены другими способами, известными специалистам в данной области техники.

В качестве альтернативы нижний корпус 401, если требуется, может содержать фланец 418. Необязательный фланец 418 выполнен с возможностью разъемного соединения с необязательным фланцем 318 корпуса 301. Соответственно, фланец 418 может включать выступы с крючками, выступы, выемки, язычки и углубления, функции которых аналогичны элементам фланца 318. Если требуется, могут быть предусмотрены разделители 415, продолжающиеся внутрь от цилиндрического участка 408.

Как показано на фиг. 13, конический участок 403 корпуса 401 является вогнутым внутрь по направлению к продольной оси 450. В частности, прямая линия, соединяющая ближайшую к первому порту 453 точку конического участка с точкой пересечения конического участка и цилиндрического участка 408, будет проходить за пределами корпуса 401.

Конический участок 403 может иметь постоянный радиус кривизны. В качестве альтернативы конический участок 403 может иметь два радиуса кривизны или более. Например, конический участок 403 может иметь первую кривизну вблизи цилиндрического участка 408 и вторую кривизну вблизи первого порта 453. Центры первой и второй кривизны расположены за пределами корпуса 401. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, в точке вблизи первого порта 453 угол наклона конического участка 403 относительно продольной оси 450 составляет менее примерно 45°. Если требуется, в точке вблизи цилиндрического участка 408 угол наклона конического участка относительно продольной оси может составлять более приблизительно 45°. Согласно другому варианту осуществления изобретения, угол наклона конического участка 403 может изменяться от приблизительно 15° до приблизительно 85° относительно продольной оси.

Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, внутри осадительного устройства 400 могут быть установлены датчики. Датчики могут быть смонтированы на внутренней поверхности одного или нескольких корпусов 301, 401. Датчики могут контактировать со средой внутри осадительного устройства 400. Датчики могут осуществлять мониторинг в осадительном устройстве 400 одного или нескольких из перечисленных параметров: pH, DO (растворенного кислорода), глюкозы, температуры и CO₂ (включая растворенный или «парциальный» CO₂). Датчики могут быть аналогичны другим датчикам, описанным в настоящем документе. Соответственно, один или несколько датчиков могут содержать флуоресцентный зонд, способный излучать свет, который изменяется в зависимости от состояния, определяемого зондом. Свет может проходить через прозрачный участок корпуса 301, 401 или через окно в корпусе.

Как показано на фиг. 12 и 13, конусы 409 образуют стопку в нижнем корпусе 401. Конусы 409 расположены так, чтобы малое отверстие 444 было ориентировано приблизительно к первому порту 453. Форма корпуса 440 каждого конуса 409 в целом соответствует форме конического участка корпуса 403 осадительного устройства. В частности, корпус 440 конуса может иметь дугообразную форму, соответствующую форме по меньшей мере некоторой области конического участка корпуса. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, корпус конуса вогнут внутрь по направлению к продольной оси 450. Если требуется, корпус конуса имеет постоянный радиус кривизны. В качестве альтернативы, корпус конуса может иметь два радиуса кривизны или более. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, угол наклона корпуса может изменяться от приблизительно 5° до приблизительно 85° относительно продольной оси.

В корпусе 440 конуса могут быть сформированы выступы 413, предназначенные создавать заданный интервал между смежными конусами. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, выступы 413 продолжаются внутрь от внутренней поверхности корпуса конуса. Дополнительно или альтернативно выступы 413, если требуется, могут быть сформированы на внутренней поверхности корпуса конуса. Выступы 413 каждого конуса в стопке конусов контактируют с внутренней поверхностью последующего нижнего конуса, в результате чего, между смежными конусами создается заданный интервал. В стопке конусов, расположенных в корпусе 401 осадительного устройства, выступы 413 самого нижнего конуса 409A контактируют с внутренней поверхностью конического участка 403. Самый верхний конус 409E, если требуется, может содержать выступы 448, которые продолжаются за пределы большого отверстия 446. Как показано на фиг. 12, выступы 448 самого верхнего конуса 409E могут контактировать с внутренней поверхностью самого нижнего конуса 309A в верхней стопке конусов 309. Благодаря контакту между выступами 448 и конусом 309A предотвращается непреднамеренное или самопроизвольное перемещение стопки конусов 409.

Как показано на фиг. 14 и 15, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, конусы 409 имеют разный диаметр. Диаметр самого нижнего конуса 409A может быть больше диаметра других конусов в стопке. Диаметр конусов 409B-409E в стопке последовательно уменьшается, при этом самый верхний конус 409E в стопке конусов имеет наименьший диаметр. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, стопка конусов, установленная в нижнем корпусе 401 осадительного устройства, содержит шесть конусов 409A-409E. Согласно другому варианту осуществления изобретения, стопка конусов 409, установленная в нижнем корпусе осадительного устройства, может содержать от четырех до десяти конусов.

Для изготовления осадительного устройства 400, включая корпуса 301, 401 и конусы 309, 409, могут использоваться материалы, описанные в других вариантах осуществления настоящего изобретения. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, один или несколько из перечисленных: корпусов и конусов изготовлены из одноразового пластика. В качестве альтернативы одно или несколько из корпусов и конусов могут быть изготовлены из металла, например из нержавеющей стали, либо из стекла. Поверхности конусов 309, 409 и внутренние поверхности корпусов 301, 401 осадительного устройства могут быть полностью или частично покрыты одним или несколькими нелипкими пластическими материалами, такими как тефлон, силикон и аналогичные материалы, известные специалистам в данной области техники. Поверхности осадительного устройства 400 (особенно из нержавеющей стали) могут быть подвергнуты электрополировке для получения гладкой поверхности. Осадительное устройство 400 можно масштабировать до любого требуемого размера.

Осадительное устройство 400 может функционировать подобным или аналогичным образом, как и осадительное устройство 300. В частности, среда для культивирования клеток, не содержащая сыворотки или животного белка, может подаваться в осадительное устройство 400 через один или несколько портов, а именно, через первый порт 453 и второй порт 454 нижнего корпуса 401. Среда для культивирования клеток может подаваться в осадительное устройство 400 как непрерывно, так и периодически. В частности, осадительное устройство 400 может функционировать в периодическом, либо в непрерывном режиме.

В осадительное устройство 400 также может подаваться регулируемая смесь O₂, CO₂ и N₂ для контроля pH и DO культурального супернатанта внутри осадительного устройства клеток. Если требуется, один или несколько портов, а именно, вторые порты 354, 454 и первый порт 353 нижнего корпуса 301 могут использоваться для отбора проб содержимого биореактора, например, с целью проверки жизнеспособности клеток и непрерывного измерения pH жидкости и DO для ввода данных в управляемый компьютером мультигазовый контроллер массового расхода.

По завершении культивирования клеток in vitro концентрированные осевшие клетки, накапливающиеся на дне осадительного устройства 400, могут быть собраны через первый порт 453 нижнего корпуса 401. Осветленная культуральная жидкость, содержащая любые метаболические отходы, такие как аммиак и лактат, или газы, вместе с любыми еще не осевшими более мелкими мертвыми клетками и клеточными дебрисами, может быть удалена через первый порт 353 верхнего корпуса 301.

Если требуется, осадительное устройство 400 может использоваться как автономная комбинация биореактора/сортировщика клеток. Среда для роста клеток может добавляться в осадительное устройство клеток через один или несколько портов, а именно, через первые и вторые порты 353, 354, 453, 454. Соответственно, осадительное устройство 300 можно использовать без перфузионного биореактора.

На фиг. 16-21 показана другая конфигурация осадительного устройства 500 частиц или клеток согласно настоящему изобретению. Элементы осадительного устройства 500 подобны или аналогичны элементам осадительных устройств 300, 400 согласно настоящему изобретению. Осадительное устройство 500, как правило, имеет верхний конический участок 503A, цилиндрический участок 508 и нижний конический участок 503B, которые образуют полость внутри осадительного устройства. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, верхний конический участок 503A и нижний конический участок 503B, по существу, идентичны. Внутри осадительного устройства 500 может быть расположена по меньшей мере одна стопка конусов 509.

Конические участки 503A, 503B, как правило, содержат первый порт 553 и, если требуется, второй порт 554. Если требуется, первый порт 553 может быть выровнен, по существу, концентрично с продольной осью 550 осадительного устройства 500. Первый порт 553 может использоваться как впускное отверстие и как выпускное отверстие.

Второй порт 554 также может использоваться для введения или удаления жидкостей, газов и твердых частиц из полости внутри осадительного устройства 500. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения второй порт 554 продолжается через конический участок 503. Если требуется, второй порт 554 может быть выровнен, как правило, параллельно продольной оси 550 осадительного устройства клеток. Согласно другим вариантам осуществления изобретения, второй порт 554 может продолжаться через цилиндрический участок 508. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, второй порт 554 может быть ориентирован поперек или перпендикулярно продольной оси 550. Возможны другие конфигурации первого порта 553 и второго порта 554. Осадительное устройство 500 может иметь более четырех портов.

Порты 553, 554 приспособлены для соединения с трубопроводом. Трубопровод может быть соединен с любым из компактных осадительных устройств клеток согласно настоящему изобретению. Трубопровод может иметь подходящий диаметр или иным образом может быть приспособлен для соединения с любым портом осадительного устройства согласно вариантам осуществления настоящего изобретения Трубопровод, к тому же, может содержать по меньшей мере один датчик, расположенный внутри полости осадительного устройства. Датчики могут контактировать с жидкостью и/или частицами внутри трубопровода. Если требуется, датчики могут быть установлены на внутренней поверхности трубопровода, хотя возможны и другие конфигурации. Датчики могут осуществлять мониторинг в трубопроводе одного или нескольких из перечисленных параметров: pH, DO, глюкозы, температуры и CO₂ (включая растворенный или «парциальный» CO₂).

Если требуется, один или несколько датчиков могут содержать флуоресцентный зонд, излучающий свет, который изменяется в зависимости от состояния, определяемого зондом. Свет может улавливаться считывателем или измерителем. Если требуется, может применяться оптоволоконный кабель, улавливающий свет и передающий на измеритель. Измеритель может фиксировать или отображать уровень по меньшей мере одного из перечисленных параметров: pH, DO, глюкозы, температуры и CO₂, в соответствии с данными флуоресцентных зондов. Трубопровод может быть изготовлен из прозрачного или по меньшей мере полупрозрачного материала. Таким образом, трубопровод может пропускать свет, генерируемый датчиком. В качестве альтернативы, по меньшей мере, некоторый участок трубопровода является прозрачным или полупрозрачным, формируя окно. Следовательно, свет, генерируемый датчиком, может проникать через участок в виде окна и улавливаться измерителем.

Если требуется, внутри осадительного устройства 500 может быть предусмотрена трубка 560, соединенная по меньшей мере с одним из вторых портов 554. Один из вариантов трубки 560 согласно настоящему изобретению показан на фиг. 20A, 20B. Трубка содержит внутренний канал 562, который продолжается по всей ее длине. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, трубка 560 не является линейной. Точнее говоря, трубка 560 может быть изогнута. Таким образом, трубка продолжается внутрь осадительного устройства 500, при этом свободный конец 564 трубки приближен к продольной оси 550, как хорошо видно на фиг. 17. Соответственно, по внутреннему каналу 562, продолжающемуся по всей длине трубки 560, текучая среда может подаваться или отводиться из средней части осадительного устройства 500, например, из внутреннего пространства конуса 509. В процессе отвода текучей среды из осадительного устройства500 через трубку 560 поток текучей среды внутри осадительного устройства принудительно направляется вверх, при этом клетки или частицы, содержащиеся в потоке текучей среды, оседают на конусах и мигрируют в направлении нижнего конического участка 503B.

Внутри полости осадительного устройства 500, к тому же, может быть расположен диффузор 570, показанный на фиг. 21A, 21B. Диффузор 570 может быть связан с одним из вторых портов, например с нижним вторым портом 554B. Вводимая или отводимая из осадительного устройства500 через диффузор текучая среда не оказывает возбуждающего действия на частицы или клетки, осевшие вблизи нижнего конического участка 503B. Текучая среда, содержащая клетки или частицы, при подаче в осадительное устройство 500 через диффузор равномерно распределяется по нижнему коническому участку 503B осадительного устройства.

Как показано на фиг. 21A, 21B, диффузор может представлять собой тор или кольцо 574 на трубчатом стержне 572. Трубчатый стержень 572 может прямолинейным и ориентирован параллельно продольной оси 550. Когда диффузор 570 установлен в осадительном устройстве 500 кольцо 574 может быть расположено вокруг продольной оси 550. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, кольцо 574 выровнено, по существу, концентрично продольной оси.

Отверстие 576 сформировано в кольце 574 диффузора для облегчения перемещения текучей среды, клеток или частиц. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, отверстие 576 сформировано на стороне соединения кольца с трубчатым стержнем 572. Таким образом, когда диффузор подсоединен к нижнему второму порту 554 отверстие 576 может быть обращено к нижнему первому порту 553B. Отверстие 576 может быть выполнено в виде единственного канала или прорези. Прорезь может продолжаться, по существу, непрерывно по окружности кольца.

В качестве альтернативы кольцо может содержать множество отдельных отверстий 576. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, отверстия ориентированы в осевом направлении для выпуска жидкости, как правило, параллельно продольной оси. Все отверстия 576 могут быть ориентированы в одном направлении. В качестве альтернативы направление нескольких отверстий может быть разным или противоположным. Если требуется, одно или несколько отверстий 576 могут быть ориентированы поперек продольной оси 550. Дополнительно или альтернативно, некоторые из отверстий могут быть ориентированы радиально или аксиально.

Конусы 509, показанные на фиг. 17, внутри осадительного устройства 500 могут быть ориентированы к одному или к другому из конических участков, а именно, к верхнему коническому участку 503А или к нижнему коническому участку 503В. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, в осадительном устройстве установлена одна стопка конусов, при этом малый конец или вершина 542 конусов 509B ориентирована к нижнему первому порту 553B нижнего конического участка 503B. Согласно указанному варианту осуществления изобретения, основание или большое отверстие 546 конусов ориентировано к верхнему первому порту 553A верхнего конического участка 503A. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, стопка внутри осадительного устройства 500 может содержать от трех до двадцати пяти конусов 509. Согласно другим вариантам осуществления изобретения, стопка может содержать от 6 до 14 конусов или 10 конусов. Однако масштабирование осадительного устройства 500, смонтированного, как показано на фиг. 16-17, позволяет вместить в осадительное устройство какое угодно количество конусов 509. По меньшей мере в одной области нижнего конического участка 503B конусы могут отсутствовать. Точнее говоря, самый нижний конус 509 может быть расположен на заданном расстоянии от внутренней поверхности нижнего конического участка 503B. Соответственно, клетки в культуре могут удерживаться в осадительном устройстве 500, например, вблизи нижнего первого отверстия 553B.

Когда конусы 509B позиционированы так, что их вершины 542 направлены к нижнему первому отверстию 553B, корпус 540 нижнего конуса 509 может поддерживаться диффузором 570. Конкретнее, как показано на фиг. 17, нижний конус 509 может продолжаться через кольцо 574 диффузора, при этом корпус 540 конуса контактирует с кольцом диффузора. Нижний конус, если требуется, может быть присоединен или приварен к кольцу диффузора. Таким образом, диффузор 570 может обеспечить расположение нижнего конуса 509 на заданном расстоянии от внутренней поверхности нижнего конического участка 503B.

Как показано на фиг. 17, если требуется, фланец 518 может продолжаться от большого конца конического участка 503 осадительного устройства. Внутренний диаметр фланца 518 примерно равен внешнему диаметру цилиндрического участка 508, однако немного превышает его. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, в смонтированном осадительном устройстве фланец 518 продолжается за пределы внешней поверхности цилиндрического участка 508 и приблизительно параллелен продольной оси 550. Необязательный фланец 518 выполнен с возможностью соединения соответствующего конического участка 503 с цилиндрическим участком 508. Например, конический участок 503 может быть приварен или иным образом закреплен на цилиндрическом участке 508 вблизи фланца 518.

Дополнительно или в качестве альтернативы, фланец 518 может включать элементы, обеспечивающие выравнивание соответствующего конического участка 503 с цилиндрическим участком 508. Согласно одному из иллюстративных вариантов осуществления изобретения, элементы содержат выступы, выполненные с возможностью сцепления с соответствующими выемками, предусмотренными в цилиндрическом участке.

Фланец может быть выполнен с возможностью удержания шайбы или прокладки, расположенной между коническим участком и цилиндрическим участком. Прокладка может быть подобна или аналогична прокладке 338, показанной на фиг. 8A и 8B.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, образующая одного или нескольких конических участков 503 осадительного устройства 500 не является линейной. В частности, конические участки 503 могут сужаться по дугообразной траектории от максимального диаметра вблизи цилиндрического участка 508 до минимального диаметра вблизи первого порта 553. Более конкретно, как показано на фиг. 17, продольное сечение каждого из конических участков 503 определяет линию дугообразной формы между цилиндрическим участком 508 и первым портом 553. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конические участки 503 вогнуты внутрь по направлению к центру осадительного устройства 500. Согласно другому варианту осуществления изобретения конические участки 503 могут иметь постоянный радиус кривизны. Если требуется, согласно другому варианту осуществления изобретения, один или несколько конических участков 503 могут иметь два радиуса кривизны или более. Например, конический участок 503 может иметь первую кривизну вблизи цилиндрического участка 508 и вторую кривизну вблизи соответствующего первого порта 553. Центры первой и второй кривизны расположены внутри осадительного устройства 500. Если требуется, угол наклона конического участка 508 может изменяться от приблизительно 5° до приблизительно 85° относительно продольной оси 550. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конический участок 503 может содержать выгнутую область вблизи первого порта 553. Выгнутая область имеет кривизну, центр которой находится за пределами осадительного устройства 500.

Как показано на фиг. 19A и 19B, каждый конус 509 обычно имеет корпус 540 с вершиной 542, содержащей малое отверстие 544, и основанием, содержащим большое отверстие 546. Если требуется, все конусы могут быть сформированы отдельно. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, конусы, по существу, имеют одинаковый размер и форму.

Согласно некоторым из вариантов осуществления изобретения, образующая корпуса 540 конуса может быть нелинейной между малым и большим отверстиями 544, 546. Как показано на фиг. 17, продольное сечение корпуса 540 имеет вид линии дугообразной формы. Дугообразная форма каждого конуса 509 может быть примерно аналогична форме одного или нескольких конических участков 503 осадительного устройства 500.

Согласно некоторым из вариантов осуществления изобретения, корпус 540 вогнут внутрь к продольной оси 550. Таким образом, прямая линия, соединяющая точку на большом отверстии 546 с точкой на малом отверстии 544, проходит внутри корпуса.

Если требуется, корпус 540 может иметь постоянный радиус кривизны. В качестве альтернативы, корпус может иметь два радиуса кривизны или более. Таким образом, корпус может иметь первую кривизну вблизи малого отверстия 544 и вторую кривизну вблизи большого отверстия 546. Центры первой и второй кривизны расположены внутри конуса 509. Таким образом, участок корпуса 540 вблизи малого отверстия 544 может иметь угол наклона, отличный от угла наклона корпуса вблизи большого отверстия. Например, вблизи малого отверстия 544 угол наклона корпуса составляет по меньшей мере приблизительно 40° относительно продольной оси 550. Вблизи большого отверстия 546 угол наклона корпуса может быть приближен к вертикали (или приближен к продольной оси). В частности, в точке вблизи большого отверстия 546 угол наклона корпуса может составлять менее приблизительно 45° относительно продольной оси. Если требуется, угол наклона корпуса 540 может изменяться от приблизительно 5° до приблизительно 85° относительно продольной оси.

Как показано на фиг. 19A, 19B, каждый конус 509 может иметь выступы 513, выполненные с возможностью контакта со смежным конусом, чтобы последовательно установленные конусы 509 удерживались в стопке примерно с одинаковым интервалом. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, выступы 513 продолжаются наружу от внешней поверхности корпуса 540. Выступы 513 выполнены с возможностью контакта с внутренней поверхностью корпуса 540 смежного конуса. В качестве альтернативы, выступы 513 могут продолжаться от внутренней поверхности корпуса 340. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, выступы 513 ориентированы, как правило, параллельно продольной оси 550.

Выступы 513 могут иметь размер, обеспечивающий заданный интервал между смежными конусами. В зависимости от конфигурации выступов 513 интервал между смежными конусами может составлять от приблизительно 1 мм до приблизительно 2,5 см. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, каждый конус 509 содержит по меньшей мере три выступа 513.

Выступы 513, если требуется, могут быть выполнены с возможностью фиксации первого конуса относительно второго конуса. Более конкретно, выступ 513 может включать гребень 532 и канавку 536. Канавка 536 первого конуса может вмещать гребень 532 второго, то есть смежного конуса, как показано на фиг. 19A.

Как показано на фиг. 18, осадительное устройство 500 может, если требуется, вмещать вторую стопку конусов 509A. Конусы 509A во второй стопке конусов могут быть аналогичны конусам 509B. В качестве альтернативы конусы 509A могут отличаться от конусов 509B размером или формой. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, вторая стопка может содержать конусы 509A разного размера. Например, диаметр самого верхнего из конусов 509A может быть больше диаметра нижнего из конусов. Соответственно, диаметр самого нижнего из конусов 509A может быть меньше диаметра других конусов во второй стопке.

Если требуется, может быть предусмотрен один или несколько разделителей (не показаны), которые выступают внутрь от внутренней поверхности осадительного устройства 500. Разделители предназначены предотвращать прилегание стопки конусов 509, установленных внутри осадительного устройства 500, к внутренней поверхности конических участков 503 или цилиндрических участков 508 осадительного устройства. Если требуется, разделители могут быть расположены приблизительно параллельно продольной оси 550 осадительного устройства 300. Разделители могут иметь, по существу, тонкое поперечное сечение, чтобы не создавались или минимизировались помехи движению или течению жидкости и взвешенных частиц внутри осадительного устройства 500. На фиг. 16-18 разделители не изображены, однако они могут быть аналогичны или подобны разделителям 315, показанным на фиг. 5A, 5B и 7 и описанным в настоящем документе.

Элементы осадительного устройства 500, такие как конические участки 503, цилиндрические участки 508 и конусы 509, могут быть изготовлены из одноразового пластика. В качестве альтернативы одно или несколько из конических участков 503, цилиндрического участка 508 и конусов 509 могут быть изготовлены из металла, например нержавеющей стали, либо из стекла. Поверхности конусов 509 и внутренние поверхности конических участков 503 и цилиндрического участка 508 могут быть полностью или частично покрыты одним или несколькими нелипкими видами пластика, такими как тефлон, силикон и подобными материалами, известные специалистам в данной области техники. Дополнительно или в качестве альтернативы, поверхности (особенно из нержавеющей стали) могут быть подвергнуты электрополировке для получения гладкой поверхности. Указанные осадительные устройства можно легко масштабировать до любого требуемого размера.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конические участки прочно соединены с цилиндрическим участком, например, с помощью сварки (например, ультразвуковой сварки или тепловой сварки), адгезива или клея. Если требуется, один или несколько конусов могут быть соединены с внутренней поверхностью осадительного устройства. Например, согласно одному из вариантов осуществления изобретения, один из участков самого верхнего конуса 509 в стопке конусов может контактировать с внутренней поверхностью верхнего конического участка 503A и может быть закреплен на ней, как показано на фиг. 17. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конусы могут быть соединены между собой для образования стопки конусов.

Осадительное устройство 500 может, если требуется, содержать рубашку для текучей среды (не показана). Рубашка для текучей среды может быть связана с одним или несколькими из конических участков 503 и цилиндрического участка 508. Вода или другая текучая среда, подаваемая в рубашку для текучей среды через один или несколько портов, обеспечивает поддержание в требуемом диапазоне температуры осадительного устройства 500 и его содержимого, включая текучую среду в нем.

Во время работы осадительного устройства 500 согласно вариантам осуществления изобретения, представленным на фиг. 16-18, среда для культивирования клеток, не содержащая сыворотки или животного белка, может подаваться в осадительное устройство 300 через один или несколько портов, а именно, через первый порт 553B и второй порт 554B нижнего конического участка 503B. Среда для культивирования клеток может подаваться в осадительное устройство 500 как непрерывно, так и периодически. В частности, осадительное устройство 500 может функционировать в периодическом, либо в непрерывном режиме.

В осадительное устройство 500 также может подаваться регулируемая смесь O₂, CO₂ и N₂ для контроля параметров: pH и DO культурального супернатанта внутри осадительного устройства 500. Если требуется, один или несколько портов, а именно, вторые порты 554A, 554B и первый порт 553B нижнего конического участка 503B могут использоваться для отбора проб содержимого биореактора, например, для проверки жизнеспособности клеток и непрерывного измерения параметров: pH жидкости и DO для ввода данных в управляемый компьютером мультигазовый контроллер массового расхода.

По завершении культивирования клеток in vitro концентрированные осевшие клетки, накапливающиеся на дне осадительного устройства 500 в нижнем коническом участке 503B, могут быть собраны через первый порт 553B осадительного устройства 500. Осветленная культуральная жидкость, содержащая любые метаболические отходы, такие как аммиак и лактат, или газы, вместе с любыми еще не осевшими более мелкими мертвыми клетками и клеточными дебрисами, может быть удалена через первый порт 553A верхнего конического участка 503A.

Если требуется, осадительное устройство 500 может использоваться как автономная комбинация биореактор/сортировщик клеток. Среда для роста клеток может добавляться в осадительное устройство через один или несколько портов, а именно, через первый порт 553 и второй порт 554. Соответственно, осадительное устройство 500 может использоваться без соединения с перфузионным биореактором.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, внутри осадительного устройства 500 могут быть установлены датчики. Если требуется, датчики могут быть установлены на внутренней поверхности одного или нескольких из конических участков 503 и цилиндрического участка 508. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения по меньшей мере один участок осадительного устройства 500 может содержать пластик. Согласно вариантам осуществления изобретения, корпус целиком может быть изготовлен из пластика. Согласно иллюстративным вариантам осуществления изобретения, пластик является прозрачным или по меньшей мере полупрозрачным. Если требуется, по меньшей мере один участок осадительного устройства 500 является прозрачным или полупрозрачным. Например, участок из прозрачного или полупрозрачного материала может прилегать к отверстию в осадительном устройстве 500, формируя окно. Прозрачный участок может быть выполнен из стекла, пластика или любого другого подходящего материала. Прозрачный участок может быть выполнен из материала, пропускающего свет определенной длины волны или определенного диапазона длин волн.

Если установлены датчики, они могут контактировать со средой внутри осадительного устройства 500. Датчики могут осуществлять мониторинг одного или нескольких из перечисленных параметров: pH, DO, глюкозы, температуры и CO₂ (включая растворенный или «парциальный» CO₂) внутри осадительного устройства 500.

Если требуется, один или несколько датчиков могут содержать флуоресцентный зонд, излучающий свет, который изменяется в зависимости от состояния, определяемого флуоресцентным зондом. Флуоресцентные зонды могут занимать всевозможные позиции внутри осадительного устройства 500. Более конкретно, флуоресцентные зонды могут быть установлены в разных областях внутри осадительного устройства клеток для определения условий и их изменений. Если требуется, по меньшей мере один флуоресцентный зонд может быть смонтирован на внутренней поверхности нижнего конического участка 503B осадительного устройства.

Свет, излучаемый флуоресцентными зондами, проходит через поверхность осадительного устройства (или прозрачный участок осадительного устройства) и может улавливаться считывателем или измерителем. Как описано в настоящем документе, измеритель может фиксировать или отображать уровень по меньшей мере одного из: pH, DO, глюкозы, температуры и CO₂, в соответствии с данными флуоресцентных зондов, установленных в осадительном устройстве 500. Если требуется, может применяться необязательный оптоволоконный кабель, собирающий излучаемый флуоресцентным зондом свет и передающий на измеритель.

На фиг. 22-23 показан другой осадительное устройство 600 согласно настоящему изобретению. Осадительное устройство 600 аналогичен осадительное устройству 500 и имеет многие из его признаков. Например, осадительное устройство 600, в целом, имеет верхний конический участок 503A, цилиндрический участок 508 и нижний конический участок 503B, которые образуют полость внутри осадительного устройства. Диффузор 570 может быть расположен во внутренней полости и быть связан посредством жидкости со вторым портом 553B.

Стопка конусов 509A может быть расположена внутри осадительного устройства 600. Следует отметить, что вершина 542 конусов 509A ориентирована к первому верхнему порту 553A верхнего конического участка 503A.

Конусы 509A могут быть закреплены на внутренней поверхности верхнего конического участка 503A. Более конкретно, согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конусы имеют выступы 513, описанные в настоящем документе. Выступы 513 верхнего конуса 509A могут быть закреплены или приварены к внутренней поверхности верхнего конического участка 503A, как показано на фиг. 23.

Если требуется, внутри осадительного устройства 600 может быть размещена вторая стопка конусов (не показана). Вершины конусов во второй стопке конусов могут быть ориентированы к нижнему коническому участку 503B. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, конусы во второй стопке конусов аналогичны или подобны конусам 509A. В качестве альтернативы конусы во второй стопке конусов могут отличаться от конусов 509A размером или формой. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения конусы во второй стопке конусов могут иметь последовательно увеличивающийся диаметр, подобно конусам 409, показанным на фиг. 14 и 15.

В каждом из вариантов осуществления настоящего изобретения угол наклона конических поверхностей конусов, образующих стопку, может составлять от примерно 30° до примерно 60° относительно вертикали. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения, угол наклона конических поверхностей или конусов, образующих стопку, составляет примерно 45° относительно вертикали. Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, угол наклона составляет примерно от 15° до примерно 75°. Как описано выше, для осаждения более липких частиц (обычно клеток млекопитающих) угол наклона, предпочтительно, приближен к вертикальному (то есть составляет примерно 30° относительно вертикали). Для менее липких твердых частиц (например, частиц катализатора) угол наклона может быть менее похож на вертикальный (предпочтительно, составляет около 60° относительно вертикали).

Материал, используемый для изготовления любого из осадительных устройств согласно настоящему изобретению, включая корпус, конусы и/или любые дополнительные элементы осадительного устройства, может представлять собой нержавеющую сталь (особенно нержавеющую сталь 316) или аналогичные материалы, используемые в областях, относящихся к клеточным культурам микроорганизмов или млекопитающих, а также другие металлы, используемые в химической промышленности, например, для осаждения катализаторов и рециркуляции. Поверхности из нержавеющей стали могут быть частично или полностью подвергнуты электрополировке для получения гладких поверхностей, по которым осажденные из жидкой суспензии клетки или частицы могут скользить вниз. На некоторые или все поверхности осадительного устройства согласно настоящему изобретению может быть нанесено покрытие из нелипкого пластика или силикона, например, диметилдихлорсилана. Альтернативно или дополнительно, конструкция любого из этих осадительных устройств согласно настоящему изобретению может быть выполнена из неметаллов, включая пластики, такие как одноразовые пластики. Осадительные устройства из металла согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены с применением стандартной прокатки листов и сварки стальных угловых пластин с нижней частью спиральной плиты, а осадительное устройство из пластика согласно настоящему изобретению или его отдельные детали можно легко непрерывно изготавливать целиком с применением, например, технологии литья под давлением или технологии трехмерной печати.

В любом из осадительных устройств согласно настоящему изобретению для ввода в или отвода жидкости через любой из портов или отверстий корпуса осадительного устройства может использоваться один или несколько насосов, например, перистальтический насос, находящийся во жидкостной связи с портом или отверстием. Такие насосы или другие средства, принудительно направляющие жидкость в осадительные устройства или из них, могут работать непрерывно или периодически. В периодическом режиме работы осадительного устройства осаждение частиц или клеток происходит при выключенном насосе, то есть пока окружающая текучая среда остается неподвижной. Таким образом, уже осевшие частицы или клетки могут беспрепятственно скользить вниз по наклонным коническим поверхностям, поскольку отсутствует восходящий поток жидкости. Преимущество периодического режима работы состоит в увеличении скорости скольжения клеток вниз, благодаря чему улучшается жизнеспособность и продуктивность клеток. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения, насос используется для направления жидкой суспензии клеток из биореактора или ферментационной среды в осадительные устройства согласно настоящему изобретению.

Материал, из которого изготовлены конусы, установленные внутри корпуса любого из осадительных устройств согласно настоящему изобретению, предпочтительно, должен быть настолько тонким, насколько это необходимо для сохранения жесткости формы и минимизации веса концентрической стопки конусов, которая должна поддерживаться внутри корпуса. Радиус и высота указанных устройств могут быть независимо увеличены настолько, насколько это необходимо для проведения крупномасштабных процессов, согласно вычислениям с помощью прогнозирующих уравнений, например, предложенных для наклонных пластинчатых осадительных устройств (Batt et al. 1990, см. выше).

Существенным фактором, способствующим сепарации частиц в осадительном устройстве согласно настоящему изобретению, является более эффективное осаждение частиц на наклонных поверхностях, что успешно продемонстрировал Boycott (Nature, 104: 532, 1920) с клетками крови, и на наклонных прямоугольных поверхностях, что успешно продемонстрировал Batt et al. (1990, см. выше) с клетками гибридомы, продуцирующими моноклональные антитела. Дополнительными факторами, улучшающими сепарацию клеток/частиц, являются центробежная сила, действующая на клетки/частицы во время их движения вверх по кольцевым областям между последовательными цилиндрами, и осаждение под действием силы тяжести на поверхностях осаждения.

В то время как при масштабировании наклонных пластинчатых осадительных устройств увеличивают независимо каждый размер, то есть увеличивают длину, ширину или количество ламельных пластин, уложенных в стопку, в предлагаемом осадительном устройстве спирально-коническая зона осаждения может быть увеличена в трех измерениях одновременно просто за счет увеличения радиуса указанного устройства по горизонтали. По мере увеличения радиуса устройства по горизонтали количество вертикальных и конических поверхностей может быть пропорционально увеличено при сохранении постоянного расстояния (или ширины канала) между последовательными спиралями. Эффективность сепарации частиц прямо пропорциональна общей площади горизонтальной проекции наклонных поверхностей осаждения. При увеличении радиуса устройства площадь горизонтальной проекции увеличивается пропорционально квадрату радиуса, что приводит к увеличению общей площади проекции (пропорционально кубу радиуса), то есть масштабирование устройства осуществляется просто путем увеличения радиуса.

Осадительное устройство 600 может функционировать аналогично другим осадительного устройствам согласно настоящему изобретению. Например, осадительное устройство 600 может использоваться и функционировать, как описанные осадительные устройства 300, 400, 500.

Способы использования осадительных устройств и рабочие процессы

Далее описываются иллюстративные способы использования осадительных устройств согласно настоящему изобретению. Жидкость, содержащая частицы (включая, например, жидкость для культивирования клеток, сточную воду или реакционную жидкость, содержащую частицы твердого катализатора, и т.д.), вводится в осадительное устройство согласно настоящему изобретению через порт. Приблизительно 50-99% поступающей жидкости (обычно около 90%) удаляется через порт в нижней части осадительного устройства, а оставшиеся 1-50% (обычно около 10%) жидкости удаляются через порт в верхней части устройства. Насос (например, перистальтический насос) может использоваться для отсасывания жидкости через верхний порт, в то время как концентрированная жидкость может выходить из нижней части через нижнее выпускное отверстие корпуса циклона под действием силы тяжести, то есть нет необходимости в использовании насоса. В качестве альтернативы, жидкость, содержащая осевшие клетки или частицы, может отсасываться через нижний порт конического осадительного устройства при расходе входящей жидкости примерно 50%-99%, а оставшаяся осветленная жидкость (1%-50%) может отводиться через верхний порт. Если требуется, жидкость через порт может откачиваться в трубопровод для сбора.

Большинство вводимых клеток (или частиц), прижимающихся к стенкам осадительного устройства за счет центробежных сил, сначала оседают на коническом участке при слабом вихревом движении, которое ускоряется по мере того, как жидкость и частицы/клетки опускаются и выходят через нижний порт. Не осевшие клетки или частицы будут перемещаться вверх через стопки конусов. По мере того, как жидкость медленно перемещается вверх через стопки конусов, более крупные частицы (например, живые клетки) будут оседать на поверхности конусов и либо скользить по конусам, либо опускаться на небольшое расстояние между конусами и внешними стенками корпуса циклона. Осевшие частицы падают вертикально вдоль внешних цилиндрических стенок, пока не достигнут нижней конической секции устройства, и продолжают скользить по конической секции к нижнему порту.

Увеличивая скорость потока жидкости, вводимой через порт, можно сократить время пребывания жидкости внутри наклонных зон осаждения, при этом более мелкие частицы (например, мертвые клетки и клеточный дебрис) не будут оседать, а будут переноситься жидкостью в верхнюю часть зоны осаждения и выходить из осадительного устройства через верхний порт. Таким образом, обеспечивается простой метод селективного удаления более мелких частиц (таких как мертвые клетки и клеточный дебрис) через верхний порт в потоке сбора, в то время как более крупные частицы (например, живые и продуцирующие клетки) возвращаются из нижнего порта в другой сосуд (например, биореактор).

Таким образом, в указанных способах этап введения жидкой суспензии в осадительные устройства может включать направление жидкой суспензии из пластикового мешка биореактора в устройство для осаждения частиц.

Жидкость может вводиться или отводиться через любые порты или отверстия в осадительном устройстве с помощью одного или нескольких насосов (например, перистальтического насоса), находящихся во жидкостной связи с портом или отверстием. Такие насосы или другие средства, принудительно направляющие жидкость в осадительные устройства или из них, могут работать непрерывно или периодически. В периодическом режиме работы осадительного устройства осаждение частиц или клеток происходит при выключенном насосе, то есть пока окружающая текучая среда остается неподвижной. Таким образом, уже осевшие частицы или клетки могут беспрепятственно скользить вниз по наклонным коническим поверхностям, поскольку отсутствует восходящий поток жидкости. Преимущество периодического режима работы состоит в увеличении скорости скольжения клеток вниз, благодаря чему улучшается жизнеспособность и продуктивность клеток. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения, насос используется для направления жидкой суспензии клеток из биореактора или ферментационной среды в осадительные устройства согласно настоящему изобретению.

Одним из параметров процесса, корректируемых в указанных способах использования осадительных устройств согласно настоящему изобретению, является скорость потока жидкости, вводимой и отводимой из осадительных устройств. Скорость потока жидкости будет полностью зависеть от конкретного применения устройства, при этом скорость можно изменять, чтобы избежать повреждения частиц, оседающих и отделенных от осветленной жидкости. В частности, может потребоваться корректировка скорости потока, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток, которые могут быть отделены в осадительных устройствах согласно настоящему изобретению и возвращены в культуру клеток, однако корректировка скорости потока также необходима для предотвращения избыточного накопления клеток или частиц в осадительных устройствах и засорения трубопроводов, по которым жидкость поступает в осадительные устройства и выходит из них.

В описываемых ниже примерах способов применения осадительных устройств осветленная жидкость, собранная из осадительного устройства, может включать по меньшей мере одно из перечисленных: биологические молекулы, органические или неорганические соединения, химические реагенты и продукты химических реакций. Осветленная жидкость, собранная из осадительного устройства, может включать по меньшей мере одно из углеводородов, полипептидов, белков, спиртов, жирных кислот, гормонов, углеводов, антител, изопреноидов, биодизеля и пива. В описываемых примерах способов осветленная жидкость, собранная из осадительного устройства, включает по меньшей мере одно из инсулина или его аналогов, моноклональных антител, факторов роста, субъединичных вакцин, вирусов, вирусоподобных частиц, колониестимулирующих факторов, эритропоэтина (EPO).

Каждая публикация или патент, упоминаемые в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Описанные в целом осадительные устройства согласно настоящему изобретению будут более понятны из нижеприведенных примеров, которые включены в описание только с целью иллюстрации определенных аспектов вариантов осуществления настоящего изобретения. Примеры не следует рассматривать как ограничивающие изобретение, при этом на основании приведенных выше руководств и описываемых ниже примеров специалисты в данной области техники поймут, что другие технологии и способы могут удовлетворять формуле изобретения и могут быть использованы без отклонения от существа объема настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1

Секретирование белковых продуктов дрожжевыми или другими микробными клетками

Рекомбинантные микробные клетки, такие как дрожжевые или грибковые клетки (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Aspergillus niger и т.д.), либо бактериальные клетки (Escherichia coli, Bacillus subtilis и т.д.), которые были сконструированы для секретирования гетерологичных белков (например, инсулин или бразцеин) или естественно секретируемых ферментов (например, A. niger, B. subtilis и т.д.) можно выращивать в биореакторах, соединенных с компактными осадительными устройствами согласно настоящему изобретению, рециркулирующими живые и продуцирующие клетки обратно в биореактор для достижения высокой плотности клеток и высокой производительности. Внутрь биореакторов, содержащих клетки с высокой плотностью, непрерывно подается свежая питательная среда к живым и продуцирующим клеткам, причем секретируемые белки или ферменты непрерывно собираются в осветленной жидкости, выпускаемой через верхний порт (или выпускные отверстия 353A, 354A, 553A, 554A на верхней стороне осадительного устройства), в то время как концентрированные живые и продуцирующие клетки возвращаются обратно в биореактор. Поскольку мертвые клетки и малая фракция живых клеток непрерывно удаляются из биореактора через выпускное отверстие для сбора, рост клеток и выработка белка могут поддерживаться неопределенно долго, без какой-либо реальной потребности в прекращении работы биореактора. При проведении процессов с дрожжевыми клетками Pichia с использованием конических осадительных устройств согласно настоящему изобретению время эксплуатации перфузионного биореактора составляло более месяца. Поскольку микробные клетки растут в суспензионной культуре и устройство для удержания клеток может быть увеличено до любого требуемого размера, осадительное устройство согласно настоящему изобретению может использоваться с суспензионным биореактором размером от лабораторного (менее 1 л) до промышленного (более 50000 л) или любого промежуточного размера, что позволяет получить перфузионные культуры с высокой плотностью клеток.

В одном из конкретных примеров описана культура перфузионного биореактора дрожжевых клеток Pichia pastoris. Дрожжевые клетки Pichia pastoris выращивали в 5-литровом биореакторе, управляемом компьютером, сначала в периодическом режиме для выращивания клеток из посевной культуры в течение 50 часов, далее в режиме периодической подпитки при медленном заполнении присоединенного 12-литрового осадительного устройства клеток в течение следующих 100 часов, а затем в режиме непрерывной перфузии с помощью компактного осадительного устройства клеток согласно настоящему изобретению, чтобы удалить более мелкие мертвые клетки и рециклировать более крупные живые клетки обратно в биореактор. Типичная схема соединения компактного осадительного устройства клеток/частиц согласно настоящему изобретению с любым многофункциональным биореактором показана на фиг. 24.

Как показано на фиг. 24, дрожжевые клетки Pichia pastoris выращивали в перфузионном биореакторе (218). Среду для выращивания добавляли в биореактор (218) из резервуара (200) для среды посредством первого насоса (202), соединенного с входным трубопроводом (201). Содержание растворенного кислорода и pH непрерывно отслеживали в биореакторе (218) с помощью монитора (206) растворенного кислорода и монитора (204) pH. Культуру дрожжевых клеток из биореактора (218) подавали в 12-литровый компактное осадительное устройство (208) клеток согласно настоящему изобретению посредством второго насоса (214), соединенного с трубопроводом (212). Вытекающую из компактного осадительного устройства клеток (208) жидкость, которая содержала мелкие мертвые клетки, откачивали по трубопроводу (210) для отвода вытекающей жидкости. Большие живые клетки по возвратному трубопроводу (217) посредством третьего насоса (216) возвращали из устройства для осаждения клеток (208) обратно в биореактор (218). Уровни среды и клеточной культуры в биореакторе (218) контролировали путем удаления избытка клеточной культуры по отводному трубопроводу (222) посредством четвертого насоса (220).

Результаты, полученные при применении указанного перфузионного биореактора, оснащенного компактным устройством для осаждения клеток/частиц согласно настоящему изобретению, представлены на фиг. 25. Кружками обозначена измеренная при длине волны 600 нм оптическая плотность отобранных из биореактора образцов, которая повышается во время начального периодического режима, режима с периодической подпиткой культуры в течение примерно 150 часов и режима с непрерывной перфузией на протяжении вплоть до 1600 час или более 2 месяцев. Для корректировки скорости потока вытекающей из осадительного устройства жидкости или скорости собираемого потока выполняется регулировка или настройка входного насоса осадительного устройства, либо настройка рециркуляционного насоса осадительного устройства. Концентрация клеток (согласно измерениям оптической плотности (OD) при длине волны 600 нм) и их распределение по размерам определяются скоростью потока сбора и распределением по размерам клеток, поступающих из биореактора, а также другими факторами, такими как коэффициент рециркуляции потока из осадительного устройства. Поток вытекающей жидкости содержит очень мало клеток, о чем свидетельствуют очень низкие значения оптической плотности (OD) в диапазоне от 0 до 30, даже при постепенном повышении скорости перфузии от 2000 мл/день до более 6000 мл/день. Полученные результаты показывают, что в биореакторе была достигнута и поддерживалась весьма высокая плотность клеток благодаря рециркуляции большей части живых клеток обратно в биореактор и селективному удалению более мелких мертвых клеток и клеточного дебриса. Даже при увеличивающейся скорости перфузии и высокой плотности клеток биореактор может функционировать неограниченно без необходимости остановки по каким-либо причинам, таким как засорение мембран в конкурентных мембранных устройствах для удержания клеток.

Образцы, отобранные одновременно из биореактора и вытекающей из осадительного устройства жидкости, анализировали с помощью анализатора размеров частиц. Результаты нормализованного распределения клеток по размеру, представленные на фиг. 26, ясно показывают, что размер клеток в вытекающей из осадительного устройства жидкости значительно меньше размера клеток в биореакторе. Эти результаты демонстрируют, что из вытекающей из осадительного устройства жидкости, предпочтительно, удаляются более мелкие мертвые клетки и любой клеточный дебрис, в то время как более крупные живые клетки, предпочтительно, возвращаются в биореактор. Таким образом, биореактор непрерывно очищается путем селективного удаления мертвых клеток и клеточного дебриса в вытекающей из осадительного устройства жидкости, благодаря чему не наблюдается скопление мертвых клеток и клеточного дебриса в биореакторе, которое обычно происходит во всех других устройствах удержания клеток.

В ранний момент процесса перфузионного культивирования образцы из биореактора и вытекающей из осадительного устройства жидкости были отобраны и центрифугированы в малых ампулах объемом 2 мл. Было установлено, что клетки из биореактора (218), осажденные центрифугированием, занимают почти 50% объема спрессованных клеток в ампуле, в то время как клетки вытекающей из осадительного устройства жидкости (208), осажденные центрифугированием, занимают только около 5% объема спрессованных клеток. Указанные результаты еще раз подтверждают, что в вытекающей из осадительного устройства жидкости удаляется лишь очень незначительная часть интактных мелких клеток из биореактора, в то время как большинство более крупных интактных клеток, предпочтительно, возвращается в биореактор.

На протяжении указанного двухмесячного перфузионного процесса проводились измерения общего содержания белка в биореакторе и вытекающей из осадительного устройства жидкости, при этом было установлено, что после начального периодического режима и режима с периодической подпиткой, то есть во время длительного перфузионного процесса, общее содержание белка в образце вытекающей из осадительного устройства жидкости (208) постоянно превышало общее содержание белка в образце из биореактора (218). Указанные результаты весьма убедительно свидетельствуют об отсутствии просеивания белка внутри осадительного устройства (208), что обычно происходит в мембранных устройствах для удержания клеток, таких как ATF с перфузионными культурами клеток млекопитающих. Кроме того, указанные результаты дают основание полагать, что в осадительном устройстве (208) происходит дополнительное продуцирование белка, в результате чего концентрация белка в вытекающей жидкости всегда выше, чем в биореакторе (218) в тот же самый момент.

Общее количество аккумулированного белка в потоке для сбора из перфузионного биореактора непрерывного действия, конфигурация которого показана на фиг. 24, можно сравнить с количеством белка, который может быть собран в бесклеточном супернатанте одиночного биореактора (218) периодического действия при культивировании продолжительностью 158 часов и многократном повторении указанной продолжительности культивирования до достижения, например, 1600 час. При культивировании с подпиткой необходима приостановка биореактора на длительный период для сбора продукта или опорожнения, очистки внутренних поверхностей биореактора, стерилизации на месте паром, охлаждения, повторного заполнения биореактора стерильной средой, засева биореактора свежими клетками, после чего требуется время для выращивания клеток с получением достаточно высокой плотности для обнаружения значительного увеличения белкового титра, в противоположность этому перфузионный биореактор непрерывного действия бесперебойно функционирует при высокой плотности клеток с высокой продуктивностью на протяжении всего периода культивирования. Следовательно, общее количество аккумулированного белка в потоке непрерывно собираемого продукта возрастает достаточно быстро по мере увеличения скорости перфузии, достигая 160 г, то есть количество белка в 5 раз превышает количество белка, которое может быть собрано в бесклеточных супернатантах в результате 8 повторных операций культивирования с подпиткой в том же 5-литровом биореакторе.

Пример 2

Удаление дрожжевых клеток из пива

При крупномасштабном производстве пива дрожжевые клетки удаляются из готового пива посредством фильтровальных устройств, которые регулярно засоряются, или при помощи устройств центрифугирования, которые являются дорогостоящими высокоскоростными механическими устройствами. Ранее гидроциклоны безуспешно тестировались для этого применения (Yuan et al., 1996; Cilliers and Harrison, 1997). Указанные устройства могут быть легко заменены осадительными устройствами согласно настоящему изобретению, в которых осветленное пиво отводится через верхние выпускные отверстия, а концентрированная суспензия дрожжевых клеток удаляется через нижние выпускные отверстия. Благодаря увеличенному времени пребывания жидкости и более эффективному осаждению в конических зонах осадительных устройств согласно настоящему изобретению обеспечивается успешное отделение дрожжевых клеток, при этом собранный супернатант клеточной культуры содержит только около 5% клеток, поступающих в осадительное устройство во время первой операции. Поскольку размер устройства можно увеличивать или уменьшать, чтобы повысить или снизить эффективность сепарации клеток, через порт сбора можно получить полностью бесклеточное пиво, если требуется. Таким образом, устройства согласно настоящему изобретению могут успешно применяться в пивоварении, для осветления пива, а также и на бродильных установках, работающих в непрерывном режиме.

Пример 3

Осветление бульона клеточной культуры млекопитающих или удаление клеток

Как и в представленном выше примере 2, осветление бульона клеточной культуры млекопитающих в конце культивирования в биореакторе периодического действия является необходимым начальным этапом в сборе секретируемого продукта, например в виде антител или терапевтических гликопротеинов, за которым следует другие этапы обработки. В настоящее время центрифугирование и глубинная фильтрация используются в качестве обычных отдельных операций для удаления клеток млекопитающих и клеточных дебрисов из бульона клеточной культуры. Однако периодическое удаление накопленных клеток при непрерывном процессе центрифугирования приводит к повторному выбросу клеток в осветленный супернатант клеточной культуры. Осадительное устройство согласно настоящему изобретению непрерывно осуществляет осветление супернатанта (с получением бесклеточного или существенно обедненного клетками), так как клетки млекопитающих легко осаждаются внутри устройства. Указанные компактные осадительные устройства более стабильно обеспечивают удаление клеток из бульона клеточных культур, при этом можно исключить центрифугирование и уменьшить площадь мембраны, обеспечивающей вторичную глубинную фильтрацию для полного удаления любых оставшихся клеток и всего клеточного дебриса. Осветление может осуществляться в периодическом режиме или в непрерывном режиме работы перфузионных биореакторов, как будет описываться ниже.

Пример 4

Перфузионные культуры клеток млекопитающих

Усиленная седиментация мышиной гибридомы и рекомбинантных клеток млекопитающих в наклонных осадительных устройствах была успешно продемонстрирована (Batt et al., 1990 и Searles et al., 1994) и наибольший эффект был обеспечен в ламельных осадительных устройствах (Thompson and Wilson, патент США № 5817505). В то время как ламельные осадительные устройства масштабируются в трех измерениях независимо, конический осадительное устройство согласно настоящему изобретению можно масштабировать сразу в трех измерениях, лишь за счет увеличения его радиуса, как обсуждалось выше. Таким образом, осадительные устройства согласно настоящему изобретению являются более компактными, содержат намного больше наклонных поверхностей для осаждения, занимают меньшее пространство и являются легкомасштабируемыми устройствами для удержания клеток, хорошо зарекомендовавшими себя применительно к клеточным культурам млекопитающих, секретирующим гликопротеины, такие как моноклональные антитела, и другие терапевтические белки. Осветленный выходящий сбор, содержащий секретируемый белок, непрерывно отбирается через верхний порт устройства для удержания клеток, в то время как концентрированные клетки через нижнее выпускное отверстие рециркулируют обратно в биореактор, благодаря чему обеспечивается высокая плотность клеток в перфузионном биореакторе, который может работать неограниченно, (то есть в течение нескольких месяцев непрерывной перфузии). Один 1000-литровый перфузионный биореактор при высокой плотности клеток способен обеспечить непрерывный сбор с высоким титром, превышающий накопленную продукцию из большого (более 20000 л) биореактора периодического действия в расчете на год.

Рекомбинантные клетки яичника китайского хомячка, которые обычно используются для сверхэкспрессии и секреции терапевтических гликопротеинов, культивировали в 1-литровом контролируемом биореакторе, соединенном с 4-дюймовым компактным устройством для осаждения клеток, как схематически показано на фиг. 24. Измеряли плотность жизнеспособных клеток в биореакторе, в жидкости, вытекающих из верхней части осадительного устройства и в возврате из нижней части осадительного устройства в биореактор. Было установлено, что по прошествии 60 час с начала операции перфузии с жидкостью, вытекающей из верхней части осадительного устройства, было удалено очень малое количество живых клеток, при этом увеличилось количество жизнеспособных клеток, возвращенных в биореактор через нижнее выпускное отверстие осадительного устройства. Отсюда следует, что с началом перфузионного процесса в биореакторе постепенно увеличивается плотность жизнеспособных клеток (VCD, при этом резко возрастает процент жизнеспособных клеток (ромбики) в биореакторе.

На 5-й день процесса определяли распределение клеток по размерам, измеренным анализатором Beckman-Coulter Multisize Analyzer, в образцах из биореактора и жидкости, вытекающей из верхней части осадительного устройства, полученная гистограмма распределения клеток/частиц по размерам в образцах из биореактора показала широкое распределение живых клеток и, возможно, дублетов в диапазоне размеров от примерно 10 мкм до примерно 30 мкм с пиком примерно 16 мкм и острый пик мертвых клеток размером от 8 до 9 мкм, а также огромный хвост клеточного дебриса в диапазоне размеров менее 8 мкм. Другая гистограмма распределения клеток/частиц по размерам, полученная при измерениях на том же приборе, в образцах жидкости, вытекающей из верхнего выпускного порта компактного осадительного устройства клеток (208), показала увеличенный пик мертвых клеток размером от 8 до 9 мкм, хвост клеточного дебриса в диапазоне размеров менее 8 мкм и полное отсутствие какого-либо пика живых клеток около 16 мкм. Проведенные измерения размеров убедительно показали, что из жидкости из перфузионного биореактора (218), вытекающей из верхней части осадительного устройства, селективно удаляются более мелкие мертвые клетки и клеточный дебрис, в то время как более крупные живые клетки постоянно возвращаются в перфузионный биореактор (218). Указанное селективное удаление более мелких мертвых клеток и клеточного дебриса было продемонстрировано (Batt et al. 1990 и Searles et al. 1994) с помощью наклонных пластинчатых осадительных устройств. Применение осадительных устройств клеток согласно настоящему изобретению подтвердило указанные успешные результаты, при этом конструкция осадительных устройств является более компактной и более легко масштабируемой. Ни одно из других доступных в настоящее время устройств для удержания клеток млекопитающих не демонстрирует указанную селективность при удалении мелких мертвых клеток и клеточного дебриса.

Пример 5

Получение вакцин, вирусов или вирусоподобных частиц или вектора для генной терапии

Получение вакцин, вирусов или вирусоподобных частиц (VLP), или векторов для генной терапии, аденоассоциированных вирусов (AAV), лентивирусов и т.д. обычно осуществляется путем инфицирования и лизиса живых клеток млекопитающих или насекомых в культуре биореактора периодического действия. Вирусы или вирусоподобные частицы высвобождаются из инфицированной клетки в литическом процессе после большого внутриклеточного продуцирования этих вирусов или вирусоподобных частиц. Поскольку размер этих частиц сильно отличается (в субмикронном или нанометровом масштабе) от размера (около 5-20 мкм) живых клеток млекопитающих и насекомых, очень легко осуществляется отделение вирусов или вирусоподобных частиц от культуры в периодическом биореакторе или периодическом биореакторе с подпиткой. Контролируя непрерывный сбор или скорость выхода осветленного бульона клеточной культуры, содержащего, главным образом, вирусы или вирусоподобные частицы (VLP), наряду с клеточными дебрисами, внутри биореактора можно вместе с растущими живыми клетками удерживать меньшее количество инфекционных частиц для непрерывного инфицирования и получения вакцины в перфузионном биореакторе непрерывного действия, соединенном с осадительным устройством согласно настоящему изобретению для непрерывного сбора вирусов и вирусоподобных частиц (VLP).

Пример 6

Сепарация и рециркуляция твердых частиц катализатора

Сепарация твердых частиц катализатора для рециркуляции в реактор и повторного использования в дальнейших катализируемых жидкофазных химических реакциях, таких как синтез Фишера-Тропша, была ранее продемонстрирована с помощью ламельных осадительных устройств (патент США № 6720358, 2001 г.). Многие двухфазные (жидкофазные или газофазные) химические реакции с участием твердых частиц катализатора могут быть улучшены с помощью осадительных устройств частиц согласно настоящему изобретению, которые являются более компактными устройствами сепарации частиц, способными выполнять сепарацию и рециркуляцию твердых частиц подобно ламельным осадительного устройствам.

Пример 7

Сбор клеток растений и водорослей

Культуры рекомбинантных клеток растений, секретирующих ценные продукты, хотя еще и не являются коммерчески перспективными, являются еще одной областью потенциального применения осадительных устройств согласно настоящему изобретению. Наклонные осадительные устройства использовались в нескольких приложениях для культивирования клеток растений. Указанные устройства можно заменить более компактными коническими спиральными осадительными устройствами согласно настоящему изобретению. Поскольку размер растительных клеток больше размера дрожжевых клеток или клеток млекопитающих, эффективность сепарации клеток будет выше для клеток отдельных растений или культур растительных тканей.

Более актуальным коммерческим применением осадительных устройств согласно настоящему изобретению может быть сбор клеток водорослей из крупных культивационных прудов для получения биодизеля из клеток водорослей. Относительно разбавленную биомассу водорослей в больших (размером с акр) неглубоких прудах, преобразующую солнечную энергию во внутриклеточные запасы жира или жирных кислот, можно легко собрать с помощью конического спирального осадительного устройства согласно настоящему изобретению, а концентрированные клетки водорослей можно собрать через нижнее выпускное отверстие.

Пример 8

Очистка муниципальных сточных вод

В крупномасштабных муниципальных очистных сооружениях (в которых применяется активный ил или консорциумы нескольких видов бактерий для разложения биологических и органических отходов в канализационных водах или сточных водах) обычно используются большие осадительные устройства, а в более современных версиях указанных сооружений используются ламельные осадительные устройства для отделения осветленной воды от осадка сточных вод. Конические спиральные осадительные устройства согласно настоящему изобретению можно масштабировать до размера, требуемого для указанных сооружений, однако даже в этом случае они будут меньше, чем гравитационные осадительные устройства или ламельные осадительные устройства, используемые в настоящее время в очистных сооружениях.

Пример 9

Очистка промышленных сточных вод

В крупномасштабных водоочистных сооружениях, предназначенных для очистки промышленных сточных вод или природных источников мутной воды, содержащей взвешенные твердые частицы, используют крупномасштабные гравитационные осадительные устройства или ламельные наклонные осадительные устройства. Взамен указанных крупномасштабных устройств можно использовать более компактные конические спиральные осадительные устройства согласно изобретению с той же целью, то есть для очистки воды для промышленного повторного использования или муниципального снабжения пресной водой.

Пример 10

Захват и очистка моноклональных антител на гранулах, покрытых белком А

Супернатанты клеточных культур, содержащие моноклональные антитела, могут контактировать с покрытыми белком А микросферами или гранулами (40-200 мкм) внутри предложенного авторами изобретения осадительного устройства, причем они поступают через разные впускные отверстия, например гранулы поступают через верхнее впускное отверстие, а супернатант клеточной культуры поступает через нижний порт, благодаря чему обеспечивается максимальный контакт и эффективность захвата. Захват моноклональных антител на гранулах белка А происходит очень быстро, и занимает обычно менее 10 минут времени пребывания внутри колонок для аффинной хроматографии. Микросферические гранулы, покрытые белком А, быстро оседают и, находясь в суспензии, могут хорошо перемешиваться для вступления в контакт с супернатантом клеточной культуры, подаваемым через нижнее впускное отверстие. Обедненные супернатанты клеточных культур могут непрерывно удаляться через верхнее выпускное отверстие осадительного устройства клеток согласно настоящему изобретению, функционирующего в режиме периодической загрузки. Гранулы, увлеченные восходящей жидкостью, будут оседать на наклонных поверхностях и возвращаться в нижнюю зону перемешивания. После загрузки, близкой к максимальной связывающей способности добавляемых гранул, гранулы могут быть промыты обычным промывочным раствором примерно 3-5-кратного объема осадительного устройства для удаления через верхнее выпускное отверстие несвязанного белка клетки-хозяина вместе с дебрисами мертвых клеток, которые присутствуют в супернатанте.

По завершении тщательной промывки осуществляют медленную подачу элюента для удаления связанных антител в жидкую среду, при этом концентрированный раствор антител удаляется через верхний порт, а гранулы остаются внутри осадительного устройства. По завершении элюирования проводят уравновешивание гранул путем закачки через нижнее впускное отверстие уравновешивающего раствора, посредством которого гранулы удерживаются во взвешенном состоянии. После уравновешивания гранул в осадительное устройство загружают следующую партию супернатанта клеточной культуры для повторения вышеуказанного четырехэтапного процесса, аналогичного процессу, проводимому в хроматографической колонке. Осадительные устройства клеток согласно настоящему изобретению при использовании для захвата моноклональных антител имеют нижеперечисленные преимущества: (i) загрузка напрямую супернатанта клеточной культуры для контакта с гранулами белка А без необходимости удаления мертвых клеток или клеточного дебриса, обычно присутствующих в супернатанте; (ii) эффективный немедленный контакт всех суспендированных гранул с поступающим супернатантом, вместо постепенного или замедленного воздействия моноклональных антител на неподвижный слой гранул в глубине колонки. Когда вместо аффинной колоночной хроматографии проводится аффинный захват антител посредством гранул белка А, суспендированных внутри осадительных устройств согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, отпадает необходимость в проводимых в настоящее время отдельных операциях центрифугирования и/или глубинной фильтрации для удаления мертвых клеток и клеточного дебриса, что позволяет существенно снизить производственные затраты.

Указанный этап аффинного захвата секретируемых антител посредством гранул, покрытых белком А и следующие за ним этапы промывки, элюирования и регенерации могут осуществляться последовательно в единственном осадительном устройстве периодического действия, либо непрерывно в нескольких осадительного устройствах, установленных последовательно. В рабочем режиме гранулы, покрытие белком А, будут переноситься из одного осадительного устройства в следующий осадительное устройство, фактически, в противоточном или поперечном потоке с бульоном культур клеток или разными буферами в каждом осадительном устройстве согласно вариантам осуществления настоящего изобретения.

Пример 11

Декантер/Осадительное устройство клеток для in situ экстракции секретируемых органических продуктов из клеток

Продуцирование и секреция некоторых ароматизирующих и вкусо-ароматических веществ метаболически сконструировано в микробных клетках дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae. Некоторые из этих соединений могут быть более токсичными для клеток и легко экстрагируются в органическую жидкость для снижения клеточной токсичности и повышения продуктивности дрожжевых клеток. Эмульсии, содержащие органическую жидкость с секретируемым продуктом и водный слой с продуктивными микробными клетками, из смесительной емкости биореактора можно закачать через впускной порт в компактное осадительное устройство клеток согласно настоящему изобретению. Внутри тихих зон осадительного устройства эмульсия легко разделяется на верхний органический слой, собираемый через верхний порт, и водный слой с живыми и продуктивными клетками, которые оседают на дно и рециркулируются в биореактор через нижний порт. Клеточный дебрис фракционируется в органический слой и легко удаляется из верхней части осадительного устройства. Живые и продуктивные клетки в водном слое возвращаются в перфузионный биореактор для увеличения плотности клеток и повышения производительности перфузионного биореактора.

Пример 12

Выращивание in vitro различных клеток млекопитающих в компактном осадительном устройстве клеток, используемом в качестве автономного перфузионного биореактора

В настоящее время область выращивания in vitro различных клеток млекопитающих, таких как стволовые клетки и клетки CAR-T, находит все большее распространение благодаря использованию стерильных одноразовых мешков для культивирования в качестве биореакторов, размещаемых на качающейся платформе для смешивания или внутри CO₂ инкубатора с контролем pH. Такие мешковые биореакторы все чаще эксплуатируются в режиме непрерывной перфузии для удаления накопленных отходов метаболических побочных продуктов, таких как аммиак и лактат, с использованием мембран для микрофильтрации в качестве устройств для удержания клеток в мешке, чтобы во время выращивания поддерживалась высокая жизнеспособность клеток. Однако во время длительной операции перфузии в указанных мешках накапливаются мертвые клетки и клеточный дебрис, которые не могут быть удалены через микрофильтрационные мембраны мешка. Осадительные устройства согласно настоящему изобретению могут эффективно функционировать как автономные эрлифтные биореакторы, работающие в режиме непрерывной перфузии для введения свежих питательных веществ и удаления продуктов метаболизма, а также для выборочного удаления любых мертвых клеток и клеточного дебриса. Нижний порт можно использовать как впускное отверстие для контролируемой смеси нескольких газов CO₂, O₂ и N₂ для поддержания требуемых значений pH и DO в биореакторе. Поднимающийся через центральную часть воздух увлекает или уносит некоторое количество жидкости для культивирования клеток, обеспечивает мягкое перемешивание питательных веществ в биореакторе и выходит через верхний выпускной канал, в то время как жидкость выводится из цилиндрического участка и рециркулирует через конические осадительные устройства. Возвратная жидкость для культивирования клеток может отбираться для непрерывных измерений pH, DO с вводом полученных значений в компьютер, контролирующий входящую газовую смесь, и для периодического определения плотности и жизнеспособности клеток, если требуется. После завершения выращивания клеток концентрированные живые клетки собираются через нижний порт путем перенаправления потока газа в мешок для сбора клеток. Основное преимущество предложенного авторами изобретения осадительного устройства клеток/биореактора заключается в том, что он обеспечивает легкое удаление мертвых клеток и клеточного дебриса вместе с токсичными побочными продуктами метаболизма для достижения высокой плотности живых клеток, выращиваемых in vitro для аутологичной клеточной терапии.

Пример 13

Непрерывная сепарация осажденных или концентрированных терапевтических белков

Некоторые терапевтические белки (например, аналог инсулина гларгин и моноклональные антитела) могут быть осаждены путем добавления простых солей (например, хлорида цинка для гларгина или сульфата аммония для антител), регулирования pH и других растворителей (например, м-крезола или других фенольных соединений для гларгина и этанола для антител). Такое осаждение представляет собой недорогую альтернативу хроматографии в последующих процессах очистки указанных терапевтических белков. В настоящее время эти этапы осаждения проводят в периодическом режиме с последующим центрифугированием или декантацией для отделения супернатанта от осаждающего агента.

Используя осадительные устройства согласно настоящему изобретению, можно реализовать непрерывный процесс сепарации. Богатая белком среда сбора (после удаления любых клеток с помощью микрофильтрации, центрифугирования или других методов) вводится в компактное осадительное устройство клеток согласно настоящему изобретению вместе с другими необходимыми химическими веществами, такими как растворители или соли в растворе, корректирующем pH, например, NaOH или HCl. В процессе осаждения в осадительном устройстве богатый белком осаждающий агент может непрерывно удаляться через нижнее выпускное отверстие, а обедненный белком супернатант может непрерывно удаляться через верхнее выпускное отверстие.

Пример 14

Ex vivo выращивание мезенхимальных стромальных/стволовых клеток (МСК) на гранулах-микроносителях и очистка выращенных стволовых клеток

Мезенхимальные стромальные/стволовые клетки (МСК) могут выращиваться ex vivo при наличии подходящей питательной среды и их обычно выращивают прикрепленными к поверхностям, например, к поверхностям колб для тканевой культуры, чашек Петри, роллерных флаконов, клеточных кубов и гранул-микроносителей. Процесс выращивания клеток, прикрепленных к гранулам-микроносителям (размер от 100 мкм до 500 мкм), очень легко масштабируется, поскольку гранулы-микроносители суспендированы встряхиванием или перемешиванием в биореакторах, регулируемых для достижения оптимальных условий роста, таких как pH, температура, концентрация растворенного кислорода и концентрация питательных веществ. Однако процесс отделения выращенных стволовых клеток от микроносителей является сложным, поскольку требуется ферментативное отцепление, незамедлительная отмывка избытка фермента и отсоединение стволовых клеток от гранул-микроносителей. Существующие в настоящее время этапы последовательной обработки являются трудоемкими, при этом не исключен риск загрязнения. Каждый из этих сложных этапов может быть легко выполнен в биореакторе/осадительном устройстве клеток согласно настоящему изобретению, который может быть оснащен сенсорными зондами, смонтированными внутри корпуса циклона. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, сенсорные зонды содержат флуоресцентные зонды для измерения внутри корпуса циклона одного или нескольких из pH, растворенного кислорода (DO), концентрации глюкозы, температуры и уровня CO₂. В частности, в этих осадительного устройствах: (i) избыток фермента очень легко смывается или удаляется через верхний порт при подаче свежей питательной среды через нижний порт, в то время как медленно оседающие отсоединенные клетки и быстро оседающие очищенные гранулы-микроносители циркулируют внутри осадительного устройства, (ii) очищенные гранулы-микроносители (100-500 мкм) оседают намного быстрее, чем стволовые клетки (10-20 мкм), и их можно удалить из нижнего порта, пока стволовые клетки циркулируют во взвешенном состоянии, и (iii) наконец, можно собрать выращенные стволовые клетки через нижний порт в требуемой концентрации для последующих применений в клеточной терапии.

Пример 15

Сокультивирование стромальных клеток на гранулах-микроносителях, секретирующих факторы роста, необходимые для поддержания выращивания или роста in vitro других дифференцированных клеток, таких как Т-лимфоциты или кардиомиоциты

Для выращивания и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты или активированные лимфоциты (клетки CAR-T) в биореактор для культивирования необходимо добавлять дорогостоящие факторы роста. Требуемые затраты можно снизить путем сокультивирования требуемых клеток с сконструированными мезенхимальными стволовыми клетками (МСК), которые выделяют требуемые факторы роста в питательную среду. Указанные секретирующие фактор роста клетки поддерживают рост других требуемых клеток, таких как CAR-T-клетки, кардиомиоциты и т.д. Сокультивирование может осуществляться в комбинированных устройствах биореактор/сортировщик клеток согласно настоящему изобретению, при этом существенно снижаются затраты на продуцирование или выращивание требуемых клеток. Выращенные клетки можно легко удалить из сокультуры потоком свежей среды, подаваемым со скоростью, требуемой для удаления выращенных единичных клеток или агрегатов клеток, при этом более крупные гранулы-микроносители сохраняются внутри биореактора/осадительного устройства клеток.

Пример 16

Фракционирование или сортировка любой смешанной популяции клеток, например, костного мозга, на несколько субпопуляций с желательными и нежелательными характеристиками

В любой биореактор/осадительное устройство клеток согласно настоящему изобретению, загруженный начальным болюсом смешанной популяции клеток (например, клеток костного мозга), можно подавать поток свежей питательной среды с постепенным, ступенчатым увеличением скорости потока, чтобы с верхним вытекающим потоком, выходящим с минимальной скоростью, удалялись самые мелкие клетки (например, тромбоциты, красные кровяные тельца и т.д.), при увеличении скорости выходящего потока удалялись клетки большего размера (лимфоциты, мононуклеарные клетки и т.д.) а при максимальной скорости выходящего потока удалялись самые большие клетки (такие как макрофаги, мегакариоциты и т.д.). Благодаря увеличению подачи питательных веществ и благодаря постепенному, ступенчатому увеличению скорости верхнего вытекающего потока можно получить относительно чистые популяции одного желательного типа клеток, которые в питательной среде для выращивания здоровых клеток покидают биореактор/сортировщик клеток с возможностью дальнейшего размножения и последующего использования.

Пример 17

Продуцирование универсальных эритроцитов in vitro

В настоящее время разрабатываются новые методы генной инженерии для направленной дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток в клетки эритроидной линии. Проэритробласты, являясь наиболее ранней стадией коммитирования в эритропоэзе, имеют довольно большие размеры (12-20 мкм), вплоть до трех раз превышающие размеры нормального эритроцита. Полихроматофильные нормобласты являются следующей стадией эритроидной линии и имеют размер (12-15 мкм), то есть меньше, чем проэритробласты. Ортохроматофильные нормобласты относятся к ядросодержащим клеткам-предшественникам эритроидов и имеют размер еще меньше (8-12 мкм), за ними следуют еще более мелкие зрелые безядерные красные кровяные тельца. (Geiler, C., et al., International Journal of Stem Cells, 9: 53-59). Биореактор/сортировщик клеток согласно настоящему изобретению способен фракционировать клетки по размерам, при этом только мельчайшие зрелые безядерные эритроциты удаляются с жидкостью, выходящей из верхней части устройства, наиболее крупные клетки-предшественники удерживаются и непрерывно размножаются внутри биореактора/сортировщика клеток.

Пример 18

Крупномасштабное продуцирование тромбоцитов

Выращивание ex vivo мегакариоцитарных клеток с высокой плоидностью в биореакторе с контролируемыми условиями культивирования и их разделение на более мелкие тромбоцитарные клетки лучше понимается на фундаментальном уровне (Panuganti, S., et al., Tissue Engineering Part A, 19: 998-1014). По мере углубления знаний могут быть установлены необходимые параметры культивирования, которые можно контролировать в указанных биореакторах/сортировщиках клеток для выращивания и дифференцировки мегакариоцитарных клеток, чтобы собирать только зрелые тромбоциты, а отделенные более мелкие тромбоциты удалять через верхнее выпускное отверстие осадительного устройства.

Для предоставления дополнительных сведений, контекста и для дополнительного удовлетворения требованиям относительно письменного описания в соответствии с разделом 35 Кодекса США § 112 полностью включены в описание настоящего изобретения посредством ссылки нижеперечисленные документы: патент США 5,624,580, публикация заявки на патент США 2009/159523, публикация заявки на патент США 2011/097800, публикация заявки на патент США 2012/180662, публикация заявки на патент США 2014/011270.

Вышеприведенные примеры осуществления настоящего изобретения были представлены и описаны с иллюстративной целью. Указанные примеры не предназначены для ограничения изобретения раскрытой здесь формой. Следовательно, изменения и модификации в соответствии с описанными руководствами для осуществления изобретения и на основании навыков и знании в соответствующей области техники, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Конкретные варианты осуществления изобретения описаны посредством представленных в настоящем документе примеров для облегчения понимания известных способов практического применения изобретения, чтобы специалисты в данной области техники могли использовать те или другие варианты осуществления изобретения с разнообразными модификациями для всевозможных приложений. Подразумевается, что прилагаемая формула изобретения должна быть истолкована как включающая альтернативные варианты осуществления в пределах, допускаемых предшествующим уровнем техники.

Реферат

Группа изобретений относится к устройству и способу осаждения клеток или частиц и может быть использовано для отделения мелких частиц от основной жидкости в различных областях, таких как выращивание культур клеток (микробов, млекопитающих, растений, насекомых или водорослей), отделение частиц твердого катализатора от жидкости или газа и очистка сточных вод. Осадительное устройство содержит верхний (503А) и нижний (503В) конический участки, имеющие по меньшей мере один порт, цилиндрический участок (508), стопку конусов (509), расположенную внутри осадительного устройства, и диффузор (570), расположенный внутри осадительного устройства. Каждый конус в стопке конусов имеет малое отверстие и большое отверстие, при этом малое отверстие ориентировано к одному из верхнего конического участка и нижнего конического участка, причем указанная стопка конусов центрирована вокруг продольной оси осадительного устройства. Диффузор содержит трубчатый стержень, соединенный с портом, выбранным из по меньшей мере одного порта нижнего конического участка, и кольцо, выступающее из трубчатого стрежня. Раскрыт также способ осаждения суспендированных частиц с использованием указанного устройства. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности сепарации частиц при помощи компактного устройства, которое легко масштабировать до требуемого размера. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 26 ил., 18 пр.

Формула