Мембрана для использования при направленной регенерации тканей - RU2217171C2

Описание

Область техники
Настоящее изобретение относится к имплантату в виде коллагеновой мембраны для использования при направленной регенерации тканей, в частности для использования in vivo при реконструкции костной или хрящевой ткани.

Уровень техники
Давно известно, что при регенерации тканей трудно реконструировать хрящевую ткань, например при повреждениях хрящей. Повреждения хрящей могут происходить в любых суставах, хотя крупные суставы, такие как коленный и локтевой, подвергаются наибольшему риску. Такие повреждения могут быть результатом травмы, дегенеративных состояний или вскрытий при остеохондрите. Повреждения суставов являются главным патомеханическим фактором при развитии артроза. Выделение ферментов приводит к воспалительному процессу в синовиальной оболочке, который в свою очередь приводит к стиранию хряща и деструкции поверхности сустава. Недавние попытки регенерировать in vivo суставной хрящ при дефектах хряща включают имплантацию культивированных аутогенных суставных хондроцитов (КСХ). Однако эта методика имела ограниченный успех.

В настоящее время общепринято, что реконструкция ткани требует обеспечения матрикса, служащего проводником для клеток, которые растут вдоль волокон и между волокнами матрикса. Недавно было предложено использовать КСХ, высаживаемые на синтетические и природные рассасывающиеся матриксы. Однако попытки реконструкции хрящевой ткани с использованием матриксов на основе полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты и коллагена 1 (оссеина, главного компонента сухожилий, связок и хрящей) или коллагена III (упрочняющего компонента стенок полых органов, в том числе кровеносных сосудов, кишечника) требовали, чтобы матриксы заселялись хондроцитами in vitro перед имплантацией. Это дает увеличение числа осложнений, то есть иммунологических воспалительных реакций при участии гигантских клеток и фибробластических клеток на поверхности между имплантатами и тканью, по сравнению со стерильной культурой хондроцитов.

Международная заявка, опубликованная под номером WO-A-96/25961, предлагает матриксный имплантат на основе коллагена II (хондрина, главного компонента хрящевой ткани), который может быть имплантирован на участок in vivo и который обеспечивает рост нативных (природных) хондроцитов на поверхности матрикса, результатом которого является регенерация хряща. Однако способность такого матрикса обеспечивать полную регенерацию хрящевой ткани ограничена.

Поэтому существует потребность в матриксном имплантате, который обеспечивал бы успешное врастание в него нативных хондроцитов и таким образом - регенерацию хрящевой ткани после имплантации in vivo. В настоящее время авторы изобретения обнаружили, что хрящ и, в конечном счете, новую костную ткань можно реконструировать посредством использования матрикса из коллагена II, который in vivo отграничен не только от окружающей соединительной ткани, но и от подлежащего дефекта кости или хряща. Предполагается, что этого можно достичь за счет использования имплантата в виде многослойной мембраны, которая сама по себе способна предотвращать нежелательное врастание в матрикс окружающих тканей, и который можно хирургически имплантировать на место дефекта, чтобы получить такой эффект.

Сущность изобретения
В одном из аспектов изобретение обеспечивает многослойную мембрану, содержащую матриксный слой, состоящий преимущественно из коллагена II и имеющий рыхлую губчатую структуру, и по меньшей мере один барьерный слой, имеющий плотную, относительно непроницаемую структуру.

Особым преимуществом использования мембраны согласно настоящему изобретению является то, что нативные клетки не способны проникнуть в слой или расти в слое, имеющем плотную, относительно непроницаемую структуру.

Хотя авторам и не хотелось бы быть связанными теорией, в настоящее время считается, что успешная регенерация хряща требует предотвращения быстрого врастания в область дефекта не только нативных клеток тканей, например соединительных тканей, кровеносных сосудов и т.п., но и новой костной ткани. Этого можно достичь при использовании двухслойной мембраны согласно настоящему изобретению, которая служит защитой коллагенового матрикса от врастания нативных клеток ткани с одной стороны. Во время хирургической имплантации эта мембрана может быть использована в сочетании с тканевым трансплантатом, например трансплантатом надкостницы, эффективно предотвращающим врастание нативных клеток ткани с противоположной стороны. Поэтому, например, трансплантат надкостницы может быть первоначально подшит на место так, чтобы он обеспечивал закрытие дефекта кости или хряща. Затем на место дефекта может быть имплантирована двухслойная мембрана согласно настоящему изобретению так, чтобы она находилась в контакте с трансплантатом и могла быть прикреплена таким образом, чтобы матриксный слой был обращен к дефекту кости. Более предпочтительно, двухслойную мембрану согласно настоящему изобретению первоначально имплантируют на место дефекта так, чтобы барьерный слой был обращен к дефекту кости или хряща. Затем укрепляют трансплантат надкостницы так, чтобы он находился в контакте с матриксным слоем. Трансплантат можно приклеить биосовместимым клеем, таким как фибриновый клей, или прикрепить рассасывающимися скобками из полимолочной кислоты, или, если это необходимо или возможно, подшить таким образом, чтобы он впоследствии служил непроницаемым барьером для врастания прилежащей соединительной ткани.

В альтернативном способе осуществления изобретения мембрана сама может эффективно предотвращать врастание нативных клеток ткани. Поэтому, с другой стороны, изобретение обеспечивает мембрану, содержащую, по меньшей мере, три слоя, в которой матриксный слой, состоящий, главным образом, из коллагена II и имеющий явно выраженную губчатую структуру, расположен между двумя барьерными слоями, имеющими плотную, относительно непроницаемую структуру.

Матриксный слой способен служить средой для врастания нативных хондроцитов, обеспечивая таким образом регенерацию хрящевой ткани. Однако, чтобы еще больше способствовать регенерации хрящевой ткани, матриксный слой может быть импрегнирован хондроцитами, либо перед, либо после имплантации in vivo. Хотя матриксный слой может быть импрегнирован хондроцитами непосредственно перед имплантацией, например, путем инъекции, ожидается, что обычно хондроциты будут вводиться в матриксный слой посредством прямой инъекции суспензии хондроцитов после имплантации. При этом хондроциты, присутствующие в основном слое мембраны, способны осуществлять регенерацию хряща и, в конечном итоге, новой кости, хотя мембрана одновременно предотвращает врастание других типов клеток из окружающих тканей.

Хондроциты для использования в настоящем изобретении могут быть получены из таких источников клеток, которые включают аллогенные или аутогенные клетки, выделенные из суставного хряща, надкостницы и надхрящницы, и мезенхимные стволовые клетки костного мозга (клетки стромы). Так как аллогенные клетки обладают потенциалом для иммунного ответа и инфекционных осложнений, предпочтительно выделять хондроциты из аутогенных клеток, в особенности из аутогенного суставного хряща. Методики накопления клеток известны и включают ферментативное расщепление или рост в культуре. Выделенные клетки затем размножают в культуре клеток перед обратным введением в организм. Обычно, по меньшей мере, 10⁶, предпочтительно, по меньшей мере, 10⁷ клеток следует импрегнировать в матриксный слой, чтобы обеспечить оптимальную регенерацию хрящевой ткани.

Обычно желательно, чтобы матриксный слой мембраны согласно настоящему изобретению содержал гликозаминогликаны (ГАГ), такие как гиалуроновую кислоту, хондроитин-6-сульфат, кератинсульфат, дерматансульфат и т.п., которые служат для создания природной среды, в которую хондроциты могут внедряться и размножаться. Хотя можно внедрить в коллагеновую основу гликозаминогликаны из разных источников, которые не обязательно имеют такие же состав, молекулярный вес и физиологические свойства, как гликозаминогликаны хряща, предпочтительными гликозаминогликанами являются гликозаминогликаны, экстрагированные из самого хряща. Обычно матриксный слой предпочтительно содержит от 1 до 10 весовых процентов гликозаминогликанов, например 2-6 весовых процента. Хотя некоторые гликозаминогликаны могут присутствовать в непроницаемом слое, большая их часть будет присутствовать в матриксном слое.

В нативных коллагенсодержащих тканях ГАГ существуют, по меньшей мере частично, в качестве компонента протеогликанов (ПГ). Использование ГАГ в форме ПГ нежелательно в связи с потенциальными иммунологическими проблемами, которые могут быть вызваны содержанием белков в ПГ. Поэтому предпочтительно матриксный слой практически не должен содержать протеогликанов. Этого можно достичь, изготавливая матриксный слой из смеси очищенного, не содержащего телопептидов коллагена II и гликозаминогликанов.

Другие добавки, которые также могут присутствовать в основном слое, включают, например, хондронектин, ламинин, фибронектин, альгинат кальция или анкорин II, помогающие прикреплению хондроцитов к волокнам коллагена II, и факторы роста, такие как фактор индукции хряща (ФИХ), инсулиноподобный фактор роста (ИФР), трансформирующий фактор роста β(ТФГ-β), присутствующий в виде гомодимеров или гетеродимеров, и морфогенетические факторы кости (МФК), такие как нативный или рекомбинантный МФК-2 человека, МФК-3 (остеогенин), МФК-4 и МФК-7 (ОП-1, остеогенный протеин-1). МФК-2 независимо влияет на два способа образования кости - прямое образование кости и образование хряща, который затем удаляется и замещается костью. Композиты из МФК и коллагена, включая костный матрикс, получаемый посредством экстракции из кортикальных костей из различных источников, или деминерализованный костный матрикс, состоят из 90% коллагена и 10% неколлагеновых белков (НКБ) для обеспечения активности МФК или индуцируемого МФК/НКБ хондрогенеза. Костный матрикс - нерастворимая коллагеновая основа - и ламинин или фибронектин действуют как переносчики МФК. Некоторые факторы роста могут также присутствовать в непроницаемом слое. Однако большая часть их будет присутствовать в основном слое. Обычно мембрана содержит от 100 мкг до 5 мг факторов роста.

Как указано выше, мембрана включает минимум два слоя, имеющие различные структуры. Предпочтительно барьерный слой мембраны изготавливают, главным образом, из коллагена I и III. Альтернативно он может содержать синтетический материал, например синтетическую рассасывающуюся полимерную сетку, которая может быть покрыта коллагеновым материалом, таким как коллаген I типа и/или коллаген III типа.

Примеры подходящих синтетических материалов включают полиэфиры, гомополимеры и сополимеры полигликолевой и полимолочной (ПМК) кислот, сополимеры гликолидов и лактидов, полиортоэфиры и поликапролактоны. Многие примеры этих веществ широко доступны, например, в компании Boehringer Ingelheim в их ассортименте продуктов RESOMER. Предпочтительны ПМК полимеры в виде восков с соответствующим размером молекул, равным примерно 650-1200, и не слишком быстрой деградацией. Особо предпочтительным биодеградируемым полимером является поли(D,L-молочная кислота), в которой соотношение D-лактида и L-лактида равно примерно 70:30. Преимущество таких синтетических материалов состоит в том, что они могут иметь высокую механическую устойчивость, которая позволяет натянуть мембранный имплантат поверх сложных, трехмерных дефектов костей без разрывов. Такие материалы также пригодны для подшивания.

Барьерный слой преимущественно состоит из длинных волокон коллагена, которые соединены настолько плотно, что высокомолекулярные вещества не могут проникать через этот барьер. Длинные волокна обеспечивают высокий предел прочности на разрыв и сопротивление разрыву, так что этот материал не только является хорошей разделяющей мембраной, но и его можно легко сшивать. При хирургических операциях важно, чтобы мембранные имплантаты можно было пришивать или прикреплять в нужном положении, а многие мембраны, предлагавшиеся раньше, не обладают этим свойством. Мембрана согласно настоящему изобретению достаточно механически устойчива, чтобы ее можно было хирургически обработать перед имплантацией.

Матриксный слой является очень пористым и может иметь удельный вес до 0,02, что обеспечивает очень быстрое врастание клеток в этот слой. Этот слой мембраны, который в норме также содержит гликозаминогликаны, сильно набухает и может поглощать до 5000% жидкости. В идеале матриксный слой должен иметь пористую структуру (пористую объемную фракцию и размер пор), которая дает возможность адгезии и росту клеток и позволяет посеянным клеткам сохранять хондроцитический фенотип, характеризующийся синтезом белков, специфичных для хряща. Размеры пор будут зависеть от процесса сублимационной сушки, используемого для получения основы из коллагена II, но можно ожидать, что он будет в диапазоне от 10 до 120 мкм, например, от 20 до 100 мкм. Опционально размер пор может быть равен примерно 85 мкм. Такой размер пор можно легко получить путем медленного замораживания при температуре от -5^oС до -10^oС в течение примерно 24 часов с последующей сублимационной сушкой или путем добавления бикарбоната аммония к пасте перед лиофилизацией.

Матриксный слой мембраны предпочтительно обеспечивают коллагеном II, полученным из хряща, предпочтительно гиалинового хряща свиней.

Хотя желательная толщина матриксного слоя будет зависеть от природы дефекта кости или хряща, подлежащего обработке, в основном можно ожидать, что она будет лежать в диапазоне от 2 до 10 мм, например от 4 до 6 мм. Толщина барьерного слоя предпочтительно равна от 0,2 до 2 мм, например от 0,2 до 0,7 мм.

Барьерный слой может представлять собой натуральную животную мембрану, содержащую коллаген I и III. Поскольку ее получают из природного источника, она полностью рассасывается в организме и не образует токсичных продуктов распада. Такие мембраны также обладают особенно высокой прочностью на разрыв как в сухом, так и во влажном состоянии и поэтому могут быть, при необходимости, сшиты хирургическими швами. Во влажном состоянии материал является очень эластичным, что дает возможность натянуть его на дефекты кости неправильной формы.

Кроме коллагена, природные животные мембраны содержат много других биоматериалов, которые следует удалить. Известна обработка таких мембран ферментами, растворителями или другими химическими веществами для осуществления очистки и для использования таких мембран в медицине. Большинство из этих материалов являются слишком тонкими, и очень часто их довольно трудно использовать. Коллагеновые фибриллы теряют свой нативный характер, и дополнительным недостатком является то, что материал часто имеет недостаточную прочность для использования в качестве сшиваемого материала, не обладает свойством набухания в воде и не имеет различий между гладкой лицевой стороной и волокнистой обратной стороной. Было обнаружено, что волокнистая форма очищенного коллагена типа I или II, не содержащего телопептида, менее растворимая и биодеградируемая, позволяет получить наиболее благоприятный материал подложки.

Мембраны, обеспечивающие барьерный слой продукта согласно настоящему изобретению, включают перитонеальную мембрану телят или свиней, которая сохраняет свою натуральную коллагеновую структуру. Перитонеальные мембраны молодых свиней в возрасте 6-7 недель (весом 60-80 кг) особо предпочтительны.

Барьерный слой должен предпочтительно содержать чистый, нативный (не денатурированный) нерастворимый коллаген и может быть изготовлен в соответствии со способом, описанным в WO-A-95/18638. Поэтому натуральную мембрану можно вначале обработать щелочами, например водным раствором NaOH в концентрации 0,2-4 вес. %. Это позволяет произвести омыление всех жиров, а также белков, чувствительных к щелочам. Второй стадией является обработка материала кислотой, обычно неорганической кислотой, такой как HCl. Это удаляет загрязнения, чувствительные к кислоте. Затем материал промывают до тех пор, пока рН не будет находиться в диапазоне 2,5-3,5. После этого мембрана имеет гладкую, или лицевую, сторону и рыхлую, более волокнистую сторону. Может оказаться полезным осуществить образование поперечных связей в мембране путем нагревания до 100-120^oС.

Коллаген II, используемый для получения матриксного слоя мембраны, можно получить из хряща посредством процедуры, сходной с процедурой, описанной выше для барьерного слоя, содержащего главным образом коллаген I и III. Предпочтительно удалить из хряща воду посредством обработки его ацетоном с последующей экстракцией жира углеводородным растворителем, таким как n-гексан, хотя можно использовать и алканолы, такие как этанол, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, или хлорированные углеводороды, такие как хлороформ, или их смеси. Обезжиренный материал затем подвергают обработке щелочью, которая омыляет все остаточные жиры и разрушает некоторые из присутствующих белков. В заключение, материал обрабатывают кислотой, которая осуществляет дополнительную деградацию белков. Материалу дают набухнуть в воде и пропускают через коллоидную мельницу для получения пасты.

Чтобы получить многослойную мембрану, мягкую пасту, содержащую коллаген II, наносят на волокнистую сторону гладкой мембраны, полученной, например, в соответствии с WO-A-95/18638. В норме мембрану помещают на гладкую поверхность лицевой стороной вниз, так что можно легко нанести пасту из коллагена II, например, посредством втирания в волокнистую сторону мембраны. Паста при этом образует слой любой желаемой толщины, который плотно прилипает к коллагеновой мембране. Образованный таким образом двойной слой подвергают замораживанию и сублимационной сушке для получения желаемой губчатой структуры, имеющей желаемый размер пор. Если необходимо, часть матриксного слоя можно удалить, придав двойной мембране равномерную толщину. Чтобы получить трехслойную мембрану, поверх матриксного слоя размещают вторую гладкую мембрану, причем ее волокнистая сторона контактирует с матриксным слоем.

Паста из коллагена II для нанесения на мембрану обычно содержит 1,0-4,0 весовых % коллагена, предпочтительно 2-3 весовых %. Для удобства значение рН этой смеси следует довести до 2,5-4,5, предпочтительно до 3,0-4,0.

В материале из коллагена II можно образовать поперечные связи после стадии сублимационной сушки, чтобы стабилизировать матриксный слой. Это также способствует повышению механической устойчивости матриксного слоя и снижению скорости его рассасывания в организме. В идеале уровень поперечного связывания должен быть таким, чтобы скорость деградации матрикса соответствовала скорости регенерации ткани. Физически поперечное связывание можно осуществить посредством нагревания, но его нужно производить осторожно, чтобы избежать нежелательной потери рассасываемости. Предпочтительно нагревание до температур 100-120^oС в течение периода от 30 минут до 5 часов. Более предпочтительно поперечное связывание может быть выполнено посредством УФ облучения с использованием УФ лампы, например, в течение периода продолжительностью до 8 часов.

Материал из коллагена II обычно содержит гликозаминогликаны. Последние фактически реагируют с коллагеном II, обеспечивая некоторое поперечное связывание, и дают нерастворимый продукт. Если это необходимо, дополнительное поперечное связывание можно осуществить посредством нагревания материала или УФ облучения, как описано выше. Реакцию между гликозаминогликанами и коллагеном можно провести при комнатных температурах при рН в диапазоне 2,5-3,5. Количество гликозаминогликанов может колебаться между 1 и 10 весовыми процентами. Материал можно подвергнуть замораживанию и сублимационной сушке сразу же после этой обработки.

Альтернативно образование пасты можно осуществить посредством повышения рН массы из коллагена II. При этой процедуре массу охлаждают примерно до 4^oС, а значение рН медленно повышают путем добавления холодного водного раствора NaOH при температуре 4^oС, до значений рН 6,5-7,5. Затем массу выдерживают при комнатной температуре в течение 15-25 часов. В это время образуется паста, а после образования пасты массу можно заморозить и подвергнуть сублимационной сушке.

Еще одной альтернативой является нейтрализация массы коллагена II до значений рН 6,8-7,4, после удаления воздуха. Смесь помещают в форму и инкубируют в течение 15-20 часов при 37^o С. Образуется мелкозернистая паста, которую впоследствии можно заморозить и подвергнуть сублимационной сушке.

Какой из этих трех вышеизложенных способов будет использован, зависит от свойств желаемого продукта. Первый процесс дает наиболее стабильный продукт. Однако преципитация может привести к образованию комков материала, и ее нужно проводить очень осторожно. Второй способ дает мягкий и однородный продукт, который, однако, более растворим, чем продукт, полученный в первом процессе.

При изготовлении пасты можно дополнительно ввести желаемые вещества, такие как лекарственные препараты, например антибактериальные, такие как тауролидин, или антибиотики, такие как гентамицин.

После нанесения пасты на мембрану материал замораживают. Чтобы получить воспроизводимый размер пор, замораживание следует тщательно контролировать, и необходимо точно регулировать скорость и время замораживания, значение рН и размер частиц. Чтобы получить очень мелкие поры, материал можно очень быстро заморозить до очень низкой температуры.

Затем замороженную мембрану подвергают сублимационной сушке, а после этого нагревают до 110-130^oС. Таким образом получают некоторое перекрестное связывание. После этого подвергнутая сублимационной сушке биомембрана может быть доведена до требуемой толщины, так что толщина матриксного слоя обычно равняется примерно 2 мм. Затем двойную мембрану стерилизуют, например, гамма-излучением или окисью этилена. Стерилизация сильным облучением, например излучением Со⁶⁰ в дозах порядка 25 кГр, может дезактивировать МФК. При таких обстоятельствах стерильную основу можно перед имплантацией импрегнировать МФК, находящимися в стерильном растворе.

Мембрану согласно настоящему изобретению можно использовать в медицине следующими способами.

В качестве материала для направленной регенерации тканей. Матриксный слой способствует росту клеток. Барьерный слой ингибирует нежелательный рост клеток.

В качестве материала для восстановления дефектов хрящей, то есть поражений, которые не затрагивают субхондральной пластинки, и для восстановления остеохондральных дефектов.

Изобретение также позволяет использовать многослойную коллагеновую мембрану, описанную выше, при направленной регенерации тканей. Содержание коллагена II в мембране особенно подходит для регенерации хрящевой ткани, но подходит и для других типов тканей.

Поэтому в еще одном аспекте изобретение обеспечивает мембрану, описанную здесь выше, пригодную для использования в качестве имплантата при направленной регенерации тканей.

Кроме того, изобретение обеспечивает способ лечения дефектов хрящей или костей в организме человека или животных, вышеуказанный способ включает наложение вышеописанной мембраны на дефект, причем вышеуказанную мембрану ориентируют таким образом, что барьерный слой предотвращает врастание нежелательных типов тканей в область регенерации кости или хряща.

Описание примеров осуществления изобретения
Нижеследующие примеры приведены только в качестве иллюстрации. В примерах все стадии процесса следует проводить при асептических условиях, например в "чистых производственных помещениях".

Пример 1.

(А) Перитонеальные мембраны от молодых телят полностью освобождали от мяса и жира механическими способами, промывали под проточной водой и обрабатывали 2% раствором NaOH в течение двенадцати часов. Затем мембраны промывали под проточной водой и подкисляли 0,5% HCl. После того как материал закислился по всей толщине (примерно через три часа), материал промывали до тех пор, пока не было получено значение рН 3,5. Затем материал усаживали 7% солевым раствором, нейтрализовали 1% раствором NaHCO₃ и промывали под проточной водой. Затем материал дегидратировали ацетоном и обезжиривали n-гексаном. В результате был получен барьерный слой, представляющий собой натуральную животную мембрану, содержащую коллаген I и коллаген III.

(Б) Замороженный хрящ от свежезабитых свиней погружали в холодную воду, тщательно промывали и механически очищали от остатков мяса, костей и твердых частиц. Затем материал в течение 30 минут промывали под проточной водой.

Далее материал три раза измельчали в гомогенизаторе. Размер видимых частиц в конце измельчения составлял примерно 8 мм.

Кусочки хряща обезвоживали посредством 4-кратного промывания ацетоном, каждый раз - в течение 8 часов. Затем хрящ обезжиривали посредством 4-кратной экстракции n-гексаном. Каждая обработка длилась минимум 8 часов. Соотношение гексана и хряща было равно 1:10.

После обезжиривания хрящу давали набухнуть в питьевой воде. Соотношение вода : материал было равно 10:1. Время обработки было равно 24 часам.

Затем материал обрабатывали NaOH (5 вес.%), причем соотношение хряща и жидкости было равно 1: 4, а время обработки было равно 32 часам. Во время обработки кусочки хряща хорошо перемешивали. Далее от хряща отмывали щелочь. Исходный рН, равный 14, при этом снижался до 9-11. Растворенные загрязнения отмывали и отделяли от хряща. Жидкость, образовавшуюся при обработке щелочью, собирали для выделения гликозаминогликана.

Коллагеновый материал затем обрабатывали крепким раствором HCl (примерно 3 вес.%), сначала - при значении рН ниже 1,0. Время обработки было равно 4-6 часам.

Далее материал промывали холодной водой достаточно долго для того, чтобы значение рН увеличилось до 3-3,5. Все загрязнения удаляли, и продукт представлял собой коллагеновую массу, не содержавшую солей, пригодную для изготовления губок или других коллагеновых материалов. С этой целью масса, полученная из хряща, может быть, в зависимости от желаемого результата, дегазирована, заморожена и подвергнута сублимационной сушке.

Экстракт, образующийся при вышеописанной обработке щелочью, содержал гликозаминогликан, щелочи, денатурированные белки и соли. Вначале экстракт нейтрализовали при помощи НСl, значение рН после нейтрализации было равно 6. Затем экстракт обрабатывали фильтрующим устройством, а именно - кизельгуром, который удаляет денатурированные белки. К экстракту добавляли 0,5 весового процента кизельгура и удаляли его путем фильтрации вместе с денатурированным белком.

Затем супернатант подвергали ультрафильтрации с использованием мембраны, отделявшей частицы с молекулярным весом примерно 10000 дальтон. Таким образом удаляли соли и оставляли очищенный гликозаминогликан.

Раствор гликозаминогликана, полученный таким образом, примешивали к вышеописанному коллагеновому материалу, для получения матрикса из коллагена II, содержащего гликозаминогликан.

Масса из коллагена II имела следующие свойства:
TG = 2,8 вес.%,
ГАГ = 3 вес.% (рассчитано в пересчете на коллаген),
Значение рН 3,5.

(С) Свежеприготовленную перитонеальную мембрану, приготовленную так, как описано в пункте (А), равномерно вымачивали в воде и расстилали на стеклянной пластинке волокнистой стороной вверх. Далее мембрану тщательно смачивали массой из коллагена II, приготовленной так, как описано в пункте (Б) выше. Мембрану растягивали по плоскости во всех направлениях так, чтобы она оставалась прикрепленной к пластинке. Затем в мембрану втирали массу из коллагена II.

На мембрану наносили очень толстый слой массы, и пластинку оставляли на ночь в холодильнике при температуре примерно 4^oС. В этот период образовывалась паста.

Пасту замораживали при следующих условиях:
Температура ванны: -12^oС,
Время: 40 минут.

Далее замороженную пасту подвергали сублимационной сушке и затем нагревали до 125^oС.

Время сублимационной сушки: 14 часов.

Затем матриксный слой коллагена II срезали до толщины 1 мм.

Пример 2.

Свежеприготовленную перитонеальную мембрану из примера 1(А) накладывали на стеклянную пластинку, и в мембрану втирали густую массу коллагена II, имеющую такие же свойства, как в примере 1. 50 г массы коллагена II разводили 100 мл воды и тщательно перемешивали. Во время перемешивания медленно добавляли 100 мл раствора гликозаминогликана. Коллаген преципитировали в форме массы совместно с ГАГ. После преципитации массу гомогенизировали, а полученную таким образом дисперсию наносили на мембрану. В течение ночи образовывалась паста, и обработанную мембрану далее обрабатывали так, как описано в примере 1.

Реферат

Изобретение относится к многослойной мембране, содержащей матриксный слой, состоящий преимущественно из коллагена II и имеющий рыхлую губчатую структуру, и, по меньшей мере, один барьерный слой, имеющий плотную, относительно непроницаемую структуру. Такая мембрана особенно подходит для использования in vivo при направленной регенерации тканей, в частности для использования при реконструкции костной или хрящевой ткани. Преимуществом использования мембраны является то, что нативные клетки не способны проникнуть в слой или расти в слое, имеющем плотную относительно непроницаемую структуру. 4 с. и 16 з.п. ф-лы.

Формула