Биосинтетический гепарин - RU2019105262A
Код документа: RU2019105262A
Формула
1. Гликозаминогликан, содержащий некоторое количество N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы, причем указанное количество является эффективным для получения биосинтетического гепарина.
2. Гликозаминогликан по п. 1, содержащий 78-99%, 81-97%, 83-95% или 85-93% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы.
3. Гликозаминогликан, содержащий некоторое количество N-сульфатированной, 2-сульфатированной (NS2S) дисахаридной группы, причем указанное количество является эффективным для получения биосинтетического гепарина.
4. Гликозаминогликан по п. 3, содержащий 44-80%, 50-78%, 55-77% или 60-76% NS2S группы и/или дополнительно содержащий NS дисахаридные группы, предпочтительносодержащий 13-39%, 14-35%, 15-30% или 16-26% NS группы.
5. Гликозаминогликан, содержащий некоторые количества N-сульфатированной, 2-сульфатированной, 6-сульфатированной (NS2S6S) дисахаридной группы и N-сульфатированной, 6-сульфатированной (NS6S) дисахаридной группы, при этом указанные количества эффективны для получения биосинтетического гепарина.
6. Гликозаминогликан по п. 5, содержащий 31-73% NS2S6S дисахаридной группы и 6-40% NS6S дисахаридной группы, 36-70% NS2S6S дисахаридной группы и 6-32% NS6S дисахаридной группы, 40-67% NS2S6S дисахаридной группы и 6-26% NS6S дисахаридной группы, или 43-64% NS2S6S дисахаридной группы и 6-22% NS6S дисахаридной группы; и/или дополнительно содержащий N-сульфатированную, 2-сульфатированную (NS2S) дисахаридную группу и N-сульфатированную (NS) дисахаридную группу, предпочтительно содержащий 0-27% NS2S группы и 1-22% NS группы или 12-27% NS2S группы и 1-17% NS группы.
7. Гликозаминогликан по любому из пп. 1-6, обладающий среднемассовой молекулярной массой, подходящей для получения конечного продукта гепарина с молекулярной массой 15000-19000 Да, причем процент цепей гепарина с молекулярной массой более 24000 Да составляет не более 20% от общего количества цепей, и отношение цепей с молекулярными массами в диапазоне от 8000 до 16000 Да к проценту цепей с молекулярными массами от 16000 до 24000 Да составляет не менее 1,0.
8. Гликозаминогликан по пп. 5 или 6, который не содержит 3S дисахаридных групп.
9. Способ получения биосинтетического гепарина, включающий:
a. получение гликозаминогликан а, содержащего 31-73% NS2S6S дисахаридной группы, 6-40% NS6S дисахаридной группы, 0-27% NS2S группы и 1-22% NS группы;
b. обработку гликозаминогликана ферментом, который представляет собой изоформу 1 3-О-сульфотрансферазы (3-ОСТ-1), в присутствии донора сульфата.
с получением партии биосинтетического гепарина.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что на этапе (b) достаточное количество остатков глюкозамина превращают в остатки 3-О-сульфоглюкозамина, так чтобы активности полученной партии против Ха и против IIa составляли не менее 180 единиц/мг и отношение активностей против Ха/против IIa составляло 0,85-1,15, или отношение активностей против Ха/против IIa составляет 0,9-1,1.
11. Способ получения второго интермедиата гликозаминогликана, содержащего 44-80% NS2S группы и 13-39% NS группы; причем указанный способ включает:
а. превращение некоторого количества остатков N-ацетилглюкозамина в гепаросане с получением первого гликозаминогликана, содержащего 78-99% N-сульфатированной (NS) дисахаридной группы, при этом указанное количество превращенных остатков N-ацетилглюкозамина соответствует количеству NS группы в первом интермедиате гликозаминогликана; и
b. обработку первого интермедиата гликозаминогликана ферментом, который представляет собой С5-эпимеразу (С5-эпи) и 2-О-сульфотрансферазу (2-ОСТ), в присутствии донора сульфата
с получением второго интермедиата гликозаминогликана.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанное превращение включает проведение реакции гепаросана с основанием и сульфонирующим реагентом или с N-деацетилазой, N-сульфотрансферазой (N-ДСТ).
13. Способ получения третьего интермедиата гликозаминогликана, содержащего 31-73% NS2S6S дисахаридной группы, 6-40% NS6S дисахаридной группы, 0-27% NS2S группы и 1-22% NS группы:
указанный способ включает обработку второго интермедиата гликозаминогликана, содержащего 44-80% NS2S группы и 13-39% NS группы, ферментом, который представляет собой изоформы 1 и/или 3 6-О-сульфотрансферазы (6-ОСТ-1/3), в присутствии донора сульфата с превращением второго интермедиата гликозаминогликана в третий интермедиат гликозаминогликана.
14. Способ по любому из пп. 9-13, отличающийся тем, что донор сульфата включает ФАФС, предпочтительно при этом ФАФС находится в растворе;, причем донор сульфата включает ПАФ и ПНФС, и при этом указанную обработку осуществляют в присутствии системы рециркуляции, включающей ФАФС, ПНФС и катализатор, предпочтительно при этом катализатор представляет собой арилсульфотрансферазу IV (ACT-IV); или указанную обработку осуществляют внутри сконструированного микробного штамма, содержащего гены, кодирующие N-ДСТ, С5-эпи, 2-ОСТ, 3-ОСТ-1, одну или обе 6-ОСТ-1 и 6-ОСТ-3 и источник ФАФС.
15. Способ по любому из пп. 9-14, отличающийся тем, что фермент находится в растворе, или иммобилизован.
