Способ получения лейкоцитарных интерферонов человека - SU1414319A3

СМ

Изобретение относится к области технологии рекомбинантвых ДНК, т,е« к способам, использующимся в реком- бинантиой ДНК-технологии, и к продуктам полученньвд этими способами.

Пример, Используют два мик- роорганизма; Eocoli х1776 и E.coli К-12 штямм (конец A.thi , hsr , bsn-L) ,

мРНК лейкоцитарного интерферона человека (LelF) получают из лейко- п.итой человек а 5 взятых у- больных хронической миелогенной лейкемией Тако являются линия клеток, обозна- чемкая KG-tj полученных от пациентов с -острой миелогенной лейкемией„

У KG-1 клеток индуцируют продукцию лейкоцитарного интерферона мРНК с помощью вирусов Сендай или Ньюкаст ла, Клетки собирают 5 ч спустя после индуцирования и РНК приготовляют по методике с применением гуанидин-- тиоцианат-гуанидингидрохлорида. Для получения 12 S фракций поли (А) мРНК используют олигодеокситимидин d Т-целлюлозную хроматографию и са харе зное градиентное ультрацентри- фугч-грорание,

5 мкг мРНК используют для получения двойной цепочки кДНК по цепо методике,.. Указанные кДНК фрак цйокир тот по размерам с помощью электрофореза на 6%-ном полиакриламид- иом геле и 230 нг материала с разме- paMii в интервале от 500 до 1500 в,п. выде.г.яют электроэлюированием. 100 и г этой кДН К присоединяют к деоксицити- дкновым остаткам (dc) и реденатури- руют с 470 нг плазмид рН R3225 которые были соединены с деоксигуанозино вьми (dG) остатка; ш по (Pst I) сайту и используют для трансформации E.col х177бо Получают устойчивые к тетрациклину , чувствительные к ампициллин трансформанты о Синтезируют четыре набора дезоксиолигонуклеотидньгх зондов для каждой последовательности, содержащие три (T-IA, В, С, D) или , один (Т-13А, Bj С D) олигонуклеотид KaxgiaK.

мРНК получают из 12 S РНК,, KG-l индуцированных вирусом Сендай либо целиком поли (Л) мРНК из неиндуци Ч-г ,

рованньж лейкоцитов, Р меченные кДНК готовят известным способом Не. меченный продукт выделяют с покощью Гельфильтрации на колонке, заполненной 10 мл Сефадекс С-ЗО, обработан

0

5

0

5

0

5

0

ной о J 3N NaOn В течение 30 мин при 70 С для разрушения РНК нейтрализуют НС1 и осуществляют гибридизацию.

Для идентификации клонов pL1-pL30 используют быстрый процесс изолирования плазмиды по Бирнбойму.

При этом получают 1 мкг плазмиды. ДНК из каждых 500 индивидуальных трансформантов Secoli К-12 штаммг 294, Каждый образец ДНК денатурируют и наносят на нитроцеллюлозные фильтры в трех экземплярахр следуя методике Кафатоса с сотр (см, выше ) ,

Три группы нитроцэллюлозн ых фильтровэ содержащих 500 образцов плазмид5 гибридизируют со стимулированной кДНКд заложенной с Т-1 группой носителей информации (прай- меров), Т-ТЗ, заложенной стимулированной кДНК, нестикулированной кДНК,, приготовленной с использованием обеих групп носителей информации

Клоны считают положительными, если они гибридизирутот сильнее один или оба зонда стимулированной кДНК, чем полностью нестимулированный зонд Бьто отобрано 30 положительных клонов () из 500 для дальнейшего анализа.

Трансформанты E.coli х1776 скри- нируют по методике гибридизации колоний используя в качестве зонда

7

Р-меченную стимулированную мРНК. Немеченную мРИК из нестимулированных клеток смешивают с зондом при соотношении 200:1 для конкуренции с нестимулированной мРНК, имеющейся в

32.

Р-меченном препарате Гибридизация меченой мРНК будет происходить предпочтительно в колонияхJ содержащих стимулированные последовательности,

Получают три класса трансформантов;

yi 2-3% колоний, гибридизованных -

мРНК очень сильно5 10% гибридизован- нмх; значительно меньше, чем 1-й клесс; остальное, не дающее определимый сигнал гибриднаацин

Исследуют положительные колонии (классы 1 и 2) на наличие интерферон-специфических последовательностей с помощью анализа, который зависит от гибридизации интерфероновой мРНК конкретно в плазмиду ДНК, Пер- вокачапьно вьфащивают индивидуально 60 сильно положительных колоний (класс 1) в 100 -(л среды МЭ дополненной тетрациклином (200 мкг/мл),

диаминопимелиновой кислотой (100 мкг/мл), тимидином (20 мкг/мл)j и d-биотином (1 мкг/мл).

Среда М9 содержит 6 г/л , 3 г/л КНгР04 0,5 г NaCl и 1 После автоклавирования прибавляют 1 мл стерильного 1М MgS04 и 10 мл стерильного 0,01 М CaCl. Собирают 10 культур и изолируют плазмкду ДНК из тести пулов, как описано КлевеллоМ с сотр. Biochemistry 9, 4Д28-440 (1970). 10 мкг каждого пула плазмиды ДНК расщепляют Hind III денатурируют и ковалентно связывают с ДВМ (диазо- бензилоксиметиловой) бумагой. На каждом фильтре гибридизуют 1 мкг очищенной мРНК из стимулированных кле .ток, Негибридизованную мРНК удаляют промывкой. Специфически гибридизован- ную мРНК элюируют и транслируют в со циты личинок Xenopus. По этой пробе все 6 пулов были отрицательными. 5 пулов из 10 колоний каждый и 1 пул из 9 колоний делают из 59 слабо поло- жительных колоний (класс 2), Готовят плазмиды из пулов и исследуют, как описано вьппе. Среды 6 тестированных пулов был тестирован один (к10), гиб- ридизованный в интерферонную мРНК . при условии значительно выше исходных уровней каждого времени. Для того , чтобы определить специфический интерферонный кДНК-клон готовят плазмиды ДНК из 9 колоний пула К10 и ис- следуют индивидуально. Две из девяти плазмид (№101 и № 104) связьгоают ин;Терферонную мРНК существенно лучше чем при указанных исходных уровнях. Из плазмиды № 104 выделяют один Bgl II рестрикционный фрагмент, со4О

держащий 260 в.р,, меченный Р с использованием процедуры, описанной Тейлором с сотр.,и используют в качестве зонда для независимого скринин- га 400 E.coli 294 трансформантов с помощью процедуры скрининга колоний in situ.

Идентифицируют 9 колоний (рЬ 31- pL 39), которые гибридизуют до раз- личной степени с этим зондом.

Кроме того, используют меченньй 260 в,р, фрагмент для независимого скрининга 4000 E.coli 294 трансформантов таким же образом. Индентифи- цируют 50 колоний, которые гибридизуют до различной степени с этим зондом . Одна содержит LeIF G-фрагмент, одна - LelF Н-фрагмент и одна - фраг19Ч

мент, обозначениьш LeIF HI, очень похожий на LeIF Н. Полученные гибридные плазмиды обозначают pLEIF Н и т.п

Готовят плазмиду ДНК из всех 39 потенциальных LeIF кДНК клонов и проводят повторный скрининг с тем же 260 Ворс ДНК зондом, используя процедуру гибридизации Кафатоса с сотр. (см. вьше) . Три плазмиды (pL 4, pL31 pL 34) дают очень сильные признаки (сигналы) гибридизации, четыре (pL 13, pL 30, pL 32, pL 36) гибри- дизованы умеренно и три (pL 6, pL 8 L 14) слабо гибридизованы зондом.

Также скринируют 39 потенциальных LeIF кДНК рекомбинантных плазмид с использованием Р-меченных синтетических ундекамеров (индивидуальные Т-1 первичные пулы праймеров информации или индивидуальные Т-13 праймеры информации) непосредственно в качестве гибридизующих зондов. Условия гибридизации выбирают таким образом, что для определимых сигналов гибридизации должны требоваться точно спаренные основания. Следовательно, плазмида ДНК из 3 клонов была приготовлена по стандартной процедуре очищения лизата (Клевелл с сотр., см. выше) и очищена колонной хроматографией на Биорад Агарозе А-50.

Образцы по 3 мкг каждого препарата делают линейными обработкой Есо RI, денатурируют в щелочи и наносят на 2 отдельных нитроцел полозньгх фильтра по 1,5 мкг на пятно (Кафатос с г/ см. выше), Фосфорилируют инди видуальные синтетические деоксиоли7 гонуклеотидные праймеры информации и пулы праймеров информации с помощью ( ) ATP следующим образом: 50 пкмоль олигонуклеотида и 100 пкмол ( У з р) АТР, (2500 Кю/ммоль) объединяют в 30 мкл 50 мМ трис-НС1, 10 мМ MgCl, 15 1 ГЬ-меркаптоэтанола. Добавляют 2 ед. Т4 ПОЛИНУклеотидкиназы и после 30 мин при 37 С, Р-меченные праймеры информации очищают хроматографией в колонках с 10 мл Сефадекс ®G-50, Гибридизации осуществляют с использованием 10 срм пула праймеров Т-13С или 3 10 срм пула прайме- ра Т-1C при 15 С в течение 14 ч в 6х SSC (IxSSC 0,15 М NaCl, 0,015 М лимоннокислого натрия, рН 7,2, 10х раствор Денхардта (0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,2% полипи5М

нилпиролидона, 0,2% фиколла). Фильтры промывают 5 JIHH (3 раза) при О С 6х SSC, сушат и облучают на рентгеновской пленке, ,

При этом плазмида ДНК из клона 104 дает значительную гибридизацию с пулом праймеров информации Т-1С и праймеров информации T-ISC но не дает определимой гибридизации с другими ундекамерами. Несколько из 39 по тенциальных LeIF плазмид (pL 2,4,13j 17,20,30,31,34) также гибридизуют с обоими этими зондами. Pst 1-усвоение pL 31 показывает размер кДНК-вставки который должен составлять примерно 1000 в.р.

Найдено,, что первый/АТС-трансли- рующий начальный кодон состоит из 60 нуклеотидов от 5 конца последова тельности и затем 188 кодонов .после TGA концевого триплета, имеется 342 нетранслируемых нуклеотидов у З конца , следующих на поли-(А)-последовательностью ,, Путативный сигнальный пептид (по-видимому, включеиньм в секрецию готового LeIF. из лейкоцитов имеет длину из 23 аминокислот, 165 аминокислот, составляющих готовьш LeIF, имеют рассчитанный молекулярный вес 19390, LeIF5 закодированньй pL 31 обозначают LeIF А, SAU ЗА рес- трикционный эндонуклеазньй участок расположен между кодонами 1 и 3u)FA. Два синтетических деоксиолигонукле- отида включают АТС-транслирующ1й начальный кодон, реконструируют кодон аминокислоты 1 (цистеин) и создают Есо RI липкий конец. Эти олигомеры были связаны в 34 в,р„ SAU За-А all фрагмент pL 31. Полученньш в результате 45 в.р. продукт лигируют в два дополнительных фрагмента ДНК для конструирования 86,5 в.р. синтетическог ( натурального гибридного гена, Кото рый кодирует LIF Аи,который связывается Есо RI и Pst I .(рестрнкционны- М11 участками). Такой ген включают в pR R322 мелоду Есо RI и Pst I участками для получения плазмиды PLIF AI.

Конструкция триптофанового контрольного элемента, содержащего ,, E.coli trp промотор, оператор и trp лидер рибосомсвязывающего участка, но не содержащего АТС-последовательности для инициирования трансляции,

Плазмида pGMI несет триптофановый оперой E.coli, содержащий делецию &L Е1413, и экспрессирует протеин.

196

включающий первые 6 аминокислот trp лидера и приблизительно последний третий trp Е полипептид (позже упоминаемый в сочетании как LE ), а также trp D полипептид в его целости j все под контролем системы trp промотор-оператор, Плазмиду (20 мкг) обрабатывают рестрикционным ферментом PVU II, который расщепляет плаз- миду на пять участков Генные фрагменты затем комбинируют с линкерами Есо RI, состоящими из самокомплиментарного олигонуклеотида с последовательностью pCATGAATTCATG, обеспечн- вая Есо R 1-участок расщепления для последующего клонирования в плазмиду содержащута Есо. R 1-участок, Обрабатывают 20 мкг ДНК-фрагментов 5 полученных из pGMI, 10 ед« Тд ДНК-лмгазы в присутствии 200 пкмоль 5 -фосфорили рованного синтетического олигонуклеотида pGATGAATTCATG и в 20 мкл Т ДНК-лигазного буфера (20 kM трис,

рН 7,6, 0,5 мМ АТФ, 10 1Ж MgCL,, 5 мМ дитиотрейтола) 4 С в течение HO4Hi Затем раствор нагревают 10 мин при 70°С до прекращения лигации Gвязки отщепляют перевариванием Есо R I и

фрагменты, теперь с концами Есо R I, отделяют, используя электрофорез на 5%-ном пoлиaкpилa шднoм геле (ПАГЭ), и при наиболее широких фрагментах, выделенных из геля первым пятном с

этидиумбром}щом, локализуя фрагменты ультрафиолетовым светом, и вырезают из геля интересующие участки. Помещают каждый гелевый фрагмент с 300 мкл 0,1 X ТБЕ в диализаторный

бачок и подвергают электрофорезу при 100 В в течение часа в 0,1 ТБЕ-буфере (ТБЕ-буфер содержит: 10,8 г трис-ос-- новаяия, 5,5 г борной кислоты 0,09 г Na - ЭДАТУК в 1 л воды), Водный раствор собирают из диализатор- ного бачка, экстрагируют фенолом, экстрагируют хлороформом делают s 0,2 М раствор хлористого натрия и извлекают ДНК в воде после осаждения этаноломэ содержащий ген trp

промотор-оператор с липкими концами . Есо RI идентифицируют по указанной ниже процедуре, которая вызывает встзвление фрагментов в чувствительнуго к тетрациклину плазмиду, которая при вставлении промотор-оператора становится устойчивой к тетрациклину,

Штазмида рВРЛ экспрессирует ам пицкллиновую устойчивость и содер7 1

жит ген устойчивости к тетрациклину Следовательно, плазмнда чувствительна к тетрациклину. Плазмиду делают устойчивой к тетрациклину путем введения системы промотор-оператор в участок EcoRI,

pBRHI расщепляют EcoRI и удаляют фермент экстракцией фенолом с последующей экстракцией хлороформом и собирают в воде после осаждения этанолом . Полученную в результате молекулу ДНК в отдельных реакционных смесях объединяют с каждым из трех фрагмен™ тон ДНК, полученных выше, и лигируют с Т ДНК-лигазой, как описано выше, Используют ДНК}, находящуюс я в реакционной смесп. Для трансформации E.coli К-12 штамма 294 по стандартной методике и бактерии помещают на LB (Luria-Bertani)-пластины, содержащие 20 мкг/л ампициллина и 5 мкг/л тетрациклина . Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний, изолируют плазмиду ДНК и доказывают наличие же- даемого фрагмента с помощью рестрик- ционного ферментного анализа. Полученную плазмиду обозначают рВ RH trp.

Продукт расщепления с помощью Есо R I и Вам Н I вирусного генома гепатита В получают традиционным способом и клонируют в Есо R I и Ват Н I участки плазмиды р G Н 6 для образования плазмиды рН S 32. Затем расщепляют плазмиду рН S 32 с помощью Xbal, экстрагируют фенолом, хлороформом , осаждают этанолом и обрабатывают 1 мкл E.coli ДНК-полимеразой I Klenow фрагмент (Боерингер-Ман - нхейм) в 30 мкл полимеразного буфера (50 мМ фосфата калия рН 7,4 мМ MgClg 1 мМ | |-меркаптоэтанола) S содержащего 0,1 мМ d ТТР и 0,1 мМ, d СТР, в течение 30 мин при 0°С, затем 2 ч при 37 С. Такая обработка приводит к заполнению 2 из 4 нуклеотидов, комплементарных к выступакщему вперед 5 концу X Ьа I участка расщепления,

5 CTAGA .5 . CTAGA

3 Т 3 ТСТ Два нуклеотида, dC и dT, были включены и дали конец с двумя выступающими вперед 5 нуклеотидами. Такой линейный остаток плазмиды рН S 32 (после экстракции фенолом и клоро формом и сбора в воде после осаждения этанолом) расщепляют Есо R Ij отделя- ют широкий плазмидный фрагмент от меньшего Есо R I-XbaI-фрагмента с по19

мощью ПАГЭ и изолируют после электро- элюированиКс Этот ДНК-фрагмент из рН S 32 (0,2 мкт;) связывают в услови- як, подобных указанным вьппе., с Есо R 1-Тар, 1-фрапчентом триптофанового оперена ( OjOl мкг), происходящего из рВ RH trp, В способе легирования фрагс ента нз рП S 32 к фрагменту

Есо В I - Tag 1, как описано вьппе, аыступающрз вперед Tag I конец связан с Быстгттатлтдим вперед концом X Ъа Ij хотя он не совершенно спарен основан1-гю Уатсона-Крика

-Е CTAGA - -TCTAGA -AGC ТСТ - -AGCTCT - Часть этой лигационной реакционной смесн трансформир1|Тот в клетки E.coli 294, проводят термообработку и поме щают на пластины LB, содержащие ам- .пициллин. Отбирают 24 колонии, выращивают в 3 мл LB (Луриа-Бертани) среды и изолируют плазмиду. Найдено, что 6 из них имеют Xbal-участок ре- ренерированный с помощью E.coli, катализированной ДНК повторным спариванием и репликацией

- TCTAGA - - TCTAGA - - AGCTCT -- AGATCT Найдено , что эти плазмиды расщепляются как Есо R I, так и Нра I и дают ожидаемые рестрикционные фрагменты , Одну плазмиду, обозначенную рТгр 14 , используют для экспрессии гетерологических полипептидов,

Плазмида pHGH 107 содержит ген человеческого гормона роста (ЧГР), составленный из 23 аминокислотных кодонов, полученных из синтетических ДНК-фрагментовJ и 163 аминокислотных кодонов 5, полученных из комплементарной ДНК, полученной с помощью обратной транскрипции информационной РНК ЧГР, Этот .ген5 хотя в нем отсутствуют кодоны рге последовательности ЧГР 5 содержит ATG-транслирукхций начальный кодон. Этот ген изолируют из 10 мкг pHGH 10 после обработки Есо R I с последующей обработкой E.coli ДНК полимеразой Кленоза фрагмента и d ТТР и d ATP. как указано выше. После экстракции фенолом и хлороформом и осаждения этанолом плазмиду обра- батызают Ваи Н1о

Фрагмент, содержащий ген ЧГР, изолируют с помощью ПАГЭ с последующим электроэлюированием. Полученньй в результате ДНК-фрагмент также содержит

UU3

первые 350 нуклеотидов устойчивого к тетрациклину структурального гена но в нем отсутствует тетрациклиновая система промотор-оператор, так что при последовательном клонировании в экспрессионную плазмиду плазмиды, содержащие вставку, могут быть обнаружены по восстановлению устойчивост к тетрациклину. Так как Есо R I коне фрагмента был заполнен в процедуре полимеразой I Кленова, фрагмент имеет один тупой и один липкий конец , обеспечивающий четкую ориентацию при последующем включении в экспрессивную плазмиду.

. Затем готовят экспрессивную плазмиду рТгр 1Ддля получейия фрагмента содержащего ЧГР-ген, приготовленного ранее, рТгр 14 расщепляют XbAI и полченные липкие концы заполняют-по процедуре полнмеразой I Кленова, применяя d ATP, d TIP, dG IP и d СТР. Пос ле экстракции фенолом и хлороформом и осаждения этанолом полученную в результате ДНК обрабатывают Ват Н I и изолируют полученный в результате широкий плазмидный фрагмент с помощью ПАГЭ и электроэ.шоирования. Фрагмент , происходящий из рТгр 14, имеет один тупой и один липкий конец, позволяющий рекомбинацию с четкой ориентацией с фрагментом, содержащим ЧГР- ген, описанный ранее

Фрагмент гена ЧГР и фрагмент рТгр 14 u,Xba-Bam Н I объединяют и лигирую в условиях, подобных описанным выше. Заполненные Xbal и Есо R I концы, связанные вместе связкой по тупому концу для воссоздания участков Xbal и Есо R I: заполненный Xbal заполненный Есо R I инициирование геном ЧГР -TCTAG AATTCTATG- -TGTAGAATTCTATG- +

-AGATC TTAAGATAG -AGATGTTAAGATACXba I Есо R I

Такая конструкция также воссоздает ген устойчивости к тетрациклину, Так как плазмида pHGU 107 экспресси- рует устойчивость к тетрациклину из промотора, расположенного вьше гена ЧГР (lac-промотор), эту конструкцию обозначают pHGH 207 ,она позволяет осуществить экспрессию гена устойчивости к тетрациклину под контролем триптофа нового промотора-оператора, Лигацион- ную смесь трансформируют в E.coli 294 и отбирают колонии на LB-пластинах, содержащих 5 мкг/л тетрациклина.

5

0

К

bj

G

5

0

5

0

5

19 О ,

Плазм1 щу рН.ОИ 207 расщепляют Есо R I с помощью ПАГЭ и электроэлю- ирования и выделяют фрагмент, содержащий trp промоторJоператор и trp ведущий рибосомный связующий участок,но в котором отсутствует АТС-последовательность для инициирования трансляции . Этот фрагмент ДНК клонируют и Есо R 1 участок pLelF А, Экспресси- онные плазмиды, содержапще модифицированный выше trp регулон (E.coli trp оперой, из которого была изъята истощенная последовательность для контролируемого повьшения уровней экспрессии), выращивают до заранее определенных уровней в питательной среде3 содержащей добавку триптофана в количестве, достаточном для подавления (репрессии) системы промо- , тор-оператор, затем изымают триптофан , чтобы дерепрессировать систему и вызвать экспрессию целевого продукта . Для этого 250 мкг плазмиды pL 31 расщепляют pst I и изолируют 1000 в,р, вставку гель-электрофорезом на 6%-ном полиакриламидном геле.

Из геля элюируют примерно 40 мкг вставки и разделяют на три аликвота для дальнейшего расщепления образца 16 мкг этого фрагмента частично рас- щепляют 40 ед, ВрД II- в течение 45 мин при 37 G и очищают реакционную смесь на 6%-ном полиакриламидном геле. Собирают приблизительно 2 мкг целевого 670 в.р. фрагмента.

Другой образец (8 мкг) из 1000 в.р. pst I вставки рестриктируют А v all и Bgl II, Goбиpaют 1 мкг указанного 150 Вар. фрагмента после гель-электрофореза .

Обрабатьгаают 16 мкг 1000 в.,р, часть Г)Аи За и А V all. После электрофореза на 10%7ном полиакриламидном геле собирают приблизительно 0,25 «х (10 пкмоль) 34 в,р, фрагмента.

Синтезируют два указанных дезокси- олигонуклеотида 5 -d AATTCATGTGT (фрагмент 1) и 5 - d-GATCAGACATG (фрагмент 2) по фосфоротриэфирной процедуре.

Фрагмент 2 фосфорилируют следующим образом.

Высушивают 200 мкл ( пкмоль) ( р) - АТР (Qraersham ЗОООКю/ммоль) и повторно суспендируют в 30 мкл 60 LTfl трис-HG l (рН 8)j 10 мМ Мр.С, 15 кМ З-меркаптозтенолЯ) содержа- п{его 100 пкмоль ЛИК фрагмента и 2 едо

. 14

4 полинуклеотидной киназы. После 15 мин при 37 С прибавляют 1 мкл 10 мМ АТР и реакция продолжается еще

15мин. Затем смесь нагревают при 70°С в течение 15 мин, объединяют с 100 пкмоль 5 -ОН фрагмента 1 и

10 пкмоль 34 в,р. SAU За-А v all рагмента. Связывание осуществляют в течение 5 ч при 4 С в 50 мкл 20 мМ трис-НС (рН 7,5), 10 мМ MgClj, . 10 м1Л дитиотрейтола, 0,5 Mli АТР и 10 ед. Т4 ДНК лигазы. Смесь подвергают электрофорезу на 6%-ном полиакриламидном геле и электроэлюированием собирают 45 в.р. продукт. Объединяют 30 нг (1 пкмоль) 45 в.р. продукта с 0,5мкг (5 пкмоль) 150 в.р. А-V aII-ВрД 2-го фрагмента и 1 мкг (2 пкмоль) 670 в,р. Bgl Il-Pst 1-го фрагмента. Лигирова- ние осуществляют при 20 С в течение

16ч, используя 20 едь Т4 ДНК лигазы. Лигазу инактивируют, нагревая при 65 С в течение 10 мин. Затем смесь усваивают Есо R I и Pst I для удаления полимеров из гена. Смесь очищают

на 6%-ном ПАГЭ. Изолируют около 20 нг, (0,04 пкмоль) 865 в.р. продукта. Половину этого продукта (10 нг) лиги- руют в p3R 322 (0,3 мкг) между сайтами Есо R I и Pst I. Трансформация E.coli 294 дала 70 устойчивых к тетрациклину , чувствительных к ампициллину трансформантов. Плазмиду ДНК, изолированную из 18 из этих трансформантов , расщепляют Есо R I и Pst I, 16 из 18 плазмид имеют Есо R I-Pst 1 фрагмент 865 в.р. в длину. Расщепляют 1 мкг одной из них, pLelF, А 1, Есо R I и лигируют в 300 в.р, EcoRI фрагмент (0,1 мкг), содержащий Е„с611 trp промотор и ведущий рибосомный связываклций сайт, приготовленный, как описано вьше. Идентифицируют трансформанты , содержащие trp промотор, используя P-trp зонд в сочетании с проце;(урой скрининга колоний Грюн- щтейна-Хогнесса, Асимметрично расположенный Xbal сайт в . trp фрагменте позволяет определить рекомбинанты, в которых trp-npoMOTop ориентирован в направлении LeIF А-гена.

Определение активности LeIF А.

Экстракты готовят для IF анализа следующим образом,

1 мл культуры выращивают в ей -бульоне , содержащем 5 мг/мл тетрациклина до значения А550 около 1,0. Затем разбавляют 25 мл среды М9, сорержа1912

щей 5 мкг/мл тетрациклина. 10 мл образцы собирают цектрифугиропанием, когда ASSQ Достигнет значения 1,0 и гранулированные клетки суспендируют в 1 мл 15% раствора сахарозы, 50 мМ трис-НС (рН 8,0), 50 мМ ЕДТА. Добавляют 1 мг лизозима и через 5 мин инкубации при 0°С клетки разрушают воздействием ультразвука. Образцы цент- рифугир тот в течение 10 мин (15000 об/мин) и активность интерферона в верхнем слое определяют сравнением со стандартами LeIF с помощью

цитопатического эффекта (СРЕ) инги- бирования. Для определения числа TF молекул на клетку используют LeIF удельную активность порядка 4-10 ед/мг Клон pLelF А trp 25, в котором

trp промотор вставляют в желаемой ориентации, дает высокие уровни активности (до 2, ед/л). Полученный с помощью E.coli К-12 штамма 294/pLeIF А trp 25 ведет себя подобно

аутентичному человеческому LeIF, он устойчив к обработке при рН 2 и нейтрализуется античеловеческими лейкоцитарными антителами кроликов. Такой интерферон имеет кажущийся молекулярный вес приблизительно 20000.

Выделение с ДНК дополнительных лейкоцитарных интерферонов, ДНК из LeIF с ДНК-содержащей плазмиды вырезают с помощью pst 1, выделенной

электрофорезом, и метят изотопом Р, Полученную в результате радиактивно меченную ДНК используют в качестве зонда для скрининга дополнительных E.coli 294 трансформантов, полученных по способу, идентичному описанному в части С по методике in situ скрининга колонии, предложенной Грун- штейном и Хогнессом (см, вьше). Колонии , которые в различных количествах гибридизировали с зондом, вьще- ляют Плазмиду ДНК из таких колоний и десять гибридизированных колоний, на которые ссылаются выше, с помощью Pst I и характе ризуют тремя различными способами. Во-первых, образцы ре- стракционного эндонуклеазного рас- щегшенкя с энзимами Bgl II, PVU II и Есо R 1, Такой анализ позволяет классифицировать по крайней мере восемь различных типов (LeIF А, LeIF В, LeIF С, LeIF D, LeIF Е, LeIF F, LeIF G, LeIF H), что соответствует приблизительно положению различных рестрикционных разрезов относительно

13U

известной в настоящее время предварительной последовательности и кодирующей последовательности.

Во-вторых, некоторые из ДНК испы тывают на гибридизационный выбор для установления способности селективно удалять LeIF и КИК из поли-Aj содержащей KG-1 клеточной РНК, Согласно этому анализу LeIF А, В, С и F дают положительные результаты. В-третьих , последние фрагменты внедряют в экспрессионную плазмиду E,coli294( трансформируют с плазмидой и фрагменты экспрессируют. Продукты такого экспрессирования представляют собой пре-интерфероны, дают положительные результаты при СРЕ анализе на активность интерферона, хотя и обладают маргинальной активностью в случае LeIF F-фрагмента.

В последовательности изолированного фрагмента, содержащего ген зрелого LeIF В, первые четйфнадцать нук леотидов типов А и В были идентичны. В соответствии с этим фрагмент из pLelF А 25, несущий trp промотор-оператор , место присоединепия рибосомы и начало LeIF А(В) гена, вьзделягот и соединяют с остающейся частью В последовательности в экспрессионной плазмиде,

Для получения приблизительно 950 в.р, SAU За к Pst фрагменту необходимо несколько стадий ввиду наличия одного или более чередующихся SAU За рестракционных сайтов,

1.Вьщелены следующие фрагменты; я)0110 в.р. от SAU За до Fco R I, в) 7i 132 в,р. от Есо R I до ХЪа,

с) 700 в.р. от ХЬа до Pst.

2.Фрагменты (1а и 1в) лигируют и разрезают с помощью ХЬа и Bgl II

с тем, чтобы предотвратить самополимеризацию через SAU За и ХЬа концевые терминалы (соответствующий SAU За сайт находится внутри сайта Bgl II, Bgl II разрезают с тем чтобы оставить SAU За - липкий конец ) . Вьщеляют 242 в.р. фрагмента.

3. Продукт со стадий (2) и (1с) лигируют и разрезают с помощью Pst I и Bgl 11 для того, чтобы предотвратить самополимеризацию. Выделяют приблизительно 950 в.р. фрагмента от SAU За до Pst. Такой фрагмент содержит часть LeIF В гена, не характерную для LeIF А.

1

4.Приблизительна 300 в„р. фрагмента от Hind III до SAU За, содержащего trp промотор-оператор, сайт присоединения рибосо, АТС начальный сигнал и цистеиновый кoдoнLeIFA, вьщеляют из pLelF А 25,

5.Приблизительно 3600 в.р. фрагмента Pst I - Hind III выделяют из

Q рВ R 322„ Такой фрагмент содержит репликон и кодированный тетрациклин, но не обладает устойчивостью к ампициллину .

6.Фрагменты,, полученные на стади- 5 ях 3 j4 j5 лигирутот и полученную в результате плазмиду трансформируют в E.coli К-12 штамм 294.

Трансформанты подвергают минискри- нйнгу и образцы плазмиды расщепляют

0 с помощью Есо R I, Продукты такой реакции представляют три фрагмента со следующими характеристиками: Есо R I- Есо R I trp промоторный фрагмент, внутренний Есо R I - Есо R I - Есо R

5 фрагмент pL4 и протеин-трансляционный начальный сигнал - Есо R I фрагмент pL4.

Согласно СРЕ анализу бактериальные экстракты из клонов, полученных ука

0 занным способом, обычно имеют примерно 10-10 ед. интерфероновой активности на литр при Ajgg 1 . Один из таких клонов, полученных указанным способом, представляет собой

3g E.coli 294/pLeIF В trp 7„

Прямое экспрессирование дополнительных зрелых лейкоцитарных интер- феронов (LeIF С, D, F, Н, I и L). Дополнительные генные фрагменты

0 полной длины, которые содержат другие LeIF типы, могут быть преобразованы в последовательность и помещены в экспрессионные векторы для экспрессирования, как это имеет место в случае LeIF А.

45

Короткая длина синтетической ДНК, обрывающаяся на 3 -конце кодирующей

спирали, с трансляционным начальным сигналом АТС затем лигируют например , путем лигирования тупого конца к полученному в результате сшитому гену для зрелых интерферонов, ген внедряют в экспрессионную плазмиду и регулируют с помощью промотора и связанного с ним сайта присоединения рибоCOt-lbl .

Согласно способу, аналогичному описанному вышед генные фрагменты, кодирующие LeIF С и LeIF D, соответ 51

ствующим образом конфигурируют для прямого бактериального экспрессиро- вания, Экспрессионная стратегия для таких дополнительных лейкоцитньгх интерферонов в каждом случае включает использование приблизительно 300 в.р. фрагмента (Hind III-SAU За) содержащего trp промотор-оператор, сайт присоединения рибосомы АТС-начальный сигнал и цистеиновый кодон LeIF А из pLelF А 25. К нему присоединяют генные фрагменты из дополнительных интерфероновых генов, кодирующих их соответствующие последовательности аминокислот выше исходного цистейна, присущего всем последова- тельностямв Каждую полученную в ре-- зультате плазмиду используют для трансформации E.coli К-12 штамм 294.

Из pLelF С выделятот следующие фрагменты: а) 35 в.р. SAU 3A-SAU 96, в) 900 в.р. SAU 96 - Pst 1, с) выделяют приблизительно 300 в.р. фрагмента (Hind 111 - SAU За) из pLelF А 25 аналогично описанному в части 4 d) выделяют приблизительно 3600 в.ро фрагмента согласно части 5,

Построение.

1. Лигируют (а) и (с). Расщепление проводят с помощью Bgl II, Hind III и вьщеляют приблизительно 335 в.р. продукта.

2 Проводят тройное лигирование (1)+(b)(d) и трансформацию E.coli с помощью полученной в результате плазмиды.

Соответствующий клоН| полученный таким образомJ представляет собой E.coli К-12 штамм 294/pLeIF С trp 35

LeIF D.

Из pLelF D вьщеляют: a) 35 в,р, SAU ЗА - A V all, в) 150 в,p. A v al Bgl II, c) приблизительно 700 в,р, Bgl II - Pst I

Из pLelF A 25 вьзделяют: d) 300 Bep. Hind III - SAU За.

Из рВ R 322 выделяют; e) приблизительно 3600 в.р. Hind III - Pst lo

Построение. , ,

1.Лигирзпот (a)+(b), разрезают с помощью Bgl II и очищают 185 в.р. продукта (1).

2.Лигируют (1)(d), разрезают с помощью Hind HI, Bgl II и очищают приблизительно 500 в.р. продукта (2)

2. Лигируют (2)+(с)+(е) и транс- формирзпот E.coli с помощью полученной в результате плазмиды.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Соответствуюынй KjiOHj полученньп таким способом5 представляет собой E.coli К-12 штамма 29 4/pLeir D trp 1 1 . LeIF F содержащий фрагмент может быть сшит для прямого экспресснрования через пересборку5 упрощенную полной гомологией a iннoкиcлo7 1-13 LeTF В и LeIF F trp промотср-содержащий фрагмент (а) с соответствутощим образом конфнгурирова нными концами получают из ЧГР 207 согласно описанному выше, через Pst I и ХЪа Х-расщепленке с последующим выделением приблизительно 1050 в„р. фрагмента. Второй фрагмент (Ь) получают в виде более крупного из фрагментов, полученных Pst I и Bgl II расщеплением плазмиды рНК Y 10,

Фрагмент (а) содержит приблизительно половину гена, кодирующего устойчивость к ампициллину, фрагмент (Ъ) - остаток гена и полный ген, кодирующий устойчивость к тетрациклину. Фрагменты (а) и (Ь) объединяют через Т4 лигазу и продукт обрабатывают ХЬа Т и Bg II для подавления димеризации с образованием фрагмента (с), содержащего trp промотор-оператор и гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину е

Фрагмент (d), содержащий приблизительно 580 в.р., получают расщеплением pLelF F под воздействием А Ya TI и Bgl II. Он содержит кодоны аминокислот 14-166 LeIF F.

Фрагмент (е) (49 в.р,) получают расщеплением pLelF В под воздействием ХЬа I и А V allo Фрагмент (е) кодирует аминокислоты 1-13 LeIF Fv

Фрагменты (с), (d) и (е) подвергают тройному лигированию в присутствии LT4-лигaзы„ Когезионные концы Соответствующих фрагментов что композиционная плазмида находится в состоянии правильной циркуляции и при зтом ген устойчивости к тетращ-пс- лину находится под контролем trp промотора-оператора совместно с геном : зрелого LeIF F, так что бактерии, трансформированные с помощью желаемой плазмиды, выбираться из пластин, содержащих тетрациклин. Клон, полученный таким образом, представляет собой E.coli К-12 штамм 294/pLeIF F trp 1.

Полный LeIF Н-ген может быть конфигурирован для экспрессирования в виде зрелого лейкоцитарного интерферона согласно следующему.

171Д

1.Плазмиду pLelF Н подвергают гидролизу в присутствии Пае II и RS al с выделением 816 в,р. фрагмента , простирающегося от сигнального пептида аминокислоты 10 до 3 некодирующего участка.

2.Фрагмент денатурируют и подвергают синтезу с фрагментом Кпенова ДНК полимеразы 1 с использованием синтетического дезоксирибо-олигоиук- леотидного праймера 5 -ATGTGTAATCTGTCT

3.Полученный в результате продукт расщепляют с помощью SAU За и выделяют 452 в.р. фрагмента, представляющего собой аминокислоты 1-150.

4.В результате расщепления LeIFН с помощью SAU За и Pst.1 и выделения полученного в результате- 500 в.р. фрагмента получают ген, кодирующий аминокислоты от 150 до конца кодирующей последовательности.

5.Фрагменты, вьщеленные на стадиях (3) и (4), лигируют с образованием фрагмента

1166

met cys asp stop АТС TGT.. + i. GAT TGA - ... - Pst I

SAU За кодирующего 166 аминокислоты LeIF-H,

6.pLelF A trp 25 расщепляют с помощью Xba I, лигируют тупые концы с помощью ДНК полимеразы 1 и продукт реакции расщепляют с помощью Pst I. Полученный в результате большой фрагмент может быть вьщелен и лигирован

с продуктом со стадии (5) с образованием экспрессионной гшазмиды, способной после трансформации E.coli К-12 штамма 294 или другого бактериального хозяина экспрессировать зре лый LeIF Н.

Л -фазную Чарон 4А рекомбинатную библиотеку человеческого генома подвергают скринингу на лейкоцитарные интерфероновые гены. Радиоактивный LeIF-зонд, полученный из сДНК клона LeIF А, используют для скрининга 500000 колоний. Шесть LeIF геномных клонов получают в результате такого скрининга. В результате последующего скрининга и очистки колоний один из таких клонов, Н LeIF 2, выбирают для дальнейшего анализа.

С использованием указанного способа могут применяться и другие зонды с тем, чтобы успешно провести выделение дополнительных LeIF клонов из человеческого генома. Они, в

. ЯЭ 18

свою очередь5 могут использоваться для получения дополнительных лейкоцитарных интерфероновьгх протеинов согласно изобретению.

1. 2000 в.р. Есо R I фрагмент клона/ХН LeIF 2 клонируют в pBR325 .на сайте нахождения Есо R I, Полученную в результате плазмиду LeIF I

Q расщепляют с помощью Есо R I и выделяют 2000 в.р. фрагмента. Деоксиоли- гонуклеотидный d AATTCTGCAG (конвертор Есо R I - Pst I) лигируют до 2000 в.р. Есо R I фрагмента и получен

5 ный в результате продукт расщепляют с помощью Pst I с образованием.2000 фрагмента, содержащего Pst 1-конць. Этот продукт расщепляют с помощью SAU 96 и 1100 в.р. фрагмент выделяют.

0 2. Плазмид.у pLelF С trp 35 расщеп- ляпот с помощью Pst I и ХЪ al. Вьще- ляют крупный фрагмент,

3.Небольшой ХЬ al - Pst I фрагмент из pLelF С trp 35 расщепляют с

5 помощью ХЪ а и SAU 96. Еьщеляют 40 в.р. ХЬ al - SAU 96 фрагмента,

4,Фрагменты, выделенные на стадиях (1), (2) и (3), лигируют с образованием экспрессионной плазмиды

0 pLelF I trp 1. LeIF J.

,1. Плазмида pLelF J содержит 3,6 (: Hind III фрагмента человеческой геномной ДНК, которая включает LeIF J генную последовательность, и вьщеля- ют 700 в.р. Dde I - RSa I фрагмент. 2. Плазмиду pLelF В trp 7 расщепляют с помощью Hind III и Dde Г и выделяют 350.в,р. Hind III-Dde I фрагмент,

Q 3«, Плазмиду рБ R 322 расщепляют с помощью Pst Ij затупляют концы в результате инкубирования в присутствии ДНК полимеразы I (кленовский - фрагмент), затем расщепляют с помощьг, Hirid III и выделяют крупный (i 3600 в,р) фрагмент,

4. Фрагменты, выделенные на стадиях (1) (2) и (3), лигируют с образованием .экспрессионной плазмиды

р pLelF J trp I,

Очистка интерферона, 1. Замороженные клеточные гранулы содержащие экспрессированный лейкоцитарный интерферон в раздробляют вручную али с использованием соответствующего оборудования для уменьшения размера частиц. Частично оттаявшие клетки суспендируют в 4 об .буфера Aj содержащего 0,1 М трис (рН 755-8,0)3

35

45

55

19

10% (вес/об) сахарозы 0,2 М MaCl, 5 мМ ЕДТЛ, 0,1 мМ P11SF и 10-100 -sH Мр,С1 , Такую суспр.нзмю выдерживают при температуре приблизительно А®С, Полученную суспензию пропускают через гомогенизаторJ работающий под давлением 6000 фунт/дюй - j после чего снова пропускают через указаное устройствоэ но при давлении 1000 фунт/дюйм. Эффлюент из гомогенизатора от двух проходов охлаждают в бане со льдом,

2,Медленно добавляют полиэти- ленимин к гомогенной среде до концентрации около 0,35% и полученной системе дают выстаиваться в течение 30 мин Твердые вещества удаляют центрифугир ванием или фильтрацией. Температуру на этой стадий контролируют или проводят ее достаточно быстро, в результате чего верхний слой (фильтрат ) поддерживается при температуре менее 10°Св Верхний слой (фильтрат) концентрируют ультрафильтрацией приблизительно до 1/10 начального объема . Мелкие частицы или туманность

в удержанной фазе можно удалить на соответствующем фильтре, например на микропористой мембране.

3,Осветленный раствор загружают непосредственно в колонку с монокло- нальным антителом со скоростью подачи 5-8 см/ч (например, 25-40 мл/ч в колонку с диаметром 2,6 см). После загрузки колонку промьшают приблизительно 10 об 25 мМ трис-НС1 рН 755-8,55 включающего NaCl (0,5 М) и такое поверхностно-активное вещество , как Тритон-Х-100 (0,2%) или его эквивалент. После промывки колонку споласкивают приблизительно 10 об раствора5 содержащего 0515 М NaCl

и поверхностно-активное вещество, такое как Тритон Х-100 (0,1%) или его эквивалент. Колонку элюируют 0,2 М раствором уксусной кислоты, содержащим такое поверхностно-активное вещество, как Тритон-Х-100 (0,1%) или-его эквиваленте Фракциюj дающую протеиновый пик из колонки с моно- клональным антителом (согласно УФ- спектроскопическому или другому ана1920

лизу) 5 объедии . ют и рН системы устанавливают приблизительно 4,5 с помощью 0,1 N раствора NaOH или 1 ,,О М трис-основаниями,

4 о Обьединенньй иитерфероновый пик загружают на катионообменник, такой как Еать;ан Qi 52 целлюлоза или его эквивалент5 который уравновешивают 1тодходяЩ|;м буфером, так -тм как ацетат аммония, рН 4,5 (50 мМ), Пос- ле загрузки колонку промывают уравновешивающим буфером до того момента, пока У -спектр дает ровный прямой

при анализе элюента,, в результате че. го небольшое количество эффлюента элюируется с колонки, Затем колонку элюируют 25 мМ ацетата аммония и 0s12 М хлористого натрия или их комбинацией , которая оптимизирует регенерацию интерферона и приводит к об- разованию лиофилизированного осадка на фильтре.

Формула изобретения

Способ получения лейкоцитарных ин терферонов человека с частичной последовательностью C s-Ala-trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-I le-Met-Arg- -v -Ser-j предусматривающей трансформацию бактерий EtColi штамм 294 АТСС 31446 плазми,дами, выбранными из группы pLelF А 25, pLelF Б trp 7,

pLelF С trp 35, pLelF D trp 11,

pLelF F trp I, pLelF I trp 1, pLelF J trp I, культивирование полученных трансформаторов с последующим экстрагированием и очисткой полученных полипептидов .

Приоритет по признакам: 01 07о80 при частичной последовательности Cys-Ala-trp-Glu-Val-Val- -Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Serr, pLelF А 25, pLelFB trp 7, Escheri- chia coli ATCC 31446;

08„09о80, при pLelF С trp 35 pLelF D trp 11 , pLelF F trp I. 10,11o80 при pLelF I trp 1, pLelF J trp 1 ,

21„04;81 при экстрагировании и очистке полученных полипептидов.