Генотерапевтический днк-вектор на основе генотерапевтического днк-вектора vtvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов ang, angpt1, vegfa, fgf1, hif1α, hgf, sdf1, klk4, pdgfc, prok1, prok2 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, спо - RU2730664C2

Код документа: RU2730664C2

Чертежи

Показать все 39 чертежа(ей)

Описание

Область техники

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве для создания препаратов генной терапии.

Уровень техники

Генная терапия - это современный медицинский подход, направленный на лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения нового генетического материала в клетки, ткани, органы пациента с целью компенсации или подавления функции мутантного гена и/или исправления генетического дефекта. Целью генной терапии является, в большинстве случаев, введение в организм генов, обеспечивающих транскрипцию и последующую трансляцию белковых молекул, кодируемых этими генами. В рамках описания настоящего изобретения под экспрессией гена подразумевается продукция белковой молекулы, аминокислотная последовательность которой кодируется этим геном.

Васкуляризация тканей может осуществляться васкулогенезом и ангиогенезом. Васкулогенез представляет собой образование кровеносных сосудов из мезенхимальных клеток в эмбриогенезе или эндотелиальных клеток-предшественников, мигрирующих из красного костного мозга в постнатальном периоде (постнатальный васкулогенез).

Ангиогенез - это процесс образования новых кровеносных сосудов в уже существующей сосудистой системе. Он играет важную роль в развитии и нормальном росте тканей, заживлении ран, репродуктивном цикле у женщин (развитие плаценты и желтого тела, овуляции), и вовлечен в патогенез различных заболеваний.

Представители семейства белков факторов роста эндотелия сосудов VEGF играют ключевую роль среди стимуляторов прорастания сосудов. Семейство VEGF включает 5 представителей VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD. VEGFA связывается с рецепторами VEGF (VEGFR) первого типа и VEGFR-2. VEGF-А стимулирует пролиферацию, миграцию и обеспечивает выживание эндотелиальных клеток. Большинство его эффектов связано с активацией рецепторов VEGFR-2.

Белок ангиогенин продукт гена ANG является одним из факторов ангиогенеза и принадлежит суперсемейству Рибонуклеаз А. Он обладает ферментативной РНКазной активностью, в отличие от других факторов ангиогенеза. Эндогенный ангиогенин необходим для пролиферации клеток, индуцируемой другими белками, как например VEGF. Как и в случае с VEGF, экспрессия ангиогенина может индуцироваться состоянием гипоксии. Белок, кодируемый ANG геном, является мощным медиатором образования новых кровеносных сосудов. Зрелый пептид обладает противомикробной активностью против некоторых бактерий и грибков, в том числе S.pneumoniae, и С. Albicans. Ангиогенин - один из ключевых белков, вовлеченных в процесс ангиогенеза в нормальных и опухолевых тканях. Ангиогенин взаимодействует с актином на поверхности эндотелиальных клеток, и путем эндоцитоза транспортируется в клеточное ядро, что в дальнейшем приводит к стимуляции процессов клеточной миграции, инвазии и пролиферации. Ангиогенин также способен связывать фоллистатин. Его активность in vivo регулируется взаимодействием с RNH1.

Факторы роста фибробластов (FGF1, FGF2), взаимодействуя с рецепторами - FGFR-1-4 являются мощными митогенами для эндотелиальных клеток, а также стимулирует их миграцию.

Ангиопоэтины ANGPT1 и ANGPT2 опосредуют свое действие через рецепторы эндотелиальных клеток Tie-2. ANGPT1 способствует выживанию эндотелиальных клеток, образованию контактов между ними, взаимодействию с перицитами, что стабилизирует образованные сосуды.

Белок гипоксией индуцированный фактор (HIF1α) - его активность увеличивается при снижении напряжения кислорода в крови. Показано, что этот фактор играет главную роль в системном ответе организма на гипоксию, синтезируется во многих тканях организма, в том числе в нервной ткани, где его экспрессия максимальна в нейронах. HIF1α, как известно, индуцирует транскрипцию более 60 генов, включая VEGF и эритропоэтин, участвующих в биологических процессах, таких как ангиогенез и эритропоэз, которые способствуют продвижению и увеличению доставки кислорода в гипоксические области. Этот белок также индуцирует транскрипцию генов, участвующих в пролиферации и выживаемости клеток, а также в метаболизме глюкозы и железа.

Фактор роста гепатоцитов (HGF) стимулирует регенерацию печеночной ткани, оказывает защитное действие на гепатоциты и другие клетки, предотвращая их апоптоз, а также оказывает антифиброзное действие, индуцируя синтез протеиназ внеклеточного матрикса. HGF стимулирует миграцию резидентных стволовых клеток сердца из мест их локализации в участки повреждения, в частности, при инфаркте миокарда - в зону инфаркта. Для продуцирования HGF используют ДНК, содержащую природный ген фактора роста гепатоцитов человека, однако при его использовании не удается получить высокий уровень экспрессии данного белка. Последовательность гена HGF, оптимизированная для получения больших количеств белка, представлена в материалах патента RU 2385936.

Фактор роста тромбоцитов С (PDGFC) - белок, один из многочисленных факторов роста, который играет важную роль в ангиогенезе. Содержится в α-гранулах в тромбоцитах, синтезируется в мегакариоцитах. В каждом тромбоците находится порядка тысячи молекул PDGFC. Этот белок - сильный стимулятор репарации тканей, рецепторы к которому расположены в сосудистой стенке на фибробластах и клетках гладкой мышечной ткани. PDGFC стимулирует пролиферацию этих клеток. Кроме того, PDGF увеличивает продукцию составляющих соединительной ткани (гликозаминогликанов, коллагена и др.).

Фактор стромальных клеток SDF1 (англ. Stromal cell-derived factor-1) - хемокин подсемейства СХС, который у человека закодирован геном CXCL12. SDF1 связывается с рецепторами CXCR4 и CXCR7 и играет важную роль в эмбриональном развитии и гематопоэзе. SDF1 выступает не только в роли хемоаттрактанта: в некоторых случаях он может стимулировать пролиферацию клеток и способствовать их выживанию.

Белок калликреин KLK4 входит в подгруппу сериновых протеаз, имеющих разнообразные физиологические функции. Научные данные свидетельствуют о том, что многие калликреины вовлечены в канцерогенез, а некоторые из них обладают потенциалом в качестве новых биомаркеров рака и других заболеваний. Этот ген является одним из пятнадцати элементов подсемейства калликреина, расположенных в кластере на хромосоме 19. KLK4 преимущественно экспрессируется в ядрах базальных клеток в эпителии простаты в соответствии с его распространением в клетках рака простаты in vitro. Калликреины могут способствовать ангиогенезу. Ряд исследований in vitro показывает, что калликреины поддерживают ангиогенез путем прямого или опосредованного разрушения внеклеточного матрикса.

Также известен фактор роста, выделяемый клетками эндокринных желез, который получил название прокинетицин-1 (PROK1). По своей структуре этот белок близок к семейству VEGF и поэтому первоначально был назван сосудистым эндотелиальным фактором роста, выделенным из эндокринных желез (EG-VEGF). Данная молекула вызывала пролиферацию, миграцию и образование мембранных разрывов в эндотелиальных клетках капилляров, полученных из эндокринных желез. При этом прокинетицин-1 практически не оказывал никакого влияния на другие типы тестируемых эндотелиальных и не эндотелиальных клеток. Подобно VEGF, прокинетицин-1 обладает сайтом связывания HIF-1, и его экспрессия индуцируется гипоксией. Оба фактора приводили к обширному ангиогенезу и формированию кисты при их доставке в яичник. Однако, в отличие VEGF, с помощью прокинетицина-1 удалось стимулировать ангиогенез в роговице или скелетной мышце. Экспрессия человеческого PROK1 обнаружена в клетках и тканях стероидогенных желез, яичников, семенников, надпочечников и плаценте и часто дополняет экспрессию VEGF, при этом предполагают, что эти молекулы действуют согласованно.

Белок прокинетицин-2 (PROK2) представляет собой близко связанный секретируемый белок с PROK1, индуцирует пролиферацию, выживаемость и миграцию клеток эндотелия сосудов коры надпочечников (LeCouter, J. et al, Proc Natl Acad Sci USA 100, 2685-2690 (2003)).

Белки PROK1 (EG-VEGF) и PROK2 (Bv8) охарактеризованы в качестве митогенов, избирательных к конкретным типам клеток эндотелия (LeCouter, J. et al, Nature 412(6850):877-84 (2001) и LeCouter, J. et al, Proc Natl Acad Sci USA 100, 2685-2690 (2003)). Этому семейству приписаны другие активности, включая ноцицепцию (Mollay, С. et al, выше), моторику желудочно-кишечного тракта (Li, M. et al, выше), регуляцию суточного двигательного ритма (Cheng, M.Y., et al., Nature All, 405-410 (2002)) и нейрогенез обонятельной луковицы (Matsumoto, S., et al, Proc Natl Acad Sci USA 103, 4140-4145 (2006)). Кроме того, Bv8 стимулировал получение гранулоцитарных и моноцитарных колоний in vitro (LeCouter, J. et al, (2003), выше; Dorsch, M. et al, J. Leukoc Biol 78(2), 426-34 (2005)). Bv8 охарактеризован в качестве хемоаттрактанта для макрофагов (LeCouter et al, Proc Natl Acad Sci USA.).

Гены, выбранные из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2 играют важную роль в организме человека и животных.

Показана связь низких/недостаточных концентраций этих белков с различными заболеваниями, которая, в ряде случаев, подтверждена нарушениями в нормальной экспрессии генов, кодирующих эти белки.

У нокаутных мышей по ANG гену наблюдается увеличение продукции форм активного кислорода по сравнению с диким типом, и повышенная чувствительность к агентам оксидативного стресса, пероксиду водорода, склонность к развитию реперфузионного синдрома, и холодовым повреждениям мозга. А также повышенный уровень окислительного повреждения мтДНК, структурные аномалии в миоцитах и митохондриях сердца. Предполагается, что ANG играет важную роль в защите митохондрий сердца от повреждений при реоксигенации in vivo. У мутантов также наблюдали брадикинин-индуцированную вазоконстрикцию. Отсутствие ANG аллеля у трансгенных мышей усиливает определенные аспекты старения, а именно уровень эндотелиальной дисфункции, ремоделирования сосудов, и инвазии лейкоцитов в сердечно-сосудистые ткани. [PMID: 12429206], [PMID: 11579147], [PMID: 14732290], [PMID: 10754271], [PMID: 18760274].

Известно, что ингибирование функции гена VEGFA может привести к бесплодию из-за блокировки функции желтого тела. Инактивация одиночного VEGF аллеля ведет к связанной с гаплонедостаточностью гибели эмбрионов из-за аномалий развития кровеносных сосудов примерно на 9-й день беременности. Дифференцировка ангиобластов не нарушена, но нарушены образование просветов сосудов, ответвлений и ангиогенез. Инактивация VEGF во время постнатального развития ведет к нарушению постнатального развития сосудов и жизнеспособности эндотелия, увеличивает смертность, задерживает рост и нарушает развитие печени, сердца и почек (Козырева Е.В., Давидян Л.Ю. https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=20811).

Снижение экспрессии целого ряда генов калликреинов (KLK) продемонстрировано в раковых опухолях молочной железы, простаты и тестикул.

При генетическом дефекте SDF-1 у мышей развиваются тяжелые расстройства гемопоэза еще при эмбриогенезе, что связывают с нарушением миграции гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) из органов раннего гемопоэза (печени, желточного мешка) в костный мозг. Введение человеческого SDF1 иммунодефицитным мышам в селезенку и костный мозг приводит к быстрому хоумингу введеных клеток костного мозга человека в эти же органы [http://gerontology-explorer.narod.ru/8ead2657-998b-4d77-9c83-8f8f80784343.html].

Таким образом, предшествующий уровень техники свидетельствует о том, что мутации в генах ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, или недостаточная экспрессия белков, кодируемых этими генами, связаны с развитием спектра заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся такими патологиями, как расстройство гемопоэза, бесплодие, ишемические поражения миокарда, мозга и мышц нижних конечностей, раковые опухоли, нарушения онтогенеза и нейрогенеза, болезнь Паркенсона, фиброз печени, легочная гипертензия, нейродегенеративные заболевания, в частности боковой амиотрофический склероз (БАС)и другими патологическими состояниями. Этим обусловлено объединение генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2 в рамках данного патента в группу генов. Генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию белков, кодируемых генами ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, входящими в группу генов, в составе того или иного вектора для генной терапии, могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов для терапии различных заболеваний, включающих в себя, но не ограничивающихся такими патологиями, как расстройство гемопоэза, бесплодие, ишемические поражения миокарда, мозга и мышц нижних конечностей, раковые опухоли, нарушения онтогенеза и нейрогенеза, болезнь Паркенсона, фиброз печени, легочная гипертензия, нейродегенеративные заболевания, в частности боковой амиотрофический склероз (БАС) и другими патологическими состояниями.

Более того, приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, входящими в группу генов, связана не только с патологическими состояниями, но и с предрасположенностью к их развитию. Также приведенные данные свидетельствуют о том, что недостаточная экспрессия белков, кодируемых генами ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, может не проявляться в явном виде в форме патологии, которая может быть однозначно описана в рамках существующих стандартов клинической практики (например, с применением кода МКБ), однако при этом вызывать состояния, которые неблагоприятны для человека и животных и связанны с ухудшением качества жизни.

Таким образом, повышение экспрессии гена, выбранного из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, и введенного в организм генотерапевтическим способом, актуально для коррекции состояний человека и животных, связанных с нарушением действия вышеназванных генов.

Для целей генной терапии используют специально сконструированные генотерапевтические векторы, которые разделяют на вирусные и невирусные. В последнее время все большее внимание уделяется разработке невирусных систем доставки генетического материала, среди которых лидируют плазмидные векторы. Данные векторы лишены недостатков, присущих вирусным векторам: в клетке-мишени они существуют в эписомальной форме, поэтому не происходит интеграции в геном; их производство достаточно дешево; отсутствие иммунного ответа и побочных реакций на введение плазмидного вектора делают их удобным инструментом генной терапии и генетической профилактики в качестве ДНК-вакцины (Li L, Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016; 15(3):313-29).

При этом имеются ограничения для использования плазмидных векторов для генной терапии: 1) наличие генов устойчивости к антибиотикам для наработки в штаммах-носителях, 2) наличие различных регуляторных элементов, представленных последовательностями вирусных геномов, 3) размер терапевтического плазмидного вектора, определяющий эффективность проникновения вектора в клетку-мишень.

Известно, что Европейское агентство по лекарственным средствам считает необходимым избегать введения маркеров антибиотикорезистентности в разрабатываемые плазмидные векторы для генной терапии (Reflection paper on design modifications of gene therapy medicinal products during development / 14 December 2011 EMA/CAT/GTWP/44236/2009 Committee for advanced therapies), а также рекомендует избегать наличия в составе терапевтических плазмидных векторов регуляторных элементов для повышения экспрессии целевых генов (промоторов, энхансеров, посттрансляционных регуляторных элементов), которые являютсячастями геномов различных вирусов (Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products / 23 March 2015, EMA/CAT/80183/2014, Committee for Advanced Therapies).

Также, существенным моментом является размер генотерапевтического вектора. Известно, что современные плазмидные векторы зачастую перегружены нефункциональными участками, серьезно увеличивающими размер вектора (Mairhofer J, Grabherr R. Rational vector design for efficient non-viral gene delivery: challenges facing the use of plasmid DNA. Mol Biotechnol. 2008.39(2):97-104), что порой не позволяет встраивать в состав вектора целевой ген нужного размера.

Известен способ накопления плазмидных векторов в штаммах Escherichia coli без использования антибиотиков (Cranenburgh RM, Hanak JA, Williams SG, Sherratt DJ.Escherichia coli strains that allow antibiotic-free plasmid selection and maintenance by repressor titration. Nucleic Acids Res. 2001. 29(5):E26). Былисозданыштаммы Escherichia coli DH1lacdapD и DH1lacP2dapD, вкоторыхген dapD, кодирующийфермент 2,3,4,5-тетрагидропиридин-2,6-дикарбоксилат-N-сукцинилтрансферазу, участвующийвбиосинтезе L-лизина, находитсяподконтролем lac-промотора. В отсутствие индуктора IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) эти штаммы подвержены лизису. Однако при введении мультикопийного вектора pORT, содержащего lac-оператор, индуцируется экспрессия гена dapD и, таким образом, трансформированные клоны могут быть отобраны и размножены. Однако, эти штаммы характеризуются низким уровнем трансформации и ее нестабильностью.

Известно решение по патентной заявке RU 2011152377 A, описывающей получение экспрессионного плазмидного вектора без устойчивости к антибиотику, которая содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок-репрессор. Экспрессия указанного белка-репрессора регулирует экспрессию токсичного генного продукта, встроенного в участок генома E. coli. Однако, как и все методы селекции, основанные на использовании белков-репрессоров, данный метод отличается нестабильностью трансформации и ее низкой эффективностью.

В патенте US 9644211 В2 описано получение минимального по размеру вектора. Данный вектор не содержит бактериальных геномных последовательностей и продуцируется путем parA-опосредованной рекомбинации, проходящей в специально полученном штамме E. coli. Недостатком данного метода получения минимального по размеру вектора является невозможность его использования при масштабировании производства.

Известно получение генотерапевтических векторов, в состав которых включены нуклеотидные последовательности, кодирующие белки васкуляризации тканей человека.

Например, известны лекарственные средства для лечения фиброза печени (Gene therapy by hepatocyte growth factor results in regression of experimental liver fibrosis RJGHC. - 2010. - Vol. 20. - No 4. - P. 22-28.), в которых в качестве основного действующего вещества использованы плазмидные конструкции, содержащие по отдельности гены фактора роста гепатоцитов (HGF) или урокиназы человека. Вышеупомянутые плазмидные генетические конструкции содержат белок-кодирующие участки ДНК соответствующих генов и при их введении в клетки млекопитающих в результате процессов транскрипции и трансляции обеспечивают синтез и последующую секрецию из клеток белков фактора роста гепатоцитов или урокиназы. Биологическая активность соответствующих белков обеспечивает поддержание функции и деления клеток печени-гепатоцитов, а также разрушение белков внеклеточного матрикса, откладывающихся в ткани при фиброзе. Способ лечения фиброза печени основан на многократном внутривенном введении указанных средств в количествах не более 3,75 мг/кг (для грызунов).

В заявке RU 2015117244 A описано использовании препарата, включающего смесь невирусных плазмидных конструкций pC4W-HGFopt и pVax1-UPAopt, содержащих гены HGF и урокиназы, которые при одновременном введении в клетки печени обеспечивают синтез и секрецию соответствующих белков, биологическая активность которых способствует излечиванию от фиброза печени. Заявляемый препарат относится к фармакологической группе биологических препаратов для генной терапии, гепатопротекторов. Введение препарата внутривенно, может стимулировать процесс восстановления поврежденной фиброзом печени, влияя на выживаемость гепатоцитов, способствуя разрушению отложений коллагена и других белков, замещающих при фиброзе паренхиму печени.

В патенте РФ 2491097 описана фармацевтическая композиция для терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза (БАС), содержащей в эффективном количестве аденовирусный вектор, выполненный в виде нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена ангиогенина ANG человека, продуцирующей в организме человека ангиогенин и нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF человека, продуцирующей в организме человека фактор роста эндотелия сосудов. При этом ген ангиогенина человека и ген фактора роста эндотелия сосудов человека клонированы в две экспрессирующих кассеты одной нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа. Также описан способ терапии БАС, заключающийся во введении человеку терапевтически эффективной дозы указанной фармацевтической композиции.

В патенте РФ 2522778 описано средство для лечения ишемических поражений тканей, представляющему собой смесь с соотношением 1÷0,5-3 из двух культур мезенхимальных стволовых клеток, одна из которых модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию фактора роста эндотелия сосудов VEGF, а другая модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию ангиопоэтина ANGPT1. Описан также способ лечения ишемических поражений тканей, который заключается во введении путем нескольких инъекций (обкалывания) прямо в ишемизированную ткань, например, мышцы конечности или миокард, в культуральной среде, не содержащей сыворотки, смеси культур модифицированных мезенхимальных стволовых (стромальных) клеток, гиперпродуцирующих VEGF и ANGPT1 в концентрациях от 3 до 100 млн клеток в 1 мл раствора.

Генетически модифицированные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани получали с помощью трансформации этих клеток рекомбинантным аденоассоциированным вирусным вектором 2 серотипа - AAV Helper-Free System (Stratagene, США), в который были встроены оптимизированный ген VEGF 165 человека и оптимизированный ген ANGPT1.

Изобретение РФ 2170104 относится к новому способу in vivo представления и прямого переноса ДНК, кодирующей нужный заживляющий белок в репарационных клетках млекопитающих. Данный способ включает имплантирование матрицы, содержащей нужную ДНК в свежую рану. Репарационные клетки, обычно возникающие в жизнеспособной ткани, окружающей рану, пролифелируют и мигрируют в активированную генами матрицу, где они сталкиваются, поглощают и экспрессируют ДНК. Поэтому трансфицированные репарационные клетки действуют как биореакторы in situ (локализованные внутри раны), вырабатывающие агенты (РНК, кодированные ДНК, белки и т.д.), заживляющие рану. Данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые могут быть использованы при осуществлении изобретения, т.е. при переносе нужной ДНК. Такие композиции включают подходящую матрицу в сочетании с нужной ДНК. Молекулы ДНК могут кодировать различные факторы, способствующие заживлению ран, включая внеклеточные, клеточно-поверхностные и внутриклеточные РНК и белки. В качестве целевого гена могут быть использованы, например, ген фактора роста гепацитов (HGF); ген фактора роста тромбоцитов (PDGF); гены основных факторов роста фибробластов (FGF1, FGF2 и т.д.); ген фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и др.

ДНК, кодирующая нужные продукты трансляции или транскрипции, может быть рекомбинантно встроена в многочисленные векторные системы, обеспечивающие широкомасштабную репликацию ДНК с целью получения активированных генами матриц. Используемые векторы включают, но не ограничиваются ими, векторы, полученные из рекомбинантной бактериофаговой ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Например, могут быть использованы плазмидные векторы, такие как pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 и серия векторов М13 мр. Бактериофаговые векторы могут включать способы переноса генов in vivo для заживления ран, патент №2170104gt10, способы переноса генов in vivo для заживления ран, патент №2170104gt11, способы переноса генов in vivo для заживления ран, патент №2170104gt18-23, способы переноса генов in vivo для заживления ран, патент №2170104ZAP/R, а также серию бактериофаговых векторов EMBL. Используемые космидные векторы включают, но не ограничиваются ими, pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 и серию векторов харомида 9. Альтернативно, могут быть сконструированы рекомбинантные вирусные векторы, включающие, но не ограниченные ими, векторы, полученные из вирусов, таких как вирус герпеса, ретровирусы, вакцинные вирусы, аденовирусы, адено-ассоциируемые вирусы или бычий папилломный вирус. Несмотря на то, что могут быть использованы интегрирующие вирусы, предпочтительными для заживления ран являются неинтегрирующие системы, не передающие генный продукт дочерним клеткам в течение многих поколений. Таким образом, генный продукт экспрессируется во время процесса заживления ран, и по мере того, как ген разбавляется в последующих поколениях, количество экспрессируемого генного продукта снижается.

В изобретении РФ 2486918 описан способ стимуляции восстановления периферической иннервации ткани после травмы, который заключается во введении терапевтически эффективного количества плазмидного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую мозговой нейротрофический фактор (BDNF), или плазмидного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческуюурокиназу uPA дикого типа (NM_002658), или их комбинации, или комбинации плазмидного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую BDNF с плазмидным вектором, содержащим оптимизированную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую фактор стромальных клеток SDF1. Способ позволяет ускорить восстановление структуры и проводимости периферических нервов после травм за счет локального увеличения продукции нейротрофических факторов.

При осуществлении изобретения впервые были сконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие оптимизированные последовательности кДНК (BDNFopt) и стромального фактора человека (SDF-1opt). При этом наилучшие результаты были получены при использовании в качестве вектора плазмиды pVax1 (#V260-20, Invitrogen). Также указано, что для клонирования могут быть использованы и другие плазмидные векторы, для которых характерна высококопийная репликация в Е. coli и высокий уровень экспрессии клонируемого гена в клетках млекопитающих. В заявке WO 2004081229 описано изобретение, которое содержит способы применения полипептидов Bv8 (PROK2) и EG-VEGF (PROK1) и соответствующих нуклеиновых кислот для содействия процессу кроветворения. Кроме того, содержит методы скрининга модуляторов для активности Bv8 и EG-VEGF. Кроме того, в заявке предусмотрены способы лечения с использованием полипептидов Bv8 и EG-VEGF или их антагонистов. Клонирование и экспрессия Bv8 описаны в заявке WO 2003020892.

Прототипом настоящего изобретения в части использования рекомбинантных ДНК-векторов для генной терапии являетсяпатент, US 9550998 (В2), в котором описан способ получения рекомбинантного вектора для генетической иммунизации. Полученный вектор представляет собой суперскрученный плазмидный ДНК-вектор, который предназначен для экспрессии клонированных генов в клетках животных и человека. Вектор состоит из области начала репликации (origin), регуляторных элементов, включающих промотор и энхансер цитомегаловируса человека, регуляторные элементы из Т-лимфотропного вируса человека. Накопление вектора производят в специальном штамме E. coli без использования антибиотиков за счет антисенс-комплементации гена sacB, введенного в штамм посредством бактериофага. Ограничением использования данного ДНК - вектора для генетической терапии является наличие в его составе регуляторных элементов, представляющих собой последовательности вирусных геномов.

Раскрытие изобретения.

Задачей изобретения является конструирование генотерапевтических ДНК-векторов на основе специально сконструированного генотерапевтического ДНК-вектора для повышения уровня экспрессиигена, выбранного из группы генов-гена ANG, кодирующегобелокангиогенин, гена ANGPT1, кодирующего белок ангиопоэтин 1, гена VEGFA, кодирующего белок фактора роста эндотелия сосудов А, гена FGF1, кодирующего белок фактора роста фибробластов 1, гена HIF1α, кодирующего белок гипоксией индуцированного фактора α, гена HGF, кодирующего белок фактора роста гепатоцитов, гена SDF1, кодирующего белок фактора стромальных клеток, гена KLK4, кодирующего белоккалликреин, гена PDGFC, кодирующего белок фактора роста тромбоцитов С, гена PROK1, кодирующего белок прокинетицин 1, гена PROK2, кодирующего белок прокинетицин 2, а также - конструирование штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-векторы для производства их в промышленных масштабах.

При этом ДНК-векторы должны оптимально сочетать в себе следующие свойства:

I) возможность безопасного использования для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов антибиотикорезистентности;

II) длину, обеспечивающую эффективное проникновение в клетку-мишень;

III) наличие регуляторных элементов, обеспечивающих эффективную экспрессию целевых генов и, в то же время, не представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов;

IV) технологичность получения и возможность наработки в промышленных масштабах.

Пункты I и III предусмотрены в данном техническом решении в соответствии с рекомендациями государственных регуляторов к лекарственным средствам для генной терапии, в частности, Европейского Агентства по лекарственным средствам.

Поставленная задача решается за счет того, что создан генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, для повышения уровня экспрессии этого целевого гена в организме человека и животных, при этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ANG или VTvaf17- ANGPT1 или VTvaf17- VEGFA или VTvaf17- FGF1 или VTvaf17- HIF1α или VTvaf17- HGF или VTvaf17- SDF1, или VTvaf17- KLK4 или VTvaf17- PDGFC, или VTvaf17- PROK1 или VTvaf17- PROK2, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 или SEQ ID №5 или SEQ ID №6 или SEQ ID №7 или SEQ ID №8 или SEQ ID №9 или SEQ ID №10 или SEQ ID №11 соответственно. Каждый из созданных генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17- ANG или VTvaf17- ANGPT1 или VTvaf17- VEGFA или VTvaf17- FGF1 или VTvaf17- HIF1α или VTvaf17- HGF или VTvaf17- SDF1, или VTvaf17- KLK4 или VTvaf17- PDGFC, или VTvaf17- PROK1, или VTvaf17- РRОK2 за счет ограниченного размера векторной части VTvaf17, не превышающего 3200 п.н, обладает способностью эффективно проникать в клетки и экспрессировать клонированный в него целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2. В составе генотерапевтического ДНК-вектора отсутствуют нуклеотидные последовательности вирусного происхождения и отсутствуют гены антибиотикорезистентности, обеспечивая возможность его безопасного применения для генетической терапии человека и животных.

Создан также способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, который заключается в том, что каждый генотерапевтический ДНК-вектор: VTvaf17- ANG или VTvaf17- ANGPT1 или VTvaf17- VEGFA или VTvaf17- FGF1 или VTvaf17-HIF1α или VTvaf17- HGF или VTvaf17- SDF1, или VTvaf17- KLK4 или VTvaf17- PDGFC, или VTvaf17- PROK1 или VTvaf17- PROK2 получают следующим образом: кодирующую часть целевого гена из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1A, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, клонируют в ДНК-вектор VTvaf17 и получают генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ANG, SEQ ID №1, или VTvaf17- ANGPT1, SEQ ID №2 или VTvaf17- VEGFA, SEQ ID №3, или VTvaf17- FGF1, SEQ ID №4 или VTvaf17- HIF1α, SEQ ID №5 или VTvaf17- HGF, SEQ ID №6 или VTvaf17- SDF1, SEQ ID №7 или VTvaf17- KLK4, SEQ ID №8 или VTvaf17- PDGFC, SEQ ID №9 или VTvaf17- PROK1, SEQ ID №10 или VTvaf17- PROK2, SEQ ID №11 соответственно.

Способ применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов заключается во введении выбранного генотерапевтического ДНК-вектора или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток человека или животного, трансфицированных выбранным генотерапевтическим ДНК-вектором или несколькими выбранными генотерапевтическими ДНК-векторами, или в сочетании обозначенных способов.

Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANG или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANGPT1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- FGF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- SDF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- KLK4 или штамма Escherichiacoli SCS110-AF/VTvaf17- PDGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2 заключается в электропорации компетентных клеток штамма Escherichia coli SCS110-AF созданным генотерапевтическим ДНК-вектором и последующей селекцией стабильных клонов штамма с использованием селективной среды.

Заявлен штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANG или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANGPT1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- FGF1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HIF1α или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HGF или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- SDF1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- KLK4 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PDGFC или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор для его наработки с возможностью культивирования штамма без использования антибиотиков.

Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора заключается в масштабировании бактериальной культуры штамма до количеств, необходимых для наращивания бактериальной биомассы в промышленном ферментере, после чего биомассу используют для выделения фракции, содержащей целевой ДНК-продукт -генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ANG или VTvaf17- ANGPT1 или VTvaf17- VEGFA или VTvaf17- FGF1 или VTvaf17- HIF1α или VTvaf17- HGF или VTvaf17- SDF1, или VTvaf17- KLK4 или VTvaf17- PDGFC, или VTvaf17- PROK1, или VTvaf17- PROK2, многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами.

При этом специалистам в данной области техники известно свойство вырожденности генетического кода, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей, отличающихся инсерцией, делецией или заменой нуклеотидов, которые не приводят к изменению полипептидной последовательности, кодируемой целевым геном, и/или не приводят к потере функциональной активности регуляторных элементов вектора VTvaf17. При этом специалистам в данной области техники известно явление генетического полиморфизма, из которого следует, что под объем настоящего изобретения также подпадают варианты нуклеотидных последовательностей генов из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, которые при этом кодируют различные варианты аминокислотных последовательностей белков ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, не отличающихся от приведенных по своей функциональной активности при физиологических условиях.

Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, заключается в том, что кодирующую часть целевого гена ANG или ANGPT1 или VEGFA, или FGF1 или HIF1α или HGF или SDF1 или KLK4 или PDGFC или PROK1 или PROK2 получают путем выделения РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации кДНК с использованием специфических олигонуклеотидов и расщеплением продукта амплификации эндонуклеазами рестрикции, причем клонирование в генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 проводят по сайтам рестрикции, обеспечивающим попадание рамки считывания целевых генов в экспрессионную кассету вектора VTvaf17.

Известно, что способность ДНК-векторов проникать в эукариотические клетки обусловлена, главным образом, размером вектора. При этом ДНК-вектора с наименьшим размером обладают более высокой проникающей способностью. Таким образом, отсутствие в составе вектора элементов, которые не несут функциональной нагрузки, но при этом увеличивают размер ДНК вектора, является предпочтительным. Данные особенности ДНК-векторов были учтены при получении генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, путем отсутствия в составе вектора крупных нефункциональных последовательностей и генов антибиотикорезистентности, что позволило, помимо технологических преимуществ и преимуществ в плане безопасности применения, значительно уменьшить размер полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2. Таким образом, способность проникать в эукариотические клетки полученного генотерапевтического ДНК-вектора обусловлена ограниченным размером векторной части VTvaf17 (в которую входит промотор, ориджин репликации, сигнал полиаденилирования, полилинкер, элемент RNA-out), не превышающим 3200 п.н.

Способность проникать в эукариотические клетки и проявлять функциональную активность, то есть способность экспрессировать целевой ген, полученного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG или VTvaf17- ANGPT1 или VTvaf17- VEGFA или VTvaf17- FGF1 или VTvaf17- HIF1α или VTvaf17- HGF или VTvaf17- SDF1, или VTvaf17- KLK4, или VTvaf17- PDGFC, или VTvaf17- PROK1, или VTvaf17- PROK2 подтверждают путем введения в эукариотические клетки полученного вектора и последующим анализом экспрессии специфической мРНК и/или белкового продукта целевого гена. При этом наличие специфической мРНК в клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ANG или VTvaf17- ANGPT1 или VTvaf17- VEGFA или VTvaf17- FGF1 или VTvaf17- HIF1α или VTvaf17- HGF или VTvaf17- SDF1, или VTvaf17- KLK4 или VTvaf17- PDGFC или VTvaf17- PROK1, или VTvaf17- PROK2 свидетельствует как о способности полученного вектора проникать в эукариотические клетки, так и о его способности экспрессировать мРНК целевого гена. При этом, как известно специалистам в данной области техники, наличие мРНК гена является обязательным условием, но не является доказательством трансляции белка, кодируемого целевым геном. Поэтому для подтверждения свойства генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG или VTvaf17- ANGPT1 или VTvaf17- VEGFA или VTvaf17- FGF1 или VTvaf17- HIF1α или VTvaf17- HGF или VTvaf17- SDF1, или VTvaf17- KLK4, или VTvaf17- PDGFC, или VTvaf17- PROK1, или VTvaf17- PROK2 экспрессировать целевой ген на уровне белка в эукариотических клетках, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор, проводят с использованием иммунологических методов анализ концентрации белков, кодируемых целевыми генами. Наличие белка ANG или ANGPT1 или VEGFA или FGF1 или HIF1α или HGF или SDF1 или KLK4 или PDGFC или PROK1 или PROK2 подтверждает эффективность экспрессии целевых генов в эукариотических клетках и возможность повышения уровня концентрации белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2.

Способ применения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, заключается во введении генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген или нескольких выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, в клетки, органы и ткани человека или животного, и/или во введении в органы и ткани человека или животного аутологичных клеток, в которые был введен генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или несколько выбранных генотерапевтических ДНК-векторов, или в сочетании обозначенных способов.

Указанные способы применения характеризуются отсутствием потенциальных рисков для генетической терапии человека и животных за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора регуляторных элементов, представляющих собой нуклеотидные последовательности вирусных геномов и за счет отсутствия в составе генотерапевтического ДНК-вектора генов устойчивости к антибиотикам, что подтверждается отсутствием участков, гомологичных вирусным геномам и генам антибиотикорезистентности в нуклеотидных последовательностях генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANGPT1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- VEGFA или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- FGF1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HIF1α или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HGF или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- SDF1, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- KLK4 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PDGFC или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK2 (SEQ ID №1 или SEQ ID №2 или SEQ ID №3 или SEQ ID №4 или SEQ ID №5 или SEQ ID №6 или SEQ ID №7 или SEQ ID №8 или SEQ ID №9 или SEQ ID №10 или SEQ ID №11 соответственно).

Как известно специалистам в данной области техники, гены антибиотикорезистентности в составе генотерапевтических ДНК-векторов используются с целью получения этих векторов в препаративных количествах путем наращивания бактериальной биомассы в питательной среде, содержащей селективный антибиотик. В рамках настоящего изобретения в целях возможности безопасного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген ANG или ANGPT1 или VEGFA или FGF1 или HIF1α или HGF или SDF1 или KLK4 или PDGFC или PROK1 или PROK2 использование селективных питательных сред, содержащих антибиотик, не представляется возможным. В качестве технологического решения для получения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, для возможности масштабирования до промышленных масштабов получения генотерапевтических векторов предлагается способ получения штаммов для наработки указанных генотерапевтических векторов на основе бактерии Escherichia coli SCSI 10-AF. Способ получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANG или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANGPT1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- FGF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HIF1α или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- SDF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- KLK4 или штамма Escherichiacoli SCS110-AF/VTvaf17- PDGFC или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2 заключается в получении компетентных клеток штамма Escherichia coli SCSI 10-AF с введением в эти клетки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANGPT1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- VEGFA или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- FGF1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HIF1α или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HGF или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- SDF1, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- KLK4 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PDGFC, или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK1 или генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK2 соответственно с помощью методов трансформации (электропорации). Полученные штаммыиспользуются для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, с возможностью использования сред без содержания антибиотиков.

Способ масштабирования получения бактериальной массы до промышленных масштабов для выделения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1A, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, заключается в том, что затравочную культуру штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANG или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- FGF1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- SDF1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- KLK4 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PDGFC или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2 инкубируют в объеме питательной среды без содержания антибиотика обеспечивающим подходящую динамику накопления биомассы, по достижению достаточного количества биомассы в логарифмической фазе роста, бактериальную культуру переносят в промышленный ферментер, после чего растят до достижения стационарной фазы роста, затем выделяют фракцию, содержащую целевой ДНК-продукт -генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ANG или VTvaf17- ANGPT1 или VTvaf17- VEGFA или VTvaf17- FGF1 или VTvaf17- HIF1α или VTvaf17- HGF или VTvaf17- SDF1 или VTvaf17- KLK4 или VTvaf17- PDGFC, или VTvaf17- PROK1 или VTvaf17- PROK2 многостадийно фильтруют и очищают хроматографическими методами. При этом специалистам в данной области техники понятно, что условия культивирования штаммов, состав питательных сред (за исключением содержания антибиотиков), используемое оборудование, методы очистки ДНК могут варьировать в рамках стандартных операционных процедур в зависимости от отдельно взятой производственной линии, но известные подходы к масштабированию, промышленному получению и очистке ДНК-векторов с использованием штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANG или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANGPT1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- FGF1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HIF1α или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- SDF1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- KLK4 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PDGFC или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2 подпадают под объем настоящего изобретения.

Изобретение поясняется чертежами, где:

На фиг. 1

представлена схемагенотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой гена человека, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2, который представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетках бактерии Eshcerichiacoli.

На фиг. 1 приведены схемы, соответствующие:

А - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANG,

В - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANGPT1,

С - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-VEGFA,

D - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-FGF1,

Е - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- HIF1α,

F - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- HGF,

G - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- SDF1,

Н - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- KLK4,

I - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- PDGFC,

K - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- PROK1,

L - генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- PROK2.

На схемах отмечены следующие структурные элементы вектора:

EF1a - промоторная область гена человеческого фактора элонгации EF1A с собственным энхансером, содержащимся в первом интроне гена. Служит для обеспечения высокого уровня транскрипции рекомбинантного гена в большинстве тканей человека.

Рамка считывания целевого гена, соответствующая кодирующей части гена ANG (фиг. 1A), или ANGPT1 (фиг. 1B), или VEGFA (фиг. 1C), или FGF1 (фиг. 1D), или HIF1α (фиг. 1E), или HGF (фиг. 1F), или SDF1 (фиг. 1G) или KLK4 (фиг. 1H), или PDGFC (фиг. 1I), или PROK1 (фиг. 1K), или PROK2 (фиг. 1L), соответственно;

hGH-TA - терминатор транскрипции и сайт полиаденилирования гена фактора роста человека;

(4) RNA-out - регуляторный элемент РНК-out транспозона Tn 10, обеспечивающий возможность положительной селекции без использования антибиотиков при использовании штамма Е. coli SCS 110;

ori - область начала репликации, участок служащий для автономной репликации с однонуклеотидной заменой для повышения копийности плазмиды в клетках большинства штаммов Е. Coli.

Отмечены уникальные сайты рестрикции Е. coli.

На фиг. 2

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно, гена ANG человека, в клетках первичной культурыфибробластов кожи человека HDFa (ATCCPCS-201-012) до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ANG, с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG, несущего целевой ген ANG, где

1 - кДНК гена ANG до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANG;

2 - кДНК гена ANG после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANG;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANG;

4 - кДНК гена В2М после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANG.

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 3

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена ANGPT1 человека, в клетках культуры фибробластов НТ 297.Т человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1, с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANGPT1, несущего целевой ген ANGPT1, где

1 - кДНК гена ANGPT1 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1,

2 - кДНК гена ANGPT1 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1,

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1,

4 - кДНК гена В2М после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1.

На фиг. 4

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена VEGFA человека в клетках культуры фибробластов крайней плоти Hs27 человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-VEGFAc целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- VEGFA, несущего целевой ген VEGFA, где

1 - кДНК гена VEGFA до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA;

2 - кДНК гена VEGFA после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA;

4 - кДНК гена В2М после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA.

На фиг. 5

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена FGF1 человека, в клетках культуры скелетных миобластов HSkM человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- FGF1c целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- FGF1, несущего целевой ген FGF1, где

1 - кДНК гена FGF1 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-FGF1;

2 - кДНК гена FGF1 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- FGF1;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-FGF1;

4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- FGF1.

На фиг. 6

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена HIF1α человека, в культурегладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-HIF1α с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HIF1α, несущего целевой ген HIF1α, где

1 - кДНК гена HIF1α до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α;

2 - кДНК гена HIF1α после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α;

4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α.

На фиг. 7

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена HGF человека, в культуре гладкомышечных клеток аорты T/GHA VSMC человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- HGF с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HGF, несущего целевой ген HGF, где:

1 - кДНК гена HGF до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HGF;

2 - кДНК гена HGF после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HGF;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HGF;

4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HGF.

На фиг. 8

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена SDF1 человека, в клетках культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- SDF1 с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- SDF1, несущего целевой ген SDF1, где:

1 - кДНК гена SDF1 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- SDF1;

2 - кДНК гена SDF1 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- SDF1;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-SDF1;

4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- SDF1.

На фиг. 9

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена KLK4 человека, в клетках культуры эндотелия пупочной вены HUVEC человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- KLK4 с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- KLK4, несущего целевой ген KLK4, где

1 - кДНК гена KLK4 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- KLK4;

2 - кДНК гена KLK4 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- KLK4;

3 -кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- KLK4;

4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- KLK4.

На фиг. 10

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена PDGFC человека, в клетках культуры меланоцитов эпидермиса НЕМа человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PDGFC с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PDGFC, несущего целевой ген PDGFC, где:

1 - кДНК гена PDGFC до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PDGFC;

2 - кДНК гена PDGFC после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PDGFC;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PDGFC;

4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PDGFC.

На фиг. 11

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена PROK1 человека, в клетках культуры скелетных миобластов HSkM человека до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PROK1 с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK1, несущего целевой ген PROK1, где:

1 - кДНК гена PROK1 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK1;

2 - кДНК гена PROK1 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK1;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK1;

4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK1.

На фиг. 12

Представлены графики накопления мРНК целевого гена, а именно гена PROK2 человека, в клетках первичной культуры эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 до их трансфекции и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PROK2 с целью подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK2, несущего целевой ген PROK2, где

1 - кДНК гена PROK2 до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK2;

2 - кДНК гена PROK2 после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK2;

3 - кДНК гена В2М до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK2;

4 - кДНК гена В2М в клетках после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK2.

На фиг. 13

Представлена диаграмма концентрации белка ангиогенина в культуральной среде клеток фибробластов кожи человека HDFa (АТСС PCS-201-012) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-ANG, с целью оценки изменения количества белка ангиогенина в культуральной среде клеток фибробластов кожи человека HDFa (АТСС PCS-201-012), при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-ANG, несущим ген ANG, где

культура А - первичная культурафибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - первичная культура фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - первичная культура фибробластов кожи человека HDFa, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- ANG, несущим ген ANG.

На фиг. 14

Представлена диаграмма концентрации белка ангиопоэтина 1в культуральной среде клеток культуры фибробластов НТ 297.Т человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1, с целью оценки изменения количества белка ангиопоэтина 1 в культуральной среде клеток культуры фибробластов НТ 297.Т человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1, несущим ген ANGPT1, где

культура А - культура фибробластов НТ 297.Т человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура фибробластов НТ 297.Т человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура фибробластов НТ 297.Т человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1, несущим ген ANGPT1.

На фиг. 15

Представлена диаграмма концентрации белка фактора роста эндотелия сосудов А в культуральной средефибробластов крайней плоти Hs27 человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA, с целью оценки изменения количества белка фактора роста эндотелия сосудов А в культуральной средефибробластов крайней плоти Hs27 человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA, несущим ген VEGFA где

культура А - культура фибробластов крайней плоти Hs27 человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура фибробластов крайней плоти Hs27 человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура фибробластов крайней плоти Hs27 человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA, несущим ген VEGFA.

На фиг. 16

Представлена диаграмма концентрации белка фактора роста фибробластов 1 в культуральной среде скелетных миобластов HSkM человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-FGF1, с целью оценки изменения количества белка фактора роста фибробластов 1 в культуральной среде скелетных миобластов HSkM человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- FGF1, несущим ген FGF1, где

культура А - культура скелетных миобластов HSkM человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура скелетных миобластов HSkM человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура скелетных миобластов HSkM человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- FGF1, несущим ген FGF1.

На фиг. 17

Представлена диаграмма концентрации белка гипоксией индуцированного фактора 1αв культуральной среде гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α, с целью оценки изменения количества белка гипоксией индуцированного фактора 1α в культуральной среде гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α, несущим ген HIF1α, где

культура А - культура гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α, несущим ген HIF1α.

На фиг. 18

Представлена диаграмма концентрации белка фактора роста гепатоцитов в культуральной среде гладкомышечных клеток аорты T/GHA VSMC человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- HGF, с целью оценки изменения количества белка фактора роста гепатоцитов в культуральной среде гладкомышечных клеток аорты T/GHA VSMC человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- HGF, несущим ген HGF, где

культура А - культура гладкомышечных клеток аорты T/GHA VSMC человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура гладкомышечных клеток аорты T/GHA VSMC человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура гладкомышечных клеток аорты T/GHA VSMC человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17-HGF, несущим ген HGF.

На фиг. 19

Представлена диаграмма концентрации белка фактора стромальных клеток 1 в культуральной среде кератиноцитов эпидермиса HEKa человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- SDF1, с целью оценки изменения количества белка фактора стромальных клеток 1 в культуральной среде кератиноцитов эпидермиса HEKa человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- SDF1, несущим ген SDF1, где

культура А - культура кератиноцитов эпидермиса HEKa человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура кератиноцитов эпидермиса HEKa человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура кератиноцитов эпидермиса HEKa человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- SDF1, несущим ген SDF1.

На фиг. 20

Представлена диаграмма концентрации белка калликреина в культуральной среде эндотелия пупочной вены HUVEC человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- KLK4, с целью оценки изменения количества белка калликреина в культуральной среде эндотелия пупочной вены HUVEC человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- KLK4, несущим ген KLK4, где

культура А - культура эндотелия пупочной вены HUVEC человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура эндотелия пупочной вены HUVEC человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура эндотелия пупочной вены HUVEC человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- KLK4, несущим ген KLK4.

На фиг. 21

Представлена диаграмма концентрации белка фактора роста тромбоцитов С в культуральной среде меланоцитов эпидермиса НЕМа человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PDGFC, с целью оценки изменения количества белка фактора роста тромбоцитов С в культуральной среде меланоцитов эпидермиса НЕМа человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PDGFC, несущим ген PDGFC, где

культура А - культура меланоцитов эпидермиса НЕМа человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура меланоцитов эпидермиса НЕМа человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура меланоцитов эпидермиса НЕМа человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- PDGFC, несущим ген PDGFC.

На фиг. 22

Представлена диаграмма концентрации белка прокинетицина-1 в культуральной среде скелетных миобластов HSkM человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PROK1, с целью оценки изменения количества белка прокинетицина-1 в культуральной среде скелетных миобластов HSkM человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PROK1, несущим ген PROK1, где

культура В - культура скелетных миобластов HSkM человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура скелетных миобластов HSkM человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- PROK1, несущим ген PROK1.

На фиг. 23

Представлена диаграмма концентрации белка прокинетицина-2 в культуральной среде эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 человека после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PROK2, с целью оценки изменения количества белка прокинетицина-2 в культуральной средеэндотелия капилляров кожи НМЕС-1 человека, при трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- PROK2, несущим ген PROK2, где

культура А - культура эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 человека, трансфицированных водным раствором без плазмидной ДНК (контроль);

культура В - культура эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17;

культура С - культура эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 человека, трансфицированных ДНК-вектором VTvaf17- PROK2, несущим ген PROK2.

На фиг. 24

Представлена диаграмма концентрации белка ангиогенина ANG в биоптатах кожи трех пациентов после введения в кожу этих пациентов генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка ангиогенина с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген ANG.

На фиг. 24 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- ANG;

П1II - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;

П2I - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- ANG;

П2II - биоптат кожи пациента П2 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П2III - биоптат кожи пациента П2 из интактного участка;

П3I - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- ANG;

П3II - биоптат кожи пациента П3 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П3III - биоптат кожи пациента П3 из интактного участка.

На фиг. 25

Представлена диаграмма концентрации белка ангиопоэтина ANGPT1 в биоптатах кожи человека после введения в кожу культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1 с целью демонстрации способа применения путем введения аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1.

На фиг. 25 отмечены следующие элементы:

П1А - биоптат кожи пациента П1 из интактного участка;

П1В - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17;

П1С - биоптат кожи пациента П1 в зоне введения культуры аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1.

На фиг. 26

Представлена диаграмма концентрации белка фактора стромальных клеток SDF1 в биоптатах мышечной ткани пациента после введения в мышечную ткань этого пациента генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- SDF1 с целью оценки функциональной активности, то есть экспрессии целевого гена на уровне белка, и возможности повышения уровня экспрессии белка с помощью генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген SDF1.

На фиг. 26 отмечены следующие элементы:

П1I - биоптат мышечной ткани пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17- SDF1;

П1II - биоптат мышечной ткани пациента П1 в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - биоптат мышечной ткани пациента П1 из интактного участка.

На фиг. 27

Представлена диаграмма изменения количества белков: белка ангиогенина (ANG), белка фактора роста эндотелия сосудов A (VEGFA), белка фактора роста фибробластов 1 (FGF1), белка прокинетицина-1 (PROK1) в кожных биоптатах крыс в зоне инъекционного введения:

в 1-й группе (КI) смесью генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17-ANG, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17- FGF1, VTvaf17- PROK1;

во 2-й группе (KII) - раствором ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо);

в 3-й группе (KIII) - физраствором.

На фиг. 28

Представлена диаграмма изменения количества белков: белка ангиогенина (ANG), белка гипоксией индуцированного фактора (HIF1α), белка фактора роста тромбоцитов С (PDGFC), белка прокинетицина-2 (PROK2) в биоптатах мышечной ткани в зоне предплечья пациента после инъекционного введения:

П1I - смеси генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17- ANG, VTvaf17- HIF1α, VTvaf17- PDGFC,VTvaf17- PROK2;

П1II - раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо);

П1III - интактная зона.

На фиг. 29

показаны графики накопления ампликонов кДНК целевого гена HGF в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC (Genlantis) до и через 48 часов после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-HGF с целью демонстрации способа применения путем введения генотерапевтического ДНК-вектора в клетки животных.

На фиг. 29 отмечены кривые накопления ампликонов в ходе реакции, соответствующие:

1 - кДНК гена HGF в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF;

2 - кДНК гена HGF в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF;

3 - кДНК гена ACT в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC до трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF;

4 - кДНК гена ACT в клетках в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF.

В качестве референтного гена использовали ген актина быка/коровы (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером АН001130.2.

Реализация изобретения

На основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 размером 3165 п.н. созданы генотерапевтические ДНК-векторы, несущие целевые гены человека - ген ANG, кодирующий белок ангиогенин, ген ANGPT1, кодирующий белок ангиопоэтин 1, ген VEGFA, кодирующий белок фактора роста эндотелия сосудов А, ген FGF1, кодирующий о белок фактора роста фибробластов 1, ген HIF1α, кодирующий белок гипоксией индуцированного фактора α, ген HGF, кодирующий белок фактора роста гепатоцитов, ген SDF1, кодирующий белок фактора стромальных клеток, ген KLK4, кодирующий белок калликреин, ген PDGFC, кодирующий белок фактора роста тромбоцитов С, ген PROK1, кодирующий белок прокинетицин-1, ген PROK2, кодирующий белок прокинетицин-2 предназначенные для повышения уровня экспрессии этих целевых генов в тканях человека и животных. При этом способ получения каждого генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевые гены человека заключается в том, что в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 клонируют белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2.

Способ получения генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов: ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2 заключается в том, что:

1. кодирующую часть гена ANG размером 448 п.н., или гена ANGPT1 размером 1501 п.н., или гена VEGFA размером 1242 п.н., или гена FGF1 размером 472 п.н. или гена HIF1α размером 2485 п.н., или гена HGF размером 2190 п.н., или гена SDF1 размером 284 п.н. или гена KLK4 размером 769 п.н., или гена PDGFC размером 1041 п.н. или гена PROK1 размером 328 п.н., или гена PROK2 размером 394 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани здорового человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации, с использованием созданных для этого методом химического синтеза олигонуклеотидов, с последующим расщеплением продукта амплификации эндонуклеазами рестрикции Sall-Kpnl или Sall-EcoRI или BamHI-EcoRI или BamHI-Sall или BamHI-HindIll.

2. кодирующую часть целевого гена ANG или гена ANGPT1 или гена FGF1 или гена HIF1α или гена PDGFC или гена PROK2 клонировали в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 по сайтам Sall-Kpnl, кодирующую часть целевого гена VEGFA клонировали в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 по сайтам BamHI-HindIll, кодирующую часть целевого гена HGF клонировали в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 по сайтам BamHI-Sall, кодирующую часть целевого гена SDF1 клонировали в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 по сайтам BamHI-EcoRI, кодирующую часть целевого гена KLK4 или гена PROK1 клонировали в полилинкер генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 по сайтам Sall-EcoRI, и в результате получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- ANG, SEQID №1, или VTvaf17- ANGPT1, SEQID №2 или VTvaf17- VEGFA, SEQID №3, или VTvaf17- FGF1, SEQID №4 или VTvaf17- HIF1α, SEQID №5 или VTvaf17- HGF, SEQID №6 или VTvaf17-SDF1, SEQID №7 или VTvaf17- KLK4, SEQID №8 или VTvaf17- PDGFC, SEQID №9 или VTvaf17- PROK1, SEQID №10 или VTvaf17- PROK2, SEQID №11. Полученным генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2 трансформировали методом электропорации бактерии Escherichia coli SCS110-AF, а селекцию полученных клонов проводили без антибиотиков.

3. для подтверждения эффективности созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG, SEQ ID №1, или VTvaf17- ANGPT1, SEQ ID №2 или VTvaf17- VEGFA, SEQ ID №3, или VTvaf17- FGF1, SEQ ID №4 или VTvaf17- HIF1α, SEQ ID №5 или VTvaf17- HGF, SEQ ID №6 или VTvaf17- SDF1, SEQ ID №7 или VTvaf17- KLK4, SEQ ID №8 или VTvaf17- PDGFC, SEQ ID №9 или VTvaf17- PROK1, SEQ ID №10 или VTvaf17- PROK2, SEQ ID №11 оценивали:

A) изменение накопления мРНК целевых генов в клетках человека и животного, после трансфекции различных клеточных линий генотерапевтическими ДНК-векторами (методом ПЦР в реальном времени-RT-PCR);

B) изменение количественного уровня целевых белков в культуральной среде клеток человека, после трансфекции различных клеточных линий генотерапевтическими ДНК-векторами (методом иммуноферментного анализа- ИФА);

С) изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека и животного, после введения в эти ткани генотерапевтических ДНК-векторов (методом ИФА);

D) изменение количественного уровня целевых белков в супернатанте биоптатов тканей человека, после введения в эти ткани аутологичных клеток этого человека, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами (методом ИФА),

Для подтверждения реализуемости способа применения созданного генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG, SEQ ID №1, или VTvaf17- ANGPT1, SEQ ID №2 или VTvaf17-VEGFA, SEQ ID №3, или VTvaf17- FGF1, SEQ ID №4 или VTvaf17-HIF1α, SEQ ID №5 или VTvaf17- HGF, SEQ ID №6 или VTvaf17-SDF1, SEQ ID №7 или VTvaf17- KLK4, SEQ ID №8 или VTvaf17-PDGFC, SEQ ID №9 или VTvaf17- PROK1, SEQ ID №10 или VTvaf17- PROK2, SEQ ID №11 выполняли:

А) трансфекциюгенотерапевтическими ДНК-векторами различных клеточных линий человека и животного;

В) введение генотерапевтических ДНК-векторов в различные ткани человека и животного;

C) введение в ткани человека и животного смеси генотерапевтических ДНК-векторов;

D) введение в ткани человека аутологичных клеток, трансфицированных генотерапевтическими ДНК-векторами.

Для подтверждения получения штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANG или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANGPT1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- FGF1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HIF1α или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SDF1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- KLK4 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PDGFC или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2, проводили трансформацию, селекцию и последующее наращивание с выделением плазмидной ДНК.

Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG, SEQ ID №1, или VTvaf17- ANGPT1, SEQ ID №2 или VTvaf17- VEGFA, SEQ ID №3, или VTvaf17-FGF1, SEQ ID №4 или VTvaf17- HIF1α, SEQ ID №5 или VTvaf17- HGF, SEQ ID №6 или VTvaf17- SDF1, SEQ ID №7 или VTvaf17- KLK4, SEQ ID №8 или VTvaf17- PDGFC, SEQ ID №9 или VTvaf17- PROK1, SEQ ID №10 или VTvaf17- PROK2, SEQ ID №11 выполняли:

А) ферментацию в промышленном масштабе штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANG или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- ANGPT1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- VEGFA или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- FGF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HIF1α или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- HGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SDF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- KLK4 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PDGFC или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий белок-кодирующую последовательность целевого гена, выбранного из группы генов: ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2.

Пример 1.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG, несущего целевой ген ANG.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANG конструировали клонированием кодирующей части гена ANG в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции Sall-Kpnl. Кодирующую часть гена ANG размером 448 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданныхолигонуклеотидов

ANG_F TTTGTCGACCACCATGGTGATGGGCCTGGGCGTT

ANG_R AATGGTACCTTACGGACGACGGAAAATTGACTG

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-FidelityDNAPolymerase (NewEnglandBiolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена ANG и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и Kpnl(NewEnglandBiolabs, США).

В результате получали ДНК-вектор VTvaf17- ANG размером 3618 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген ANG, с нуклеотидной последовательностью SEQID №1, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.А.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали объединением шести фрагментов ДНК, полученных из разных источников:

(а) область начала репликации (ori) получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды pBR322 с внесением точечной мутации;

(б) промоторный регион EF1a получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(в) терминатор транскрипции hGH-TA получали путем ПЦР-амплификации участка геномной ДНК человека;

(г) регуляторный участок транспозона Tn10 PHK-out получали путем синтеза из олигонуклеотидов|

(д) ген устойчивости к канамицину получали путем ПЦР-амплификации участка коммерческой плазмиды рЕТ-28 человека;

(е) полилинкер получали отжигом двух синтетических олигонуклеотидов.

ПЦР-амплификацию проводили с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) в соответствии с инструкцией производителя. Фрагменты имеют перекрывающиеся области для возможности их объединения с последующей ПЦР-амплификацией. Объединяли фрагменты (а) и (б) с использованием олигонуклеотидов Ori-F и EF1-R, а также фрагменты (в), (г) и (д) с использованием олигонуклеотидов hGH-F и Kan-R. Далее, полученные участки объединяли путем рестрикции с последующим лигированием по сайтам BamHI и Ncol. В результате получали плазмиду, пока еще не содержащую полилинкер. Для его введения проводили расщепление плазмиды по сайтам BamHI и EcoRI, и лигирование с фрагментом (е). Таким образом, получали вектор размером 4182 п.н., несущий ген устойчивости к канамицину, который фланкирован сайтами рестрикции Spel. Далее этот участок выщепляли по сайтам рестрикции Spel, после чего оставшийся фрагмент лигировали сам на себя. Таким образом получали генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 размером 3165 п.н., который является рекомбинантным, с возможностью селекции без антибиотиков.

Пример 2.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANGPT1, несущего целевой ген ANGPT1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANGPT1 конструировали клонированием кодирующей части гена ANGPT1 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции Nhel и HindIll. Кодирующую часть гена ANGPT1 размером 1501 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биологического образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

ANGPT1_FTTTGTCGACCACCATGACAGTTTTCCTTTCCTTTGCTTTCC

ANGPT1_RAATGGTACCTCAAAAATCTAAAGGTCGAATCATCATAGTTG и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-FidelityDNAPolymerase (NewEnglandBiolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена ANGPT1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sall и Kpnl (NewEnglandBiolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17-ANGPT1 размером 4660 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген ANGPT1, с нуклеотидной последовательностью SEQID №2 с возможностью селекции без антибиотиков, со структурой изображенной на фиг. 1.В.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 3

Получение ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген VEGFA человека.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-VEGFA конструировали клонированием кодирующей части гена VEGFA в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции BamHI-HindIll. Кодирующую часть гена VEGFA размером 1242 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

VEGFA_F

GGGGGATCCACCATGACGGACAGACAGACAGACACCGC

VEGFA_R

TTTGGATCCACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGC

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена VEGFA и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и HindIll(NewEnglandBiolabs, США).

В результате получили генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-VEGFA размером 4395 п.н. несущий целевой ген, а именно VEGFA, с нуклеотидной последовательностью SEQID №3, с возможностью селекции без антибиотиков, со структурой изображенной на фиг. 1.С.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 4.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-FGF1, несущего целевой ген FGF1

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- FGF1 конструировали клонированием кодирующей части гена FGF1 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции Sall-Kpnl. Кодирующую часть гена FGF1 размером 472 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

FGF_F TTTGTCGACCACCATGGCTGAAGGGGAAATCACC

FGF_R AATGGTACCTTAATCAGAAGAGACTGGCAGGGG

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена FGF1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и Kpnl (New England Biolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17-FGF1 размером 3631 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген FGF1, с нуклеотидной последовательностью SEQID №4, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.D.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 5.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HIF1α, несущего целевой ген HIF1α.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-HIF1α конструировали клонированием кодирующей части гена HIF1α в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции Sall-Kpnl. Кодирующую часть гена HIF1α размером 2485 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

HIF_F TTTGTCGACCACCATGGAGGGCGCCGGCGGCGCGA

HIF_R

AATGGTACCTCAGTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAGTAATTC

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена HIF1α и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и Kpnl (New England Biolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- HIF1α размером 5643 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген HIF1α, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №5, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.Е.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 6.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HGF, несущего целевой ген HGF.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- HGF конструировали клонированием кодирующей части гена HGF в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции BamHI-Sall. Кодирующую часть гена HGF размером 2190 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

HGF_F

TTTGGATCCACCATGTGGGTGACCAAACTCCTGCCA

HGF_R

AATGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTATATGTTAAAAT

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена HGF и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sall (New England Biolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- HGF размером 5349 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген HGF, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №6, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.F.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 7.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- SDF1, несущего целевой ген SDF1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- SDF1 конструировали клонированием кодирующей части гена SDF1 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции BamHI-EcoRI.

Кодирующую часть гена SDF1 размером 284 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

SDF_F AGGATCCCACCATGAACGCCAAGGTCGTGGT

SDF_R TATGAATTCACATCTTGAACCTCTTGTTTAAAGC

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена SDF1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- SDF1 размером 3425 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген SDF1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №7, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.G.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 8.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- KLK4, несущего целевой ген KLK4.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- KLK4 конструировали клонированием кодирующей части гена KLK4 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции Sall-EcoRI. Кодирующую часть гена KLK4 размером 769 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

KLK_F TTTGTCGACCACCATGGCCACAGCAGGAAATCCC

KLK_R TTTTTGAATTCTTAACTGGCCTGGACGGTTTTCTC

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена KLK4 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- KLK4 размером 3922 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген KLK4, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №8, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.Н.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 9.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC, несущего целевой ген PDGFC.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- PDGFC конструировали клонированием кодирующей части гена PDGFC в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции Sall-Kpnl. Кодирующую часть гена PDGFC размером 1041 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

PDGFC_F

TTTGTCGACCACCATGAGCCTCTTCGGGCTTCTCC

PDGFC_R AATGGTACCTATCCTCCTGTGCTCCCTCTGCAC

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена PDGFC и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sail и Kpnl (New England Biolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- PDGFC размером 4200 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген PDGFC, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №9, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.I.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf1 7 конструировали по Примеру 1.

Пример 10.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK1, несущего целевой ген PROK1.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- PROK1 конструировали клонированием кодирующей части гена PROK1 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции Sall-EcoRI. Кодирующую часть гена PROK1 размером 328 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

PROK1_F

TATGTCGACCACCATGAGAGGTGCCACGCGAG

PROK1_R

TATGGAATTCGGTACGCTAAAAATTGATGTTCTTCAAGTCCA и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-FidelityDNAPolymerase (NewEnglandBiolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена PROK1 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Saill и EcoRI (New England Biolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- PROK1 размером 3481 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген PROK1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №10, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.K.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 11.

Получение генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK2, несущего целевой ген PROK2.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17- PROK2 конструировали клонированием кодирующей части гена PROK2 в ДНК-вектор VTvaf17 по сайтам рестрикции Sall-Kpnl. Кодирующую часть гена PROK2 размером 394 п.н. получали путем выделения суммарной РНК из биопсийного образца ткани человека с последующим проведением реакции обратной транскрипции с использованием коммерческого набора Mint-2 (Евроген, Россия) и созданных олигонуклеотидов

PROK2_F

TTTGTCGACCACCATGAGGAGCCTGTGCTGCG

PROK2_R

AATGGTACCTTACTTTTGGGCTAAACAAATAAATCGG

и ПЦР-амплификации с использованием коммерческого набора Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, США) и созданных олигонуклеотидов.

Расщепление продукта амплификации кодирующей части гена PROK2 и ДНК-вектора VTvaf17 проводили эндонуклеазами рестрикции Sall и Kpnl (New England Biolabs, США).

В результате получили ДНК-вектор VTvaf17- PROK2 размером 3553 п.н. несущий целевой ген, а именно, ген PROK2, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №11, с возможностью селекции без антибиотиков со структурой изображенной на фиг. 1.L.

При этом генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 конструировали по Примеру 1.

Пример 12.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG, несущего целевой ген ANG. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген ANG.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG оценивали изменения накопления мРНК целевого гена ANG, в клетках первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (ATCCPCS-201-012) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANG.

Клетки первичной культуры фибробластов кожи человека HDF а выращивали в среде Fibroblast Basal Medium (АТСС PCS-201-030) с добавлением компонентов входящих в состав набора Fibroblast Growth Kit-Serum-Free (АТСС PCS-201-040) в атмосфере 5% CO₂ при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×10⁴ клеток/лунку.

Для трансфекции использовали реагент Lipofectamine 3000 (ThermoFisherScientific, США). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANG проводили следующим образом. В пробирке №1 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco) добавляли 1 мкл раствора ДНК-вектора VTvaf17-ANG(концентрация 500 нг/мкл) и 1 мкл реагента Р3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. В пробирке №2 к 25 мкл среды Opti-MEM (Gibco) добавляли 1 мкл раствора Lipofectamine 3000. Аккуратно перемешивали легким встряхиванием. Добавляли содержимое пробирки №1 к содержимому пробирки №2, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Полученный раствор по каплям добавляли к клеткам в объеме 40 мкл.

В качестве контроля использовали фибробласты кожи человека HDFа, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена(кДНК гена ANG до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано выше.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли следующим образом. В лунку с клетками добавляли 1 мл TrizolReagent (ThermoFisherScientific) и гомогенизировали с последующим прогреванием в течении 5 мин при 65°С. Далее образец центрифугировали при 14000g в течении 10 мин и снова прогревали в течении 10 мин при 65°С. Далее добавляли 200 мкл хлороформа, плавно перемешивали и центрифугировали при 14000g в течении 10 мин. Затем отбирали водную фазу, добавляли к ней 1/10 объема 3М ацетата натрия рН5.2 и равный объем изопропилового спирта. Инкубировали образец при -20°С в течении 10 мин с последующим центрифугированием при 14 000g в течении 10 мин. Осадок промывали 1 мл 70% этилового спирта, высушивали на воздухе и растворяли в 10 мкл воды, свободной от РНКаз. Для определения уровня экспрессии мРНК гена ANG после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена ANG человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 183 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили с помощью набора реагентов SYBRGreenQuantitectRT-PCRKit (Qiagen, США) в режиме реального времени в 20 мкл амплификационной смеси, содержащей: 25 мкл QuantiTectSYBRGreenRT-PCRMasterMix, 2,5 mM хлорида магния, по 0,5 мкМ каждого праймера, 5 мкл суммарной РНК. Реакцию осуществляли на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, USA) при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов ANGи В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ANG и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANG в культуре клетокфибробластов кожи человека HDFa после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANG на фиг. 2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры фибробластов кожи человека НDFагенотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANG, уровень специфической мРНК гена ANG человекавырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG для повышения уровня экспрессии гена ANG в эукариотических клетках.

Пример 13.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора ANGPT1, несущего целевой ген ANGPT1. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген ANGPT1.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANGPT1, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена ANGPT1, в клетках первичной культуры фибробластов кожи человека НТ 297.Т (АТСС® CRL-7782™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1.

Клетки первичной культуры фибробластов кожи человека НТ 297.Т выращивали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium согласно методики производителя (https://www.lqcstandards-atcc.orq/products/all/CRL-7782.aspx#culturemethod) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры фибробластов кожи человека НТ 297.Т трансфицировали как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1.

В качестве контроля использовали фибробласты кожи человека НТ 297.Т, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором ANGPT1, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена ANGPT1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена ANGPT1 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена ANGPT1 человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 181 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов ANGPT1 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов ANGPT1 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена ANGPT1 в культуре клеток фибробластов кожи человека НТ 297.Т после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1 на фиг. 3 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры фибробластов кожи человека НТ 297.Т генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1, уровень специфической мРНК гена ANGPT1 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANGPT1. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANGPT1 для повышения уровня экспрессии гена ANGPT1 в эукариотических клетках.

Пример 14.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген VEGFA. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген VEGFA.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- VEGFA, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена VEGFA, в клетках первичной культуры фибробластов крайней плоти Hs27 (АТСС® CRL-1634™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA.

Клетки первичной культуры фибробластов крайней плоти Hs27 выращивали в среде Dulbecco's Modified Eagle's Medium согласно методики производителя (https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1634.aspx#culturemethod) в атмосфере при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры фибробластов крайней плоти Hs27 трансфицировали,как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA.

В качестве контроля использовали фибробласты крайней плоти Hs27, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена VEGFA до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяликак описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена VEGFA после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена VEGFA человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 167 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов VEGFA и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов VEGFA и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена VEGFA в культуре клеток фибробластов крайней плоти Hs27 после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA на фиг. 4 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры фибробластов крайней плоти Hs27 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA, уровень специфической мРНК гена VEGFA человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- VEGFA. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA для повышения уровня экспрессии гена VEGFA в эукариотических клетках.

Пример 15.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-FGF1, несущего целевой ген FGF1. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген FGF1.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-FGF1, оценивали изменения накопления мРНК целевого гeнa FGF1, в клетках первичной культуры скелетных миобластов HSkM человека (А12555, Thermo Fisher Scientific) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- FGF1.

Клетки первичной культуры скелетных миобластов HSkM человекавыращивали в среде Gibco® HSkM Differentiation Medium (DM) согласно методики производителя (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A12555) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры скелетных миобластов HSkM трансфицировали, как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-FGF1.

В качестве контроля использовали скелетные миобласты HSkM человека, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена FGF1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена FGF1 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена FGF1 человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 189 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов FGF1 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов FGF1 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена FGF1 в культуре клеток скелетных миобластов HSkM после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- FGF1 на фиг. 5 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры скелетных миобластов HSkM генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-FGF1, уровень специфической мРНК гена FGF1 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-FGF1. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- FGF1 для повышения уровня экспрессии гена FGF1 в эукариотических клетках.

Пример 16.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HIF1α, несущего целевой ген HIF1α. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген HIF1α.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HIF1α, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена HIF1α, в клетках первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека (АТСС® PCS-420-012™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α.

Клетки первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc выращивали в среде Vascular Cell Basal Medium (АТСС PCS-100-030) с добавлением компонентов входящих в состав набора для роста (АТСС PCS-100-042) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc трансфицировали, как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HIF1α.

В качестве контроля использовали клетки первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена HIF1α до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена HIF1α после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена HIF1α человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 173 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов HIF1α и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов HIF1α и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена HIF1α в первичной культуре гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α на фиг. 6 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HIF1α, уровень специфической мРНК гена HIF1α человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HIF1α. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HIF1α для повышения уровня экспрессии гена HIF1α в эукариотических клетках.

Пример 17.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HGF, несущего целевой ген HGF. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген HGF.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HGF, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена HGF, в первичной культуре гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC (АТСС® CRL-1999™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HGF.

Клетки первичной культуры гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC выращивали в среде F-12K Medium согласно методики производителя (https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1999.aspx#culturemethod) в атмосфере при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC трансфицировали, как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF.

В качестве контроля использовали Клетки первичной культуры гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена HGF до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена HGF после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена HGF человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 182 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов HGF и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов HGF и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена HGF в первичной культуре гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HGF на фиг. 7 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF, уровень специфической мРНК гена HGF человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HGF. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HGF для повышения уровня экспрессии гена HGF в эукариотических клетках.

Пример 18.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1, несущего целевой ген SDF1. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген SDF1.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена SDF1, в клетках первичной культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa (АТСС® PCS-200-011™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- SDF1.

Клетки первичной культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa выращивалив среде Dermal Cell Basal Medium (АТСС® PCS200030) с добавлением Keratinocyte Growth Kit (АТСС® PCS200040) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa трансфицировали, как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-SDF1.

В качестве контроля использовали кератиноциты эпидермиса HEKa, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена SDF1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена SDF1 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена SDF1 человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 152 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов SDF1 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов SDF1 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена SDF1 в культуре кератиноцитов эпидермиса HEKa после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-SDF1 нa фиг. 8 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-SDF1, уровень специфической мРНК гена SDF1 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1 для повышения уровня экспрессии гена SDF1 в эукариотических клетках.

Пример 19.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-KLK4, несущего целевой ген KLK4. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген KLK4.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf 17-KLK4, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена KLK4, в клетках первичной культуры эндотелия пупочной вены HUVEC (АТСС® PCS-100-010™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- KLK4.

Клетки первичной культуры эндотелия пупочной вены HUVEC выращивалив среде Vascular Cell Basal Medium (АТСС PCS-100-030) согласно методики производителя (https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/PCS-100-010.aspx#cultureconditions) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры эндотелия пупочной вены НUVЕС трансфицировали, как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-KLK4.

В качестве контроля использовали клетки первичной культуры эндотелия пупочной вены HUVEC, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена KLK4 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена KLK4 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена KLK4 человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 177 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов KLK4 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов KLK4 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена KLK4 в первичной культуре клеток эндотелия пупочной вены HUVEC после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- KLK4 на фиг. 9 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры клеток эндотелия пупочной вены HUVEC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-KLK4, уровень специфической мРНК гена KLK4 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-KLK4.

Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-KLK4 для повышения уровня экспрессии гена KLK4 в эукариотических клетках.

Пример 20

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC, несущего целевой ген PDGFC. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген PDGFC.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена PDGFC, в клетках первичной культуры меланоцитов эпидермиса НЕМа (АТСС® PCS-200-013™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PDGFC.

Клетки первичной культуры меланоцитов эпидермиса НЕМа выращивалив среде Dermal Cell Basal Medium (АТСС® PCS200030) согласно методики производителя (https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/PCS-200-013.aspx#cultureconditions) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры меланоцитов эпидермиса НЕМатрансфицировали, как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PDGFC.

В качестве контроля использовали клетки первичной культуры меланоцитов эпидермиса НЕМа, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена PDGFC до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена PDGFC после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена PDGFC человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 173 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов PDGFC и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов PDGFC и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена PDGFC в культуре клеток меланоцитов эпидермиса НЕМа после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PDGFC на фиг. 10 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры меланоцитов эпидермиса НЕМа генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PDGFC, уровень специфической мРНК гена PDGFC человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PDGFC для повышения уровня экспрессии гена PDGFC в эукариотических клетках.

Пример 21

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK1, несущего целевой ген PROK1. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген PROK1.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK1, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена PROK1, в клетках первичной культуры скелетных миобластов HSkM человека (А12555, Thermo Fisher Scientific) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK1.

Клетки первичной культуры скелетных миобластов HSkM человека выращивали в среде Gibco® HSkM Differentiation Medium (DM) согласно методики производителя (https://www.thermofisher.com/order/cataloq/product/A12555) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры скелетных миобластов HSkM трансфицировали, как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK1.

В качестве контроля использовали клетки первичной культуры скелетных миобластов HSkM, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащимвставку целевого гена (кДНК гена PROK1 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf 17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена PROK1 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена PROK1 человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 184 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов PROK1 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов PROK1 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена PROK1 в культуре клеток скелетных миобластов HSkM после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK1 на фиг. 11 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры скелетных миобластов HSkM генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK1, уровень специфической мРНК гена PROK1 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK1. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK1 для повышения уровня экспрессии гена PROK1 в эукариотических клетках.

Пример 22

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK2, несущего целевой ген PROK2. Данный пример также демонстрирует реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора, несущего целевой ген PROK2.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK2, оценивали изменения накопления мРНК целевого гена PROK2, в клетках первичной культуры клеток эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 (АТСС® CRL-3243™) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK2.

Первичную культуру клеток эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 выращивали в среде MCDB131 (без L-Glutamine) согласно методики производителя (https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-3243.aspx#culturemethod) при 37°С. Для получения 90% конфлюэнтности, за 24 часа до постановки трансфекции клетки высевали в 24-луночный планшет из расчета 5×104 клеток/лунку.

Клетки первичной культуры клеток эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 трансфицировали, как описано в Примере 12.

Трансфекцию проводили генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf 17- PROK2.

В качестве контроля использовали клетки эндотелия капилляров кожи НМЕС-1, трансфицированные генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена (кДНК гена PROK2 до и после трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не содержащим вставку целевого гена на фигурах не показано). Подготовку контрольного вектора VTvaf17 для трансфекции проводили как описано в Примере 12.

Суммарную РНК из трансфицированных клеток выделяли как описано в Примере 12. Для определения уровня экспрессии мРНК гена PROK2 после трансфекции использовали метод ПЦР в режиме реального времени (SYBR GreenRealTimePCR). Для амплификации кДНК, специфичной для гена PROK2 человека, использовали олигонуклеотиды

Длина продукта амплификации - 174 п.н. В качестве референтного гена использовали ген бета-2-микроглобулина В2М.

ПЦР-амплификацию проводили как описано в Примере 12 при следующих условиях: 1 цикл обратной транскрипции при 42°С 30 минут, денатурация 98°С - 15 мин, затем 40 циклов, включающих денатурацию 94°С - 15 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек и элонгацию 72°С - 120 сек. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности кДНК генов PROK2 и В2М. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов PROK2 и В2М, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1.

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена PROK2 в культуре клеток эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 после трансфекции данных клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- PROK2 на фиг. 12 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, из которых следует, что в результате трансфекции первичной культуры клеток эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PROK2, уровень специфической мРНК гена PROK2 человека вырос многократно. Это свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- PROK2. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK2 для повышения уровня экспрессии гена PROK2 в эукариотических клетках.

Пример 23.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG, несущего целевой ген, а именно, ген ANG и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANG, несущего целевой ген, а именно, ген ANG и реализуемости способа его использования оценивалиизменение количества белка ангиогенина в культуральной среде фибробластов кожи человека HDFa (ATCCPCS-201-012) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ANG, несущим ген ANG человека, как описано в Примере 12.

Для оценки изменения количества белка ангиогенина, использовали клетки первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (ATCCPCS-201-012), которые выращивали по примеру 12.

После трансфекции к 0,5 мл культуральной жидкости приливали 0,1 мл 1NHCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Затем нейтрализовали смесь, добавляя 0,1 мл 1.2N NaOH/0.5M HEPES (рН 7-7,6) и тщательно перемешивали. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка.

Количественное определение продукта кДНК гена ANG проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США) согласно методике производителя http://www.abcam.com/ps/products/99/ab99970/documents/ab99970_Angiogenin%20(ANG)%20Human%20ELISA_Kit%20v3%20(website).pdf Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка ANG в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка ANG, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Статистическую обработку полученных результатов, осуществляли с помощью программного обеспечения для статистической обработки и визуализации данных R, версия 3.0.2 (https://www.r-project.org/).

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 13, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры фибробластов кожи человека HDFa (ATCCPCS-201-012) генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANG, несущим ген ANG, приводит к увеличению количества белка ангиогенина по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ANG науровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG для повышения уровня экспрессии ANG в эукариотических клетках.

Пример 24.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANGPT1, несущего целевой ген, а именно, ген ANGPT1 и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- ANGPT1, несущего целевой ген, а именно, ген ANGPT1 и реализуемости способа его использования оценивалиизменение количества белка ангиопоэтина 1 в культуральной среде фибробластов кожи человека НТ 297.Т (АТСС® CRL-7782™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- ANGPT1, несущим ген ANGPT1 человека, как описано в Примере 13.

Для оценки изменения количества белка ангиопоэтина 1, использовали клетки фибробластов кожи человека НТ 297.Т, которые выращивали по примеру 13.

Количественное определение продукта кДНК гена ANGPT1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ANGPT1 Human ELISA Kit (Abeam, США) согласно методике производителя https://www.abcam.com/ps/products/99/ab99972/documents/ab99972 А nqiopoietin%201%20(ANG1)%20Human%20ELISA_Kit%20v%204%20(website).pdf.

Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка ANGPT1 в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка ANGPT1, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 14, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры фибробластов кожи человека НТ 297.Т генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1, несущим ген ANGPT1, приводит к увеличению количества белка ангиопоэтинапо сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANGPT1 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген ANGPT1 науровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANGPT1 для повышения уровня экспрессии ANGPT1 в эукариотических клетках.

Пример 25.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- VEGFA, несущего целевой ген, а именно, ген VEGFA и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка фактора роста эндотелия сосудов в культуральной среде клеток первичной культуры фибробластов крайней плоти Hs27 (АТСС® CRL-1634™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- VEGFA, несущим ген VEGFA человека, как описано в Примере 14.

Для оценки изменения количества белка фактора роста эндотелия сосудов, использовали клетки первичной культуры фибробластов крайней плоти Hs27 (АТСС® CRL-1634™), которые выращивали по примеру 14.

Количественное определение продукта кДНК гена VEGFA проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор VEGFA Human ELISA Kit (Abeam, США) согласно методике производителя https://www.abcam.com/ps/products/119/ab19566/documents/ab119566%20-%20VEGFA%20Human%20ELISA%20Kit%20v5%20(website).pdf. Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (AwarenessTechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка VEGFA в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка VEGFA, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 15, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры фибробластов крайней плоти Hs27 генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-VEGFA, несущим ген VEGFA, приводит к увеличению количества белка фактора роста эндотелия сосудов по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген VEGFA на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA для повышения уровня экспрессии VEGFA в эукариотических клетках.

Пример 26.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- FGF1, несущего целевой ген, а именно, ген FGF1 и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- FGF1, несущего целевой ген, а именно, ген FGF1 и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка фактора роста фибробластов 1 в культуральной среде клеток первичной культуры скелетных миобластов HSkM человека (А12555, Thermo Fisher Scientific) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- FGF1, несущим ген FGF1 человека, как описано в Примере 15.

Для оценки изменения количества белка фактора роста фибробластов 1, использовали клетки скелетных миобластов HSkM человека (А12555, Thermo Fisher Scientific),которые выращивали по примеру 15.

Количественное определение продукта кДНК гена FGF1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор FGF1 Human ELISA Kit (Abeam, США) согласно методике производителя https://www.abcam.com/ps/products/219/ab219636/documents/ab219636_Hu%20FGF1_31%20Mar%202017%20(website).pdf. Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNologylnc, США) и пропорциональна концентрации белка FGF1 в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка FGF1, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 16, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры скелетных миобластов HSkM человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-FGF1, несущим ген FGF1, приводит к увеличению количества белка фактора роста фибробластов 1 по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-FGF1 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген FGF1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-FGF1 для повышения уровня экспрессии FGF1 в эукариотических клетках.

Пример 27.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HIF1α, несущего целевой ген, а именно, ген HIF1α и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HIF1α, несущего целевой ген, а именно, ген HIF1α и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка гипоксией индуцированного фактора альфа в культуральной среде клеток первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека (АТСС® PCS-420-012™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- HIF1a, несущим ген HIF1α человека, как описано в Примере 16.

Для оценки изменения количества белка гипоксией индуцированного фактора альфа, использовали клетки первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека, которые выращивали по примеру 16.

Количественное определение продукта кДНК гена HIF1α проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human HIF1alpha ELISA Kit (Abcam, США) согласно методике производителя https://www.abcam.com/ps/products/171/ab171577/documents/ab171577_HIF1a_20180116_ACW%20(website).pdf.

Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка HIF1α в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка HIF1α, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 17, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры гладкомышечных клеток мочевого пузыря HBdSMc человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17- HIF1α, несущим ген HIF1α, приводит к увеличению количества белка гипоксией индуцированного фактораальфа по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HIF1α и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HIF1α на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HIF1α для повышения уровня экспрессии HIF1α в эукариотических клетках.

Пример 28.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HGF, несущего целевой ген, а именно, ген HGF и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17- HGF, несущего целевой ген, а именно, ген HGF и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка фактора роста гепатоцитов в культуральной среде гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC (АТСС® CRL-1999™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17- HGF, несущим ген HGF человека, как описано в Примере 17.

Для оценки изменения количества белка фактора роста гепатоцитов, использовали клетки первичной культуры гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC, которые выращивали по примеру 17.

Количественное определение продукта кДНК гена HGF проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human HGF ELISA Kit (Abeam, США) согласно методике производителя https://www.abcam.com/ps/products/100/ab100534/documents/ab100534%20HGF%20Human%20ELISA_Kit%20v3%20(website).pdf.

Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка HGF в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка HGF, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 18, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры гладкомышечных клеток аорты T/G HA-VSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF, несущим ген HGF, приводит к увеличению количества белка фактора роста гепатоцитов по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HGF и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HGF на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HGF для повышения уровня экспрессии HGF в эукариотических клетках.

Пример 29.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1, несущего целевой ген, а именно, ген SDF1 и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1, несущего целевой ген, а именно, ген SDF1 и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка фактора стромальных клеток 1 в культуральной среде клеток первичной культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa (АТСС® PCS-200-011™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-SDF1, несущим ген SDF1 человека, как описано в Примере 18.

Для оценки изменения количества белка фактора стромальных клеток 1, использовали клетки первичной культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa, которые выращивали по примеру 18.

Количественное определение продукта кДНК гена SDF1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human SDF1 ELISA Kit (Abcam, США) согласно методике производителя https://www.abcam.com/ps/products/100/ab100637/documents/ab100637%20SDF1%20alpha%20Human%20ELISA_Kit%20v4%20(website).pdf.

Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка SDF1 в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка SDF1, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 19, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры кератиноцитов эпидермиса HEKa генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-SDF1, несущим ген SDF1, приводит к увеличению количества белка фактора стромальных клеток 1 по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген SDF1 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1 для повышения уровня экспрессии SDF1 в эукариотических клетках.

Пример 30.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-KLK4, несущего целевой ген, а именно, ген KLK4 и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-KLK4, несущего целевой ген, а именно, ген KLK4 и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка калликреина в культуральной среде клеток первичной культуры эндотелия пупочной вены HUVEC (АТСС® PCS-100-010™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-KLK4, несущим ген KLK4 человека, как описано в Примере 19.

Для оценки изменения количества белка калликреина, использовали клетки первичной культуры эндотелия пупочной вены HUVEC, которые выращивали по примеру 19.

Количественное определение продукта кДНК гена KLK4 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human kallikrein-related peptidase 4 (KLK4) ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя https://www.mybiosource.com/prods/ELISA-Kit/Human/kallikrein-related-peptidase-4/KLK4/datasheet.php?products_id=917102.

Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка KLK4 в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка KLK4, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 20, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры эндотелия пупочной вены HUVEC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-KLK4, несущим ген KLK4, приводит к увеличению количества белка калликреина по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-KLK4 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген KLK4 науровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-KLK4 для повышения уровня экспрессии KLK4 в эукариотических клетках.

Пример 31.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC, несущего целевой ген, а именно, ген PDFGC и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDFGC, несущего целевой ген, а именно, ген PDGFC и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка фактора роста тромбоцитов С в культуральной среде клеток первичной культуры меланоцитов эпидермиса НЕМа (АТСС® PCS-200-013™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-PDGFC, несущим ген PDFGC человека, как описано в Примере 20.

Для оценки изменения количества белка фактора роста тромбоцитов С, использовали клетки первичной культуры меланоцитов эпидермиса НЕМа (АТСС® PCS-200-013™), которые выращивали по примеру 20.

Количественное определение продукта кДНК гена PDGFC проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human PDGFC ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя https://www.mybiosource.com/prods/ELISA-Kit/Human/PDGFC/datasheet.php?products_id=2501938.

Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка PDGFC, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 21, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры меланоцитов эпидермиса НЕМа (АТСС® PCS-200-013™) генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PDGFC, несущим ген PDGFC, приводит к увеличению количества белка фактора роста тромбоцитов С по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген PDGFC на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC для повышения уровня экспрессии PDGFC в эукариотических клетках.

Пример 32.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK1, несущего целевой ген, а именно, ген PROK1 и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK1, несущего целевой ген, а именно, ген PROK1, и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка прокинетицина-1 в культуральной среде клеток первичной культуры скелетных миобластов HSkM человека (А12555, Thermo Fisher Scientific) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-PROK1, несущим ген PROK1 человека, как описано в Примере 21.

Для оценки изменения количества белка прокинетицина-1, использовали клетки скелетных миобластов HSkM человека (А12555, Thermo Fisher Scientific), которые выращивали по примеру 21.

Количественное определение продукта кДНК гена PROK1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор PROK1 elisa kit: Human EG-VEGF ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя https://www.mybiosource.com/images/tds/protocol_manuals/000000-799999/MBS175861.pdf Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка PROK1 в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка PROK1, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 22, из которой следует, что трансфекция клеток первичной культуры скелетных миобластов HSkM человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PROK1, несущим ген PROK1, приводит к увеличению количества белка прокинетицина-1 по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK1 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген PROK1 науровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK1 для повышения уровня экспрессии PROK1 в эукариотических клетках.

Пример 33.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK2, несущего целевой ген, а именно, ген PROK2 и реализуемости способа его использования.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK2, несущего целевой ген, а именно, ген PROK2, и реализуемости способа его использования оценивали изменение количества белка прокинетицина-2 в культуральной среде клеток эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 (АТСС® CRL-3243™) после трансфекции этих клеток ДНК-вектором VTvaf17-PROK2, несущим ген PROK2 человека, как описано в Примере 22.

Для оценки изменения количества белка прокинетицина-2, использовали первичную культуру клеток эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 (АТСС® CRL-3243™), которые выращивали по примеру 22.

Количественное определение продукта кДНК гена PROK2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор Human Prokineticin-2, PROK2 ELISA Kit (MyBioSource, США) согласно методике производителя https://www.mybiosource.com/images/tds/protocol_manuals/800000-9999999/MBS940962.pdf Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness TechNology Inc., США) и пропорциональна концентрации белка PROK2 в пробе. Численное значение концентрации определяется с помощью калибровочной кривой, построенной по калибраторам с известной концентрацией белка PROK2, входящим в состав набора. Разница между значениями оптической плотности (ОП) калибраторов поставленных в трех повторностях не превышала 10%.

Диаграмма, полученная в результате анализа представлена на фиг. 23, из которой следует, что трансфекция клеток эндотелия капилляров кожи НМЕС-1 (АТСС® CRL-3243™) человека генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-PROK2, несущим ген PROK2, приводит к увеличению количества белка прокинетицина-2 по сравнению с контрольными образцами, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK2 и подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген PROK2 на уровне белка. Представленные результаты также подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK2 для повышения уровня экспрессии PROK2 в эукариотических клетках.

Пример 34.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG, несущего ген ANG, для повышения экспрессии белка ANG в органах человека.

С целью анализа изменения количества белка ангиогенина трем пациентам вводили в кожу предплечья генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANG, несущий ген ANG и параллельно вводили плацебо, представляющее собой генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, не содержащий ген ANG.

Пациент 1, мужчина 64 лет, (П1); пациент 2, женщина 66 лет, (П2); пациент 3, мужчина, 62 года, (П3). В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANG, который содержит ген ANG и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI готовили в соответствии с рекомендациями производителя.

Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтический ДНК вектор VTvaf17-ANG вводили в количестве 1 мг для каждой генетической конструкции тоннельным методом иглой 30G на глубину 3 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) и генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-ANG - 0,3 мл для каждой генетической конструкции. Очаги введения каждой генетической конструкции располагались на участке предплечья на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 2-е сутки после введения генетических конструкций генотерапевтических ДНК-векторов. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациентов в зоне введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-ANG, несущего ген ANG (I), генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо) (II), а также из интактных участков кожи (III), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия). Кожу пациентов в зоне отбора биоптата предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Размер биопсийного образца составлял около 10 куб. мм, масса - около 11 мг. Образец помещали в буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl pH 7.6, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, и гомогенизировали до получения однородной суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 14000g. Отбирали супернатант и использовали его для количественного определения целевого белка ангиогенина методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя набор ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 23 с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка ангиогенина, входящим в состав набора. Диаграммы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 24.

Из фигуры 24 следует, что в коже всех трех пациентов в области введения генотерапевтического ДНК вектора VTvaf17-ANG, несущего целевой ген ANG человека, произошло увеличение количества белка ангиогенина в сравнении с количеством белкаангиогенина в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 (плацебо), не содержащего ген ANG человека, что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при введении генотерапевтического ДНК-вектора в органы человека.

Пример 35.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANGPT1, несущего ген ANGPT1 и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка ангиопоэтина в органах человека путем введения аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANGPT1, несущего ген ANGPT1 и реализуемости способа его применения оценивали изменения количества белка ангиопоэтина в коже человека при введении в кожу пациента культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1.

Пациенту вводили в кожу предплечья соответствующую культуру аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1, несущим ген ANGPT1, и параллельно вводили плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген ANGPT1.

Первичную культуру фибробластов человека выделяли из биоптатов кожи пациента. Используя устройство для взятия биопсии кожи Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) брали образец биоптата кожи из зоны, защищенной от действия ультрафиолета, а именно за ушной раковиной или с боковой внутренней поверхности в зоне локтевого сустава, размером около 10 кв. мм, массой - около 11 мг. Кожу пациента предварительно промывали стерильным физиологическим раствором и анестезировали раствором лидокаина. Культивирование первичной культуры клеток осуществляли при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2 в среде DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и ампициллином 100 Ед/мл. Пересев культуры и смену культуральной среды осуществляли каждые 2 дня. Общая продолжительность роста культуры не превышала 25-30 дней. Из культуры клеток отбирали аликвоту, содержащую 5×104 клеток. Культуру фибробластов пациента трансфицировали генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1, несущим ген ANGPT1 или плацебо - вектор VTvaf17, не несущий целевой ген ANGPT1.

Трансфекцию осуществляли с помощью катионного полимера полиэтиленимина JETPEI (Polyplus transfection, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя. Клетки культивировали 72 часа и затем вводили пациенту. Введение пациенту культуры аутологичных фибробластов этого пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1, и плацебо, представляющее собой культуру аутологичных фибробластов пациента, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, осуществляли туннельным методом в область предплечья иглой 30G длиной 13 мм на глубину около 3 мм. Концентрация модифицированных аутологичных фибробластов в вводимой суспензии составляла примерно 5 млн клеток на 1 мл суспензии, количество вводимых клеток не превышало 15 млн. Очаги введения культуры аутологичных фибробластов располагались на расстоянии 8-10 см друг от друга.

Биопсийные образцы отбирали на 4-е сутки после введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1, несущим целевой ген, а именно, ген ANGPT1 и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков кожи пациента в зоне введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1, несущим целевой ген ANGPT1 (С), культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим целевой ген ANGPT1 (плацебо) (В), а также из участков интактной кожи (А), используя устройство для взятия биопсии Epitheasy 3.5 (Medax SRL, Италия) и далее проводили манипуляции с полученными образцами по примеру 34.

Количество белка ангиопоэтина оценивали в супернатантах биоптатов кожи пациентов методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор ANGPT1 Human ELISA Kit (Abcam, США) согласно методике производителя (см. Пример 24) с детекцией оптической плотности при длине волны 450 нм при помощи автоматического биохимического и иммуноферментного анализатора ChemWell (Awareness Technology Inc., США).

Численное значение концентрации определяли с помощью калибровочной кривой, построенной по стандартным образцам с известной концентрацией белка ангиопоэтина, входящим в состав набора. Диаграммы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 25.

Из фигуры 25 следует, что в коже пациента в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1, несущим ген ANGPT1, произошло увеличение количества белка ангиопоэтина в сравнении с количеством того же белка в области введения культуры аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген ANGPT1 (плацебо), что свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANGPT1 и подтверждает реализуемость способа его применения для повышения уровня экспрессии ANGPT1 в органах человека, в частности при введении в кожу аутологичных фибробластов, трансфицированных генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANGPT1.

Пример 36.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1, несущего ген SDF1, для повышения экспрессии белка фактора стромальных клеток в тканях человека.

С целью анализа уровня экспрессии целевого гена SDF1 пациенту вводили генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-SDF1 и параллельно вводили плацебо, представляющее собой векторную плазмиду VTvaf17 не содержащую кДНК гена SDF1 - в мышечную ткань в зоне предплечья.

В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-SDF1, который содержит ген SDF1 и генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, используемый в качестве плацебо, растворяли в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Комплексы ДНК-cGMP grade in-vivo-jetPEI готовили в соответствии с рекомендациями производителя.

Полученные комплексы использовали для введения пациенту. Введение осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 15-20 мм. Объем вводимого раствора генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1 и плацебо - около 0,5 мл для каждого. Очаги введения ДНК-вектора и плацебо располагались на расстоянии 5-7 см друг от друга.

Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения генно-терапевтической субстанции. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани в зоне введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1 (П1I), а также из интактных участков мышцы (П1III) и в зоне введения плацебо (П1II), используя автоматическое устройство для взятия биопсии MAGNUM (компания BARD, USA), далее проводили манипуляции с полученными образцами по примеру 34.

Количественную оценку белка фактора стромальных клеток проводили в лизатах биоптатов мышечной ткани пациента методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА ELISA), используя набор Human SDF1 ELISA Kit (Abeam, США), как описано в Примере 29.

Диаграммы, полученные в результате анализа, представлены на фиг. 26.

Показано, что, в мышечной ткани пациента в области введения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1 с кДНК гена SDF1, произошло увеличение соответствующего белка фактора стромальных клеток. Тогда как при введении плацебо количество белка фактора стромальных клеток в мышечной ткани не изменялась, что подтверждает увеличение экспрессии гена SDF1 при использовании генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1. Это также свидетельствует об эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-SDF1 и подтверждает реализуемость способа его применения, в частности при введении генотерапевтического ДНК-вектора в ткани человека.

Пример 37.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG, несущего целевой ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-FGF1, несущего целевой ген FGF1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK1, несущего целевой ген PROK1 для повышения уровня экспрессии белков ANG, VEGFA, FGF1PROK1 в органах\тканях млекопитающих.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG, несущего целевой ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-VEGFA, несущего целевой ген VEGFA, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-FGF1, несущего целевой ген FGF1, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK1, несущего целевой ген PROK1 и реализуемости способа сочетанного применения данных векторов оценивали изменение количества белков : белка ангиогенина, белка фактора роста эндотелия сосудов А, белка фактора роста фибробластов 1, прокинетицина-1 соответственно в зонах внутрикожных инъекций крысыВистар (самцы, в возрасте 22-24 недель).

Была приготовлена смесь генотерапевтических ДНК-векторовв соотношении 1:1:1:1 (по массе) из лиофилизата ДНК-векторов VTvaf17-ANG, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17-FGF1, VTvaf17-PROK1 путем растворения в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Комплексы ДНК-cGMP grade in-vivo-jetPEI готовили в соответствии с рекомендациями производителя.

Было сформировано 3 группы животных по 11 особей в каждой. Всем животным под анестезией были сделаны внутрикожные инъекции:

в 1-й группе (KI) смесью генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17-ANG, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17-FGF1, VTvaf17-PROK1 в объеме 150 мкл. (концентрация каждого генотерапевтического ДНК-вектора 1 мкг/мкл),

во 2-й группе (KII) - раствором ДНК-вектора VTvaf17 в объеме 150 мкл, с концентрацией ДНК-вектора 1 мкг/мкл, (плацебо),

в 3-й группе (KIII) - физраствором в объеме 150 мкл.

Биопсийные образцы отбирали через 72 часа после введения смеси генотерапевтических ДНК-векторов и плацебо. Взятие биопсии осуществлял и после некропсии животных из участков инъекций в зоне введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены ANG VEGFA, FGF1, PPOK1 (1-й группы), в зоне введения раствора ДНК-вектора VTvaf17 (2-й группы), в зоне введения физраствора (3-й группы).Масса каждого биопсийного образца составляла около 20 мг. Далее проводили манипуляции с полученными образцами по примеру 34.

Количественное определение продуктов генов ANG VEGFA, FGF1, PROK1 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя Наборы ANGHumanELISAKit (Abcam, США), VEGFAHumanELISAKit (Abcam, США), FGF1 HumanELISAKit (Abcam, США), PROK1 elisa kit: Human EG-VEGF ELISA Kit (MyBioSource, США). Подготовку тестируемых образцов, измерение и обработку результатов проводили как описано в Примерах 23, 25, 26, 32.

Диаграммы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 27, на которой показано, что в зоне инъекций в коже у животных в области введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-ANG, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17-FGF1, VTvaf17-PROK1 в 1-й группе животных произошло существенное увеличение количества белков: белка ангиогенина, белка фактора роста эндотелия сосудов А, белка фактора роста фибробластов 1, белка прокинетицина-1 в сравнении соответственно с количеством белков-белка ангиогенина, белка фактора роста эндотелия сосудов А, белка фактора роста фибробластов 1, белка прокинетицина-1 во 2-й и 3-й группе.

Приведенные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17-ANG, VTvaf17-VEGFA, VTvaf17-FGF1, VTvaf17-PROK1 и эффективность их использования для повышения уровня экспрессии белков-белка ангиогенина, белка фактора роста эндотелия сосудов А, белка фактора роста фибробластов 1, белка прокинетицина-1 в органах\тканях млекопитающих.

Пример 38.

Подтверждение эффективности и реализуемости способа сочетанного применения генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG, несущего целевой ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HIF1α, несущего целевой ген HIF1α, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC, несущего целевой ген PDGFC, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK2, несущего целевой ген PROK2 для повышения уровня экспрессии белков ANG, HIF1α, PDGFC, PROK2 в тканях человека.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG, несущего целевой ген ANG, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HIF1α, несущего целевой ген HIF1α, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PDGFC, несущего целевой ген PDGFC, генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-PROK2, несущего целевой ген PROK2 и реализуемости способа сочетанного применения данных векторов оценивали изменение количества белков: белка ангиогенина, белка гипоксией индуцированного фактора, белка фактора роста тромбоцитов С, белка прокинетицина-2 соответственно в мышечной ткани в зоне предплечья пациента.

Была приготовлена смесь генотерапевтических ДНК-векторов в соотношении 1:1:1:1 (по массе) из лиофилизата ДНК-векторов VTvaf17-ANG, VTvaf17-HIF1α, VTvaf17-PDGFC, VTvaf17-PROK2 путем растворения в стерильной воде степени очистки Nuclease-Free. Концентрация ДНК-векторов в смеси составляла 1 мг/мл. В качестве транспортной системы использовали полиэтиленимин Transfection reagent cGMP grade in-vivo-jetPEI (Polyplus Transfection, Франция). Комплексы ДНК- cGMP grade in-vivo-jetPEI готовили в соответствии с рекомендациями производителя. Раствор генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 в концентрации 1 мг/мл был использован в качестве плацебо.

Полученную смесь ДНК векторов VTvaf17-ANG, VTvaf17-HIF1α, VTvaf17-PDGFC, VTvaf17-PROK2 и плацебо использовали для введения пациенту, которое осуществляли тоннельным методом иглой 30G на глубину 15-20 мм. Объем вводимого раствора смеси ДНК-векторов и плацебо - около 0,6 мл для каждого. Очаги введения смеси ДНК-векторов и плацебо располагались на расстоянии 7-8 см друг от друга.

Биопсийные образцы брали на 3 сутки после введения смеси ДНК-векторов и плацебо. Взятие биопсии осуществляли из участков мышечной ткани в зоне введения смеси ДНК векторов VTvaf17-ANG, VTvaf17-HIF1α, VTvaf17-PDGFC, VTvaf17-PROK2 (П1I), a также из интактных участков мышцы (П1III) и в зоне введения плацебо (П1II), используя автоматическое устройство для взятия биопсии MAGNUM (компания BARD, USA), далее проводили манипуляции с полученными образцами по примеру 34.

Количественное определение продуктов генов ANG, HIF1α, PDGFC, PROK2 проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), используя наборы ANG Human ELISA Kit (Abeam, США), Human HIF1 alpha ELISA Kit (Abcam, США), Human PDGFC ELISA Kit (MyBioSource, США), Human Prokineticin-2, PROK2 ELISA Kit (MyBioSource, США). Измерение и обработку результатов проводили как описано в Примерах 23, 27, 31, 33.

Диаграммы, полученные в результате анализа представлены на фиг. 28, на которой показано, что в зоне инъекции в области введения смеси четырех генотерапевтических ДНК-векторов: VTvaf17-ANG, VTvaf17-HIF1α, VTvaf17-PDGFC, VTvaf17-PROK2 в произошло существенное увеличение количества белков: белка ангиогенина, белка гипоксией индуцированного фактора, белка фактора роста тромбоцитов С, белка прокинетицина-2 в сравнении соответственно с количеством данных белков в зоне инъекции в области введения плацебо ДНК-вектора VTvaf17.

Приведенные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтических ДНК-векторов VTvaf17-ANG, VTvaf17-HIF1α, VTvaf17-PDGFC, VTvaf17-PROK2 и эффективность их использования для повышения уровня экспрессии белков - белка ангиогенина, белка гипоксией индуцированного фактора, белка фактора роста тромбоцитов С, белка прокинетицина-2 в тканях человека.

Пример 39.

Подтверждение эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HGF, несущего ген HGF и реализуемости способа его применения для повышения уровня экспрессии белка HGF в клетках млекопитающих.

Для подтверждения эффективности генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-HGF, несущего ген HGF оценивали изменение накопления мРНК целевого гена HGF в клетках в клетках гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC (Genlantis) через 48 часов после их трансфекции генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF, несущим ген HGF человека по сравнению с контрольными клетками BEND, трансфицированными генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген HGF человека (плацебо).

Культуру клеток гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC (Genlantis) выращивали в среде Bovine Smooth Muscle Cell Growth Mediumm (Sigma B311F-500) с добавлением сыворотки рогатого скота до 10% (Панэко, Россия). Трансфекцию генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF, несущим ген HGF человека и ДНК-вектором VTvaf17, не несущим ген HGF человека (контроль), выделение РНК, реакцию обратной транскрипции, ПЦР амплификацию и анализ данных проводили как описано в примере 17. В качестве референтного гена использовали ген актина быка/ коровы (ACT), приведенного в базе данных GenBank под номером АН001130.2. В качестве положительного контроля использовали ампликоны, получаемых при ПЦР на матрицах, представляющих собой плазмиды в известных концентрациях, содержащие последовательности генов HGF и ACT. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Количество ПЦР продуктов - кДНК генов HGF и ACT, полученных в результате амплификации, оценивали в режиме реального времени с помощью программного обеспечения амплификатора Bio-RadCFXManager 2.1. (Bio-Rad, USA).

Графики, полученные в результате анализа представлены на фиг. 29.

Из фигуры 29 следует, что в результате трансфекции клеток гладкой мускулатуры аорты быка BAOSMC генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF, уровень специфической мРНК гена HGF человека вырос многократно, что подтверждает способность вектора проникать в эукариотические клетки и экспрессировать ген HGF на уровне мРНК. Представленные результаты подтверждают реализуемость способа применения генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-HGF для повышения уровня экспрессии гена HGF в клетках млекопитающих.

Пример 40.

Штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANG или Escherichia coli SCS110-AFA/Tvaf17-ANGPT1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA или Escherichia coli SCS110-AFA/Tvaf17-FGF1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или Escherichia coli SCS110-AFA/Tvaf17-HGF или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SDF1, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-KLK4 или Escherichia coli SCS110-AFA/Tvaf17-PDGFC, или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK2 несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения.

Конструирование штамма для наработки в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген ANG, или ANGPT1, или VEGFA, или FGF1, или HIF1A, или HGF, или SDF1, или KLK4, или PDGFC или PROK1, или PROK2: а именно штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANG или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-VEGFA или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-FGF1, или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-HGF или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-SDF1, или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-KLK4 или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-PDGFC, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK2, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANG или VTvaf17-ANGPT1 или VTvaf17-VEGFA или VTvaf17-FGF1 или VTvaf17-HIF1α или VTvaf17-HGF или VTvaf17-SDF1, или VTvaf17-KLK4 или VTvaf17-PDGFC или VTvaf17-PROK1, или VTvaf17-PROK2 соответственно для его наработки с возможностью селекции без использования антибиотиков заключается в получении электрокомпетентных клеток штамма EscherichiacoliSCS110-AF с проведением электропорации этих клеток генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANG или VTvaf17-ANGPT1 или VTvaf17-VEGFA или VTvaf17-FGF1 или VTvaf17-HIF1α или VTvaf17-HGF или VTvaf17-SDF1, или VTvaf17-KLK4 или VTvaf17-PDGFC или VTvaf17-PROK1 или VTvaf17-PROK2, после чего клетки высеивали на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы, а также 10 мкг/мл хлорамфеникола. При этом штамм Escherichia coliSCS110-AF для наработки генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 или генотерапевтических ДНК-векторов на его основе с возможностью положительной селекции без использования антибиотиков получали путем конструирования линейного фрагмента ДНК, содержащего регуляторный элемент RNA-in транспозона Tn10 для селекции без применения антибиотиков размером 64 п.н., ген левансахаразы sacB, продукт которого обеспечивает селекцию на сахарозо-содержащей среде размером 1422 п.н., генустойчивости к хлорамфениколу catR, необходимый для отбора клонов штамма, в которых прошла гомологичная рекомбинация размером 763 п.н. и две гомологичные последовательности, обеспечивающие процесс гомологичной рекомбинации в области гена recA с одновременной его инактивацией размером 329 п.н. и 233 п.н., после чего проводили трансформацию клеток Escherichia coli путем электропорации и отбирали клоны, выжившие на среде, содержащей 10 мкг/мл хлорамфеникола. Полученные штаммы для наработки были внесены в коллекции Национального биоресурсного центра - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (НБЦ ВКПМ), РФ и NCIMB Patent Deposit Service, UK с присвоением регистрационных номеров: штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANG - регистрационный № ВКПМ В-13280, дата депонирования 16.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43297, дата депонирования 13.12.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 - регистрационный № ВКПМ B-13279, дата депонирования 16.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43300, дата депонирования 13.12.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA - регистрационный № ВКПМ B-13344, дата депонирования 22.11.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43289, дата депонирования 22.11.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-FGF1 - регистрационный № ВКПМ В-13338, дата депонирования 22.11.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43282, дата депонирования 22.11.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HIF1α - регистрационный № ВКПМ В-13383, дата депонирования 14.12.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43309, дата депонирования 13.12.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HGF - регистрационный № ВКПМ В-13260, дата депонирования 24.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43207, дата депонирования 20.09.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SDF1 - регистрационный № ВКПМ В-13342, дата депонирования 22.11.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43287, дата депонирования 22.11.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-KLK4 - регистрационный № ВКПМ B-13346, дата депонирования 22.11.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43283, дата депонирования 22.11.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PDGFC - регистрационный № ВКПМ B-13340, дата депонирования 22.11.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43286, дата депонирования 22.11.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK1 - регистрационный № ВКПМ B-13254, дата депонирования 24.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43209, дата депонирования 20.09.2018; штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK2-регистрационный № ВКПМ B-13261, дата депонирования 24.10.2018; INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY № NCIMB 43210 дата депонирования 20.09.2018.

Пример 41.

Способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROM, PROK2.

Для подтверждения технологичности получения и возможности производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG (SEQID №1), или VTvaf17-ANGPT1 (SEQID №2), или VTvaf17-VEGFA (SEQID №3), или VTvaf17-FGF1(SEQID №4), или VTvaf17-HIF1α (SEQ ID №5), или VTvaf17-HGF (SEQ ID №6), или VTvaf17-SDF1 (SEQ ID №7), или VTvaf17-KLK4 (SEQ ID №8), или VTvaf17-PDGFC (SEQ ID №9), VTvaf17-PROK1 (SEQ ID №10), VTvaf17-PROK2 (SEQ ID №11), каждый из которых несет целевой ген, а именно, ANG или ANGPT1 или VEGFA или FGF1 или HIF1α или HGF или SDF1 или KLK4 или PDGFC или PROK1 или PROK2 проводили масштабную ферментацию штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANG или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-VEGFA или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-FGF1 или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-HGF или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-SDF1 или штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-KLK4 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PDGFC, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK2, каждый из которых содержит генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17, несущий целевой ген, а именно, ANG или ANGPT1 или VEGFA или FGF1 или HIF1α или HGF или SDF1 или KLK4 или PDGFC или PROK1 или PROK2. Штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANG или штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 или штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-VEGFA или штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-FGF1, или штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-HGF или штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-SDF1, или штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-KLK4 или штамм EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-PDGFC или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK1, или штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK2, получали на базе штамма EscherichiacoliSCS110-AF (CellandGeneTherapyLLC, PITLtd) no примеру 40 путем электропорации компетентных клеток этого штамма генотерапевтическим ДНК-вектором VTvaf17-ANG или VTvaf17-ANGPT1 или VTvaf17-VEGFA или VTvaf17-FGF1 или VTvaf17-HIF1α или VTvaf17-HGF или VTvaf17-SDF1 или VTvaf17-KLK4 или VTvaf17-PDGFC, или VTvaf17-PROK1, или VTvaf17-PROK2, несущим целевой ген, а именно, ANG или ANGPT1 или VEGFA или FGF1 или HIF1α или HGF или SDF1 или KLK4 или PDGFC, или PROK1, или PROK2, с последующим высевом трансформированных клеток на чашки Петри с агаризованной селективной средой, содержащей дрожжевой экстракт, пептон, 6% сахарозы и отбором отдельных клонов.

Ферментацию полученного штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANG, несущего генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANG проводили в ферментере объемом 10 л с последующим выделением генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG.

Для ферментации штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANG готовили среду, содержащую на 10 л: 100 г триптон, 50 г дрожжевой экстракт (BectonDickinson), доводили водой до 8800 мл и автоклавировали при 121°С 20 мин, затем добавляли 1200 мл 50% (вес/объем) сахарозы. Далее засевали в колбу затравочную культуру штамма EscherichiacoliSCS110-AF/VTvaf17-ANG в объеме 100 мл. Инкубировали в шейкере-инкубаторе 16 ч при 30°С. Переносили затравочную культуру в ферментер TechforsS (InforsHT, Швейцария), растили до достижения стационарной фазы. Контроль осуществляли измерением оптической плотности культуры при длине волны 600 нм. Клетки осаждали центрифугированием 30 мин при 5000-10000 g. Супернатант удаляли, клеточную массу ресуспендировали в 10% по объему фосфатно-солевого буфера. Повторно центрифугировали 30 мин при 5000-10000g. Супернатант удаляли, к клеточной массе добавляли раствор 20 мМ TrisCl, 1 мМ ЭДТА, 200 г/л сахароза, pH 8,0 в объеме 1000 мл, тщательно перемешивали до образования гомогенной суспензии. Добавляли раствор яичного лизоцима до конечной концентрации 100 мкг/мл. Инкубировали 20 мин на льду при бережном перемешивании. Далее, добавляли 2500 мл раствора 0,2 М NaOH, 10 г/л додецилсульфат натрия, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании, затем добавляли 3500 мл раствора 3М ацетат натрия, 2М уксусная кислота, pH 5-5,5, инкубировали 10 мин на льду при бережном перемешивании. Полученный образец центрифугировали 20-30 мин при 15000 g или более. Раствор аккуратно декантировали, от остатков осадка избавлялись фильтрацией через грубый фильтр (фильтровальную бумагу). Добавляли РНКазу A (Sigma) до конечной концентрации 20 нг/мл, инкубировали ночь 16 ч при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 20-30 мин при 15000 g, затем фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм (Millipore). Далее проводили ультрафильтрацию через мембрану размером отсечения 100 кДа (Millipore) и разбавляли до начального объема буфером 25 мМ TrisCl, pH 7.0. Операцию повторяли три - четыре раза. Наносили раствор, на колонку с 250 мл сорбента DEAEsepharoseHP (GE, США), уравновешенную раствором 25 мМ TrisCl, pH 7.0. После нанесения образца колонку промывали тремя объемами этого же раствора, а затем проводили элюцию генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG линейным градиентом от раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0 до раствора 25 мМ TrisCl, pH 7.0, 1М NaCl в объеме пяти объемов колонки. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм. Хроматографические фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANG, объединяли и проводили гель-фильтрацию на сорбенте Superdex 200 (GE, США). Колонку уравновешивали фосфатно-солевым буфером. Контроль элюции осуществляли по оптической плотности сходящего раствора при 260 нм, фракции анализировали электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-ANG объединяли и хранили при -20°С. Для оценки воспроизводимости техпроцесса обозначенные технологические операции повторяли пятикратно. Все технологические операции для штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-FGF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SDF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-KLK4 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PDGFC или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK2, проводили аналогичным образом.

Воспроизводимость техпроцесса и количественные характеристики выхода конечного продукта подтверждают технологичность получения и возможность производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17-ANG или VTvaf17-ANGPT1 или VTvaf17-VEGFA или VTvaf17-FGF1 или VTvaf17-HIF1α или VTvaf17-HGF или VTvaf17-SDF1 или VTvaf17-KLK4 или VTvaf17-PDGFC или VTvaf17-PROK1, или VTvaf17-PROK2.

Таким образом, созданный генотерапевтический ДНК-вектор с целевым геном может быть использован для введения в клетки организма животных и человека, характеризующихся сниженной или недостаточной экспрессией данного гена, обеспечивая таким образом достижение терапевтического эффекта.

Задача, поставленная в данном изобретении, а именно: конструирование генотерапевтических ДНК-векторов, несущих целевые гены человека на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17 для лечения заболеваний, связанных с необходимостью повышения уровня экспрессии этих целевых генов оптимально сочетающего в себе:

II) длину, обеспечивающую эффективное проникновение в клетку-мишень;

IV) технологичность получения и возможность наработки в промышленных масштабах, а также задача по конструированию штаммов, несущих эти генотерапевтические ДНК-вектора для производствав промышленных масштабах этих генотерапевтических ДНК-векторов решена, что подтверждается примерами:

для п. I - пример 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33; 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41;

для п. II - пример пример 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33; 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41;

для п. III - пример пример 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33; 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41;

для п. IV - пример 40, 41.

Промышленная применимость:

Все представленные выше примеры подтверждают промышленную применимость предлагаемого генотерапевтического ДНК-вектора на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущего целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способа его получения и использования, штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANG или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-FGF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HGF или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SDF1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-KLK4 или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PDGFC, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK1, или штамма Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PROK2, несущего генотерапевтический ДНК-вектор, способа его получения, способа производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

Перечень сокращений

VTvaf17 - вектор генотерапевтический, не содержащий последовательностей вирусных геномов и маркеров антибиотико-резистентности (vectortherapeuticvirus-antibiotic-free)

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота,

РНК - рибонуклеиновая кислота,

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота,

п.н. - пар нуклеотидов,

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

RT-PCR - ПЦР в режиме реального времени,

мл - миллилитр, мкл - микролитр,

куб. мм - кубический миллиметр,

л - литр,

мкг - микрограмм,

мг - миллиграмм,

г - грамм,

мкМ - микромоль,

мМ - миллимоль,

мин - минута,

сек - секунда,

об/мин - обороты в минуту,

нм - нанометр,

см - сантиметр,

мВт - милливатт,

о.е. ф-относительная единица флуоресценции,

РВС - фосфатно-солевой буфер.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Селл энд Джин Терапи Лтд (CELL and GENE THERAPY Ltd), Общество с ограниченной ответственностью «Прорывные Инновационные Технологии»,

<120> Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген, выбранный из группы генов ANG, ANGPT1, VEGFA, FGF1, HIF1α, HGF, SDF1, KLK4, PDGFC, PROK1, PROK2 для повышения уровня экспрессии этих целевых генов, способ его получения и применения, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANG или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-ANGPT1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-VEGFA или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-FGF1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HIF1α или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-HGF или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-SDF1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-KLK4 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-PDGFC или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK1 или Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17- PROK2, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора.

<160> 11

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 3618

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 1

cgtgaggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaaa gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacaggtaa 240

gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct tgcgtgcctt 300

gaattacttc cacgcccctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 360

agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 420

gaggcctggc ttgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 480

ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 540

tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 600

tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 660

ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 720

ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 780

tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 840

aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 900

gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 960

cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 1020

tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 1080

ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 1140

cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgaaa actaccccta 1200

aaagccagga tccgatccga tatcgtcgac caccatggtg atgggcctgg gcgttttgtt 1260

gttggtcttc gtgctgggtc tgggtctgac cccaccgacc ctggctcagg ataactccag 1320

gtacacacac ttcctgaccc agcactatga tgccaaacca cagggccggg atgacagata 1380

ctgtgaaagc atcatgagga gacggggcct gacctcaccc tgcaaagaca tcaacacatt 1440

tattcatggc aacaagcgca gcatcaaggc catctgtgaa aacaagaatg gaaaccctca 1500

cagagaaaac ctaagaataa gcaagtcttc tttccaggtc accacttgca agctacatgg 1560

agggtccccc tggcctccat gccagtaccg agccacagcg gggttcagaa acgttgttgt 1620

tgcttgtgaa aatggcttac ctgtccactt ggatcagtca attttccgtc gtccgtaagg 1680

taccgaattc gaattccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 1740

actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 1800

gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg 1860

aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa 1920

tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc 1980

gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt tttttggtag 2040

agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac 2100

ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc 2160

cttacgcgta gaattggtaa agagagtcgt gtaaaatatc gagttcgcac atcttgttgt 2220

ctgattattg atttttggcg aaaccatttg atcatatgac aagatgtgta tctaccttaa 2280

cttaatgatt ttgataaaaa tcattaacta gtccatggct gcctcgcgcg tttcggtgat 2340

gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 2400

gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 2460

gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 2520

cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 2580

ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 2640

tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 2700

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 2760

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 2820

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 2880

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 2940

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 3000

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 3060

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 3120

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 3180

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 3240

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 3300

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 3360

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 3420

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 3480

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 3540

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 3600

ccatagttgc ctgactcc 3618

<210> 2

<211> 4660

<212> DNA

<213> Homo Sapiens

<400> 2