Иммуногенные композиции pcv2 и способы получения таких композиций - RU2007128943A

Реферат

1. Способ выделения рекомбинантного белка, экспрессированного с открытой рамки считывания 2 из PCV2, включающий стадии:

A) клонирования указанной рекомбинантной открытой рамки считывания 2 из PCV2 в вектор-переносчик;

B) трансфекции части указанного вектора-переносчика, содержащей указанную рекомбинантную открытую рамку считывания 2, в вирус;

C) инфекции клеток в среде указанным вирусом;

D) обеспечения экспрессии указанным вирусом белка с указанной открытой рамки считывания 2;

E) отделения клеток от указанного вектора в супернатанте; и

F) выделения указанного белка, экспрессированного с открытой рамки считывания 2, из указанного супернатанта.

2. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает стадию амплификации указанной открытой рамки считывания 2 из штамма PCV2 перед клонированием указанной открытой рамки считывания в указанный вектор-переносчик.

3. Способ по п.1, где указанная рекомбинантная открытая рамка считывания 2 дополнительно содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5'-последовательности Козака, 3'-участка EcoR1, и их сочетания.

4. Способ по п.3, где указанная 5'-последовательность Козака содержит SEQ ID NO: 1.

5. Способ по п.3, где указанный 3'-участок EcoR1 содержит SEQ ID NO: 2.

6. Способ по любому из пп.1-5, где указанная открытая рамка считывания PCV2 содержит SEQ ID NO: 4.

7. Способ по любому из пп.1-5, где указанный рекомбинантный белок содержит SEQ ED No: 6.

8. Способ по любому из пп.1-5, где указанная среда включает бессывороточную среду для клеток насекомых.

9. Способ по любому из пп.1-5, дополнительно включающий стадии:

i) клонирования перед стадией A указанной амплифицированной открытой рамки считывания 2 в первый вектор;

ii) вырезания указанной открытой рамки считывания 2 из указанного первого вектора; и

iii) применение указанной вырезанной открытой рамки считывания 2 на стадии A.

10. Способ по любому из пп.1-5, где указанные клетки включают клетки SF+.

11. Способ по любому из пп.1-5, где указанный вирус включает бакуловирус.

12. Способ по любому из пп.1-5, где указанная трансфицированная часть содержит SEQ ID NO: 4.

13. Способ по любому из пп.1-5, где указанный белок с открытой рамки считывания 2 выделяют из указанного супернатанта по меньшей мере через 5 суток после инфекции клеток указанным вирусом.

14. Способ получения композиции для вызывания иммунного ответа против PCV2, где указанный способ включает стадии:

i) трансфекции конструкции в вирус, где указанная конструкция содержит рекомбинантную ДНК из открытой рамки считывания 2 PCV2;

ii) инфекции клеток указанным трансфицированным вирусом, где указанные клетки находятся в культуральной среде;

iii) обеспечения экспрессии указанным вирусом рекомбинантного белка с указанной открытой рамки считывания 2;

iv) выделения указанного белка, экспрессированного с открытой рамки считывания 2, из супернатанта; и

v) объединения указанного выделенного белка с подходящим адъювантом или другим фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.

15. Способ по п.14, где указанный способ дополнительно включает стадию получения указанной конструкции из вектора-переносчика.

16. Способ по п.14, где указанный способ дополнительно включает стадию амплификации указанной открытой рамки считывания 2 из штамма PCV2 перед клонированием указанной открытой рамки считывания 2 в указанный вектор-переносчик.

17. Способ по п.14, где указанная рекомбинантная открытая рамка считывания 2 дополнительно содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5'-последовательности Козака, 3'-участка EcoR1, и их сочетаний.

18. Способ по п.17, где указанная 5'-последовательность Козака содержит SEQ ID NO: 1.

19. Способ по п.17, где указанный 3'-участок EcoR1 содержит SEQ ID NO: 2.

20. Способ по любому из пп.14-19, где указанная открытая рамка считывания 2 PCV2 содержит SEQ ID NO: 4.

21. Способ по любому из пп.14-19, где указанный рекомбинантный белок содержит SEQ ID NO: 6.

22. Способ по любому из пп.14-19, где указанная среда включает бессывороточную среду для клеток насекомых.

23. Способ по п.16, дополнительно включающий стадии:

i) клонирования указанной амплифицированной открытой рамки считывания 2 в первый вектор;

ii) вырезания указанной открытой рамки считывания 2 из указанного первого вектора; и

iii) применения указанной вырезанной открытой рамки считывания 2 для клонирования в указанный вектор-переносчик.

24. Способ по любому из пп.14-19 и 23, где указанные клетки включают клетки SF+.

25. Способ по любому из пп.14-19 и 23, где указанный вирус включает бакуловирус.

26. Способ по любому из пп.14-19 и 23, где указанная трансфицированная конструкция содержит SEQ ID NO: 4.

27. Способ по любому из пп.14-19 и 23, где указанный белок с открытой рамки считывания 2 выделяют по меньшей мере через 5 суток после инфекции указанных клеток указанным вирусом.

28. Способ по любому из пп.14-19 и 23, где указанная стадия выделения дополнительно включает стадию отделения указанной среды от указанных клеток и клеточного дебриса.

29. Способ по п.28, где указанная стадия отделения включает стадию фильтрации указанных клеток, клеточного дебриса и культуральной среды через фильтр с размером пор в диапазоне от приблизительно 0,45 мкм до приблизительно 1,0 мкм.

30. Способ по любому из пп.14-19 и 23, где указанный способ дополнительно включает стадию инактивации указанного вируса перед объединением указанного выделенного белка с подходящим адъювантом.

31. Способ выделения белка, экспрессированного с открытой рамки считывания 2 из PCV2, где указанный способ включает стадии

i) инфекции клеток в культуральной среде рекомбинантным вирусным вектором, содержащим указанную открытую рамку считывания 2;

ii) обеспечение экспрессии указанным вирусом указанного белка; и

iii) выделение указанного экспрессированного белка из супернатанта.

32. Способ по п.31, где указанное выделение проводят по меньшей мере через 5 суток после инфекции клеток указанным вирусным вектором.

33. Композиция, полученная способом по любому из пп.1-5, 14-19, 23, 31 или 32.

34. Применение композиции по п.33 в качестве лекарственного средства.

35. Применение композиции по п.33 для получения лекарственного средства для предупреждения инфекции PCV2.

36. Способ получения диагностического набора для детекции инфекции PCV2 в образце, включающий

i) получение рекомбинантного белка, как указано в любом из пп.1-5, 14-19 или 23;

ii) упаковки указанного рекомбинантного белка в подходящий контейнер.

37. Способ по п.36, дополнительно включающий стадию вложения инструкции в контейнер с упакованным рекомбинантным белком.

38. Иммуногенная композиция, эффективная для уменьшения тяжести клинических симптомов, связанных с инфекцией PCV2, содержащая белок ORF2 PCV2 или его иммуногенную часть, где указанная иммуногенная часть имеет по меньшей мере 10 непрерывных аминокислот из белка ORF2 PCV2.

39. Иммуногенная композиция по п.38, где указанный белок ORF2 PCV2 представляет собой

i) полипептид, содержащий последовательность из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11;

ii) любой полипептид, по меньшей мере на 80% гомологичный полипептиду из i),

iii) любую иммуногенную часть полипептидов из i) и/или ii),

iv) иммуногенную часть из iii), содержащую по меньшей мере десять непрерывных аминокислот, входящих в последовательности SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID No: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11,

v) полипептид, кодированный ДНК, содержащей последовательность из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4,

vi) любой полипептид, кодированный полинуклеотидом, по меньшей мере на 80% гомологичным полинуклеотиду из v),

vii) любую иммуногенную часть полипептидов, кодируемых полинуклеотидом из v) и/или vi),

viii) иммуногенную часть из vii), где полинуклеотид, кодирующий указанную иммуногенную часть, содержит по меньшей мере 30 непрерывных нуклеотидов, входящих в последовательности SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4.

40. Иммуногенная композиция по п.38, где указанная композиция дополнительно содержит инактивированный вирусный вектор и супернатант культуры клеток.

41. Иммуногенная композиция по п.40, где указанный инактивированный вирусный вектор представляет собой рекомбинантный бакуловирус, кодирующий белок ORF2 PCV2.

42. Иммуногенная композиция по п.38-41, где указанная композиция содержит BEI.

43. Иммуногенная композиция по п.42, где указанная композиция содержит тиосульфат натрия.

44. Иммуногенная композиция по любому из пп.38-41, где указанная композиция содержит дополнительный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из носителей, адъювантов, среды, инактиваторов вируса, разбавителей, изотонических средств, иммуномодулирующих веществ, антибиотиков и их сочетаний.

45. Иммуногенная композиция по п.44, где указанная композиция содержит адъювант, предпочтительно карбопол.

46. Иммуногенная композиция по п.38, где указанная композиция содержит фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно солевой раствор.

47. Иммуногенная композиция по любому из пп.38-41, где указанная композиция содержит по меньшей мере 0,2 мкг/мл белка ORF2 PCV2.

48. Иммуногенная композиция по любому из пп.38-41, где указанная композиция содержит по меньшей мере 2 мкг белка ORF2 PCV2.

49. Контейнер, содержащий по меньшей мере одну дозу иммуногенной композиции по п.38, где одна доза содержит по меньшей мере 2 мкг белка ORF2 PCV2.

50. Контейнер, содержащий 10-250 доз иммуногенной композиции по любому из п.п.38-41, где одна доза содержит по меньшей мере 2 мкг белка ORF2 PCV2.

51. Контейнер по п.49 или 50, дополнительно содержащий противомикробное активное средство.

52. Набор, содержащий контейнер по любому из пп.49 или 50 и инструкцию, содержащую информацию по внутримышечному применению по меньшей мере одной дозы иммуногенной композиции у поросят для уменьшения тяжести клинических симптомов, связанных с инфекцией PCV2.

53. Набор по п.52, где инструкция содержит информацию по второму или последующему введению(введениям) по меньшей мере одной дозы иммуногенной композиции, где второе введение или любое дополнительное введение проводят по меньшей мере через 14 суток после прошлого введения.