Эффективная вакцинация против европейских штаммов вируса репродуктивного и респираторного синдрома (prrs) до отлучения от матери - RU2755345C2

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представленное изобретение предусматривает вакцины, которые защищают свиней всех возрастов, как самцов, так и самок, от Европейских штаммов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS). Представленное изобретение, в частности, предусматривает безопасную и раннюю вакцинацию поросят до отлучения от матери, в том числе от непосредственно после рождения (то есть только в возрасте около 1 дня или меньше) до трехнедельного возраста, в любое время, необязательно, в комбинации с поливалентными комбинированными вакцинами для свиней, такими как двухвалентные против вакцины PRRSV/Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), двухвалентные вакцины против PRRSV/свиного цирковируса типа 2 (PCV2), и трехвалентные вакцины против PRRSV/M.hyo/PCV2, или просто в виде моновалентной вакцины против PRRSV, причем компонент вакцины PRRS, как правило, соответствует его генотипу (и подтипам указанного генотипа), признанным циркулирующим на Европейском континенте, и включает в себя как Западную Европу, Средиземноморские регионы, Скандинавские регионы, так и Восточную Европу, такие страны как Россия, Турция и Украина.

Настоящее изобретение в целом направлено на новые классы аттенуированных европейских штаммов PRRS, которые в модифицированной живой форме оба являются исключительно безопасными и эффективными, когда их вводят даже самым молодым животным в качестве вакцин, и обеспечивают очень большую продолжительность иммунитета.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS) характеризуется абортами, мертворождением и другими проблемами репродуктивной функции у свиноматок и молодых свиней (до первого опороса), а также респираторными заболеваниями у молодняка свиней. Возбудителем является PRRS вирус (PRRSV), представитель семейства Arteriviridae и отряда Nidovirales. Нидовирусы представляют собой оболочечные вирусы, имеющие геномы, состоящие из одной цепи РНК с положительной полярностью. Геномная РНК вируса с положительной цепью РНК выполняет двойную роль как в хранении, так и в экспрессии генетической информации. Никакая ДНК не участвует в репликации или транскрипции у нидовирусов. Неструктурные белки транслируются непосредственно из геномной РНК нидовирусов в виде крупных полипротеинов и впоследствии расщепляются вирусными протеазами на дискретные функциональные белки. 3’-котерминальный вложенный набор субгеномных РНК (сгРНК) синтезируется из генома и используется в качестве информационных РНК для трансляции структурных белков. Таким образом, размножение нидовирусной геномной РНК представляет собой комбинированный процесс репликации генома и синтеза сгРНК.

В конце 1980-х годов, два разных генотипа вируса появились почти одновременно, один в Северной Америке, а другой в Европе. Вирус PRRS в настоящее время является эндемическим заболеванием почти во всех странах-производителях свиней, и считается одним из наиболее экономически важных заболеваний, влияющих на мировую индустрию свинины. Кроме того, высоковирулентные генотипы были выделены в Китае и соседних странах, и такие генотипы, как правило, тесно связаны с генотипами Северной Америки.

Несмотря на значительные успехи в понимании биологии PRRSV, борьба с вирусом остается сложной. Вакцинация животных в полевых условиях оказалась в значительной степени неэффективной. PRRS обычно вновь появляется в иммунизированных стадах, и большинство кампаний вакцинации против PRRSV на ферме в конечном итоге не в состоянии контролировать заболевание.

Не ограничиваясь теорией, инфицирование свиней немутантного типа PRRSV или их вакцинация живой аттенуированной формой этого патогена, к сожалению, вызывает только избыточную выработку не нейтрализующих антител. Например, в течение этого интервала времени генерируются только ограниченные количества клеток, секретирующих интерферон (IFN)-γ. Таким образом, PRRSV, по-видимому, по своей природе стимулирует несбалансированный иммунный ответ, отличающийся последовательно обильным гуморальным (на основе антител) иммунитетом, а также вариабельным и ограниченным, но потенциально защитным T-хелперным (Th) 1-подобным IFN-γ ответом. Одной из характеристик инфекции PRRSV, которая, скорее всего, способствует несбалансированному развитию адаптивного иммунитета, является отсутствие адекватного врожденного иммунного ответа. Обычно инфицированные вирусом клетки секретируют интерферон I типа «IFN» (включая IFN-α и IFN-β), который защищает соседние клетки от инфекции. Кроме того, высвобожденный IFN типа I взаимодействует с поднабором наивных Т-клеток, чтобы способствовать их превращению в вирус-специфические клетки, секретирующие IFN типа II (IFN-γ). Напротив, IFN-α реакция свиней на воздействие PRRSV практически отсутствует. Такое неэффективное стимулирование продуцирования IFN-α патогеном, как могло бы ожидаться, оказывает значительное влияние на характер адаптивного иммунного ответа хозяина, поскольку IFN-α активирует экспрессию гена IFN-γ. Соответственно, первый цитокин, вероятно, контролирует доминантный путь, который способствует развитию адаптивного иммунитета, а именно, опосредованные Т-клетками ответы IFN-β и пик антивирусной иммунной защиты.

В связи с этим стало очевидным, что вероятная связь между врожденным и адаптивным иммунитетом при вирусных инфекциях происходит через особый тип дендритных клеток, который обладает способностью продуцировать большие количества интерферона типа I, и играет критическую роль в поляризации функции Т-клеток. В частности, нечастый, но примечательный тип дендритных клеток, плазмоцитоидные дендритные клетки (PDC), также известные как естественные клетки, продуцирующие IFN-α/β, играют критическую роль в противовирусном иммунитете за счет их способности провоцировать наивные Т-клетки дифференцироваться в клетки, секретирующие IFN-γ. Несмотря на редкость, PDC являются чрезвычайно мощными продуцентами IFN-α, причем каждая клетка способна продуцировать 3-10 пг IFN-α в ответ на вирус. Напротив, моноциты продуцируют в 5-10 раз меньше IFN-α в пересчете на клетку. Фенотип и некоторые биологические свойства свиного PDC были описаны (Summerfield et al., 2003, Immunology 110:440). Недавние исследования определили, что PRRSV не стимулирует свиные PDC секретировать IFN-α (Calzada et al., 2010, Veterinary Immunology and Immunopathology 135:20).

Этот факт в сочетании с наблюдением, что экзогенно добавленный IFN-α во время вакцинации, как было обнаружено, улучшает интенсивность PRRSV-специфического IFN-γ ответа (W.A. Meier et al., Vet. Immunol. Immunopath. 102, pp 299-314, 2004), подчеркивает важнейшую роль, которую IFN-α играет при инфицировании свиней данным вирусом. Учитывая очевидную критическую роль IFN-α в развитии защитного иммунитета, важно определить способность различных запасов вируса PRRS стимулировать и/или ингибировать продуцирование IFN-α. Соответственно, существует острая необходимость в новых и улучшенных модифицированных живых вакцинах для защиты против PRRS.

Европейский PRRS обычно обозначаются как «тип 1», чтобы отличать его от отдаленно связанных североамериканского или PRRS «типа 2», и данные два типа являются идентичными только приблизительно на 60% по общему нуклеотидному уровню. Первый четко определенный изолят европейского PRRSV был раскрыт Wensvoort et al., как агент Лелистада (смотрите изолят 1102 института Пастера, и патенты США 5,620,691 и 6,197,310 и их международные аналоги). Различные подтипы европейского PRRS (все из которых могут быть защищены во всех аспектах представленного изобретения) более подробно описаны в M. P. Murtaugh et al., Virus Research, Vol 154, pp. 18-30, 2010; and M. Shi et al., Virus Research, vol 154 pp. 7-17, 2010. Ранние североамериканские изоляты PRRS раскрыты в патентах США 5,476,778 и 5,840, 563.

Авторы представленного изобретения обнаружили, что возможным является предложить аттенуированные формы европейских штаммов PRRS, которые оказываются как безопасными, так и эффективными, когда их дают самым молодым животным, и, которые в отличие от многих других доступных в настоящее время вакцин против PRRS, не блокируют многие аспекты механизмов ответа иммунной системы животного, такие как вышеупомянутые, тем самым еще более способствуя безопасности и эффективности. Как хорошо известно в данной области техники, оказалось очень трудным культивировать вирус PRRS. Исторически линия клеток почки обезьяны MA-104 и ее производные использовались почти исключительно для размножения и ослабления коммерческих модифицированных живых вакцин против PRRSV вакцины, хотя неизвестно, почему такие клетки были пригодны для этой цели (смотрите патент США 5,476,778).

Открытие того факта, что клеточный поверхностный белок млекопитающих «CD163» естественным образом используется вирусом PRRS для проникновения в клетки млекопитающих (смотрите, например, патент США 9,102,912) позволило разработать новые PRRSV-пермиссивные клеточные линии. Неожиданно, аттенюация на этих более новых клеточных линиях приводит к появлению вакцинных вирусов со свойствами, которые отличаются от существующих вакцин (смотрите патент США 9,566,324 и публикацию заявки США 2013-0309263).

Соответственно, было неожиданно обнаружено, что европейские вирусы PRRS, адаптированные для культивирования либо на (1) свиных клетках, либо (2) несвиных клетках, которые включают рецептор свиного CD163 (смотрите патент США 7,754,464) сохраняют профиль безопасности и эффективности, который в большей степени имеет значение для свиней, чем те, которые обеспечиваются вакцинными вирусами, культивируемыми традиционными способами, и, кроме того, что защитный иммунитет может быть достигнут даже при вакцинации в раннем возрасте. Таким образом, представляется, что обычная адаптация PRRS к культуре в клеточной линии почек обезьяны MA-104 (которая странным образом экспрессирует обезьяний CD163, возможно, в связи с функцией захватывания гемоглобина, и в которой указанный обезьяний CD163 является только на приблизительно 85% идентичным свиному CD163) приводит к профилю безопасности/эффективности, который всегда будет менее биологически значимым и неоптимальным. Репрезентативные примеры свиного CD163 описаны в патенте США 7,754,464 и членах его семейства, патентах США 8,058,050; 8,486,685; и 9,102,912 (смотрите, например, SEQ ID: NO:14 и SEQ ID NO:2 в указанных документах). Как дополнительно описано в этом семействе патентов, применительно к практике представленного изобретения, для рекомбинантной экспрессирующей клетки нет необходимости экспрессировать полноразмерный CD163, при условии, что полипептид CD163 имеет трансмембранный домен для закрепления в мембране и экспрессирует его поверхностные, подвергающиеся действию домены, таким образом, C-терминальный домен может отсутствовать или уменьшаться.

Кроме того, вакцины согласно представленному изобретению, как ожидается, не будут препятствовать интерферонному ответу хозяина, тогда как вакцины известного уровня техники, такие как Ingelvac MLV (смотрите US 5,476,778 и 5,846,805), которые адаптированы для культивирования в клетках обезьяны (которые обеспечивают только обезьяний CD163 в качестве рецептора), обычно показывают сильный ингибирующий эффект на IFN-альфа ответ хозяина (смотрите, пример 5 в целом, и фигуру 4 в патенте США 9,566,324).

Вирус PRRS обычно вызывает самые тяжелые симптомы у самого молодого животного, и при этом является способным обеспечить вакцинацию, которая является одновременно как безопасной, так и эффективной для поросенка, которому всего один день, например, существенно способствует развитию животноводства, а не только путем снижения смертности молодых поросят, а также обеспечения возможности перемещения животных между хозяйствами в кратчайшие сроки после отлучения от матери.

Еще один аспект изобретения предусматривает распознавание того, что современные европейские вакцины на основе клеток обезьян могут быть улучшены путем повторной адаптации, лежащей в основе вирусов, либо для роста в соответствующих свиных клетках (смотрите обсуждение, например, клеток PK-9 ниже), либо несвиных клеток, которые экспрессируют свиной CD163, в результате чего вакцины, как правило, более безопасны и могут безопасно вызывать надежный и устойчивый иммунный ответ в гораздо более раннем возрасте. Таким образом, типичные требования безопасности и эффективности, связанные с традиционными вакцинами, которые были приготовлены в клетках обезьян (то есть такие вакцины вводятся только в возрасте около 3 недель или позже), могут быть отменены с улучшенными характеристиками, также достигая эффективности уже в 1-ый день жизни. Таким образом, учитывая большое разнообразие типов, подтипов и штаммов PRRSV, способы согласно представленному изобретению также могут быть использованы для повышения текущей релевантности и эффективности многих ранее существующих живых вакцин против PRRS.

О том, что вакцины против PRRS типа 2 (Северная Америка) могут быть безопасными и эффективными, когда ранее сообщалось о введении перед отлучением от матери в отношении североамериканских/азиатских штаммов PRRS (смотрите WO 2013/173443, например, в примерах 9 и 10), в частности, при сравнении с образцом аттенюирует “P129 штамм” североамериканского вируса PRRS (смотрите, например, SEQ ID NO:6 в указанном документе, а также PCT/IB2011/055003 и US 6,500,662). Тем не менее, европейские и североамериканские вирусы PRRS являются идентичными только приблизительно на 60% на нуклеотидном уровне, и ведут себя несколько по-разному в зависимости от типов патологий у разных классов животных (возраст, пол и тому подобное).

В данном документе описывается применение в качестве вакцины клеточных линий, экспрессирующих свиной CD163, для ослабления и выбора штаммов генотипа 1 (европейский) PRRSV, обладающих превосходными свойствами.

Сущность изобретения

В первом варианте осуществления, представленное изобретение предусматривает выделенную полинуклеотидную молекулу, которая включает последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую вирус PRRS, который генетически модифицирован таким образом, что в качестве вакцины он вызывает эффективный иммунозащитный ответ против вируса PRRS у животных свиней. В определенных аспектах изобретение предусматривает последовательность ДНК, как изложено в данном документе, которая включает SEQ ID NO.:5. Кодирующие последовательности, которые являются, по меньшей мере, на 80% идентичными к SEQ ID NO:5 (и более предпочтительно, имеющая 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность к ней), также являются функциональными в практике согласно представленному изобретению, при условии, что они обеспечивают различные ключевые мутации, как описано ниже, которые отличают указанные изоляты от других штаммов или штаммов-предшественников.

Дополнительный вариант осуществления изобретения включает последовательности РНК, соответствующие вышеупомянутым полинуклеотидам ДНК, и которые могут быть экспрессированы из них, и фактические вирусы, которые могут быть собраны из такой экспрессии. Дополнительные аттенуированные европейские вирусы PRRS, полезные в практике изобретения, включают те, которые кодируются последовательностью ДНК, которая гибридизуется с комплементом последовательности ДНК SEQ ID NO:5 в очень жестких условиях, которые включают гибридизацию для фильтрации связанной ДНК в 0.5 M NaHPО₄, 7% SDS, 1мM ЭДТУ при 65 градусах C, и промывании в 0.1 SSC/0/1%SDS при 68 градусах C.

Для целей изобретения «соответствующий» означает, что относительные последовательности могут быть оптимально выровнены с использованием алгоритма BLOSUM, как описано в Henikoff et al. Proc Natl. Acad. Sci., USA, 89, pp. 10915-10919, 1992.

В определенных вариантах изобретения, изобретение предусматривает плазмиду, которая включает выделенную полинуклеотидную молекулу, как изложено в данном документе, и промотор, способный транскрибировать полинуклеотидную молекулу в приемлемой клетке-хозяине. В другом варианте изобретения, европейская PRRS-кодирующая последовательность плазмиды в данном документе дополнительно кодирует один или несколько детектируемых гетерологичных антигенных эпитопов. Представленное изобретение предусматривает трансфицированную клетку-хозяин, которая включает плазмиду, представленную в данном документе.

В другом аспекте, представленное изобретение предусматривает вакцину для защиты животного свиньи от заражения вирусом PRRS. Вакцина может включать европейский вирус PRRS, кодируемый молекулой инфекционной РНК, причем каждая из молекул инфекционной РНК кодируется выделенной полинуклеотидной молекулой, как изложено в данном документе. В еще другом аспекте, вакцина включает плазмиду или вирусный вектор, который включает полинуклеотид в данном документе. Вакцина, представленная в данном документе, может необязательно включать вакцинный носитель, приемлемый для ветеринарного применения. В одном важном аспекте, вакцина обладает сниженным ингибирующим действием на интерферон-α по сравнению с европейскими вирусами немутантного типа и другими доступными вакцинами.

В одном варианте изобретения, представленное изобретение предусматривает диагностический набор, который включает полинуклеотидные молекулы, которые различаются (так называемый тест DIVA) между животными свиньями, естественно инфицированными полевым штаммом вируса PRRS, и животными свиньями, вакцинированными модифицированной живой вакциной, представленной в данном документе.

В других вариантах изобретения, изобретение предусматривает способ защиты животного свиньи от заражения штаммом вируса PRRS, который включает введение животному иммуногенно защитного количества вакцины согласно формуле изобретения, представленной в данном документе.

Представленное изобретение также предусматривает плазмиду, способную непосредственно трансфектировать подходящую клетку-хозяин и экспрессировать вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS) из подходящей клетки-хозяина, таким образом, трансфицированной, причем плазмида содержит: (a) последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую вирус PRRS, и (b) промотор, способный транскрибировать указанную молекулу инфекционной РНК.

В следующих предпочтительных вариантах изобретения, указанная плазмида содержит промотор, который представляет собой эукариотический промотор, способный обеспечивать запуск ДНК в целевых эукариотических клетках, или прокариотический или фаговый промотор, способный направлять транскрипцию плазмиды in vitro. Изобретение аналогичным образом предусматривает способ генерирования вируса PRRS, где способ включает трансфектирование подходящей клетки-хозяина соответствующей плазмидий и получение вируса PRRS, генерируемого трансфицированной клеткой.

Изобретение также предусматривает клетки-хозяины, трансфицированные полинуклеотидными молекулами, и предусматривает вакцины для защиты животного свиньи от заражения вирусом PRRS, причем вакцина включает: (a) генетически модифицированный европейский вирус PRRS, кодируемый такими вышеуказанными полинуклеотидными молекулами, или (b) указанную инфекционную молекулу, или (c) указанную полинуклеотидную молекулу в форме плазмиды, или (d) вирусный вектор, содержащий указанную полинуклеотидную молекулу, причем вирус PRRS способен вызывать эффективный иммунозащитный ответ против заражения вирусом PRRS в количестве, эффективном для создания иммунозащиты против инфекции, и носитель, подходящий для применения в ветеринарии.

В частности, изобретение включает способ генерирования европейского вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS), причем способ включает трансфектирование подходящей эукариотической клетки-хозяина композицией, выбранной из группы, состоящей из:

(a) плазмиды, содержащей (1) последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую европейский вирус PRRS, причем указанная кодирующая последовательность ДНК представляет собой SEQ ID: NO:5, или кодирующую последовательность ДНК, которая является, по меньшей мере, на 85% идентичной к SEQ ID NO:5, и (2) промотор, способный управлять транскрипцией указанной последовательности ДНК, кодирующую указанную молекулу инфекционной РНК в указанной подходящей клетке-хозяине; и

(b) инфекционной молекулы РНК PRRS, полученной в результате транскрипции in vitro плазмиды, содержащей последовательность ДНК, кодирующую указанную инфекционную молекулу РНК PRRS, кодирующую европейский вирус PRRS, причем указанная кодирующая последовательность ДНК представляет собой SEQ ID: NO:5, или кодирующую последовательность ДНК, которая является, по меньшей мере, на 85% идентичной к SEQ ID NO:5,

причем для случаев (a) и (b) используется кодирующая последовательность, которая является, по меньшей мере, на 85% идентичной к SEQ ID NO:5, и содержит одну или несколько конкретных мутаций по сравнению с эталонной последовательностью.

В предпочтительных примерах, для поросенка (или самца, или самки) может быть предусмотрена как защитная, так и безопасная вакцинация в однократной дозе в возрасте менее одного дня, например, через 8-16 часов после рождения, до двухнедельного возраста, или трехнедельного возраста, принимая во внимание то, что поросенок может быть отлучен от матери в какой-либо момент от приблизительно двух- до трехнедельного возраста. Таким образом, представленное изобретение является, как правило, применимым к ранней вакцинации однократной дозой, то есть в какое-либо время в первый день жизни (от рождения до 24-часового возраста), аналогично в 2-ой день, 3-ий день, 4-ый день, 5-ый день, 6-ой день, 7-ой день, 1-10 дни, 1-14 дни, и 1-21 дни, или просто вакцинации, которая проводится раньше, чем примерно в день отлучения от матери. При желании могут быть использованы две или больше доз.

Ранняя вакцинация (обычно внутримышечным или интраназальным путем) против вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) в таких условиях также обеспечивает раннее начало защитного иммунитета, например, в возрасте от одной до восьми недель; или примерно от двух до шести недель после вакцинации; и обычно приблизительно через 28 дней после вакцинации.

Вакцинация в соответствии с практикой изобретения, как правило, обеспечивает продолжительность иммунитета у поросенка, которая составляет приблизительно 23-28 недель, обычно, по меньшей мере, приблизительно 26 недель, что является полностью ожидаемой продолжительностью жизни рыночной свиньи. Таким образом, программы вакцинации, которые стали возможными благодаря представленному изобретению, защищают поросят, когда они наиболее уязвимы для инфекции и с ними легче всего обращаться. Такая вакцинация также позволяет наступлению иммунитета совпадать с моментом, когда отлученные поросята удаляются от свиноматки, и могут быть транспортированы в другие хозяйства, где может присутствовать дальнейший риск заражения PRRSV. Вакцины согласно изобретению также являются высокоэффективными для защиты кабанов; и свиноматок и молодых свиней, таким образом, косвенно защищая не родившееся потомство. Хотя предпочтительным является предполагать внутримышечную и интраназальную вакцинацию, другие способы также являются применимыми.

В дополнительном примере изобретения, хотя он и менее предпочтителен, полипептид CD163, экспрессируемый рекомбинантными клетками, в которых культивируется европейский вирус PRRS (и, таким образом, предварительно адаптированный к инфекции и росту у животных свиней), не является свиным CD163, но скорее CD163 млекопитающего, имеющий аминокислотную последовательность, которая относительно близка к свиной последовательности, например, по меньшей мере, на 90% идентичной последовательности SEQ ID NO: 2 или 14 US 7,754,464. Более предпочтительно, чтобы данная аминокислотная идентичность составляла 92%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Изобретение также предусматривает диагностические наборы, содержащие полинуклеотидные молекулы, которые различают животных свиней, естественным образом инфицированных полевым штаммом вируса PRRS, и животных свиней, вакцинированных вакцинами согласно изобретению, причем эти вакцины (вирусы) предпочтительно свидетельствуют о сниженном эффекте ингибирования интерферона-α по сравнению с немутантным типом.

Изобретение, кроме того, предусматривает репрезентативные последовательности всего генома PRRSV, полученные из европейского (бельгийского) изолята PRRSV 96V198. Изолят 96V198 сам по себе был получен в 1996 году профессором Hans Nauwynck, Ghent University, Belgium, из легких молодой свиньи с респираторными признаками (пассаж 0, таким образом, был извлечен из сыворотки зараженной свиньи (SEQ ID NO: 1).

Пассаж 1 (SEQ ID NO:2) является результатом одного пассажа на первичных альвеолярных макрофагах свиньи (PAM). Все последующие пассажи выполняли на клеточной линии BHK21-C12-26. Пассаж 9 (SEQ ID NO:3) выполняется непосредственно перед биологическим клонированием вируса с помощью трех раундов ограниченного разведения. Пассаж 14 (SEQ ID NO:4) представляет собой клон 1 (из шести клонов, исследованных и оцененных). Клон 1 продолжал превращаться в главный производственный вирус в пассаже 44, и MSV+5 пассажей становились продуктом Suvaxyn® PRRS MLV в пассаже 49 (SEQ ID NO:5). Все геномы имеют длину 15092 нуклеотидов. Все геномы являются, по меньшей мере, на 99,5% идентичными друг другу, и являются приблизительно на 92% идентичными вирусу Лелистада.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет полноразмерную нуклеотидную последовательность (15092 оснований) изолята пассажа 49 для продукта Suvaxyn® PRRS MLV, SEQ ID NO:5.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет пассаж 0 изолята PRRSV 96V198.

SEQ ID NO: 2 представляет пассаж 1 изолята PRRSV 96V198.

SEQ ID NO: 3 представляет пассаж 9 изолята PRRSV 96V198.

SEQ ID NO: 4 представляет пассаж 14 изолята PRRSV 96V198.

SEQ ID NO: 5 представляет пассаж 49 изолята PRRSV 96V198.

SED ID NOS: 6-8 представляют последовательности праймера ПЦР.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как используется в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки множественного числа, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылки на «способ» включают в себя один или несколько способов и/или стадий, описанных в данном документе, которые станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения данного раскрытия и так далее.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают обычные специалисты в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя какие-либо способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе, могут быть использованы при практическом применении или испытании изобретения, предпочтительные способы и материалы описываются сейчас.

Осуществление на практике представленного изобретения будет использовать, если не указано иное, общепринятые способы вирусологии, иммунологии, микробиологии, молекулярной биологии и методики рекомбинантных ДНК, известные специалистам в данной области, многие из которых описаны ниже с целью иллюстрации. Такие методики полностью объясняются в литературе. Смотрите, например, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription и Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

"Североамериканский вирус PRRS" означает какой-либо вирус PRRS, имеющий генетические характеристики, связанные с изолятом североамериканского вируса PRRS, таким как, но не ограничиваясь этим, вирус PRRS, который был впервые выделен в Соединенных Штатах приблизительно в начале 1990-х годов (смотрите, например, Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126); Изолят североамериканского вируса PRRS MN-1b (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293-296); штамм Quebec LAF-exp91 PRRS (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418); и Североамериканский вирус PRRS изолят VR 2385 (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801). Генетические характеристики относятся к сходству геномной нуклеотидной последовательности и сходству аминокислотной последовательности, характерной для штаммов североамериканского вируса PRRS. Штаммы вируса азиатского PRRS обычно свидетельствуют о 80-95% идентичности нуклеотидной последовательности с североамериканскими штаммами (смотрите величины по умолчанию для алгоритма Clustal W в наборе программного обеспечения Lasergene, DNASTAR, Inc.), и североамериканские штаммы являются, аналогичным образом, на от приблизительно 85% до 100% идентичными друг другу.

"Европейский вирус PRRS" (PRRSV-1, или ранее PRRSV тип 1) относится к какому-либо штамму вируса PRRS, имеющему генетические характеристики, связанные с вирусом PRRS, который был впервые выделен в Европе около 1991 года (смотрите, например, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130, вирус Лелистада, смотрите, также патенты США 5,620,691 и 6,197,310). Европейский вирус PRRS также, как правило, относится к вирусам, имеющим полноразмерные нуклеотидные последовательности, которые являются приблизительно на 80% идентичными или выше к изоляту Лелистада. Следует отметить, что в пределах PRRSV-1, пришли к определению подтипов, так что вирус Лелистад был назван прототипом для подтипа 1 и вируса Лена (U. Karniychuk et al., BMC Veterinary Research, 2010, Vol 6, No. 30) стал назван как прототип подтипа 3. Данные два вируса приблизительно охватывают максимальное текущее расхождение PRRSV-1, и таким образом, например, при использовании ORF5, Лелистада и Лена являются приблизительно на 82,8% идентичными на нуклеотидном уровне, и с использованием полных геномов, Лелистад и Лена являются приблизительно на 80,7% идентичными на нуклеотидном уровне. Оптимизация выравнивания незначительно варьируется в зависимости от параметров алгоритма, но ридер обычно ссылается на значения по умолчанию для алгоритма Clustal W в программном обеспечении Lasergene (DNASTAR, Inc.).

Европейские штаммы PRRS, как правило, приблизительно на 60% идентичны как североамериканским, так и азиатским (китайским) штаммам. Например, при использовании нуклеотидной последовательности ORF5 (которая дает хорошую или достоверную оценку всего генома, когда полные геномы неизвестны), прототип вируса Лелистада PRRSV-1 и прототип североамериканского штамма VR2332 являются приблизительно на 65,0% идентичными на нуклеотидном уровне. Используя нуклеотидную последовательность полного генома, прототип вируса Лелистада и прототип вируса VR2332 являются приблизительно на 58,6% идентичными на нуклеотидном уровне, снова используя значения по умолчанию для процитированного алгоритма Clustal W.

"Эффективный иммунозащитный ответ", "иммунозащита", и подобные термины для целей представленного изобретения, означают иммунный ответ, направленный против одного или нескольких антигенных эпитопов патогена, таким образом, чтобы защитить от инфекции, вызванной патогеном, вакцинированное животное. Для целей представленного изобретения, защита от заражения патогеном включает не только абсолютную профилактику инфекции, но также какое-либо обнаруживаемое снижение степени или скорости заражения патогеном, или какое-либо обнаруживаемое снижение тяжести заболевания или какой-либо симптом или состояние, вызванное в результате заражения патогеном у вакцинированного животного по сравнению с невакцинированным инфицированным животным. Эффективный иммунозащитный ответ может быть индуцирован у животных, которые ранее не были инфицированы патогеном и/или не инфицированы патогеном во время вакцинации. Эффективный иммунозащитный ответ также может быть индуцирован у животного, уже зараженного патогеном во время вакцинации.

Генетически модифицированный вирус PRRS является "аттенуированным", если он менее вирулентен, чем его немодифицированный родительский штамм. Штамм является «менее вирулентным», если он показывает статистически значимое снижение одного или нескольких параметров, определяющих тяжесть заболевания. Такие параметры могут включать уровень виремии, лихорадку, тяжесть респираторного расстройства, тяжесть репродуктивных симптомов или количество или тяжесть поражений легких и т.д.

"Клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию вируса PRRS" означает клетку, которая является способной генерировать инфекционный PRRS при заражении вирусом согласно изобретению. Такие клетки включают свиные клетки моноцитарной/макрофаговой клеточной линии, такие как свиные альвеолярные макрофаговые клетки и производные, клетки почки обезьяны MA-104 и производные, такие как клетки MARC-145; и клетки, трансфицированные геном, кодирующим рецептор вируса PRRS (смотрите патент США 9,102,912, относящийся к назначению поверхностного белка CD163 млекопитающего в качестве нормального рецептора клетки вируса PRRS). Термин "клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию вируса PRRS" также может включать клетки в живой свинье.

"Открытая рамка считывания", или "ORF", как используется в данном документе, означает минимальную нуклеотидную последовательность, необходимую для кодирования конкретного белка вируса PRRS без промежуточного стоп-кодона.

"Свиной" и "свиньи" используются взаимозаменяемо в данном документе и относятся к какому-либо животному, которое является членом семейства Suidae, таким как, например, свинья. Вакцины и протоколы способов согласно изобретению являются применимыми ко всем свиньям, будь то самцы какого-либо возраста, или самка какого-либо возраста, включая свиноматок и молодых свиней, и такие способы также способны косвенно защищать самцов и самок поросят посредством защиты, вводимой матери-свиноматке. Термин "PRRS вирус", как используется в данном документе, если не указано иное, означает какой-либо штамм из или североамериканского, азиатского или европейского вируса PRRS.

"PRRS" охватывает симптомы заболевания у свиней, вызванного инфицированием вирусом PRRS (PRRSV). Примеры таких симптомов включают, но не ограничиваются этим, лихорадку, аборт у беременных самок, респираторный дистресс, поражения легких, потерю аппетита и смертность у молодняка свиней. Как используется в данном документе, вирус PRRS, который является "неспособным продуцировать PRRS" относится к вирусу, который может инфицировать свинью, но который не вызывает никаких симптомов заболевания, обычно связанных с инфекцией PRRS у свиньи.

"Трансфицированная клетка-хозяин" означает практически какую-либо клетку-хозяин, которая при трансфицировании РНК вируса PRRS, может продуцировать, по меньшей мере, первый раунд вирионов PRRS.

“Инфекционная молекула ДНК”, для целей представленного изобретения, представляет собой молекулу ДНК, которая кодирует необходимые элементы для поддержания репликации, транскрипции и трансляции в функциональном вирионе из подходящей клетки-хозяина.

Аналогичным образом, “выделенная полинуклеотидная молекула” относится к композиции вещества, включающей полинуклеотидную молекулу согласно представленному изобретению, очищенную или контролируемую до какой-либо обнаруживаемой степени из ее естественного состояния, если оно существует.

Для целей представленного изобретения, нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы (либо РНК, либо ДНК) является “гомологичной” к нуклеотидной последовательности первой полинуклеотидной молекулы, или имеет “идентичность” к указанной первой полинуклеотидной молекулы, причем нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы кодирует такую же полиаминокислоту, что и нуклеотидная последовательность первой полинуклеотидной молекулы исходя из вырожденности генетического кода, или когда она кодирует полиаминокислоту, которая является в достаточной степени подобной полиаминокислоте, кодируемой нуклеотидной последовательностью первой полинуклеотидной молекулы таким образом, чтобы быть полезной в практике представленного изобретения. Гомологичные полинуклеотидные последовательности также относятся к смысловой и антисмысловой цепям и во всех случаях к комплементу каких-либо таких цепей. Для целей представленного изобретения, полинуклеотидная молекула полезна для практического применения представленного изобретения, и поэтому является гомологичной или имеет идентичность, причем она может быть использована в качестве диагностического зонда для обнаружения присутствия вируса PRRS или вирусного полинуклеотид в образце жидкости или ткани инфицированной свиньи, например, используя стандартные методики гибридизации или амплификации. Как правило, нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы представляет собой гомологичную нуклеотидную последовательность первой полинуклеотидной молекулы, если она имеет, по меньшей мере, приблизительно 70% идентичность нуклеотидной последовательности к нуклеотидной последовательности первой полинуклеотидной молекулы на основании алгоритма BLASTN (National Center for Biotechnology Information, также известного как NCBI, (Bethesda, Maryland, USA) института United States National Institute of Health). В конкретном примере для расчетов в соответствии с практическим применением согласно представленному изобретению, делается ссылка на BLASTP 2.2.6 [Tatusova TA and TL Madden, “BLAST 2 sequences- a new tool for comparing protein and nucleotide sequences.” (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250.]. Вкратце, две аминокислотные последовательности выровнены для оптимизации показателей выравнивания с использованием штрафа за открытие пробела 10, штрафа за расширение пробела 0,1 и матрицы оценки “blosum62” от Henikoff и Henikoff (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. 1992). Процент идентичности затем рассчитывается следующим образом: общее количество идентичных совпадений x 100/ деленное на длину более длинной последовательности + количество пробелов, введенных в более длинную последовательность для выравнивания двух последовательностей.

Предпочтительно, гомологичная нуклеотидная последовательность имеет, по меньшей мере, приблизительно 75% идентичность нуклеотидной последовательности, даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98% и 99% идентичность нуклеотидной последовательности. Поскольку генетический код является вырожденным, гомологичная нуклеотидная последовательность может включать какое-либо количество “молчащих” изменений основания, то есть нуклеотидных замещений, которые, тем не менее, кодируют одну и ту же аминокислоту.

Гомологичная нуклеотидная последовательность может дополнительно содержать немолчащие мутации, то есть замещения, делеции, или добавления оснований, которые в результате приводят к аминокислотным различиям в кодируемой полиаминокислоте, при условии, что последовательность остается, по меньшей мере, приблизительно на 70% идентичной к полиаминокислоте, кодируемой первой нуклеотидной последовательностью, или иное является полезным для практической реализации представленного изобретения.

В этом отношении могут быть сделаны определенные консервативные аминокислотные замещения, которые, как правило, распознаются, при этом не активируя общую функцию белка: например, в отношении положительно заряженных аминокислот (и наоборот), лизина, аргинина и гистидина; в отношении отрицательно заряженных аминокислот (и наоборот), аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и в отношении определенных групп нейтрально заряженных аминокислот (и во всех случаях, а также наоборот), (1) аланин и серин, (2) аспарагин, глутамин и гистидина, (3) цистеин и серин, (4) глицин и пролин, (5) изолейцин, лейцин и валин, (6) метионин, лейцин и изолейцин, (7) фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, (8) серин и треонин, (9) триптофан и тирозин, (10) и например, тирозин, тирптофан и фенилаланин. Аминокислоты могут быть классифицированы в соответствии с физическими свойствами и вкладом во вторичную и третичную структуру белка. Консервативная замена известна в данной области техники как замещение одной аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет сходные свойства. Типичные консервативные замещения могут быть найти в WO 97/09433, страница 10, опубликованная 13 марта 1997 года (PCT/GB96/02197, поданная 6 сентября 1996 года). Альтернативно, консервативные аминокислоты могут быть сгруппированы, как описано в Lehninger, (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp. 71-77). Дополнительные подходящие консервативные изменения и их применение описаны ниже.

Гомологичные нуклеотидные последовательности могут быть определены путем сравнения нуклеотидных последовательностей, например, с использованием BLASTN, указанного выше. Альтернативно, гомологичные нуклеотидные последовательности могут быть определены путем гибридизации в выбранных условиях. Например, нуклеотидная последовательность второй полинуклеотидной молекулы является гомологичной SEQ ID NO:5 (или какой-либо другой конкретной полинуклеотидной последовательности), если она гибридизуется с комплементом SEQ ID NO:5 в умеренно жестких условиях, например, гибридизация со связанной на фильтре ДНК в 0,5 M NaHPO₄, 7% додецилсульфата натрия (SDS), 1 мM ЭДТУ при 65°C, и промывке в 0,2xSSC/0,1% SDS при 42°C (смотрите Ausubel et al editors, Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1994, pp. 6.0.3 to 6.4.10), или условия, которые в противном случае будут в результате приводить к гибридизации последовательностей, которые кодируют вирус PRRS как определено ниже. Модификации в условиях гибридизации могут быть определены эмпирически или точно рассчитаны на основе длины и процентного соотношения оснований гуанозин/цитозин (GC) зонда. Условия гибридизации могут быть рассчитаны, как описано в Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York (1989), pp. 9.47 to 9.51.

В другом варианте изобретения, вторая нуклеотидная последовательность является гомологичной SEQ ID NO:5 (или какой-либо другой последовательности согласно изобретению), если она гибридизуется с комплементом SEQ ID NO:5 в очень жестких условиях, например, гибридизация со связанной на фильтре ДНК в 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 мM ЭДТУ при 65°C, и промывке в 0,1xSSC/0,1% SDS при 68°C, как известно в данной области с уровня техники (Ausebel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing и Wiley Interscience, New York, 1989.

Кроме того, следует понимать, что выделенные полинуклеотидные молекулы и выделенные молекулы РНК согласно представленному изобретению включают как синтетические молекулы, так и молекулы, полученные с помощью рекомбинантных технологий, таких как клонирование и транскрипция in vitro.

Полинуклеотидные молекулы могут быть генетически мутированы с использованием рекомбинантных способов, известных специалистам в данной области, включая сайт-направленный мутагенез или случайный мутагенез, такой как воздействие химических мутагенов или радиации, как известно в данной области. "Мутации могут быть выполнены стандартными способами, известными в данной области с уровня техники, например, путем сайт-направленного мутагенеза (смотрите, например, Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) инфекционной копии, как описано (например, Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol., 1998, 440:199-206).

В связи с предоставлением предпочтительных последовательностей европейского вируса PRRS, которые являются как безопасными, так и эффективными при введении поросятам перед отлучением от матери, среди аминокислотных положений, которые могут быть модифицированы, могут быть выделены следующие. При определении этих специфических мутаций, конечно, отмечается, что консервативные замещения для данных предпочтительных аминокислотных остатков, как определено непосредственно выше, также могут быть использованы. При определении предпочтительных кодируемых аминокислот соответствующие/ исходные аминокислоты немутантного изолята штамма 96V198 также показаны в скобках, таким образом, пассаж 0 (SEQ ID NO: 1) сравнивают с пассажем 49 (предпочтительный вакцинный материал, SEQ ID NO: 5). Таким образом, для аминокислотной последовательности, кодируемой из ORF1a, S находится в аминокислотном положении 19 (N); Y в - аминокислотном положении 24 (F); A - в аминокислотном положении 156 (T); Y - в аминокислотном положении 157 (H); D - в аминокислотном положении 268 (N); H - в аминокислотном положении 294 (Y); Y - в аминокислотном положении 416 (C); S - в аминокислотном положении 742 (P); L - в аминокислотном положении 884 (F); P - в аминокислотном положении 908 (S); K - в аминокислотном положении 916 (E); K - в аминокислотном положении 977 (E); S - в аминокислотном положении 1138 (P); F - в аминокислотном положении 1160 (L); S - в аминокислотном положении 1500 (P); R - в аминокислотном положении 2094 (Q); P - в аминокислотном положении 2254 (S); и L - в аминокислотном положении 2290 (F). Для аминокислотной последовательности, кодируемой из ORF1b, S- в аминокислотном положении 567 (N); и H- в аминокислотном положении 912 (Q). Для аминокислотной последовательности, кодируемой из ORF2a, L находится в аминокислотном положении 22 (S); F - в аминокислотном положении 88 (V); M - в аминокислотном положении 94 (I); и F - в аминокислотном положении 95 (L). Для аминокислотной последовательности, кодируемой из ORF2b, L находится в аминокислотном положении 47 (F). Для аминокислотной последовательности, кодируемой из ORF3, S находится в аминокислотном положении 52 (T). Для аминокислотной последовательности, кодируемой из ORF4, T находится в аминокислотном положении 151 (I). Для аминокислотной последовательности, кодируемой из ORF5, F находится в аминокислотном положении 20 (L); и D находится в аминокислотном положении 37 (N). Для аминокислотной последовательности, кодируемой из ORF5a, V находится в аминокислотном положении 18 (A); и R находится в аминокислотном положении 35 (Q).

Соответственно, представленное изобретение, кроме того, предусматривает способ получения генетически модифицированного европейского вируса PRRS, причем способ включает мутирование последовательности ДНК, кодирующей инфекционную молекулу РНК, которая кодирует вирус PRRS, как описано выше, и экспрессирует генетически модифицированный вирус PRRS с использованием подходящей экспрессионная система. Генетически модифицированный вирус PRRS может быть экспрессирован из выделенной полинуклеотидной молекулы с использованием подходящих экспрессионных систем, как правило, известных в данной области с уровня техники, примеры которых описаны в настоящей заявке. Например, выделенная полинуклеотидная молекула может находиться в форме плазмиды, способной экспрессировать кодируемый вирус в приемлемой клетке-хозяине in vitro, как более подробно описывается ниже.

Последовательности N-белка североамериканского PRRSV являются высококонсервативными, и указанные последовательности имеют приблизительно 93-100% идентичность друг с другом. N-белки североамериканского и европейского PRRSV являются приблизительно на 57-59% идентичными и имеют общие структурные мотивы. Как правило, при сравнении кодирующих последовательностей и изолятов PRRS, которые могут быть пронумерованы по-разному в отношении конкретных нуклеотидов или кодированных аминокислот, идентификация подходящих областей легко достигается путем идентификации сохраненных характерных аминокислот в интересующем штамме PRRS и сопоставления ее с эталонным штаммом.

Технология рекомбинантной ДНК включает чрезвычайно разнообразные и мощные методы молекулярной биологии, направленные на модифицирование нуклеиновых кислот на уровне ДНК, и позволяет анализировать и модифицировать геномы на молекулярном уровне. В этом отношении вирусы, такие как вирус PRRS из-за скромного размера его генома, особенно подвержены таким манипуляциям. Однако, технология рекомбинантной ДНК не сразу применима к не ретровирусным РНК-вирусам, потому что данные вирусы не охватывают промежуточную стадию ДНК в своей репликации. Для таких вирусов необходимым является разработать инфекционные клоны кДНК, прежде чем технология рекомбинантной ДНК может быть применена к их геному для создания модифицированного вируса. Инфекционные клоны могут быть получены путем конструирования полноразмерной (геномной длины) кДНК (в данном документе используется в широком смысле ДНК-копии РНК, и не только в строгом смысле ДНК-копии мРНК) исследуемого вируса, после чего инфекционный транскрипт синтезируется in vivo в клетках, трансфицированных полноразмерной кДНК, но инфекционные транскрипты также могут быть получены путем транскрипции in vitro из полноразмерной кДНК в плазмиде, имеющей прокариотический промотор, в присутствии транскрипционного коктейля, или снова in vitro с использованием лигированных фрагментов кДНК частичной длины, которые содержат полный вирусный геном. Во всех случаях транскрибированная РНК несет все модификации, которые были введены в кДНК, и может быть использована для дальнейшего пассирования модифицированного таким образом вируса.

Получение инфекционного клона изолята европейского вируса PRRS или вируса Лелистад описывается в патенте США No. 6,268,199, который, таким образом, полностью включен в качестве ссылки. Получение инфекционного клона кДНК изолята североамериканского вируса PRRS, обозначенного P129 (Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004) описывается в патенте США No. 6,500,662 который, таким образом, полностью включен в качестве ссылки. Последовательность P129 кДНК раскрыта в Genbank с регистрационным номером AF494042 и в патенте США No. 6,500,662. В нашей работе, приведенной ниже, используется такой инфекционный клон, который в контексте плазмиды экспрессируется непосредственным ранним промотором CMV и обозначается как pCMV-S-P129, и также раскрывается в патенте США No. 6,500,662. Как описывается в патенте США No. 6,500,662 существуют другие плазмиды и промоторы, подходящие для использования в данном документе.

Учитывая полную последовательность какой-либо открытой рамки считывания, представляющей интерес, и местоположение интересующего аминокислотного остатка, специалисту в данной области просто нужно обратиться к таблице кодонов для того, чтобы сконструировать изменения в конкретном желаемом положении.

Кодоны представляют собой триплетные последовательности нуклеотидов в мРНК и соответствующие им молекулы кДНК. Кодоны характеризуются основным урацилом (U), когда присутствует в молекуле мРНК, но характеризуются основным тимидином (T), когда присутствует в ДНК. Простое изменение в кодоне такого же аминокислотного остатка в полинуклеотиде не изменит последовательность или структуру кодируемого полипептида. Очевидно, что, когда фраза, утверждающая, что конкретная 3-нуклеотидная последовательность «кодирует» какую-либо конкретную аминокислоту, специалист в данной области техники признает, что приведенная выше таблица предоставляет средства для идентификации конкретных рассматриваемых нуклеотидов. Например, если конкретная трехнуклеотидная последовательность кодирует лизин, приведенная выше таблица раскрывает, что двумя возможными триплетными последовательностями являются AAA и AAG. Глицин кодируется GGA, GGC, GGT (GGU, если в РНК) и GGG. Чтобы заменить остаток лизина на глицин в кодируемом белке, можно заменить триплет AAA или AAG на какой-либо из GGA и GGC, GGT или GGG в кодирующей нуклеиновой кислоте.

Исследования по иммунобиологии вируса PRRS позволяют предположить, что взаимодействие вируса PRRS с PDC заслуживает изучения. Этот тип клеток составляет 0,2% -0,8% мононуклеарных клеток периферической крови у людей, мышей, крыс, свиней и обезьян. Несмотря на дефицит, данная клетка является важным компонентом врожденной иммунной системы и способна секретировать обильные количества IFN-α после вирусной стимуляции. Именно благодаря секреции IFN-α PDC играют основную роль в регуляции противовирусного врожденного и адаптивного иммунитета, поскольку они стимулируют функцию естественных клеток-киллеров, B-клеток и T-клеток. Кроме того, созреванию свиных моноцитарного происхождения дендритных клеток (MoDC) способствует IFN-α, секретируемый PDC, что в результате приводит к повышенной способности MoDC представлять антиген и активировать Т-клетки. На более поздней стадии вирусной инфекции PDC дифференцируются в уникальный тип зрелой дендритной клетки, которая непосредственно регулирует функцию Т-клеток и направляет дифференцирование Т-клеток в клетки, способные секретировать IFN-γ, который является основным медиатором противовирусного иммунитета против вирусов, которые включают вирус PRRS. Не удивительно, что существуют вирусы человека, такие как респираторный синцитиальный вирус и вирус кори, которые, как известно, подавляют способность PDC секретировать IFN-α. Данный ингибирующий эффект, как считается, играет роль в преобладании гуморального иммунного ответа и связанной с ним иммунопатологии, наблюдаемой в результате инфицирования данными вирусами, а также в повышенной восприимчивости хозяина к вторичным бактериальным и вирусным инфекциям.

Как уже упоминалось, существует множество известных штаммов и изолятов европейского, североамериканского и китайского PRRS, и новые штаммы продолжают развиваться или быть выделенными. Хотя между всеми данными штаммами существует высокий уровень гомологии аминокислотной последовательности, квалифицированные специалисты в данной области сразу поймут, что некоторые вариации действительно существуют, и действительно можно воспользоваться преимуществами этих различий и сходств для дальнейшего улучшения фенотипических свойств всех вакцинных штаммов.

Во-первых, что касается всех аминокислотных мотивов, определенных SEQ ID NOS, как указано ниже, возможным обычно является проверить соответствующие экспрессированные белковые последовательности из каких-либо других европейских PRRS, чтобы найти соответствующий аминокислотный мотив, даже если дополнительные изменения произошли в таких других штаммах, в результате эволюции, вызывая замещения и/или удаления, или добавления. Таким образом, возможным должно быть легко идентифицировать сопоставимый мотив в другом штамме PRRS, если, например, валин в нем замещен изолейцином, или лейцином, или каким-либо другим остатком, или если остаток просто отсутствует или добавлен дополнительный остаток. Существуют многочисленные компьютерные программы для идентификации выравниваний и, таким образом, определения, соответствуют ли мотивы полипептидных последовательностей, например, так называемые таблицы Blosum (на основе заданного уровня процентной идентичности), смотрите S. Henikoff et al. “Amino Acid Substitution matrices from protein blocks”, Proc Natl Acad Sci, USA, 89(22), pp. 10915-10919, Nov 15, 1992., и смотрите также A. L. Lehninger et al. Principles of Biochemistry, 2005, MacMillan и Company, 4^th edition. Консервативные аминокислотные изменения также распознаются на основе классификации по 5 общим группам: сульфидрил (Cys); ароматические (Phe, Tyr, и Trp); основные (Lys, Arg, His); алифатические (Val, Ileu, Leu, Met), и гидрофильные (Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser и Thr). Таким образом, в практику изобретения входит модификация какой-либо кодирующей нуклеотидной последовательности европейского PRRS для включения в отвечающее требованиям и соответствующее положение каких-либо из аминокислотных изменений, обеспечиваемых SEQ ID NO:5, даже если одна или несколько других аминокислот, которые соседствуют с указанным положением, были добавлены, удалены или заменены. Такие аминокислотные замены, конечно, могут быть введены в соответствующие кодирующие нуклеотидные последовательности вируса с использованием сайт-направленного мутагенеза, ПЦР и других методов, которые хорошо известны в данной области с уровня техники.

Общий показатель аттенюации

Для того, чтобы продемонстрировать, что конкретный генетически модифицированный штамм является аттенуированным, может быть использован эксперимент, описанный следующим образом.

По меньшей мере 10 молодых свиней на группу включены в каждое испытание, которые получены с фермы, на которой отсутствовал PRRSV. Животных исследуют на отсутствие специфических сывороточных антител к вирусу PRRS и отрицательных касательно PRRSV. Все животные, включенные в исследование, имеют один и тот же источник и породу. Распределение животных по группам было рандомизированным.

Контрольное заражение проводится на 90-ый день беременности за счет интраназального применения 1 мл PRRSV 10⁵ TCID₅₀ на ноздрю. Существует, по меньшей мере, три группы для каждого исследуемого набора установок: одна группа с немутантного типа вирусом; одна исследуемая группа с контрольным заражением возможно аттенуированным вирусом; и одна группа строгого контроля.

Исследование считается действительным, когда строгие контроли остаются PRRSV-отрицательными в течение всего периода исследования, и, по меньшей мере, на 25% меньше живых здоровых поросят рождается в группе с контрольным заражением немутантным типом по сравнению со строгим контролем.

Аттенюация, другими словами, меньшая вирулентность, определяется как статистически значимое изменение одного или нескольких параметров, определяющих репродуктивную функцию или другие симптомы:

Значительное снижение, по меньшей мере, одного из следующих параметров для исследуемой группы (возможно, аттенуированный вирус) по сравнению с группой, инфицированной немодифицированным родительским штаммом, будет показателем аттенюации:

a) частота мертворожденных

b) аборт во время или до 112 дня беременности

c) количество мумифицированных поросят

d) количество мумифицированных поросят

e) смертность перед отлучением от матери.

Кроме того, предпочтительным является значительное увеличение одного из следующих параметров для исследуемой группы по сравнению с группой, инфицированной немодифицированным родительским штаммом:

f) количество поросят, отлученных на свиноматку

g) количество живых здоровых поросят, рожденных на свиноматку.

Альтернативно, респираторные симптомы и другие симптомы инфекции PRRSV могут быть исследованы для установления аттенюации.

Аттенуированный штамм является ценным для формуляции вакцин. Представленная вакцина является эффективной, если она защищает свинью от заражения вирусом PRRS. Вакцина защищает свинью от заражения вирусом PRRS, если, после введения вакцины одной или нескольким не пораженным свиньям, последующее контрольное заражение биологически чистым вирусным изолятом (например, какого-либо европейского немутантного типа) в результате приводит к снижению тяжести каких-либо больших или гистопатологических изменений (например, поражения легких) и/или симптомов заболевания по сравнению с теми изменениями или симптомами, которые обычно вызываются изолятом у похожих свиней, которые не защищены (то есть относительно соответствующего контроля). В частности, представленная вакцина, как может быть показано, является эффективной путем введения вакцины одной или нескольким подходящим свиньям, нуждающимся в этом, а затем по истечении соответствующего периода времени (например, 4 недели), контрольного заражения большим образцом (10^(3-7)TCID₍₅₀₎) биологически чистого изолята PRRSV. Образец крови затем отбирают у зараженной свиньи примерно через одну неделю, и затем предпринимают попытку выделить вирус из образца крови. Выделение большого количества вируса является показателем того, что вакцина может быть неэффективной, в то время как выделение уменьшенного количества вируса (или вообще никакого вируса) является показателем того, что вакцина может быть эффективной.

Таким образом, эффективность представленной вакцины может быть оценена количественно (то есть уменьшение процента консолидированной легочной ткани по сравнению с соответствующей контрольной группой) или качественно (например, выделение PRRSV из крови, выявление антигена PRRSV в образце ткани легкого, миндалины или лимфатического узла с помощью иммуноанализа). Симптомы репродуктивного и респираторного заболевания свиней могут оцениваться количественно (например, температура/лихорадка) или полуколичественно (например, наличие или отсутствие одного, или нескольких симптомов или уменьшение тяжести одного или нескольких симптомов, таких как цианоз, пневмония, поражения легких и т. д.).

Не пораженная свинья представляет собой свинью, которая либо не подвергалась воздействию инфекционного агента, вызывающего репродуктивную и респираторную болезнь свиньи, либо которая подвергалась воздействию инфекционного агента, вызывающего репродуктивную и респираторную болезнь свиньи, но не проявляет симптомов заболевания. Пораженная свинья представляет собой свинью, которая проявляет симптомы PRRS, или из которой может быть выделен PRRSV.

Вакцины согласно представленному изобретению могут быть сформулированы в соответствии с принятой конвенцией для включения приемлемых носителей для животных, включая людей (если применимо), таких как стандартные буферы, стабилизаторы, разбавители, консерванты и/или солюбилизаторы, и также могут быть сформулированы для облегчения замедленного высвобождения. Разбавители включают воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Добавки для изотоничности включают, среди прочего, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают, среди прочего, альбумин. Другие подходящие вакцинные носители и добавки, включая те, которые особенно полезны при формуляции модифицированных живых вакцин, известны или будут очевидны для специалистов в данной области с уровня техники. Смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, которая включена в данном документе в качестве ссылки.

Вакцины согласно представленному изобретению могут дополнительно включать один или несколько дополнительных иммуномодулирующих компонентов, таких как, например, адъювант или цитокин, среди прочих. Неограничивающие примеры адъювантов, которые могут быть использованы в вакцине согласно представленному изобретению, включают систему адъювантов RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), квасцы, минеральные гели, такие как гель гидроксида алюминия, эмульсии масло-в-воде, эмульсии вода-в-масле, такие как, например, полные и неполные адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN.RTM. адъювант, сапонин, Quil A или другая фракция сапонина, монофосфориллипид A, и авридиновый липид-аминный адъювант. Неограничивающие примеры эмульсий масло-в-воде, используемых в вакцине согласно изобретению, включают модифицированные составы SEAM62 и SEAM 1/2. Модифицированный SEAM62 представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую 5% (об./об.) сквалена (Sigma), 1% (об./об.) SPAN.RTM. 85 детергента (ICI Surfactants), 0,7% (об./об.) TWEEN.RTM. 80 детергента (ICI Surfactants), 2,5% (об./об.) этанола, 200 пг/мл Quil A, 100 мкг/мл холестерина, и 0,5% (об./об.) лецитина. Модифицированный SEAM 1/2 представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую 5% (об./об.) сквалена, 1% (об./об.) SPAN.RTM. 85 детергента, 0,7% (об./об.) Tween 80 детергента, 2,% (об./об.) этанола, 100 мкг/мл Quil A, и 50 мкг/мл холестерина. Другие иммуномодулирующие агенты, которые могут быть включены в вакцину, включают, например, один или несколько интерлейкинов, интерферонов или других известных цитокинов.

Вакцины согласно представленному изобретению необязательно могут быть сформулированы для замедленного высвобождения вируса, молекулы инфекционной РНК, плазмиды или вирусного вектора согласно представленному изобретению. Примеры таких составов с пролонгированным высвобождением включают вирус, молекулу инфекционной РНК, плазмиду или вирусный вектор в комбинации с композитами биосовместимых полимеров, таких как, например, поли(молочная кислота), поли(молочно-гликолевая кислота), метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, коллаген и тому подобное. Структура, выбор и использование разлагаемых полимеров в средствах доставки лекарств были рассмотрены в нескольких публикациях, включая A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Дополнительное руководство по выбору и использованию полимеров в фармацевтических составах может быть найдена в текстах, известных в данной области с уровня техники, например, M. Chasin and R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, N.Y., которая также включена в данный документ посредством ссылки. Альтернативно или дополнительно, вирус, плазмида или вирусный вектор могут быть микрокапсулированы для улучшения введения и эффективности. Способы микроинкапсулирования антигенов хорошо известны в данной области с уровня техники, и включают способы, описанные, например, в патенте США No. 3,137,631; в патенте США No. 3,959,457; в патенте США No. 4,205,060; в патенте США No. 4,606,940; в патенте США No. 4,744,933; в патенте США No. 5,132,117; и Международной патентной публикации WO 95/28227, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

Липосомы могут также быть использованы для обеспечения замедленного высвобождения вируса, плазмиды или вирусного вектора. Подробности относительно того, как изготавливать и использовать липосомные составы, могут быть найдены, среди прочего, в патенте США No. 4,016,100; в патенте США No. 4,452,747; в патенте США No. 4,921,706; в патенте США No. 4,927,637; в патенте США No. 4,944,948; в патенте США No. 5,008,050; и в патенте США No. 5,009,956, все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.

Эффективное количество какой-либо из вышеописанных вакцин может быть определено обычными методами, начиная с низкой дозы вируса, плазмиды вирусного белка или вирусного вектора, а затем увеличивая дозировку, одновременно отслеживая эффекты. Эффективное количество может быть получено после однократного введения вакцины или после многократного введения вакцины. Известные факторы могут быть приняты во внимание при определении оптимальной дозы на животное. К ним относятся вид, размер, возраст и общее состояние животного, наличие других лекарственных средств у животного и тому подобное. Фактическую дозировку предпочтительно выбирают после рассмотрения результатов других исследований на животных (смотрите Примеры 3-7 ниже).

Одним из способов определения того, был ли достигнут адекватный иммунный ответ, является определение сероконверсии и титра антител у животного после вакцинации. Время вакцинации и количество ревакцинаций, если таковые имеются, предпочтительно будет определяться врачом или ветеринаром на основе анализа всех соответствующих факторов, некоторые из которых описаны выше.

Эффективное количество дозы вируса, белка, молекулы инфекционной ДНК, плазмиды или вирусного вектора согласно представленному изобретению может быть определено с использованием известных методик, принимая во внимания факторы, которые могут быть определены специалистом в данной области, такие как масса животного, подлежащего вакцинации. Количество дозы вируса согласно представленному изобретению в вакцине согласно представленному изобретению предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 10¹ до приблизительно 10⁹ БОЕ (бляшкообразующих единиц), более предпочтительно от приблизительно 10² до приблизительно 10⁸ БОЕ, и наиболее предпочтительно от приблизительно 10³ до приблизительно 10⁷ БОЕ. Количество дозы плазмиды согласно представленному изобретению в вакцине согласно представленному изобретению предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 100 мг, более предпочтительно от приблизительно 1 мг до приблизительно 10 мг, еще более предпочтительно от приблизительно 10 мг до приблизительно 1 мг. Количество дозы инфекционной молекулы ДНК согласно представленному изобретению в вакцине согласно представленному изобретению предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 100 мг, более предпочтительно от приблизительно 1 мг до приблизительно 10 мг, еще более предпочтительно от приблизительно 10 мг до приблизительно 1 мг. Количество дозы вирусного вектора согласно представленному изобретению в вакцине согласно представленному изобретению предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 10¹ БОЕ до приблизительно 10⁹ БОЕ, более предпочтительно от приблизительно 10² БОЕ до приблизительно 10⁸ БОЕ, и еще более предпочтительно от приблизительно 10³ до приблизительно 10⁷ БОЕ. Подходящий размер дозировки находится в диапазоне от приблизительно 0,5 мл до приблизительно 10 мл, и более предпочтительно от приблизительно 1 мл до приблизительно 5 мл.

Подходящие дозы для вирусных белковых или пептидных вакцин в соответствии с практикой согласно представленному изобретению находятся в диапазоне от, как правило, от 1 до 50 микрограммов на дозу или более высокие количества, которые могут быть определены стандартными способами, с количеством адъюванта, которое должно быть определено признанными способами в отношении каждого такого вещества. В предпочтительном примере изобретения, касающемся вакцинации свиней, оптимальный возраст для животных составляет от 1 до 21 дня, которая перед отлучением, может также соответствовать другим запланированным прививкам, таким как против Mycoplasma hyopneumoniae или PCV. Кроме того, предпочтительный график вакцинации для племенных свиноматок будет включать аналогичные дозы с ежегодным графиком ревакцинации.

Одним из способов определения того, был ли достигнут адекватный иммунный ответ, является определение сероконверсии и титра антител у животного после вакцинации. Время вакцинации и количество ревакцинаций, если таковые имеются, предпочтительно будет определяться врачом или ветеринаром на основе анализа всех соответствующих факторов, некоторые из которых описаны выше.

Эффективное количество дозы вируса, молекулы инфекционной РНК, плазмиды или вирусного вектора согласно представленному изобретению может быть определено с использованием известных методик, принимая во внимание факторы, которые могут быть определены специалистом в данной области, такие как масса животного, подлежащего вакцинации. Например, вакцины могут доставляться перорально, парентерально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, интраназально или внутривенно. Пероральная доставка может включать, например, добавление композиций к корму или питью животных. Факторы, влияющие на дозировку вакцины, включают, например, массы и возраст свиньи.

Представленное изобретение, кроме того, предусматривает способ получения вакцины, содержащей PRRS вирус, молекулу инфекционной РНК, плазмиду, или вирусный вектор, описанный в данном документе, причем способ включает комбинирование эффективного количества одного из вируса PRRS, молекулы инфекционной РНК, плазмиды или вирусного вектора согласно представленному изобретению, с носителем, приемлемым для фармацевтического или ветеринарного применения.

Кроме того, живая аттенуированная вакцина согласно представленному изобретению может быть модифицирована, как описано в патенте США No. 6,500,662 для кодирования гетерологичного антигенного эпитопа, который вставлен в вирусный геном PRRS с использованием известных рекомбинантных методик. Смотрите также патент США 7,132,106, который включен в качестве ссылки в полном объеме. Антигенные эпитопы, применимые в качестве в качестве гетерологичных антигенных эпитопов для представленного изобретения, включают в себя антигенные эпитопы от патогена свиней, иного, чем вирус PRRS, которые включают, но не ограничиваются этим, антигенный эпитоп из патогена свиней, выбранных из группы, состоящей из свиного парвовируса, свиного цирковируса, свиного цирковируса, свиного гриппа, вируса псевдобешенства, вируса трансмиссивного гастроэнтерита, свиного респираторного коронавируса, классического вируса чумы свиней, вируса африканской чумы свиней, вируса энцефаломиокардита, свиного парамиксовируса, вируса гепатита TTV, вирус трансмиссивного гастроэнтерита, респираторного коронавируса свиньи, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Bacillus anthraci, Bordetella bronchiseptica, Clostridium haemolyticum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Haemophilus parasuis, Leptospira spp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia, Pasteurella multocida, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Streptococcus equismilis, и Streptococcus suis. Нуклеотидные последовательности, кодирующие антигенные эпитопы из вышеупомянутых патогенов свиней, известны в данной области с уровня техники и могут быть получены из общедоступных баз данных генов во всемирной сети, таких как Genbank из (США) Национального центра биотехнологической информации.

Дополнительные признаки и варианты изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники из всей этой заявки, включая подробное описание, и все такие признаки предназначены в качестве аспектов изобретения. Аналогичным образом, признаки изобретения, описанного в данном документе, могут быть повторно объединены в дополнительные варианты осуществления изобретения, которые также предназначены в качестве аспектов изобретения, независимо от того, конкретно ли указана комбинация признаков в качестве аспекта или варианта осуществления изобретения. Кроме того, только такие ограничения, которые описаны в данном документе как критические для изобретения, должны рассматриваться как таковые; варианты изобретения, в которых отсутствуют ограничения, которые не были описаны в данном документе как критические, предназначены в качестве аспектов изобретения. Будет понятно, что изобретение может быть осуществлено иначе, чем конкретно описано в указанном выше описании и примерах.

Соответственно, вакцина против PRRS, основанная на вирусе SEQ ID NO:5 будет рассматриваться как репрезентативная для тех, которые имеют профиль безопасности и эффективности, который обеспечивает значительное улучшение, позволяющее успешно проводить вакцинацию поросят, даже в первый день жизни, с продолжительным иммунитетом до приблизительно 6 месячного возраста, Такие беспрецедентные улучшения эффективности вакцин неожиданно обеспечиваются культивированием и ослаблением вируса в среде культивирования клеток, которая максимизирует отношение к биологии свиней, в том числе путем разрешения соответствующей и безопасной репликации вируса в хозяине-свинье, не снижая при этом необходимый иммунный ответ хозяина. Такие преимущества предоставляются для поросят, кабанов, и свиноматок и молодых свиней (как до, так и во время беременности); и во всех случаях, является ли животное серопозитивным или сероотрицательным во время вакцинации.

Очевидным также является то, что усовершенствования в области культивирования согласно представленному изобретению в равной степени применимы к европейским вирусам независимо от того, используются ли они, подвергались или будут подвергаться манипулированию рекомбинантными средствами или только были выделены, сохранены или культивированы и адаптированы преимущественно не рекомбинантными средствами; во всех случаях, включая вопрос о том, являются ли какие-либо используемые клетки для культивирования сами по себе рекомбинантными или нет.

Многочисленные модификации и вариации представленного изобретения возможны в свете вышеприведенных идей и, следовательно, находятся в пределах объема изобретения.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения изобретения.

Пример 1 - Генерирование клеточной линии BHK21-C12-26

Генерирование клеточной линии BHK21-C12, родителя клеточной линии BHK21-C12-26, используемой в этих исследованиях, было ранее описано в US 9,102,912. В данном патенте клеточная линия BHK21-C12 упоминается как BHK/CMV/v11 #12 в Примере 14 и на Фигуре 6. Вкратце, обычно используемая клеточная линия BHK-21 почки новорожденного хомяка была трансфицирована плазмидой pCMV-susCD163v1, которая содержит усеченный вариант (v1) свиного (sus) CD163 PRRSV рецепторного гена, под контролем промотора CMV. Плазмида также содержит устойчивости к канамицину/неомицину под контролем двойных прокариотических/эукариотических промоторов для селекции в клетках E. coli и млекопитающих, соответственно. После трансфекции клетки подвергали одновременному отбору с G418 (Geneticin, аналог неомицина) и клонированию отдельных клеток в 96-луночных планшетах. Один из полученных в результате клонов (#12, или “C12”) был выбран для дальнейшего использования и обозначен как BHK21-C12.

Клеточную линию BHK21-C12 серийно пассировали 65 раз под селекцией G418 и сохраняли PRRSV-пермиссивный фенотип. При пассаже 64 было обнаружено, что несколько клеток выжили после заражения вирусом PRRS, что указывает на ранние стадии фенотипической нестабильности. Было проведено дополнительное клонирование отдельных клеток, и многие новые клоны были оценены на предмет наличия PRRSV-пермиссивного фенотипа и общих характеристик роста. Из них был выбран клон #26 за то, что он превосходит другие клоны и родительскую клеточную линию BHK21-C12. Клон #26 был обозначен BHK21-C12-26, и использовался для ослабления вируса PRRS 96V198.

Пример 2 - дополнительные клетки, подходящие для адаптации и культивирования вируса, который является безопасным и эффективным в очень раннем возрасте, например, для вакцинации в 1-й день после рождения

Клетки PK-9 представляют собой линию трансгенных клеток, полученную путем стабильного трансфектирования клеточной линии почки свиньи PK0809 плазмидой, кодирующей удаленную версию гена CD163 свиньи и гена устойчивости к неомицину. Детали конструкта и характеристики клеточной линии PK-9 были описаны ранее (смотрите патент США 9,102,912).

Следует отметить, что адаптация вируса первого пассажа из клеток PAM к росту на клетках PK-9 может быть затруднена и требует нескольких попыток с несколькими параллельными клеточными линиями. В этом случае инфекция может контролироваться с использованием иммунофлюоресценции дублированных лунок с использованием FITC-конъюгированного моноклонального антитела SDOW17, специфичного для вирусного нуклеокапсидного белка (Rural Technologies Inc, Brookings South Dakota). Ранние пассажи могут в результате привести к появлению нескольких небольших очагов и не генерировать достаточное количество бесклеточных вирусных частиц для того, чтобы инициировать заражение свежего монослоя. Данные пассажи, тем не менее, могут быть выполнены путем обработки инфицированного монослоя акутазой (заменителем трипсина) и повторного посева клеток в несколько лунок со свежей средой с добавлением или без добавления неинфицированных клеток PK-9. После нескольких таких пассажей некоторые линии должны демонстрировать явное увеличение частоты и размера флуоресцентных очагов. Некоторые из них должны приобрести способность к пассированию с использованием бесклеточных вирусных жидкостей. Как правило, ожидается, что соответствующие пассажи свидетельствуют о сниженной способности ингибировать альфа-интерферон.

Безопасность и эффективность вакцин против европейского PRRS согласно изобретению дополнительно подтверждаются экспериментальными протоколами и данными, содержащими примеры 3-7, которые следуют далее.

Пример 3 - Продолжительность иммунитета, обеспечиваемого европейским PRRS MLV, введенным поросятам в возрасте 1 день, с последующим контрольным заражением дополнительным европейским изолятом PRRSV приблизительно через 26 недель после вакцинации.

Цель исследования состояла в том, чтобы оценить продолжительность иммунитета (DOI) модифицированной живой вакцины против европейского PRRS (вируса, кодируемого SEQ ID NO: 5) у свиней, вакцинированных в возрасте 1 дня внутримышечным (в.м., группа T02) или интраназальным (и.н., группа T03) способом с последующим респираторным контрольным заражением через 26 недель после вакцинации другим европейским изолятом PRRSV. Основной переменной при определении эффективности была вирусная нагрузка в сыворотке крови (виремия) в группах обработки T02 и T03 по сравнению со свиньями T01. Поражения легких, ректальные температуры, выделения, клинические признаки и масса тела сравнивались как вторичные переменные.

В возрасте 1 дня свиньям из групп T02 и T03 вводили однократную дозу IVP по 2 мл внутримышечным (T02) или интраназальным (T03) способом. Свиньи из контрольной группы (Т01) получали 2 мл внутримышечно и 2 мл интраназально солевого физиологического раствора. Через 26 недель после вакцинации (182 дня) свиней контрольно заражали интраназально изолятом EU PRRSV Olot/91 (смотрите J. Duran et al., Virus Genes, vol 14 No. 1., 1997, pp 19-29 и Z. Lu et al., Virology Journal, vol 11, No 42, 2014) в качестве респираторного контрольного заражения. Во время фазы контрольного заражения пробы крови, мазки из носа и рта, клинические наблюдения и ректальные температуры собирали каждые 3-4 дня до дня вскрытия. Свиней взвешивали перед вакцинацией, перед контрольным заражением и при вскрытии. Через девять или десять дней после контрольного заражения свиней умерщвляли и подвергали вскрытию. После вскрытия легкие оценивались на наличие повреждений PRRSV и оценивались. Исследование было действительным, так как все свиньи T01 оставались вирусно-отрицательными на PRRSV в течение периода вакцинации, и не было обнаружено никаких смешанных факторов заболевания.

При сравнении вирусной нагрузки в сыворотке крови между группами наблюдался защитный эффект вакцинации как в.м., так и и.н. Обе группы, вакцинированные IVP (T02 и T03), имели значительно (P≤0,05) более низкие титры вируса по сравнению с контрольной группой во все дни отбора проб после контрольного заражения (3, 6, 8 и 9/10, что соответствует дням исследования 185, 188, 190 и 191/192). Эффективность также подтверждается значительным снижением поражений легких, связанных с PRRSV, при вскрытии, а также значительным снижением выделения из носа и рта в обеих вакцинированных группах по сравнению с контрольной группой.

Сравнение между вакцинированными группами показало, что через 3 дня после контрольного заражения группа, вакцинированная и.н. способом (T03), имела значительно более низкую виремию, выделение из носа и пероральное выделение по сравнению с группой, вакцинированной в.м. способом (T02). Данные результаты показывают, что в условиях представленного исследования защита, полученная после вакцинации и.н. способом, была сильнее, чем после вакцинации в.м. способом.

Вакцинация индуцировала развитие PRRSV-специфичных антител в пределах 28 дней после вакцинации. Все вакцинированные свиньи были серопозитивными к антителам PRRS при контрольном заражении (через 26 недель после вакцинации), что указывает на то, что оба способа введения могли вызывать сильный и защитный ответ антител на вакцинацию. Однако уровень титров антител, обнаруженных при контрольном заражении, был значительно выше в группе, вакцинированной и.н. способом, по сравнению с группой, вакцинированной внутримышечно, что объясняло бы значительное снижение вирусной нагрузки, обнаруженной как в сыворотке, так и в путях экскреции в и.н. группе по сравнению с в.м. группой через 3 дня после контрольного заражения.

В заключение, результаты данного исследования продемонстрировали, что однократное введение вакцины EU PRRSV MLV (SEQ ID NO:5), содержащей дозу 2,5 log10 CCID50 поросятам в возрасте 1 день внутримышечным или интраназальным способом давало защитную продолжительность иммунитета 6,5 месяцев (26 недель).

Сокращения, используемые в примерах 3-7, включают: AAALAC, Ассоциация по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными животными; AE, неблагоприятное событие; CCID50, 50% инфекционная доза клеточной культуры; CP, контрольный продукт; DC, День контрольного заражения; DCF, форма сбора данных; DRAC, ежедневный обзор по уходу за животными; ID, идентификация; IF, иммунофлуоресценция; в.м., внутримышечно; и.н., интраназально; в.в., внутривенно; IVP, исследовательский ветеринарный продукт; MDA, материнские антитела; MLV, модифицированная живая вакцина; MSF, ведущая документация исследования; MSV, исходный вакцинный вирус; NA, неприменимо; PAM, свиные альвеолярные макрофаги; PRRSV, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней; PBS, Фосфатный буферный солевой раствор; RT-qPCR, количественная обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция; SART, отчет о больных животных и лечении; SOP, стандартная операционная процедура; S/P, образец к положительному; и TBD, подлежит определению.

Дизайн

В возрасте 1-ого дня дозу 2 мл (в.м. способ введения) и дозу 2 мл (и.н. способ введения) CP вводили поросятам T01. Кроме того, однократную дозу 2,0 мл IVP вводили поросятам T02 путем в.м. введения и поросятам T03 путем и.н. введения. Через двадцать шесть недель после вакцинации свиней осуществляли контрольное заражение PRRSV Olot/91, и через 9-10 после контрольного заражения их подвергали эвтаназии и вскрытию. День 0 = День вакцинации.

Рандомизация

Непосредственно после рождения поросят смешено вскармливали таким образом, что поросята были рандомизированы и как можно более равномерно распределены по всем свиноматкам. При отлучении свиноматок удаляли, и поросят содержали в загонах на ферме-источнике (1 загон на обработку).

Определенные параметры для животных являются следующими:

Двенадцать беременных свиноматок были использованы для получения 117 поросят. За день до предполагаемой даты опороса роды были вызваны внутримышечной инъекцией клопростенола (Cyclix® Porcino, Virbac). Все свиноматки опоросились на следующий день (D-1). Для сокращения продолжительности родов и количества мертворожденных поросят всем свиноматкам, кроме двух (71 и 78, у которых уже закончился опорос), инъекционно вводили окситоцин (Partovet® DFV).

Во время фазы вакцинации, 8 поросят умерли или были подвергнуты эвтаназии. Из оставшихся 109 поросят, 55 были взяты для представленного исследования.

Для того, чтобы уменьшить агрессивное и сексуальное поведение у самцов свиней в более старшем возрасте, поросят кастрировали в 6-дневном возрасте, следуя методам содержания животных, специфичным для конкретного участка. Три поросенка (232, 284 и 286) не могли быть кастрированы, потому что у них была мошоночная грыжа.

Примерно через 1 месяц после вакцинации, две внезапные смерти с одинаковыми патологическими признаками вместе с наличием белых пятен на полу и у некоторых свиней с белой мочой в конце процесса мочеиспускания свидетельствуют о бактериальной инфекции, поражающей мочевыводящие пути. Считалось, что данный процесс не оказал влияния на результаты исследования, поскольку все животные хорошо реагировали на лечение, и никаких других случаев не наблюдалось в течение остальной фазы вакцинации (следующие 3 месяца до контрольного заражения). Какое-либо животное с травмой или клиническим заболеванием, не связанным с процедурой исследования, которая может повлиять на здоровье животного и оценку результатов, может быть исключено из исследования по усмотрению исследователя. Исследовательский ветеринарный продукт (IVP) был получен из лиофилизированной фракции, которую снова суспендировали в физиологическом растворе при 2,5 log₁₀CCID₅₀/мл (SEQ ID NO: 5 вирус).

Реконструкция

В день 0, IVP разбавляли вакцинным разбавителем (партия T22019), чтобы соответствовать целевому титру (2,5 log₁₀ CCID₅₀/2 мл). Одну аликвоту IVP собирали для титрования на клетках BHK-21-C12-26 для подтверждения дозировки. Дополнительный образец IVP замораживали (-80 ± 10°C) и хранили в качестве контрольного образца. Титрование на клетках BHK-21-C12-26 проводили в соответствии с местными стандартными процедурами. Восстановленная и разбавленная вакцина имела титр 10^1,9 CCID₅₀/мл, что соответствует 10^2,2 CCID₅₀/ 2 мл (2,2 log₁₀CCID₅₀/ 2 мл). В день 0 IVP разбавляли вакцинным разбавителем (партия T22019) для того, чтобы соответствовать целевому титру (2,5 log₁₀ CCID₅₀ / 2 мл). Одну аликвоту IVP собирали для титрования на клетках BHK-21-C12-26 для подтверждения дозировки. Дополнительный образец IVP замораживали (-80 ± 10°C) и хранили в качестве контрольного образца. Титрование на клетках BHK-21-C12-26 проводили в соответствии с местными стандартными процедурами. Восстановленная и разбавленная вакцина имела титр 10^1,9 CCID₅₀ / мл, что соответствует 10^2,2 CCID₅₀ / 2 мл (2,2 log₁₀CCID₅₀/ 2 мл), контрольный продукт (CP) представлял собой разбавитель вакцины (физиологический раствор) и вводился в виде 4,0 мл (2,0 мл в.м. + 2,0 мл и.н.).

В день 0 поросят вакцинировали IVP или CP, как описано. Поросятам групп T01 и T02 инъекционно вводили внутримышечно правую сторона шеи. Поросятам групп T01 и T03 вводили интраназально, доставляя 1,0 мл в каждую ноздрю.

Введение контрольного заражения

Всех свиней подвергали контрольному заражению интраназально (и.н.) с общим объемом контрольного заражения 2,0 мл путем закапывания 1,0 мл материала контрольного заражения в каждую ноздрю с вирусом Olot / 91 при титре 10^5,7 CCID₅₀ / 2 мл.

Результаты- вирусемия

Все свиньи были отрицательными на ОТ-кПЦР (количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) PRRSV в сыворотке крови перед вакцинацией (D0) и перед контрольным заражением (D181). После контрольного заражения, 100% свиней из группы T01 становились виремическими в день 185 (3 дня после заражения, DC+3) и оставались положительными до конца исследования. В вакцинированных группах 100% (группа T02) и 88% (T03) свиней также были положительными в DC+3. Однако процент положительных свиней в обеих вакцинированных группах снизился во времени и стал значительно ниже в DC+8 и в день вскрытия (DN) по сравнению с контрольной группой T01.

В обеих вакцинированных группах количество вирусной нагрузки, обнаруженной в сыворотке, также было значительно сниженным по сравнению с группой Т01 во все дни отбора образцов после заражения. В день 185 (DC+3) также наблюдалось значительное снижение вирусных титров в группе T03 по отношению к T02. Таблица 1 суммирует результаты вирусемии в течение 10-дневного периода после контрольного заражения.

N: количество; SE: стандартная ошибка; CB: доверительный предел; D = день исследования; DC: день контрольного заражения; DN: день вскрытия; ОТ-кПЦР-положительная: > 1,7 log10 РНК-копий/мл.

Назальные выделения

Все свиньи были отрицательными на PRRSV по ОТ-кПЦР в назальных мазках перед контрольным заражением (D181). После контрольного заражения, все свиньи из T01 стали иметь назальные выделения. В вакцинированных группах, процент свиней, которые имели выделения назальным путем, составлял 94% (T02 группа) и 88% (T03 группа). Что касается группы T01, значительное снижение процента назальных выделений наблюдалось в группе Т03 на день 185, 188 и 191/192 (DC+3, DC+6 и DN) и в группе Т02 на день 191/192 (DN). Никаких значительных разниц в проценте назальных выделений между вакцинированными группами обнаружено не было. Количество вируса, выделяемое назальным путем, было в значительной мере выше в группе T01 по сравнению с группой T02 в DC+6 и DN, и по сравнению с группой T03 в DC+3, DC+6 и DN. Сравнение между вакцинированными группами продемонстрировало, что вирусные титры в группе Т02 были в значительной мере более высокими по сравнению с T03 в DC+3. Таблица 2 суммирует результаты назальных выделений в течение 10-дневного периода после контрольного заражения.

N: количество; SE: стандартная ошибка; CB: доверительный предел; D = день исследования; DC: день контрольного заражения; DN: день вскрытия; ОТ-кПЦР-положительная: > 1,7 log10 РНК-копий/мл.

Выделения из ротовой полости

Все свиньи были отрицательными на PRRSV по ОТ-кПЦР в выделениях из полости рта перед контрольным заражением (D181). После контрольного заражения, часть свиней, которые имели выделения оральным путем составила 9/20 (45%), 8/18 (44%) и 7/17 (41%) в группах T01, T02 и T03, соответственно. К концу исследования, все свиньи из группы Т02 и все кроме одной в группе Т03 были отрицательными в выделениях из полости рта. В контрольной группе T01, 5/20 были все еще положительными на тот момент времени; различия в проценте выделений из полости рта между T01 и T02 были статистически значимыми в конце исследования (DN). Количество вируса, выделяемое оральным путем, было в значительной мере выше в группе T01 по сравнению с группой T03 на день вскрытия, что соответствует 9/10 дням после контрольного заражения. Вирусная нагрузка также была в значительной мере более высокой в группе Т02 по сравнению с как T01, так и T03 на день 185 (DC+3). Таблица 3 суммирует результаты выделений из полости рта в течение 10-дневного периода после контрольного заражения.

N: количество; SE: стандартная ошибка; CB: доверительный предел; D = день исследования; DC: день контрольного заражения; DN: день вскрытия; ОТ-кПЦР-положительная: > 1,7 log10 РНК-копий/мл.

Клинические наблюдения

Ни у одной из свиней не было ненормального общего состояния, депрессии, дыхательной недостаточности, кашля или чихания в течение всего периода после контрольного заражения.

Ректальные температуры

Таблица 4 суммирует результаты ректальной температуры в течение периода после контрольного заражения. В группе T01, у 5/20 свиней (25%) была лихорадка (RT ≥ 40,5), по меньшей мере, один раз в течение периода после контрольного заражения. В вакцинированных группах T02 и T03, часть свиней, у которой была лихорадка после контрольного заражения, составляла 8/18 (44%) и 12/17 (71%), соответственно. Ректальные температуры были в значительной мере выше в обеих вакцинированных группах T02 и T03 по сравнению с группой T01, на день 185 (DC+3).

LSM: Средние значения полученные методом наименьших квадратов; SE: Стандартная ошибка; CB: доверительный предел; RT: Ректальной температуры

Поражения легких

Процент легких с поражениями для каждой группы лечения показан в таблице 5. Визуальные оценки легких показаны в таблице 6. При вскрытии, 18/20 свиней (90%) из контрольной группы T01 имели положительный визуальный балл легких, что указывает на то, что контрольное заражение PRRSV было успешным в индуцировании поражений легких. . В группах T02 и T03, 12/17 (71%) и 7/16 (44%) свиней также получили положительные результаты. У одной свиньи из группы T03 (#300) наблюдалась катарально-гнойная плевропневмония, поражающая от 10 до 70% правых долей легкого, от 2 до 30% левых долей легкого и 70% от вспомогательной доли, таким образом маскируя присутствие какие-либо потенциальные поражения, связанные с PRRSV. Данные от этой свиньи были маркированы из анализа (смотрите доклад по маркировке в MSF). Процент легких с поражениями, наблюдаемыми при вскрытии, был значительно выше в контрольной группе T01 по сравнению с вакцинированными группами T02 и T03. Не было обнаружено никаких различий между вакцинированными группами.

Результаты серологии (ИФА)

Краткое изложение результатов серологии показано в таблице 7. Результаты ИФА, полученные из образцов, собранных с месячными интервалами во время фазы вакцинации, суммированы только с описательной статистикой (среднее геометрическое значение и стандартные отклонения); различия между группами не могли быть оценены, потому что не было репликации экспериментальной единицы (лечение не было замаскировано). Различия между группами были исследованы только на 181-й день исследования, после того, как животные появились в фазе контрольного заражения. Все свиньи были отрицательными по ИФА перед вакцинацией (соотношение IDEXX S/P < 0,4). Свиньи из контрольной группы T01 оставались отрицательными до контрольного заражения. Через один месяц после вакцинации (28-ой день) все свиньи из групп T02 и T03 уже выработали антитела к PRRSV, и все они оставались положительными на момент контрольного заражения (через 6,5 месяцев после вакцинации). Сравнение между группами на день 181 (DC-1) продемонстрировало значительно более высокие средние значения по методу наименьших квадратов титров антител в группе T03 по сравнению с группой T02.

Вирусемия и выделения

Перед статистическим анализом ОТ-кПЦР преобразовали с использованием соответствующего логарифмического преобразования. Преобразованные данные были проанализированы с использованием общей линейной смешанной модели с повторными измерениями. Попарное сравнение обработки проводилось в каждый момент времени, если эффект лечения или лечения в момент времени был значительным (P≤0,05). Среднее значение по методу наименьших квадратов и 95% доверительные интервалы лечения были обратно преобразованы для представления. Процент вирусемических/с выделениями животных также был рассчитан. Каждый образец был определен как положительный, если> 50 копий РНК PRRSV / мл (1,7 log10 копий РНК PRRSV / мл), что соответствует половине предела обнаружения метода (100 копий РНК PRRSV / мл). Кроме того, было определено, было ли животное когда-либо вирусемическим или когда-либо были у него выделения в течение Дней ≤ DC (касается периода перед контрольным заражением) и Дней > DC (после контрольного заражения). Таблицы частот для статуса вирусемия были рассчитаны для каждой точки времени, если у животного когда-либо была вирусемия в течение нескольких дней до контрольного заражения и дней после контрольного заражения.

Ректальные температуры

Ректальные температуры были проанализированы с использованием анализа общей линейной смешанной модели с повторными измерениями. Попарное сравнение обработки проводилось в каждый момент времени, если эффект лечения или лечения в момент времени был значительным (P≤,05). Среднее значение лечения по методу наименьших квадратов, 95% доверительные интервалы, максимум и минимум были рассчитаны для каждой временной точки. Описательные статистические данные, средние значения, стандартные отклонения и диапазоны были рассчитаны для каждого лечения и дня исследования до контрольного заражения.

Распределения частот животных с лихорадкой (ректальная температура 40,5°C) рассчитывали для каждой обработки и собирали данные по временным точкам. Было определено, была ли у животного лихорадка в течение дней ≤ DC и дней > DC. Таблицы частот для случаев, когда у животного когда-либо была лихорадка, были рассчитаны для каждого периода, дни ≤ DC и дни > DC.

Серология (ИФА)

Перед статистическим анализом серология была преобразована, где это необходимо, с использованием соответствующего логарифмического преобразования. Преобразованные серология серологические данные анализировали с использованием общей линейной смешанной модели с повторными измерениями. Сравнения парного лечения проводили в каждый момент времени, если эффект лечения или лечения в момент времени был значительным (P ≤ 0,05). Среднее значение по методу наименьших квадратов и 95% доверительные интервалы лечения были обратно преобразованы для представления. Кроме того, частотные распределения положительных/отрицательных результатов были рассчитаны для каждой обработки в каждый момент времени. Кроме того, для каждого животного было определено, является ли оно сероконвертированный (≥ 0,4 соотношение S/P) в какое-либо время в течение исследования. Распределения частот того, является ли животное сероконвертированным или нет, рассчитывали для каждой обработки. Описательные статистические данные, средние значения, стандартные отклонения и диапазоны были рассчитаны для каждой обработки, перед контрольным заражением.

Клинические наблюдения

Частотные распределения клинических признаков перед контрольным заражением и клинических признаков после контрольного заражения рассчитывали отдельно для каждой обработки и собирали данные в определенные точки времени. Частотные распределения того, имело ли животное когда-либо клинический признак, для каждой фазы (дни ≤ DC и дни > DC), рассчитывали для каждой обработки.

Массы тела

Массы тела анализировали с использованием общей линейной смешанной модели с повторными измерениями. Среднее значение лечения по методу наименьших квадратов, стандартные ошибки, 95% доверительные интервалы, максимумы и минимумы были рассчитаны для каждой обработки в каждой временной точки. Сравнения парного лечения проводили между обработками в каждый момент времени, если эффект лечения или лечения по взаимодействию в момент времени был значительным (P ≤ 0,05). Стандартные ошибки и 95% доверительные интервалы оценок были рассчитаны. Описательные статистические данные, средние значения, стандартные отклонения и диапазоны были рассчитаны для каждой обработки, перед контрольным заражением. Оценки среднего ежедневного прироста и сравнения были рассчитаны с использованием оценок параметров из модели.

Поражения легких

Процент всего легкого с поражениями рассчитывали по следующей формуле: Процент всего легкого с поражениями = (0,10 х левой краниальной части) + (0,10 x левой средней части) + (0.25 x левой каудальной части) + (0,10 x правой краниальной части) + (0,10 x правой средней части) + (0.25 x правой каудальной части) + (0,10 x придаточной части). Преобразование квадратного корня арксинуса применяли к проценту от общей части легких с поражениями до анализа. Трансформированные поражения легких анализировали по общей линейной смешанной модели. Попарное сравнение было сделано между группами лечения, если эффект лечения был значительным. Рассчитывали обратно преобразованные средние значения по методу наименьших квадратов процента общей части легкого с поражениями, их стандартные ошибки, и их 95% доверительные интервалы, а также минимумы и максимумы.

Баллы оценки поражения легкого

Частотные распределения баллов оценки поражения легких рассчитывали для каждой обработки. Баллы, нормальные или ненормальные, были проанализированы с использованием обобщенной линейной смешанной модели для биномиальных данных. Если общая линейная смешанная модель не сходилась, для анализа данных использовался точный критерий Фишера. Если основной эффект лечения был значительным, то проводилось попарное сравнение лечения.

Модели для анализов

Преобразованный процент от общей части легкого с поражениями анализировали с использованием общей линейной смешанной модели с фиксированными эффектами, лечением, и случайными эффектами загона и блока в пределах загона. Линейные комбинации оценок параметров использовались в априорных контрастах после тестирования касательно значительного (P≤0,05) эффекта лечения. Сравнения были сделаны между обработками. Уровень значимости 5% (P≤0,05) использовался для оценки статистических различий. Средние значения по методу наименьших квадратов (обратное преобразование), стандартные ошибки, 95% доверительные интервалы средних значений и диапазонов были рассчитаны для каждой обработки.

Статус вирусемии анализировали с использованием общей линейной смешанной модели с повторными измерениями с логит-связью с фиксированными эффектами: обработка, момент времени и влияние контрольного момента времени на результаты лечения, а также случайные эффекты: загон, блок в пределах загона и животное в пределах блока, загон и лечение, которое относится к термину «животное». Линейные комбинации оценок параметров использовались в априорных контрастах после исследования касательно значительного (P ≤ 0,05) эффекта лечения или влияние контрольного момента времени на результаты лечения. Сравнения были сделаны между обработками в каждый момент времени. Уровень значимости 5% (P ≤ 0,05) использовали для оценки статистических различий. Средние значения по методу наименьших квадратов (обратно преобразованные), стандартные ошибки, и 95% доверительные интервалы средних значений были рассчитаны для каждой обработки и момента времени. Если модель не сходилась, для анализа данных использовался точный критерий Фишера.

Баллы оценки легкого, нормальные/ненормальные, и, если когда-либо, вирусемии были проанализированы с использованием обобщенной линейной смешанной модели с фиксированными эффектами лечения и случайными эффектами: загон, блок в пределах загона с использованием GLIMMIX. Если основной эффект лечения был значительным, то проводились попарные сравнения лечения. Если GLIMMIX не сходился, для анализа данных использовался точный критерий Фишера.

Вирусная нагрузка, серология, масса тела, и ректальные температуры анализировались с использованием обобщенной линейной смешанной модели с повторными измерениями с фиксированными эффектами: обработка, момент времени, и влияние контрольного момента времени на результаты лечения, и случайные эффекты: загон, блок в пределах загона и животное в пределах блока, загон и лечение, которое относится к термину «животное». Линейные комбинации оценок параметров использовались в априорных контрастах после исследования касательно значительного (P ≤ 0,05) эффекта лечения или или влияние контрольного момента времени на результаты лечения. Сравнения были сделаны между обработками в каждый момент времени. Уровень значимости 5% (P ≤ 0,05) использовали для оценки статистических различий. Средние значения по методу наименьших квадратов (обратно преобразованные касательно вирусной нагрузки и серологии), стандартные ошибки, 95% доверительные интервалы средних значений и диапазонов были рассчитаны для каждой обработки и момент времени. Все исследования гипотез были проведены на уровне значимости 0,05 с использованием двусторонних критериев.

Обсуждение

Таким образом, цель представленного исследования состояла в том, чтобы оценить продолжительность иммунитета (DOI) модифицированной живой вакцины ЕС PRRS (SEQ ID NO: 5) у свиней, вакцинированных в возрасте 1-ого дня путем внутримышечного (в.м., группа T02) или интраназального (и.н., группа T03) введения при инокуляции изолятом PRRS генотипа I в качестве респираторного контрольного заражения через 26 недель после вакцинации. Основной переменной при определении эффективности была вирусная нагрузка в сыворотке крови (вирусемия) в группах обработки T02 и T03 по сравнению со свиньями T01. Поражения легких, ректальные температуры, выделения, клинические признаки и масса тела сравнивались в качестве вторичных переменных.

Исследование было действительным, поскольку все свиньи T01 оставались вирусно-отрицательными на PRRSV в течение периода вакцинации, и не было обнаружено никаких смешанных факторов заболевания. Защитный эффект вакцинации как в.м., так и и.н. наблюдался при сравнении вирусной нагрузки в сыворотке крови между группами; контрольная группа T01 имела значительно более высокие вирусные титры по сравнению с вакцинированными группами T02 и T03 во все дни отбора проб после контрольного заражения. Кроме того, по отношению к контрольной группе доля виремических свиней также была значительно сниженной на 8-ой и 9/10-ый день после контрольного заражения в обеих вакцинированных группах. Когда сравнивали вакцинированные группы, значительно более низкие титры вируса были обнаружены на 185 день (DC + 3) в группе, вакцинированной и.н. путем (T03), по сравнению с группой, вакцинированной внутримышечно (T02). Преимущество как в.м., так и и.н. вакцинации в отношении репликации вируса также подтверждается значительным снижением, наблюдаемым в обеих вакцинированных группах, количества вируса, выделяемого назальным путем, а также процента назальных выделений. Кроме того, положительный эффект вакцинации также наблюдался по выделениям полости рта на 9/10-ые дни после контрольного заражения, о чем свидетельствует значительное снижение вирусной нагрузки (группа T03) или процент положительных свиней по выделениям из полости рта (группа T02) по отношению к контрольной группе.

После контрольного заражения, ректальные температуры были в значительной мере выше в обеих вакцинированных группах по сравнению с контрольной группой в DC+3. В тоже время доля свиней с лихорадкой (RT≥40,5°C) в группах, вакцинированных IVP в.м. и и.н. способом, составляла 6/18 (33%) и 9/17 (53%), соответственно. В контрольной группе, только у 1/20 (5%) была лихорадка в DC+3. Однако следует отметить, что в то время (DC + 3) вирусная нагрузка, обнаруженная в сыворотке крови, действительно значительно снижалась в обеих вакцинированных группах по сравнению с контрольной группой, что позволяет предположить, что репликация PRRSV, вероятно, была не единственной причиной повышенной ректальной температуры, наблюдаемой у вакцинированных свиней вскоре после контрольного заражения. Кроме того, с тех пор ректальные температуры у вакцинированных свиней снижались, и к 8-му дню после заражения средние ректальные температуры во всех группах уже были ниже 40°C.

Помимо повышенных ректальных температур, ни у одной из свиней ни в одной группе не было клинических признаков, сопоставимых с PRRSV (ненормальное состояние тела, депрессия, респираторный дистресс, кашель или чихание) в течение всего периода после контрольного заражения. Кроме того, между группами не было обнаружено никаких различий в массе тела или среднесуточном приросте массы.

При вскрытии 18/20 свиней (90%) из контрольной группы T01 имели положительный визуальный показатель легких, что указывает на то, что заражение PRRSV было успешным касательно индуцирования поражения легких. В группах T02 и T03 12/17 (71%) и 7/16 (44%) свиней также дали положительные результаты. Сравнение между группами лечения показало значительно более высокий % легкого с поражениями в контрольной группе, чем в вакцинированных группах, демонстрируя преимущество вакцинации за счет уменьшения поражений легких, связанных с PRRSV, независимо от способа введения.

Серологические данные продемонстрировали, что вакцинация с использованием IVP с использованием в.м. или и.н. способа индуцировала развитие PRRSV-специфичных антител в течение 28 дней после вакцинации. Все вакцинированные свиньи были сероположительными к антителам PRRSV при контрольном заражении (через 6,5 месяцев после вакцинации), что указывает на то, что оба способа введения могли вызывать сильный и защитный ответ антител на вакцинацию. Однако сравнение между вакцинированными группами показало значительно более высокие титры антител в группе, вакцинированной и.н. способом введения, по сравнению с группой, вакцинированной в.м. путем способом введения.

Хотя вакцинация и.н. и в.м. способом обеспечивала четкую защиту от PRRSV в контрольном заражении через 26 недель после вакцинации, сравнение между группами продемонстрировало, что через 3 дня после контрольного заражения у группы, вакцинированной и.н. способом (T03), была значительно более низкая вирусемия, выделения из носа и выделения из полости рта по сравнению с группой, вакцинированной внутримышечно (T02). Данные результаты показывают, что в условиях представленного исследования защита, полученная после и.н. вакцинации, была сильнее, чем после в.м. вакцинации. Данные различия в вирусологическом результате могли бы быть объяснены значительно более высокими титрами антител, обнаруженными ИФА перед контрольным заражением в группе, вакцинированной и.н. (диапазон соотношения S/P: 0,665-2,422), по сравнению с группой вакцинированных в.м. (диапазон соотношений S/P: 0,477-1,959).

Вакцинация путем однократного введения вакцины MLV EU PRRS (SEQ ID NO: 5), содержащей дозу 2,5 log10 CCID50, сероотрицательным свиньям в 1-дневном возрасте, либо в.м., либо и.н. способом, обеспечивала иммунитет продолжительностью 26 недель, так как это видно по значительному снижению вирусной нагрузки, обнаруженной в сыворотке после контрольного заражения патогенным штаммом EU PRRSV через 26 недель после вакцинации. Эффективность также была подтверждена значительным снижением процента поражений легких при вскрытии, а также уменьшением выделения из носа и полости рта.

Лабораторные способы

Касательно ОТ-кПЦР, вирусемия (нагрузка PRRSV в сыворотке) и выделения (нагрузка PRRSV в материале мазка) измеряли с помощью кПЦР с обратной транскрипцией (ОТ), выполняемой после локальной SOP на образцах сыворотки, собранных перед вакцинацией (D-1), перед контрольным заражением (D62) и в 3, 5, 7 и 10-ый дни после контрольного заражения (D66, D68, D70 и D73). Вкратце, очищенная вирусная РНК использовалась в качестве матрицы, транскрибированной обратно при 50°C в течение 30 минут и денатурированной при 95°C в течение 5 минут. ПЦР программа ответа состояла из 40 циклов денатурации при 95°C в течение 20 секунд и ренатурации при 53°C в течение 40 секунд. ОТ-кПЦР проводили в термоблоке система ПЦР в реальном времени7500. Подходящие праймеры и зонд были выбраны для вируса Лелистада следующим образом:

Прямой праймер (Лелистад F): 5'-GCACCACCTCACCCAGAC-3' (SEQ ID NO: 6, конечная концентрация 0,5 микромоль).

Обратный праймер (Лелистад R): 5'-CAGTTCCTGCGCCTTGAT-3' (SEQ ID NO:7, конечная концентрация 0,5 микромоль).

Зонд (Лелистад S): 5'-6-FAM- CCTCTGCTTGCAATCGATCCAGAC -TAMRA-3' (SEQ ID NO:8, конечная концентрация 0,6 микромоль).

Серология (ИФА)

Сыворотки, собранные перед вакцинацией (D0), перед контрольным заражением (D67) и при вскрытии (D77), исследовали на антитела к PRRSV с использованием ИФА IDEXX PRRS X3, следуя инструкциям производителя. Вкратце, образцы сыворотки разводили 1:40 в 96-луночном планшете, покрытом рекомбинантным антигеном PRRSV, и инкубировали 30 минут при 18-26°C. После промывания добавляли анти-свиной пероксидазный конъюгат хрена, и планшеты инкубировали в течение еще 30 минут при 18-26°C. Несвязанный конъюгат вымывали и в лунки добавляли субстрат TMB. Развитие цвета измеряли при 650 нм. Значения S/P были записаны для каждого образца. Если соотношение S/P составляло ≥ 0,4, образец был классифицирован как положительный на антитела к РРСС. Если соотношение S/P составляло < 0,4, то образец был классифицирован как отрицательный. Инструкции ИФА были включены в файл исследования.

Пример 4 - Возникновение иммунитета (OOI) от модифицированной живой вакцины EU PRRSV, введенной 2-недельным свиньям против контрольного заражения европейским изолятом PRRS через 4 недели после вакцинации.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить возникновение иммунитета (OOI) от экспериментальной вакцины MLV ЕС PRRSV (вирус SEQ ID NO: 5), вводимой свиньям 2-недельного возраста для профилактики респираторного заболевания, вызванного PRRSV, через 4 недели после вакцинации. Первичной переменной при определении профилактики заболевания была вирусная нагрузка в сыворотке крови в группе лечения Т02 (вакцинированной исследуемым объектом) по сравнению с группой Т01 (вакцинированной контрольным продуктом), подтверждаемая поражениями легких, выделением из ротовой полости и назальным выделением, клиническими наблюдениями, ректальными температурами и массой тела.

В возрасте 14-15 дней, однократную дозу 2,0 мл контрольного продукта (CP) или исследуемого объекта (вирус TI, SEQ ID NO:5) вводили в виде внутримышечной инъекции каждому животному Через четыре недели после вакцинации, свиней подвергали контрольному заражению интраназально изолятом EU PRRSV Olot/91 в качестве респираторного контрольного заражения. Во время фазы контрольного заражения, образцы крови, назальные выделения и выделения из полости рта, клинические наблюдения и ректальные температуры собирались каждые 2-3 дня до дня вскрытия. Свиней взвешивали за день перед вакцинацией, перед контрольным заражением и при вскрытии. Через десять дней после контрольного заражения, свиней анестезировали, подвергали эвтаназии и вскрытию. После вскрытия легкие оценивались на наличие поражений и очагов PRRSV. Данное исследование было действительным, поскольку свиньи T01 оставались PRRSV серо- и вирусно-отрицательными в течение периода вакцинации, и не было обнаружено никаких смешанных факторов заболевания.

Защитный эффект вакцинации наблюдался при сравнении вирусной нагрузки в сыворотке крови между группами. Группа, вакцинированная TI (T02), имела значительно более низкие вирусные титры по сравнению с контрольной группой во все дни отбора образцов после контрольного заражения.

Эффективность также была подтверждена значительным снижением процента легких с поражениями при вскрытии (через 10 дней после контрольного заражения), снижением назальных выделений и выделений из полости рта, , а также снижением ректальных температур через 7 дней после контрольного заражения. Никаких различий в массе тела обнаружено не было. Вакцинация индуцировала развитие PRRSV-специфических антител в течение 4 недель после вакцинации. Через десять дней после контрольного заражения, титры антител оставались значительно выше в группе Т02 по сравнению с контрольной группой (Т01). В заключение следует отметить, что однократное внутримышечное введение экспериментальной вакцины EU PRRSV MLV, содержащей дозу 2,0 log₁₀CCID₅₀ свиньям 14-15 дневного возраста (сероотрицательные по отношению к PRRSV) защищало от респираторного заболевания, вызванного после контрольного заражения патогенным штаммом EU PRRS через 4 недели после вакцинации. Дизайн эксперимента выглядит следующим образом:

На 27-ой день после повторного размещения в стойла свиней, всех животных подвергали контрольному заражению 2 мл контрольного штамма Olot/91 интраназальным (IN) способом. Свиней подвергали контрольному заражению общим объемом контрольного заражения 2,0 мл путем закапывания 1,0 мл заражающего материала в каждую ноздрю. Свиньи удерживались в положении с поднятой головой в течение нескольких секунд после контрольного заражения.

Клинические наблюдения и ректальные температуры

Клинические наблюдения включали общее состояние, депрессию, чихание, кашель и дыхательную недостаточность. Ректальные температуры регистрировались в соответствии с местными стандартными процедурами. В те дни (перед и после вакцинации/контрольной иммунизации), когда полное клиническое обследование не проводилось, общее состояние здоровья свиней наблюдали и регистрировали в формах ежедневного обзора по уходу за животными (DRAC), следуя стандартной SOP.

Вскрытие и оценка легкого.

При вскрытии поражения легких оценивали с использованием следующих способов: 1) процент уплотнения для каждой доли (левой краниальной доли, левой средней доли, левой каудальной доли, правой краниальной доли, правой средней доли, правой каудальной доли и придаточной доли) будет оцениваться и регистрироваться как процент доли, наблюдаемой с поражениями; и 2) числовой визуальный балл (0, 1, 2, 3).

ОТ кПЦР

Вирусемия (нагрузка PRRSV в сыворотке) и выделения (нагрузка PRRSV в назальных выделениях и выделениях из полости рта) измерялись посредством количественной полимеразная цепная реакция (кПЦР) с обратной транскриптазой (ОТ), осуществляемой в соответствии со стандартными процедурами. Вкратце, очищенную вирусную РНК использовали в качестве матрицы, обратно транскрибировали при 50°C в течение 30 минут и денатурировали при 95°C в течение 5 минут. Программа ПЦР реакций состояла из 40 циклов денатурации при 95°C в течение 20 секунд и ренатурация при 53°C в течение 40 секунд. ОТ-кПЦР проводили в системном термоблоке ПЦР в реальном времени 7500. Результаты выражали в виде копий РНК/мл.

Серология

Сыворотки, собранные перед вакцинацией, перед контрольным заражением и при вскрытии, были исследованы на антитела к PRRSV с использованием ИФА IDEXX PRRS X3, следуя инструкциям производителя. Вкратце, образцы сыворотки разводили 1:40 в 96-луночном планшете, покрытом рекомбинантным антигеном PRRSV, и инкубировали 30 минут при 18-26°C. После промывания добавляли анти-свиной конъюгат пероксидазы хрена, и планшеты инкубировали в течение еще 30 минут при 18-26°C. Несвязанный конъюгат вымывали и в лунки добавляли субстрат TMB Развитие цвета измеряли при 650 нм. Значения S/P были записаны для каждого образца. Если соотношение S/P составляло ≥ 0,4 образец был классифицирован как положительный на антитела к PRRS. Если соотношение S/P составляло < 0,4 образец был классифицирован как отрицательный. Инструкции по ИФА включаются в файл исследования. Исследование закончилось на 37 день (эвтаназия).

Вирусемия и выделения

Перед статистическим анализом данные ОТ-кПЦР были преобразованы с использованием соответствующего логарифмического преобразования. Преобразованные данные были проанализированы с использованием общей линейной смешанной модели с повторными измерениями. Попарное сравнение лечения проводилось в каждый момент времени, если эффект лечения или влияние контрольного момента времени на результаты лечения является значительным (P≤0,05). Среднее значение по методу наименьших квадратов и 95% доверительные интервалы были обратно преобразованные для представления. Процент дней вирусемий/выделений был также рассчитан. Каждый образец был определен как положительный, если >250 PRRSV копий РНК/мл, что соответствовало половине предела обнаружения метода (500 PRRSV копий РНК/мл образца). Также было определено, было ли животное когда-либо вирусемическим или когда-либо имело выделения в течение дней ≤27 (касается перед контрольным заражением) и дней >27 (после контрольного заражения).

Поражения легких

Процент от общей части легкого с поражениями рассчитывали, используя следующую формулу: Процент от общей части легкого с поражениями = (0,10 x левой краниальной части) + (0,10 x левой средней части) + (0,25 x левой каудальной части) + (0,10 x правой краниальной части) + (0,10 x правой средней части) + (0,25 x правой каудальной части) + (0,10 x придаточной части). Преобразование квадратного корня арксинуса применяли к проценту от общей части легких с поражениями до анализа. Трансформированные поражения легких анализировали по общей линейной смешанной модели. Попарное сравнение было сделано между группами лечения, если эффект лечения был значительным. Рассчитывали обратно преобразованные средние значения по методу наименьших квадратов процента общей части легкого с поражениями, их стандартные ошибки, и их 95% доверительные интервалы, а также минимумы и максимумы. Частотные распределения баллов оценки поражения легких рассчитывали для каждой процедуры. Баллы, нормальные или ненормальные, были проанализированы с использованием общей линейной смешанной линейной модели для биномиальных данных. Если общая линейная смешанная модель не сходилась, для анализа данных использовался точный критерий Фишера. Если основной эффект лечения был значительным, то проводилось парное сравнение лечения.

Оценка легкого

Процент легких с поражениями для каждой группы лечения показан в таблице 8. Визуальные оценки легких представлены в таблице 9. При вскрытии 17/18 свиней (94,4%) из контрольной группы T01 имели положительный визуальный показатель легких, свидетельствующий о том, что контрольное заражение PRRSV было успешным в индуцировании поражений легких. В группе Т02, 14/19 (73,7%) свиней также были оценены как положительные. Контрольная группа T01 имела в значительной мере более высокий средний процент LS легких с поражениями по сравнению с группой T02. Что касается общего визуального показателя легкого, то легкие от всех свиней группы T02 были оценены как 0 (без поражений) или 1 (легкие поражения). В контрольной группе T01 7/18 (38,9%) свиней получили визуальный балл 2 (умеренные поражения). Ни одному из легких ни в одной группе не было присвоено визуальное значение 3 (тяжелые поражения).

Результаты ОТ-кПЦР, вирусемия (нагрузка PRRSV в сиворотке крови)

Все свиньи, как было обнаружено, являются PRRSV-отрицательный по ОТ-кПЦР в крови на день 0. При контрольном заражении (27-ой день), РНК PRRSV можно было обнаружить у 100% свиней, вакцинированных TI (группа T02). К тому времени все свиньи T01 были все еще PRRSV-отрицательными. У контрольных свиней, вирусемия была впервые обнаружена на 29 день (через 2 дня после контрольного заражения), и свиньи оставались положительными на PRRSV до конца исследования. Во все дни отбора образцов после контрольного заражения, вирусные нагрузки, обнаруженные в контрольной группе T01, были значительно выше, обнаруженные в группе Т02. В таблице 10 суммированы результаты вирусемии с 27-го дня (дня контрольного заражения) по 36-ой день. Суммирование результатов средних значений, полученных методом наименьших квадратов и различий средних значений LS между группами показана в таблице 11.

Таблица 10. Суммирование результатов вирусемии по группам и дню исследования

Таблица 11. Суммирование результатов таблицы средних значений, полученных методом наименьших квадратов для результатов по вирусемии

Назальных выделений и выделений из полости рта

Все свиньи, как было обнаружено, являются PRRSV-отрицательный по ОТ-кПЦР в мазках из носа и полости рта на день 0. При контрольном заражении (27-ой день), у 70% и 85% свиней вакцинированных TI (группа T02) обнаруживалась РНК PRRSV в назальных выделениях и выделениях из полости рта, соответственно. Ни одна свинья из группы Т01 не выделяла в тот момент времени. В течение периода после контрольного заражения, процент назальных выделений в группе T01 находился в диапазоне от 85% (34-ый День) до 100% (29-ый День). В группе Т02, проценты назальных выделений находились в диапазоне от 42% (36-ой День) до 90% (29-ый День). Что касается выделения с полости рта, процент положительных свиней находился в диапазоне от 95 до 100% в группе T01 и от 73,7 to 100% в группе T02. Сравнение LSM между группами продемонстрировало значительные, более высокие вирусные нагрузки в группе T01 во все дни после контрольного заражения, но на 34-ый день для назальных мазков и на 31-ый и 36-ой день для выделений из полости рта.

Результаты касательно назальных выделений и выделений из полости рта с 27-ого дня (дня контрольного заражения) по 36-й день просуммированы в таблице 12, и

Таблица 14 соответственно. Краткое изложение LSM и LS средних значений различий между группами показаны в таблицах 13 и 15.

Таблица 12. Суммирование результатов назальных выделений по группе и дню исследования

Таблица 13. Суммирование результатов таблицы средних значений, полученных методом наименьших квадратов для назальных выделения

Таблица 14. Суммирование результатов выделений из ротовой полости по группе и дню исследования

Таблица 15. Суммирование результатов таблицы средних значений, полученных методом наименьших квадратов для выделений из ротовой полости

Серология

Все свиньи были серологически отрицательными в отношении PRRSV перед вакцинацией (соотношение S/P IDEXX <0,4). При контрольном заражении (через 4 недели после вакцинации), все контрольные свиньи оставались сероотрицательными, в то время как 90% свиней, вакцинированных TI были сероконвертированы в PRRSV (соотношение S/P IDEXX > 0,4). На 36-ой день (через 9 дней после контрольного заражения), все свиньи были сероположительными к PRRSV. Свиньи из группы T02 имели в значительной мере более высокие средние значения LS титров антител по сравнению с контрольной группой T01. В таблице 16 просуммированы серологические результаты, полученные посредством ИФА.

Таблица 16. Результаты соотношение S/P по ИФА (средние значения LS и диапазон) и % сероположительности свиней по группе лечения и дню

Обсуждение

В данном исследовании оценивали возникновение иммунитета (OOI) от модифицированной живой вакцины против PRRSV у свиней, вакцинированных в возрасте 14-15 дней после инокуляции патогенным изолятом PRRSV генотипа I, в качестве респираторного контрольного заражения через 4 недели после вакцинации. Исследование было действительным, поскольку все свиньи T01 оставались PRRSV серо- и виро-отрицательными в течение периода вакцинации, и не было обнаружено никаких смешанных факторов заболевания.

Первичной переменной при определении эффективности была вирусная нагрузка в сыворотке крови группы лечения Т02 по сравнению со свиньями Т01. Поражения легких, ректальные температуры, выделения, клинические признаки и масса тела сравнивались как вторичные переменные.

Защитный эффект вакцинации наблюдался при сравнении вирусной нагрузки в сыворотке крови между группами T01 и T02; группа, вакцинированная TI, имела значительно более низкие титры вируса по сравнению с контрольной группой T01 во все дни отбора проб после контрольного заражения.

После контрольного заражения у всех свиней могут быть обнаружены выделения из полости рта и носа независимо от группы обработки. Тем не менее, значительно более высокие вирусные нагрузки была обнаружена в группе T01, причем все дни, кроме дня 34, для мазков из носа и на 31-ый и 36-ой день для выделений из полости рта.

Что касается поражений легких, защитный эффект вакцины также наблюдался у свиней T02 при сравнении среднего значения обратного преобразования по методу наименьших квадратов процента поражений легких между группами. Кроме того, все 14 свиней из группы T02, которым при вскрытии дали положительный визуальный балл, были оценены как 1 (слабые поражения). Напротив, легкие из 17 свиней в группе T01, которые также получили положительный результат, 10 получили оценку 1 (слабые поражения) и 7 - оценку 2 (умеренные поражения).

В течение периода после контрольного заражения, ректальные температуры были значительно ниже у свиней, вакцинированных TI, на 7-ой день после контрольного заражения. К этому времени у 20% свиней из группы T01 была лихорадка, тогда как ни у одной свиньи из группы T02 лихорадки не было. Перед контрольным заражением, ректальные температуры в группе Т02 были значительно ниже по сравнению с T01. Однако ни у одной из свиней не было лихорадки, и в этой группе не было явного клинического состояния, которое могло бы вызвать повышение ректальной температуры. Помимо повышения ректальной температуры, никаких других клинических наблюдений, совместимых с PRRS (депрессия, респираторный дистресс, кашель или чихание), не наблюдалось ни у одной свиньи в течение всего периода времени. Кроме того, никаких различий в массе тела не могло быть обнаружено в какой-либо момент времени между группами.

Серологические данные продемонстрировали, что вакцинация TI (группа T02) вызывала развитие PRRSV-специфических антител в течение 4 недель после вакцинации. Титры антител в группе T02 увеличивались до конца исследования и были в значительной мере выше, чем титры, обнаруженные к тому времени в невакцинированной группе T01 с контрольным заражением.

Вакцинация однократным внутримышечным введением экспериментальной вакцины MLV EU PRRSV, содержащей дозу 2,0 log₁₀CCID₅₀ свиньям 14-15 дневного возраста защищала от PRRSV, о чем свидетельствует значительное снижение вирусной нагрузки, обнаруженной в сыворотке крови после контрольного заражения патогенным штаммом EU PRRS через 4 недели после вакцинации. Эффективность была также подтверждена защитным эффектом, наблюдаемым в отношении процента поражений легких при вскрытии (через 10 дней после контрольного заражения), снижением выделений из ротовой полости и назальных выделений, а также снижением ректальной температуры через 7 дней после контрольного заражения.

Пример 5 - Оценка потенциального влияния антител материнского происхождения на эффективность модифицированной живой вакцины EU PRRSV, введенной однодневным сероположительным свиньям против заражения европейским изолятом PRRSV.

Цель представленного исследования состояла в том, чтобы оценить влияние антител материнского происхождения (MDA) на эффективность MLV EU PRRS (вирус, экспрессируемый из SEQ ID NO: 5) при введении поросятам в 1-дневном возрасте внутримышечным (в.м., группа T02) или интраназальным (и.н., группа T03) способом.

Исследование было разработано на основе рекомендаций EMA/CVMP/WP/439467/2007: “Reflection paper on the demonstration of a possible impact of maternally derived antibodies on vaccine efficacy in young animals” и Европейской фармакопеи (Ph. Eur.) Монография 04/2008:50207: “Evaluation of efficacy of veterinary vaccines and immunosera”. Оба документа рекомендуют, что следует адекватно оценить влияние пассивно приобретенных и полученных от матери антител на эффективность вакцины. Кроме того, в EMA/CVMP/WP/439467/2007 говорится, что эффективность вакцины у животных, вакцинированных в присутствии MDA, должна, несмотря на нормальные биологические вариации, быть аналогичной той, которая была получена у животных того же возраста, но вакцинированной в отсутствие MDA.

На основании вышеупомянутых спецификаций возникновение защитного иммунитета (OOI) модифицированной живой вакцины против EU PRRSV было оценено у сероположительных свиней, вакцинированных (в.м. и и.н. способом), в 1-дневном возрасте после инокуляции патогенным изолятом PRRSV генотипа I в качестве респираторного контрольного заражения. Животных подвергали контрольному заражению в то время, когда уровни MDA, обнаруженные с использованием теста серонейтрализации (SNT) в контрольной группе (T01), становились необнаруживаемыми. Для того, чтобы продемонстрировать защиту против заражения, были оценены те же параметры, которые оценивались в предыдущем исследовании, проведенном на сероотрицательных животных (вирусная нагрузка в сыворотке крови, поражения легких, ректальные температуры, выделение, клинические признаки и масса тела).

Исследование было действительным, так как все контрольные свиньи (группа T01) оставались виро-отрицательными на PRRSV в течение периода вакцинации, и не было обнаружено никаких сопутствующих факторов заболевания.

Когда MLV EU PRRS вводили в.м. способом, наблюдался защитный эффект вакцинации, о чем свидетельствует значительное снижение вирусной нагрузки в сыворотке по сравнению с контрольной группой; эффективность также была подтверждена значительным снижением назальных выделений и выделений из полости рта, а также значительным снижением ректальной температуры. Различия в среднем значении процента поражений легких были близки к значению (р = 0,092). Эффективность, наблюдаемая после в.м. введения в представленном исследовании, является аналогичной эффективности, полученной в предыдущем исследовании, в котором эффективность оценивается у сероотрицательных животных; в обоих исследованиях значительное влияние вакцинации наблюдалось на первичную переменную (снижение вирусемии), а также подтверждалось снижением назальных выделений и ректальной температуры.

Когда MLV EU PRRS вводился и.н. способом, не было достигнуто никакой защиты от контрольного заражения PRRSV, о чем свидетельствует отсутствие значительных различий ни в одном из оцениваемых параметров.

В заключение следует отметить, что результаты представленного исследования демонстрируют отсутствие интерференции материнских антител с эффективностью вакцины, когда вакцина вводится внутримышечно поросятам в 1-дневном возрасте. Однако, когда вакцина вводится и.н. способом, у большинства свиней иммунный ответ после вакцинации не вызывался, по-видимому, из-за нейтрализации вакцины MDA. Для получения положительных на PRRSV MDA поросят шесть беременных свиноматок были вакцинированы вакциной MLV ЕС PRRSV партии VMRD13-015 (5 log₁₀CCID₅₀/2 мл) в течение первой половины беременности (45 дней беременности). За день до предполагаемой даты опороса роды были вызваны внутримышечной инъекцией клопростенола (Cyclix® Porcino, Virbac). Все свиноматки опоросились на следующий день. Все свиноматки были сероположительными к PRRS на 0-ой день. Результаты показаны.

Вакцинный вирус вводили с содержанием действующего вещества 6,0 log10CCID50 /мл. На день 0, IVP разбавляли вакцинным разбавителем (партия T22019) для того, чтобы соответствовать целевому титру (2,5 log10 CCID50/2 мл). Одну аликвоту IVP собирали для титрования на клетках BHK-21-C12-26 для подтверждения дозировки. Дополнительный образец IVP замораживали (-80±10°C) и хранили в качестве контрольного образца. Титрование на клетках BHK-21-C12-26 проводили в соответствии с местными стандартными процедурами. Восстановленная и разбавленная вакцина имела титр 101,8 CCID50/мл, который соответствует 102,1 CCID50/2 мл (2,1 log10CCID50 /2 мл).

На день 0, поросят вакцинировали IVP или CP как описано в разделе 4. Поросятам групп T01 и T02 инъекционно внутримышечно вводили в правую сторона шеи. Поросятам групп T01 и T03 вводили интраназально, доставляя 1,0 мл в каждую ноздрю. Материалом для контрольного заражения был испанский изолят Olot/91 PRRSV генотипа 1, выращенный в свиных альвеолярных макрофагах (PAM). Данный штамм был выделенный в 1991 году при случае позднего аборта у свиноматок.

Вирусемия

Все свиньи, как было обнаружено, являются PRRSV-отрицательными по ОТ-кПЦР в сыворотке крови перед вакцинацией (D0), и все свиньи из группы T01 оставались таковыми до контрольного заражения. Напротив, 8/16 (50%) поросят из группы T02 (вакцинированные в.м) и 1/19 (5,3%) поросят из группы T03 (вакцинированные и.н.) были PRRSV-положительными ОТ-кПЦР при контрольном заражении (через 67 дней после вакцинации).

После контрольного заражения, 100% свиней из группы T01 становились вирусемическими в D70 (через 3 дня после контрольного заражения) и оставались положительными до конца исследования (DC+10). В вакцинированных группах (T02 и T03), у всех свиней был обнаружен положительный результат PRRSV, по меньшей мере, один раз; однако, к концу исследования (DC+10), только 11/16 свиней T02 (68,8%) все еще были вирусемическими. Напротив, все свиньи T03, кроме одной, были положительными во всех точках отбора образцов после контрольного заражения.

Свиньи из группы Т02 имели в значительной мере ниже вирусную нагрузку в сыворотке, чем у свиней из контрольной группы Т01 во все дни отбора образцов после контрольного заражения. При DC+3 и DC+10, вирусная нагрузка в группе T02 также была в значительной степени ниже, чем в группе Т03. Никаких значительных разниц не было обнаружено между группами T01 и T03.

Таблица 17 суммирует результаты вирусемии в течение 10-дневного периода после контрольного заражения.

Вирусемия и выделения

Перед статистическим анализом данные ОТ-кПЦР были преобразованы с использованием соответствующего логарифмического преобразования. Преобразованные данные были проанализированы с использованием общей линейной смешанной модели с повторными измерениями. Попарное сравнение лечения проводилось в каждый момент времени, если эффект лечения или влияние контрольного момента времени на результаты лечения были значительными (P≤0,05). Среднее значение по методу наименьших квадратов и 95% доверительные интервалы были обратно преобразованы для представления. Процент дней вирусемии/выделений также был рассчитан. Каждый образец, как было определен, был положительным если> 50 копий копий РНК/мл PRRSV, что соответствует половине предела обнаружения метода (100 PRRSV копий РНК/мл). Кроме того, было определено, было ли животное когда-либо виремическим или когда-либо имело выделения в течение дней ≤DC (касается перед контрольным заражением) и дней >DC (после контрольного заражения).

Целью представленного исследования было оценить влияние антител материнского происхождения (MDA) на эффективность MLV EU PRRS, когда их вводят поросятам 1-дневного возраста внутримышечным (в.м., группа T02) или интраназальным (и.н., группа Т03) способом. Эффективность оценивали у серопозитивных свиней, вакцинированных в 1-дневном возрасте после инокуляции патогенным изолятом PRRSV генотипа I в качестве респираторного контрольного заражения. Животных подвергали контрольному заражению в то время, когда уровни MDA, обнаруженные SNT в группе T01, становились необнаружимыми (День 67).

Первичной переменной при определении эффективности была вирусная нагрузка в сыворотке крови (вирусемия) в группах обработки T02 и T03 по сравнению со свиньями группы T01. Поражения легких, ректальные температуры, выделения, клинические признаки и масса тела сравнивались как вторичные переменные.

Исследование было действительным, поскольку все свиньи T01 оставались вирусно-отрицательными на PRRSV в течение периода вакцинации, и не было обнаружено никаких смешанных факторов заболевания.

Защитный эффект вакцинации в.м. наблюдался при сравнении вирусной нагрузки в сыворотке крови между группами T01 и T02; группа, вакцинированная IVP в.м. способом, имела значительно более низкие титры вируса по сравнению с контрольной группой T01 во все дни отбора образцов после контрольного заражения. Между группами T01 и T03 не было обнаружено никаких различий в титрах вируса, что указывает на отсутствие защитного эффекта от и.н. вакцинации на вирусную нагрузку после контрольного заражения. Отсутствие эффективности в группе T03 также было подтверждено значительным увеличением вирусной нагрузки, наблюдаемой в этой группе, по сравнению с группой T02 через 3 и 10 дней после контрольного заражения.

Защита, обеспеченная после в.м. вакцинации (группа T02), была подтверждена значительным снижением процента назальных выделений, а также количества вируса, обнаруженного в назальных выделениях и выделениях из ротовой полости в группе T02 по сравнению с контрольной группой T01. Подобно тому, что наблюдалось для вирусемии, никакого положительного эффекта вакцинации не наблюдалось при выделении вируса, когда IVP вводили и.н. способом (T03 группа), поскольку не было обнаружено никаких различий между группами T01 и T03. Фактически, количество вируса, выделяемое как назальным, так и оральным путем в группе Т03 также было в значительной мере выше, чем в группе T02.

Вакцинация в.м. способом также положительно повлияла на ректальную температуру. Перед контрольным заражением (D67), средние значения ректальных температур были в значительной степени ниже в группе T02 по сравнению с T01 и T03; однако, поскольку ни у одной из свиней из какой-либо группы не было лихорадки (RT≥40,5) в тоже время и ректальные температуры на D67 регистрировались до того, как животные были взяты на фазу контрольного заражения, то можно сделать вывод, что данные различия, вероятно, объясняются стрессом животных, которые были впервые оценены. В течение периода после контрольного заражения, процент свиней, у которых была лихорадка, по меньшей мере, один раз составлял 61%, 31%, и 42% в группах T01, T02 и T03, соответственно. Контрольные свиньи (T01) имели в значительной мере более высокие ректальные температуры, чем свиньи, вакцинированные IVP (группы T02 и T03) на день 70 (через 3 дня после контрольного заражения); однако, на DC+10, ректальные температуры группы T03 были в значительной мере более высокие, чем в группах T01 и T02. Помимо повышения ректальной температуры, других клинических признаков, совместимых с инфекцией PRRSV, не наблюдалось. Что касается массы тела, никакого эффекта от вакцинации не наблюдалось, что видно по отсутствию значительных различий между группами.

При вскрытии 13/18 свиней (72%) из контрольной группы T01 имели положительный балл по визуальной оценке легких. В группах T02 и T03, 7/16 (44%) и 13/19 (68%) свиней также получили положительный балл. Сравнение между группами лечения не показало никаких значительных различий в % легких с поражениями. Однако различия, наблюдаемые между контрольной группой T01 и группой, вакцинированной IVP в.м. способом (T02) были близки к значимости (p=0.092).

Все свиньи имели присутствие PRRSV-специфических антител перед вакцинацией, как было измерено посредством ИФА (соотношение S/P ≥ 0,4), таким образом, соответствуя критериям включения. Перед контрольным заражением (через 67 дней после вакцинации), 39% свиней в контрольной группе все еще оставались сероположительными, что указывало на наличие оставшихся MDA на то время (среднее значение соотношения S/P: 0,279). Однако тот факт, что у всех свиней из контрольной группы развилась вирусемия после контрольного заражения, и что 13/18 имели также положительный балл при оценке легких при вскрытии, указывает на то, что оставшийся MDA, обнаруженный с помощью ИФА, не мешал проведению контрольного заражения. Фактически, когда уровни PRRSV-специфических нейтрализующих антител были определены у данных свиней с использованием SNT, отрицательные результаты были обнаружены у всех свиней T01 перед контрольным заражением (день 52). В группе, вакцинированной IVP в.м. способом, у 9/16 свиней наблюдалось увеличение уровней антител, определенных с использованием ИФА, со дня вакцинации до 67 дней после вакцинации, и все они были сероположительными перед контрольным заражением (среднее значение соотношения S/P: 1,803), что указывает на развитие антительного ответа после в.м. вакцинации даже на фоне MDA. Напротив, только у 2/19 свиней, вакцинированных IVP и.н. способом было увеличение антител к PRRS от вакцинации до контрольного заражения, и только 32% было сероположительных на D67 (среднее значение соотношения S/P: 0,328), которое указывает на то, что никакого гуморального иммунного ответа не было индуцировано у остальных 17 свиней из-за нейтрализации вакцины MDA. После контрольного заражения (D77), все свиньи, независимо от группы лечения, были сероположительными и никаких значительных различий в титрах ИФА не было обнаружено между группами.

В руководстве EMA/CVMP/WP/439467/2007 “Reflection paper on the demonstration of a possible impact of maternally derived antibodies on vaccine efficacy in young animals” говорится, что эффективность вакцины у животных, вакцинированных в присутствии MDA, должна быть такой: несмотря на нормальную биологическую изменчивость, подобную той, которая получена у животных такого же возраста, но вакцинированных в отсутствие MDA. На основании этих спецификаций эффективность, наблюдаемая в настоящем исследовании, должна быть аналогична эффективности, полученной в предыдущем исследовании (C/394/13), в котором OOI оценивали у сероотрицательных животных, вакцинированных в 1-дневном возрасте и.н. и в.м. способами.

Когда MLV EU PRRS вводили в.м. способом, эффективность могла быть продемонстрирована независимо от серологического статуса свиней, так как в обоих исследованиях наблюдалось значительное снижение вирусемии (первичной переменной). Защитный эффект в.м. вакцинации также был продемонстрирован для назального выделения и ректальной температуры в обоих случаях. Кроме того, после в.м. вакцинации свиней MDA+, выделение из ротовой полости также было в значительной степени снижено, и различия в % легких с поражениями были близки к значительным. В целом, эти данные ясно демонстрируют отсутствие влияния MDA на эффективность вакцины, когда вакцина вводится поросятам 1-дневного возраста внутримышечно.

Когда MLV EU PRRS вводили и.н. способом, эффективность могла быть продемонстрирована только в отсутствие MDA, о чем свидетельствует значительное снижение вирусемии и назального выделения, наблюдаемое у сероотрицательных животных. У свиней с MDA+ и.н. вакцинация не индуцировала защиты, о чем свидетельствует отсутствие значительных различий ни по какому-либо одному из оцениваемых параметров.

Таким образом, вакцинация однократным введением вакцины MLV EU PRRSV, содержащей дозу 2,5 log₁₀CCID₅₀ сероположительным свиньям 1-дневного возраста в.м. способом защищала от PRRSV, о чем свидетельствует значительное снижение вирусной нагрузки, обнаруженной в сыворотке крови после контрольного заражения патогенным штаммом EU PRRS через 67 дней (9,6 недель) после вакцинации. Эффективность также подтверждалась значительным снижением назальных выделений и выделений из полости рта, а также ректальных температур после контрольного заражения. Кроме того, различия в среднем значении процента поражений легких были близки к значимости (р = 0,09). Вакцинация однократным введением вакцины MLV EU PRRSV вакцина, содержащей дозу 2,5 log₁₀CCID₅₀ сероположительным свиньям 1-дневного возраста и.н. способом не защищала от PRRSV при контрольном заражении. Результаты представленного исследования демонстрируют отсутствие интерференции материнских антител с эффективностью вакцины, когда вакцина вводится внутримышечно в 1-дневном возрасте. Когда вакцина вводится и.н. способом, большинству свиней (17/19) не удается выработать иммунный ответ после вакцинации, который измерялся методом ИФА. Это указывает на нейтрализацию вакцины MDA, что может поставить под угрозу эффективность вакцины на уровне стада.

Пример 6 - Распространение, распределение и безопасность введения одной дозы, повторной дозы и передозировки модифицированной живой вакцины EU PRRSV 96V198 слона 1 MSV+3 свиньям 1-дневного возраста

Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить безопасность повторной дозы и передозировки, а также распространение, распределение и безопасность одной дозы модифицированной живой вакцины против PRRSV 96 к198 клона 1, вводимой свиньям 1-дневного возраста в.м. и и.н. способом. Исследование проводилось с использованием MSV+3, который является наименее аттенуированным уровнем пассажа (смотрите страницу 8, MSV+5 представляет собой стандартный пассаж 49), который присутствует в партии вакцины.

В соответствии с действующим европейским законодательством, для получения разрешения на продажу необходимо продемонстрировать безопасность вакцины. В этом случае протокол был разработан с учетом Европейской фармакопеи; директивы 2009/9/EC и руководящих принципов VICH GL44 для того, чтобы продемонстрировать безопасность одной дозы, повторной дозы и передозировки при и.н. и в.м. способе введении для поросят однодневного возраста - предлагаемые способы и категория животных, для которых предназначена вакцина.

Безопасность оценивали в соответствии с рекомендациями Европейской Фармакопеи для вакцин ветеринарного применения, то есть для оценки ректальной температуры, а также местных и общих реакций, по крайней мере, до 14 дней после инокуляции. Распределение вакцинного штамма оценивали от вакцинированных (одна доза) до невакцинированных индикаторных свиней; выделение (носовая слизь, жидкости ротовой полости и фекалии) и распространение в тканях у вакцинированных животных (одна доза) также были исследованы.

Исследование проводилось в соответствии с правилами Надлежащей лабораторной практики (GLP), в соответствии с соответствующими руководящими принципами OCDE и в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи 7.7 04/2013:50206 (Оценка безопасности ветеринарных вакцин и иммуноферментов).

Исследуемый продукт представлял собой MLV EU PRRS (клон 1 96V198), наименьший аттенуированный уровень пассажа (MSV+3), при максимальном титре высвобождения 105,2 TCID50/2 мл при дозе 2 л и.н. или в.м., причем нижний пассаж (менее аттенуированный) был выбран в качестве лучшей меры безопасности. Для исследуемой системы протокол был разработан с учетом Европейской Фармакопеи; директивы 2009/9/EC и руководящих принципов VICH GL44 для того, чтобы продемонстрировать безопасность применения одной дозы, повторной дозы и передозировки при и.н. и в.м. способе введения для поросят 1-дневного возраста - предлагаемой категории животных, для которых предназначена вакцина.

Достаточное количество свиноматок (n = 11) было использовано для получения поросят, необходимых для проведения исследования (по меньшей мере, n = 80). Применяемый дизайн, позволяющий надлежащим образом описать безопасность, распространение и распределение вакцины для обоих способов введения, в.м. и и.н. Свиноматки прибыли на экспериментальную ферму с фермы отрицательной по PRRSV (Приложение I). Свиноматки были размещены в 11 изолированных ящиках в помещениях. На экспериментальной ферме у свиноматок брали перед опоросом и снова анализировали на наличие PRRSV-специфических антител с использованием коммерческого ИФА (PRRS X3 Ab Test: Ref. 99-4095, IDEXX Laboratories;) (Приложение I). В качестве профилактического лечения свиноматкам делали внутримышечное введение цефтиофура натрия (13 мл / свиноматку).

Опорос свиноматок синхронизировали, введением1 мл в.м. D-клопростенола (Galapan, INVESA;) (приложение XVI) приблизительно через 111-113 дней после осеменения (с синхронизацией опоросов). Поросята родились в течение следующих 40 часов (9 и 10 апреля). Начало вакцинации было сделано 10-го; на эту дату возраст всех поросят составлял примерно ≤ 24 ч (1-дневный возраст).

Перекрестное воспитание проводили в течение первого дня после опороса (перед вакцинацией) для того, чтобы сбалансировать пометы и гомогенизировать пометы. В конце концов, было использовано десять свиноматок с общим количеством поросят в каждой группе, равным или превышающим минимальный размер выборки, для проведения исследований безопасности, установленных в Европейской фармакопее. Общее количество: 80 поросят; 40 поросят для каждого способа введения: и.н. и в.м. (28 вакцинированы экспериментальным продуктом - доза, повторная доза и передозировка, 8 животных - в качестве контроля и 4 животных - в качестве индикаторов).

Тридцать лишних поросят также были распределены по всем группам от T01 до T12 в качестве резерва, которые должны быть включены в исследование, только если какая-то группа не достигла минимального необходимого количества поросят из-за мертвых поросят или исключения (Приложение II и Приложение XIV; Поправка № 2); необработанные данные этих поросят были записаны в дополнительные записные книжки с необработанными данными, помеченные знаком (S) (записные книжки с номерами от 13 до 24). В конце концов было использовано десять свиноматок, и у каждого из них было по 11 поросят.

Экспериментальная гипотеза

Данное исследование было разработано для того, чтобы продемонстрировать безопасность вакцины MLV EU PRRS у свиней 1-дневного возраста (клон 1 96V198) в экспериментальных условиях путем сравнения с контрольной группой, инокулированной разбавителем вакцины (отрицательные контроли) для всех параметров, описанных ниже, но температуру анализировали с учетом основной температуры каждого поросенка перед вакцинацией в качестве контрольного значения. Вакцина считалась безопасной, если не было отмечено серьезных местных или системных реакций по причинам, связанным с вакциной, и среднее повышение температуры для всех свиней в вакцинированной группе не превышало 1,5°C по сравнению со средней основной температурой до вакцинации, и ни один из поросят в экспериментальной группе не показал повышение температуры более чем на 2°C по сравнению с основной температурой у каждого поросенка перед вакцинацией. Оценивали распространение и распределение вакцинного штамма, исследуя наличие вакцинного штамма у индикаторных свиней. Распространение у вакцинированных животных оценивали, исследуя количество вируса в образцах крови, из носа, из ротовой полости и ректальных образцах и в тканях.

Ректальные температуры - Интраназальный и внутримышечный способы введения.

Что касается температуры, может быть сделан вывод, что вакцина безопасна во всех оцененных протоколах (способ введения, титр и количество доз), потому что полученные результаты соответствуют рекомендациям Европейской фармакопеи для вакцин ветеринарного применения.

Местные реакции

Интраназальный способ введения. Местных реакций не наблюдалось.

Внутримышечный способ введения.

При вскрытии только два поросенка в T12 (максимальный титр при в.м. способе введения) имели макроскопические слабые поражения. Микроскопически, поражения наблюдались только у четырех свиней из группы Т10; поражения характеризовались очень слабым очаговым или многоочаговым присутствием мононуклеарных инфильтратов воспалительных клеток.

Системные реакции и побочные эффекты

Интраназальный способ введения: Отсутствие системных реакций и клинических признаков, связанных с вакцинацией, указывают на то, что вакцина безопасна.

Внутримышечный способ введения.

Неблагоприятные события после введения вакцины наблюдались только у 2 из 8 поросят, принадлежащих к группе, получившей самый высокий титр (максимальный титр высвобождения х10) при в.м. способе введения (группа Т12). Данные события исчезли до 4 часов, и поросята полностью выздоровели. Что касается ежедневной клинической оценки, случаи хромоты не могут рассматриваться как явления, связанные с введением вакцины; хромота наблюдалась также у поросят контрольной группы. Причина, лежащая за пределами единственной смерти, наблюдаемой во время исследования, была вызвана раздавливанием; следовательно, следует учитывать, что эта смерть не была связана с введением вакцины. Таким образом, вакцинный штамм 96V198 CLONE 1 при в.м. способе введения следует считать полностью безопасным, за исключением неблагоприятных событий, описанных для самого высокого титра (х10).

Масса тела

Интраназальный способ введения.

При сравнении средств увеличения веса T07 показывал более низкие значения, чем соответствующий контроль (T02) (p <0,05) с 0 по 14 день. Однако, эта различие исчезало при сравнении прироста веса с 14 по 28 день и, особенно, когда все исследования - с 0 по 28 день - были приняты во внимание. Следовательно, прирост веса поросят, вакцинированных интраназальным способом введения, не зависел от полученной дозы.

Внутримышечный способ введения.

Таким же образом, T11 показал более низкие значения, чем соответствующий контроль (T04) (p <0,05) с 0 по 14 день. Это различие исчезало, когда анализировался период с 14 по 28, но оно снова появилось, во всех исследованиях - с 0 дня до 28 день. Данные различия могут объяснить тем, что прирост массы тела у трех поросят из T11 был наименьшим, включая всех вскрытых поросят на 28-ой день, независимо от продукта, титра или способа введения (это означает T02, T04, T07 и T11). Все индивидуальные прибавки в весе с 0 по 28 день были равны или превышали 5,5 кг, за исключением трех вышеупомянутых поросят (прибавка в весе 4,08, 2,89 и 3,05 кг для поросят n°199, 202 и 205, соответственно). Интересно, что эти поросята страдали хромотой в течение самого длительного периода. В заключение, нельзя отличить, если различия, наблюдаемые между прибавками в весе T04 и T11, были вызваны событиями хромоты или вакцинацией.

Распространение

Интраназальный и внутримышечный способы введения. Распространение вируса было продемонстрировано присутствием вакцинного штамма почти во всех тканях, оцененных у вакцинированных животных, независимо от используемого способа введения. Присутствие штамма 96V198 клона 1 в титрах, которые могут считаться высокими в легких, миндалинах и трахеобронхиальных лимфатических узлах, а также в селезенке и брыжеечных лимфатических узлах, свидетельствует о полном органическом распространении вакцинного штамма.

Распределение

Интраназальный и внутримышечный способы введения. Хотя обнаружение вакцинного штамма в ротовой жидкости и ректальных мазках было непостоянным у вакцинированных поросят, оно было постоянным и высоким в назальных мазках; распределение частоты обнаружения вакцинных штаммов со временем уменьшалось. Данные результаты вместе с обнаружением вакцинного штамма в образцах крови от всех индикаторных свиней, демонстрируют, что 96V198 клон 1 активно и непрерывно выделяется после вакцинации. Кроме того, наличие вакцинного штамма в тканях и образцах крови от индикаторных поросят указывало на то, что вирус, распространяемый от вакцинированных поросят, был активным; он мог инфицировать индикаторных животных и и мог размножаться в них; и даже одна в.м. индикаторная свинья из T09 имела поражения легких соответствующие PRRS плюс положительный результат для IHC. В заключение следует отметить, что вышеупомянутые результаты показывают, что 96V198 клон 1 может последовательно передаваться от вакцинированных к невакцинированным поросятам, по меньшей мере, в ранний период после вакцинации.

Поражения легких

Интраназальный и внутримышечный способы введения. Все девять свиней с макро- и микроскопическими поражениями, соответствующие PRRS (интерстициальная пневмония), плюс положительный результат для IHC PRRSV, были из в.м. групп. Таким образом, может быть сделан вывод, что и.н. способ введения был безопасным, тогда как в.м. способ введения мог индуцировать поражения легких, соответствующие PRRSV, по меньшей мере, у одной свиньи в каждой группе (с T09 по T12).

Пример 7. - Безопасность повторного введения однократной дозы модифицированной живой вакцины PRRSv EU при введении беременным свиноматкам сероположительным на PRRSv.

Представленное исследование было разработано для того, чтобы продемонстрировать безопасность введения повторной однократной дозы MLV EU PRRS сероположительным свиноматкам во второй половине беременности (87 дней беременности). Никаких системных реакций после вакцинации не наблюдалось после первого или второго введения. Кроме того, никаких клинические наблюдения не было зарегистрировано ни у одной свиноматки в течение всего периода наблюдения.

Что касается ректальных температур, ни у одной свиноматки не было зарегистрировано лихорадки в какой-либо момент после вакцинации (RT ≥40,1°C). Кроме того, среднее значение ректальной температуры после вакцинации не превосходило среднее значение ректальной температуры перед вакцинацией плюс 1,5°C, и ни у одной из свиноматок не наблюдалось превышение собственной ректальной температуры до вакцинации плюс 2°C.

Местные реакции в месте инъекции наблюдались у 63% и 50% свиноматок, вакцинированных исследуемым элементом при 1-ом и 2-ом введении, соответственно. Реакции состояли из ощутимого и/или видимого отека (от 0,4 до 2,8 см в диаметре), который исчезал между 1 и 6 днями. Ни у одной из свиноматок не наблюдалось покраснения, увеличения местного тепла или боли в месте инъекции после какого-либо введения.

Что касается репродуктивной функции, никаких абортов, или преждевременных опоросов зарегистрировано не было. Кроме того, не наблюдалось явного влияния вакцинации на число мертворожденных, мумифицированных, низко жизнеспособных поросят и на смертность перед отлучением от матери. Вакцинация не вызывала трансплацентарную инфекцию, о чем свидетельствуют отрицательные результаты ОТ-кПЦР, обнаруженные в образцах сыворотки крови, собранных при рождении и при отлучении поросят от матери. В заключение, повторное введение вакцины является безопасным для сероположительных свиноматок во второй половине беременности.

Сокращения, использованные в данном документе, включают: BHK-21, клон 21 почки новорожденного хомяка; BRP, протокол выпуска серии; CCID50; 50% инфекционная доза клеточной культуры; CP, контрольный продукт; D, день; DRAC, ежедневный обзор по уходу за животными; ID, идентификация; GLP, надлежащие лабораторные практики; IF, иммунофлуоресценция; в.в., внутривенно; MLV, модифицированная живая вакцина; MSV, исходный вакцинный вирус; NA, не применяли; P, Пассаж; PBS, фосфатный буферный солевой раствор; PI, после инокуляции; PRRSV, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней; RT, ректальные температуры; ОТ-кПЦР, количественная обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция; SOP, стандартная операционная процедура; S/P, образец к положительному; TBD, подлежит определению; TI, исследуемый препарат, и VICH, ветеринарный международный совет по гармонизации.

Цель исследования и обоснование

Модифицированная живая вакцина (MLV) EU PRRSV предназначена для активной иммунизации молодых свиней и свиноматок в среде, зараженной PRRS, для снижения вирусемии, трансплацентарной инфекции и абортов, вызванных заражением европейскими штаммами вируса PRRS. В соответствии с действующим законодательством, для получения разрешения на продажу является необходимым продемонстрировать безопасность вакцины. Данное исследование было разработано в соответствии с Европейской фармакопеей 7.7:04/2013/50206 - Оценка безопасности ветеринарных вакцин и иммуноферментов и VICH GL44 - Целевая безопасность животных касательно ветеринарных живых и инактивированных вакцин - руководство. Целью данного исследования является оценка безопасности повторного введения (1x + 1x) MLV EU PRRS сероположительным свиноматкам во второй половине беременности. Исследуемый материал представлял собой 6,6 log10CCID50 / флакон EU PRRSV, штамм 96v198c1, (MSV+3), с дозой 5,2 log10CCID50 в 2 мл/ внутримышечно по ОТ-кПЦР.

Вирусемия (нагрузка PRRSV в сыворотке) измерялась посредством кПЦР с обратной транскрипцией (ОТ), которую выполняли в соответствии со стандартными процедурами. Вкратце, очищенную вирусную РНК использовали в качестве матрицы, транскрибировали обратно при 50°C в течение 30 минут и денатурировали при 95°C в течение 5 минут. Программа ПЦР реакций состояла из 40 циклов денатурации при 95°C в течение 20 секунд и ренатурация при 53°C в течение 40 секунд. ОТ-кПЦР проводили в системном термоблоке ПЦР в реальном времени 7500.

Последовательности праймеров и зонда являются следующими (SEQ ID NOS 6-8, последовательно):

Прямой праймер (Лелистад F): 5'-GCACCACCTCACCCAGAC-3' (Конечная концентрация 0,5 мкM).

Обратный праймер (Лелистад R): 5'-CAGTTCCTGCGCCTTGAT-3'(Конечная концентрация 0,5 мкM).

Зонд (Лелистад S): 5'-6-FAM- CCTCTGCTTGCAATCGATCCAGAC -TAMRA-3’ (Конечная концентрация 0,6 мкM).

Серология

Собранную сыворотку свиней перед вакцинацией исследовали на антитела к PRRSV с использованием ИФА IDEXX PRRS X3, следуя инструкциям производителя. Вкратце, образцы сыворотки разбавляли 1:40 в 96-луночном планшете, покрытом рекомбинантным антигеном PRRSV, и инкубировали 30 минут при 18-26°C. После промывания добавляли конъюгат анти-свиной пероксидазы хрена и планшеты инкубировали в течение еще 30 минут при 18-26°C. Несвязанный конъюгат вымывали, и в лунки добавляли субстрат TMB. Развитие цвета измеряли при 650 нм. Значения S/P регистрировались для каждого образца. Если соотношение S/P было ≥ 0,4, образец был классифицирован как положительный на антитела к PRRS. Если соотношение S/P было <0,4, образец был классифицирован как отрицательный. Инструкции ELISA были включены в файл исследования.

Клинические наблюдения

Никаких аномальных клинических наблюдений за какой-либо свиноматкой в период после вакцинации зарегистрировано не было (с D0 по D28).

Ректальные температуры

Для того, чтобы исследовать ректальные температуры, были соблюдены два критерия:

a) Среднее значение ректальной температуры после вакцинации для всей группы не должно превышать среднее значение ректальной температуры перед вакцинацией плюс 1,5°C.

1-ая вак.: Среднее значение ректальной температуры после вакцинации (в либо D0+4ч, D1, D2, D3 либо D4) ≤ [Среднее значение ректальной температуры перед вакцинацией (Среднее значение D-1/D0)] + 1,5°C.

2-ая вак.: Среднее значение ректальной температуры после вакцинации (в либо D14+4ч, D15, D16, D17, либо D18) ≤ [Среднее значение ректальной температуры перед вакцинацией (Среднее значение D13/D14)] + 1,5°C.

b) Индивидуальная ректальная температура каждой свиноматки после вакцинации не должна превышать ректальную температуру перед вакцинацией (Pre-vac) плюс 2°C.

1-ая вак.: Индивидуальная ректальная температура после вакцинации (в либо D0+4ч, D1, D2, D3 или D4) ≤ [Индивидуальная ректальная температура перед вакцинацией (Индивидуальное среднее значение D-1/D0)] + 2,0°C.

2-ая вак.: Индивидуальная ректальная температура после вакцинации (в либо D14+4ч, D15, D16, D17 или D18) ≤ [Индивидуальная ректальная температура перед вакцинацией (Индивидуальное среднее значение D13/D14)] + 2,0°C.

В обеих группах T01 и T02 среднее значение RT после вакцинации не превышало среднего значения перед вакцинацией плюс 1,5°C. Кроме того, RT после вакцинации каждой свиноматки не превышала такую же ректальную температуру свиноматка перед вакцинацией плюс 2°C у какой-либо из свиноматок из групп T01 или T02. После первого введения максимальное увеличение RT составляло 0,81°C (день 2) в T01 и 0,76°C (день 0+4 ч) в группе T02. После второго введения максимальное увеличение наблюдалось на день 17 как в группе T01 (0,81°C), так и группе T02 (0,47°C). Ни у одной из свиноматок из группы T01 или T02 не наблюдалось повышенной ректальной температуры (≥40,1°C) в какой-либо момент времени после вакцинации.

Системные реакции после вакцинации

Никакой системной реакции после вакцинации не наблюдалось ни у одной из свиноматок из группы T01 или T02.

Местные реакции в месте инъекции

Перед вакцинацией всех свиноматок осматривали на наличие местных реакций в области шеи, вызванных предыдущими прививками, которые могли помешать оценке местных реакций в месте инъекции. Три свиноматки, две из группы T01 (1802 и 2259) и одна из T02 (1663), показали старые реакции в правой части шеи из-за предыдущих прививок. Однако все эти реакции были расположены ниже и были удалены от соответствующей точки инокуляции. Когда левая сторона шеи была осмотрена перед второй вакцинацией, старые реакции также наблюдались у четырех свиноматок, двух из группы T01 (316 и 1802) и двух из группы T02 (2547 и 2842). Как отмечено для правой части шеи, данные реакции были расположены ниже точки инокуляции. Во всех случаях (как для правой, так и для левой части шеи) старые реакции не считались потенциально мешающими оценке местных реакций после вакцинации. Ни у одной из свиноматок, вакцинированной СР (группа Т01), не проявилось локальной реакции в месте инъекции в какой-либо момент времени после вакцинации. Местные реакции, наблюдаемые после вакцинации в группе Т02, суммированы в 17.

После первой вакцинации 63% свиноматок T02 (5/8) имели видимый и/или ощутимый отек в месте инъекции в правой части шеи. Наблюдаемый максимальный отек представлял собой реакцию диаметром 2,8 см (соответствует 3 баллам), которая длилась 6 дней. Ни у одной из свиноматок не наблюдалось покраснение, усиление местного жара или боль в месте инъекции.

После второй вакцинации у 50% свиней T02 наблюдался видимый и/или ощутимый отек (левая сторона шеи) (4/8). Все наблюдаемые реакции были оценены как 1 или 2 (максимум 1 см в диаметре) и продолжались максимум 5 дней. Как отмечалось после 1-ой вакцинации, ни у одной из свиноматок не наблюдалось покраснение, усиление местного жара или боль в месте введения.

Посмертное обследование мест инъекций

При макроскопическом исследовании было замечено, что у нескольких свиноматок из обеих групп были поражения мышц шеи, в основном состоящие из множества узлов казеозного материала, которые были распределены по всей области шеи. Данные повреждения были приписаны старым инъекциям, потому что они не были обнаружены в точке инъекции.

При осмотре точек инокуляции свиноматок Т02 у 1/8 наблюдалась видимая реакция на правой стороне шеи и 3/8 на левой стороне шеи. В группе T01 у одной свиноматки (1/7) также была видимая реакция в первой точке инокуляции (правая сторона шеи). Все реакции были описаны как наличие бледных мышечных волокон, в большинстве случаев, четко следящих за траекторией иглы и не поддающихся измерению. Кроме того, у двух свиноматок Т02 наблюдались множественные узелки (левая точка инокуляции).

Репродуктивная способность

Ни в одной из групп лечения не было зарегистрировано никаких абортов или преждевременных опоросов. Продолжительность беременности находилась в диапазоне от 114 до 117 дней в группе T01 и от 114 до 119 дней в группе T02. Поросята, рожденные здоровыми у каждой свиноматки, были идентифицированы с использованием ушных бирок и содержались в

В представленном исследовании, безопасность повторного введения однократной дозы MLV EU PRRS оценивалась во второй половине беременности (87 дней беременности) у сероположительных свиноматок. Параметры безопасности включали системные реакции на вакцинацию, ректальную температуру после вакцинации, клинические наблюдения, местные реакции в месте инъекции, репродуктивную способность и посмертное обследование мест инъекции.

Никаких системных реакций после вакцинации не наблюдалось после первого или второго введения. Кроме того, никаких общих клинических наблюдений не было зарегистрировано ни у одной из свиноматок на протяжении всего исследования.

Что касается ректальных температур, ни у одной из свиноматок не было лихорадки в какой-либо момент после вакцинации (RT ≥40,1°C). Кроме того, среднее значение ректальной температуры после вакцинации не превышало среднее значение ректальной температуры перед вакцинацией плюс 1,5°C, и ни у одной из свиноматок не превышалась собственная ректальная температура перед вакцинацией плюс 2°C.

Местные реакции в месте инъекции наблюдались у 63% и 50% свиноматок из группы T02 при 1-ой и 2-ой вакцинации, соответственно. После 1-ой вакцинации наблюдалась максимальная отечность диаметром 2,8 см, которая длилась не больше 6 дней. После второй вакцинации максимальная отечность составляла 1 см в диаметре, а максимальная продолжительность составляла 5 дней. Ни у одной свиноматки не наблюдалось покраснения, повышения локальной температуры или боли в месте инъекции после какого-либо введения.

При посмертном осмотре видимая реакция в месте инокуляции наблюдалась только у 3/8 вакцинированных свиноматок. Две из них (15 и 1663) соответствовали тем, у которых самый высокий балл отечности (2 и 3, соответственно), данный при оценке местных реакций; макроскопически, поражения были описаны как бледные мышечные волокна после траектории иглы, которые были диагностированы как умеренный гранулематозный миозит с вовлечением мышечных волокон. В случае свиноматки 15 внутри поражения наблюдались капли вакцины, подтверждая тот факт, что это повреждение было вызвано в результате введения исследуемого продукта. Для другой свиноматки T02 (2547), которая показала видимую реакцию, поражение также описывалось как бледные мышечные волокна, следующие траектории иглы, но в этом случае также с множественными узлами, содержащими казеозный материал. При гистопатологическом анализе данное поражение было диагностировано как тяжелый гранулематозный миозит с наличием очагового, но обширного некроза. Поскольку наличие множественных узелков в области шеи, но не конкретно в точке инокуляции, наблюдалось также у 8/8 T02 и 5/7 свиноматок T01, возможно, что поражение, наблюдаемое у свиноматок 2547, было вызвано предыдущими инъекциями, а не исследуемым продуктом. Это подтверждается тем фактом, что при оценке локальных реакций in vivo у этой свиноматки была отечность диаметром менее 0,5 см, которая продолжалась 5 дней.

PRRSV-ассоциированные репродуктивные расстройства характеризуются повышенным числом опоросов, поздних абортов, мертворожденных или мало жизнеспособных поросят и мумифицированных плодов. В представленном исследовании, не было зарегистрировано ни одного аборта или преждевременных опоросов. Кроме того, не наблюдалось явного воздействия вакцинации на количество мертворожденных, мумифицированных или мало жизнеспособных поросят. Инфекция PRRSV может также увеличить смертность перед отлучением от матери. В представленном исследовании, среднее значение % смертности поросят перед отлучением от матери составляло 6,0 и 5,3 в группах T01 и T02, соответственно, что указывает на отсутствие влияния вакцинации на выживаемость поросят.

Наконец, все образцы сыворотки, полученные при рождении или при отлучении от матери, у поросят, рожденных от свиноматок, как группы T01, так и T02, были отрицательными к PRRSV по ОТ-кПЦР, что указывает на отсутствие трансплацентарной инфекции после вакцинации.

Таким образом, введение повторной однократной дозы MLV EU PRRSV PRRSV-сероположительным свиноматкам на 87 день беременности: не вызывало патологических системных реакций (анафилактический шок, рвота); не вызывало каких-либо клинических наблюдений в течение 14 дней после вакцинации не вызывало аномальных ректальных температур после вакцинации; вызывало локальные реакции в месте инъекции у 63% и 50% свиноматок после 1-ой и 2-ой вакцинации, соответственно, причем такие реакции состояли из пальпируемой и/или видимой отечности (от 0,4 до 2,8 см в диаметре), которая исчезала в течение от 1 до 6 дней; не оказывало влияния на репродуктивные параметры; и не вызывало трансплацентарную инфекцию.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Zoetis Services LLC

Calvert, Jay Gregory

Balasch, Monica

Fort, Maria

Pearce, Douglas S.

Keith, Marcia L.

<120> ЭФФЕКТИВНАЯ ВАКЦИНАЦИЯ ПРОТИВ ЕВРОПЕЙСКИХ ШТАММОВ ВИРУСА

РЕПРОДУКТИВНОГО И РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА (PRRS) ДО ОТЛУЧЕНИЯ

ОТ МАТЕРИ

<130> ZP000148A PCT

<150> 62/434,144

<151> 2016-12-14

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15092

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Изолят 96V198 вируса PRRS - пассаж 0

<400> 1

atgatgtgta gggtattccc cctacataca cgacacttct agtgtttgtg tgccttggag 60

gcgtgggtac agccccgccc cacctcttgg cccctgttct agcccaacag gtatccttct 120

ctctcggggc gagcgcgccg cctgctgctc ccttgcagca ggaaggacct cccgagtatt 180

tccggagagc acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc 240

ggtgcatgtg caccccggct gcccgggtat tttggaacgc cggccaagtc ttttgcacac 300

ggtgtctcag tgcgcggtct cttctctctc cggagcttca ggacactgac ctcgctgcaa 360

ttggcttgtt ttacaagcct aaagacaagc ttcactggaa agtccctatc ggcatccctc 420

aggtggagtg tactccgtcc gggtgctgtt ggctctcagc catcttcccc ttggcgcgca 480

tgacctccgg caatcacaac tttctccaac gacttgtgaa ggttgctgat gttttgtacc 540

gtgacggctg cttggcacct cgacaccttc gcgaactcca agtttacgag cgcggctgca 600

actggtaccc gatcacgggg cccgtgcccg ggatgggttt gtacgcgaac tccatgcacg 660

tgtccgacca accgtttcct ggtgccactc atgtgttaac gaactcacct ctgcctcagc 720

aggcttgtcg acagccgttt tgtccatttg aggaggttca ttccgacgta tacaggtgga 780

agaaattcgt gatttttgtg gattcctctt ctgacggccg atctcgcatg atgtggacac 840

caggatccga cgactcggct gccttagaag tattgccacc tgaactagaa tgtcgagtcg 900

aaatcctcgt tcggagtttt cctgcccacc accctgtcga catcaccaac tgggagctca 960

ctgagtcccc tgagcacggt ttttccttca gcacgtctca ttcttgtggt taccttgccc 1020

aaaaccctga cgtgtttgat ggtaagtgtt ggctttcttg ctttttgggc ctgccgaccg 1080

aagtgtggcg tcatgaggag tatctagcta acgccttcgg ttaccaaacc aagtggggcg 1140

tgcatggtaa gtacctccag cgcaggcttc aggtccgcgg catgcgtgct gtagttgatc 1200

ctgatggtcc catccacgtt gaagcgctgt cttgccccca gtcttggatc aggcacctga 1260

ctctaaatga tgacgtcacc ccaggatttg ttcgcctaac atcccttcgc attgagccga 1320

acacagagcc tactactttc cggatctttc ggtttggagc gcataagtgg tatggcgctg 1380

ccggcaaacg ggctcgtgct aagcgtgccg ctaaaggtga gaagaattca gctcccaccc 1440

ccaaggtcgc cctgccggtc cccacctgtg gaattaccac ctactctcca ccgacagacg 1500

ggtcttgtgg ttggcatgtc cttgccgcca taatgaaccg gatgataaat ggtgacttca 1560

cgtcccctct gactccgtac aacagaccag aggatgattg ggcttctgat tatgatcttg 1620

ctcaggcaat ccaatgtcta caactgcctg ctaccgtggt ccggagtcgc gcctgtccta 1680

acgccaagta cctcataaaa ctcaacggag tccactggga ggtagaggtg aggtcaggaa 1740

tggctcctcg ctctctttct cgtgaatgtg tggttggcgt ttgctctgaa ggttgtgttg 1800

caccgcctta tccagcagac gggctaccag aacgagcact cgaggccttg gcgtctgctt 1860

acaggttacc ctctgattgt gttagctctg gcattgctga ctttcttgct aacccacctc 1920

ctcaggaatt ctggaccctc gacaaaatgt tgacctcccc gtcaccagag cggtccggct 1980

tctctagttt gtataaatta ctattagagg ttgttccgca aaaatgcggt gccacggaag 2040

gggctttcgt ctatgctgtt gagagaatgt tgaaggattg tccgagctcc aaacaggcca 2100

tggcccttct ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tcccttgacg 2160

agtgtttccc tacggatgtt tcagccgact tcgagccagc atctcaggaa aggccccaaa 2220

gttccggtgc tgctgttgtc ctgtgttcac cggaagtaaa agagttcgaa gaagcagccc 2280

cagaagaagt tcaagagagt ggccacaagg tcgcccgctc tgcatttgtt gccgagggtc 2340

ctaacaatga acaggtaccg atggctgccg gcgagcaact gaagcccggt ggtcgcgttt 2400

tggcggtcgg gaatgctcat gaaggtgttc tggcctcaac tagtccgact aacctgatag 2460

gcgggaactt ccccccttca gactccatga aagagagcat gctcaatagc tgggaagacg 2520

aaccactgga tttgtcccaa ccggcaccag ctgttacaat gacccttgtg agagagcaaa 2580

cacccgacaa cctgggtcct gatgccggtg ccttccccgt caccgttcga aaatttgtcc 2640

cgacagggcc tacactccgt catgttgagc actgcggcac ggagtcaggc gacagcagtt 2700

cgcccttgga tctgtcttat gcgcaaaccc tggaccagcc tttaaatcta tccttggccg 2760

cttggccagt gagggccacc gcgtctgacc ctggctgggt ccacggtagg cgcgagccta 2820

tctttgtaaa gcctcgagat gctttctctg acggcgattc agcccttcag ttcggggagc 2880

tgtctgaatc cggctctgtc atcgagtttg accggacaag aaatgctccg gcggtcgacg 2940

cctctgttga cttgacggct tcgaacgagg ccctctctgt ggttgatcct ttcgaatttg 3000

ccgaactcaa gcgcccgcgt ttttccgcac aagccttaat tgaccgaggc ggtccacttg 3060

ccgacgtcca tgcaaaaata aagaaccggg tatatgaaca gtgcctccag gcttgtgagc 3120

ctggcagtcg cgcaacccca gccaccaagg agtggctcga taaaatgtgg gatagggtgg 3180

acatgaagac ttggcgctgt acctcgcagt tccaagctgg tcgcattctt gcgtccctta 3240

aattcctccc tgacatgatt caggacacac cacctcctgt tcctaggaag aatcgggcta 3300

gtgataatgc cggcctgaag cgactggtgg cgcagtggga cagaaaattg agtgcaaccc 3360

ccccttcaaa accggttgga ccaacacttg accaaattgt cccttcgccc acgggtaccc 3420

agcaagaaga tgtcacttcc tccgatgggc catctcatgc gccggatcct cctagtcgaa 3480

tgagcacgag tgggagttgg aagggccttg tgctctctgg tacccgtctc gcggggtcca 3540

ttagtcagca tttcatgaca tgggtttttg aggttttctc ccatctccca gcttttgcac 3600

tcacactttt ctcgccgagg ggctctatgg ctccaggtga ttggatgttt gcaggtgttg 3660

ttttacttgc tctcctgctc tgtcgttctt acccagtact cgggtgcctt cccttattgg 3720

gtgtcctttc tggctctgtg cggcgcgttc gtctgggggt ttttggttct tggatggctt 3780

tcgctgtatt tttattctcg actccatcca acccagtcgg ttcttcttgt gaccacgatt 3840

cgccggagtg tcatgctgag cttttggctc ttgagcagcg ccaactttgg gaacctgtgc 3900

gcggccttgt ggtcggcccc tcgggcctct tatgtgtcat tcttggcaag ctactcggtg 3960

ggtcacgtta tctctggcat gttttcttac gtttatgcat gcttgcagat ttggcccttt 4020

ctcttgttta tgtggtgtcc caggggcgtt gtcacaagtg ttggggaaag tgtataagaa 4080

cagctccggc ggaggtggct ctcaatgtgt tccctttctc gcgcgctacc cgtagctctc 4140

ttgtgtcctt gtgcgatcgg ttccaagcgc caaaaggggt tgatcctgtg tacttggcaa 4200

cgggttggcg cgggtgttgg tgtggtgaga gtcccattca tcaaccgcac caaaaaccca 4260

tagcttatgc taatttggat gaaaagaaaa tatctgccca aacggtggtt gctgtcccac 4320

acgatcccag tcaggccatc aagtgcctga aagttttgca ggcgggagga gccatcgtgg 4380

accagcccac acctgaggtc gtccgtgtat ccgaaatccc cttctcagcc ccatttttcc 4440

caaaagttcc agtcaaccca gattgtaagg ttgtggtgga ttcggacact tttgtggctg 4500

cggttcgctg cggctactcg acagcacaac tggtcctagg ccagggcaac tttgccaagt 4560

taaatcagat tcccctcagg agctccatct ccaccaaagc gattggcggg gcctcttaca 4620

cccttgctgt ggctcaagtt tctgtgtgga ctcttgttca cttcatcctc ggtctttggt 4680

tcacgtcacc ccaagtgtgt ggccgaggaa cctctgaccc atggtgttca aatccttttt 4740

cataccctac ctatggcccc ggggttgtgt gctcctctcg actttgtgtg tctgccgacg 4800

gggtcactct accattgttc tcagccgtgg ctcaactctc cggtagagag gtggggattt 4860

ttattttggt gctcgtctcc ttgatggctt tggcccaccg catggccctt aaggcagaca 4920

tgttgatggt ctttctggct ttttgtgctt acgcctggcc catgagctcc tggttgattt 4980

gcttctttcc tacactcttg aagtgggtta ccctccaccc tcttactatg ctttgggtgc 5040

actcattctt ggtgttttgt ctgccagcag ccggcatcct ctcactaggg ataactggcc 5100

ttctttgggc ggttggccgc tttactcagg ttgccggaat tattacacct tatgacatcc 5160

accagtacac ctctgggcca cgtggcgcag cagccgtggc cacagcccca gaaggcactt 5220

atatggccgc cgtcaggaga gctgctttaa ctgggcgaac tttaatcttc accccgtctg 5280

cagttggatc ccttctcgaa ggagctttca ggactcataa accttgtctt aacaccgtaa 5340

atgttgtagg ctcttccctt ggttccggcg gggttttcac tattgacggc agaaaaattg 5400

ttgtcactgc tgcccatgtg ttgaacggcg acacagctag agtcaccggc gactcctaca 5460

accgcatgca tactttcaag accaatggtg attatgcctg gtcccatgct gatgactggc 5520

ggggcgttgc ccctgcggtc aaggttgcga aggggtaccg cggtcgtgcc tactggcaaa 5580

catcaactgg cgtcgaaccc ggtgttattg gggaagggtt cgccttctgt ttcaccacct 5640

gtggcgattc ggggtcaccc gtcatctcag aatccggtga tctcattgga atccataccg 5700

gttcaaataa acttggttct ggtcttgtga caacccctga aggggagaca tgtaccatca 5760

aagaaaccaa gctctctgac ctttccagac atttcgcagg cccaagcgtt cctcttgggg 5820

atattaaatt gagtccagcc atcatccctg atgtaacatc cattccgagt gacttggcat 5880

cgctcctatc ctccgtccct gtagtggaag gcggcctctc gaccgttcaa cttttgtgtg 5940

tctttttcct actttggcgc atgatgggcc atgcctggac tcccattgtt gccgtgggtt 6000

tctttttact gaatgaaatt cttccagcag ttttggtccg agccgtgttt tcttttgcac 6060

tttttgtgct tgcatgggcc accccctggt ctgcacaggt gttgatgatt agactcctca 6120

cggcatctct caaccgcaac aagctttctc tggcgttcta cgcactcggg ggggtcgtcg 6180

gtttggccgc tgaaatcggg acttttgctg gcaaattgcc tgaattgtct caaacccttt 6240

cgacatactg cttcttacct agggtccttg ctatgaccag ttgtgttccc accatcatca 6300

ttggtggact ccatgccctc ggtgtaattc tgtggttgtt caaataccgg tgcctccaca 6360

acatgctcgt tggtgatggg agtttttcaa gcgccttctt cctacggtat tttgcagagg 6420

gtaatctcag aaaaggtgtt tcgcagtcct gtggcatgaa taacgagtcc ctgacggctg 6480

ctttagcttg caagttgtca caggctgacc ttgatttttt gtccagctta acgaacttca 6540

agtgctttgt atctgcttcg aatatgaaaa atgctgccgg ccagtacatt gaagcggcgt 6600

atgccaaggc cctgcgccaa gagttggcat ctctagttca gattgacaaa atgaaaggag 6660

ttttgtccaa actcgaggcc tttgctgaaa cagctactcc gtcccttgac ataggtgacg 6720

tgattgttct gcttgggcaa catccacacg gatctatcct tgatattaat gtggggactg 6780

agaggaaaac tgtgtccgtg caagagaccc ggagcctagg cggttccaaa ttcagtgttt 6840

gtactgtcgt gtctaacaca cccgtggacg ccttaaccgg catcccactc cagacaccaa 6900

cccctctttt tgagaatggt ccgcgtcatc gcagcgaaga agacgatctt aaagtcgaga 6960

ggatgaagaa acactgtgtg tccctcggct tccacaacat caatggcaaa gtttactgca 7020

agatttggga caagtccacc ggtgacacct tttacacgga tgattcccgg tatacccacg 7080

accatgcttt tcaggacagg tcagccgact acagagacag ggactatgag ggtgtgcaaa 7140

ccgcccccca acagggattt gatccaaagt ctgaaacccc tgtcggcact gttgtgatcg 7200

gcggtattac gtataacagg tatctgacta agggtaagga ggttctggtt cccaagcccg 7260

acaattgcct tgaagctgcc aagctgtctc ttgagcaagc tctcgctggg atgggccaaa 7320

cttgcgacct tacagctgcc gaggtggaaa agttaaagcg catcatcagt caactccaag 7380

gtttgaccac tgaacaggct ttaaactgct agccgctagc ggcttgaccc gctgtggccg 7440

cggcggctta gttgttactg aaacggcggt aaaaattgta agataccaca gcagaacttt 7500

caccttgggc cctttggacc taaaagtcgc ttctgaggtg gaggtgaaga gatcaactga 7560

gcagggccac gctgttgtgg caaacctatg ttctggtgtt gtattgatga gacctcaccc 7620

accgtccctt gttgacgttc ttctgaaacc cggacttgac acaacacccg gcattcaacc 7680

ggggcatggg gccgggaata tgggcgtgga cggttccatt tgggattttg aaaccgcacc 7740

cacaaaggca gaactcgagt tgtccaagca aataatccaa gcatgtgaag tcaggcgcgg 7800

ggatgccccg aacctccaac tcccttacaa gctctgtcca gttagggggg atcctgagcg 7860

gcataaaggc cgccttatca ataccaggtt tggagatttg ccttacaaga ctcctcaaga 7920

caccaagtcc gcaatccacg cggcttgttg cctgcacccc aacggggctc ccgtgtctga 7980

tggtaaatcc acattaggca ccactcttca acacggtttc gagctttatg tccctactgt 8040

gccctatagt gtcatggagt accttgattc acgccctgac acccccttta tgtgtaccaa 8100

acatggtact cccgaggctg ctgcagagga ccttcgaaaa tatgacttat ccacccaagg 8160

gtttgtcctg cctggggtcc tacgtctagt acgcagattc atctttggcc atattggtaa 8220

ggcaccgcca ctgttcctcc catcaactta tcccgccaag aactctatgg cagggatcaa 8280

tggccagagg ttcccaacaa aagacgttca gagcatacct gaaattgatg aaatgtgtgc 8340

ccgcgctgtc aaagagaatt ggcaaactgt gacgccttgc accctcaaaa aacagtattg 8400

ttccaagcct aaaaccagga ccatccttgg taccaacaac ttcattgcct tggctcacag 8460

gtcggcactc agcggtgtca ctcaggcgtt catgaaaaaa gcctggaagt ccccgatcgc 8520

cttggggaaa aacaaattta aggagttgca ctgcactgtc gccggtaggt gcctcgaggc 8580

cgacttggcc tcttgtgatc gcagcacccc ggccatcgtg aggtggtttg ttgccaacct 8640

cctgtacgaa cttgcgggtt gtgaagagta cttgccaagc tatgtgctca attgttgcca 8700

tgacctggtg gcaacgcaaa atggcgcctt cacaaaacgt ggtggcctgt catctggaga 8760

ccccgttacc agtgtgtcca acacagtgta ttcactggtg atttatgctc agcacatggt 8820

gctgtcggct ttgaagatgg gtcatgaaat cggcctcaag ttcctcgagg aacagcttaa 8880

gttcgaggac cttctcgaaa tccagcctat gttggtatat tctgatgacc ttgtattgta 8940

tgctgaaaga cccaccttcc ccaattacca ttggtgggtt gagcaccttg acctgatgct 9000

gggttttaag acagacccaa aaaagactgt cataactgac aaacccagct ttcttggctg 9060

tagaatcgaa gcggggcgac aactggttcc caatcgcgac cgcattctgg ctgctcttgc 9120

atatcacatg aaggcgcaga acgcctcaga gtattatgcg tctgctgccg cgattctgat 9180

ggactcgtgt gcttgcattg accacgatcc tgagtggtat gaggacctca tctgcggcat 9240

tgctcgatgc gcccgccagg atggctacag tttcccaggc ccgccgttct tcatgtccat 9300

gtgggagaag ctgaaaagtc acaatgaagg caagaaattc cgccactgtg gcatttgtga 9360

cgccaaggcc gatcatgcgt ccgcctgtgg gcttgattta tgtctgttcc actcgcactt 9420

tcatcaacac tgccctgtta ctctgagctg cggccatcat gccggttcaa aagaatgccc 9480

acagtgtcag tcacctgttg gagctggtaa atcccccctt gatgcagtgc tgaaacaaat 9540

cccgtacaaa ccccctcgtc ctgtcatcat gaaggtggac aataaaacaa cgacccttga 9600

cccgggaagg tatcagtccc gtcgaggtct tgttgctgtc aagaggggta ttgcaggcaa 9660

tgaggttgat ctcgctgatg gagactatca ggtagtgccc cttttgccaa cctgcaaaga 9720

cataaacatg gtgaaggtgg ctgtcaatgt gctactcagc aagttcatag tggggccgcc 9780

aggttccggc aagacgacct ggctactgag tcaagttcag gatgatgatg tcatctatac 9840

acctacccat cagaccatgt tcgacatagt caatgccctc aaagtctgta ggtattccat 9900

cccagtggct tcagggctcc ctttcccacc gcccgccaga tctggaccgt gggttaggct 9960

cgttgctagc gggcacatcc ctggccgaat atcatacctt gacgaggccg gatattgcaa 10020

tcatctggat attctcagac tgctttctaa gacacctctt gtgtgtttgg gtgaccttca 10080

gcaacttcac cctgtcggct ttgactctta ctgttatgtt tttgatcaaa tgcctcataa 10140

gcagctgacc actatttata gatttggccc caatatctgt tctgccattc aaccttgtta 10200

cagggaaaaa ctcgaatcta aggccaggaa cactagggtg gtttttactg cccggcccgt 10260

ggcttttggt caggtgttga cgccatatca taaagaccgc accggctcag ctataaccat 10320

agattcatcc cagggagcca cctttgatgt tgtgacgctg catttgccgt cgccagattc 10380

cctgaacaaa tcccgggctc ttgtagctat tactcgggca aggcatgggt tgttcatcta 10440

tgaccctcat aaccaactcc ggaagttttt caacttaaca cctgagcgca ctgattgcaa 10500

cctcgtgttc aaccgcgggg acgagttggt agttttgaat gcagataatg cagtcacgac 10560

tgtggctaag gttttggagg cgggcccgtc tcggtttcga gtatcagatc caaggtgcaa 10620

gtctctttta gccgcttgct cggccagtct ggaaggaggc tgcatgccac tgccgcaagt 10680

ggcacataat ctggggtttt acttctctcc agatagtcca gcatttgcac ctctgccaaa 10740

agagctggca ccacattggc cggtggttac tagtcagaac aaccaggcat ggcccgaccg 10800

acttgtcgct agtatgcggc cagttgatgc ccgctacagc aagcctatgg tcggtgcagg 10860

gtatgtggtt gggccatcca ctttccttgg cactcctggt gtagtgtcat actatctcac 10920

gctgtacatc aggggtgagc cccaggcctt gccggagaca ctcgtctcaa cgggacgtat 10980

agctactgat tgtcgagagt atctcgacgc agctgaggaa gaagcagcta aagaactccc 11040

tcacgcattc attggcgatg tcaaaggtac tacagtgggg gggtgtcacc acattacgtc 11100

aaaatacctt cccaggtcct tgcccaagga ctccgttgcc gtggtcggag tgagttcgcc 11160

cggcaaggct gccaaagccg tgtgtactct caccgatgtg tatcttcccg agctccggcc 11220

atatttgcaa ccggaaacag catcgaaatg ctggaaactt aaactagact tcagggatgt 11280

cagactgatg gtctggaaag gagccaccgc atatttccaa ctggaggggc tcacatggtc 11340

agcgctgccc gactatgcca ggttcattca gctaccaaaa gatgccgttg tgtacattga 11400

tccgtgcata ggaccggcaa cagccaaccg taaggttgtg agaactacag attggcgagc 11460

tgacctggca gtgacaccgt acgactacgg tgctcagagc attttgacta cagcctggtt 11520

cgaggacctt gggccgcagt ggaagatttt agggttgcaa cccttcaagc gggcatttgg 11580

ctttgaaaac actgaggatt gggcgatcct tgcacgtcgc atgaacgacg gcaaggacta 11640

cactgactat aactggaatt gtgttcgaca acgcccacat gccatctacg gacgtgcccg 11700

tgaccatacg tatcactttg cccctggcac tgaactgcaa gtagagctag gtaaaccccg 11760

gctaccgcct gagcaagtac cgtgaatcta gagtgatgca atggggtcac tgtggagtaa 11820

aatcagtcaa ctgttcgtgg atgccttcac tgagttcctc gttagtgtgg ttgatattgt 11880

catcttcctt gccatactgt ttgggttcac cgttgcaggg tggttactgg tctttttttt 11940

cagagtggtt tgctccgcgc ttctccgttc gcgctctgcc attcactctt ccgaactatc 12000

gaaggtccta tgagggcttg ctacctaatt gcagaccgga tgttccacaa ttcgcagtca 12060

agcacccatt gggtatactt tggcacatgc gagtttccca cttaattgac gaaatggtct 12120

ctcgccgcat ttaccagacc atggaacatt caggtcaagc ggcctggaag caggtggtta 12180

gtgaagctac tctcacaaga ctgtcaaagc tcgacatagt tctccacttc caacacctgg 12240

ccgcaataga ggcggattct tgccgcttcc tcagctcacg acttgtgatg ctgaaaaatc 12300

ttgccgttgg caatatgagc ctacagtaca acaccacgtt ggaccgcgtt gagctcatct 12360

tcccaacacc aggtacgagg cccaaattga ccgattttag acaatggctc gtcagtgtgc 12420

acgcttctat tttttcctct gtggcctcat cagttacctt gttcatagtg ctttggcttc 12480

gaattccagc tctacgctat gtttttggtt tccattggcc cacggcaaca catcattcga 12540

gctaaccatc aattacacta tatgtaagcc ctgtctcacc agtcaagcgg ctcgacaaag 12600

gctcgaaccc ggtcgcaaca tgtggtgcaa aataggacac accacgtgtg aggagcgtga 12660

ccatgatgag ttgtcaatga ccattccgtc cgggtacgat aacctcaaac ttgagggtta 12720

ttacgcttgg ctggcttttt tgtccttttc ttacgcagcc caatttcatc cagagttgtt 12780

cggaataggg aatgtgtcac gcgtcttcgt ggataaacgg caccagttca tctgtgccga 12840

gcacgacgga caaaattcaa ccgtatccac cgaacataat atttccgcat tgtatgcggc 12900

gtactaccac caccaggtag acgggggcaa ttggttccac ctggaatggc tgcggccttt 12960

cttttcctcc tggctagtac tcaatatttc atggtttctg aggcgttcgc ctgcaagccc 13020

tgtttctcga cgcatttatc agatattgag accaacacga ccgcggctgc cggtttcatg 13080

gtccttcagg acatcaactg tttccacagt ggctcagagg cacaaacgac tggtcccatc 13140

agaaagtcgt cccaatgccg tgaagccgtc ggcactcccc agtacatcaa gataacggcc 13200

aatgtgaccg acgaatcata cttgtacaac gcggacttgc tgatgctttc tgcgtgcctt 13260

ttctacgcct cagagatgag cgagaaaggc tttaaagtca tttttgggaa tgtctctggc 13320

gttgtctccg cttgtgtcaa ttttacagat tatgtggccc atgtgaccca acatacccag 13380

cagcatcatt tggtaatcaa tcacattcgg ttgctacatt tcctgacacc atcagcaatg 13440

aggtgggcta caaccattgc ttgtttgttc gccattctct tggcgatatg agatgttctc 13500

acaaatcggg gtgtttcttg actccgcact cttgcttctg gtggcttttt ttgctgtgta 13560

ccggcttgtc ctggtccttt gccgatggca acggcaacag ctcgacatac caatatatat 13620

ataacttgac gatatgcgag ctgaatggga ccgaatggct gtccgaccat tttaattggg 13680

cagtcgagac ttttgtgctc tacccagtgg cgactcatat cctctcactg ggtttcctca 13740

cgacaagtca tttccttgat gcgttcggtc ttggagctgt gtcagttaca gggttttgtg 13800

gcgggcggta cgtgctcagc agcgtgtacg gcgcttgtgc actagcagcg ctcgtatgtt 13860

ttgttatccg tgctgccaaa aattgtatgg cttgccgcta tgctcgtacc cggtttacca 13920

acttcattgt ggatgaccgg gggagaatcc atcggtggag gtctccaata gtggtggaaa 13980

aattaggtaa agctgacgtc ggcggcgacc ttgtcaccat caaacatgtc atcctcgaag 14040

gagtcaaagc tcaacccttg acgaggactt cggccgagca atgggaggcc tagataattt 14100

ctgcaacgat cccaccgccg cacaaaagct tgtgctagcc tttagcatca catatacacc 14160

catcatgata tacgccctta aggtgtcacg cggccgactc ttggggttgt tgcacatctt 14220

gatatttctg aactgttctt tcacgttcgg atacatgaca tatatgcatt ttgaatccac 14280

caaccgtgtc gcgcttacca tggggggcgt tgtcgccctt ctgtggggcg tttatagttt 14340

catagagtca tggaagttta tcacttccag atgcagattg tgttgcctag gccggcgata 14400

cattctggcc cctgcccacc acgtagaaag tgctgcaggc ctccatccga tcccagcgtc 14460

tggtaaccaa gcatacgctg tgagaaagcc cggactaaca tcagtgaacg gcactctggt 14520

accaggactt cgaggcctcg tgctgggcgg caaacgagct gttaaacgag gagtggttaa 14580

cctcgtcaag tatggccggt aaaaaccaga gccagaagaa aaagaaaaat ccagctccaa 14640

tggggaatgg ccagtcagtc aatcaactgt gccagctgct gggcacaatg ataaagtccc 14700

agcgccagcg acccagggga ggacaggcta aaaagaaaaa gcctgagaag ccacatttcc 14760

ccctggctgc tgaagatgac gtccggcacc atctcaccca gaccgagcgc tccctttgct 14820

tgcaatcgat ccagacggct tttaatcaag gcgcaggaac tgcgtcgctt tcatccagcg 14880

ggaagatcgg ttttcaggtt gagtttatgc taccggttgc tcatacagtg cgcctgattc 14940

gcgtgacttc tacatccgcc ggtcaggatg caaattaatt tgatagtcag gtgaatggcc 15000

gcgattggcg tgtggcctct gagtcaccta ttcaattagg gcgatcacat gggggtcaga 15060

cttaattagg caggaaccat gtgaccgaaa tt 15092

<210> 2

<211> 15092

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Изолят 96V198 вируса PRRS - пассаж 1

<400> 2

atgatgtgta gggtattccc cctacataca cgacacttct agtgtttgtg tgccttggag 60

gcgtgggtac agccccgccc cacctcttgg cccctgttct agcccaacag gtatccttct 120

ctctcggggc gagcgcgccg cctgctgctc ccttgcagca ggaaggacct cccgagtatt 180

tccggagagc acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc 240

ggtgcatgtg caccccggct gcccgggtat tttggaacgc cggccaagtc ttttgcacac 300

ggtgtctcag tgcgcggtct cttctctctc cagagcttca ggacactgac ctcgctgcaa 360

tcggcttgtt ttacaagcct aaagacaagc ttcactggaa agtccctatc ggcatccctc 420

aggtggagtg tactccgtcc gggtgctgtt ggctctcagc catcttcgtc ttggcgcgca 480

tgacctccgg caatcacaac tttccccaac gacttgtgaa ggttgctgat gttttgtacc 540

gtgacggctg cttggcacct cgacaccttc gcgaactcca agtttacgag cgcggctgca 600

actggtaccc gatcacgggg cccgtgcccg ggatgggttt atacgcgaac tctatgcatg 660

tgtccgacca accgtttcct ggtgccaccc atgtgttgac gaactcacct ctgcctcagc 720

aggcttgtcg acagccgttt tgtccatttg aggaggttca ttccgacgta tacaggtgga 780

agaaattcgt gatttttgtg gattcctctt ctgacggccg atctcgcatg atgtggacac 840

caggatccga cgactcggct gccttagaag tattgccacc tgaactagaa tgtcgagtcg 900

aaatcctcgt tcggagtttt cctgcccacc accctgtcga catcaccaac tgggagctca 960

ctgagtcccc tgagcacggt ttttccttca gcacgtctca ttcttgtggt taccttgccc 1020

aaaaccctga cgtgtttgat ggtaagtgtt ggctttcttg ctttttgggc ctgccgaccg 1080

aagtgtggcg tcatgaggag tatctagcta acgccttcgg ttaccaaacc aagtggggcg 1140

tgcatggtaa gtacctccag cgcaggcttc aggtccgcgg catgcgtgct gtagttgatc 1200

ctgatggtcc catccacgtt gaagcgctgt cttgccccca gtcttggatc aggcacctga 1260

ctctaaatga tgacgtcacc ccaggatttg ttcgcctaac atcccttcgc attgagccga 1320

acacagagcc tactactttc cggatctttc ggtttggagc gcataagtgg tatggcgctg 1380

ccggcaaacg ggctcgtgct aagcgtgccg ctaaaggtga gaagaattca gctcccaccc 1440

ccaaggtcgc cctgccggtc cccacctgtg gaattaccac ctactctcca ccgacagacg 1500

ggtcttgtgg ttggcatgtc cttgccgcca taatgaaccg gatgataaat ggtgacttca 1560

cgtcccctct gactccgtac aacagaccag aggatgattg ggcttctgat tatgatcttg 1620

ctcaggcaat ccaatgtcta caactgcctg ctaccgtggt ccggagtcgc gcctgtccta 1680

acgccaagta cctcataaaa ctcaacggag tccactggga ggtagaggtg aggtcaggaa 1740

tggctcctcg ctctctttct cgtgaatgtg tggttggcgt ttgctctgaa ggttgtgttg 1800

caccgcctta tccagcagac gggctaccag aacgagcact cgaggccttg gcgtctgctt 1860

acaggttacc ctctgattgt gttagctctg gcattgctga ctttcttgct aacccacctc 1920

ctcaggaatt ctggaccctc gacaaaatgt tgacctcccc gtcaccagag cggtccggct 1980

tctctagttt gtataaatta ctattagagg ttgttccgca aaaatgcggt gccacggaag 2040

gggctttcgt ctatgctgtt gagagaatgt tgaaggattg tccgagctcc aaacaggcca 2100

tggcccttct ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tcccttgacg 2160

agtgtttccc tacggatgtt tcagccgact tcgagccagc atctcaggaa aggccccaaa 2220

gttccggtgc tgctgttgtc ctgtgttcac cggaagtaaa agagttcgaa gaagcagccc 2280

cagaagaagt tcaagagagt ggccacaagg tcgcccgctc tgcatttgtt gccgagggtc 2340

ctaacaatga acaggtaccg atggctgccg gcgagcaact gaagcccggt ggtcgcgttt 2400

tggcggtcgg gaatgctcat gaaggtgttc tggcctcaac tagttcgact aacctgatag 2460

gcgggaactt ccccccttca gactccatga aagagagcat gctcaatagc tgggaagacg 2520

aaccactgga tttgtcccaa ccggcaccag ctgttacaat gacccttgtg agagagcaaa 2580

cacccgacaa cctgggtcct gatgccggtg ccttccccgt caccgttcga aaatttgtcc 2640

cgacagggcc tacactccgt catgttgagc actgcggcac ggagtcaggc gacagcagtt 2700

cgcccttgga tctgtcttat gcgcaaaccc tggaccagcc tttaaatcta tccttggccg 2760

cttggccagt gagggccacc gcgtctgacc ctggctgggt ccacggtagg cgtgagccta 2820

tctttgtaaa gcctcgagat gctttctctg acggcgattc agcccttcag ctcggggagc 2880

tgtctgaatc cggctccgtc atcgagtttg accggacaag aaatgctccg gcggtcgacg 2940

cccctgttga cttgacggct tcgaacgagg ccctctctgt ggttgatcct ttcgaatttg 3000

ccgaactcaa gcgcccgcgt ttttccgcac aagccttaat tgaccgaggc ggtccacttg 3060

ccgacgtcca tgcaaaaata aagaaccggg tatatgaaca gtgcctccag gcttgtgagc 3120

ctggcagtcg cgcaacccca gccaccaagg agtggctcga taaaatgtgg gatagggtgg 3180

acatgaagac ttggcgctgt acctcgcagt tccaagctgg tcgcattctt gcgtccctta 3240

aattcctccc tgacatgatt caggacacac cacctcctgt tcctaggaag aatcgggcta 3300

gtgataatgc cggcctgaag cgactggtgg cgcagtggga cagaaaattg agtgcaaccc 3360

ccccttcaaa accggttgga ccaacacttg accaaattgt cccttcgccc acgggtaccc 3420

agcaagaaga tgtcacttcc tccgatgggc catctcatgc gccggatcct cctagtcgaa 3480

tgagcacgag tgggagttgg aagggccttg tgctctctgg tacccgtctc gcggggtcca 3540

ttagtcagca tttcatgaca tgggtttttg aggttttctc ccatctccca gcttttgcac 3600

tcacactttt ctcgccgagg ggctctatgg ctccaggtga ttggatgttt gcaggtgttg 3660

ttttacttgc tctcctgctc tgtcgttctt acccagtact cgggtgcctt cccttattgg 3720

gtgtcctttc tggctctgtg cggcgcgttc gtctgggggt ttttggttct tggatggctt 3780

tcgctgtatt tttattctcg actccatcca acccagtcgg ttcttcttgt gaccacgatt 3840

cgccggagtg tcatgctgag cttttggctc ttgagcagcg ccaactttgg gaacctgtgc 3900

gcggccttgt ggtcggcccc tcgggcctct tatgtgtcat tcttggcaag ctactcggtg 3960

ggtcacgtta tctctggcat gttttcttac gtttatgcat gcttgcagat ttggcccttt 4020

ctcttgttta tgtggtgtcc caggggcgtt gtcacaagtg ttggggaaag tgtataagaa 4080

cagctccggc ggaggtggct ctcaatgtgt tccctttctc gcgcgctacc cgtagctctc 4140

ttgtgtcctt gtgcgatcgg ttccaagcgc caaaaggggt tgatcctgtg tacttggcaa 4200

cgggttggcg cgggtgttgg tgtggtgaga gtcccattca tcaaccgcac caaaaaccca 4260

tagcttatgc taatttggat gaaaagaaaa tatctgccca aacggtggtt gctgtcccac 4320

acgatcccag tcaggccatc aagtgcctga aagttttgca ggcgggagga gccatcgtgg 4380

accagcccac acctgaggtc gtccgtgtat ccgaaatccc cttctcagcc ccatttttcc 4440

caaaagttcc agtcaaccca gattgtaagg ttgtggtgga ttcggacact tttgtggctg 4500

cggttcgctg cggctactcg acagcacaac tggtcctagg ccagggcaac tttgccaagt 4560

taaatcagat tcccctcagg agctccatct ccaccaaagc gattggcggg gcctcttaca 4620

cccttgctgt ggctcaagtt tctgtgtgga ctcttgttca cttcatcctc ggtctttggt 4680

tcacgtcacc ccaagtgtgt ggccgaggaa cctctgaccc atggtgttca aatccttttt 4740

cataccctac ctatggcccc ggggttgtgt gctcctctcg actttgtgtg tctgccgacg 4800

gggtcactct accattgttc tcagccgtgg ctcaactctc cggtagagag gtggggattt 4860

ttattttggt gctcgtctcc ttgatggctt tggcccaccg catggccctt aaggcagaca 4920

tgttgatggt ctttctggct ttttgtgctt acgcctggcc catgagctcc tggttgattt 4980

gcttctttcc tacactcttg aagtgggtta ccctccaccc tcttactatg ctttgggtgc 5040

actcattctt ggtgttttgt ctgccagcag ccggcatcct ctcaataggg ataactggcc 5100

ttctttgggc ggttggccgc tttactcagg ttgccggaat tattacacct tatgacatcc 5160

accagtacac ctctgggcca cgtggcgctg cagctgtggc cacagcccca gaaggcactt 5220

atatggccgc cgtccggaga gctgctttaa ctgggcgaac tttaatcttc accccgtctg 5280

cagttggatc ccttctcgaa ggagctttca ggactcataa accttgtctt aacaccgtaa 5340

atgttgtagg ctcttccctt ggttccggcg gggttttcac tattgacggc agaaaaattg 5400

ttgtcactgc tgcccatgtg ttgaacggcg acacagctag agtcaccggc gactcctaca 5460

accgcatgca tactttcaag accaatggtg attatgcctg gtcccatgct gatgactggc 5520

ggggcgttgc ccctgcggtc aaggttgcga aggggtaccg cggtcgtgcc tactggcaaa 5580

catcaactgg cgtcgaaccc ggtgttattg gggaagggtt cgccttctgt ttcaccacct 5640

gtggcgattc ggggtcaccc gtcatctcag aatccggtga tctcattgga atccataccg 5700

gttcaaataa acttggttct ggtcttgtga caacccctga aggagagaca tgtgccatca 5760

aagaaaccaa gctctctgac ctttccagac atttcgcagg cccaagcgtt cctcttgggg 5820

atattaaatt gagtccagcc atcatccctg atgtaacatc cattccgagt gacttggcat 5880

cgctcctatc ctccgtccct gtagtggaag gcggcctctc gaccgttcaa cttttgtgtg 5940

tctttttcct actttggcgc atgatgggcc atgcctggac tcccattgtt gccgtgggtt 6000

tctttttact gaatgaaatt cttccagcag ttttggtccg agccgtgttt tcttttgcac 6060

tttttgtgct tgcatgggcc accccctggt ctgcacaggt gttgatgatt agactcctca 6120

cggcatctct caaccgcaac aagctttctc tggcgttcta cgcactcggg ggggtcgtcg 6180

gtttggccgc tgaaatcggg acttttgctg gcaaattgcc tgaattgtct caaacccttt 6240

cgacatactg cttcttacct agggtccttg ctatgaccag ttgtgttccc accatcatca 6300

ttggtggact ccatgccctc ggtgtaattc tgtggttgtt caaataccgg tgcctccaca 6360

acatgctcgt tggtgatggg agtttttcaa gcgccttctt cctacggtat tttgcagagg 6420

gtaatctcag aaaaggtgtt tcgcagtcct gtggcatgaa taacgagtcc ctgacggctg 6480

ctttagcttg caagttgtca caggctgacc ttgatttttt gtccagctta acgaacttca 6540

agtgctttgt atctgcttcg aatatgaaaa atgctgccgg ccagtacatt gaagcggcgt 6600

atgccaaggc cctgcgccaa gagttggcat ctctagttca gattgacaaa atgaaaggag 6660

ttttgtccaa actcgaggcc tttgctgaaa cagctactcc gtcccttgac ataggtgacg 6720

tgattgttct gcttgggcaa catccacacg gatctatcct tgatattaat gtggggactg 6780

agaggaaaac tgtgtccgtg caagagaccc ggagcctagg cggttccaaa ttcagtgttt 6840

gtactgtcgt gtctaacaca cccgtggacg ccttaaccgg catcccactc cagacaccaa 6900

cccctctttt tgagaatggt ccgcgtcatc gcagcgaaga agacgatctt aaagtcgaga 6960

ggatgaagaa acactgtgtg tccctcggct tccacaacat caatggcaaa gtttactgca 7020

agatttggga caagtccacc ggtgacacct tttacacgga tgattcccgg tatacccacg 7080

accatgcttt tcaggacagg tcagccgact acagagacag ggactatgag ggtgtgcaaa 7140

ccgcccccca acagggattt gatccaaagt ctgaaacccc tgtcggcact gttgtgatcg 7200

gcggtattac gtataacagg tatctgacta agggtaagga ggttctggtt cccaagcccg 7260

acaattgcct tgaagctgcc aagctgtctc ttgagcaagc tctcgctggg atgggccaaa 7320

cttgcgacct tacagctgcc gaggtggaaa agttaaagcg catcatcagt caactccaag 7380

gtttgaccac tgaacaggct ttaaactgct agccgctagc ggcttgaccc gctgtggccg 7440

cggcggctta gttgttactg aaacggcggt aaaaattgta agataccaca gcagaacttt 7500

caccttgggc cctttggacc taaaagtcgc ttctgaggtg gaggtgaaga gatcaactga 7560

gcagggccac gctgttgtgg caaacctatg ttctggtgtt gtattgatga gacctcaccc 7620

accgtccctt gttgacgttc ttctgaaacc cggacttgac acaacacccg gcattcaacc 7680

ggggcatggg gccgggaata tgggcgtgga cggttccatt tgggattttg aaaccgcacc 7740

cacaaaggca gaactcgagt tgtccaagca aataatccaa gcatgtgaag tcaggcgcgg 7800

ggatgccccg aacctccaac tcccttacaa gctctgtcca gttagggggg atcctgagcg 7860

gcataaaggc cgccttatca ataccaggtt tggagatttg ccttacaaga ctcctcaaga 7920

caccaagtcc gcaatccacg cggcttgttg cctgcacccc aacggggctc ccgtgtctga 7980

tggtaaatcc acattaggca ccactcttca acacggtttc gagctttatg tccctactgt 8040

gccctatagt gtcatggagt accttgattc acgccctgac acccccttta tgtgtaccaa 8100

acatggtact cccgaggctg ctgcagagga ccttcgaaaa tatgacttat ccacccaagg 8160

gtttgtcctg cctggggtcc tacgtctagt acgcagattc atctttggcc atattggtaa 8220

ggcaccgcca ctgttcctcc catcaactta tcccgccaag aactctatgg cagggatcaa 8280

tggccagagg ttcccaacaa aagacgttca gagcatacct gaaattgatg aaatgtgtgc 8340

ccgcgctgtc aaagagaatt ggcaaactgt gacgccttgc accctcaaaa aacagtattg 8400

ttccaagcct aaaaccagga ccatccttgg taccaacaac ttcattgcct tggctcacag 8460

gtcggcactc agcggtgtca ctcaggcgtt catgaaaaaa gcctggaagt ccccgatcgc 8520

cttggggaaa aacaaattta aggagttgca ctgcactgtc gccggtaggt gcctcgaggc 8580

cgacttggcc tcttgtgatc gcagcacccc ggccatcgtg aggtggtttg ttgccaacct 8640

cctgtacgaa cttgcgggtt gtgaagagta cttgccaagc tatgtgctca attgttgcca 8700

tgacctggtg gcaacgcaaa atggcgcctt cacaaaacgt ggtggcctgt catctggaga 8760

ccccgttacc agtgtgtcca acacagtgta ttcactggtg atttatgctc agcacatggt 8820

gctgtcggct ttgaagatgg gtcatgaaat cggcctcaag ttcctcgagg aacagcttaa 8880

gttcgaggac cttctcgaaa tccagcctat gttggtatat tctgatgacc ttgtattgta 8940

tgctgaaaga cccaccttcc ccaattacca ttggtgggtt gagcaccttg acctgatgct 9000

gggttttaag acagacccaa aaaagactgt cataactgac aaacccagct ttcttggctg 9060

tagaatcgaa gcggggcgac aactggttcc caatcgcgac cgcattctgg ctgctcttgc 9120

atatcacatg aaggcgcaga acgcctcaga gtattatgcg tctgctgccg cgattctgat 9180

ggactcgtgt gcttgcattg accacgatcc tgagtggtat gaggacctca tctgcggcat 9240

tgctcgatgc gcccgccagg atggctacag tttcccaggc ccgccgttct tcatgtccat 9300

gtgggagaag ctgaaaagtc acaatgaagg caagaaattc cgccactgtg gcatttgtga 9360

cgccaaggcc gatcatgcgt ccgcctgtgg gcttgattta tgtctgttcc actcgcactt 9420

tcatcaacac tgccctgtta ctctgagctg cggccatcat gccggttcaa aagaatgccc 9480

acagtgtcag tcacctgttg gagctggtaa atcccccctt gatgcagtgc tgaaacaaat 9540

cccgtacaaa ccccctcgtc ctgtcatcat gaaggtggac aataaaacaa cgacccttga 9600

cccgggaagg tatcagtccc gtcgaggtct tgttgctgtc aagaggggta ttgcaggcaa 9660

tgaggttgat ctcgctgatg gagactatca ggtagtgccc cttttgccaa cctgcaaaga 9720

cataaacatg gtgaaggtgg ctgtcaatgt gctactcagc aagttcatag tggggccgcc 9780

aggttccggc aagacgacct ggctactgag tcaagttcag gatgatgatg tcatctatac 9840

acctacccat cagaccatgt tcgacatagt caatgccctc aaagtctgta ggtattccat 9900

cccagtggct tcagggctcc ctttcccacc gcccgccaga tctggaccgt gggttaggct 9960

cgttgctagc gggcacatcc ctggccgaat atcatacctt gacgaggccg gatattgcaa 10020

tcatctggat attctcagac tgctttctaa gacacctctt gtgtgtttgg gtgaccttca 10080

gcaacttcac cctgtcggct ttgactctta ctgttatgtt tttgatcaaa tgcctcataa 10140

gcagctgacc actatttata gatttggccc caatatctgt tctgccattc aaccttgtta 10200

cagggaaaaa ctcgaatcta aggccaggaa cactagggtg gtttttactg cccggcccgt 10260

ggcttttggt caggtgttga cgccatatca taaagaccgc accggctcag ctataaccat 10320

agattcatcc cagggagcca cctttgatgt tgtgacgctg catttgccgt cgccagattc 10380

cctgaacaaa tcccgggctc ttgtagctat tactcgggca aggcatgggt tgttcatcta 10440

tgaccctcat aaccaactcc ggaagttttt caacttaaca cctgagcgca ctgattgcaa 10500

cctcgtgttc aaccgcgggg acgagttggt agttttgaat gcagataatg cagtcacgac 10560

tgtggctaag gttttggagg cgggcccgtc tcggtttcga gtatcagatc caaggtgcaa 10620

gtctctttta gccgcttgct cggccagtct ggaaggaggc tgcatgccac tgccgcaagt 10680

ggcacataat ctggggtttt acttctctcc agatagtcca gcatttgcac ctctgccaaa 10740

agagctggca ccacattggc cggtggttac tagtcagaac aaccaggcat ggcccgaccg 10800

acttgtcgct agtatgcggc cagttgatgc ccgctacagc aagcctatgg tcggtgcagg 10860

gtatgtggtt gggccatcca ctttccttgg cactcctggt gtagtgtcat actatctcac 10920

gctgtacatc aggggtgagc cccaggcctt gccggagaca ctcgtctcaa cgggacgtat 10980

agctactgat tgtcgagagt atctcgacgc agctgaggaa gaagcagcta aagaactccc 11040

tcacgcattc attggcgatg tcaaaggtac tacagtgggg gggtgtcacc acattacgtc 11100

aaaatacctt cccaggtcct tgcccaagga ctccgttgcc gtggtcggag tgagttcgcc 11160

cggcaaggct gccaaagccg tgtgtactct caccgatgtg tatcttcccg agctccggcc 11220

atatttgcaa ccggaaacag catcgaaatg ctggaaactt aaactagact tcagggatgt 11280

cagactgatg gtctggaaag gagccaccgc atatttccaa ctggaggggc tcacatggtc 11340

agcgctgccc gactatgcca ggttcattca gctaccaaaa gatgccgttg tgtacattga 11400

tccgtgcata ggaccggcaa cagccaaccg taaggttgtg agaactacag attggcgagc 11460

tgacctggca gtgacaccgt acgactacgg tgctcagagc attttgacta cagcctggtt 11520

cgaggacctt gggccgcagt ggaagatttt agggttgcaa cccttcaagc gggcatttgg 11580

ctttgaaaac actgaggatt gggcgatcct tgcacgtcgc atgaacgacg gcaaggacta 11640

cactgactat aactggaatt gtgttcgaca acgcccacat gccatctacg gacgtgcccg 11700

tgaccatacg tatcactttg cccctggcac tgaactgcaa gtagagctag gtaaaccccg 11760

gctaccgcct gagcaagtac cgtgaatcta gagtgatgca atggggtcac tgtggagtaa 11820

aatcagtcaa ctgttcgtgg atgccttcac tgagttcctc gttagtgtgg ttgatattgt 11880

catcttcctt gccatactgt ttgggttcac cgttgcaggg tggttactgg tctttttttt 11940

cagagtggtt tgctccgcgc ttctccgttc gcgctctgcc attcactctt ccgaactatc 12000

gaaggtccta tgagggcttg ctacctaatt gcagaccgga tgttccacaa ttcgcagtca 12060

agcacccatt gggtatactt tggcacatgc gagtttccca cttaattgac gaaatggtct 12120

ctcgccgcat ttaccagacc atggaacatt caggtcaagc ggcctggaag caggtggtta 12180

gtgaagctac tctcacaaga ctgtcaaagc tcgacatagt tctccacttc caacacctgg 12240

ccgcaataga ggcggattct tgccgcttcc tcagctcacg acttgtgatg ctgaaaaatc 12300

ttgccgttgg caatatgagc ctacagtaca acaccacgtt ggaccgcgtt gagctcatct 12360

tcccaacacc aggtacgagg cccaaattga ccgattttag acaatggctc gtcagtgtgc 12420

acgcttctat tttttcctct gtggcctcat cagttacctt gttcatagtg ctttggcttc 12480

gaattccagc tctacgctat gtttttggtt tccattggcc cacggcaaca catcattcga 12540

gctaaccatc aattacacta tatgtaagcc ctgtctcacc agtcaagcgg ctcgacaaag 12600

gctcgaaccc ggtcgcaaca tgtggtgcaa aataggacac accacgtgtg aggagcgtga 12660

ccatgatgag ttgtcaatga ccattccgtc cgggtacgat aacctcaaac ttgagggtta 12720

ttacgcttgg ctggcttttt tgtccttttc ttacgcagcc caatttcatc cagagttgtt 12780

cggaataggg aatgtgtcac gcgtcttcgt ggataaacgg caccagttca tctgtgccga 12840

gcacgacgga caaaattcaa ccgtatccac cgaacataat atttccgcat tgtatgcggc 12900

gtactaccac caccaggtag acgggggcaa ttggttccac ctggaatggc tgcggccttt 12960

cttttcctcc tggctagtac tcaatatttc atggtttctg aggcgttcgc ctgcaagccc 13020

tgtttctcga cgcatttatc agatattgag accaacacga ccgcggctgc cggtttcatg 13080

gtccttcagg acatcaactg tttccacagt ggctcagagg cacaaacgac tggtcccatc 13140

agaaagtcgt cccaatgccg tgaagccgtc ggcactcccc agtacatcaa gataacggcc 13200

aatgtgaccg acgaatcata cttgtacaac gcggacttgc tgatgctttc tgcgtgcctt 13260

ttctacgcct cagagatgag cgagaaaggc tttaaagtca tttttgggaa tgtctctggc 13320

gttgtctccg cttgtgtcaa ttttacagat tatgtggccc atgtgaccca acatacccag 13380

cagcatcatt tggtaatcaa tcacattcgg ttgctacatt tcctgacacc atcagcaatg 13440

aggtgggcta caaccattgc ttgtttgttc gccattctct tggcgatatg agatgttctc 13500

acaaatcggg gtgtttcttg actccgcact cttgcttctg gtggcttttt ttgctgtgta 13560

ccggcttgtc ctggtccttt gccgatggca acggcaacag ctcgacatac caatatatat 13620

ataacttgac gatatgcgag ctgaatggga ccgaatggct gtccgaccat tttaattggg 13680

cagtcgagac ttttgtgctc tacccagtgg cgactcatat cctctcactg ggtttcctca 13740

cgacaagtca tttccttgat gcgttcggtc ttggagctgt gtcagttaca gggttttgtg 13800

gcgggcggta cgtgctcagc agcgtgtacg gcgcttgtgc actagcagcg ctcgtatgtt 13860

ttgttatccg tgctgccaaa aattgtatgg cttgccgcta tgctcgtacc cggtttacca 13920

acttcattgt ggatgaccgg gggagaatcc atcggtggag gtctccaata gtggtggaaa 13980

aattaggtaa agctgacgtc ggcggcgacc ttgtcaccat caaacatgtc atcctcgaag 14040

gagtcaaagc tcaacccttg acgaggactt cggccgagca atgggaggcc tagataattt 14100

ctgcaacgat cccaccgccg cacaaaagct tgtgctagcc tttagcatca catatacacc 14160

catcatgata tacgccctta aggtgtcacg cggccgactc ttggggttgt tgcacatctt 14220

gatatttctg aactgttctt tcacgttcgg atacatgaca tatatgcatt ttgaatccac 14280

caaccgtgtc gcgcttacca tggggggcgt tgtcgccctt ctgtggggcg tttatagttt 14340

catagagtca tggaagttta tcacttccag atgcagattg tgttgcctag gccggcgata 14400

cattctggcc cctgcccacc acgtagaaag tgctgcaggc ctccatccga tcccagcgtc 14460

tggtaaccaa gcatacgctg tgagaaagcc cggactaaca tcagtgaacg gcactctggt 14520

accaggactt cgaggcctcg tgctgggcgg caaacgagct gttaaacgag gagtggttaa 14580

cctcgtcaag tatggccggt aaaaaccaga gccagaagaa aaagaaaaat ccagctccaa 14640

tggggaatgg ccagtcagtc aatcaactgt gccagctgct gggcacaatg ataaagtccc 14700

agcgccagcg acccagggga ggacaggcta aaaagaaaaa gcctgagaag ccacatttcc 14760

ccctggctgc tgaagatgac gtccggcacc atctcaccca gaccgagcgc tccctttgct 14820

tgcaatcgat ccagacggct tttaatcaag gcgcaggaac tgcgtcgctt tcatccagcg 14880

ggaagatcgg ttttcaggtt gagtttatgc taccggttgc tcatacagtg cgcctgattc 14940

gcgtgacttc tacatccgcc ggtcaggatg caaattaatt tgatagtcag gtgaatggcc 15000

gcgattggcg tgtggcctct gagtcaccta ttcaattagg gcgatcacat gggggtcaga 15060

cttaattagg caggaaccat gtgaccgaaa tt 15092

<210> 3

<211> 15092

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Изолят 96V198 вируса PRRS - пассаж 9

<400> 3

atgatgtgta gggtattccc cctacataca cgacacttct agtgtttgtg tgccttggag 60

gcgtgggtat agccccgccc cacctcttgg cccctgttct agcccaacag gtatccttct 120

ctctcggggc gagcgcgccg cctgctgctc ccttgcagca ggaaggacct cccgagtatt 180

tccggagagc acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc 240

ggtgcatgtg caccccggct gcccgggtat tttggagcgc cggccaagtc tattgcacac 300

ggtgtctcag tgcacggtct cttctctctc cggagcttca ggacactgac ctcgctgcaa 360

ttggcttgtt ttacaagcct aaagacaagc ttcactggaa agtccctatc ggcatccctc 420

aggtggagtg tactccgtcc gggtgctgtt ggctctcagc catcttcccc ttggcgcgca 480

tgacctccgg caatcacaac tttctccaac gacttgtgaa ggttgctgat gttttgtacc 540

gtgacggctg cttggcacct cgacaccttc gcgaactcca agtttacgag cgcggctgca 600

actggtaccc gatcacgggg cccgtgcccg ggatgggttt gtacgcgaac tccatgcacg 660

tgtccgacca accgtttcct ggtgccgctc atgtgttaac gaactcacct ctgcctcagc 720

aggcttgtcg acagccgttt tgtccatttg aggaggttca ttccgacgta tacaggtgga 780

agaaattcgt gatttttgtg gattcctctt ctgacggccg atctcgcatg atgtggacac 840

caggatccga cgactcggct gccttagaag tattgccacc tgaactagaa tgtcgagtcg 900

aaatcctcgt tcggagtttt cctgcccacc accctgtcga catcaccaac tgggagctca 960

ctgagtcccc tgagcacggt ttttccttca gcacgtctca ttcttgtggt taccttgccc 1020

aagaccctga cgtgtttgat ggtaagtgtt ggctttcttg ctttttgggc ctgccgaccg 1080

aagtgtggcg tcatgaggag tatctagcta acgccttcgg ttaccaaacc aagtggggcg 1140

tgcatggtaa gtacctccag cgcaggcttc aggtccgcgg catgcgtgct gtagttgatc 1200

ctgatggtcc catccacgtt gaagcgctgt cttgccccca gtcttggatc aggcacctga 1260

ctctaaatga tgacgtcacc ccaggatttg ttcgcctaac atcccttcgc attgagccga 1320

acacagagcc tactactttc cggatctttc ggtttggagc gcataagtgg tatggcgctg 1380

ccggcaaacg ggctcgtgct aagcgtgccg ctaaaggtga gaagaattca gctcccaccc 1440

ccaaggtcgc cctgccggtc cccacctatg gaattaccac ctactctcca ccgacagacg 1500

ggtcttgtgg ttggcatgtc cttgccgcca taatgaaccg gatgataaat ggtgacttca 1560

cgtcccctct gactccgtac aacagaccag aggatgattg ggcttctgat tatgatcttg 1620

ctcaggcaat ccaatgtcta caactgcctg ctaccgtggt ccggagtcgc gcctgtccta 1680

acgccaagta cctcataaaa ctcaacggag tccactggga ggtagaggtg aggtcaggaa 1740

tggctcctcg ctctctttct cgtgaatgtg tggttggcgt ttgctctgaa ggttgtgttg 1800

caccgcctta tccagcagac gggctaccag aacgagcact cgaggccttg gcgtctgctt 1860

acaggttacc ctctgattgt gttagctctg gcattgctga ctttcttgct aacccacctc 1920

ctcaggaatt ctggaccctc gacaaaatgt tgacctcccc gtcaccagag cggtccggct 1980

tctctagttt gtataaatta ctattagagg ttgttccgca aaaatgcggt gccacggaag 2040

gggctttcgt ctatgctgtt gagagaatgt tgaaggattg tccgagctcc aaacaggcca 2100

tggcccttct ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tcccttgacg 2160

agtgtttccc tacggatgtt tcagccgact tcgagccagc atctcaggaa aggccccaaa 2220

gttccggtgc tgctgttgtc ctgtgttcac cggaagtaaa agagttcgaa gaagcagccc 2280

cagaagaagt tcaagagagt ggccacaagg tcgcccgctc tgcatttgtt gccgagggtc 2340

ctaacaatga acaggtaccg atggctgccg gcgagcaact gaagcccggt ggtcgcgttt 2400

tggcggtcgg gaatgctcat gaaggtgttc tggcctcaac tagttcgact aacctgatag 2460

gcgggaactt ccccccttca gactccatga aagagagcat gctcaatagc tgggaagacg 2520

aaccactgga tttgtcccaa ccggcaccag ctgttacaat gacccttgtg agagagcaaa 2580

cacccgacaa cctgggtcct gatgccggtg ccttccccgt caccgttcga aaatttgtcc 2640

cgacagggcc tacactccgt catgttgagc actgcggcac ggagtcaggc gacagcagtt 2700

cgcccttgga tctgtcttat gcgcaaaccc tggaccagcc tttaaatcta tccttggccg 2760

cttggccagt gagggccacc gcgtctgacc ctggctgggt ccacggtagg cgtgagccta 2820

tctttgtaaa gcctcgagat gctttctctg acggcgattc agcccttcag ctcggggagc 2880

tgtctgaatc cggctccgtc atcgagtttg accggacaag aaatgctccg gcggtcgacg 2940

cccctgttga cttgacggct tcgaacaagg ccctctctgt ggttgatcct ttcgaatttg 3000

ccgaactcaa gcgcccgcgt ttttccgcac aagccttaat tgaccgaggc ggtccacttg 3060

ccgacgtcca tgcaaaaata aagaaccggg tatatgaaca gtgcctccag gcttgtgagc 3120

ctggcagtcg cgcaacccca gccaccaaga agtggctcga taaaatgtgg gatagggtgg 3180

acatgaagac ttggcgctgt acctcgcagt tccaagctgg tcgcattctt gcgtccctta 3240

aattcctccc tgacatgatt caggacacac cacctcctgt tcctaggaag aatcgggcta 3300

gtgataatgc cggcctgaag cgactggtgg cgcagtggga cagaaaattg agtgcaaccc 3360

ccccttcaaa accggttgga ccaacacttg accaaattgt cccttcgccc acgggtaccc 3420

agcaagaaga tgtcacttcc tccgatgggc catctcatgc gccggatcct cctagtcgaa 3480

tgagcacgag tgggagttgg aagggccttg tgctctctgg tacccgtctc gcggggtcca 3540

ttagtcagca tttcatgaca tgggtttttg aggttttctc ccatctccca gcttttgcac 3600

tcacactttt ctcgccgagg ggctctatgg cttcaggtga ttggatgttt gcaggtgttg 3660

ttttacttgc tctcctgctc tgtcgttctt acccagtatt cgggtgcctt cccttattgg 3720

gtgtcctttc tggctctgtg cggcgcgttc gtctgggggt ttttggttct tggatggctt 3780

tcgctgtatt tttattctcg actccatcca acccagtcgg ttcttcttgt gaccacgatt 3840

cgccggagtg tcatgctgag cttttggctc ttgagcagcg ccaactttgg gaacctgtgc 3900

gcggccttgt ggtcggcccc tcgggcctct tatgtgtcat tcttggcaag ctactcggtg 3960

ggtcacgtta tctctggcat gttttcttac gtttatgcat gcttgcagat ttggcccttt 4020

ctcttgttta tgtggtgtcc caggggcgtt gtcacaagtg ttggggaaag tgtataagaa 4080

cagctccggc ggaggtggct ctcaatgtgt tccctttctc gcgcgctacc cgtagctctc 4140

ttgtgtcctt gtgcgatcgg ttccaagcgc caaaaggggt tgatcctgtg tacttggcaa 4200

cgggttggcg cgggtgttgg tgtggtgaga gtcccattca tcaaccgcac caaaaaccca 4260

tagcttatgc taatctggat gaaaagaaaa tatctgccca aacggtggtt gctgtcccac 4320

acgatcccag tcaggccatc aagtgcctga aagttttgca ggcgggagga gccatcgtgg 4380

accagcccac acctgaggtc gtccgtgtat ccgaaatccc cttctcagcc ccatttttcc 4440

caaaagttcc agtcaaccca gattgtaagg ttgtggtgga ttcggacact tttgtggctg 4500

cggttcgctg cggctactcg acagcacaac tggtcttagg ccagggcaac tttgccaagt 4560

taaatcagat tcccctcagg agctccatct ccaccaaagc gattggcggg gcctcttaca 4620

cccttgctgt ggctcaagtt tctgtgtgga ctcttgttca cttcatcctc ggtctttggt 4680

tcacgtcacc ccaagtgtgt ggccgaggaa cctctgactc atggtgttca aatccttttt 4740

cataccctac ctatggcccc ggggttgtgt gctcctctcg actttgtgtg tctgccgacg 4800

gggtcactct accattgttc tcagccgtgg ctcaactctc cggtagagag gtggggattt 4860

ttattttggt gctcgtctcc ttgatggctt tggcccaccg catggccctt aaggcagaca 4920

tgttgatggt ctttctggct ttttgtgctt acgcctggcc catgagctcc tggttgattt 4980

gcttctttcc tacactcttg aagtgggtta ccctccaccc tcttactatg ctttgggtgc 5040

actcattctt ggtgttttgt ctgccagcag ccggcatcct ctcactaggg ataactggcc 5100

ttctttgggc ggttggccgc tttactcagg ttgccggaat tattacacct tatgacatcc 5160

accagtacac ctctgggcca cgtggcgctg cagctgtggc cacagcccca gaaggcactt 5220

atatggccgc cgtccggaga gctgctttaa ctgggcgaac tttaatcttc accccgtctg 5280

cagttggatc ccttctcgaa ggagctttca ggactcataa accttgtctt aacaccgtaa 5340

atgttgtagg ctcttccctt ggttccggcg gggttttcac tattgacggc agaaaaattg 5400

ttgtcactgc tgcccatgtg ttgaacggcg acacagctag agtcaccggc gactcctaca 5460

accgcatgca tactttcaag accaatggtg attatgcctg gtcccatgct gatgactggc 5520

ggggcgttgc ccctgcggtc aaggttgcga aggggtaccg cggtcgtgcc tactggcaaa 5580

catcaactgg cgtcgaaccc ggtgttattg gggaagggtt cgccttctgt ttcaccacct 5640

gtggcgattc ggggtcaccc gtcatctcag aatccggtga tctcattgga atccataccg 5700

gttcaaataa acttggttct ggtcttgtga caacccctga aggggagaca tgtaccatca 5760

aagaaaccaa gctctctgac ctctccagac atttcgcagg cccaagcgtt cctcttgggg 5820

atattaaatt gagtccagcc atcatccctg atataacatc cattccgagt gacttggcat 5880

cgctcctatc ctccgtccct gtagtggaag gcggcctctc gaccgttcaa cttttgtgtg 5940

tctttttcct actttggcgc atgatgggcc atgcctggac tcccattgtt gccgtgggtt 6000

tctttttact gaatgaaatt cttccagcag ttttggtccg agccgtgttt tcttttgcac 6060

tttttgtgct tgcatgggcc accccctggt ctgcacaggt gttgatgatt agactcctca 6120

cggcatctct caaccgcaat aagctttctc tggcgttcta cgcactcggg ggggtcgtcg 6180

gtttggccgc tgaaatcggg acttttgctg gcaaattgcc tgaattgtct caaacccttt 6240

cgacatactg cttcttacct agggtccttg ctatgaccag ttgtgttccc accatcatca 6300

ttggtggact ccatgccctc ggtgtaattc tgtggttgtt caaataccgg tgcctccaca 6360

acatgctcgt tggtgatggg agtttttcaa gcgccttctt cctacggtat tttgcagagg 6420

gtaatctcag aaaaggtgtt tcgcagtcct gtggcatgaa taacgagtcc ctgacggctg 6480

ctttggcttg caagttgtca cgggctgacc ttgatttttt gtccagctta acgaacttca 6540

agtgctttgt atctgcttcg aatatgaaaa atgctgccgg ccagtacatt gaagcggcgt 6600

atgccaaggc cctgcgccaa gagttggcgt ctctagttca gattgacaaa atgaaaggag 6660

ttttgtccaa actcgaggcc tttgctgaaa cagctactcc gtcccttgac ataggtgacg 6720

tgattgttct gcttgggcaa catccacacg gatctatcct tgatattaat gtggggactg 6780

agaggaaaac tgtgtccgtg caagagaccc ggagcctagg cggttccaaa ttcagtgttt 6840

gtactgtcgt gtctaacaca cccgtggacg ccttaaccgg catcccactc cagacaccaa 6900

cccctctttt tgagaatggt ccgcgtcatc gcagcgaaga agacgatctt aaagtcgaga 6960

ggatgaagaa acactgtgtg tccctcggct tccacaacat caatggcaaa gtttactgca 7020

agatttggga caagtccacc ggtgacacct tttacacgga tgattcccgg tatacccacg 7080

accatgctct tcaggacagg tcagccgact acagagacag ggactatgag ggtgtgcaaa 7140

ccgcccccca acagggattt gatccaaagt ctgaaacccc tgtcggcact gttgtgatcg 7200

gcggtattac gtataacagg tatctgacta agggtaagga ggttctggtt cccaagcccg 7260

acaattgcct tgaagctgcc aagctgtctc ttgagcaagc tctcgctggg atgggccaaa 7320

cttgcgacct tacagctgcc gaggtggaaa agttaaagcg catcatcagt caactccaag 7380

gtttgaccac tgaacaggct ttaaactgct agccgctagc ggcttgaccc gctgtggccg 7440

cggcggctta gttgttactg aaacggcggt aaaaattgta agataccaca gcagaacttt 7500

caccttgggc cctttggacc taaaagtcgc ttctgaggtg gaggtgaaga gatcaactga 7560

gcagggccac gctgttgtgg caaacctatg ttctggtgtt gtattgatga gacctcaccc 7620

accgtccctt gttgacgttc ttctgaaacc cggacttgac acaacacccg gcattcaacc 7680

ggggcatggg gccgggaata tgggcgtgga cggttccatt tgggattttg aaaccgcacc 7740

cacaaaggca gaactcgagt tgtccaagca aataatccaa gcatgtgaag tcaggcgcgg 7800

ggatgccccg aacctccaac tcccttacaa gctctgtcca gttagggggg atcctgagcg 7860

gcataaaggc cgccttatca ataccaggtt tggagatttg ccttacaaga ctcctcaaga 7920

caccaagtcc gcaatccacg cggcttgttg cctgcacccc aacggggctc ccgtgtctga 7980

tggtaaatcc acattaggca ccactcttca acacggtttc gagctttatg tccctactgt 8040

gccctatagt gtcatggagt accttgattc acgccctgac acccccttta tgtgtaccaa 8100

acatggtact cccgaggctg ctgcagagga ccttcgaaaa tatgacttat ccacccaagg 8160

gtttgtcctg cctggggtcc tacgtctagt acgcagattc atctttggcc atattggtaa 8220

ggcaccgcca ctgttcctcc catcaactta tcccgccaag aactctatgg cagggatcaa 8280

tggccagagg ttcccaacaa aagacgttca gagcatacct gaaattgatg aaatgtgtgc 8340

ccgcgctgtc aaagagaatt ggcaaactgt gacgccttgc accctcaaaa aacagtattg 8400

ttccaagcct aaaaccagga ccatccttgg taccaacaac ttcattgcct tggctcacag 8460

gtcggcactc agcggtgtca ctcaggcgtt catgaaaaaa gcctggaagt ccccgatcgc 8520

cttggggaaa aacaaattta aggagttgca ctgcactgtc gccggtaggt gcctcgaggc 8580

cgacttggcc tcttgtgatc gcagcacccc ggccatcgtg aggtggtttg ttgccaacct 8640

cctgtacgaa cttgcgggtt gtgaagagta cttgccaagc tatgtgctca attgttgcca 8700

tgacctggtg gcaacgcaaa atggcgcctt cacaaaacgt ggtggcctgt catctggaga 8760

ccccgttacc agtgtgtcca acacagtgta ttcactggtg atttatgctc agcacatggt 8820

gctgtcggct ttgaagatgg gtcatgaaat cggcctcaag ttcctcgagg aacagcttaa 8880

gttcgaggac cttctcgaaa tccagcctat gttggtatat tctgatgacc ttgtattgta 8940

tgctgaaaga cccaccttcc ccaattacca ttggtgggtt gagcaccttg acctgatgct 9000

gggttttaag acagacccaa aaaagactgt cataactgac aaacccagct ttcttggctg 9060

tagaatcgaa gcggggcgac aactggttcc cagtcgcgac cgcattctgg ctgctcttgc 9120

atatcacatg aaggcgcaga acgcctcaga gtattatgcg tctgctgccg cgattctgat 9180

ggactcgtgt gcttgcattg accacgatcc tgagtggtat gaggacctca tctgcggcat 9240

tgctcgatgc gcccgccagg atggctacag tttcccaggc ccgccgttct tcatgtccat 9300

gtgggagaag ctgaaaagtc acaatgaagg caagaaattc cgccactgtg gcatttgtga 9360

cgccaaggcc gatcatgcgt ccgcctgtgg gcttgattta tgtctgttcc actcgcactt 9420

tcatcaacac tgccctgtta ctctgagctg cggccatcat gccggttcaa aagaatgccc 9480

acagtgtcag tcacctgttg gagctggtaa atcccccctt gatgcagtgc tgaaacaaat 9540

cccgtacaaa ccccctcgtc ctgtcatcat gaaggtggac aataaaacaa cgacccttga 9600

cccgggaagg tatcagtccc gtcgaggtct tgttgctgtc aagaggggta ttgcaggcaa 9660

tgaggttgat ctcgctgatg gagactatca ggtggtgccc cttttgccaa cctgcaaaga 9720

cataaacatg gtgaaggtgg ctgtcaatgt gctactcagc aagttcatag tggggccgcc 9780

aggttccggc aagacgacct ggctactgag tcaagttcag gatgatgatg tcatctatac 9840

acctacccat cagaccatgt tcgacatagt caatgccctc aaagtctgta ggtattccat 9900

cccagtggct tcagggctcc ctttcccacc gcccgccaga tctggaccgt gggttaggct 9960

cgttgctagc gggcacatcc ctggccgaat atcatacctt gacgaggccg gatattgcaa 10020

tcatctggat attctcagac tgctttctaa gacacctctt gtgtgtttgg gtgaccttca 10080

gcaacttcac cctgtcggct ttgactctta ctgttatgtt tttgatcaaa tgcctcataa 10140

gcagctgacc actatttata gatttggccc caatatctgt tctgccattc aaccttgtta 10200

cagggaaaaa ctcgaatcta aggccaggaa cactagggtg gtttttactg cccggcccgt 10260

ggcttttggt caggtgttga cgccatatca taaagaccgc accggctcag ctataaccat 10320

agattcatcc cagggagcca cctttgatgt tgtgacgctg catttgccgt cgccagattc 10380

cctgaacaaa tcccgggctc ttgtagctat cactcgggca aggcatgggt tgttcatcta 10440

tgaccctcat aaccaactcc ggaagttttt caacttaaca cctgagcgca ctgattgcaa 10500

cctcgtgttc aaccgcgggg acgagttggt agttttgaat gcagataatg cagtcacgac 10560

tgtggctaag gttttggagg cgggcccgtc tcggtttcga gtatcagatc caaggtgcaa 10620

gtctctttta gccgcttgct cggccagtct ggaaggaggc tgcatgccac tgccgcaagt 10680

ggcacataat ctggggtttt acttctctcc agatagtcca gcatttgcac ctctgccaaa 10740

agagctggca ccacattggc cggttgttac tagtcagaac aaccaggcat ggcccgaccg 10800

acttgtcgct agtatgcggc cagttgatgc ccgctacagc aagcctatgg tcggtgcagg 10860

gtatgtggtt gggccatcca ctttccttgg cactcctggt gtagtgtcat actatctcac 10920

gctgtacatc aggggtgagc cccaggcctt gccggagaca ctcgtctcaa cgggacgtat 10980

agctactgat tgtcgagagt atctcgacgc agctgaggaa gaagcagcta aagaactccc 11040

tcacgcattc attggcgatg tcaaaggtac tacagtgggg gggtgtcacc acattacgtc 11100

aaaatacctt cccaggtcct tgcccaagga ctccgttgcc gtggtcggag tgagttcgcc 11160

cggcaaggct gccaaagccg tgtgtactct caccgatgtg tatcttcccg agctccggcc 11220

atatttgcaa ccggaaacag catcgaaatg ctggaaactt aaactagact tcagggatgt 11280

cagactgatg gtctggaaag gagccaccgc atatttccaa ctggaggggc tcacatggtc 11340

agcgctgccc gactatgcca ggttcattca gctaccaaaa gatgccgttg tgtacattga 11400

tccgtgcata ggaccggcaa cagccaaccg taaggttgtg agaactacag attggcgagc 11460

tgacctggca gtgacaccgt acgactacgg tgctcagagc attttgacta cagcctggtt 11520

cgaggacctt gggccgcagt ggaagatttt agggttgcaa cccttcaagc gggcatttgg 11580

ctttgaaaac actgaggatt gggcgatcct tgcacgtcgc atgaacgacg gcaaggacta 11640

cactgactat aactggaatt gtgttcgaca acgcccacat gccatctacg gacgtgcccg 11700

tgaccatacg tatcactttg cccctggcac tgaactgcaa gtagagctag gtaaaccccg 11760

gctaccgcct gagcaagtac cgtgaatcta gagtgatgca atggggtcac tgtggagtaa 11820

aatcagtcaa ctgttcgtgg atgccttcac tgagttcctt gttagtgtgg ttgatattgt 11880

catcttcctt gccatactgt ttgggttcac cgttgcaggg tggttactgg tctttttttt 11940

cagagtggtt tgctccgcgc ttctccgttc gcgctctgcc attcactctt ccgaactatc 12000

gaaggtccta tgagggcttg ctacctaatt gcagaccgga tgttccacaa ttcgcattca 12060

agcacccatt gggtatgttt tggcacatgc gagtttccca cttaattgac gaaatggtct 12120

ctcgccgcat ttaccagacc atggaacatt caggtcaagc ggcctggaag caggtggtta 12180

gtgaagctac tctcacaaga ctgtcaaagc tcgacatagt tctccacttc caacacctgg 12240

ccgcaataga ggcggattct tgccgcttcc tcagctcacg acttgtgatg ctgaaaaatc 12300

ttgctgttgg caatatgagc ctacagtaca acaccacgtt ggaccgcgtt gagctcatct 12360

tcccaacacc aggtacgagg cccaaattga ccgattttag acaatggctc gtcagtgtgc 12420

acgcttctat tttttcctct gtggcctcat cagttacctt gttcatagtg ctttggcttc 12480

gaattccagc tctacgctat gtttttggtt tccattggcc cacggcaaca catcattcga 12540

gctaaccatc aattactcta tatgtaagcc ctgtctcacc agtcaagcgg ctcgacaaag 12600

gctcgaaccc ggtcgcaaca tgtggtgcaa aataggacac accacgtgtg aggagcgtga 12660

ccatgatgag ttgtcaatga ccattccgtc cgggtacgat aacctcaaac ttgagggtta 12720

ttacgcttgg ctggcttttt tgtccttttc ttacgcagcc caatttcatc cagagttgtt 12780

cggaataggg aatgtgtcac gcgtcttcgt ggataaacgg caccagttca tctgtgccga 12840

gcacgacgga caaaattcaa ccgtatccac cgaacataat atttccgcat tgtatgcggc 12900

gtactaccac caccaggtag acgggggcaa ttggttccac ctggaatggc tgcggccttt 12960

cttttcctcc tggctagtac tcaatatttc atggtttctg aggcgttcgc ctgcaagccc 13020

tgtttctcga cgcatttatc agatattgag accaacacga ccgcggctgc cggtttcatg 13080

gtccttcagg acatcaactg tttccacagt ggctcagagg cacaaacgac tggtcccatc 13140

agaaagtcgt cccaatgccg tgaagccgtc ggcactcccc agtacatcaa gataacggcc 13200

aatgtgaccg acgaatcata cttgtacaac gcggacttgc tgatgctttc tgcgtgcctt 13260

ttctacgcct cagagatgag cgagaaaggc tttaaagtca tttttgggaa tgtctctggc 13320

gttgtctccg cttgtgtcaa ttttacagat tatgtggccc atctgaccca acatacccag 13380

cagcatcatt tggtaaccaa tcacattcgg ttgctacatt tcctgacacc atcagcaatg 13440

aggtgggcta caaccattgc ttgtttgttc gccattctct tggcgatatg agatgttctc 13500

acaaatcggg gtgtttcttg actccgcact cttgcttttg gtggtttttt ttgctgtgta 13560

ccggcttgtc ctggtccttt gccgatggca acggcaacag ctcgacatac caatatatat 13620

ataacttgac gatatgcgag ctgaatggga ccgaatggct gtccgaccat tttaattggg 13680

cagtcgagac ttttgtgctc tacccagtgg cgactcatat cctctcactg ggtttcctca 13740

cgacaagtca tttccttgat gcgttcggtc ttggagctgt gtcaattaca gggttttgtg 13800

gcgggcggta cgtgctcagc agcgtgtacg gcgcttgtgc actagcagcg ctcgtatgtt 13860

ttgttatccg tgctgccaaa aattgtatgg cttgccgcta tgctcgtacc cggtttacca 13920

acttcattgt ggatgaccgg gggagaatcc atcggtggag gtctccaata gtggtggaaa 13980

aattaggtaa agctgacgtc ggcggcgacc ttgtcaccat caaacatgtc atcctcgaag 14040

gagtcaaagc tcaacccttg acgaggactt cggccgagca atgggaggcc tagataattt 14100

ctgcaacgat cccaccgccg cacaaaagct tgtgctagcc tttagcatca cgtatacacc 14160

catcatgata tacgccctta aggtgtcacg cggccgactc ttggggttgt tgcacatctt 14220

gatatttctg aactgttctt tcacgttcgg atacatgaca tatatgcatt ttgaatccac 14280

caaccgtgtc gcgcttacca tggggggcgt tgtcgccctt ctgtggggcg tttatagttt 14340

catagagtca tggaagttta tcacttccag atgcagattg tgttgcctag gccggcgata 14400

cattctggcc cctgcccacc acgtagaaag tgctgcaggc ctccatccga tcccagcgtc 14460

tggtaaccaa gcatacgctg tgagaaagcc cggactaaca tcagtgaacg gcactctggt 14520

accaggactt cgaggcctcg tgctgggcgg caaacgagct gttaaacgag gagtggttaa 14580

cctcgtcaag tatggccggt aaaaaccaga gccagaagaa aaagaaaaat ccagctccaa 14640

tggggaatgg ccagtcagtc aatcaactgt gccagctgct gggcacaatg ataaagtccc 14700

agcgccagcg acccagggga ggacaggcta aaaagaaaaa gcctgagaag ccacatttcc 14760

ccctggctgc tgaagatgac gtccggcacc atctcaccca gaccgagcgc tccctttgct 14820

tgcaatcgat ccagacggct tttaatcaag gcgcaggaac tgcgtcgctt tcatccagcg 14880

ggaagatcgg ttttcaggtt gagtttatgc taccggttgc tcatacagtg cgcctgattc 14940

gcgtgacttc tacatccgcc ggtcaggatg caaattaatt tgatagtcag gtgaatggcc 15000

gcgattggcg tgtggcctct gagtcaccta ttcaattagg gcgatcacat gggggtcaga 15060

cttaattagg caggaaccat gtgaccgaaa tt 15092

<210> 4

<211> 15092

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Изолят 96V198 вируса PRRS - пассаж 14

<400> 4

atgatgtgta gggtattccc cctacataca cgacacttct agtgtttgtg tgccttggag 60

gcgtgggtat agccccgccc cacctcttgg cccctgttct agcccaacag gtatccttct 120

ctctcggggc gagcgcgccg cctgctgctc ccttgcagca ggaaggacct cccgagtatt 180

tccggagagc acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc 240

ggtgcatgtg caccccggct gcccgggtat tttggagcgc cggccaagtc tattgcacac 300

ggtgtctcag tgcacggtct cttctctctc cggagcttca ggacactgac ctcgctgcaa 360

ttggcttgtt ttacaagcct aaagacaagc ttcactggaa agtccctatc ggcatccctc 420

aggtggagtg tactccgtcc gggtgctgtt ggctctcagc catcttcccc ttggcgcgca 480

tgacctccgg caatcacaac tttctccaac gacttgtgaa ggttgctgat gttttgtacc 540

gtgacggctg cttggcacct cgacaccttc gcgaactcca agtttacgag cgcggctgca 600

actggtaccc gatcacgggg cccgtgcccg ggatgggttt gtacgcgaac tccatgcacg 660

tgtccgacca accgttccct ggtgccgctt atgtgttaac gaactcacct ctgcctcagc 720

aggcttgtcg acagccgttt tgtccatttg aggaggttca ttccgacgta tacaggtgga 780

agaaattcgt gatttttgtg gattcctctt ctgacggccg atctcgcatg atgtggacac 840

caggatccga cgactcggct gccttagaag tattgccacc tgaactagaa tgtcgagtcg 900

aaatcctcgt tcggagtttt cctgcccacc accttgtcga catcaccaac tgggagctca 960

ctgagtcccc tgagcacggt ttttccttca gcacgtctca ttcttgtggt taccttgccc 1020

aagaccctga cgtgtttgat ggtaagtgtt ggctttcttg ctttttgggc ctgccgaccg 1080

aagtgtggcg tcatgaggag catctagcta acgccttcgg ttaccaaacc aagtggggcg 1140

tgcatggtaa gtacctccag cgcaggcttc aggtccgcgg catgcgtgct gtagttgatc 1200

ctgatggtcc catccacgtt gaagcgctgt cttgccccca gtcttggatc aggcacctga 1260

ctctaaatga tgacgtcacc ccaggatttg ttcgcctaac atcccttcgc attgagccga 1320

acacagagcc tactactttc cggatctttc ggtttggagc gcataagtgg tatggcgctg 1380

ccggcaaacg ggctcgtgct aagcgtgccg ctaaaggtga gaagaattca gctcccaccc 1440

ccaaggtcgc cctgccggtc cccacctatg gaattaccac ctactctcca ccgacagacg 1500

ggtcttgtgg ttggcatgtc cttgccgcca taatgaaccg gatgataaat ggtgacttca 1560

cgtcccctct gactccgtac aacagaccag aggatgattg ggcttctgat tatgatcttg 1620

ctcaggcaat ccaatgtcta caactgcctg ctaccgtggt ccggagtcgc gcctgtccca 1680

acgccaagta cctcataaaa ctcaacggag tccactggga ggtagaggtg aggtcaggaa 1740

tggctcctcg ctctctttct cgtgaatgtg tggttggcgt ttgctctgaa ggttgtgttg 1800

caccgcctta tccagcagac gggctaccag aacgagcact cgaggccttg gcgtctgctt 1860

acaggttacc ctctgattgt gttagctctg gcattgctga ctttcttgct aacccacctc 1920

ctcaggaatt ctggaccctc gacaaaatgt tgacctcccc gtcaccagag cggtccggct 1980

tctctagttt gtataaatta ctattagagg ttgttccgca aaaatgcggt gccacggaag 2040

gggctttcgt ctatgctgtt gagagaatgt tgaaggattg tccgagctcc aaacaggcca 2100

tggcccttct ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tcccttgacg 2160

agtgtttccc tacggatgtt tcagccgact tcgagccagc atctcaggaa aggccccaaa 2220

gttccggtgc tgctgttgtc ctgtgttcac cggaagtaaa agagttcgaa gaagcagccc 2280

cagaagaagt tcaagagagt ggccacaagg tcgcccgctc tgcatttgtt gccgagggtc 2340

ctaacaatga acaggtaccg atggctgccg gcgagcaact gaagcccggt ggtcgcgttt 2400

tggcggtcgg gaatgctcat gaaggtgttc tggcctcaac tagttcgacc aacctgatag 2460

gcgggaactt ccccccttca gactccatga aagagagcat gctcaatagc tgggaagacg 2520

aaccactgga tttgtcccaa ccggcaccag ctgttacaat gacccttgtg agagagcaaa 2580

cacccgacaa cctgggtcct gatgccggtg ccttccccgt caccgttcga aaatttgtcc 2640

cgacagggcc tacactccgt catgttgagc actgcggcac ggagtcaggc gacagcagtt 2700

cgcccttgga tctgtcttat gcgcaaaccc tggaccagcc tttaaatcta tccttggccg 2760

cttggccagt gagggccacc gcgtctgacc ctggctgggt ccacggtagg cgtgagccta 2820

tctttgtgaa gcctcgagat gctttctctg acggcgattc agcccttcag ctcggggagc 2880

tgtctgaatc cggctccgtc atcgagtttg accggacaag aaatgctccg gcggtcgacg 2940

cccctgttga cttgacggct tcgaacaagg ccctctctgt ggttgatcct ttcgaatttg 3000

ccgaactcaa gcgcccgcgt ttttccgcac aagccttaat tgaccgaggc ggtccacttg 3060

ccgacgtcca tgcaaaaata aagaaccggg tatatgaaca gtgcctccag gcttgtgagc 3120

ctggcagtcg cgcaacccca gccaccaaga agtggctcga taaaatgtgg gatagggtgg 3180

acatgaagac ttggcgctgt acctcgcagt tccaagctgg tcgcattctt gcgtccctta 3240

aattcctccc tgacatgatt caggacacac cacctcctgt ccccttcaaa accggttgga 3300

ccaacacttg accaaattgt cccttcgccc acgggtaccc agcaagaaga tgtcacttcc 3360

tccgatgggc catctcatgc gccggatcct cctagtcgaa tgagcacgag tgggagttgg 3420

aagggccttg tgctctctgg tacccgtctc gcggggtcca ttagtcagca tttcatgaca 3480

tgggtttttg aggttttctc ccatctccca gcttttgcac tcacactttt ctcgccgagg 3540

ggctctatgg cttcaggtga ttggatgttt gcaggtgttg ttttacttgc tctcctgctc 3600

tgtcgttctt acccagtatt cgggtgcctt cccttattgg gtgtcctttc tggctctgtg 3660

cggcgcgttc gtctgggggt ttttggttct tggatggctt tcgctgtatt tttattctcg 3720

actccatcca acccagtcgg ttcttcttgt gaccacgatt cgccggagtg tcatgctgag 3780

cttttggctc ttgagcagcg ccaactttgg gaacctgtgc gcggccttgt ggtcggcccc 3840

tcgggcctct tatgtgtcat tcttggcaag ctactcggtg ggtcacgtta tctctggcat 3900

gttttcttac gtttatgcat gcttgcagat ttggcccttt ctcttgttta tgtggtgtcc 3960

caggggcgtt gtcacaagtg ttggggaaag tgtataagaa cagctccggc ggaggtggct 4020

ctcaatgtgt tccctttctc gcgcgctacc cgtagctctc ttgtgtcctt gtgcgatcgg 4080

ttccaagcgc caaaaggggt tgatcctgtg tacttggcaa cgggttggcg cgggtgttgg 4140

tgtggtgaga gtcccattca tcaaccgcac caaaaaccca tagcttatgc taatctggat 4200

gaaaagaaaa tatctgccca aacggtggtt gctgtcccac acgatcccag tcaggccatc 4260

aagtgcctga aagttttgca ggcgggagga gccatcgtgg accagcccac acctgaggtc 4320

gtccgtgtat ccgaaatccc cttctcagcc ccatttttcc caaaagttcc agtcaaccca 4380

gattgtaagg ttgtggtgga ttcggacact tttgtggctg cggttcgctg cggctactcg 4440

acagcacaac tggtcttagg ccagggcaac tttgccaagt taaatcagat tcccctcagg 4500

agctctatct ccaccaaagc gattggcggg gcctcttaca cccttgctgt ggctcaagtt 4560

tctgtgtgga ctcttgttca cttcatcctc ggtctttggt tcacgtcacc ccaagtgtgt 4620

ggccgaggaa cctctgactc atggtgttca aatccttttt cataccctac ctatggcccc 4680

ggggttgtgt gctcctctcg actttgtgtg tctgccgacg gggtcactct accattgttc 4740

tcagccgtgg ctcaactctc cggtagagag gtggggattt ttattttggt actcgtctcc 4800

ttgatggctt tggcccaccg catggccctt aaggcagaca tgttgatggt ctttctggct 4860

ttttgtgctt acgcctggcc catgagctcc tggttgattt gcttctttcc tacactcttg 4920

aagtgggtta ccctccaccc tcttactatg ctttgggtgc actcattctt ggtgttttgt 4980

ctgccagcag ccggcatcct ctcactaggg ataactggcc ttctttgggc ggttggccgc 5040

tttactcagg ttgccggaat tattacacct tatgacatcc accagtacac ctctgggcca 5100

cgtggcgctg cagctgtggc cacagcccca gaaggcactt atatggccgc cgtccggaga 5160

gctgctttaa ctgggcgaac tttaatcttc accccgtctg cagttggatc ccttctcgaa 5220

ggagctttca ggactcataa accttgtctt aacaccgtaa atgttgtagg ctcttccctt 5280

ggttccggcg gggttttcac tattgacggc agaaaaattg ttgtcactgc tgcccatgtg 5340

ttgaacggcg acacagctag agtcaccggc gactcctaca accgcatgca tactttcaag 5400

accaatggtg attatgcctg gtcccatgct gatgactggc ggggcgttgc ccctgcggtc 5460

aaggttgcga aggggtaccg cggtcgtgcc tactggcaaa catcaactgg cgtcgaaccc 5520

ggtgttattg gggaagggtt cgccttctgt ttcaccacct gtggcgattc ggggtcaccc 5580

gtcatctcag aatccggtga tctcattgga atccataccg gttcaaataa acttggttct 5640

ggtcttgtga caacccctga aggggagaca tgtaccatca aagaaaccaa gctctctgac 5700

ctctccagac atttcgcagg cccaagcgtt cctcttgggg atattaaatt gagtccagcc 5760

atcatccctg atataacatc cattccgagt gacttggcat cgctcctatc ctccgtccct 5820

gtagtggaag gcggcctctc gaccgttcaa cttttgtgtg tctttttcct actttggcgc 5880

atgatgggcc atgcctggac tcccattgtt gccgtgggtt tctttttact gaatgaaatt 5940

cttccagcag ttttggtccg agccgtgttt tcttttgcac tttttgtgct tgcatgggcc 6000

accccctggt ctgcacaggt gttgatgatt agactcctca cggcatctct caaccgcaat 6060

aagctttctc tggcgttcta cgcactcggg ggggtcgtcg gtttggccgc tgaaatcggg 6120

acttttgctg gcaaattgcc tgaattgtct caaacccttt cgacatactg cttcttacct 6180

agggtccttg ctatgaccag ttgtgttccc accatcatca ttggtggact ccatgccctc 6240

ggtgtaattc tgtggttgtt caaataccgg tgcctccaca acatgctcgt tggtgatggg 6300

agtttttcaa gcgccttctt cctacggtat tttgcagagg gtaatctcag aaaaggtgtt 6360

tcgcagtcct gtggcatgaa taatgagtcc ctgacggctg ctttggcttg caagttgtca 6420

cgggctgacc ttgatttttt gtccagctta acgaacttca agtgctttgt atctgcttcg 6480

aatatgaaaa atgctgccgg ccagtacatt gaagcggcgt atgccaaggc cctgcgccaa 6540

gagttggcgt ctctagttca gattgacaaa atgaaaggag ttttgtccaa actcgaggcc 6600

tttgctgaaa cagctactcc gtcccttgac ataggtgacg tgattgttct gcttgggcaa 6660

catccacacg gatctatcct tgatattaat gtggggactg agaggaaaac tgtgtccgtg 6720

caagagaccc ggagcctagg cggttccaaa ttcagtgttt gtactgtcgt gtctaacaca 6780

cccgtggacg ccttaaccgg catcccactc cagacaccaa cccctctttt tgagaatggt 6840

ccgcgtcatc gcagcgaaga agacgatctt aaagtcgaga ggatgaagaa acactgtgtg 6900

cccctcggct tccacaacat caatggcaaa gtttactgca agatttggga caagtccacc 6960

ggtgacacct tttacacgga tgattcccgg tatacccacg accatgctct tcaggacagg 7020

tcagccgact acagagacag ggactatgag ggtgtgcaaa ccgcccccca acagggattt 7080

gatccaaagt ctgaaacccc tgtcggcact gttgtgatcg gcggtattac gtataacagg 7140

tatctgacta agggtaagga ggttctggtt cccaagcccg acaattgcct tgaagctgcc 7200

aagctgtctc ttgagcaagc tctcgctggg atgggccaaa cttgcgacct tacagctgcc 7260

gaggtggaaa agttaaagcg catcatcagt caactccaag gtttgaccac tgaacaggct 7320

ttaaactgct agccgctagc ggcttgaccc gctgtggccg cggcggctta gttgttactg 7380

aaacggcggt aaaaattgta agataccaca gcagaacttt caccttgggc cctttggacc 7440

taaaagtcgc ttctgaggtg gaggtgaaga gatcaactga gcagggccac gctgttgtgg 7500

caaacctatg ttctggtgtt gtattgatga gacctcaccc accgtccctt gttgacgttc 7560

ttctgaaacc cggacttgac acaacacccg gcattcaacc ggggcatggg gccgggaata 7620

tgggcgtgga cggttccatt tgggattttg aaaccgcacc cacaaaggca gagctcgagt 7680

tgtccaggca aataatccaa gcatgtgaag tcaggcgcgg ggatgccccg aacctccaac 7740

tcccttacaa gctctgtcca gttagggggg atcctgagcg gcataaaggc cgccttatca 7800

ataccaggtt tggagatttg ccttacaaga ctcctcaaga caccaagtcc gcaatccacg 7860

cggcttgttg cctgcacccc aacggggctc ccgtgtctga tggtaaatcc acattaggca 7920

ccactcttca acacggtttc gagctttatg tccctactgt gccctatagt gtcatggagt 7980

accttgattc acgccctgac acccccttta tgtgtaccaa acatggtacc cccgaggctg 8040

ctgcagagga ccttcgaaaa tatgacttat ccacccaagg gtttgtcctg cctggggtcc 8100

tacgtctagt acgcagattc atctttggcc atattggtaa ggcaccgcca ctgttcctcc 8160

catcaactta tcccgccaag aactctatgg cagggatcaa tggccagagg ttcccaacaa 8220

aagacgttca gagcatacct gaaattgatg aaatgtgtgc ccgcgctgtc aaagagaatt 8280

ggcaaactgt gacgccttgc accctcaaaa aacagtattg ttccaagcct aaaaccagga 8340

ccatccttgg taccaacaac ttcattgcct tggctcacag gtcggcactc agcggtgtca 8400

ctcaggcgtt catgaaaaaa gcctggaagt ccccgatcgc cttggggaaa aacaaattta 8460

aggagttgca ctgcactgtc gccggtaggt gcctcgaggc cgacttggcc tcttgtgatc 8520

gcagcacccc ggccatcgtg aggtggtttg ttgccaacct cctgtacgaa cttgcgggtt 8580

gtgaagagta cttgccaagc tatgtgctca attgttgcca tgacctggtg gcaacgcaaa 8640

atggcgcctt cacaaaacgt ggtggcctgt catctggaga ccccgttacc agtgtgtcca 8700

acacagtgta ttcactggtg atttatgctc agcacatggt gctgtcggct ttgaagatgg 8760

gtcatgaaat cggcctcaag ttcctcgagg aacagcttaa gttcgaggac cttctcgaaa 8820

tccagcctat gttggtatat tctgatgacc ttgtattgta tgctgaaaga cccaccttcc 8880

ccaattacca ttggtgggtt gagcaccttg acctgatgct gggttttaag acagacccaa 8940

aaaagactgt cataactgac aaacccagct ttcttggctg tagaatcgaa gcggggcgac 9000

aactggttcc cagtcgcgac cgcattctgg ctgctcttgc atatcacatg aaggcgcaga 9060

acgcctcaga gtattatgcg tctgctgccg cgattctgat ggactcgtgt gcttgcattg 9120

accacgatcc tgagtggtat gaggacctca tctgcggcat tgctcgatgc gcccgccagg 9180

atggctacag tttcccaggc ccgccgttct tcatgtccat gtgggagaag ctgaaaagtc 9240

acaatgaagg caagaaattc cgccactgtg gcatttgtga cgccaaggcc gatcatgcgt 9300

ccgcctgtgg gcttgattta tgtctgttcc actcgcactt tcatcaacac tgccctgtta 9360

ctctgagctg cggccatcat gccggttcaa aagaatgccc acagtgtcag tcacctgttg 9420

gagctggtaa atcccccctt gatgcagtgc tgaaacaaat cccgtacaaa ccccctcgtc 9480

ctgtcatcat gaaggtggac aataaaacaa cgacccttga cccgggaagg tatcagtccc 9540

gtcgaggtct tgttgctgtc aagaggggta ttgcaggcaa tgaggttgat ctcgctgatg 9600

gagactatca ggtggtgccc cttttgccaa cctgcaaaga cataaacatg gtgaaggtgg 9660

ctgtcaatgt gctactcagc aagttcatag tggggccgcc aggttccggc aagacgacct 9720

ggctactgag tcaagttcag gatgatgatg tcatctatac acctacccat cagaccatgt 9780

tcgacatagt caatgccctc aaagtctgta ggtattccat cccagtggct tcagggctcc 9840

ctttcccacc gcccgccaga tctggaccgt gggttaggct cgttgctagc gggcacatcc 9900

ctggccgaat atcatacctt gacgaggccg gatattgcaa tcatctggat attctcagac 9960

tgctttctaa gacacctctt gtgtgtttgg gtgaccttca gcaacttcac cctgtcggct 10020

ttgactctta ctgttatgtt tttgatcaca tgcctcataa gcagctgacc actatttata 10080

gatttggccc caatatctgt tctgccattc aaccttgtta cagggaaaaa ctcgaatcta 10140

aggccaggaa cactagggtg gtttttactg cccggcccgt ggcttttggt caggtgttga 10200

cgccatatca taaagaccgc accggctcag ctataaccat agattcatcc cagggagcca 10260

cctttgatgt tgtgacgctg catttgccgt cgccagattc cctgaacaaa tcccgggctc 10320

ttgtagctat cactcgggca aggcatgggt tgttcatcta tgaccctcat aaccaactcc 10380

ggaagttttt caacttaaca cctgagcgca ctgattgcaa cctcgtgttc aaccgcgggg 10440

acgagttggt agttttgaat gcagataatg cagtcacgac tgtggctaag gttctggagg 10500

cgggcccgtc tcggtttcga gtatcagatc caaggtgcaa gtctctttta gccgcttgct 10560

cggccagtct ggaaggaggc tgcatgccac tgccgcaagt ggcacataat ctggggtttt 10620

acttctctcc agatagtcca gcatttgcac ctctgccaaa agagctggca ccacattggc 10680

cggttgttac tagtcagaac aaccaggcat ggcccgaccg acttgtcgct agtatgcggc 10740

cagttgatgc ccgctacagc aagcctatgg tcggtgcagg gtatgtggtt gggccatcca 10800

ctttccttgg cactcctggt gtggtgtcat actatctcac gctgtacatc aggggtgagc 10860

cccaggcctt gccggagaca ctcgtctcaa cgggacgtat agctactgat tgtcgagagt 10920

atctcgacgc agctgaggaa gaagcagcta aagaactccc tcacgcattc attggcgatg 10980

tcaaaggtac tacagtgggg gggtgtcacc acattacgtc aaaatacctt cccaggtcct 11040

tgcccaagga ctccgttgcc gtggtcggag tgagttcgcc cggcaaggct gccaaagccg 11100

tgtgtactct caccgatgtg tatcttcccg agctccggcc atatttgcaa ccggaaacag 11160

catcgaaatg ctggaaactt aaactagact tcagggatgt cagactgatg gtctggaaag 11220

gagccaccgc atatttccaa ctggaggggc tcacatggtc agcgctgccc gactatgcca 11280

ggttcattca gctaccaaaa gatgccgttg tgtacattga tccgtgcata ggaccggcaa 11340

cagccaaccg taaggttgtg agaactacag attggcgagc tgacctggca gtgacaccgt 11400

acgactacgg tgctcagagc attttgacta cagcctggtt cgaggacctt gggccgcagt 11460

ggaagatttt agggttgcaa cccttcaagc gggcatttgg ctttgaaaac actgaggatt 11520

gggcgatcct tgcacgtcgc atgaacgacg gcaaggacta cactgactat aactggaatt 11580

gtgttcgaca acgcccacat gccatctacg gacgtgcccg tgaccatacg tatcactttg 11640

cccctggcac tgaactgcaa gtagagctag gtaaacctcg gctaccgcct gagcaagtac 11700

cgtgaatcta gagtgatgca atggggtcac tgtggagtaa aatcagtcaa ctgttcgtgg 11760

atgccttcac tgagttcctt gttagtgtgg ttgatattgt catcttcctt gccatactgt 11820

ttgggttcac cgttgcaggg tggttactgg tctttttttt cagagtggtt tgctccgcgc 11880

ttctccgttc gcgctctgcc attcactctt ccgaactatc gaaggtccta tgagggcttg 11940

ctacctaatt gcagaccgga tgttccacaa ttcgcattca agcacccatt gggtatgttt 12000

tggcacatgc gagtttccca cttaattgac gaaatggtct ctcgccgcat ttatcagacc 12060

atggaacatt caggtcaagc ggcctggaag caggtggtta gtgaagctac tctcacaaga 12120

ctgtcaaagc tcgacatagt tctccacttc caacacctgg ccgcaataga ggcggattct 12180

tgccgcttcc tcagctcacg acttgtgatg ctgaaaaatc ttgctgttgg caatatgagc 12240

ctacagtaca acaccacgtt ggaccgcgtt gagctcatct tcccaacacc aggtacgagg 12300

cccaaattga ccgattttag acaatggctc gtcagtgtgc acgcttctat tttttcctct 12360

gtggcctcat cagttacctt gttcatagtg ctttggcttc gaattccagc tctacgctat 12420

gtttttggtt tccattggcc cacggcaaca catcattcga gctaaccatc aattactcta 12480

tatgtaagcc ctgtctcacc agtcaagcgg ctcgacaaag gctcgaaccc ggtcgcaaca 12540

tgtggtgcaa aatagggcac accacgtgtg aggagcgtga ccatgatgag ttgtcaatga 12600

ccattccgtc cgggtacgat aacctcaaac ttgagggtta ttacgcttgg ctggcttttt 12660

tgtccttttc ttacgcagcc caatttcatc cagagttgtt cggaataggg aatgtgtcac 12720

gcgtcttcgt ggataaacgg caccagttca tctgtgccga gcacgacgga caaaattcaa 12780

ccgtatccac cgaacataat atttccgcat tgtatgcggc gtactaccac caccaggtag 12840

acgggggcaa ttggttccac ctggaatggc tgcggccttt cttttcctcc tggctagtac 12900

tcaatatttc atggtttctg aggcgttcgc ctgcaagccc tgtttctcga cgcatttatc 12960

agatattgag accaacacga ccgcggctgc cggtttcatg gtccttcagg acatcaactg 13020

tttccacagt ggctcagagg cacaaacgac tggtcccatc agaaagtcgt cccaatgccg 13080

tgaagccgtc ggcactcccc agtacatcaa gataacggcc aatctgaccg acgaatcata 13140

cttgtacaac gcggacttgc tgatgctttc tgcgtgcctt ttctacgcct cagagatgag 13200

cgagaaaggc tttaaagtca tttttgggaa tgtctctggc gttgtctccg cttgtgtcaa 13260

ttttacagat tatgtggccc atctgaccca acatacccag cagcatcatt tggtaaccaa 13320

tcacattcgg ttgctacatt tcctgacacc atcagcgatg aggtgggcta caaccattgc 13380

ttgtttgttc gccattctct tggcgatatg agatgttctc acaaatcggg gtgtttcttg 13440

actccgcact cttgcttttg gtggtttttt ttgctgtgta ccggcttgtc ctggtccttt 13500

gccgatggca acggcgacag ctcgacatac caatatatat ataacttgac gatatgcgag 13560

ctgaatggga ccgaatggct gtctgaccat tttaattggg cagtcgagac ttttgtgctc 13620

tacccagtgg cgactcatat cctctcactg ggtttcctca cgacaagtca tttccttgat 13680

gcgttcggtc ttggagctgt gtcaattaca gggttttgtg gcgggcggta cgtgctcagc 13740

agcgtgtacg gcgcttgtgc actagcagcg ctcgtatgtt ttgttatccg tgctgccaaa 13800

aattgtatgg cttgccgcta tgctcgtacc cggtttacca acttcattgt ggatgaccgg 13860

gggagaatcc atcggtggag gtctccaata gtggtggaaa aattaggtaa agctgacgtc 13920

ggcggcgacc ttgtcaccat caaacatgtc atcctcgaag gagtcaaagc tcaacccttg 13980

acgaggactt cggccgagca atgggaggcc tagataattt ctgcaacgat cccaccgccg 14040

cacaaaagct tgtgctagcc tttagcatca cgtatacacc catcatgata tacgccctta 14100

aggtgtcacg cggccgactc ttggggttgt tgcacatctt gatatttctg aactgttctt 14160

tcacgttcgg atacatgaca tatatgcatt ttgaatccac caaccgtgtc gcgcttacca 14220

tggggggcgt tgtcgccctt ctgtggggcg tttatagttt catagagtca tggaagttta 14280

tcacttccag atgcagattg tgttgcctag gccggcgata cattctggcc cctgcccacc 14340

acgtagaaag tgctgcaggc ctccatccga tcccagcgtc tggtaaccaa gcatacgctg 14400

tgagaaagcc cggactaaca tcagtgaacg gcactctggt accaggactt cgaggcctcg 14460

tgctgggcgg caaacgagct gttaaacgag gagtggttaa cctcgtcaag tatggccggt 14520

aaaaaccaga gccagaagaa aaagaaaaat ccagctccaa tggggaatgg ccagtcagtc 14580

aatcaactgt gccagctgct gggcacaatg ataaagtccc agcgccagcg acccagggga 14640

ggacaggcta aaaagaaaaa gcctgagaag ccacatttcc ccctggctgc tgaagatgac 14700

gtccggcacc atctcaccca gaccgagcgc tccctttgct tgcaatcgat ccagacggct 14760

tttaatcaag gcgcaggaac tgcgtcgctt tcatccagcg ggaagatcgg ttttcaggtt 14820

gagtttatgc taccggttgc tcatacagtg cgcctgattc gcgtgacttc tacatccgcc 14880

ggtcaggatg caaattaatt tgatagtcag gtgaatggcc gcgattggcg tgtggcctct 14940

gagtcaccta ttcaattagg gcgatcacat gggggtcaga cttaattagg caggaaccat 15000

gtgaccgaaa tttcctagga agaatcgggc tagtgataat gccggcctga agcgactggt 15060

ggcgcagtgg gacagaaaat tgagtgcaac cc 15092

<210> 5

<211> 15092

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Изолят 96V198 вируса PRRS - пассаж 49

<400> 5

atgatgtgta gggtattccc cctacataca cgacacttct agtgtttgtg tgccttggag 60

gcgtgggtat agccccgccc cacctcttgg cccctgttct agcccaacag gtatccttct 120

ctctcggggc gagcgcgccg cctgctgctc ccttgcagca ggaaggacct cccgagtatt 180

tccggagagc acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc 240

ggtgcatgtg caccccggct gcccgggtat tttggagcgc cggccaagtc tattgcacac 300

ggtgtctcag tgcacggtct cttctctctc cggagcttca ggacactgac ctcgctgcaa 360

ttggcttgtt ttacaagcct aaagacaagc ttcactggaa agtccctatc ggcatccctc 420

aggtggagtg tactccgtcc gggtgctgtt ggctctcagc catcttcccc ttggcgcgca 480

tgacctccgg caatcacaac tttctccaac gacttgtgaa ggttgctgat gttttgtacc 540

gtgacggctg cttggcacct cgacaccttc gcgaactcca agtttacgag cgcggctgca 600

actggtaccc gatcacgggg cccgtgcccg ggatgggttt gtacgcgaac tccatgcacg 660

tgtccgacca accgttccct ggtgccgctt atgtgttaac gaactcacct ctgcctcagc 720

aggcttgtcg acagccgttt tgtccatttg aggaggttca ttccgacgta tacaggtgga 780

agaaattcgt gatttttgtg gattcctctt ctgacggccg atctcgcatg atgtggacac 840

caggatccga cgactcggct gccttagaag tattgccacc tgaactagaa tgtcgagtcg 900

aaatcctcgt tcggagtttt cctgcccacc accctgtcga catcaccaac tgggagctca 960

ctgagtcccc tgagcacggt ttttccttca gcacgtctca ttcttgtggt taccttgccc 1020

aagaccctga cgtgtttgat ggtaagtgtt ggctttcttg ctttttgggc ctgccgaccg 1080

aagtgtggcg tcatgaggag catctagcta acgccttcgg ttaccaaacc aagtggggcg 1140

tgcatggtaa gtacctccag cgcaggcttc aggtccgcgg catgcgtgct gtagttgatc 1200

ctgatggtcc catccacgtt gaagcgctgt cttgccccca gtcttggatc aggcacctga 1260

ctctaaatga tgacgtcacc ccaggatttg ttcgcctaac atcccttcgc attgagccga 1320

acacagagcc tactactttc cggatctttc ggtttggagc gcataagtgg tatggcgctg 1380

ccggcaaacg ggctcgtgct aagcgtgccg ctaaaggtga gaagaattca gctcccaccc 1440

ccaaggtcgc cctgccggtc cccacctatg gaattaccac ctactctcca ccgacagacg 1500

ggtcttgtgg ttggcatgtc cttgccgcca taatgaaccg gatgataaat ggtgacttca 1560

cgtcccctct gactccgtac aacagaccag aggatgattg ggcttctgat tatgatcttg 1620

ctcaggcaat ccaatgtcta caactgcctg ctaccgtggt ccggagtcgc gcctgtccca 1680

acgccaagta cctcataaaa ctcaacggag tccactggga ggtagaggtg aggtcaggaa 1740

tggctcctcg ctctctttct cgtgaatgtg tggttggcgt ttgctctgaa ggttgtgttg 1800

caccgcctta tccagcagac gggctaccag aacgagcact cgaggccttg gcgtctgctt 1860

acaggttacc ctctgattgt gttagctctg gcattgctga ctttcttgct aacccacctc 1920

ctcaggaatt ctggaccctc gacaaaatgt tgacctcccc gtcaccagag cggtccggct 1980

tctctagttt gtataaatta ctattagagg ttgttccgca aaaatgcggt gccacggaag 2040

gggctttcgt ctatgctgtt gagagaatgt tgaaggattg tccgagctcc aaacaggcca 2100

tggcccttct ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tcccttgacg 2160

agtgtttccc tacggatgtt tcagccgact tcgagccagc atctcaggaa aggccccaaa 2220

gttccggtgc tgctgttgtc ctgtgttcac cggaagtaaa agagttcgaa gaagcagccc 2280

cagaagaagt tcaagagagt ggccataagg tcgcccgctc tgcatttgtt gccgagggtc 2340

ctaacaatga acaggtaccg atggctgccg gcgagcaact gaagcccggt ggtcgcgttt 2400

tggcggtcgg gaatgctcat gaaggtgttc tggcctcaac tagttcgacc aacctgatag 2460

gcgggaactt ccccccttca gactccatga aagagagcat gctcaatagc tgggaagacg 2520

aaccactgga tttgtcccaa ccggcaccag ctgttacaat gacccttgtg agagagcaaa 2580

cacccgacaa cctgggtcct gatgccggtg ccttccccgt caccgttcga aaatttgtcc 2640

cgacagggcc tacactccgt catgttgagc actgcggcac ggagtcaggc gacagcagtt 2700

cgcccttgga tctgtcttat gcgcaaaccc tggaccagcc tttaaatcta tccttggccg 2760

cttggccagt gagggccacc gcgtctgacc ctggctgggt ccacggtagg cgtgagccta 2820

tctttgtgaa gcctcgagat gctttctctg acggcgattc agcccttcag ctcggggagc 2880

tgtctgaatc cggctccgtc atcgagtttg accggacaag aaatgctccg gcggtcgacg 2940

cccctgttga cttgacggct tcgaacaagg ccctctctgt ggttgatcct ttcgaatttg 3000

ccgaactcaa gcgcccgcgt ttttccgcac aagccttaat tgaccgaggc ggtccacttg 3060

ccgacgtcca tgcaaaaata aagaaccggg tatatgaaca gtgcctccag gcttgtgagc 3120

ctggcagtcg cgcaacccca gccaccaaga agtggctcga taaaatgtgg gatagggtgg 3180

acatgaagac ttggcgctgt acctcgcagt tccaagctgg tcgcattctt gcgtccctta 3240

aattcctccc tgacatgatt caggacacac cacctcctgt tcctaggaag aatcgggcta 3300

gtgataatgc cggcctgaag cgactggtgg cgcagtggga cagaaaattg agtgcaaccc 3360

ccccttcaaa accggttgga ccaacacttg accaaattgt cccttcgccc acgggtaccc 3420

agcaagaaga tgtcacttcc tccgatgggc catctcatgc gccggatcct cctagtcgaa 3480

tgagcacgag tgggagttgg aagggccttg tgctctctgg tacccgtctc gcggggtcca 3540

ttagtcagca tttcatgaca tgggtttttg aggttttctc ccatctccca gcttttgcac 3600

tcacactttt ctcgccgagg ggctctatgg cttcaggtga ttggatgttt gcaggtgttg 3660

ttttacttgc tctcctgctc tgtcgttctt acccagtatt cgggtgcctt cccttattgg 3720

gtgtcctttc tggctctgtg cggcgcgttc gtctgggggt ttttggttct tggatggctt 3780

tcgctgtatt tttattctcg actccatcca acccagtcgg ttcttcttgt gaccacgatt 3840

cgccggagtg tcatgctgag cttttggctc ttgagcagcg ccaactttgg gaacctgtgc 3900

gcggccttgt ggtcggcccc tcgggcctct tatgtgtcat tcttggcaag ctactcggtg 3960

ggtcacgtta tctctggcat gttttcttac gtttatgcat gcttgcagat ttggcccttt 4020

ctcttgttta tgtggtgtcc caggggcgtt gtcacaagtg ttggggaaag tgtataagaa 4080

cagctccggc ggaggtggct ctcaatgtgt tccctttctc gcgcgctacc cgtagctctc 4140

ttgtgtcctt gtgcgatcgg ttccaagcgc caaaaggggt tgatcctgtg tacttggcaa 4200

cgggttggcg cgggtgttgg tgtggtgaga gtcccattca tcaaccgcac caaaaaccca 4260

tagcttatgc taatctggat gaaaagaaaa tatctgccca aacggtggtt gctgtcccac 4320

acgatcccag tcaggccatc aagtgcctga aagttttgca ggcgggagga gccatcgtgg 4380

accagcccac acctgaggtc gtccgtgtat ccgaaatccc cttctcagcc ccatttttcc 4440

caaaagttcc agtcaaccca gattgtaagg ttgtggtgga ttcggacact tttgtggctg 4500

cggttcgctg cggctactcg acagcacaac tggtcttagg ccagggcaac tttgccaagt 4560

taaatcagat tcccctcagg agctctatct ccaccaaagc gattggcggg gcctcttaca 4620

cccttgctgt ggctcaagtt tctgtgtgga ctcttgttca cttcatcctc ggtctttggt 4680

tcacgtcacc ccaagtgtgt ggccgaggaa cctctgactc atggtgttca aatccttttt 4740

cataccctac ctatggcccc ggggttgtgt gctcctctcg actttgtgtg tctgccgacg 4800

gggtcactct accattgttc tcagccgtgg ctcaactctc cggtagagag gtggggattt 4860

ttattttggt actcgtctcc ttgatggctt tggcccaccg catggccctt aaggcagaca 4920

tgttgatggt ctttctggct ttttgtgctt acgcctggcc catgagctcc tggttgattt 4980

gcttctttcc tacactcttg aagtgggtta ccctccaccc tcttactatg ctttgggtgc 5040

actcattctt ggtgttttgt ctgccagcag ccggcatcct ctcactaggg ataactggcc 5100

ttctttgggc ggttggccgc tttactcagg ttgccggaat tattacacct tatgacatcc 5160

accagtacac ctctgggcca cgtggcgctg cagctgtggc cacagcccca gaaggcactt 5220

atatggccgc cgtccggaga gctgctttaa ctgggcgaac tttaatcttc accccgtctg 5280

cagttggatc ccttctcgaa ggagctttca ggactcataa accttgtctt aacaccgtaa 5340

atgttgtagg ctcttccctt ggttccggcg gggttttcac tattgacggc agaaaaattg 5400

ttgtcactgc tgcccatgtg ttgaacggcg acacagctag agtcaccggc gactcctaca 5460

accgcatgca tactttcaag accaatggtg attatgcctg gtcccatgct gatgactggc 5520

ggggcgttgc ccctgcggtc aaggttgcga aggggtaccg cggtcgtgcc tactggcaaa 5580

catcaactgg cgtcgaaccc ggtgttattg gggaagggtt cgccttctgt ttcaccacct 5640

gtggcgattc ggggtcaccc gtcatctcag aatccggtga tctcattgga atccataccg 5700

gttcaaataa acttggttct ggtcttgtga caacccctga aggggagaca tgtaccatca 5760

aagaaaccaa gctctctgac ctctccagac atttcgcagg cccaagcgtt cctcttgggg 5820

atattaaatt gagtccagcc atcatccctg atataacatc cattccgagt gacttggcat 5880

cgctcctatc ctccgtccct gtagtggaag gcggcctctc gaccgttcaa cttttgtgtg 5940

tctttttcct actttggcgc atgatgggcc atgcctggac tcccattgtt gccgtgggtt 6000

tctttttact gaatgaaatt cttccagcag ttttggtccg agccgtgttt tcttttgcac 6060

tttttgtgct tgcatgggcc accccctggt ctgcacaggt gttgatgatt agactcctca 6120

cggcatctct caaccgcaat aagctttctc tggcgttcta cgcactcggg ggggtcgtcg 6180

gtttggccgc tgaaatcggg acttttgctg gcaaattgcc tgaattgtct caaacccttt 6240

cgacatactg cttcttacct agggtccttg ctatgaccag ttgtgttccc accatcatca 6300

ttggtggact ccatgccctc ggtgtaattc tgtggttgtt caaataccgg tgcctccaca 6360

acatgctcgt tggtgatggg agtttttcaa gcgccttctt cctacggtat tttgcagagg 6420

gtaatctcag aaaaggtgtt tcgcagtcct gtggcatgaa taacgagtcc ctgacggctg 6480

ctttggcttg caagttgtca cgggctgacc ttgatttttt gtccagctta acgaacttca 6540

agtgctttgt atctgcttcg aatatgaaaa atgctgccgg ccagtacatt gaagcggcgt 6600

atgccaaggc cctgcgccaa gagttggcgt ctctagttca gattgacaaa atgaaaggag 6660

ttttgtccaa actcgaggcc tttgctgaaa cagctactcc gtcccttgac ataggtgacg 6720

tgattgttct gcttgggcaa catccacacg gatctatcct tgatattaat gtggggactg 6780

agaggaaaac tgtgtccgtg caagagaccc ggagcctagg cggttccaaa ttcagtgttt 6840

gtactgtcgt gtctaacaca cccgtggacg ccttaaccgg catcccactc cagacaccaa 6900

cccctctttt tgagaatggt ccgcgtcatc gcagcgaaga agacgatctt aaagtcgaga 6960

ggatgaagaa acactgtgtg cccctcggct tccacaacat caatggcaaa gtttactgca 7020

agatttggga caagtccacc ggtgacacct tttacacgga tgattcccgg tatacccacg 7080

accatgctct tcaggacagg tcagccgact acagagacag ggactatgag ggtgtgcaaa 7140

ccgcccccca acagggattt gatccaaagt ctgaaacccc tgtcggcact gttgtgatcg 7200

gcggtattac gtataacagg tatctgacta agggtaagga ggttctggtt cccaagcccg 7260

acaattgcct tgaagctgcc aagctgtctc ttgagcaagc tctcgctggg atgggccaaa 7320

cttgcgacct tacagctgcc gaggtggaaa agttaaagcg catcatcagt caactccaag 7380

gtttgaccac tgaacaggct ttaaactgct agccgctagc ggcttgaccc gctgtggccg 7440

cggcggctta gttgttactg aaacggcggt aaaaattgta agataccaca gcagaacttt 7500

caccttgggc cctttggacc taaaagtcgc ttctgaggtg gaggtgaaga gatcaactga 7560

gcagggccac gctgttgtgg caaacctatg ttctggtgtt gtattgatga gacctcaccc 7620

accgtccctt gttgacgttc ttctgaaacc cggacttgac acaacacccg gcattcaacc 7680

ggggcatggg gccgggaata tgggcgtgga cggttccatt tgggattttg aaaccgcacc 7740

cacaaaggca gagctcgagt tgtccaggca aataatccaa gcatgtgaag tcaggcgcgg 7800

ggatgccccg aacctccaac tcccttacaa gctctgtcca gttagggggg atcctgagcg 7860

gcataaaggc cgccttatca ataccaggtt tggagatttg ccttacaaga ctcctcaaga 7920

caccaagtcc gcaatccacg cggcttgttg cctgcacccc aacggggctc ccgtgtctga 7980

tggtaaatcc acattaggca ccactcttca acacggtttc gagctttatg tccctactgt 8040

gccctatagt gtcatggagt accttgattc acgccctgac acccccttta tgtgtaccaa 8100

acatggtacc cccgaggctg ctgcagagga ccttcgaaaa tatgacttat ccacccaagg 8160

gtttgtcctg cctggggtcc tacgtctagt acgcagattc atctttggcc atattggtaa 8220

ggcaccgcca ctgttcctcc catcaactta tcccgccaag aactctatgg cagggatcaa 8280

tggccagagg ttcccaacaa aagacgttca gagcatacct gaaattgatg aaatgtgtgc 8340

ccgcgctgtc aaagagaatt ggcaaactgt gacgccttgc accctcaaaa aacagtattg 8400

ttccaagcct aaaaccagga ccatccttgg taccaacaac ttcattgcct tggctcacag 8460

gtcggcactc agcggtgtca ctcaggcgtt catgaaaaaa gcctggaagt ccccgatcgc 8520

cttggggaaa aacaaattta aggagttgca ctgcactgtc gccggtaggt gcctcgaggc 8580

cgacttggcc tcttgtgatc gcagcacccc ggccatcgtg aggtggtttg ttgccaacct 8640

cctgtacgaa cttgcgggtt gtgaagagta cttgccaagc tatgtgctca attgttgcca 8700

tgacctggtg gcaacgcaaa atggcgcctt cacaaaacgt ggtggcctgt catctggaga 8760

ccccgttacc agtgtgtcca acacagtgta ttcactggtg atttatgctc agcacatggt 8820

gctgtcggct ttgaagatgg gtcatgaaat cggcctcaag ttcctcgagg aacagcttaa 8880

gttcgaggac cttctcgaaa tccagcctat gttggtatat tctgatgacc ttgtattgta 8940

tgctgaaaga cccaccttcc ccaattacca ttggtgggtt gagcaccttg acctgatgct 9000

gggttttaag acagacccaa aaaagactgt cataactgac aaacccagct ttcttggctg 9060

tagaatcgaa gcggggcgac aactggttcc cagtcgcgac cgcattctgg ctgctcttgc 9120

atatcacatg aaggcgcaga acgcctcaga gtattatgcg tctgctgccg cgattctgat 9180

ggactcgtgt gcttgcattg accacgatcc tgagtggtat gaggacctca tctgcggcat 9240

tgctcgatgc gcccgccagg atggctacag tttcccaggc ccgccgttct tcatgtccat 9300

gtgggagaag ctgaaaagtc acaatgaagg caagaaattc cgccactgtg gcatttgtga 9360

cgccaaggcc gatcatgcgt ccgcctgtgg gcttgattta tgtctgttcc actcgcactt 9420

tcatcaacac tgccctgtta ctctgagctg cggccatcat gccggttcaa aagaatgccc 9480

acagtgtcag tcacctgttg gagctggtaa atcccccctt gatgcagtgc tgaaacaaat 9540

cccgtacaaa ccccctcgtc ctgtcatcat gaaggtggac aataaaacaa cgacccttga 9600

cccgggaagg tatcagtccc gtcgaggtct tgttgctgtc aagaggggta ttgcaggcaa 9660

tgaggttgat ctcgctgatg gagactatca ggtggtgccc cttttgccaa cctgcaaaga 9720

cataaacatg gtgaaggtgg ctgtcaatgt gctactcagc aagttcatag tggggccgcc 9780

aggttccggc aagacgacct ggctactgag tcaagttcag gatgatgatg tcatctatac 9840

acctacccat cagaccatgt tcgacatagt caatgccctc aaagtctgta ggtattccat 9900

cccagtggct tcagggctcc ctttcccacc gcccgccaga tctggaccgt gggttaggct 9960

cgttgctagc gggcacatcc ctggccgaat atcatacctt gacgaggccg gatattgcaa 10020

tcatctggat attctcagac tgctttctaa gacacctctt gtgtgtttgg gtgaccttca 10080

gcaacttcac cctgtcggct ttgactctta ctgttatgtt tttgatcaca tgcctcataa 10140

gcagctgacc actatttata gatttggccc caatatctgt tctgccattc aaccttgtta 10200

cagggaaaaa ctcgaatcta aggccaggaa cactagggtg gtttttactg cccggcccgt 10260

ggcttttggt caggtgttga cgccatatca taaagaccgc accggctcag ctataaccat 10320

agattcatcc cagggagcca cctttgatgt tgtgacgctg catttgccgt cgccagattc 10380

cctgaacaaa tcccgggctc ttgtagctat cactcgggca aggcatgggt tgttcatcta 10440

tgaccctcat aaccaactcc ggaagttttt caacttaaca cctgagcgca ctgattgcaa 10500

cctcgtgttc aaccgcgggg acgagttggt agttttgaat gcagataatg cagtcacgac 10560

tgtggctaag gttctggagg cgggcccgtc tcggtttcga gtatcagatc caaggtgcaa 10620

gtctctttta gccgcttgct cggccagtct ggaaggaggc tgcatgccac tgccgcaagt 10680

ggcacataat ctggggtttt acttctctcc agatagtcca gcatttgcac ctctgccaaa 10740

agagctggca ccacattggc cggttgttac tagtcagaac aaccaggcat ggcccgaccg 10800

acttgtcgct agtatgcggc cagttgatgc ccgctacagc aagcctatgg tcggtgcagg 10860

gtatgtggtt gggccatcca ctttccttgg cactcctggt gtggtgtcat actatctcac 10920

gctgtacatc aggggtgagc cccaggcctt gccggagaca ctcgtctcaa cgggacgtat 10980

agctactgat tgtcgagagt atctcgacgc agctgaggaa gaagcagcta aagaactccc 11040

tcacgcattc attggcgatg tcaaaggtac tacagtgggg gggtgtcacc acattacgtc 11100

aaaatacctt cccaggtcct tgcccaagga ctccgttgcc gtggtcggag tgagttcgcc 11160

cggcaaggct gccaaagccg tgtgtactct caccgatgtg tatcttcccg agctccggcc 11220

atatttgcaa ccggaaacag catcgaaatg ctggaaactt aaactagact tcagggatgt 11280

cagactgatg gtctggaaag gagccaccgc atatttccaa ctggaggggc tcacatggtc 11340

agcgctgccc gactatgcca ggttcattca gctaccaaaa gatgccgttg tgtacattga 11400

tccgtgcata ggaccggcaa cagccaaccg taaggttgtg agaactacag attggcgagc 11460

tgacctggca gtgacaccgt acgactacgg tgctcagagc attttgacta cagcctggtt 11520

cgaggacctt gggccgcagt ggaagatttt agggttgcaa cccttcaagc gggcatttgg 11580

ctttgaaaac actgaggatt gggcgatcct tgcacgtcgc atgaacgacg gcaaggacta 11640

cactgactat aactggaatt gtgttcgaca acgcccacat gccatctacg gacgtgcccg 11700

tgaccatacg tatcactttg cccctggcac tgaactgcaa gtagagctag gtaaacctcg 11760

gctaccgcct gagcaagtac cgtgaatcta gagtgatgca atggggtcac tgtggagtaa 11820

aatcagtcaa ctgttcgtgg atgccttcac tgagttcctt gttagtgtgg ttgatattgt 11880

catcttcctt gccatactgt ttgggttcac cgttgcaggg tggttactgg tcttttttct 11940

cagagtggtt tgctccgcgc ttctccgttc gcgctctgcc attcactctt ccgaactatc 12000

gaaggtccta tgagggcttg ctacctaatt gcagaccgga tgttccacaa ttcgcattca 12060

agcacccatt gggtatgttt tggcacatgc gagtttccca cttaattgac gaaatggtct 12120

ctcgccgcat ttatcagacc atggaacatt caggtcaagc ggcctggaag caggtggtta 12180

gtgaagctac tctcacaaga ctgtcaaagc tcgacatagt tctccacttc caacacctgg 12240

ccgcaataga ggcggattct tgccgcttcc tcagctcacg acttgtgatg ctgaaaaatc 12300

ttgctgttgg caatatgagc ctacagtaca acaccacgtt ggaccgcgtt gagctcatct 12360

tcccaacacc aggtacgagg cccaaattga ccgattttag acaatggctc gtcagtgtgc 12420

acgcttctat tttttcctct gtggcctcat cagttacctt gttcatagtg ctttggcttc 12480

gaattccagc tctacgctat gtttttggtt tccattggcc cacggcaaca catcattcga 12540

gctaaccatc aattactcta tatgtaagcc ctgtctcacc agtcaagcgg ctcgacaaag 12600

gctcgaaccc ggtcgcaaca tgtggtgcaa aatagggcac accacgtgtg aggagcgtga 12660

ccatgatgag ttgtcaatga ccattccgtc cgggtacgat aacctcaaac ttgagggtta 12720

ttacgcttgg ctggcttttt tgtccttttc ttacgcagcc caatttcatc cagagttgtt 12780

cggaataggg aatgtgtcac gcgtcttcgt ggataaacgg caccagttca tctgtgccga 12840

gcacgacgga caaaattcaa ccgtatccac cgaacataat atttccgcat tgtatgcggc 12900

gtactaccac caccaggtag acgggggcaa ttggttccac ctggaatggc tgcggccttt 12960

cttttcctcc tggctagtac tcaatatttc atggtttctg aggcgttcgc ctgcaagccc 13020

tgtttctcga cgcatttatc agatattgag accaacacga ccgcggctgc cggtttcatg 13080

gtccttcagg acatcaactg tttccacagt ggctcagagg cacaaacgac tggtcccatc 13140

agaaagtcgt cccaatgccg tgaagccgtc ggcactcccc agtacatcaa gataacggcc 13200

aatctgaccg acgaatcata cttgtacaac gcggacttgc tgatgctttc tgcgtgcctt 13260

ttctacgcct cagagatgag cgagaaaggc tttaaagtca tttttgggaa tgtctctggc 13320

gttgtctccg cttgtgtcaa ttttacagat tatgtggccc atctgaccca acatacccag 13380

cagcatcatt tggtaaccaa tcacattcgg ttgctacatt tcctgacacc atcagcgatg 13440

aggtgggcta caaccattgc ttgtttgttc gccattctct tggcgatatg agatgttctc 13500

acaaatcggg gtgtttcttg actccgcact cttgcttttg gtggtttttt ttgctgtgta 13560

ccggcttgtc ctggtccttt gccgatggca acggcgacag ctcgacatac caatatatat 13620

ataacttgac gatatgcgag ctgaatggga ccgaatggct gtctgaccat tttaattggg 13680

cagtcgagac ttttgtgctc tacccagtgg cgactcatat cctctcactg ggtttcctca 13740

cgacaagtca tttccttgat gcgttcggtc ttggagctgt gtcaattaca gggttttgtg 13800

gcgggcggta cgtgctcagc agcgtgtacg gcgcttgtgc actagcagcg ctcgtatgtt 13860

ttgttatccg tgctgccaaa aattgtatgg cttgccgcta tgctcgtacc cggtttacca 13920

acttcattgt ggatgaccgg gggagaatcc atcggtggag gtctccaata gtggtggaaa 13980

aattaggtaa agctgacgtc ggcggcgacc ttgtcaccat caaacatgtc atcctcgaag 14040

gagtcaaagc tcaacccttg acgaggactt cggccgagca atgggaggcc tagataattt 14100

ctgcaacgat cccaccgccg cacaaaagct tgtgctagcc tttagcatca cgtatacacc 14160

catcatgata tacgccctta aggtgtcacg cggccgactc ttggggttgt tgcacatctt 14220

gatatttctg aactgttctt tcacgttcgg atacatgaca tatatgcatt ttgaatccac 14280

caaccgtgtc gcgcttacca tggggggcgt tgtcgccctt ctgtggggcg tttatagttt 14340

catagagtca tggaagttta tcacttccag atgcagattg tgttgcctag gccggcgata 14400

cattctggcc cctgcccacc acgtagaaag tgctgcaggc ctccatccga tcccagcgtc 14460

tggtaaccaa gcatacgctg tgagaaagcc cggactaaca tcagtgaacg gcactctggt 14520

accaggactt cgaggcctcg tgctgggcgg caaacgagct gttaaacgag gagtggttaa 14580

cctcgtcaag tatggccggt aaaaaccaga gccagaagaa aaagaaaaat ccagctccaa 14640

tggggaatgg ccagtcagtc aatcaactgt gccagctgct gggcacaatg ataaagtccc 14700

agcgccagcg acccagggga ggacaggcta aaaagaaaaa gcctgagaag ccacatttcc 14760

ccctggctgc tgaagatgac gtccggcacc atctcaccca gaccgagcgc tccctttgct 14820

tgcaatcgat ccagacggct tttaatcaag gcgcaggaac tgcgtcgctt tcatccagcg 14880

ggaagatcgg ttttcaggtt gagtttatgc taccggttgc tcatacagtg cgcctgattc 14940

gcgtgacttc tacatccgcc ggtcaggatg caaattaatt tgatagtcag gtgaatggcc 15000

gcgattggcg tgtggcctct gagtcaccta ttcaattagg gcgatcacat gggggtcaga 15060

cttaattagg caggaaccat gtgaccgaaa tt 15092

<210> 6

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный праймер

<400> 6

gcaccacctc acccagac 18

<210> 7

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный праймер

<400> 7

cagttcctgc gccttgat 18

<210> 8

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный праймер

<400> 8

cctctgcttg caatcgatcc agac 24

<---

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к вакцине, способу вакцинирования для защиты животного свиньи от заражения вирусом PRRS. Вакцина включает: (a) европейский вирус PRRS, кодируемый полинуклеотидной молекулой SEQ ID NO: 5 или полинуклеотидной молекулой, являющейся по меньшей мере на 90% идентичной SEQ ID NO: 5, причем указанный вирус был адаптирован для роста в клетках свиньи или в несвиных клетках млекопитающих, которые экспрессируют свиной рецептор CD163 перед введением указанного вакцинного вируса животному свинье; (b) указанную кодирующую полинуклеотидную молекулу; (c) указанную полинуклеотидную молекулу в форме плазмиды; или (d) вирусный вектор, содержащий указанную полинуклеотидную молекулу. Способ включает введение вакцины в период от приблизительно 12 часов после рождения до 3-недельного возраста, перед отлучением от матери указанного животного. Вакцина безопасна и эффективна и позволяют вакцинировать свиней перед отлучением от матери однократной дозой, как правило, уже в первый день жизни. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 18 табл., 7 пр.

Формула