Вирус утиного энтерита и его применение - RU2721575C2

Чертежи

Показать все 8 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается новых вирусов и их применения. Более конкретно, изобретение касается новых конструкций вируса утиного энтерита и их применения для экспрессирования или доставки представляющих интерес полипептидов животным, в особенности домашним птицам. Изобретение особенно подходит для вакцинации домашней птицы от птичьих патогенов.

Уровень техники

Мясо и яйца птицы являются важным источником пищи, потребление которых постоянно возрастает вследствие роста численности населения и их высокого соотношения цена-качество. Недавняя эпидемия птичьего гриппа обратила общественное мнение на здоровье птиц, а также на безопасность и надежность пищевых продуктов, а технология вакцинации домашней птицы стала всемирной проблемой.

Рекомбинантные вирусы, экспрессирующие белки патогенов, широко применяются в качестве вакцин для домашней птицы против целевых патогенов. Вакцины, включающие такие вирусы, индуцируют экспрессию чужеродных белков патогенов либо их фрагментов в инфицированных клетках, которые впоследствии могут индуцировать специфический и защитный гуморальный иммунитет, а также клеточный иммунитет.

В связи с этим был разработан целый ряд вирусов, в которые были встроены чужеродные гены, происходящие из патогенов, для применения в качестве вакцин с вирусными векторами. Эти вирусные векторы (или рекомбинантные вирусы), как правило, основываются на авипоксвирусах типа вируса птичьей оспы (EP-A-0,517,292), герпесвирусах, в частности HVT (например, WO-A-87/04463, 5,980,906, 5,853,733), вирусе болезни Ньюкасл (NDV) или птичьих аденовирусах. Эти рекомбинантные вирусы птиц проявляют различные степени защиты, в зависимости от болезни и/или животных.

Например, поскольку поксвирусы, NDV и аденовирусы не персистируют у кур, то они считаются не лучшими кандидатами для продолжительного иммунитета у кур. Рекомбинантные HVT, экспрессирующие антигены, проявляли преимущества, и они в настоящее время поступают в продажу для вакцинации кур (например, Vectormune^® IBD, Vectormune^® ND или Vectormune^® LT).

Однако, учитывая растущее число и разнообразие патогенов и непрерывный рост потребления домашней птицы, существует потребность в альтернативных стратегиях и/или системах вакцинации, которые можно использовать для выработки эффективного защитного иммунитета у домашней птицы. В частности, существует потребность в эффективных системах для выработки иммунитета у очень молодых животных (3 дня или меньше) либо in ovo.

В связи с этим изучались новые серотипы вирусов с целью поиска альтернативных совместимых вирусных векторов для улучшения вакцинации у животных, особенно у домашней птицы, обеспечивающих стабильную экспрессию белка и эффективную защиту.

В WO 2014/0036735 обсуждается возможное применение вируса утиного энтерита на курах. В природе DEV заражает уток или гусей, но не известно никакого тропизма для кур. В этом документе предлагается вводить конструкции DEV 1-недельным цыплятам путем внутримышечной инъекции. Но в этом документе сообщается только о позднем введении.

Однако, проводя дальнейшие эксперименты с DEV, авторы изобретения обнаружили, что такой вирус летален при введении молодым цыплятам (3 дня или меньше) либо in ovo. Вне ожидания, хотя введение цыплятам DEV дикого типа (или конструкции DEV, содержащей все нативные гены, как предлагается в WO 2014/0036735) через неделю после вылупления хорошо переносится, но введение такой конструкции в 1-й день после вылупления либо in ovo вызывает массовую гибель животных (от 80 до 100%). Еще более неожиданно авторы изобретения смогли модифицировать структуру DEV и получить такие конструкции DEV, которые могут применяться у домашней птицы, в том числе на очень ранней стадии (3 дня или меньше) либо in ovo, причем это может вызывать существенную и раннюю экспрессию белка in vivo. Следовательно, такие вирусы представляют собой новые мощные векторы для вакцинации домашней птицы.

Сущность изобретения

Изобретением предусмотрены новые вирусные конструкции, подходящие для экспрессии генов или белков in vivo у животных, в особенности у домашней птицы, в том числе на очень ранней стадии (то есть на 3-й день после вылупления или раньше, а также in ovo). В частности, изобретением предусмотрены новые вирусы DEV, полученные путем инактивации гена UL4, и показано, что такие DEVs (i) подвергаются аттенуации in vivo, особенно у кур, и (ii) являются стабильными и способны экспрессировать чужеродные гены способом, подходящим для индуцирования защитного иммунитета. Поскольку такие DEVs не обладают никаким известным естественным тропизмом, например, для кур, то применение таких конструкций DEV для вакцинации кур не связано с риском диссеминирования или заражения невакцинированных животных. Кроме того, у цыплят нет материнских антител или иммунитета против DEV, поэтому вирусы по изобретению можно использовать для выработки очень раннего иммунитета у вакцинированных животных. Вне ожидания, как указано ранее, хотя DEV дикого типа летален у молодых цыплят или in ovo, DEVs по изобретению являются безопасными и могут эффективно экспрессировать нужные гены in vivo. Следовательно, такие новые DEV представляют собой очень эффективные векторы для вакцинации животных, особенно домашней птицы, и вырабатывания раннего защитного иммунитета.

Предметом изобретения, в частности, является такой вирус утиного энтерита (DEV), который содержит неактивный ген UL4. Так, в изобретении показано, что при инактивации гена UL4 можно получить жизнеспособные, стабильные и репликативные вирусы DEV, причем такие вирусы могут применяться для создания рекомбинантных DEVs путем введения чужеродного генетического материала. Результаты также показали, что такой чужеродный генетический материал хорошо экспрессируется из таких вирусов при заражении клеток, причем такая экспрессия остается стабильной во времени. Более того, вне ожидания, хотя нативные DEV, а также многие другие делетированные конструкции DEV, полученные авторами изобретения, оказались патогенными или летальными для молодых цыплят (на 3-й день после вылупления или раньше) и in ovo, однако при инактивации UL4 образуются ослабленные вирусы, которые можно безопасно использовать для экспрессии белков и антигенов у молодых животных, в том числе in ovo. Такой результат был совершенно неожиданным и дает представленным вирусам большие преимущества и полезность.

Итак, другим предметом изобретения является такой вирус утиного энтерита (DEV), который содержит неактивный ген UL4 и содержит чужеродную нуклеиновую кислоту.

В соответствии с определенными воплощениями ген UL4 подвергается мутации или удаляется или прерывается; а/или чужеродная нуклеиновая кислота располагается в гене UL4, заменяя собой всю или часть последовательности гена UL4 и/или чужеродная нуклеиновая кислота кодирует птичий патоген.

Следующим предметом изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, включающая геном DEV, содержащий неактивный ген UL4.

Изобретение также касается клеток хозяина, содержащих DEV или нуклеиновую кислоту, как определено выше.

Изобретением также предусмотрен способ получения или реплицирования DEV, как определено выше, включающий инфицирование компетентных клеток молекулой нуклеиновой кислоты или DEV, как определено выше, и извлечение DEV.

Изобретение также касается способа получения рекомбинантного DEV, который включает введение чужеродной нуклеиновой кислоты в последовательность гена UL4 из DEV, предпочтительно путем замены всей или по меньшей мере 20% последовательности гена UL4.

Изобретением также предусмотрена композиция, содержащая DEV, нуклеиновую кислоту или клетки хозяина, как определено выше, фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент или носитель и, необязательно, адъювант.

Изобретением также предусмотрена вакцина, включающая DEV, нуклеиновую кислоту или клетки хозяина, как определено выше, фармацевтически или ветеринарно-приемлемый эксципиент или носитель и, необязательно, адъювант.

Следующим предметом изобретения является композиция, DEV, нуклеиновая кислота или клетки хозяина, как определено выше, для применения при вакцинации или иммунизации птиц, в особенности домашней птицы, более предпочтительно кур, более предпочтительно молодых цыплят (на 3-й день после вылупления или раньше либо in ovo).

Следующим предметом изобретения является композиция, DEV, нуклеиновая кислота или клетки хозяина, как определено выше, для применения при вырабатывании защитного иммунитета у птиц, в особенности домашней птицы, более предпочтительно кур, более предпочтительно молодых цыплят (на 3-й день после вылупления или раньше либо in ovo).

Изобретение также касается способа вакцинации нечеловеческих животных, в особенности домашней птицы, более предпочтительно кур, более предпочтительно молодых цыплят (на 3-й день после вылупления или раньше либо in ovo), который включает введение данным животным композиции или вируса, как определено выше.

Одним конкретным предметом изобретения является способ вакцинации домашней птицы, включающий введение композиции или вируса in ovo, как определено выше.

Другим конкретным предметом изобретения является способ вакцинации домашней птицы, включающий введение композиции или вируса, как определено выше, в 1-й день (то есть в пределах 24 часов) после вылупления.

В следующем аспекте изобретения предусмотрен способ вырабатывания иммуногенной или защитной реакции у нечеловеческих животных против одного или нескольких патогенов птиц, включающий введение данным животным, в особенности домашним птицам, более предпочтительно курам, более предпочтительно молодым цыплятам (на 3-й день после вылупления или раньше либо in ovo) композиции, вакцины или вируса, как определено выше.

Вирусы или композиции по изобретению можно вводить любым способом. Предпочтительно их вводят in ovo или путем подкожной (например, п/к) инъекции через 1 или 2 дня после вылупления, чтобы обеспечить очень ранний иммунитет.

Изобретением также предусмотрен вакцинационный набор для иммунизации птиц, который включает следующие компоненты:

a) эффективное количество композиции, как указано выше, и

b) средство для введения указанной композиции данным птицам.

Изобретение может применяться для экспрессии полипептидов у любых животных, предпочтительно для вакцинации птиц, причем оно подходит для экспрессии одного или нескольких полипептидов или пептидов, в особенности иммуногенных пептидов из патогенов птиц.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена графическая схема генома вируса утиного энтерита (DEV) и расположение клонируемой области рекомбинантного DEV/rpsLneo-DsRed2, включая сайт вставки.

На фиг. 2 представлена графическая схема рекомбинантного генома DEV/rpsLneo-DsRed2 с указанием расположения участков Junction 1, Junction 2 и Junction 3, амплифицируемых при ПЦР-реакциях для подтверждения структуры генома вируса.

На фиг. 3 представлена графическая схема генома DEV и расположение гена UL4 и клонируемого участка pUC18-KAPEVAC-UL4del.

На фиг. 4 представлена графическая схема генома DEV и расположение области вставки UL26/UL27 с указанием расположения участков Junction 1, Junction 2 и Junction 3, амплифицируемых при ПЦР-реакциях для подтверждения структуры генома вируса.

На фиг. 5 представлена графическая схема генома DEV и расположение гена UL23 и клонируемых участков pUC18-KAPEVAC-UL23del-BacVP2 и pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2.

На фиг. 6 представлена графическая схема генома DEV и расположение области вставки UL45/UL46.

На фиг. 7 представлена графическая схема генома DEV и расположение области вставки UL50/UL51.

На фиг. 8 представлена графическая схема генома DEV и расположение области US7 и клонируемого участка pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2.

Раскрытие сущности изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к аттенуированным вирусам DEV, а также к таким DEVs, которые содержат чужеродные последовательности генов, расположенные в определенных сайтах вставки в геноме. Настоящее изобретение также касается композиций, содержащих такие DEVs, а также их применения для вакцинации животных, в особенности домашней птицы, предпочтительно молодых птиц (на 3-й день после вылупления или раньше либо in ovo).

Настоящее описание станет более понятным с привлечением следующих определений.

Определения

Термином “вирус” обозначаются, в частности, вирусные частицы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты (например, генома), заключенную в капсид или капсулу. Термином “вирус” также обозначаются вирусные векторы или выделенный геном вируса.

Термином “рекомбинантные” обозначаются молекулы, которые были созданы, разработаны или модифицированы с использованием генетических технологий. В отношении вирусов термин “рекомбинантный” более конкретно означает вирус, геном которого (или геном его предка) был модифицирован путем вставки или делеции по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты.

Термином “чужеродная нуклеиновая кислота” в отношению вирусов обозначается нуклеиновая кислота, которая не встречается естественным образом в геноме вируса или же встречается естественным образом в данном геноме, но в другом виде или в другом положении.

В настоящем описании термин “нуклеиновая кислота” или “нуклеиновые кислоты” обозначает любые молекулы или последовательности нуклеиновой кислоты типа дезоксирибонуклеотидов (ДНК) или рибонуклеотидов (РНК), которые могут быть, например, одно- или двухцепочечными. Нуклеиновые кислоты могут содержать ORF или нет. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами, известными per se в данной области, как то: методами искусственного синтеза, по рекомбинантной технологии, ферментативной технологии, методами репликации в клетках хозяина либо их комбинации.

“Ген” означает молекулу или последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую продукт типа полипептида (например, пептид, белок и т.д.) или РНК.

Термин “аттенуированный” в настоящем изобретении относится к таким вирусам, которые практически не вызывают болезней на животных моделях. Аттенуированный вирус обычно реплицируется в хозяине, не вызывая его смерти. Аттенуированный вирус более конкретно означает вирус, который не является вирулентным для эмбрионов при инъекции в дозе 1×10³ бляшкообразующих единиц (pfu) на 1 яйцо. Наиболее предпочтительные аттенуированные вирусы безопасны в дозе 1×10³ pfu/яйцо по меньшей мере у 70% инъецированных яиц, более предпочтительно по меньшей мере у 80% инъецированных яиц, еще более предпочтительно по меньшей мере у 90, 95, 97, 98, 99% или больше. Аттенуированные вирусы по изобретению также безопасны при введении после вылупления, в том числе в день 0 (то есть от 0,1 до 48 часов после вылупления).

Термин “птица” служит для обозначения всех видов птиц типа птиц из класса Aves, то есть позвоночных животных, которые являются оперенными, крылатыми, двуногими, эндотермическими и яйцекладущими. В контексте изобретения птицы или виды птиц более предпочтительно означают птиц, представляющих экономический и/или агрономический интерес, типа домашних птиц, более предпочтительно кур и индеек; или же декоративных птиц типа лебедей и попугаев.

Термин “вакцина” в настоящем изобретении означает средство, которое может использоваться для вырабатывания, стимулирования или усиления иммунного ответа в организме.

“Иммунный ответ” означает возникновение у хозяина клеточного и/или антительного иммунного ответа на данную композицию или вакцину. Обычно “иммунный ответ” включает в себя вырабатывание антител, B-клеток, хелперных T-клеток и/или цитотоксических T-клеток, направленных конкретно на антиген или антигены, включенные в данную композицию или вакцину. Предпочтительно иммунный ответ является защитным в том, что повышается устойчивость к новой инфекции и/или уменьшается клиническая тяжесть заболевания.

Термин введение или инъекция “in ovo” обычно означает инокуляцию или инъекцию в зародыш, содержащийся в яйце. Инъекция in ovo предпочтительно проводится в любое время между 5-м днем и 1-м днем перед вылуплением.

Вирус утиного энтерита

Вирус утиного энтерита (DEV), также известный как вирус вирусного энтерита уток (DVEV), в природе заражает уток и гусей. Была определена полная нуклеотидная последовательность DEV и доступна онлайн (к примеру, см. JQ673560). Вирусный геном содержит около 162 т.о., кодируя почти 80 различных белков. Было выделено несколько серотипов и штаммов DEV, как то: штамм Jansen, штамм CSC, штамм CHv, штамм VAC и штамм 2085.

DEV плохо изучен и его применение в качестве вектора для экспрессии генов не было хорошо исследовано. Например, Liu et al. (2013) и WO 2014/0036735 попытались использовать рекомбинантный DEV для экспрессии генов у кур. Они использовали конструкцию DEV, в которой нуклеиновая кислота была клонирована между генами US7 и US8 вирусного генома без изменения экспрессии нативного гена. Хотя сообщалось, что такая конструкция может переноситься при внутримышечной инъекции 1-недельным цыплятам, однако в этом документе или в любом другом документе предшествующего уровня техники не описано какое-либо возможное применение DEV для вакцинации домашней птицы или для вакцинации молодых цыплят, то есть на 3-й день после вылупления или раньше, особенно в 1-й или 2-й день после вылупления.

Проводя дальнейшие эксперименты с DEV, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что этот вирус летален при введении молодым цыплятам (3 дня или меньше) либо in ovo. Вне ожидания, хотя введение цыплятам DEV дикого типа (или конструкции DEV, содержащей все нативные гены, как предложено в WO 2014/0036735) через неделю после вылупления хорошо переносится, но введение такой конструкции в 1-й день после вылупления либо in ovo вызывает массовую гибель животных (от 80 до 100%), как изложено в примере 1.

Еще более неожиданно авторы изобретения смогли модифицировать структуру DEV и получить такие конструкции DEV, которые могут применяться у домашней птицы, в том числе на очень ранней стадии (3 дня или меньше) либо in ovo, причем это может вызывать существенную и раннюю экспрессию белка in vivo. В частности, авторы настоящего изобретения провели дальнейшие исследования с DEV и получили различных рекомбинантов с различными делециями или изменениями генов. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что одна из этих конструкций представляет собой стабильный, безопасный и мощный рекомбинантный DEV, в то время как другие были по существу летальны in ovo. Более конкретно, при инактивации гена UL4 можно получить рекомбинантные DEV, которые (i) подвергаются аттенуации in vivo, особенно у кур, и (ii) стабильны и способны экспрессировать чужеродные гены способом, подходящим для индуцирования защитного иммунитета. Таким образом, изобретение показывает, что при инактивации гена UL4 можно получить жизнеспособные, стабильные и репликативные DEV, причем такие вирусы можно использовать для вставки чужеродного генетического материала. Результаты также показывают, что такой чужеродный генетический материал хорошо экспрессируется из таких вирусов при заражении клеток, причем такая экспрессия остается стабильной с течением времени. Более того, вне ожидания, хотя нативный DEV или другие рекомбинантные DEV патогенны или летальны для молодых цыплят (менее 3 дней либо in ovo), однако инактивация UL4 дает аттенуированные DEVs, которые можно безопасно использовать для экспрессии белков или антигенов у молодых цыплят и in ovo. Поскольку DEV не обладает никаким известным естественным тропизмом, например, для кур, то применение конструкций DEV по изобретению для вакцинации цыплят не связано с риском диссеминирования или заражения невакцинированных животных. Кроме того, у цыплят нет материнских антител или иммунитета против DEV, поэтому вирусы по изобретению можно использовать для вырабатывания очень раннего иммунитета у вакцинированных животных.

Итак, предметом изобретения является такой вирус утиного энтерита (DEV), который содержит неактивный ген UL4.

Другим предметом изобретения является такой вирус утиного энтерита (DEV), который содержит неактивный ген UL4 и содержит чужеродную нуклеиновую кислоту.

Следующим предметом изобретения является такой вирус утиного энтерита (DEV), который содержит по меньшей мере первый и второй неактивные гены, причем первым неактивным геном является ген UL4, а второй неактивный ген выбран из генов UL23 и US7.

DEV по изобретению может быть получен из любого вида или штамма DEV. Сообщалось о нескольких штаммах DEV, которые доступны из общественных коллекций, как то: штамм CSC (Genbank #JQ673560), штамм Jansen, штамм CHv (Genbank #JQ647509), штамм VAC (Genbank #EU082088) и штамм 2085 (Genbank #JF999965).

В предпочтительном воплощении DEV по изобретению получают или готовят из исходного штамма, выбранного из штамма Jansen или штамма CSC или любого штамма DEV, по меньшей мере на 90% идентичного по последовательности со штаммом Jansen или штаммом CSC, более предпочтительно по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или на 99%.

В изобретении показано, что при инактивации (то есть приведении его в нефункциональное состояние или удалении) гена UL4 можно получить аттенуированные вирусы DEV, которые безопасны даже при введении in ovo или молодым цыплятам и могут реплицироваться и экспрессировать белки у домашней птицы. Предполагается, что ген UL4 у DEV кодирует ядерный белок. Однако действительная функция гена UL4 у DEV остается неясной. Вплоть до настоящего изобретения не была известна возможность получения UL4-дефектных вирусов DEV, а способность UL4-дефектных вирусов DEV к репликации и экспрессии чужеродных генов без летальности у птиц была совершенно неизвестна.

Ген UL4 обычно состоит из 717 п.о. генома DEV. Обращаясь к штамму CSC, ген UL4 соответствует нт. 112845-113561 в геноме. Нуклеотидная последовательность гена UL4 у штамма DEV типа Jansen представлена в SEQ NO: 13. Подразумевается, что специалист в данной области сможет легко идентифицировать точное расположение гена UL4 у любого штамма DEV, используя информацию, содержащуюся в настоящей заявке, и общие познания, или же путем совмещения последовательности.

В контексте изобретения DEV, содержащий неактивный ген UL4, означает такой DEV, который не может экспрессировать функциональный белок UL4. Таким образом, неактивный ген UL4 означает мутированный, делетированный и/или прерванный ген UL4, который не может кодировать белок UL4 дикого типа.

Предпочтительными мутациями являются точечные мутации в кодирующей последовательности UL4, которые предотвращают экспрессию полноразмерного белка UL4. Такие мутации могут вводить в последовательность стоп-кодон или нонсенс-кодон или вызывать замену незаменимых аминокислотных остатков в кодируемом белке, что ведет к неактивному белку.

У определенных DEV по изобретению по меньшей мере 20% последовательности гена UL4 подвергается делеции, более предпочтительно по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или же 85%, вплоть до 100%. В предпочтительном примере DEV по изобретению имеет делецию по меньшей мере 400 п.о. из последовательности гена UL4, более предпочтительно по меньшей мере 500 п.о., по меньшей мере 600 п.о. или больше.

В конкретном воплощении DEV по изобретению имеет делецию, охватывающую по меньшей мере нт. 200-500 из последовательности гена UL4, более предпочтительно по меньшей мере нт. 100-600, еще более предпочтительно по меньшей мере нт. 80-650. В конкретном примере DEV по изобретению имеет делецию нт. 51-667 (т.е. около 85%) из последовательности гена UL4 (например, DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2).

Как показано в примерах, конструкции DEV с неактивным геном UL4 являются стабильными, могут реплицироваться в культуре и их можно безопасно вводить в яйца домашней птицы или молодым цыплятам. Следовательно, такие вирусы можно использовать для получения рекомбинантных DEV, содержащих чужеродный материал из нуклеиновой кислоты, в частности гены, кодирующие антигены, для экспрессии таких генов у домашней птицы.

Итак, в одном конкретном воплощении изобретение касается таких вирусов утиного энтерита (DEV), которые содержат неактивный ген UL4 и содержат чужеродную нуклеиновую кислоту.

В одном предпочтительном воплощении чужеродная нуклеиновая кислота располагается в последовательности гена UL4 в геноме вируса DEV, либо в дополнение к существующей последовательности гена UL4 (тем самым делая ген неактивным, прерывая последовательность гена), либо взамен делетированной последовательность гена UL4, либо в мутированной последовательности гена UL4.

В одном предпочтительном воплощении DEV по изобретению имеет делецию в последовательности гена UL4 и содержит чужеродную нуклеиновую кислоту, которая располагается на месте делетированных нуклеотидов.

В другом конкретном воплощении чужеродная нуклеиновая кислота располагается в клонирующем сайте вирусного генома DEV, отличном от последовательности гена UL4, либо в дополнение к существующей последовательности гена, либо взамен делетированной последовательности, либо в мутированной последовательности гена. Такой дополнительный сайт вставки может быть выбран из гена UL44, межгенного участка UL27-UL26, гена UL23, межгенного участка UL45-UL46, межгенного участка UL50-UL51, гена US4, гена US5, гена US7, межгенного участка US7-US8 или гена US10.

У вируса DEV по изобретению чужеродный ген обычно находится под контролем транскрипционного промотора. Предпочтительно промотор клонируют вместе с чужеродным геном. Промотором может быть любой природный или синтетический промотор, происходящий из клеточных или вирусных генов. Примеры подходящих промоторов включают, к примеру, промотор β-актина курицы (Bac) или его производные типа Coa5, промотор Pec, самый ранний (ie) промотор-1 мышиного цитомегаловируса (Mcmv), промотор цитомегаловируса человека (Hcmv), промотор обезьяньего вируса (SV) 40 и промотор вируса саркомы Рауса (RSV) или же любые их фрагменты, сохраняющие активность промотора.

Кроме того, DEV по изобретению может содержать несколько чужеродных нуклеиновых кислот. При этом несколько чужеродных нуклеиновых кислот могут быть вставлены в область UL4, как описано выше, под контролем одного или нескольких отдельных промоторов. С другой стороны, DEV может содержать чужеродную нуклеиновую кислоту, вставленную в UL4, и одну или несколько чужеродных нуклеиновых кислот, вставленных в один или несколько различных сайтов вставки. Такие дополнительные сайты вставки могут быть выбраны из гена UL44, межгенного участка UL27-UL26, гена UL23, межгенного участка UL45-UL46, межгенного участка UL50-UL51, гена US4, гена US5, гена US7, межгенного участка US7-US8 или гена US10.

В этой связи, в одном конкретном воплощении, изобретение касается таких вирусов утиного энтерита (DEV), которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген UL44. В частности, изобретение касается таких вирусов DEV, которые содержат первую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL44 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. Ген UL44 обычно состоит из 1296 п.о. генома DEV. Обращаясь к штамму CSC, ген UL44 соответствует нт. 27419-28714 в геноме. Подразумевается, что специалисты в данной области смогут легко установить точное расположение гена UL44 у любого штамма DEV, используя информацию, содержащуюся в настоящей заявке, и общие познания, или же путем совмещения последовательности. У определенных DEV по изобретению по меньшей мере 20% последовательности гена UL44 подвергается делеции, более предпочтительно по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и вплоть до 100%. В предпочтительном примере DEV по изобретению имеет делецию по меньшей мере 500 п.о. из последовательности гена UL44, более предпочтительно по меньшей мере 600, 700, 800, 900, 1000 или больше. В одном конкретном воплощении DEV по изобретению имеет делецию, охватывающую по меньшей мере нт. 200-1000 в последовательности гена UL44, более предпочтительно по меньшей мере нт. 100-1100, еще более предпочтительно по меньшей мере нт. 100-1200. В конкретном примере DEV по изобретению имеет делецию нт. 51-1246 (то есть более 90%) из последовательности гена UL44.

В другом конкретном воплощении изобретение касается таких вирусов утиного энтерита (DEV), которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген UL23. Примеры таких рекомбинантных DEV по изобретению включают JK015, JK022, JK023, JK024 и JK025. В изобретении показано, что инактивация этих двух генов дает такие DEVs, которые сильно аттенуированы, с выживаемостью 95% при введении in ovo. Полученные результаты также показывают, что такие аттенуированные вирусы могут эффективно реплицироваться in vitro и могут экспрессировать последовательности чужеродных генов. В частности, изобретение касается таких вирусов DEV, которые содержат первую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL23 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат неактивный ген UL4 и при этом содержат чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL23 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген US7 и при этом содержат чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL23 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген UL23 и при этом содержат чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в межгенный участок UL26-UL27 или в межгенный участок UL45-UL46 или в межгенный участок UL50-UL51. У DEV ген UL23 кодирует тимидинкиназу, которая, как полагают, участвует в катализе синтеза нуклеотидов. Вплоть до настоящего изобретения не была известна возможность получения UL23-дефектных вирусов DEV. Ген UL23 обычно состоит из 1077 п.о. генома DEV. Обращаясь к штамму CSC, ген UL23 соответствует нт. 77997-79073 в геноме. Подразумевается, что специалисты в данной области смогут легко установить точное расположение гена UL23 у любого штамма DEV, используя информацию, содержащуюся в настоящей заявке, и общие познания, или же путем совмещения последовательности. У определенных DEV по изобретению по меньшей мере 20% последовательности гена UL23 подвергается делеции, более предпочтительно по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и вплоть до 100%. В предпочтительном примере DEV по изобретению имеет делецию по меньшей мере 500 п.о. из последовательности гена UL23, более предпочтительно по меньшей мере 600, 700, 800, 900, 1000 или больше. В одном конкретном воплощении DEV по изобретению имеет делецию, охватывающую по меньшей мере нт. 200-900 в последовательности гена UL23, более предпочтительно по меньшей мере нт. 100-1000, еще более предпочтительно по меньшей мере нт. 80-1000. В конкретном примере DEV по изобретению имеет делецию нт. 51-1027 (то есть более 90%) из последовательности гена UL23.

В следующем конкретном воплощении изобретение касается таких вирусов утиного энтерита (DEV), которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген US4. В частности, изобретение касается таких вирусов DEV, которые содержат первую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген US4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. У DEV ген US4 кодирует гликопротеин D, который, как полагают, расположен на вирусной оболочке и плазматической мембране инфицированных клеток. Вплоть до настоящего изобретения не была известна возможность получения US4-дефектных вирусов DEV. Ген US4 обычно состоит из 1380 п.о. генома DEV. Обращаясь к штамму CSC, ген US4 соответствует нт. 141123-142502 в геноме. Подразумевается, что специалисты в данной области смогут легко установить точное расположение гена US4 у любого штамма DEV, используя информацию, содержащуюся в настоящей заявке, и общие познания, или же путем совмещения последовательности. У определенных DEV по изобретению по меньшей мере 20% последовательности гена US4 подвергается делеции, более предпочтительно по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и вплоть до 100%. В предпочтительном примере DEV по изобретению имеет делецию по меньшей мере 500 п.о. из последовательности гена US4, более предпочтительно по меньшей мере 600, 700, 800, 900, 1000 или больше. В одном конкретном воплощении DEV по изобретению имеет делецию, охватывающую по меньшей мере нт. 200-1000 в последовательности гена US4, более предпочтительно по меньшей мере нт. 150-1150, еще более предпочтительно по меньшей мере нт. 100-1300. В конкретном примере DEV по изобретению имеет делецию нт. 51-1330 (то есть более 90%) из последовательности гена US4.

В этой связи, в одном конкретном воплощении, изобретение касается таких вирусов утиного энтерита (DEV), которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген US5. В частности, изобретение касается таких вирусов DEV, которые содержат первую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген US5 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. У DEV ген US5 кодирует гликопротеин J, функция которого остается неизвестной. Вплоть до настоящего изобретения не была известна возможность получения US5-дефектных вирусов DEV. Ген US5 обычно состоит из 1620 п.о. генома DEV. У определенных штаммов DEV типа штамма 2085 и штамма Jansen ген US5 короче (около 1197 п.о.) в результате мутаций в гене. Обращаясь к штамму CSC, ген US5 соответствует нт. 142662-144281 в геноме. Подразумевается, что специалисты в данной области смогут легко установить точное расположение гена US5 у любого штамма DEV, используя информацию, содержащуюся в настоящей заявке, и общие познания, или же путем совмещения последовательности. У определенных DEV по изобретению по меньшей мере 20% последовательности гена US5 подвергается делеции, более предпочтительно по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и вплоть до 100%. В предпочтительном примере DEV по изобретению имеет делецию по меньшей мере 500 п.о. из последовательности гена US5, более предпочтительно по меньшей мере 600, 700, 800, 900, 1000 или больше. В одном конкретном воплощении DEV по изобретению имеет делецию, охватывающую по меньшей мере нт. 200-1000 в последовательности гена US5, более предпочтительно по меньшей мере нт. 100-1100, еще более предпочтительно по меньшей мере нт. 80-1120. В конкретном примере DEV по изобретению, полученный из штамма Jansen, имеет делецию нт. 51-1147 (то есть более 90%) из последовательности гена US5, а DEV, полученный из штамма CSC, имеет делецию нт. 51-1570 из последовательности гена US5.

В другом конкретном воплощении изобретение касается таких вирусов утиного энтерита (DEV), которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген US7. Примеры таких рекомбинантных DEV по изобретению включают JK016, JK025, JK026, JK027 и JK028. В изобретении показано, что инактивация этих двух генов дает такие DEVs, которые сильно аттенуированы, давая смертность в 0% при введении in ovo. Полученные результаты также показывают, что такие аттенуированные вирусы могут эффективно реплицироваться in vitro и могут экспрессировать последовательности чужеродных генов. В частности, изобретение касается таких вирусов DEV, которые содержат первую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген US7 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат неактивный ген UL4 и при этом содержат чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген US7 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген US7 и при этом содержат чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL23 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген US7 и при этом содержат чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в межгенный участок UL26-UL27 или в межгенный участок UL45-UL46 или в межгенный участок UL50-UL51. У DEV ген US7 кодирует гликопротеин I, который, как полагают, участвует в распространении вируса из клетки в клетку. Вплоть до настоящего изобретения не была известна возможность получения US7-дефектных вирусов DEV. Ген US7 обычно состоит из 1116 п.о. генома DEV. Обращаясь к штамму CSC, ген US7 соответствует нт. 145769-146884 в геноме. Подразумевается, что специалисты в данной области смогут легко установить точное расположение гена US7 у любого штамма DEV, используя информацию, содержащуюся в настоящей заявке, и общие познания, или же путем совмещения последовательности. У определенных DEV по изобретению по меньшей мере 20% последовательности гена US7 подвергается делеции, более предпочтительно по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и вплоть до 100%. В предпочтительном примере DEV по изобретению имеет делецию по меньшей мере 500 п.о. из последовательности гена US7, более предпочтительно по меньшей мере 600, 700, 800, 900, 1000 или больше. В одном конкретном воплощении DEV по изобретению имеет делецию, охватывающую по меньшей мере нт. 200-900 в последовательности гена US7, более предпочтительно по меньшей мере нт. 100-1000, еще более предпочтительно по меньшей мере нт. 80-1120. В конкретном примере DEV по изобретению имеет делецию нт. 51-1066 (то есть более 90%) из последовательности гена US7.

В этой связи, в одном конкретном воплощении, изобретение касается таких вирусов утиного энтерита (DEV), которые содержат неактивный ген UL4 и неактивный ген US10. В частности, изобретение касается таких вирусов DEV, которые содержат первую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген US10 с заменой по меньшей мере 20% данного гена. У DEV ген US10 предположительно кодирует белок вириона, функция которого остается неизвестной. Вплоть до настоящего изобретения не была известна возможность получения US10-дефектных вирусов DEV. Ген US10 обычно состоит из 900-970 п.о. генома DEV, в зависимости от штамма. Обращаясь к штамму CSC, ген US10 соответствует нт. 136391-137320 в геноме. Подразумевается, что специалисты в данной области смогут легко установить точное расположение гена US10 у любого штамма DEV, используя информацию, содержащуюся в настоящей заявке, и общие познания, или же путем совмещения последовательности. У определенных DEV по изобретению по меньшей мере 20% последовательности гена US10 подвергается делеции, более предпочтительно по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% и вплоть до 100%. В предпочтительном примере DEV по изобретению имеет делецию по меньшей мере 500 п.о. из последовательности гена US10, более предпочтительно по меньшей мере 600, 700, 800 или больше. В одном конкретном воплощении DEV по изобретению имеет делецию, охватывающую по меньшей мере нт. 200-7000 в последовательности гена US10, более предпочтительно по меньшей мере нт. 100-800, еще более предпочтительно по меньшей мере нт. 80-850. В конкретном примере DEV по изобретению, полученный из штамма CSC, имеет делецию нт. 51-880 (то есть более 80%) из последовательности гена US10, а DEV, полученный из штамма VAC, имеет делецию нт. 51-847 из последовательности гена US10.

Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат первую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в межгенный участок, расположенный между генами UL27 и UL26. Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат неактивный ген UL4 и при этом содержат чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в межгенный участок, расположенный между генами UL27 и UL26. Обращаясь к штамму CSC, межгенный участок, расположенный между UL27 и UL26, соответствует нт. 72195-72646 в геноме. Клонирование может проводиться в любом положении в пределах такого участка, более предпочтительно между нт. 72300 и 72500, еще более предпочтительно между нт. 72350 и 72450. В конкретном воплощении клонирование проводится между нт. 72431 и 72432.

Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат первую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в ген UL4 с заменой по меньшей мере 20% данного гена, и вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в межгенный участок, расположенный между генами US7 и US8. Такой межгенный сайт клонирования описан в WO 024/0036735.

Изобретение также касается таких вирусов DEV, которые содержат неактивный ген UL4 и при этом содержат чужеродную нуклеиновую кислоту, клонированную в межгенный участок, расположенный между генами UL45 и UL46 или между генами UL50 и UL51. Обращаясь к штамму CSC, межгенный участок, расположенный между UL45 и UL46, соответствует нт. 25132-25352 в геноме. Клонирование может проводиться в любом положении в пределах такого участка, более предпочтительно между нт. 25200 и 25300. В конкретном воплощении клонирование проводится между нт. 25275 и 25276. Обращаясь к штамму CSC, межгенный участок, расположенный между UL50 и UL51, соответствует нт. 15914-16063 в геноме. Клонирование может проводиться в любом положении в пределах такого участка, более предпочтительно между нт. 15970 и 16010. В конкретном воплощении клонирование проводится между нт. 15979 и 15980.

Конструирование и клонирование вирусов может осуществляться методами, известными per se в данной области. Клонирование генов и конструирование плазмид хорошо известно рядовым специалистам в данной области и может в основном проводиться стандартными методами молекулярной биологии (Molecular Cloning: The Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012). Как правило, рекомбинантные вирусы могут быть получены при гомологической рекомбинации между вирусным геномом и конструкцией (например, гомологичной плазмидой), содержащей вставляемую нуклеиновую кислоту, фланкированную нуклеотидами из сайта вставки, обеспечивающими рекомбинацию. Клонирование может осуществляться с удалением эндогенных последовательностей или без него. В конкретном воплощении рекомбинантная последовательность клонируется с заменой по крайней мере части последовательности генома типа по меньшей мере 50 нуклеотидов или больше. Такое удаление повышает клонирующую способность вируса.

При конструировании последовательность, содержащая целевой участок вставки, обычно сначала клонируют в подходящий вектор с получением гомологичного вектора. Примеры векторов включают плазмиды типа pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8 или pUC9; фаги типа фага лямбда и фага М13; или космиды типа pHC79. Последовательность целевого участка встраивают в вектор стандартными методами клонирования. Используемая последовательность целевого участка предпочтительно имеет достаточную длину для последующей гомологической рекомбинации in vivo с вирусным геномом DEV. Предпочтительно последовательность клонируемого целевого участка должна иметь длину по меньшей мере около 100 нуклеотидов, обычно более 300, как то: от 500 до 2000 нуклеотидов. Затем в целевой участок, клонированный в вектор, вставляют чужеродную нуклеиновую кислоту (которая обычно содержит ген и промотор). Вставка предпочтительно должна проводиться таким образом, чтобы на каждой стороне клонированной вставки оставалась часть последовательности целевого участка с длиной, достаточной для гомологической рекомбинации (например, по меньшей мере 50 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере в 100 нуклеотидов). Чужеродную нуклеиновую кислоту можно вводить в клонированный целевой участок с помощью классических методов типа рестрикционных ферментов и процедур лигирования. При необходимости в определенный сайт целевого участка можно вводить мутации для создания нового сайта расщепления для рестрикционного фермента. Для этой цели можно использовать стандартные методы мутагенеза, хорошо известные специалистам в данной области, такие, к примеру, как мутагенез in vitro или ПЦР. Затем гомологические векторы, у которых в целевой участок была вставлена чужеродная нуклеиновая кислота, вводят в клетки, инфицированные DEV, или в клетки, трансфицированные геномом DEV, используя известные методы типа электропорации, методы на основе фосфата кальция, липофектина и т.п. При этом образуются рекомбинантные вирусы при рекомбинации между вирусом и вектором в данных клетках. Полученные рекомбинантные вирусы подвергаются отбору по генотипу или фенотипу с помощью известных методов, например, гибридизации, секвенирования, ПЦР или функционального анализа для выявления каких-либо продуктов, кодируемых чужеродной нуклеиновой кислотой, как описано в примерах. Отобранный рекомбинантный вирус можно культивировать в большом масштабе в культуре клеток, после чего можно собирать рекомбинантные вирусы.

Чужеродный ген

DEV по изобретению может содержать любую чужеродную нуклеиновую кислоту, предпочтительно какой-либо чужеродный ген. Чужеродный ген может кодировать любой представляющий интерес продукт типа РНК или биологически активных и/или иммуногенных (например, антигенных) белков, полипептидов или пептидов. В предпочтительном воплощении чужеродный ген кодирует антиген, еще более предпочтительно пептид или полипептид, происходящий из антигена патогенного организма, способного вызывать инфекции у животных, в особенности птиц. Примеры патогенов, вызывающих инфекции у птиц, включают вирусы, бактерии, грибки, простейшие и т.д. Иммуногенным (поли) пептидом предпочтительно является (получен из) поверхностный белок, секретируемый белок или структурный белок данного патогена или его фрагменты. Полипептид может быть происходить из любого источника, например, вирусного, прокариотического, эукариотического или синтетического.

В предпочтительном воплощении чужеродный ген кодирует антигенный пептид патогенного агента птиц.

Конкретные примеры патогенных агентов включают, без ограничения, вирус птичьего гриппа, птичий парамиксовирус типа 1, также называемый вирусом болезни Ньюкасл (NDV), птичий метапневмовирус, вирус болезни Марека, вирус болезни Гумборо, также называемый вирусом инфекционного бурсита (IBDV), вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV), вирус инфекционного бронхита (IBV), Escherichia coli, Salmonella sp., Pasteurella multocida, Riemerella anatipestifer, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, микоплазменные микроорганизмы, инфицирующие птиц, или кокцидии.

Предпочтительно чужеродный ген кодирует антиген из числа белка F NDV, белка HN NDV, белка VP2 IBDV, белка gB ILTV, белка 40K Mycoplasma gallisepticum или поверхностного белка гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа либо их иммуногенных фрагментов. В контексте изобретения термин “фрагмент” белка означает фрагмент, предпочтительно содержащий по меньшей мере 5 последовательных аминокислотных остатков данного белка, еще более предпочтительно от 5 до 100. В предпочтительном воплощении такой фрагмент содержит по меньшей мере один эпитоп и/или является иммуногенным in vivo, то есть может вызывать образование антител, связывающих полноразмерный белок.

Конкретные примеры иммуногенных пептидов включают, к примеру, пептиды, содержащие аминокислотные остатки 1-453 VP2, 1-469 gB или 1-540 F.

Предпочтительные вирусы DEV

Предпочтительный DEV по изобретению включает делецию всего гена UL4.

Один предпочтительный DEV по изобретению включает делецию по меньшей мере нт. 100-600 из последовательности гена UL4, как то: делецию нт. 51-667 гена UL4 DEV.

Другой предпочтительный DEV по изобретению включает неактивный ген UL4 и неактивный ген UL23.

Другой предпочтительный DEV по изобретению включает неактивный ген UL4 и неактивный ген US7.

У предпочтительных DEV по изобретению чужеродная нуклеиновая кислота кодирует птичий антиген, более предпочтительно белок VP2, HN или F либо его иммуногенный фрагмент.

Другие предпочтительные DEV по изобретению включают делецию по меньшей мере нт. 100-600 из последовательности гена UL4 и по меньшей мере еще одну делецию, выбранную из:

- делеции по меньшей мере нт. 100-1200 из последовательности гена UL44;

- делеции по меньшей мере нт. 100-1000 из последовательности гена UL23;

- делеции по меньшей мере нт. 100-1300 из последовательности гена US4;

- делеции по меньшей мере нт. 100-1100 из последовательности гена US5;

- делеции по меньшей мере нт. 100-1000 из последовательности гена US7 и/или

- делеции по меньшей мере нт. 100-800 из последовательности гена US10 либо их комбинаций.

Нуклеиновые кислоты

Изобретение также касается молекул нуклеиновой кислоты, содержащих геном DEV с неактивным геном UL4. Такие нуклеиновые кислоты могут быть одно- или двухцепочечными, ДНК либо РНК. В одном конкретном воплощении нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК, содержащую геном DEV, как определено выше.

Нуклеиновая кислота может находиться в свободной форме или в виде вектора типа плазмиды, ВАС и др. Нуклеиновая кислота может быть выделенной или содержаться в клетках хозяина.

Культуры клеток

Рекомбинантные вирусы настоящего изобретения можно размножать в любых культурах компетентных клеток. По достижении требуемого роста вирусов можно отделить клетки от стенок с помощью скребка или трипсина и выделить инфицированные клетки из супернатанта центрифугированием.

Примеры компетентных клеток включают CEF, содержащие эмбрионы яйца, клетки почек курицы и т.п. Клетки или вирусы можно культивировать в культуральной среде типа среды MEM Игля, смеси Leibowitz-L-15/McCoy 5A (1:1) при 37°C от 3 до 6 дней. Как правило, инфицированные клетки суспендируют в культуральной среде, содержащей 10% диметилсульфоксида (DMSO), и хранят в замороженном виде в жидком азоте.

Композиции и вакцины

Изобретение также касается композиций типа вакцины, которые содержат один или несколько DEV по изобретению.

Композиции и вакцины по изобретению могут содержать вирусы DEV в фармацевтически или ветеринарно-приемлемом носителе или эксципиенте. Кроме того, композиции и вакцины могут содержать подходящий адъювант.

Композиции и вакцины по настоящему изобретению могут содержать подходящий растворитель, такой, к примеру, как водный буфер или фосфатный буфер. Предпочтительно композиции и вакцины также содержат добавки, как то: стабилизирующие вещества, консерванты, красители, поверхностно-активные вещества и др.

Например, композиции или вакцины настоящего изобретения могут быть составлены с одной или несколькими дополнительными добавками для поддержания изотоничности, физиологического рН и стабильности, к примеру, с буфером типа физиологического раствора (0,85%), физраствора с фосфатным буфером (PBS), цитратного буфера, трис (гидроксиметил)аминометанового (TRIS) буфера, физраствора с трис-буфером и т.п., или же с антибиотиком, к примеру, неомицином или стрептомицином, и пр.

В одном конкретном воплощении композиция по изобретению содержит консервант.

В другом конкретном воплощении композиция по изобретению содержит солюбилизирующее вещество.

В другом конкретном воплощении композиция по изобретению содержит адъювант. Адъюванты могут быть получены из целого ряда источников, включая различные белки и пептиды из различных животных (например, гормоны, цитокины, костимулирующие факторы) и новые нуклеиновые кислоты из различных вирусов и других источников (например, двухцепочечная РНК, CpG) и пр., которые по отдельности или в комбинации достаточны для усиления иммунного ответа.

Композиции по изобретению могут быть жидкими (растворы, суспензии, эмульсии) или твердыми (порошки, гели, пасты, масла), и они могут быть составлены для любого способа введения. Предпочтительно их составляют для инъекций типа инъекций in ovo или же, например, для внутривенного, подкожного, внутримышечного, внутриглазничного, внутриглазного, внутрикожного и/или внутрибрюшинного введения. С другой стороны, они могут быть составлены для перорального, глазного (например, в виде глазных капель), интраназального или глазоносового введения, например, с помощью аэрозоля или распылителя.

Каждая доза вакцины может содержать подходящую дозу, достаточную для получения защитного иммунного ответа у птиц. Оптимизация таких доз хорошо известна в данной области. Количество антигена на 1 дозу может быть установлено известными способами с использованием реакций антиген/антитело, к примеру, методом ELISA.

Вакцины по изобретению можно вводить в виде однократных доз или многократных доз в зависимости от методики вакцинации.

В одном конкретном воплощении изобретение касается вакцин, содержащих вирус, нуклеиновую кислоту или клетки, как определено выше, и подходящий эксципиент или адъювант.

В другом конкретном воплощении изобретение касается вакцин, включающих жидкие композиции вируса, нуклеиновой кислоты или клеток, как определено выше, и подходящий эксципиент или адъювант.

Настоящее изобретение также касается применения вирусов, композиций, вакцин, нуклеиновых кислот или клеток, как описано выше, для иммунизации птиц типа домашней птицы, и способа иммунизации птиц путем введения иммунологически эффективного количества вируса, композиции, вакцины, нуклеиновой кислоты или клеток, как описано выше.

Следующим предметом изобретения является композиция, DEV, нуклеиновая кислота или клетки хозяина, как определено выше, для применения при вакцинации или иммунизации птиц, в особенности домашней птицы, более предпочтительно кур, более предпочтительно молодых цыплят (на 3-й день после вылупления или раньше) либо in ovo).

Следующим предметом изобретения является композиция, DEV, нуклеиновая кислота или клетки хозяина, как определено выше, для применения при вакцинации или иммунизации птиц, в особенности домашней птицы, более предпочтительно кур, более предпочтительно молодых цыплят (на 3-й день после вылупления или раньше) либо in ovo).

Следующим предметом изобретения является композиция, DEV, нуклеиновая кислота или клетки хозяина, как определено выше, для применения при вырабатывании защитного иммунитета у птиц, в особенности домашней птицы, более предпочтительно кур, более предпочтительно молодых цыплят (на 3-й день после вылупления или раньше) либо in ovo.

Изобретение также касается способа вакцинации нечеловеческих животных, в особенности домашней птицы, более предпочтительно кур, более предпочтительно молодых цыплят (на 3-й день после вылупления или раньше либо in ovo), который включает введение данным животным композиции, вакцины, нуклеиновой кислоты или клеток хозяина, как определено выше.

Одним конкретным предметом изобретения является способ вакцинации домашней птицы, включающий введение in ovo композиции, вакцины, DEV, нуклеиновой кислоты или клеток хозяина, как определено выше.

Другим конкретным предметом изобретения является способ вакцинации домашней птицы, включающий введение композиции, вакцины, DEV, нуклеиновой кислоты или клеток хозяина, как определено выше, в 1-й день или 2-й день после вылупления.

В следующем аспекте изобретения предусмотрен способ вырабатывания иммуногенной или защитной реакции у нечеловеческих животных против одного или нескольких патогенов птиц, включающий введение данным животным, в особенности домашним птицам, более предпочтительно курам, более предпочтительно молодым цыплятам (на 3-й день после вылупления или раньше) либо in ovo композиции, вакцины, DEV, нуклеиновой кислоты или клеток хозяина, как определено выше.

Как указано в экспериментальном разделе, вирусы по изобретению особенно выгодны для вакцинации молодой птицы (в 1-й, 2-й или 3-й день после вылупления) или для вакцинации in ovo. Так, в изобретении вне ожидания показано, что вирусы по изобретению безопасны при таком раннем введении, тогда как нативный или DEV дикого типа летальны. Такое раннее введение, в сочетании с ранним возникновением иммунитета, вызванного этими вирусами, особенно выгодно для выработки раннего защитного иммунитета еще до того, как птица может существенно подвергнуться воздействию патогенов.

В этой связи, в более общем аспекте изобретение также касается способа вакцинации или иммунизации птиц, в особенности домашней птицы, более предпочтительно кур, который включает введение in ovo данным птицам аттенуированного DEV, кодирующего антиген. Изобретение также касается способа экспрессии чужеродных генов у птиц, в особенности у домашней птицы, более предпочтительно кур, который включает введение in ovo данным птицам аттенуированного DEV, содержащего чужеродный ген. Изобретение также касается применения аттенуированных DEV, содержащих чужеродные гены, для экспрессии данного гена у птиц при введении таких DEV in ovo. Изобретение также касается аттенуированных DEV, кодирующих антигены, для применения при вырабатывании иммунного ответа или при вакцинации птиц путем введения таких DEV in ovo. Предпочтительно DEV содержит неактивный эндогенный ген, что делает такой DEV аттенуированным и хорошо переносится при инъекции in ovo.

Настоящее изобретение также касается вакцинационных наборов для иммунизации птиц, которые включают эффективное количество поливалентной вакцины, как описано выше, и средство для введения указанных компонентов данным птицам. Например, такой набор включает инъекционное устройство, заполненное вакциной по изобретению, и инструкции для внутрикожного, подкожного, внутримышечного введения или инъекции in ovo. Альтернативно, набор содержит устройство для распыления/аэрозоля, заполненное вакциной по изобретению, или глазные капли с вакциной по изобретению, и инструкции для глазоносового введения, перорального или мукозального введения.

Другие аспекты и преимущества изобретения будут изложены в следующем экспериментальном разделе, который иллюстрирует заявленное изобретение.

Примеры

Пример 1. Вирулентность DEV дикого типа для яиц или молодых цыплят

Проводили клиническое исследование для изучения патогенности или вирулентности DEV для кур при введении в разное время. В частности, проводили введение in ovo (за 3 дня до вылупления), в 1-й день после вылупления или в день 4 после вылупления. Использовали DEV дикого типа штамма Jansen. Вводимая доза составляла 100 или 1000 б.о.е. (pfu) на 1 дозу. В качестве контроля в группе 1 вводили раствор PBS. Патогенность оценивали по измерению смертности каждый день после вылупления.

Результаты представлены в следующей таблице.

¹ Возраст в день инокуляции

² Количество птиц, умерших с 9-го по 19-й день

Вышеприведенные результаты показывают, что введение DEV дикого типа на 4-й день после вылупления было безопасным при выживаемости в 100% (см. группу 5). Напротив, после введения DEV in ovo 100% птиц умерли на 4-й день, тогда как введение PBS in ovo было безопасным. Таким образом, эти результаты показывают, что хотя DEV дикого типа может подходить для введения взрослым животным, но неожиданно он оказался летальным для молодых животных (на 3-й день или меньше после вылупления) или же при введении in ovo.

Пример 2. Конструирование DEV, содержащего неактивный ген UL4

2.1. Конструирование кассеты rpsLneo-DsRed2

Фрагмент ДНК в 2,8 т.о. для кассеты rpsLneo-DsRed2 конструировали с помощью реакций ПЦР. Вкратце, проводили три реакции ПЦР. Первую реакцию ПЦР проводили с помощью пары праймеров SEQ ID NO:1 (5′-GGCCTGGTGATGATGGCGGATCGTTGTAT-3′) и SEQ ID NO:2 (5′-CCATGGTGCTGCGCTCAGAAGAACTCTCTCTC-3′) с матрицей из синтезированного фрагмента rpsLneo (SEQ ID NO:3). Вторую реакцию ПЦР проводили с помощью пары праймеров SEQ ID NO:4 (5′-ACGAGTTCTTCTGAGCGCAGCACCATGGC′) и SEQ ID NO: 5 (5′-TCGGAGGAGGCCCCCCTATAAGAGCTGTAAT-3′) с матрицей в виде плазмиды pSI из экспрессирующих векторов млекопитающих (Promega, кат. № E1721). Третью реакцию ПЦР проводили с помощью пары праймеров SEQ ID NO: 6 (5′-TACAGCTCTTAAGGATGGCCTCCTCCGAGA-3′) и SEQ ID NO: 7 (5′-GCAGTGAAAAA′) с матрицей в виде плазмиды pIRES2-DsRed2 (Clontech, кат. № 632420). Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из первой и второй реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO: 5 в качестве праймеров. Этот продукт ПЦР и ПЦР-продукт из третьей реакции ПЦР смешивали и использовали для заключительной реакции ПЦР с парой праймеров SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:7, получая кассету rpsLneo-DsRed2.

2.2. Конструирование вставочной кассеты

Фрагмент ДНК кассеты rpsLneo-DsRed2, к обоим концам которой были добавлены гомологические последовательности из 5′- и 3′-концов области UL4 вируса утиного энтерита (DEV) (по 50 п.о.), конструировали с помощью реакции ПЦР (фиг. 1). Реакцию ПЦР проводили, используя в качестве матрицы кассету rpsLneo-DsRed2. Использовали пару праймеров SEQ ID NO: 8 (5′-ATGCAATCGCATCCGGCAACGTTTATAACTTACACTCTGGGGGTACCGGGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3′) и SEQ ID NO: 9 (5′-TTAAATGTCTATACCGTTCACTGCAATTGGCTCCTGAGACGTTCCATTGCGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3′). Полученный ПЦР-фрагмент подвергали электрофорезу и очищали.

2.3. Конструирование рекомбинантного DEV, несущего ген rpsLneo-DsRed2

Конструирование рекомбинантного DEV, несущего ген rpsLneo-DsRed2 в области UL4, проводили путем гомологической рекомбинации в E. coli. Штамм, несущий геном DEV, трансфицировали с помощью 0,1 мкг вставочной кассеты. Трансфекцию проводили методом электропорации на приборе Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories) при 1,75 кВ, 25 мкФ и 200 Ом. После трансфекции E. coli высеивали на чашки с агаром Luria-Bertani (LB) и инкубировали в течение ночи при 30°C. Клоны E. coli, несущие соответствующую вставку, содержащую ген rpsLneo-DsRed2, идентифицировали методом ПЦР с помощью пары праймеров, амплифицирующей область между геном rpsLneo-DsRed2 и участком сайта вставки в геноме DEV (Junction 1, фиг. 2). Использовали праймеры SEQ ID NO: 10 (5′-TGTTTAGCGTTATCCGCCCACTGTGTAAAC-3′) и SEQ ID NO: 11 (5′-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3′). Из клонов E. coli с соответствующей вставкой экстрагировали модифицированную ДНК DEV и трансфицировали её в клетки CEF при помощи Nucleofector II (Lonza, Basel, Switzerland). Трансфицированные клетки вносили в смесь из среды Leibovitz L-15 (Life Technologies Corp., кат. № 41300-39) и среды McCoy 5A (Life Technologies Corp., кат. № 21500-061) (1:1) с 4% телячьей сыворотки [среда LM (+)], высеивали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей, а затем инкубировали при 37°C в 4-5% CO₂ в течение 5-7 дней до тех пор, пока не проявлялся цитопатический эффект (CPE).

2.4. Проверка структуры генома

Структуру генома у рекомбинантного DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 проверяли по трем реакциям ПЦР, амплифицирующим стыковочные участки (Junction 1, Junction 2 и Junction 3; фиг. 2) на каждом конце вставленного гена. Пары праймеров, используемые в реакциях ПЦР для Junction 1, описаны в примере 2.3. В реакциях ПЦР для Junction 2 использовали пару праймеров SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 12 (5′-GGGAGTATTCACAAAATAATAAACAAAC-3′). Для Junction 3 использовали SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 12. Наблюдались ожидаемые размеры продуктов ПЦР, подтверждающие, что rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 имеет ожидаемую структуру генома.

Пример 3. Экспрессия чужеродного гена рекомбинантным DEV с неактивным геном UL4

Экспрессию белка DsRed2 рекомбинантным DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 проверяли по флуоресценции DsRed2. Возбуждение флуоресценции DsRed2 проводили на клетках CEF, инфицированных рекомбинантным DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2. Вкратце, клетки CEF в 6-луночном планшете инфицировали rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 или исходным штаммом DEV при множественности заражения примерно 0,01. Через три дня после инокуляции клетки возбуждали при 563 нм. Красная флуоресценция наблюдалась только в бляшках рекомбинантного DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2.

Пример 4. Жизнеспособность и стабильность рекомбинантного DEV с неактивным геном UL4

Рекомбинантный DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 пассировали в клетках CEF по 15 раз и проверяли стабильность вставленного гена rpsLneo-DsRed2. Пассирование проводили через каждые 3-4 дня. После каждых 5 пассажей бляшки rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 проверяли на красную флуоресценцию под флуоресцентным микроскопом, а структуру генома rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 проверяли методом ПЦР, амплифицируя стыковочные участки (Junction 1, Junction 2 и Junction 3; фиг. 2) с помощью праймеров, приведенных в Примере 2.4. Красная флуоресценция и ожидаемые размеры продуктов ПЦР наблюдались у всех проверяемых вирусов, подтверждая, что rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 сохраняет ген rpsLneo-DsRed2 по меньшей мере при 15 пересевах.

Пример 5. Введение in ovo

Рекомбинантный DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2 или исходный DEV инокулировали в 18-дневные эмбрионы лишенных определенных патогенов (SPF) цыплят или цыплят коммерческих кур-несушек (белый леггорн) с материнскими антителами. Все группы эмбрионов вакцинировали in ovo примерно при 1000 pfu на 0,1 мл рекомбинантного DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2, исходного DEV или PBS через иглу 20 размера на 1,5 дюйма. У вылупившихся цыплят каждую неделю брали кровь в возрасте от 1 до 3 недель. Цыплят ежедневно проверяли на клинические признаки, связанные с DEV, такие как депрессия и смерть. Через 3 недели после вылупления цыплят обследовали на предмет увеличения веса, проводили вскрытие и проверяли на макроскопические поражения.

¹ Количество птиц, умерших с 6-го по 8-й день

² Количество птиц, умерших с 10-го по 11-й день

Результаты представлены выше. В то время, как почти все птицы, зараженные исходным DEV, умерли, выжило более 60% птиц, зараженных DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2.

Пример 6. Конструирование и введение in ovo DEV, содержащего неактивный ген UL4 и последовательность чужеродного гена, вставленную между UL27 и UL26

Конструировали DEV, содержащий неактивный ген UL4 и последовательность чужеродного гена, вставленную между UL27 и UL26.

6.1. Конструирование pUC18-KAPEVAC-UL4del

Фрагмент ДНК в 1,0 т.о. из генома DEV, фланкирующий гены UL5 и UL3.5, клонировали с помощью реакций ПЦР, добавляя сайт распознавания SfiI на сайт вставки (фиг. 3). Вкратце, используя в качестве матрицы ДНК, экстрагированную из DEV, проводили две реакции ПЦР. Использовали пары праймеров: SEQ ID NO: 14 (5′-GCGCATGCACTATAGCGCGCTCACAG-3′) и SEQ ID NO: 15 (5′-CAGACCTAAAGGTTAGGCCGTCTGTGAATG-3′), SEQ ID NO: 16 (5′-CATTCACAGACGGCCTAACCTTTAGGTCTG-3′) и SEQ ID NO: 17 (5′-GCGAATTCCGCAAACTACACAAGTCCG-3′). Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 17 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 после расщепления с помощью SphI и EcoRI, получая pUC18-KAPEVAC-UL4del (фиг. 3).

6.2. Конструирование pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2

Фрагмент ДНК в 1,0 т.о. из генома DEV, фланкирующий гены UL26 и UL27, клонировали с помощью реакций ПЦР, добавляя сайт распознавания SfiI на сайт вставки (фиг. 4). Вкратце, используя в качестве матрицы ДНК, экстрагированную из DEV, проводили две реакции ПЦР. Использовали пары праймеров: SEQ ID NO: 18 (5′-CGGTCGACACTCCCAGGGGTGAAGC-3′) и SEQ ID NO: 19 (5′-CGGCCAATAAGGCCAAGAATGCATTCGGCC-3′), SEQ ID NO: 20 (5′-TGGCCTTATTGGCCGCCGTATGAATTGCGC-3′) и SEQ ID NO: 21 (5′-GCGAGCTCCTGCAACCACAGACCGC-3′). Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 после расщепления с помощью SalI и SacI, получая pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI. Затем, используя плазмиду pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI, конструировали гомологический вектор, содержащий промотор и ген VP2 IBDV из стандартного заражающего штамма. Сначала расщепляли pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI с помощью SfiI и дефосфорилировали с помощью PAP. Получали кассету промотор BAC-VP2-STC путем расщепления p45/46bacVP2-STC#11 (U.S. Patent No. 6,764,684) с помощью BglI и вставляли её в расщепленную SfiI pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI, получая pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2 (фиг. 4). Эту плазмиду использовали для конструирования DEV/del/UL26/BacVP2.

6.3. Конструирование DEV, содержащего неактивный ген UL4 и последовательность чужеродного гена, вставленную между UL27 и UL26

Конструирование рекомбинантного DEV, содержащего неактивный ген UL4 и последовательность чужеродного гена, вставленную между областью UL27 и UL26, проводили путем гомологической рекомбинации в штамме E. coli, несущем геном DEV, которых трансфицировали 0,1 мкг pUC18-KAPEVAC-UL4del и pUC18- KAPEVAC-UL26-BacVP2. Трансфекцию проводили методом электропорации на приборе Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories) при 1,75 кВ, 25 мкФ и 200 Ом. После трансфекции E. coli высеивали на чашки с агаром Luria-Bertani (LB) и инкубировали в течение ночи при 30°C. Клоны E. coli, несущие соответствующую вставку, содержащую ген rpsLneo-DsRed2, идентифицировали методом ПЦР с помощью пары праймеров, амплифицирующей область между генами UL3.5 и UL5 (Junction 4, фиг. 4) или область между генами Bac-VP2 и участком сайта вставки в геноме DEV (Junction 1, фиг. 4). Использовали праймеры SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 17 для Junction 4 и SEQ ID NO: 22 (5′-GACGCTATACCCAATGACGATGAAAAC-3′) и SEQ ID NO: 23 (5′-GAGCAACTTCGAGCTGATCC-3′) для Junction 1. Из клонов E. coli с соответствующей вставкой экстрагировали модифицированную ДНК DEV и трансфицировали её в клетки CEF при помощи Nucleofector II. Трансфицированные клетки вносили в среду LM (+), высеивали в 96-луночные планшеты для культивирования тканей, а затем инкубировали при 37°C в 4-5% CO₂ в течение 5-7 дней до тех пор, пока не проявлялся цитопатический эффект (CPE) DEV.

6.4. Проверка структуры генома

Структуру генома у рекомбинантного DEV/UL4del/UL26/BacVP2 проверяли по 4-м реакциям ПЦР, амплифицирующим стыковочные участки (Junction 1, Junction 2 и Junction 3; фиг. 4) на каждом конце вставленного гена. Пары праймеров, используемые в реакциях ПЦР для Junction 1 и Junction 4, описаны в Примере 6.3. В реакциях ПЦР для Junction 2 использовали пару праймеров SEQ ID NO: 24 (5′-GTACTGCCCGGCCGGTCTAATG-3′) и SEQ ID NO: 25 (5′-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3′). Для Junction 3 использовали SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 24. Наблюдались ожидаемые размеры продуктов ПЦР, подтверждающие, что rDEV/UL4del/BacVP2 имеет ожидаемую структуру генома.

6.5. Введение in ovo

В 18-дневные эмбрионы цыплят вводили по 1000 бляшкообразующих единиц rDEV/UL4del/UL26/BacVP2 или исходного вируса KAPEVAC in ovo в день 3. У птиц отслеживали клинические признаки в течение 35 дней после вылупления. Результаты по 17 птицам показали уровень выживаемости более 80%.

Пример 7. Конструирование и введение in ovo DEV, содержащих неактивный ген UL4 и неактивный ген UL23

Конструировали DEVs, содержащие неактивные гены UL4 и UL23 и чужеродный ген.

7.1. Конструирование pUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2 и pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2

Фрагмент ДНК в 1,0 т.о. из генома DEV, фланкирующий гены UL24 и UL22, клонировали с помощью реакций ПЦР, добавляя сайт распознавания SfiI на сайт вставки (фиг. 5). Вкратце, используя в качестве матрицы ДНК, экстрагированную из DEV, проводили две реакции ПЦР. Использовали пары праймеров: SEQ ID NO: 26 (5′-GCGCATGCCAATTGTCTAATTCCAG-3′) и SEQ NO: 27 (5′-CCCGGCCAATAAGGCCACAGAAAAAGCGCG-3′), SEQ ID NO: 28 (5′-CTGTGGCCTTTTGGCCGGGATCTGGAAC-3′) и SEQ ID NO: 29 (5′-GCGAATTCATGTGCTACGCCCAG-3′). Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 29 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 после расщепления с помощью EcoRI и SphI, получая pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI. Затем, используя плазмиду pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI, конструировали гомологический вектор, содержащий промотор и VP2-STC. Сначала расщепляли pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI с помощью SfiI и дефосфорилировали с помощью PAP. Получали кассету Bac-VP2 из плазмиды pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2 путем расщепления с помощью SfiI и вставляли её в расщепленную SfiI лигированную pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI, получая pUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2 (фиг. 5). Кроме того, используя pUC18-KAPEVAC-UL23-SfiI, конструировали pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2. Промотор Coa5 получали из плазмиды pGICOA (U.S. Pat. No. 6,866,852) при расщеплении с помощью BglI и XbaI и лигировали с фрагментом XbaI-EcoRI (6,3 т.о.) и фрагментом EcoRI-BglI (0,1 т.о.) из p45/46bacVP2-STC#11 (U.S. Pat. No. 6,764,684), получая p45/46COA5VP2-STC#11. Затем из p45/46COA5VP2-STC#11 вырезали кассету промотор Coa5-VP2-STC путем расщепления BglI и лигировали с расщепленной SfiI pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI, получая pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2 (фиг. 5).

7.2. Конструирование pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2

Конструировали pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2, используя расщепленную SfiI pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI. Получали кассету Coa5-VP2 из pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2 при расщеплении с помощью SfiI и вставляли в расщепленную SfiI pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI, получая pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2 (фиг. 4).

7.3. Конструирование pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2

Фрагмент ДНК в 1,0 т.о. из генома DEV, фланкирующий гены UL45 и UL46, клонировали с помощью реакций ПЦР, добавляя сайт распознавания SfiI на сайт вставки (фиг. 6). Вкратце, используя в качестве матрицы ДНК, экстрагированную из DEV, проводили две реакции ПЦР. Использовали пары праймеров: SEQ ID NO: 30 (5′-CGGTCGACATAGAACGCGCTTCATCTAA-3′) и SEQ ID NO: 31 (5′-TGGCCAATAAGGCCGTTTTTTTTTATATAT-3′), SEQ ID NO: 32 (5′-CGGCCTTATTGGCCAATCTGATTCATCCAA-3′) и SEQ ID NO: 33 (5′-GCGAGCTCCGCCTAATCACAATCGGTATTG-3′). Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 33 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 после расщепления с помощью SalI и SacI, получая pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI. Затем, используя плазмиду pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI, конструировали гомологический вектор, содержащий промотор и ген VP2 IBDV из стандартного заражающего штамма. Сначала расщепляли pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI с помощью SfiI и дефосфорилировали с помощью PAP. Вырезали кассету промотор Coa5-VP2-STC из pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2 путем расщепления SfiI и лигировали с расщепленной SfiI pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI, получая pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2 (фиг. 6).

7.4. Конструирование pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2

Фрагмент ДНК в 1,0 т.о. из генома DEV, фланкирующий гены UL50 и UL51, клонировали с помощью реакций ПЦР, добавляя сайт распознавания SfiI на сайт вставки (фиг. 7). Вкратце, используя в качестве матрицы ДНК, экстрагированную из DEV, проводили две реакции ПЦР. Использовали пары праймеров: SEQ ID NO: 34 (5′-CCGCATGCGCAACTATATATGTCGGTC-3′) и SEQ ID NO: 35 (5′-GGGCCAATAAGGCCCAAAAGTACATTTTTTTTTT-3′), SEQ ID NO: 36 (5′-GGGCCTTTTTGGCCCAATTTATTTACTATT-3′) и SEQ ID NO: 37 (5′-GCGAATTCTGGATATGATATACCGTTGC-3′). Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 37 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 после расщепления с помощью EcoRI и SphI, получая pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI. Затем, используя плазмиду pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI, конструировали гомологический вектор, содержащий промотор и ген VP2 IBDV из стандартного заражающего штамма. Сначала расщепляли pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI с помощью SfiI и дефосфорилировали с помощью PAP. Вырезали кассету промотор Coa5-VP2-STC из pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2 путем расщепления SfiI и лигировали с расщепленной SfiI pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI, получая pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2. Эту плазмиду использовали для конструирования DEV/US4US5del/UL50/VP2 (фиг. 7).

7.5. Конструирование pUC18-KAPEVAC-UL23del

Фрагмент ДНК в 1,0 т.о. из генома DEV, фланкирующий гены UL24 и UL22, клонировали с помощью реакций ПЦР, добавляя сайт распознавания SfiI на сайт вставки (фиг. 5). Вкратце, используя в качестве матрицы ДНК, экстрагированную из DEV, проводили две реакции ПЦР. Использовали пары праймеров: SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 38 (5′-CTTGTTCCAGATCCCACAGAAAAAGCGCG-3′), SEQ ID NO: 39 (5′-CGCGCTTTTTCTGTGGGATCTGGAACAAG-3′) и SEQ ID NO: 29. Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 29 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 после расщепления с помощью EcoRI и SphI, получая pUC18-KAPEVAC-UL23del (фиг. 5).

7.6. Конструирование DEV, содержащих неактивные гены UL4 и UL23 и последовательность чужеродного гена

Конструирование рекомбинантных DEV, содержащих неактивные гены UL4 и UL23 и последовательность чужеродного гена, проводили путем гомологической рекомбинации в штамме E. coli, несущем геном DEV, которых трансфицировали 0,1 мкг pUC18-KAPEVAC-UL4del и pUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2 для JK015, pUC18-KAPEVAC-UL4del, pUC18-KAPEVAC-UL23del и pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2 для JK022, pUC18-KAPEVAC-UL4del, pUC18-KAPEVAC-UL23del и pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2 для JK023 или pUC18-KAPEVAC-UL4del, pUC18-KAPEVAC-UL23del и pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2 для JK024. Трансфекцию проводили, как описано выше, и отбирали DEV, содержащие неактивные гены UL4 и UL23 и последовательность чужеродного гена (JK022-JK024).

Были успешно получены JK015, JK022, JK023 и JK024.

7.7. Скорость роста

Определяли скорость роста этих DEV, а результаты приведены ниже.

7.8. Введение in ovo

В 18-дневные эмбрионы цыплят вводили in ovo 1000 бляшкообразующих единиц следующих DEV или исходного вируса KAPEVAC в день 3. У птиц отслеживали клинические признаки в течение 35 дней после вылупления. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

В этом испытании большинство цыплят, инокулированных rDEV/UL4del/UL23/BacVP2, выжили за период наблюдения, тогда как все цыплята, зараженные исходным штаммом DEV, умерли.

Пример 8. Конструирование и введение in ovo DEV, содержащих неактивный ген UL4 и неактивный ген US7

Конструировали DEVs, содержащие неактивные гены UL4 и UL23 и чужеродный ген.

8.1. Конструирование pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2

Фрагмент ДНК в 0,6 т.о. из генома DEV, фланкирующий гены US6 и US8, клонировали с помощью реакций ПЦР, добавляя сайт распознавания SfiI на сайт вставки (фиг. 8). Вкратце, используя в качестве матрицы ДНК, экстрагированную из DEV, проводили две реакции ПЦР. Использовали пары праймеров: SEQ ID NO: 40 (5′-GCGCATGCCCACCCATAGCCTATTAC-3′) и SEQ NO: 41 (5′-TATGATTGACTGTTTGCCTTTCATTAACATCCAAATATATTTGTACATGAGGTAATAGGCTATGGGTGCCTTATTGGCCA-3′), SEQ ID NO: 42 (5′-AACAGTCAATCATAACAAAAACATTTACTTTTAGTCATACTGATGTGAATTAGGCCTTATTGGCCTTCTATTTTTGAAAC-3′) и SEQ ID NO: 43 (5′-GCGAATTCATGACCATGGACATGC-3′). Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 43 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 после расщепления с помощью EcoRI и SphI, получая pUC18-KAPEVAC-US7del-SfiI. Затем, используя плазмиду pUC18-KAPEVAC-US7del-SfiI, конструировали гомологический вектор, содержащий промотор и VP2-STC. Сначала pUC18-KAPEVAC-US7del-SfiI расщепляли с помощью SfiI и дефосфорилировали с помощью PAP. Получали кассету Bac-VP2 из плазмиды pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2 путем расщепления с помощью SfiI и вставляли её в расщепленную SfiI лигированную pUC18-KAPEVAC-US7del-SfiI, получая pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2 (фиг. 8).

8.2. Конструирование pUC18-KAPEVAC-US7del

Фрагмент ДНК в 0,6 т.о. из генома DEV, фланкирующий гены US6 и US8, клонировали с помощью реакций ПЦР (фиг. 8). Вкратце, используя в качестве матрицы ДНК, экстрагированную из DEV, проводили две реакции ПЦР. Использовали пары праймеров: SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 44 (5′-GTGCGCCATATAGACGTAATTCACATCAG-3′), SEQ ID NO: 45 (5′-CTGATGTGAATTACGTCTATATGGCGCAC-3′) и SEQ ID NO: 43. Другую реакцию ПЦР проводили, используя смесь продуктов ПЦР из двух предыдущих реакций ПЦР в качестве матрицы и SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 43 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в вектор pUC18 после расщепления с помощью EcoRI и SphI, получая pUC18-KAPEVAC-US7del (фиг. 8).

8.3. Конструирование DEV, содержащих неактивные гены UL4 и US7 и последовательность чужеродного гена

Конструирование рекомбинантных DEV, содержащих неактивные гены UL4 и US7 и последовательность чужеродного гена, проводили путем гомологической рекомбинации в штамме E. coli, несущем геном DEV, которых трансфицировали 0,1 мкг pUC18-KAPEVAC-UL4del и pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2 для JK016, pUC18-KAPEVAC-UL4del, pUC18-KAPEVAC-US7del и pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2 для JK025, pUC18-KAPEVAC-UL4del, pUC18-KAPEVAC-US7del и pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2 для JK026, pUC18-KAPEVAC-UL4del, pUC18-KAPEVAC-US7del и pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2 для JK027 или pUC18-KAPEVAC-UL4del, pUC18-KAPEVAC-US7del и pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2 для JK028. Трансфекцию проводили, как описано выше, и отбирали DEV, содержащие неактивные гены UL4 и US7 и последовательность чужеродного гена (JK016 и JK025-JK028).

8.4. Скорость роста

Определяли скорость роста этих DEV, а результаты приведены ниже.

8.5. Введение in ovo

В 18-дневные эмбрионы цыплят вводили in ovo 1000 бляшкообразующих единиц следующих DEV или исходного вируса KAPEVAC в день 3. У птиц отслеживали клинические признаки в течение 35 дней после вылупления. Результаты представлены в нижеследующей таблице.

В этом испытании все цыплята, инокулированные rDEV/UL4del/US7/BacVP2, выжили на протяжении 35 дней.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Описан вирус утиного энтерита (DEV) для экспрессии чужеродных генов, который содержит в своем геноме неактивный ген UL4. Также описана клетка-хозяин для продуцирования описанного DEV и способ его получения. Описано применение указанного DEV при вакцинации или иммунизации домашней птицы, предпочтительно цыплят, и для вырабатывании защитного иммунитета у домашней птицы, предпочтительно у цыплят. Представлена композиция для вакцинации или иммунизации птиц, содержащая эффективное количество указанного DEV, нуклеиновую кислоту, колирующую его геном или указанную клетку-хозяина, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый эксципиент или носитель. Представлен вакцинный набор для иммунизации птиц, который включает следующие компоненты: a) эффективное количество указанной композиции и b) средство для введения указанной композиции данным птицам. Изобретение особенно подходит для вакцинации домашней птицы от птичьих патогенов. 8 н. и 13 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл., 8 пр.

Формула