Вакцина против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома - RU2162710C2

Код документа: RU2162710C2

Чертежи

Показать все 17 чертежа(ей)

Описание

Изобретение относится к средствам для защиты свиней от заболеваний респираторного и репродуктивного трактов, в частности к вакцине против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома.

С конца восьмидесятого вплоть до начала девяностого года в Северной Америке, соответственно в Европе, появилось новое эпидемически распространяющееся и связанное с высокими экономическими потерями заболевание свиней. Между тем оно получило официальное название "свиной репродуктивный и респираторный синдром" (СРРС).

Основными клиническими симптомами этого эпидемического заболевания являются ухудшениe плодовитости у свиноматок и заболевания дыхательных путей у поросят и откормочных свиней.

Наряду с нерегулярно появляющимися неспецифическими симптомами, как отсутствие аппетита, апатия и повышенная температура тела, у свиноматок заболевание характеризуется поздними выкидышами, рождением мертвых, мумифицированных и нежизнеспособных поросят. Вследствие эпидемии часто появляются симптомы в виде комплекса мастита, метрита и агалактии (ММА-комплекс) и оглушения.

Если в эндемической области в начале эпидемии заболевание поражает в основном поросят-сосунков и поросят-отъемышей, то при дальнейшем ее распространении в возрастающей мере заболевают откормочные свиньи. При этом наряду в основном с имеющими место заболеваниями респираторного тракта дополнительно могут наблюдаться в качестве сопутствующих также другие классические заболевания свиней. Эпидемия приводит к значительным экономическим потерям, которые наряду с прямыми потерями животных выражаются в снижении производственных показателей (результаты опороса и отлучения от матки, ход беременности, прирост в живом весе).

В качестве основного действующего инфекционного фактора считают новый размножающийся в макрофагах легочных альвеол РНК-вирус. С другой стороны, дальнейшие эпидемиологические исследования указывают на то, что респираторные и репродуктивные заболевания вызываются или усиливаются за счет вторичных, соответственно множественных инфекций с помощью других вирусов, соответственно вирусов и бактерий. Поэтому желательно защищать свиней не только от основного возбудителя СРРС, но и также от возбудителей, которые совместно с СРРС ответственны за репродуктивные и респираторные заболевания.

Известна вакцина против свиного репродуктивного или респираторного синдрома, содержащая выделенное из гриппозного вируса человека активное вещество и целевые добавки (см. The Veterinary Record, том 129, выпуск 1, 1991 г., с. 1991).

Задачей изобретения является расширение ассортимента вакцины против свиного репродуктивного или респираторного синдрома.

Поставленная задача решается предлагаемой вакциной против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома, содержащей активное вещество и целевые добавки, за счет того, что она содержит в качестве активного вещества парагриппозные вирусы 2 типа, в частности штамм SER, в живой, мертвой, ослабленной или полученной путем рекомбинантной технологии форме, целиком или в виде частей или фрагментов в эффективном количестве.

В качестве парагриппозных вирусов 2 типа следует указать:
1) полные, живые вирусные частицы, получаемые путем размножения вируса в культурах клеток или эмбрионированных куриных яйцах;
2) полные, живые, ослабленные вирусные частицы, получаемые путем длительных пассажей вируса в первичных культурах клеток, перманентных линиях клеток, эмбрионированных птичьих яйцах или подопытных животных с последующим размножением в культурах клеток или эмбрионированных куриных яйцах;
3) полные, умерщвленные вирусные частицы, получаемые обычными способами, как химическая или физическая инактивация;
4) части (субъединицы) вирусных частиц, получаемые из вируса, который размножается в культурах клеток или эмбрионированных куриных яйцах;
5) части (субъединицы) вирусных частиц, которые экспрессируются на основании рекомбинантных генных технологий систем клеток и которые в случае необходимости можно отделять от них или изолировать из них;
6) вирусные антигены, которые экспрессируются через векторные системы, причем с помощью рекомбинантных генных технологий геном вируса или его части вводят в геномные векторы, как вирусы вакцин, вирусы герпеса, аденовирусы или другие пригодные векторные системы.

Парагриппозные вирусы 2 типа (далее ПГВ-2) можно изолировать из респираторного или репродуктивного тракта свиней, у которых обнаруживают подобную СРРС симптоматику. Предпочтительный штамм SER был депонирован 12.06.1993 г. в Национальной коллекции культур и микроорганизмов (Институт Пастера, Париж, Франция) под номером I - 1331 согласно Будапештскому cоглашению.

В предлагаемой вакцине активное вещество может находиться в смеси с антигенным материалом из других вирусов или бактерий. В качестве таковых следует назвать хламиды, в особенности Chlamydia psittaci и Chlamydia pecorum в концентрациях 105 - 1010 ЕВЕ/доза, Erysipelothrix rhusiopathiae в концентрациях 107 - 1012 КВЕ/доза, СРРС - вирусы в концентрациях 104 - 109 КИД50/доза, свиной парвовирус в концентрациях 104 - 109 КИД50/доза.

Особенно предпочтительна смесь из ПГВ-2 и хламид, в особенности Chlamydia psittaci или Chlamydia pecorum.

В нижеследующем тексте описания используют следующие понятия:
котрансфекция: одновременный перенос двух различных последовательностей ДНК в клетки, в которых могут размножаться вирусы, с целью индуктировать рекомбинации вируса, которые содержат последовательности чужеродной ДНК. Различными последовательностями ДНК являются (1) чужеродная ДНК, которая может быть вставлена в шаттл-векторы, и (2) очищенный геном векторного вируса;
геномный вектор: живые возбудители, в особенности вирусы, которые пригодны для вставки чужеродной ДНК и инфицируют клетки или организмы с помощью вставленной в их геном чужеродной ДНК или экспрессируют в них чужеродную ДНК;
иммуногены: пептиды или протеины, которые в более высшем организме вызывают иммунологическую реакцию и могут экспрессироваться в векторах за счет последовательностей чужеродной ДНК;
клонирование: введение в векторы последовательностей чужеродной ДНК;
плазмида: экстрахромосомальные, кольцеобразные последовательности ДНК, которые реплицируются в клетках низших или более высших организмов;
шаттл-вектор: бактериофаги или плазмиды, в особенности бактериальные плазмиды, которые содержат вставленную чужеродную ДНК, фланкированную последовательностью ДНК векторного вируса;
трансфекция: перенос последовательностей ДНК в клетки низших или более высших организмов с целью индуцирования рекомбинации клеточного генома с введенными последовательностями ДНК;
векторы: плазмиды, бактериофаги или вирусы, которые в своей генетической информации содержат последовательности чужеродной ДНК.

Размножение вирусов для получения полных живых вирусных частиц осуществляют обычным образом, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман).

Размножение в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных роллерных культурах или культурах на носителе в форме сплошных соединений клеток (монослои) или в суспендированных культурах. В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для размножения вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40oC, предпочтительно при 32 - 39oC, особенно предпочтительно при 37oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g.

Размножение в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39oC, предпочтительно 38,5oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для размножения вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 101 - 107 КИД50/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 104 - 105 КИД50/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, и можно проводить ее обработку дальше, например, посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования при ускорении вплоть до 10000 g.

Ослабленный, живой вирус получают обычным образом путем длительных пассажей и/или переменных пассажей, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), или в клетках почек собак, как перманентные клетки почек собак MDCK (ATCC CCL34 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных яйцах кур, голубей или уток, предпочтительно в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман), или в подопытных животных, предпочтительно в маленьких лабораторных животных, например, как морские свинки, крысы или мыши, в которых вирус размножается, не вызывая серьезных симптомов заболевания.

Пассирование в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных культурах в форме сплошных соединений клеток (монослои). В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для пассирования вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40oC, предпочтительно при 32 - 39oC, особенно предпочтительно при 37oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток применяют для инфицирования свежей культуры клеток (последующее пассирование).

Пассирование в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39oC, предпочтительно 38,5oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для пассирования вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 101 - 107 КИД50/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 104 - 105 КИД50/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца. Ее применяют для инфицирования свежих, предварительно инкубированных, эмбрионированных яиц (последующий пассаж).

Пассирование в подопытных животных осуществляют самим по себе известным образом путем парентерального введения вирусной суспензии и выделения вируса снова из органов и тканей подопытных животных.

Для пассирования в подопытных животных используют предпочтительно ювенильных, маленьких лабораторных животных, которых специально выращивают в беспатогенных условиях, например, как морские свинки (Hsd/Win: DH, фирма Харлан-Винкельман Гмбх, Борхен), крысы (Hsd/Win: WU, фирма Харлан-Винкельман Гмбх, Борхен) или мыши (Hsd/Win: NMR 1, фирма Харлан-Винкельман Гмбх, Борхен, Бальб/С/ЛСО, Иффа Кредо, Бельгия). Подопытных животных инфицируют с помощью 0,1 - 2,0 мл вирусной суспензии парентерально, например, путем чрескожного, внутримышечного, внутриносового, интраперитонеального, внутривенного или подкожного введения. В вирусной суспензии вирус в среде для размножения вируса находится в таком количестве, что подопытные животные, смотря по обстоятельствам, получают дозу вируса 101 - 107 КИД50, предпочтительно 103 - 105 КИД50 (инфекционная доза для 50% культур на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток). В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Размножение вируса осуществляют в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 1 - 12 дней.

Вирус снова выделяют известным образом из тканей, предпочтительно из внутренних органов подопытных животных. Для этого у подопытных животных извлекают внутренние органы, например, легкие, печень или селезенку. Из органов или частей органов путем механического размельчения, например, с помощью ножниц и ступки, готовят высокодисперсную суспензию в среде для размножения вируса, которую обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Полученную содержащую вирус среду применяют для инфицирования новых подопытных животных (последующие пассажи).

Процесс последующего пассажа повторяют многократно, предпочтительно 10 - 20 раз, в одинаковой системе размножения (гомологичные пассажи) или в различных системах размножения (гетерологичные пассажи).

Повторный контроль вируса на ослабление осуществляют путем экспериментального инфицирования полностью восприимчивых подопытных животных, предпочтительно свиней, с помощью вирусной суспензии, которую получают из последнего пассажа ряда последующих пассажей.

Если еще появляются типичные симптомы заболевания, например, выкидыши или рождения мертвых поросят у супоросных свиноматок или респираторные заболевания, то исходя из вирусов последнего последующего пассирования осуществляют дальнейшие гомологичные или гетерологичные длительные пассирования.

Если более не появляются никакие типичные симптомы заболевания, то вирусы последнего последующего пассирования размножают как описано выше, и фильтраты или надосадочные жидкости после центрифугирования содержащих вирус надосадочных жидкостей культур или аллантоидных жидкостей применяют для приготовления вакцин.

Размножение вирусов для получения умерщвленных вирусных частиц осуществляют обычным образом, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман).

Размножение в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных роллерных культурах или культурах на носителе в форме сплошных соединений клеток (монослои) или в суспендированных культурах. В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно, их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для размножения вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40oC, предпочтительно при 32 - 39oC, особенно предпочтительно при 37oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0, 45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g.

Размножение в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39oC, предпочтительно 38,5oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для размножения вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 101 - 107 КИД50/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 104 - 105 КИД50/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, и можно проводить ее обработку дальше, например, посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования при ускорении вплоть до 10000 g.

Инактивацию вируса осуществляют обычным образом с помощью физических способов, например, путем воздействия нагрева, ультрафиолетового или γ-облучения, или предпочтительно с помощью химических способов, например, путем воздействия этанола, формальдегида, β-пропиолактона и предпочтительно с помощью этиленаминов.

Химическую инактивацию осуществляют самим по себе известным образом в пригодных реакционных сосудах, которые оснащены устройством для поддерживания постоянной реакционной температуры, а также для постоянного движения реакционной смеси (например, ферментер). В качестве инактивирующего средства используют предпочтительно этиленамины, особенно предпочтительно 2-бром-этиламин-гидробромид (2-БЭА) в концентрации 1 - 10 ммоль/л, предпочтительно 2,5 - 7,5 ммоль/л.

Перед добавкой раствора 2-бром-этиламин-гидрохлорида в вирусной суспензии с концентрацией 104,0 - 109,0 КИД50/мл, предпочтительно 105,0 - 108,0 КИД50/мл, которую получают из одного или нескольких процессов размножения вируса, устанавливают значение pH, равное 8,1 - 8,7, предпочтительно 8,3 - 8,5.

Инактивацию осуществляют при 4 - 40oC, предпочтительно при 23 - 37oC, особенно предпочтительно при 36 - 37oC, в течение 6 - 48 ч, предпочтительно 16 - 20 ч.

После окончания инактивации избыточный 2-бром-этиламин-гидрохлорид нейтрализуют путем добавки гидролизующих агентов. Для этой цели пригоден в особенности тиосульфат натрия, который добавляют в конечной концентрации 40 - 80 ммоль/л, предпочтительно 50 ммоль/л. Нейтрализацию проводят при 4 - 40oC, предпочтительно при 2 - 8oC, в течение 2 - 16 ч, предпочтительно 4 - 8 ч.

Размножение вирусов для получения субъединиц осуществляют обычным образом, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман).

Размножение в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных роллерных культурах или культурах на носителе в форме сплошных соединений клеток (монослои) или в суспендированных культурах. В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для размножения вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40oC, предпочтительно при 32 - 39oC, особенно предпочтительно при 37oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g.

Размножение в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39oC, предпочтительно 38,5oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для размножения вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 101 - 107 КИД50/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 104 - 105 КИД50/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, и можно проводить ее обработку дальше, например, посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования при ускорении вплоть до 10000 g.

Вирус выделяют путем изопикнического или зонального центрифугирования, например, с градиентами плотности сахарозы. Для этой цели содержащую вирус среду, соответственно аллантоидную жидкость, после удаления остатков клеток подвергают зональному центрифугированию с ускорением 100000 g вплоть до седиментации вирусных частиц. В более чистом виде вирусные частицы получают путем зонального центрифугирования в водном растворе с более высокой плотностью, чем содержащая вирус среда. В качестве водного раствора может служить, например, 30 - 60 мас.%, предпочтительно 35 - 50 мас.% буферированный раствор сахарозы. Еще более высокой степени чистоты достигают путем центрифугирования с градиентом плотности. Для этой цели освобожденный от клеток и остатков клеток сконцентрированный с помощью зонального центрифугирования вирус выделяют путем изопикнического или зонального центрифугирования с градиентом плотности, например, 30 - 50 мас.% сахарозы в буферированном водном растворе при ускорении центрифугирования, например, 100000 - 150000 g.

Таким образом полученные вирусные концентраты обрабатывают детергентами.

Пригодными детергентами являются анионоактивные поверхностно-активные агенты, как лаурилсульфат натрия, сульфаты простых эфиров спиртов жирного ряда, моноэтаноламинная соль сложного эфира ортофосфорной кислоты и простого моно-/ди-алкилполигликолевого эфира, алкиларилсульфонат кальция, дезоксихолят натрия; катионоактивные поверхностно-активные агенты, как цетилтриметиламмонийхлорид; амфотерные поверхностно-активные агенты, как ди-натрий-N-лаурилиминодипропионат или лецитин; неионные поверхностно-активные агенты, например, полиоксиэтилированное касторовое масло, полиоксиэтилированный сорбитан-моноолеат, сорбитан-моностеарат, глицеринмоностеарат, полиоксиэтиленстеарат, алкилфенолполигликолевый простой эфир.

Предпочтительно следует назвать следующие неионные детергенты: неионные, водорастворимые эмульгаторы с ГЛБ (значение гидрофильно-липофильного баланса) более 10, например, эмульгатор НП 40 (Байер АГ), алкиларилполигликолевый простой эфир; Ренекс 678 (Атлас Кемикал Индастри), полиоксиэтиленалкилариловый простой эфир; Твин 20 (Атлас), полиоксиэтиленсорбитанмонопальмитат; Майри 53 (Атлас), полиоксиэтиленстеарат; Атлас Г 3707, полиоксиэтиленлауриловый простой эфир; Атлас Г 3920, полиоксиэтиленолеиловый простой эфир; Атлас Г 9046 Т, полиоксиэтиленманнитанмонолаурат; эмульгатор 1371 Б (Байер АГ), алкилполигликолевый простой эфир; эмульгатор 1736 (Байер АГ), алкилполигликолевый простой эфир (олеилполигликолевый простой эфир); эмульгатор ОКС (Байер АГ), алкилполигликолевый простой эфир (додецилполигликолевый простой эфир); Нинокс БМ-2 (Стэпан Кемикал Ко.), этоксиэтилированный нонилфенол; Тритон Х-100 (Ром и Хаас Ко.), изооктилфенолполиэтоксиэтанол; Кремофор ЕЛ, Нонидет П 40 (Шелл).

Детергенты применяют в виде водных разбавленных растворов. Следует указать растворы с концентрацией 0,1 - 10 об.%, предпочтительно 0,5 - 5 об. %, особенно предпочтительно примерно 1 об.% детергента.

Раствор детергента добавляют к вирусному концентрату в объемном соотношении примерно от 1:1 до примерно 10:1. Предпочтительно соотношение раствора детергента к вирусному концентрату составляет примерно 3:1.

Обработку детергентом осуществляют при постоянном перемешивании смеси при температурах от 0 до примерно 24oC, предпочтительно при 2 - 8oC. Обработка детергентом продолжается от 15 мин до 2 дней, предпочтительно в течение 6 - 18 ч. Для улучшения обработки детергентом смесь можно дополнительно подвергать ультразвуковой обработке.

Не растворившиеся при этой обработке частицы удаляют, предпочтительно путем фильтрации или центрифугирования, например при 150000 g. Таким образом полученный фильтрат, соответственно надосадочную жидкость, после центрифугирования можно хранить вплоть до ее дальнейшей переработки при низких температурах (от 0 до -70oC).

Содержащиеся в лизате гликопротеины вирусных частиц выделяют путем обработки с помощью лектинов. Лектины представляют собой протеины или гликопротеины из растений, особенно их семян, микроорганизмов, позвоночных и беспозвоночных, которые специфически связывают сахара и их конъюгаты. Применяют лектины, которые распознают и связывают гликопротеины из парамиксовирусов. Предпочтительно применяют лектины, которые распознают маннозу и/или глюкозу, а также их конъюгаты. В частности, следует назвать лектины из Canavalia ensiformis, Lens culinaris, Lathygros odoratus, Pisum sativum, Vicia faba, Sambucus nigra, Glycine max, Ulex europaens. Helix promatia, Phytolacca americana, Lycopersicon esculentum, Datura stramonium, Bandeiraea simplicifolia.

Лектины используют в водорастворимой и нерастворимой в воде форме. В нерастворимой в воде форме их предпочтительно иммобилизируют за счет связывания с инертной матрицей, как, например, декстраны, агарозы, целлюлозы, используемые в виде суспензий. В частности, следует назвать конканавалин-A-агарозу, конканавалин-A-сефарозу, лентил-лектин-сефарозу, агароза - лектин из пшеничных зерен, Helix pomatia-лектин-сефарозу.

Лектины используют в виде содержащего детергент и соль раствора, суспензии или геля. Для этой цели как лизат, так и также используемый лектиновый раствор, лектиновую суспензию или лектиновый гель предварительно смешивают с таким количеством хлорида натрия, а также известных стабилизирующих лектин солей, чтобы концентрация хлорида натрия составляла 0,5 - 2, предпочтительно 0,7 - 1,2 моль/л. Установление концентрации лизатов осуществляют предпочтительно путем диализа. Необходимая концентрация стабилизирующих лектин солей известна из уровня техники и специфична для используемых лектинов. Сверх того лектиновый раствор, лектиновую суспензию или лектиновый гель смешивают с используемым для обработки лизатов детергентом в такой же концентрации, так что лизат и лектиновый раствор имеют одинаковые концентрации соли и детергента.

Применяют примерно 1 - 150 мг, предпочтительно 1 - 50 мг, особенно предпочтительно 5 - 20 мг, чистого лектина на 1 мл раствора, суспензии или геля. К лизату добавляют столько этого раствора, суспензии или геля лектина, чтобы на мг общего количества протеина приходилось 0,01 - 50 мг, предпочтительно 0,1 - 20 мг, особенно предпочтительно 0,5 - 5 мг лектина. Обработку лектином осуществляют при температуре от 0 до примерно 24oC, предпочтительно при 2 - 8oC, в течение времени примерно от 10 мин до 3 дней, предпочтительно в течение времени от 1 ч до 2 дней.

Реакцию лектинов с гликопротеинами также можно проводить с помощью колоночной хроматографии, причем лизат вводят в контакт с лектином, иммобилизированным на гелеобразной матрице в хромaтографической колонке.

Комплекс гликопротеина с лектином обычным образом отделяют от общего количества раствора или суспензии. Это можно осуществлять путем центрифугирования, фильтрации или в случае хроматографии - путем промывок.

В полученных по этим способам суспензиях или гелях, которые содержат комплексы лектина с гликопротеином, путем фильтрации, центрифугирования, диализа или других процессов промывки можно изменять концентрацию детергента и/или соли в физиологически приемлемой области или вплоть до удаления.

Таким образом полученные суспензии или гели комплексов лектина с гликопротеином можно применять непосредственно в качестве антигенного материала. В зависимости от содержания связанного с лектином гликопротеина их можно далее концентрировать или разбавлять.

Суспензии или гели комплексов лектина с гликопротеином можно хранить при температурах ниже 8oC. Их также можно подвергать сушке вымораживанием.

Из полученных суспензий или гелей комплексов лектина с гликопротеином можно выделять гликопротеины для получения антигенного материала. Для этой цели суспензии или гели обрабатывают содержащим соль водным раствором сахара.

Род используемого сахара выбирают в зависимости от специфичности применяемых лектинов. Концентрация сахара составляет 0,1 - 1 моль/л, предпочтительно 0,1 - 0,5 моль/л, особенно предпочтительно 0,3 - 0,5 моль/л. Концентрация и состав соли соответствуют таковым содержащих гликопротеин-лектиновый комплекс суспензий или гелей.

Обработку раствором сахара осуществляют при температуре от 0 до примерно 24oC, предпочтительно при 2 - 8oC. Обработка занимает время от примерно 15 мин до 4 дней, предпочтительно от 1 ч до 2 дней, особенно предпочтительно 10 - 24 ч.

Элюированные при этом гликопротеины отделяют от лектинов путем центрифугирования, фильтрации или других обычных способов разделения (например, хроматографии). В полученных в результате препаратах концентрации детергента, соли и сахара можно изменять описанным уже выше образом.

Таким образом полученные выделенные гликопротеины можно применять в качестве антигенного материала. Содержание гликопротеина можно изменять путем концентрирования или разбавления.

Хранение препаратов осуществляют в виде их растворов при температурах ниже 0oC или в лиофилизированной форме.

Для получения субъединиц вирусных частиц рекомбинантным путем сначала получают вирусный геном.

Для получения вирусного генома сначала осуществляют размножение вирусов обычным образом, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман).

Размножение в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных роллерных культурах или культурах на носителе в форме сплошных соединений клеток (монослои) или в суспендированных культурах. В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для размножения вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40oC, предпочтительно при 32 - 39oC, особенно предпочтительно при 37oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g.

Размножение в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39oC, предпочтительно 38,5oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для размножения вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 101 - 107 КИД50/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 104 - 105 КИД50/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, и можно проводить ее обработку дальше, например, посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0, 45 мкм и/или с помощью центрифугирования при ускорении вплоть до 10000 g.

Очистки, соответственно выделения, вируса достигают путем изопикнического или зонального центрифугирования, например с градиентами плотности сахарозы. Для этой цели содержащую вирус среду, соответственно аллантоидную жидкость, после удаления остатков клеток подвергают зональному центрифугированию с ускорением 100000 g вплоть до седиментации вирусных частиц. В более чистом виде вирусные частицы получают путем зонального центрифугирования в водном растворе с более высокой плотностью, чем содержащая вирус среда. В качестве водного раствора может служить, например, 30 - 60 мас.%, предпочтительно 35 - 50 мас.% буферированный раствор сахарозы. Еще более высокой степени чистоты достигают путем центрифугирования с градиентом плотности. Для этой цели освобожденный от клеток и остатков клеток сконцентрированный с помощью зонального центрифугирования вирус выделяют путем изопикнического или зонального центрифугирования с градиентом плотности, например, 30 - 50 мас. % сахарозы в буферированном водном растворе при ускорении центрифугирования, например 100000 - 150000 g.

Для получения пригодных генов, которые кодируют иммуногенные протеины, сначала выделяют вирусный геном из очищенных вирусных частиц. Природную вирусную рибонуклеиновую кислоту (РНК) предпочтительно получают путем обработки очищенных вирусных частиц содержащими детергенты и протеазы водными растворами.

Используют анионные, катионные, амфотерные и неионные детергенты. Предпочтительно применяют ионные детергенты, предпочтительно додецилсульфат натрия, в концентрации 0,1 - 10 об.%, предпочтительно 0,5 - 3 об.%.

В качестве протеаз используют такие, которые эффективны в присутствии детергентов, как, например, проназа, и предпочтительно используют протеиназу K. Протеазы применяют в концентрации 0,01 - 10 мг/мл, предпочтительно 0,05 - 0,5 мг/мл.

Предпочтительно применяют водные буферированные растворы с добавкой рибонуклеазных ингибиторов.

В качестве буферных веществ применяют соли слабых кислот с сильными основаниями, как, например, трис(гидроксиметил)аминометан, соли сильных кислот со слабыми основаниями, как, например, первичные фосфаты или их смеси. Предпочтительно применяют трис(гидроксиметил)аминометан. Буферные вещества используют в концентрациях, обеспечивающих pH-значение, при котором РНК не денатурируется. Предпочтительны pH-значения 6 - 8,5, особенно предпочтительны 7 - 8.

В качестве рибонуклеазных ингибиторов служат, например, рибонуклеозидванадильные комплексы, протеиновые ингибиторы (например, РНК guard/Фармациа) или предпочтительно диэтилпирокарбонат (ДЭПК), в концентрациях 0,01 - 2 об. %, предпочтительно 0,1 - 0,5 об.%.

Липофильные вещества вирусных лизатов затем экстрагируют растворителем, как, например, фенол, хлороформ или их смеси. Экстракцию осуществляют в одну или несколько стадий.

В остающейся водной фазе РНК осаждают с помощью водных растворов, которые содержат спирты, как, например, этанол или изопропанол, или хлориды или ацетаты одновалентных металлов, как, например, хлорид натрия, ацетат натрия или ацетат калия.

Концентрация спиртов составляет 40 - 100 об.%, предпочтительно 60 - 80 об.%, а концентрация хлоридов или ацетатов составляет 0,01 - 1 моль/л, предпочтительно 0,1 - 0,8 моль/л.

Осадившуюся РНК отделяют от водного раствора, например, путем центрифугирования и снова растворяют в водном растворе, например, водном растворе диэтилпирокарбоната. Этот водный раствор содержит предпочтительно буферные вещества, как, например, трис(гидроксиметил)аминометан, в концентрациях 1 - 100 ммоль/л, предпочтительно 10 - 50 ммоль/л, возможно при добавке этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в концентрациях 0,1 - 10 ммоль/л, предпочтительно 1 - 10 ммоль/л, или дитиотреита в концентрациях 0,1 - 10 ммоль/л, предпочтительно 1 - 10 ммоль/л.

Выделенную РНК хранят при температурах ниже -65oC.

Другим методом выделения РНК является, например, экстракция РНК с помощью гуанидинийтиоцианата и последующее центрифугирование вирусного лизата с градиентом плотности хлорида цезия.

Методы выделения РНК описываются J. Sambrook, E.F. Fritsh и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Идентифицирование пригодных генов осуществляют при применении выделенного вирусного генома, например, следующими путями:
а) гибридизация РНК/ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) генома при применении известных генных зондов. В качестве пригодных генных зондов служат ДНК-зонды с нуклеотидными последовательностями известных генов для иммуногенов родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
б) получение комплементарной ДНК (кДНК), клонирование кДНК, например, в бактериальных плазмидах, как, например, pBR 322, для накопления вирусной ДНК и гибридизация клонированной ДНК с помощью известных генных зондов. В качестве пригодных генных зондов служат ДНК-зонды с нуклеотидными последовательностями известных генов для иммуногенов родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
в) получение комплементарной ДНК (кДНК) и клонирование кДНК в плазмидных экспрессирующих векторах, как, например, pUC18/19 или pUC118/119, или в λ-бактериофаговых экспрессирующих векторах, как, например, λgtII и его потомки или λZAP или λORF8. Идентификацию генов осуществляют путем обнаружения их экспрессированных иммуногенов с помощью антител, которые прямо или косвенно обнаруживаются, например, путем иммунофлуоресценции или иммуноосаждения. Пригодными антителами являются такие, которые реагируют с иммуногенами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
г) получение комплементарной ДНК (кДНК) и клонирование кДНК, например, в бактериальных плазмидах для накопления вирусной ДНК. Вирусную ДНК клонов секвенируют и исследуют в отношении гомологий последовательностей с известными генами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
д) секвенирование кДНК при ее получении и исследование в отношении гомологий последовательностей с известными генами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
е) сочетание методов а) - д).

Методы гибридизации РНК/ДНК и ДНК/ДНК, получение кДНК, клонирование ДНК в плазмидных и бактериофаговых векторах, секвенирование ДНК, а также методы иммунологического обнаружения экспрессированных иммуногенов описываются в:
J. Sambrook, E.F. Fritsch и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;
F. M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, изд. Jonn Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987;
A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, том III, изд. Густав Фишер, Штутгарт, 1989.

Выбирают такие гены, в случае которых вышеуказанными методами можно обнаружить нуклеотидную последовательность, которая кодирует один или несколько иммуногенов. В качестве примера в Протоколе последовательностей (см. в конце описания) приводятся нуклеотидные последовательности с соответствующими аминокислотными последовательностями гемагглютинин-нейраминидаза-гена и гена слитого белка парагриппозного вируса 2, депонированного в Национальной коллекции культур и микроорганизмов (Институт Пастера, Париж, Франция) под номером I -1331.

Экспрессию генов для получения иммуногенов осуществляют, например, следующими путями:
а) Стабильная интеграция генов в форме комплементарной ДНК в клеточном наследственном материале клеток более высших организмов. Прежде всего гены клонируют в пригодных шаттл-векторах. Для этой цели пригоден, например,
обезьяний вирус 40 (ОБ40), а также плазмидные экспрессирующие векторы, которые пригодны для селекционирования и размножения в прокариотах (например, Е. Coli), а также содержат регуляторные элементы для экспрессии чужеродной ДНК в клетках более высших организмов.

Пригодными плазмидными экспрессирующими векторами являются, например, плазмидные векторы на основе OB40, как pMSG, pSVT7 или pMT2, или плазмидные векторы на основе вируса Эпстайна-Барра, как pHEBo или p205.

Клонированную ДНК выделяют и очищают с помощью вышеописанных методов и вводят в клетки более высших организмов путем трансфекции.

Пригодными клетками являются клетки животных, в особенности перманентные линии клеток, как, например, клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 и их потомки), клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), клетки почек собак MDCK (ATCC CCL34 или их потомки) или клетки почек кроликов RK-13 (ATCC CCL37).

Трансфекцию осуществляют, например, в форме соосаждения ДНК с фосфатом калия или с помощью диэтиламиноэтилдекстранового метода, липосомного метода или путем электропорации.

Методы клонирования выбранных генов в пригодных векторах, а также трансфекции клонированными генами клеток более высших организмов подробно описываются J. Sambrook, E.F. Fritsch и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и F. M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, изд. Jonn Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987.

Надосадочные жидкости культур клеток, соответственно клеточные лизаты, таким образом обработанных клеток испытывают на наличие экспрессированных иммуногенов с помощью антител, которые прямо или косвенно обнаруживаются, например, путем иммунофлуоресценции или иммуноосаждения. Пригодными антителами являются такие, которые реагируют с иммуногенами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2.

б) Клонирование генов в форме комплементарной ДНК в пригодных экспрессирующих векторах для клеток низших и более высших организмов.

Пригодны, например, (I) бактериальные плазмидные экспрессирующие векторы, (II) вирусные экспрессирующие векторы для бактерий или (III) вирусные экспрессирующие векторы для клеток более высших организмов, в которых экспрессируется клонированный ген.

К пункту (I):
Пригодными бактериальными плазмидными экспрессирующими векторами являются, например, pUC18/19 или pUC118/119. После клонирования ДНК в плазмиде ее вводят в прокариотные клетки, предпочтительно бактерии, и размножают. Пригодна, например, Escherichia coli K12 и ее потомки.

Для введения плазмиды в прокариотную клетку пригодно, например, соосаждение ДНК с фосфатом кальция или электропорация.

К пункту (II):
Пригодными вирусными экспрессирующими векторами для бактерий являются λ-бактериофаговые векторы, как, например, λgtII и его потомки, λZAP или λORF8. Размножение λ-бактериофаговых векторов осуществляется в особенности в Escherichia coli, например Escherichia coli K12 и ее потомках.

К пункту (III):
Пригодными вирусными экспрессирующими векторами для клеток более высших организмов являются, например, обезьяний вирус 40, аденовирусы, вирус простого герпеса или бакуловирусы. Размножение вирусных векторов происходит в соответствующих системах клеток.

Методы клонирования выбранных генов в пригодных экспрессирующих векторах, а также их введение в соответствующие экспрессионные системы подробно описывается J. Sambrook, E.F. Fritsch и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и F. M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, изд. Jonn Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987.

Экспрессированные иммуногены применяют в качестве антигенного материала либо непосредственно в виде систем экспрессии (культуральный субстрат и/или клетки), либо после получения и очистки посредством биохимических и/или иммунологических методов и в случае необходимости после концентрирования или разбавления.

Пригодными для очистки являются, например, способы аффинной или гель-хроматографии, при которых иммуногены отделяют или выделяют из системы экспрессии в случае необходимости после ее переведения в растворимую форму путем обработки детергентом.

Для получения вирусных антигенов, которые экспрессируются векторными системами, прежде всего получают вирусный геном.

Для получения вирусного генома сначала осуществляют размножение вирусов обычным образом, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман).

Размножение в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных роллерных культурах или культурах на носителе в форме сплошных соединений клеток (монослои) или в суспендированных культурах. В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для размножения вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае, когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40oC, предпочтительно при 32 - 39oC, особенно предпочтительно при 37oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g.

Размножение в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39oC, предпочтительно 38,5oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для размножения вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца, и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 101 - 107 КИД50/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 104 - 105 КИД50/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, и можно проводить ее обработку дальше, например, посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0, 45 мкм и/или с помощью центрифугирования при ускорении вплоть до 10000 g.

Очистки, соответственно выделения, вируса достигают путем изопикнического или зонального центрифугирования, например, с градиентами плотности сахарозы. Для этой цели содержащую вирус среду, соответственно аллантоидную жидкость, после удаления остатков клеток подвергают зональному центрифугированию с ускорением 100000 g вплоть до седиментации вирусных частиц. В более чистом виде вирусные частицы получают путем зонального центрифугирования в водном растворе с более высокой плотностью, чем содержащая вирус среда. В качестве водного раствора может служить, например, 30 - 60 мас.%, предпочтительно 35 - 50% мас.% буферированный раствор сахарозы. Еще более высокой степени чистоты достигают путем центрифугирования с градиентом плотности. Для этой цели освобожденный от клеток и остатков клеток, сконцентрированный с помощью зонального центрифугирования вирус выделяют путем изопикнического или зонального центрифугирования с градиентом плотности, например, 30 - 50 мас.% сахарозы в буферированном водном растворе при ускорении центрифугирования, например 100000 - 150000 g.

Для получения пригодных генов, которые кодируют иммуногенные протеины, сначала выделяют вирусный геном из очищенных вирусных частиц. Природную вирусную рибонуклеиновую кислоту (РНК) предпочтительно получают путем обработки очищенных вирусных частиц содержащими детергенты и протеазы водными растворами.

Используют анионные, катионные, амфотерные и неионные детергенты. Предпочтительно применяют ионные детергенты, предпочтительно додецилсульфат натрия, в концентрации 0,1 - 10 об.%, предпочтительно 0,5 - 3 об.%.

В качестве протеаз используют такие, которые эффективны в присутствии детергентов, как, например, проназа, и предпочтительно используют протеиназу K. Протеазы применяют в концентрации 0,01 - 10 мг/мл, предпочтительно 0,05 - 0,5 мг/мл.

Предпочтительно применяют водные буферированные растворы с добавкой рибонуклеазных ингибиторов.

В качестве буферных веществ применяют соли слабых кислот с сильными основаниями, как, например, трис(гидроксиметил)аминометан, соли сильных кислот со слабыми основаниями, как, например, первичные фосфаты или их смеси. Предпочтительно применяют трис(гидроксиметил)аминометан. Буферные вещества используют в концентрациях, обеспечивающих pH-значение, при котором РНК не денатурируется. Предпочтительны pH-значения 6 - 8,5, особенно предпочтительны 7 - 8.

В качестве рибонуклеазных ингибиторов служат, например, рибонуклеозидванадильные комплексы, протеиновые ингибиторы (например, РНК guard/Фармация) или предпочтительно диэтилпирокарбонат (ДЭПК), в концентрациях 0,01 - 2 об. %, предпочтительно 0,1 - 0,5 об.%.

Липофильные вещества вирусных лизатов затем экстрагируют растворителем, как, например, фенол, хлороформ или их смеси. Экстракцию осуществляют в одну или несколько стадий.

В остающейся водной фазе РНК осаждают с помощью водных растворов, которые содержат спирты, как, например, этанол или изопропанол, или хлориды или ацетаты одновалентных металлов, как, например, хлорид натрия, ацетат натрия или ацетат калия.

Концентрация спиртов составляет 40 - 100 об.%, предпочтительно 60 - 80 об.%, а концентрация хлоридов или ацетатов составляет 0,01 - 1 моль/л, предпочтительно 0,1 - 0,8 моль/л.

Осадившуюся РНК отделяют от водного раствора, например, путем центрифугирования и снова растворяют в водном растворе, например, водном растворе деэтилпирокарбоната. Этот водный раствор содержит предпочтительно буферные вещества, как, например, трис(гидроксиметил)аминометан, в концентрациях 1 - 100 ммоль/л, предпочтительно 10 - 50 ммоль/л, возможно при добавке этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в концентрациях 0,1 - 10 ммоль/л, предпочтительно 1 - 10 ммоль/л, или дитиотреита в концентрациях 0,1 - 10 ммоль/л, предпочтительно 1 - 10 ммоль/л.

Выделенную РНК хранят при температурах ниже -65oC.

Другим методом выделения РНК является, например, экстракция РНК с помощью гуанидинийтиоцианата и последующее центрифугирование вирусного лизата с градиентом плотности хлорида цезия.

Методы выделения РНК описываются J. Sambrook, E.F. Fritsh и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Идентифицирование пригодных генов осуществляют при применении выделенного вирусного генома, например, следующими путями:
а) гибридизация РНК/ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) генома при применении известных генных зондов. В качестве пригодных генных зондов служат ДНК-зонды с нуклеотидными последовательностями известных генов для иммуногенов родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
б) получение комплементарной ДНК (кДНК), клонирование кДНК, например, в бактериальных плазмидах, как, например, pBR 322, для накопления вирусной ДНК и гибридизация клонированной ДНК с помощью известных генных зондов. В качестве пригодных генных зондов служат ДНК-зонды с нуклеотидными последовательностями известных генов для иммуногенов родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
в) получение комплементарной ДНК (кДНК) и клонирование кДНК в плазмидных экспрессирующих векторах, как, например, pUC18/19 или pUC118/119, или в λ-бактериофаговых экспрессирующих векторах, как, например, λgtII и его потомки или λZAP или λORF8. Идентификацию генов осуществляют путем обнаружения их экспрессированных иммуногенов с помощью антител, которые прямо или косвенно обнаруживаются, например, путем иммунофлуоресценции или иммуноосаждения. Пригодными антителами являются такие, которые реагируют с иммуногенами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
г) получение комплементарной ДНК (кДНК) и клонирование кДНК, например, в бактериальных плазмидах для накопления вирусной ДНК. Вирусную ДНК клонов секвенируют и исследуют в отношении гомологий последовательностей с известными генами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
д) секвенирование кДНК при ее получении и исследование в отношении гомологий последовательностей с известными генами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2;
е) сочетание методов а) - д).

Методы гибридизации РНК/ДНК и ДНК/ДНК, получение кДНК, клонирование ДНК в плазмидных и бактериофаговых векторах, секвенирование ДНК, а также методы иммунологического обнаружения экспрессированных иммуногенов описываются в:
J. Sambrook, E.F. Fritsch и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989;
F. M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, изд. Jonn Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987;
A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, том III, изд. Густав Фишер, Штутгарт, 1989.

Выбирают такие гены, в случае которых вышеуказанными методами можно обнаружить нуклеотидную последовательность, которая кодирует один или несколько иммуногенов. В качестве примера в Протоколе последовательностей (см. в конце описания) приводятся нуклеотидные последовательности с соответствующими аминокислотными последовательностями гемаглютинин-нейраминидаза-гена и гена слитого белка парагриппозного вируса 2, депонированного в Национальной коллекции культур и микроорганизмов (Институт Пастера, Париж, Франция) под номером I - 1331.

Эти гены, которые кодируют один или несколько иммуногенов (чужеродная ДНК), вставляют в геномный вектор, который в случае инфекции клетки или организма экспрессирует чужеродный ген. Для этого пригодны векторные вирусы и векторные бактерии. Находят применение, например, апатогенные ДНК-вирусы, которые включают стабильный геном с известными областями вставок для приема 0,1 - 20 т.н. (1000 пар нуклеотидов) чужеродной ДНК, как, например, вирусы вакцины, вирусы герпеса или аденовирусы.

Для этого необходимо (α) сначала вставить ген или гены в шаттл-вектор, который содержит чужеродную ДНК, фланкированную от ДНК-последовательностей векторного вируса. Затем (β) ген или гены вставляют в геном векторного вируса, например, путем котрансфекции шаттл-вектора и векторного вируса.

Пригодными шаттл-векторами являются плазмидные и бактерифаговые векторы.

Примерами обычных плазмидных векторов являются pBR322, pUC18/19, pAT153, pACYC184 или pSP64/65, и примерами бактерифаговых векторов являются λgt10/11, λZAP или M13mp18/19.

(α) Вставка гена или генов в шаттл-вектор.

Сначала фрагмент ДНК, который содержит область вставки векторного вируса, вставляют в ДНК шаттл-вектора. Для этой цели как ДНК-последовательности известных областей вставок генома векторного вируса, так и также ДНК шаттл-вектора обрабатывают с помощью рестрикционных эндонуклеаз (ферменты рестрикции), чтобы определить пассирующие концы последовательности для вставки. Такого рода подготовленную ДНК шаттл-вектора смешивают с избытком вставляемого фрагмента ДНК, например, примерно в соотношении 1:5. ДНК-смесь обрабатывают ДНК-лигазами, чтобы связать ковалентно фрагмент ДНК в векторе.

При применении шаттл-плазмиды ее вводят в прокариотные или эукариотные клетки, предпочтительно бактерии, и размножают. Пригодна, например, Escherichia coli K12 и ее потомки.

Отбирают бактерии, которые включают несущую ДНК-фрагмент плазмиду.

Клонирование области вставки в шаттл-плазмидном геноме, его вставка в прокариотные или эукариотные клетки, размножение и селекция трансформированных бактерий подробно описываются J. Sambrook, E.F. Fritsch и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и F.M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, изд. Jonn Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987.

Если необходимо, используют так называемый "полилинкер" в областях вставок векторного вируса. Полилинкерами являются ДНК-последовательности по меньшей мере с двумя определенными местами расщепления ферментом рестрикции.

Для этого фрагмент ДНК, который содержит область вставки, обрабатывают с помощью такого фермента рестрикции, чтобы фрагмент открывался (расщеплялся) только в одной области. Таким образом подготовленный фрагмент вместе с полилинкером и ДНК-лигазой инкубируют для целевой вставки в определенные места расщепления ферментом рестрикции.

Полилинкер можно вставлять в выделенный или несущий клонированные в шаттл-векторе области вставок фрагмент ДНК.

Если в выделенные фрагменты ДНК вводят полилинкер, то их затем нужно вставлять в шаттл-вектор. При применении шаттл-плазмиды ее вставляют в прокариотные или эукариотные клетки, предпочтительно бактерии, и размножают. Пригодна, например, Escherichia coli K12 и ее потомки. Отбирают бактерии, которые включают содержащую фрагмент ДНК плазмиду.

Если в клонированный в шаттл-векторе фрагмент ДНК вводят полилинкер, то его размножают и селекционируют.

Гены, которые кодируют один или несколько иммуногенов (чужеродная ДНК), вставляют в области вставок.

Если необходимо, прежде всего удаляют частичные последовательности ДНК-фрагмента, который несет область вставки. Для этой цели ДНК-фрагмент обрабатывают с помощью ферментов рестрикции, и полученные фрагменты ДНК отделяют.

Для вставки чужеродной ДНК сначала выделенный или клонированный в шаттл-векторе фрагмент ДНК, который несет область вставки, обрабатывают с помощью одного или нескольких ферментов рестрикции, и фрагмент раскрывают в области вставки, соответственно во введенном полилинкере. Чужеродную ДНК вставляют в таким образом подготовленную область вставки, например, с помощью ДНК-лигаз.

Если чужеродную ДНК вставляют в выделенные фрагменты ДНК, то их затем нужно вставлять в шаттл-вектор. При применении шаттл-плазмиды ее вставляют в прокариотные или эукариотные клетки, предпочтительно бактерии, и размножают.

Пригодна, например, Escherichia coli K12 и ее потомки. Отбирают бактерии, которые содержат включающие чужеродную ДНК плазмиды.

Если чужеродную ДНК вставляют в клонированный в шаттл-векторе фрагмент ДНК, то ее размножают и селекционируют.

Методы получения шаттл-векторов подробно описываются J. Sambrook, E.F. Fritsch и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и P.M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, изд. Jonn Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987.

(β) Введение чужеродной ДНК в геном векторного вируса:
Для вставки чужеродной ДНК в геном векторного вируса можно применять следующие методы:
(I) котрансфекция пригодных клеток с помощью шаттл-векторной ДНК и выделенной природной векторной вирусной ДНК;
(II) трансфекция пригодных клеток с помощью шаттл-векторной ДНК и инфицирование с помощью векторного вируса;
(III) инфицирование пригодных клеток с помощью векторного вируса и трансфекция с помощью шаттл-вирусной ДНК.

Пригодные для этой цели методы подробно описываются J. Sambrook, E.F. Fritsch и T. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное руководство, второе издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и F.M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, изд. Jonn Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987.

Предпочтительно используют метод (I), который осуществляют по методике осаждений ДНК фосфатом кальция. Для этого необходимы следующие стадии:
(1) Шаттл-вектор размножают, выделяют и далее очищают. Очистку шаттл-векторной ДНК проводят, например, с помощью изопикнического центрифугирования с градиентом плотности, например, с градиентом плотности хлорида цезия.

Векторный вирус размножают и очищают. Вирусный геном выделяют и далее очищают. Очистку векторной вирусной ДНК осуществляют, например, с помощью изопикнического центрифугирования с градиентом плотности, например, градиентом плотности хлорида цезия.

(2) Для котрансфекции применяют кольцевую или предпочтительно линейную шаттл-векторную ДНК.

Линейную шаттл-векторную ДНК получают, например, путем обработки очищенной ДНК с помощью ферментов рестрикции. Предпочтительны ферменты рестрикции, которые не содержат никакого места распознавания (места расщепления) во вставленной чужеродной ДНК, то есть последовательность чужеродной ДНК не расщепляется.

(3) Векторную вирусную ДНК и шаттл-векторную ДНК смешивают, например, в соотношении 0,01 - 0,1 · 10-12 моль/л векторной вирусной ДНК к 1 - 3 · 10-12 моль/л шаттл-векторной ДНК.

(4) Смесь ДНК соосаждают, например, с фосфатом кальция и переносят в пригодные клетки.

Пригодными клетками являются клетки животных, в особенности перманентные линии клеток, как, например, клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 и их потомки), клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), клетки почек собак MDCK (ATCC CCL34 или их потомки) или клетки почек кроликов RK-13 (ATCC CCL37).

Котрансфекцию можно осуществлять также с помощью других методов. В качестве таковых следует, например, назвать диэтиламиноэтилдекстрановый метод, липосомный метод или электропорацию.

(5) Клетки культивируют, например, согласно подробно описанным выше методам. При появлении цитопатогенетического эффекта клоны векторного вируса выделяют по однозональному методу очистки и размножают далее.

Методы однозональной очистки описываются A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, том I, изд. Густав Фишер, Штутгарт, 1974.

(6) Селекцию рекомбинантных векторных вирусов осуществляют
(I) путем обнаружения экспрессии чужеродного гена или
(II) путем обнаружения вставленной чужеродной ДНК в векторный вирусный геном, например, за счет ДНК/ДНК-гибридизации:
(I) Обнаружение экспрессии чужеродной ДНК осуществляют, например, с помощью антител. Пригодными антителами являются такие, которые реагируют с иммуногенами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2. Генный продукт чужеродной ДНК можно обнаружить, например, путем иммунофлуоресценции или иммуноосаждения.

(II) Обнаружение вставленной чужеродной ДНК осуществляют путем гибридизации с генными зондами соответствующего чужеродного гена.

Стабильные рекомбинантные векторные вирусы размножают, выделяют и обрабатывают далее по обычным известным способам, как подробно описанные выше, и применяют в качестве антигенного материала.

В предлагаемых согласно изобретению вакцинах антигенный материал находится индивидуально или в смеси с обычными, вспомогательными для формулирования веществами. В качестве таковых следует назвать фармакологически приемлемые растворители или разбавители, добавки, консерванты, суспендирующие агенты или агенты растворения, как эмульгаторы.

Антигенный материал используют в качестве биологически активного вещества при формулировании вакцин.

Для приготовления живой вакцины применяют антигенный материал в форме живых вирусных частиц, к которому для стабилизации добавляют добавки и в случае необходимости также антивспениватели и консерванты. Для лучшей сохраняемости живую вакцину лиофилизируют путем сушки вымораживанием. Перед применением этой вакцины лиофилизированный продукт реконструируют с помощью растворителя, как, например, дистиллированная вода, очищенная вода или 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

Освобожденные от клеточного субстрата вирусные частицы в концентрации по меньшей мере 106 КИД50/мл смешивают вместе с защитными коллоидами, соответственно стабилизаторами, как, например, целлюлозы, декстраны, желатины, коллидоны или стеараты, и в случае необходимости при добавке антивспенивателей, как, например, трибутилфосфат, изопропанол или силиконовое масло, а также консервантов, как, например, мертиолат или тимеросал, в водном с буферированным pH-значением растворе вносят в соответствующие емкости и подвергают сушке вымораживанием.

Для приготовления убитых вакцин (инактивированные вакцины) в качестве антигенного материала применяют полные умерщвленные вирусные частицы в концентрации 104,0 - 109,0 КИД50/мл, предпочтительно 105,0 - 108,0 КИД50/мл, перед инактивацией, или отдельные части (субъединицы) вирусных частиц в такой концентрации, что на одну дозу для вакцинации содержатся 10 - 250 мг протеина, предпочтительно 10 - 100 мг протеина. Антигенный материал в вакцине находится в смеси с обычными вспомогательными для формулирования веществами, как растворители и разбавители, добавки, консерванты, суспендирующие агенты или агенты растворения, регулирующие pH-значение средства и в случае необходимости антивспениватели.

В качестве растворителей и разбавителей следует назвать дистиллированную воду, очищенную воду, физиологически приемлемые солевые растворы, а также среды для культур клеток. В особенности находят применение вышеуказанная минимальная необходимая среда Игла, а также буферированный фосфатом раствор хлорида натрия.

В качестве добавок следует назвать:
1) минеральные соли, как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция, каолин или кремний. Предпочтительно используют 10 - 50 об.%, предпочтительно 25 - 35 об.% геля гидроксида алюминия с долей гидроксида алюминия 1 - 5 мас.%/объем, предпочтительно 2 - 3 мас.%/объем;
2) масляные добавки, как нетоксичные минеральные масла (например, Драцеол, парафиновое масло), растительные масла (например, лецитин, арахисовые масла) или животные масла (сквалан, сквален), которые используются в концентрации 1 - 40 об.%, предпочтительно 1 - 15 об.%;
3) гидрофильные и гидрофобные полимеры, как полиэтиленоксид и полипропиленоксид. Предпочтительно используют синтетически полученные блок-сополимеры (например, Плюроник Л 101, Плюроник Л 121, Плюроник Л 122, Тетроник 1501) в концентрации 1 - 10 об.%;
4) добавки бактериального происхождения, как Pertussis-токсин (Bordetella pertussis), митоген Salmonella-typhimurium, или бактериальные эндотоксины, как липополисахариды (ЛПС, например, из микобактерий или сальмонелл), а также аналоги или производные липополисахаридов, как, например, липид-A, монофосфорил-липид-A (МФЛ), дифосфорил-липид-A (ДФЛ), трегалозодимиколат (ТДМ), мурамилдипептид (МДП) или адамантилдипептид (АлДП), а также их производные. Предпочтительно используют производные мурамилдипептида или адамантилдипептид в концентрации 0,0001 - 10 мас.%/объем;
5) органические диспергируемые в воде добавки, как холестерин, желатина, фосфатидилхолин, полисахариды (например, зимозан, агар), алифатические амины (например, диметилдиоктадециламин /ДДА/, N,N-диотадецил-N',N'-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин /Авридин/), диэтиламиноэтилдекстраны или сапонин (из коры Quillaja saponaria Molina) и производные сапонина (Квил A);
6) монокины и лимфокины, как, например, интерлейкин-1, интерлейкин-2 или γ-интерферон;
7) возможные сочетания из 1) - 6).

В качестве консервантов следует назвать формалин в концентрациях вплоть до 1%, фенол и бензиловый спирт в концентрациях вплоть до 0,5%, сорбиновую кислоту, бензойную кислоту, бензоат натрия, а также их производные, как, например, натриевая соль 2-(этилмеркурио-тио)бензойной кислоты (Мертиолат, Тимеросал, Тиомерсал) или натриевая соль 4-(этилмеркурио-тио)бензойной кислоты (Тиомерфонат). Предпочтительно используют Мертиолат в концентрациях 0,01 - 0,5%.

В качестве суспендирующих агентов следует назвать нетоксичные поверхностно-активные вещества, как растительные протеины, альгинаты, целлюлозы, фосфолипиды и в особенности вещества на основе простых гликолевых эфиров, как полиэтиленгликоли и их производные. Предпочтительно используют полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярными массами 200, 300, 400, 600 и 900, а также производные полиэтиленгликоля (Спан, Арлацел, Твин, Майри, Бриж), особенно предпочтительно Твин 80, в концентрации 0,05 - 5 об.%, предпочтительно 0,2 - 1 об.%.

В качестве регулирующих значение pH веществ следует назвать, например, гидроксид натрия и гидроксид калия, карбонат натрия и карбонат калия, уксусную кислоту, винную кислоту и лимонную кислоту или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислоту (Гепес).

В качестве антивспенивателей следует назвать трибутилфосфат, изопропанол, силиконовое масло, Антифоам или Байсилон, антивспениватель EBZ.

Предлагаемые согласно изобретению парагриппозные вирусы, которые вызывают заболевания респираторного и репродуктивного трактов свиней, можно получать, например, следующим образом.

У свиней, которые больны с подобными СРРС симптомами, извлекают органы и выделяют вирус. Особенно пригодны нежизнеспособные или больные поросята из инфицированного поголовья. У пригодного животного извлекают внутренние органы, в особенности легкие, печень, почки и селезенку. Части этих органов или смесей органов гомогенизируют с физиологически приемлемыми водными растворами до получения суспензий, причем доля частей органов составляет примерно 10 мас. %/объем. В качестве суспендирующего агента особенно пригодна вышеописанная минимальная необходимая среда Игла. Суспензии освобождают от клеток и остатков клеток путем центрифугирования с ускорением примерно 1500 g. Дальнейшую очистку надосадочной жидкости после центрифугирования можно осуществлять путем фильтрации. Для этой цели пригодны фильтры с размерами пор 0,2 - 5 мкм, предпочтительно 0,2 - 0,45 мкм.

Из извлеченных органов, предпочтительно из легких, также можно получать первичную культуру клеток, которую исследуют в отношении появления цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Для этой цели груборазмельченную ткань подвергают ферментативному разложению с помощью протеаз. Для этого особенно пригоден трипсин в концентрации 0,1 - 0,5 мас.%/объем, предпочтительно 0,125 - 0,25 мас. %/объем, в физиологическом водном растворе. Гидролиз трипсином осуществляют при 20 - 37oC, предпочтительно при комнатной температуре, в течение 2 - 8 ч. Не подвергшиеся гидролизу составные части ткани отделяют путем фильтрации через крупнопористый фильтр. Подвергнувшиеся гидролизу трипсином клетки выделяют путем центрифугирования при 500 - 1500 g. Осадок клеток снова суспендируют в пригодной среде для выращивания, как, например, в описанной минимальной необходимой среде Игла, и в концентрации 105 - 106 клеток на 1 мл среды высевают в емкости для культивирования. В зависимости от скорости роста среду для выращивания меняют каждые 3 - 7 дней. Рост клеток и появление цитопатогенного эффекта исследуют ежедневно. Дополнительно можно анализировать в отношении гемагглютинирующих свойств надосадочную жидкость культур клеток в постоянные промежутки времени 2 - 7 дней.

Надосадочные жидкости после центрифугирования, соответственно фильтраты гомогенатов органов, а также надосадочные жидкости культур клеток из полученных первичных культур органов при разбавлении от 1:1 до 1:1000, предпочтительно от 1:10 до 1:100, наносят на первичные или перманентные культуры клеток молочной железы и инкубируют при 32 - 39oC, предпочтительно при 37oC, в течение нескольких дней. Для этой цели применяют расы клеток, которые выросли до слияния на 20 - 100%, предпочтительно 80 - 100%. Культуры клеток ежедневно исследуют в отношении появления цитопатогенного эффекта. Дополнительно можно анализировать в отношении гемагглютинирующих свойств надосадочную жидкость культуры клеток в постоянные промежутки времени 2 - 7 дней. Если не появляются никакие признаки размножения вируса, то надосадочные жидкости культуры клеток пассируют далее в указанных разбавлениях на свежих культурах клеток. Этот процесс можно повторять многократно.

При появлении признаков размножения вируса путем дальнейших пассажей вирус адаптируют к применяемой культуре клеток.

У абортирующей свиноматки, которая происходит из поголовья с подобными СРРС симптомами, путем аутопсии извлекают еще находившегося в матке поросенка. Из легких этого поросенка путем получения первичной культуры клеток легких и путем пассажей с получающейся из нее культуральной надосадочной жидкости в линиях клеток животных выделяют цитопатогенный действующий фактор. Он характеризуется как содержащий оболочку, гемагглютинирующий, размером примерно 200 нм, однонитевой РНК-вирус, который согласно анализу на электронном микроскопе имеет морфологию парамиксовируса. Протеины этого вируса распознаются путем Вестерн-блотирования антисыворотки по отношению к парагриппозному вирусу типа 2 (ПГВ-2). В одной и той же тест-системе полученная по отношению к изолированному вирусу антисыворотка распознает штамм парагриппозного вируса типа 2 "ОВ 5", что говорит о серологическом родстве выделенного вируса с парагриппозным вирусом типа 2.

Этот парагриппозный изолят с названием SER"хранится с 12.06.1993 г. в "Национальной коллекции культур и микроорганизмов" Института Пастера, Париж, Франция, под номером I - 1331.

Выделенный вирус может размножаться в большом масштабе при применении культур клеток животных. Из таким образом полученных вирусных суспензий с помощью пригодного технического способа (центрифугирование, тангенциальная фильтрация) можно приготовлять очищенные антигенные препараты. Их можно использовать в качестве исходного материала для диагноза и предохранения свиней от респираторных и репродуктивных заболеваний, в особенности свиного репродуктивного и респираторного синдрома.

Пример 1
Выделение парагриппозного изолята SER
Парагриппозный изолят SER можно выделить из легких поросенка, извлеченного из матки при аутопсии эвтаназированной, абортирующей свиноматки, которая происходит из поголовья с подобными СРРС симптомами.

PK-15 Клетки (клонированные клетки свиных почек, ATCC N CCL33)
Минимальная необходимая среда Игла с солями Эрле (E-MEM):
E-MEM-порошок с феноловым красным (например, Гибко БРЛ 072-0110) - Для 100 л
Заменимые аминокислоты, готовый раствор, 100-кратное разбавление - 1000 мл
Неомицинсульфат - 3 г
Полимиксин-Б-сульфат - 3 МЕ
Очищенная вода (EP 8) - До 100 мл
Заменимые аминокислоты, готовый раствор, 100-кратное разбавление:
Аланин (EP 752) - 8,9 г
Моногидрат аспарагина (DAB 10) - 15,0 г
L-аспарагиновая кислота - 13,2 г
Глицин (EP 614) - 7,5 г
Глутаминовая кислота (EP 750) - 14,5 г
Пролин (EP 785) - 11,5 г
Серин (EP 788) - 10,5 г
Очищенная вода (EP 8) - До 10 л
плодная телячья сыворотка (ПТС, например, Гибко БРЛ 012-06290)
среда для выращивания: E-MEM с 2,0 г/л гидрокарбоната натрия и 2% ПТС
поддерживающая среда: E-MEM с 0,85 г/л гидрокарбоната натрия и 5% ПТС
0,25%-ный раствор трипсина (например, Гибко БРЛ 043-05050)
Буферированный фосфатом раствор хлорида натрия:
Хлорид натрия - 8,0 г
Хлорид калия - 0,2 г
Дигидрофосфат калия - 0,2 г
Динатрийфосфат с 12 молекулами воды - 2,9 г
Очищенная вода (EP 8) - До 1000 мл
Поверхность тканевой культуры 80 см2 (Раукс - поверхность, например, Грейнер 658170).

Часть извлеченных в стерильных условиях легких поросенка грубо размельчают с помощью ножниц и подвергают ферментативному разложению в 0,25%-ном растворе трипсина. Гидролиз с помощью трипсина осуществляют при перемешивании при комнатной температуре в течение 4 ч. Крупные куски ткани отделяют в стерильном фильтре из тканого сита. Фильтрат промывают трижды с помощью буферированного фосфатом раствора хлорида натрия при центрифугировании с небольшим числом оборотов (1000 g, 10 мин). Клетки высевают в E-MEM при добавке 5%-ной плодной телячьей сыворотки в концентрации 10 клеток/мл на поверхность для культивирования 80 см2 и инкубируют при 37oC. Среду для выращивания заменяют каждые 4 - 5 дней. За ростом этой первичной культуры следят ежедневно путем наблюдения в микроскоп. При этом в особенности обращают внимание на появление цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Спустя примерно две недели можно обнаружить цитопатогенный эффект в форме округляющихся сморщивающихся клеток с медленной тенденцией к распространению. Культуральную надосадочную жидкость первичных клеток разбавляют 1:10 поддерживающей средой и инфицируют слившийся монослой культурами PK-15 клеток на поверхности культуры 80 см2 (инкубационный объем 40 мл). Для контроля от каждой клетки оставляют неинфицированную культуру. После инкубации в течение 7 дней развивается цитопатогенный эффект с начинающимся перфорированием. Культуру подвергают процессу замораживания-оттаяния и инфицируют надосадочную жидкость, разбавленную в соотношении 1:10 свежей культурой, эту надосадочную жидкость спустя 6 - 7 дней исследуют в тесте на гемагглютинацию при применении куриных эритроцитов. В четвертом пассаже после инкубации в течение 6 дней обнаруживают культуры примерно со 100%-ным цитопатогенным эффектом. Положительные в тесте на гемагглютинацию надосадочные культуральные жидкости хранят при -70oC.

Пример 2
Размножение парагриппозного изолята SER
Материал: парагриппозный изолят SER, базисный посевной материал
Клетки PK-15 (клонированные клетки почек свиней, ATCC N CCL33)
Mинимальная необходимая среда Игла с солями Эрле (E-MEM)
Порошок E-MEM с феноловым красным (например, Гибко БРЛ 072-0110) - Для 100 л
Заменимые аминокислоты, готовый раствор, 100-кратное разбавление - 1000 мл
Неомицинсульфат - 3 г
Полимиксин-Б-сульфат - 3 МЕ
Очищенная вода (EP 8) - До 100 л
плодная телячья сыворотка (ПТС, например, Гибко БРЛ 012-06290)
среда для выращивания: E-MEM с 2,0 г/л гидрокарбоната натрия и 2% ПТС
поддерживающая среда: E-MEM с 0,85 г/л гидрокарбоната натрия и 5% ПТС поверхность тканевой культуры 80 см2 (Раукс - поверхность, например, Грейнер 658170)
ванный штабель, 6000 см2 (например, Нунк 164327)
Методика.

Среду для выращивания декантируют с поверхности тканевой культуры, обросшей конфлюэнтно клетками PK-15 и поверхность тканевой культуры покрывают 40 мл базисного посевного вирусного материала, разбавленного в среде для получения 1: 50. После инкубации в течение 7 дней при 37oC подвергнутое процессу замораживания - оттаяния и суспендированное с помощью ультразвука содержимое поверхности тканевой культуры дополняют поддерживающей средой до объема 3000 мл и инфицируют конфлюэнтно обросший клетками PK-15 ванный штабель. После инкубации в течение 7 дней при 37oC надосадочную культуральную жидкость собирают и хранят при -70oC вплоть до дальнейшей переработки.

Пример 3
Приготовление убитой вакцины (парагриппозный изолят SER)
Материал: парагриппозный изолят SER, надосадочная жидкость культуры клеток из процесса размножения вируса
0, 5 М готовый раствор 2-бромметиламин-гидробромида:
2-Бромметиламин-гидробромид (BrCH2CH2NH2HBr, Мерк 820176) - 102,5 г
Очищенная вода (EP 8) - До 1000 мл
2,5 М готовый раствор тиосульфата натрия:
Пентагидрат тиосульфата натрия (EP 414) - 620,5 г
Очищенная вода (EP 8) - До 1000 мл
3%-ная суспензия гидроксида алюминия (например, Суперфос)
1%-ный готовый раствор Квил A:
Квил A (например, Суперфос) - 10,0 г
очищенная вода (EP 8) - До 1000 мл
2%-ный готовый раствор Тимеросала
Тимеросал (C9H9HgNaO2S) - 50,0 г
Очищенная вода (EP 8) - До 1000 мл
Буферированный фосфатом раствор хлорида натрия:
Хлорид натрия - 8,0 г
Хлорид калия - 0,2 г
Дигидрофосфат калия - 0,2 г
Динатрийгидрофосфат с 12 молекулами воды - 2,9 г
Очищенная вода (EP 8) - До 1000 мл
Надосадочную жидкость размноженного на культурах клеток вируса освобождают от клеток и остатков клеток путем центрифугирования при 10000 g. Таким образом очищенную вирусную суспензию с концентрацией вирусных частиц 106,0 КИД50/мл, происходящих из одного или нескольких сборов вирусов, переносят в стерильный сосуд. Устанавливают pH-значение равным 8,4 с помощью 2 н. раствора гидроксида натрия. При постоянном перемешивании добавляют такое количество 0,5 М раствора 2-бромметиламин-гидробромида, чтобы достичь конечной концентрации 2-бромметиламин-гидробромида, равной 5 ммоль/л. Инактивацию вируса осуществляют в течение 18 ч при 37oC. Затем инактивирующий агент нейтрализуют при 4oC путем добавки 2,5 М раствора тиосульфата натрия вплоть до конечной концентрации 50 ммоль/л.

К 31 мл стерильной суспензии гидроксида алюминия (3% гидроксида алюминия, pH = 7,3) добавляют 62 мл инактивированной вирусной суспензии и перемешивают в течение 2 ч при 4oC. После добавки 1,25 мл Квила A (2%-ный раствор) и 0,1 мл Тимеросала (2%-ный раствор) дополняют до 100 мл с помощью буферированного фосфатом раствора хлорида натрия и перемешивают следующие 20 ч при 4oC. Готовой вакциной заполняют емкости, включающие многократные дозы вакцины, и хранят при 4oC.

Вакцинацию свиней всех возрастов проводят путем подкожного введения 2 мл этой вакцины.

Публикации, относящиеся к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют иммуногены обезьяньего вируса 5:
Hiebert, S. W., Paterson, R.G. and Lamb, R.A. (1985). Hemagglutinin-neuraminidase protein of the paramyxovirus simian virus 5: nucleotide sequence of the mRNA predicts a N-terminal membrane anchor. Journal of Virology, 54, 1 - 6.

Hiebert, S.W., Paterson, R.G. and Lamb, R.A. (1985). Identification and predicted sequence of a previously unrecognized small hydrophobic protein, SH, of the paramyxovirus simian virus 5. Journal of Virology, 55, 744 - 751.

Paterson, R.G., Harris, T.J.R. and Lamb, R.A. (1984). Analysis and gene assignment of mRNAs of a paramyxovirus, simian virus 5. Virology, 138, 310 - 323.

Paterson, R.G., Harris, T.J.R. and Lamb, R.A. (1984). Fusion protein of the paramyxovirus simian virus 5: nucleotide sequence of the mRNA predicts a highly hydrophobic glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6706 - 6710.

Paterson, R. G., Hiebert, S.W. and Lamb, R.A. (1985). Expression at the cell surface of biologically active fusion and hemagglutinin/neuraminidase proteins of the paramyxovirus simian virus 5 from cloned cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7520 - 7524.

Thomas, S., Lamb, R.A. and Paterson, R.G. (1988). Two mKNAs that differ by two nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramyxovirus SV5. Cell, 54, 891 - 902.

Реферат

Вакцина против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома содержит активное вещество и целевые добавки, при этом в качестве активного вещества применяют парагpиппозные вирусы 2 типа, в частности штамм SER, в живой, мертвой, ослабленной или полученной путем рекомбинантной технологии форме, целиком или в виде частей или фрагментов в эффективном количестве. Вакцина применяется для выработки у животного иммунитета против СРРС.

Формула

Вакцина против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит парaгриппозные вирусы 2 типа, в частности штамм SER, в живой, мертвой, ослабленной или полученной путем рекомбинантной технологии форме, целиком или в виде частей или фрагментов в эффективном количестве.

Патенты аналоги

Авторы

Патентообладатели

Заявители

0
0
0
0
Невозможно загрузить содержимое всплывающей подсказки.
Поиск по товарам