Температурочувствительный штамм вируса аборта лошадей ehv-1, фармацевтическая композиция, вакцина испособ иммунизации животного - RU2252253C2

Описание

ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение относится к мутантному вирусу аборта лошадей, к способу получения указанного мутанта, к использованию указанного мутанта и к живым вакцинам, полученным на основе этого мутанта.

Вирус аборта лошадей (EHV-1), герпесвирус, является главным патогеном лошадей, ответственным за вирусиндуцированный аборт, неврологическое заболевание, такое как парез, инфекции верхних дыхательных путей и болезни новорожденных жеребят (БНЖ). БНЖ вызываются трансплацентарной инфекцией плода, возникающей в близкий к родам срок, при этом жеребенок рождается слабым с тяжелым респираторным заболеванием, а иногда с желтухой, обусловленной инфицированием печени вирусом EHV-1. Эти животные обычно умирают через несколько дней после рождения. Вирус ринопневмонита лошадей (EHV-4) является главной причиной острых заболеваний дыхательных путей (“ринопневмонит”) и вызывает инфекции у большинства лошадей во время первых двух лет их жизни. Ринопневмонит характеризуется лихорадочным состоянием, анорексией и обильными выделениями из носа, которые позднее переходят в гнойные выделения. В редких случаях инфекция EHV-4 вызывает аборт у жеребых кобыл. Кроме того, EHV1 и EHV4 приводит к установлению персистентных долгоживущих латентных инфекций. После реактивации эти вирусы вызывают рецидивирующее заболевание, сопровождающееся выделением вируса и переносом его на других животных.

Борьба с герпесвирусной инфекцией у лошадей и с их заболеваниями, а в частности, с EHV-1-опосредованным абортом лошадей, парезом и с болезнями новорожденных жеребят, вызываемыми трансплацентарной инфекцией плода, возникающей в близкий к родам срок, не дает удовлетворительных результатов. Несмотря на то, что инактивированные, а также модифицированные живые вакцины являются доступными, очевидно, что ни одна из этих вакцин не блокирует в достаточной степени инфекцию и не предупреждает возникновения латентной инфекции, вызываемой вирусом дикого типа. Поэтому существует крайняя необходимость в получении безопасных вакцин с улучшенными защитными функциями против полевых инфекций, вызываемых этими вирусами, а в частности, против инфекций, вызываемых EHV1.

Настоящее изобретение относится к таким вакцинам.

В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к мутанту Ts EHV-1, депонированному в Европейской коллекции клеточных культур животных (ЕСАСС), Salisbury, Wiltshire SP4 ОJG, UK, 10 июня 1999 под номером доступа V99061001, и к его потомству.

Мутанты Ts EHV-1 настоящего изобретения, кроме того, фенотипически характеризуются тем, что:

они образуют небольшие бляшки при их росте на нескольких линиях клеток лошадей,

они теряют свою способность расти на клетках почки кроликов, а в частности, на клетках RK13 и

они обладают ограниченной способностью вызывать виремию.

Мутанты Ts EHV-1 настоящего изобретения имеют то преимущество, что их репликация ограничена верхними дыхательными путями обыкновенной лошади, не вызывая при этом виремии или вызывая ограниченную виремию. Мутанты Ts являются безопасными для жеребых кобыл, но при этом они обеспечивают значительную иммунную стимуляцию после размножения в верхних дыхательных путях. Мутанты Ts не легко переходят от животного к животному, что ограничивает возможность их передачи и реверсии.

В соответствии с настоящим изобретением, термин “потомство” относится также ко всем штаммам, полученным путем последующего серийного пассажа депонированного мутанта Ts EHV-1.

В соответствии с настоящим изобретением, температурочувствительный мутант определяется как мутантный вирус, который обнаруживает недостаточный рост при определенной или близкой к ней температуре, при которой вирус дикого типа обнаруживает нормальный рост. Мутанты Ts EHV-1 настоящего изобретения характеризуются тем, что они являются температурочувствительными при температуре тела животного. Мутанты Ts EHV-1 настоящего изобретения не реплицируются при температуре выше 38,5-39,0°С. Мутанты Ts EHV-1 настоящего изобретения предпочтительно не реплицируются при температуре 38,5° С.

В соответствии с настоящим изобретением, термин “небольшие бляшки” означает бляшки, которые по своему размеру составляют половину или треть от размера бляшек, образуемых родительским штаммом дикого типа в клетках лошадей.

В соответствии с настоящим изобретением, выражение “ограниченная способность вызывать виремию” означает способность не индуцировать или индуцировать у некоторых животных низкий (то есть лишь детектируемый) уровень виремии в течение 1-3 или 4 дней по сравнению со способностью родительского штамма вызывать виремию.

Температурочувствительные мутанты EHV-1 настоящего изобретения могут быть получены путем обработки коровьих, лошадиных или других пермиссивных клеточных культур при 34°С нетоксичными концетрациями мутагенов, таких как, 5-бром-2-дезоксиуридин, азацитидин и т.п., в процессе репликации вируса in vitro с последующим биологическим клонированием потомства вируса из указанных обработанных культур в бычьих, лошадиных или других пермиссивных клеточных линиях.

Благоприятные свойства Ts-мутантов настоящего изобретения делают их весьма подходящими для получения вакцины. Таким образом, во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, а в частности к вакцинной композиции, содержащей Ts-мутант EHV-1 настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Более конкретно, (вакцинная) композиция настоящего изобретения включает Ts-мутант EHV1, депонированный в (ЕСАСС), Salisbury, UК, под номером доступа V99061001, и/или к его потомству. Фармацевтически приемлемыми носителями или наполнителями, подходящими для использования в вакцине настоящего изобретения, являются стерилизованная вода, физиологический раствор, водные буферы, такие как PBS и т.п. Кроме того, вакцина настоящего изобретения может содержать другие добавки, такие как адъюванты, стабилизаторы, антиоксиданты и т.п.

Вакцинные композиции настоящего изобретения являются безопасными и могут быть использованы для клинической и вирусологической защиты лошадей от инфекций EHV-1 и для защиты от вирус-индуцированных абортов и парезов. Кроме того, было обнаружено, что вакцина настоящего изобретения уничтожает трансплацентарную инфекцию и таким образом защищает новорожденных жеребят от болезней. Вакцинная композиция настоящего изобретения может быть введена не только лошадям, но также и другим животным, восприимчивым к инфекции EHV-1, таким как ослы, зебры и т.п. Предусматривается, что крупный рогатый скот, который является восприимчивым к инфекции EHV-1 и EHV-4, может быть обработан вакциной настоящего изобретения.

Кроме того, было неожиданно обнаружено, что вакцины, содержащие Ts-мутант EHV-1 настоящего изобретения, не только защищают от инфекций EHV-1, но также и от болезней и от ассоциированного с ними выделения вируса после инфицирования вирусом EHV-4. Таким образом, указанная вакцина может быть использована для перекрестной защиты вакцинированных лошадей. Указанные вакцины дают улучшенную защиту, эффективно блокируя, инфицирование вирусами дикого типа.

Вакцинные композиции настоящего изобретения могут быть получены стандартными методами. Предпочтительной вакциной настоящего изобретения является живая вакцина. Для получения живой вакцины исходный вирус Ts-мутанта EHV может быть культивирован на клеточной культуре, такой как первичные или вторичные клетки почки коровы или лошадиные клетки. Культивированные таким образом вирусы могут быть собраны путем сбора жидких культур клеток тканей и/или клеток. В процессе сбора выход данных вирусов может быть, но необязательно, стимулирован методами, которые облегчают высвобождение инфекционных частиц из субстрата для роста, например, путем обработки ультразвуком. Указанная живая вакцина может быть получена в форме суспензии, либо она может быть лиофилизована.

Фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут быть использованы в вакцине настоящего изобретения, являются стерилизованная вода, физиологический раствор, водные буферы, такое как PBS и т.п. Кроме того, вакцина настоящего изобретения может содержать другие добавки, такие как адъюванты, стабилизаторы, антиоксиданты и т.п.

Подходящими стабилизаторами являются, например, углеводы, включая сорбит, маннит, крахмал, сахарозу, декстран и глюкозу, белки и продукты их разложения, включая, но не ограничиваясь ими, альбумин и казеин, белоксодержащие агенты, такие как бычья сыворотка или сепарированное молоко, и буферы, включая, но не ограничиваясь ими, фосфаты щелочных металлов. В лиофилизованные вакцинные композиции предпочтительно добавлять один или несколько стабилизаторов.

Подходящими адъювантами включают, но не ограничиваясь ими, гидроксид, фосфат или оксид алюминия, амфиген, токоферолы, монофосфенил-липид А, мурамил-дипептид, масляные эмульсии, глюканы, карбомеры, блок-сополимеры, цитокины и сапонины, такие как Quil А. Количество добавляемого адъюванта зависит от природы этого адъюванта.

Ts-мутанты EHV-1 настоящего изобретения предпочтительно вводят обычным серонегативным животным в возрасте от нескольких дней до нескольких лет, включая жеребых кобыл. Указанная вакцина может быть введена животным непарентеральными способами введения, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное введение, введение путем распыления, аэрозольное введение, внутриглазное и интраназальное введение. Альтернативно указанная вакцина может быть введена парентеральными способами введения. Указанную вакцину предпочтительно вводят подкожно или интраназально.

В основном Ts-мутантный вирус EHV-1 вводят в количестве, эффективном для индуцирования защиты от EHV-1-инфекции. Доза обычно зависит от пути введения, времени введения, а также от возраста, состояния здоровья и рациона вакцинируемого животного. Указанный вирус может быть введен в количестве от 10² до 10⁹, предпочтительно от 10³ до 10⁵ б.о.е./дозу, а более предпочтительно 10² б.о.е./дозу на животное.

Вакцины настоящего изобретения также могут быть введены одновременно или поочередно с другими живыми или инактивированными вакцинами. Указанные дополнительные вакцины могут быть введены не-парентерально или парентерально. Эти дополнительные вакцины рекомендуются предпочтительно для парентерального введения.

Примеры

1. Выделение и оценка температурочувствительного мутантного штамма TS C147 EHV-1

Почти конфлюентные однодневные 75 см² монослои клеток кожи лошадей инфицировали при множественности заражения (МЗ) 0,001 EHV-1. Инокулят (2,0 мл) адсорбировали (1 час, 37°С), удаляли и монослои промывали PBS, а затем повторно подпитывали средой для культивирования ткани (25 мл), содержащей 40 мкг/мл 5-бром-2-дезоксиуридина, и инкубировали при 34°С. При максимальном ЦПД (7 дней после инокуляции) культуру собирали (замораживали при -40°С, а затем оттаивали при 37°С), диализовали в течение ночи против PBS при 4°С, титровали на EHV-1-инфекционность в клетках ED при 37°С, а затем клонировали при 34°С в клетках ED, культивированных в 96-луночных планшетах для микротитрования. Лунки с одним очагом EHV-1 индентифицировали, оставляли для культивирования до максимального ЦПД, а затем небольшой (20 мкл из общих 200 мкл) образец использовали для фенотипического типирования при пермиссивной или ограничивающей температурах с использованием клеток ED. Затем температурочувствительные клоны пассировали, на клетках почек телят линия JCK (Jay's Calf Kidney-Intervet), для получения исходного и рабочего посевного материала.

2. Температурочувствительный фенотип штамма TS C147 EHV-1

Штамм TS C147 EHV-1 на уровне исходного вакцинного вируса (MSV)+1° титровали параллельно в клетках легкого бычьего эмбриона (линия BEL26-Intervet), в клетках почки теленка, линия JCK (Jay's Calf Kidney- Intervet), в клетках кожи лошади (ED), и в клетках клона W7 С5 кожи лошади (линия ED- W7 С5 -Intervet) при 37°С и 38,5°С. Вирус на уровне (MSV)+1°-пассажа не обнаруживал роста при 38,5°С. Результаты представлены в таблице 1.

3. Штамм TS C147 EHV-1 имеет EHV-4-подобные характеристики

Критерием дифференциации между EHV-1 и EHV-4 является их способность реплицироваться в клетках почки кролика (RK13). Штаммы EHV-1 хорошо реплицируются в клетках RK13, однако, эти клетки невосприимчивы к штаммам EHV-4. Штамм TS C147 EHV-1 на уровне (MSV)+1°, его родительский штамм EHV1 дикого типа, штамм EHV-1, дефицитный по предраннему гену (IE EHV-1), патогенный штамм CHLi EHV-1 и полевой изолят EHV-4 титровались параллельно при 37°С в клетках RK13 и в клетках кожи лошади (ED). Результаты, представленные в таблице 2, показали, что 4 штамма EHV-1, включая штамм TS C147 EHV-1 и штамм EHV-4 реплицируются в клетках ED, однако, штамм TS C147 EHV-1 и штамм EHV-4 не обнаруживают роста в клетках RK13.

Таблица 1. Относительные титры штамма TS C147 EHV-1 при 37°С и 38,5°С в различных линиях клеток коров и лошадей

а) Титры после 5-дневного инкубирования; титры, представленные как <1,1 log₁₀ ТСID₅₀/мл, не давали очагов EHV-1, детектируемых при самом низком разведении 4×200 мкл (10^-1) вируса, тестируемого при титровании.

Таблица 2. Способность клеток почки кролика поддерживать репликацию штамма TS C147 EHV-1

а) Титры, представленные как <1,1 log₁₀ ТСID₅₀/мл, не давали ЦПД EHV-1, детектируемого при самом низком разведении 4×200 мкл (10^-1) при титровании.

4. Клиническая и вирусологическая защита обыкновенных пони от EHV-1- и EHV-4-инфекций

Из 29 обыкновенных пони со слабо EHV-1-нейтрализующим или вообще не нейтрализующим EHV-1 антителом, (ВН), 15 животных интраназально (i.n.) вакцинировали дозой 5,3 log₁₀ TCID₅₀ штамма TS C147 EHV-1, a 14 пони оставляли невакцинированными в качестве невакцинированного контроля. Через 1 месяц после одной вакцинации (i.n.), 8 вакцинированных и 8 невакцинированных (контрольных) пони подвергали заражению (i.n.) полевым штаммом EHV-1, а группу из 7 EHV-1-вакцинированных и 6 контрольных животных подвергали заражению (i.n.) свежим полевым изолятом EHV-4. После вакцинации и заражения животных непрерывно контролировали клинические реакции, выделение вируса в носовую слизь, инфицированные лейкоциты (виремию) и EHV-1-нейтрализующие антитела.

У 11/15 пони вакцинный вирус размножался до низких титров (максимальные титры в носовой слизи составляли 1,5-3,0 log₁₀ TCID₅₀/мл) в течение 1-8 дней, а у 7 из 15 животных в течение 1-4 дней он также приводил к виремии с низким уровнем лейкоцитов (лишь детектируемым). Однако все 15 пони были сероконвертированными. В противоположность этому EHV-1 не выделялся из носовой слизи или из крови у 14 контрольных пони, наблюдаемых ежедневно в течение 10 или 14 дней соответственно, и эти животные оставались серонегативными по EHV-1 и после проведения заражения. Аналогичный уровень гипертермии наблюдался у 10 животных в каждой из двух (вакцинированной и контрольной) групп. Эти результаты систематизированы в таблице 3.

После интраназального EHV-1-заражения наблюдалось значительное снижение выхода вируса в носовую слизь у вакцинированных пони по сравнению с выходом вируса у контрольных животных. Аналогичным образом единственная вакцинация предупреждала лейкоцитарную виремию у 7 из 8 пони, в то же время одна пони была почти вирусположительной в течение 1 дня. В противоположность этому почти у всех 8 невакцинированных пони наблюдалась виремия, у 7 пони - в течение 3-4 дней, а у 1 пони - 1 день. Все 8 контрольных пони имели повышенную температуру от умеренной до высокой в течение 1-6 дней, а все 8 вакцинированных животных оставались здоровыми. Ни у одного из 8 вакцинированных животных не наблюдалось анамнестической реакции на заражение, тогда как у всех 8 контрольных животных наблюдался ответ с образованием значительного количества EHV-1-нейтрализующего антитела. Эти результаты систематизированы в таблице 4.

После интраназального заражения EHV-4 вирус выделялся из носовой слизи у одной из 7 вакцинированных пони в одном случае, тогда как у всех 6 контрольных пони вирус выделялся при довольно высоком титре на 2-3-й день, за исключением лишь одной пони. Ни у одной из 7 EHV-1-вакцинированных пони не возникала виремия, в отличие от 3 из 6 контрольных пони, у которых наблюдалась виремия на 1-3-й день. Заражение EHV-4 приводило к гипертермии у 3 из 6 контрольных животных на 2-3-й день, но ни у одной из 7 вакцинированных пони этой гипертермии не наблюдалось. У 4 из 7 вакцинированных животных и у 5 из 6 контрольных животных наблюдалось небольшое увеличение частоты дыхания (15-20 выдохов/минут) в течение 1-3 и 2-6 дней соответственно. Эти результаты систематизированы в таблице 5.

Защита лошадей от пареза и абортов, вызванных EHV-1-инфекцией

Из 12 жеребых кобыл со слабо EHV-1-нейтрализующим или вообще ненейтрализующим EHV-1 антителом, (VN), 6 животных интраназально (i.n.) вакцинировали примерно в течение 6 месяцев беременности, а затем все 12 кобыл подвергали заражению (i.n.) патогенным штаммом EHV-1 на стадии беременности, которая является критической для EHV-1-индуцируемых абортов, а именно примерно на 9-м месяце беременности. После вакцинации заражения животных непрерывно контролировали клинические реакции, выделение вируса в носовую слизь, инфицированные лейкоциты (виремию) и EHV-1-нейтрализующее антитело.

Хотя вакцинный вирус не выделялся из носовой слизи ни у одной из 6 вакцинированных кобыл, однако, у 5-6 кобыл обнаруживалась слабая (временная) виремия (1-3 дня), и у всех 6 животных наблюдалась сероконверсия с образованием значительного уровня антитела VN против EHV-1. Ни у одной из 6 контрольных кобыл, которых наблюдали параллельно с вакцинированными животными в течение 10-14 дней, не обнаруживалось выхода EHV-1 из носовой слизи или из лейкоцитов, однако, у одного из 6 животных, примерно через 2,5 месяца, наблюдалась сероконверсия. Эти результаты систематизированы в таблице 6.

После заражения наблюдалось значительное (2 из 6 по сравнению с 5 из 6 и 1,5-1,7 (1,5-3,0 log₁₀ TCID₅₀/мл, в течение 1-2 дней по сравнению с 245-3,7 log₁₀ TCID₅₀/мл, в течение 1-6 дней) снижение выхода вируса в носовую слизь у вакцинированных кобыл. Аналогичным образом ни у одной из 6 вакцинированных кобыл не наблюдалось виремии, тогда как у 5 из 6 невакцинированных контрольных кобыл виремия наблюдалась. В контрольной группе у 5 из 6 кобыл наблюдалась высокая температура в течение 1-5 дней, у 3 кобыл также развивался парез, сопровождающийся тяжелой желтухой, а у 2 кобыл наблюдалась дезинтергация слизистой пробки в шейке матки с признаками выкидыша плода. Одно из двух животных погибло, а 2-е животное было срочно подвергнуто эвтаназии. Оба животных имели мертвых жеребят. У трех кобыл наблюдались аборты. Ткани плода от всех 5 эмбрионов были положительными на EHV-1. В противоположность этому у всех 6 вакцинированных кобыл были здоровые жеребята. Клиническая реакция, наблюдаемая только у вакцинированных кобыл, представляла собой кратковременную (1 день) гипертермию у одной из 6 кобыл. Контрольная кобыла, у которой был нормальный жеребенок, в действительности обнаруживала сероконверсию непосредственно перед заражением. Эти результаты систематизированы в таблице 7.

^а = не наблюдали, поскольку животных держали в изоляции от вакцинированной группы.

Таблица 7: Результаты после заражения

Результат - Количество +vе/общее количество (диапазон максимальной активности и продолжительность)

+ Контрольная кобыла показала серонегативный результат при взятии проб крови через 3 месяца после вакцинации кобыл группы 1, но обнаруживала сероконверсию перед заражением.

6. Безопасность TS C147 EHV-1 для жеребых кобыл

Четыре кобылы примерно на 9 месяце беременности (критическая стадия для EHV-1-абортов) были инокулированы естественным способом 10-кратной протективной дозой и их наблюдали на аборты. Результаты, представленные в таблице 8, показали, что у всех 4 кобыл наблюдалась сероконверсия по EHV-1, a у одной из 4 кобыл наблюдалась кратковременная виремия, однако, роды проходили нормально. Три из 4 жеребят показали негативные результаты на вирус-нейтрализующие (ВН) антитела против EHV-1 в пробах крови, взятых перед вскармливанием своей матерью, тогда как один жеребенок давал положительный результат на ВН-антитело, что было обусловлено приемом молозива (поскольку он родился в промежуток времени между наблюдениями в ранние часы). Эти результаты систематизированы в таблице 8.

а = EHV-1-нейтрализующее антитело при рождении;

b = рожденный между интервалами мониторинга в ранние часы и у этого жеребенка брали пробы крови, по крайней мере, через 3 часа после рождения;

с = исследования незавершены, то есть продолжаются.

7. Отсутствие передачи TS C147 EHV-1 между видами-мишенями

Исследования по передаче вируса от одного животного другому были осуществлены у “наивных по EHV” (всех типов) жеребят-отъемышей (жеребят, у которых отсутствует специфический патоген, SPF-жеребят).

Двух SPF-жеребят инокулировали интраназально (i.n.) 10-кратной протективной дозой штамма TS C147 EHV-1 на уровне пассажа исходного вакцинного вируса +1°, и вирусположительную носовую слизь, собранную в течение нескольких дней, использовали для аналогичного инфицирования другой пары SPF-жеребят. После инокуляции (i.n.) жеребят наблюдали на (i) выделение вируса в носовую слизь, (ii) клинические реакции и (iii) сероконверсию по EHV-1.

У жеребят, инокулированных TS C147 EHV-1 на уровне (MSV)+1°, выделялся вирус в носовую слизь, и все они были сероконвертированными. Однако пул образцов вирусположительной носовой слизи не инфицировал другую пару “наивных по EHV” жеребят, на что указывало отсутствие выделения EHV-1 из их носовой слизи и отсутствие сероконверсии по EHV-1. Эти результаты были подтверждены исследованием с использованием других 4 SPF-жеребят, 2 из которых инокулировали (MSV)+1°, а еще 2 жеребятам вводили вирусположительную носовую слизь, взятую от первых двух жеребят. Результаты систематизированы в таблицах 9 и 10.

Реферат

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен температурочувствительный штамм вируса аборта лошадей ENV-1, а также фармацевтическая композиция, вакцина и способ иммунизации животного на его основе. Штамм характеризуется тем, что его репликация ограничена верхними дыхательными путями, не вызывая при этом виремии. Кроме того, штамм характеризуется недостаточным ростом при температуре, при которой вирус дикого типа обнаруживает нормальный рост. Штамм и основанные на нем композиции и вакцины могут быть использованы для клинической и вирусологической защиты лошадей от инфекций ENV-1 и для защиты от вирус-индуцированных абортов и парезов. 4 н.п.ф-лы, 10 табл.

Формула