Последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает поддержание эписомальной репликации в клетке млекопитающего, и вектор ее включающий - RU2240348C2
Код документа: RU2240348C2
Чертежи
Описание
Известный уровень техники
Вирус Эпштейна-Барра (EBV) представляет собой вирус герпеса человека с латентной фазой, характеризуемой стабильным эписомальным размножением замкнутой в кольцо формы вирусной ДНК. Для латентной фазы репликации необходимы два дискретных элемента ДНК: находящееся в цис-положении начало репликации, OriP, и ядерный антиген 1 Эпштейна-Барра (EBNA1) - единственный кодируемый вирусом белок, необходимый для репликации (Yates et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3806-10, 1984; Yates et al. Nature 313: 812-5, 1985). Большинство векторов EBV очень велики, порядка 10 т.п.о. или больше (без вставки), из-за большого размера сегментов EBNA1 и OriP. Размер существующих сегментов EBNA1 и OriP служит помехой в разработке экспрессионных векторов с улучшенными свойствами и в создании компактных экспрессирующих ген и стабильных кассет, которые могут быть введены в состав других средств доставки, таких как ретровирусы или аденовирусы.
Краткое изложение существа изобретения
В целом отличительной особенностью изобретения служит последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает поддержание эписомальной репликации в клетке млекопитающего. Эта нуклеотидная последовательность включает (а) последовательность OriP с делецией и (b) последовательность EBNA1 с делецией, функционально связанную с промотором, и эта нуклеотидная последовательность имеет длину менее 3 т.п.о., предпочтительно менее 2 т.п.о. и наиболее предпочтительно менее 1,8 т.п.о.
В предпочтительных вариантах последовательность OriP включает приблизительно 1-495 остатки SEQ ID NO:1 последовательность EBNA1 включает приблизительно 627-1718 остатки SEQ ID NO:1; последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно включает консенсусную последовательность полиаденилирования (например, близкую к последовательности SEQ ID NO: 2); а промотор представляет собой вирусный промотор.
В сходных вариантах в изобретении характеризуются также векторы и клетки (например, клетки млекопитающих и предпочтительно клетки человека), которые включают такие последовательности нуклеиновых кислот.
Подробное описание
Фиг.1 представляет собой последовательность укороченной EBV OriP и EBNA-1 кассеты.
Фиг.2 представляет собой последовательность компактного синтетического работающего в обоих направлениях сайта полиаденилирования, которая может быть применена совместно с компактным репликоном EBV.
После большой делеции и мутагенеза оказалось возможным вставить во фрагмент длиной менее 2 т.п.о. цис- и трансдействующие функции, необходимые для эписомальной репликации EBV. В частности, примером является представленный на фиг.1 фрагмент из 1748 пар оснований (SEQ ID NO: 1), который действует как компактный репликон EBV. Этот фрагмент содержит все последовательности, необходимые для эффективной экспрессии белка EBNA-1, за исключением консенсусной последовательности полиаденилирования. Фрагмент является сегментом от сайта Вg12 до сайта BamHl, который содержит OriP элемент между остатками 1 и 495, модифицированный промотор гена тими-динкиназы вируса 1 Неrpes simplex между остатками с 496 до 616 и кодирующую последовательность для укороченного и модифицированного гена EBNA1 между остатками 627 и 1718. Плазмидные векторы, основанные на этой последовательности, реплицируют как эписомы в ядре трансфецированных клеток, происходящих не от грызунов (Yates et al., 1985, смотри выше).
Для сведения к минимуму суммарной длины последовательности указанный выше фрагмент конструировали как вставку вышеработающего в обоих направлениях сайта полиаденилирования в соответствующем векторе. Пример компактного синтетического работающего в обоих направлениях сайта полиаденилирования представлен на фиг.2 (SEQ ID NO: 2).
Компактные репликоны EBV находят применение в векторах для генной терапии, например, в средствах доставки генов, таких как экспрессионные векторы.
Другие осуществления представлены в формуле изобретения.
Реферат
Изобретение относится к генетической инженерии. Предложена последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает поддержание эписомальной репликации в клетке млекопитающего. Предложенная нуклеиновая кислота состоит из последовательности OriP вируса Эпштейна-Барра, включающей остатки 1-495 SEQ ID NO:1, и последовательности EBNA1 вируса Эпштейна-Барра, включающей остатки 627-1718 SEQ ID NO:1, консенсусную последовательность полиаденилирования и вирусный промотор. Предложенная нуклеиновая кислота имеет длину менее 3 т.п.н. Предложен также вектор, включающий вышеуказанную последовательность. Предложенная группа изобретений позволяет улучшить свойства экспрессионных векторов и создать стабильные кассеты, экспрессирующие ген. Изобретение может быть использовано для генной терапии и для создания экспрессионных векторов. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил.
