Вакцины на основе реовирусов птиц - RU2708316C2

Чертежи

Показать все 24 чертежа(ей)

Описание

ДАННЫЕ О ПРОДОЛЖАЮЩЕЙ ЗАЯВКЕ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США с регистрационным № 61/932995, поданной 29 января 2014 г., которая включена в данный документ посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Реовирусы птиц связаны с некоторыми заболеваниями сельскохозяйственной птицы, включающими синдром мальабсорбции и синдром карликовости (RSS), хотя их роль как первичных патогенов в этих клинических синдромах неясна. С другой стороны, достаточно очевидна связь реовирусов птиц с клиническими случаями вирусного артрита/тендосиновита, поскольку реовирусы были выделены из сухожилий пораженных птиц. Борьбу с вирусным артритом/тендосиновитом, вызываемым реовирусами, можно осуществлять путем вакцинации племенных бройлеров комбинацией живых и/или инактивированных вакцин, при которой материнский иммунитет передается потомству для ранней защиты от заражения в полевых условиях. В отношении бройлеров живые аттенуированные вакцины доступны для применения в день вылупления и для применения in ovo. Существующие в настоящее время коммерческие вакцинные штаммы (к примеру, S1133, 1733, 2408 и 2177) применялись в течение десятилетий для борьбы с болезнями, ассоциированными с реовирусами. Тем не менее, эти коммерческие вакцинные штаммы были выделены в 1960-1970 гг. и не обеспечивают защиту от распространяющихся в настоящее время реовирусов, которые были выделены от индивидуумов с подтвержденными случаями вирусного артрита/тендосиновита. Поэтому существует потребность в выделении и получении характеристик распространяющихся в настоящее время реовирусов птиц и разработке эффективных вакцин.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает генетически и серологически различные реовирусы птиц группы 1 и группы 2, выделенные от кур с клиническими случаями вирусного артрита (VA)/тендосиновита.

Настоящее изобретение включает выделенный реовирус птиц группы 1, где реовирус птиц группы 1 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:4. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:2. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 является аттенуированным, инактивированным или убитым. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 аттенуирован по меньшей мере 25 пассажами в яйце или в линии клеток-хозяев.

Настоящее изобретение включает выделенный реовирус птиц группы 1, где реовирус птиц группы 1 содержит ген S1, имеющий нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:3. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит ген S1, имеющий нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:1. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит ген S1, имеющий нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:3. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит ген S1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит ген S1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:3. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 является аттенуированным, инактивированным или убитым. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 аттенуирован по меньшей мере 25 пассажами в яйце или в линии клеток-хозяев.

Настоящее изобретение включает выделенный реовирус птиц группы 2, где реовирус птиц группы 2 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:6. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:6. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 содержит белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 является аттенуированным, инактивированным или убитым. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 аттенуирован по меньшей мере 25 пассажами в яйце или в линии клеток-хозяев.

Настоящее изобретение включает выделенный реовирус птиц группы 1, где реовирус птиц группы 1 содержит ген S1, имеющий нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:5. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 содержит ген S1, имеющий нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:5. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 содержит ген S1, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 является аттенуированным, инактивированным или убитым. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 аттенуирован по меньшей мере 25 пассажами в яйце или в линии клеток-хозяев.

В некоторых аспектах настоящее изобретение включает выделенный реовирус птиц группы 1, где реовирус птиц группы 1 включает в себя штамм 94594 реовируса птиц, а также его производные и потомство. В некоторых аспектах штамм 94595 реовируса птиц является убитым, инактивированным или аттенуированным по меньшей мере 25 пассажами в яйце или в линии клеток-хозяев.

В некоторых аспектах настоящее изобретение включает выделенный реовирус птиц группы 1, где реовирус птиц группы 1 включает в себя штамм 94826 реовируса птиц, а также его производные и потомство. В некоторых аспектах штамм 948264 является убитым, инактивированным или аттенуированным по меньшей мере 25 пассажами в яйце или в линии клеток-хозяев.

В некоторых аспектах настоящее изобретение включает выделенный реовирус птиц группы 2, где реовирус птиц включает в себя штамм 96139 реовируса птиц, а также его производные и потомство. В некоторых аспектах штамм 96139 реовируса птиц является убитым, инактивированным или аттенуированным по меньшей мере 25 пассажами в яйце или в линии клеток-хозяев.

Настоящее изобретение включает композиции, содержащие один или несколько реовирусов птиц, описанных в данном документе. Такие композиции могут дополнительно содержать адъювант и/или антигенную детерминанту одного или нескольких дополнительных патогенов, вызывающих инфекцию у сельскохозяйственной птицы.

Настоящее изобретение включает вакцины, содержащие один или несколько реовирусов птиц по настоящему изобретению, описанных в данном документе. Такие вакцины могут дополнительно содержать адъювант и/или антигенную детерминанту одного или нескольких дополнительных патогенов, вызывающих инфекцию у сельскохозяйственной птицы.

Настоящее изобретение включает иммунологические композиции для индукции выработки антител у сельскохозяйственной птицы, содержащие один или несколько реовирусов птиц, описанных выше в данном документе. Такие композиции могут дополнительно содержать адъювант и/или антигенную детерминанту одного или нескольких дополнительных патогенов, вызывающих инфекцию у сельскохозяйственной птицы.

Настоящее изобретение включает диагностический набор, содержащий один или несколько реовирусов птиц, описанных выше в данном документе.

Настоящее изобретение включает способ выработки антител к реовирусам у сельскохозяйственной птицы, при этом способ предусматривает введение птице выделенного реовируса птиц, композиции или вакцины по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение включает способ защиты птицы из отряда Galliformes от патологии или заболевания, вызываемых реовирусом птиц, при этом способ предусматривает введение птице выделенного реовируса птиц, композиции или вакцины по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение включает способ снижения восприимчивости птицы из отряда Galliformes к патологии или заболеванию, вызываемым реовирусом птиц, при этом способ предусматривает введение птице выделенного реовируса птиц, композиции или вакцины по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение включает способ снижения интенсивности вирусного артрита и/или тендосиновита у птицы из отряда Galliformes, при этом способ предусматривает введение птице выделенного реовируса птиц, композиции или вакцины по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение включает способ предупреждения вирусного артрита и/или тендосиновита у птицы из отряда Galliformes, при этом способ предусматривает введение птице выделенного реовируса птиц, композиции или вакцины по настоящему изобретению.

В некоторых аспектах способов по настоящему изобретению птица включает курицу или индейку.

В некоторых аспектах способов по настоящему изобретению введение включает введение до или после вылупления.

В некоторых аспектах способов по настоящему изобретению введение включает введение in ovo. В некоторых аспектах введение in ovo включает введение в момент времени приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней, приблизительно 15 дней, приблизительно 16 дней, приблизительно 17 дней, приблизительно 18 дней, приблизительно 19 дней, приблизительно 20 дней или в любом диапазоне этих значений.

В некоторых аспектах способов по настоящему изобретению введение включает введение племенной самке птицы.

Настоящее изобретение включает антитело, которое связывается с реовирусом птиц группы 1 или реовирусом птиц группы 2, описанными в данном документе, но не связывается со штаммами S1133, 1733, 2408 и/или 2177 реовируса птиц. В некоторых аспектах антитело представляет собой моноклональное антитело.

Настоящее изобретение включает способ выявления воздействия на птицу реовируса птиц, при этом способ предусматривает определение того, что образец антисыворотки, получаемый от птицы, специфически связывается с реовирусом птиц по настоящему изобретению или с его компонентом.

Настоящее изобретение включает способ выявления воздействия на птицу реовируса птиц, при этом способ предусматривает определение того, что образец антисыворотки, получаемый от птицы, специфически связывается с белком сигма-С реовируса птиц группы 1 или реовируса птиц группы 2 по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение включает способ выявления возбудителя инфекции, представляющего собой реовирус птиц, в образце, при этом способ предусматривает выявление гибридизации полинуклеотида, содержащего SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5, или его фрагмента с образцом.

Настоящее изобретение включает способ выявления реовируса птиц в образце, при этом способ предусматривает получение продукта амплификации в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью по меньшей мере одного праймера, полученного из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1. Нуклеотидная последовательность S1, кодирующая белок сигма-С (пары оснований 1-931), из полевого изолята 94594 варианта VA 2012 группы 1 (SEQ ID NO:1).

Фигура 2. Аминокислотная последовательность сигма-С, кодируемая S1 (аминокислоты 1-310), из полевого изолята 94594 варианта VA 2012 группы 1 (SEQ ID NO:2).

Фигура 3. Нуклеотидная последовательность S1, кодирующая белок сигма-С (пары оснований 1-931), из полевого изолята 94826 варианта VA 2012 группы 1 (SEQ ID NO:3).

Фигура 4. Аминокислотная последовательность сигма-С, кодируемая S1 (аминокислоты 1-310), из полевого изолята 94826 варианта VA 2012 группы 1 (SEQ ID NO:4).

Фигура 5. Нуклеотидная последовательность S1, кодирующая белок сигма-С (пары оснований 1-931), из полевого изолята 96139 варианта VA 2012 группы 2 (SEQ ID NO:5).

Фигура 6. Аминокислотная последовательность белка сигма-С, кодируемая S1 (аминокислоты 1-310), из полевого изолята 96139 варианта VA 2012 группы 2 (SEQ ID NO:6).

Фигура 7. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей сигма-С с использованием Clustal W и полученное в результате филогенетическое дерево с 1000 повторных бутстреп-выборок. Уровни достоверности в бутстреп-анализе обозначены числами на каждом узле дерева.

Фигура 8. Процент идентичности и дивергенция, полученные на основании множественного выравнивания, построенного с помощью алгоритма Clustal W.

Фигура 9. Средние значения измерений подушечки стопы в миллиметрах в дни, обозначенные на оси X. Начиная с семидневного возраста, наблюдалось значимое различие в размере между птицами в группах, зараженных S1133 и 94286, по сравнению с отрицательными контролями. Стандартное отклонение для каждой группы указано планками погрешностей.

Фигура 10. Средние значения массы тела в день завершения эксперимента (возраст 14 дней). Стандартное отклонение для каждой группы указано планками погрешностей.

Фигура 11. Измерения проводили над сухожилием сгибателя пальцев непосредственно под скакательным суставом в возрасте 10 дней и повторно в день завершения эксперимента в возрасте 14 дней. Отчетливо выраженный отек наблюдался в возрасте 14 дней в группе, зараженной 94286. Стандартное отклонение для каждой группы указано планками погрешностей.

Фигура 12. Клинические признаки, зарегистрированные в день завершения эксперимента. Следует отметить, что в день 10 6 птиц были исключены из группы S1133 по причине хромоты и невозможности получить доступ к пище или воде.

Фигура 13. Средняя масса тела в граммах на момент завершения исследования (возраст 23 дня). Стандартное отклонение для каждой группы представлено линией с наконечником.

Фигура 14. Средние значения измерений подушечки стопы в миллиметрах, проведенных в возрасте 12, 14, 16, 19, 21 и 23 дней. Первое измерение проводили в возрасте 12 дней непосредственно перед заражением.

Фигура 15. Средние значения измерений пятки в миллиметрах, проведенных в возрасте 19, 21 и 23 дней. Измерение 1 пятки проводили на скакательном суставе, а измерение 2 пятки проводили над сухожилием сгибателя пальцев непосредственно под скакательным суставом.

Фигура 16. Клинические признаки и поражения в день завершения эксперимента (23 дня).

Фигура 17. Серологические показатели в день вылупления.

Фигура 18. Значения массы тела птиц, зараженных вирусом группы 2.

Фигура 19. Значение измерения отека подушечки стопы в день 14, представленное в виде процентной доли от массы тела птиц, зараженных вирусом группы 2.

Фигура 20. Значение измерения отека сухожилия, представленное в виде процентной доли от массы тела птиц, зараженных вирусом группы 2.

Фигура 21. Номера доступа в GenBank для изолятов группы 1 и группы 2. Строки, заштрихованные серым цветом, представляют реовирусы птиц группы 2. Все остальные строки представляют реовирусы группы 1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В настоящем изобретении две генетически и серологически различные группы реовирусов птиц были выделены от индивидуумов с клиническими случаями вирусного артрита (VA)/тендосиновита со всей территории США и Канады. Генетический анализ белка сигма-С реовирусов птиц выявил новые генотипы группы 1 и группы 2, которые не связаны с существующими в настоящее время вакцинными штаммами реовирусов птиц. Серологическая оценка вирусов выявила практически отсутствующую перекрестную нейтрализацию с известными антисыворотками к существующим в настоящее время коммерческим вакцинам на основе реовирусов. Дополнительно, исследования патогенности и защиты потомства подтверждают, что существующие в настоящее время коммерческие вакцины не обеспечивают достаточную защиту потомства вакцинированных племенных самок птиц. Существующие в настоящее время вакцинные штаммы реовирусов были выделены в 1960-1970 гг. и не обеспечивают защиту от распространяющихся в настоящее время реовирусов, которые были выделены от индивидуумов с подтвержденными случаями вирусного артрита/тендосиновита.

Реовирусы птиц, наряду с реовирусами млекопитающих, относятся к роду Orthoreovirus семейства Reoviridae. Эти вирусы содержат геном из 10 сегментов dsRNA, заключенный в двойной икосаэдральный капсид без оболочки размером приблизительно 80 нм. Сегменты генома на основании их электрофоретической подвижности могут быть разделены на три больших (L1, L2, L3), три средних (M1, M2, M3) и четыре маленьких (S1, S2, S3, S4) сегмента, которые кодируют соответственно белки λ1, λ2, λ3, μ1, μ2, μNS, σ3, σ1, σ2, σNS. Белок σ2 представляет собой белок внешнего капсида, который несет специфические для группы нейтрализующие эпитопы. Он также связывает двухцепочечную РНК и был определен как цинк-содержащий металлопротеин. Белок сигма-С, минорный белок внешнего капсида, который кодируется сегментом σ1, представляет собой мишень для получения молекулярных характеристик реовирусов птиц и отвечает за прикрепление к клетке, а также за индукцию типоспецифических нейтрализующих антител.

Вирион реовирусов птиц включает капсид, сердцевину и нуклеопротеиновый комплекс. Капсид вируса не имеет оболочки. Капсид/нуклеокапсид является изометрическим с икосаэдральной симметрией и имеет диаметр приблизительно 80-82 нм. Капсидная оболочка вирионов состоит из двух слоев. Обычно присутствуют все оболочки, или же внешняя оболочка часто утрачивается в процессе получения препарата. Капсиды выглядят круглыми. В структуре поверхности капсида выявляется регулярная схема с отличительными особенностями. Расположение капсомеров четко видимо. Проекции поверхности отсутствуют. Кор, или внутренний капсид, имеет диаметр приблизительно 60 нм. Препараты вирусов содержат один компонент частицы. Сердцевина имеет сферическую форму и состоит из генома, представленного dsRNA, с диаметром приблизительно 49 нм. Концы нитей выступают почти до поверхности капсида.

В вакцинном штамме S1133 реовируса птиц мРНК-транскрипт s1 имеет длину 1644 нуклеотида и содержит три цистрона в разных фазах, которые частично перекрываются. Первый цистрон (ORF-1, нуклеотиды 25-319) экспрессирует p10, второй цистрон (ORF-2, нуклеотиды 293-731) экспрессирует p17, а третий цистрон (ORF-3, нуклеотиды 630-1608) экспрессирует белок C, отвечающий за прикрепление к клетке.

Анализ аминокислотных последовательностей сигма-С вакцинных штаммов S1133, 1733, 2408 и 2177 реовирусов выявил > 99% сходство между этими вакцинными штаммами. Получение генотипических характеристик полевых изолятов реовирусов включает сравнение полевых изолятов с вакцинными штаммами, а также со всеми последовательностями реовирусов, доступными в открытых источниках и в базе данных PDRC. Сходство генотипа для полевых изолятов представляют как наивысший процент сходства с другой последовательностью полевого изолята либо вакцинного штамма.

В настоящем изобретении две генетически и серологически различные группы реовирусов птиц были выделены от индивидуумов с клиническими случаями тендосиновита. Генетический анализ белка сигма-С реовирусов птиц выявил новые генотипы, которые не связаны с существующими в настоящее время вакцинными штаммами реовирусов птиц. Серологическая оценка вирусов выявила практически отсутствующую перекрестную нейтрализацию с известными антисыворотками к существующим в настоящее время коммерческим вакцинам на основе реовирусов. Дополнительно, были проведены исследования патогенности и защиты потомства с целью подтверждения того, что существующие в настоящее время коммерческие вакцины не обеспечивают достаточную защиту потомства вакцинированных племенных самок птиц.

Две генетические/серологические группы полевых изолятов, описанных в данном документе, называют вариантом VA 2012 группы 1 (также именуемым в данном документе ʺреовирусом птиц группы 1ʺ) и вариантом VA 2012 группы 2 (также именуемым в данном документе ʺреовирусом птиц группы 2ʺ). Реовирусы варианта VA 2012 группы 1 и/или варианта VA 2012 группы 2 можно применять как в живых аттенуированных, так и в убитых/инактивированных вакцинах. В некоторых аспектах такая вакцина может представлять собой аутогенную вакцину.

Реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C с аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 55% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 60% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 65% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:2. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 1, описанный в данном документе, содержит белок сигма-C по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:2.

Реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C с аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 55% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 60% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 65% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:4. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 1, описанный в данном документе, содержит белок сигма-C по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:4.

Реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 55% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 60% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 65% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:1. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 1, описанный в данном документе, содержит белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:1.

Реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 55% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 60% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 65% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:3. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 1, описанный в данном документе, содержит белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:3.

В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 1 представляет собой один из вирусов, приведенных в таблице 21, или его потомство или производное.

В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 1 представляет собой реовирус птиц CK/945494/Tendon/GA/2012 (также именуемый в данном документе ʺполевым изолятом 94594 варианта VA 2012 группы 1ʺ или ʺ94594ʺ) или его потомство или производное.

В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 1 представляет собой реовирус птиц CK/94826/Tendon/GA/2012 (также именуемый в данном документе ʺполевым изолятом 94826 варианта VA 2012 группы 1ʺ или ʺ94826ʺ) или его потомство или производное.

Реовирус птиц группы 2 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C с аминокислотной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:6. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 2, описанный выше, содержит белок сигма-C по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO: 6.

Реовирус птиц группы 2 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:5. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 по настоящему изобретению может содержать белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO:5. В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 1, описанный в данном документе, содержит белок сигма-C, кодируемый нуклеотидной последовательностью по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:5.

В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 2 представляет собой один из вирусов, приведенных в таблице 21, или его потомство или производное.

В некоторых вариантах осуществления реовирус птиц группы 2 представляет собой реовирус птиц CK/96139/Tendon/GA/2012 (также именуемый в данном документе ʺполевым изолятом 96139 варианта VA 2012 группы 2ʺ или ʺ96139ʺ) или его потомство или производное.

Описанный в данном документе реовирус птиц или клеточная линия, инфицированная таким вирусом, можно передать на депонирование в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC®), 10801 University Boulevard, Манассас, Вирджиния 20110-2209, США. Такое депонирование может соответствовать Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Реовирус птиц согласно настоящему изобретению можно получить с использованием общепринятых способов, включающих, без ограничения, любой из способов, описанных в разделе "Примеры", включенном в данный документ. Вкратце, субстрат, способный поддерживать репликацию реовируса птиц, инокулируют реовирусом птиц по настоящему изобретению, который размножают до репликации вируса до необходимого инфекционного титра или массового содержания антигена. После этого собирают материал, содержащий реовирус. Подходящие субстраты могут включать первичные культуры клеток (птиц), такие как, например, клетки печени куриных эмбрионов, фибробласты куриных эмбрионов или клетки почек кур, линии клеток млекопитающих, такие как, например, линия клеток VERO или линия клеток BGM-70, или линии клеток птиц, такие как, например, QT-35, QM-7 или LMH. В некоторых вариантах применения могут быть использованы яйца с развивающимися эмбрионами.

Настоящее изобретение включает способ выявления воздействия на птицу реовируса птиц группы 1 и/или группы 2, при этом способ предусматривает определение того, происходит ли специфическое связывание полученного от птицы образца антисыворотки с вирусом, линией клеток, клеточным дебрисом, надосадочной жидкостью и/или полипептидом по настоящему изобретению. К примеру, настоящее изобретение включает применение одного или нескольких реовирусов птиц по настоящему изобретению в способах выявления воздействия на птицу реовируса птиц, при этом способ предусматривает определение того, что образец антисыворотки, получаемый от птицы, специфически связывается с реовирусом птиц по настоящему изобретению. Такой реовирус птиц включает любой из описанных в данном документе, в том числе, без ограничения, любой из штаммов реовирусов птиц, перечисленных на фигуре 21, включая, без ограничения, штаммы 94594, 94826 или 96139 реовирусов птиц. Такой реовирус птиц может быть инактивированным, убитым и/или лиофилизированным. Настоящее изобретение также включает диагностические наборы, содержащие один или несколько реовирусов птиц по настоящему изобретению. Такой набор может включать в качестве дополнительных компонентов, например, вирус для положительного контроля, вирус для отрицательного контроля, вторичное антитело и/или детектируемый маркер.

Настоящее изобретение включает выделенный полипептид сигма-С, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 55% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 60% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 65% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:6. В некоторых аспектах настоящее изобретение включает выделенный полипептид сигма-С, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:6. В некоторых аспектах настоящее изобретение включает выделенный полипептид сигма-С, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:6.

Настоящее изобретение включает выделенный полипептид сигма-С, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 55% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 60% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 65% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 96% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 97% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 и/или SEQ ID NO:5. В некоторых аспектах настоящее изобретение включает выделенный полипептид сигма-С, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 и/или SEQ ID NO:5. В некоторых аспектах настоящее изобретение включает выделенный полипептид сигма-С, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 и/или SEQ ID NO:5.

Настоящее изобретение включает полипептиды, описанные в данном документе, их усеченные варианты и фрагменты. Усеченные варианты включают, без ограничения, аминокислотные последовательности, в которых одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более аминокислот удалены с амино-конца аминокислотной последовательности и/или одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более аминокислот удалены с карбоксильного конца аминокислотной последовательности.

Фрагменты включают, без ограничения, например, фрагменты, имеющие приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650 и приблизительно 700 последовательных аминокислотных остатков последовательности, описанной в данном документе. Фрагменты также включают, например, фрагменты, диапазон размеров которых представлен любой комбинацией вышеупомянутых размеров фрагментов.

Фрагменты включают, без ограничения, например, фрагменты, имеющие по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250, по меньшей мере 300, по меньшей мере 350, по меньшей мере 400, по меньшей мере 450, по меньшей мере 500, по меньшей мере 550, по меньшей мере 600, по меньшей мере 650 и по меньшей мере 700 последовательных аминокислотных остатков последовательности, описанной в данном документе.

Настоящее изобретение включает полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью, десятью, одиннадцатью, двенадцатью, тринадцатью, четырнадцатью, пятнадцатью, шестнадцатью, семнадцатью, восемнадцатью, девятнадцатью, двадцатью или более заменами аминокислот по сравнению с аминокислотной последовательностью, описанной в данном документе, или ее фрагментами. Такие замены аминокислот включают, без ограничения, консервативные замены аминокислот.

Настоящее изобретение включает применение одного или нескольких полипептидов по настоящему изобретению в способах выявления воздействия на птицу реовируса птиц, при этом способ предусматривает определение того, что образец антисыворотки, получаемый от птицы, специфически связывается с полипептидом по настоящему изобретению. Такие полипептиды включают любой из описанных в данном документе полипептидов, в том числе, без ограничения, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6, а также их производные и фрагменты. Настоящее изобретение также включает диагностические наборы, содержащие один или несколько полипептидов по настоящему изобретению. Такой набор может включать в качестве дополнительных компонентов, например, полипептид для положительного контроля, полипептид для отрицательного контроля, вторичное антитело, детектируемый маркер.

Настоящее изобретение включает выделенную полинуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 55% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 60% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 65% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5. Настоящее изобретение включает выделенную полинуклеотидную последовательность, содержащую SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5, их усеченный вариант или фрагмент. В некоторых аспектах настоящее изобретение включает описанную в данном документе выделенную полинуклеотидную последовательность по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5.

Настоящее изобретение включает выделенную полинуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 50% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 55% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 60% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 65% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере приблизительно 98% идентичностью последовательности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6. В некоторых аспектах настоящее изобретение включает выделенную полинуклеотидную последовательность, содержащую SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6. В некоторых аспектах настоящее изобретение включает описанную в данном документе выделенную полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность по меньшей мере с одной модификацией по типу замещения по сравнению с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6.

Настоящее изобретение включает полинуклеотидные последовательности и их фрагменты, которые гибридизируются с описанной в данном документе полинуклеотидной последовательностью в различных условиях. Условия жесткости включают, без ограничения, умеренную и высокую жесткость. Условиями высокой жесткости гибридизации могут быть, например, 6X SSC, 5X раствор Денхардта, 0,5% додецилсульфат натрия (SDS) и 100 мкг/мл фрагментированной и денатурированной ДНК из молок лосося, гибридизация в течение ночи при 65°C и отмывка в 2X SSC, 0,1% SDS по меньшей мере один раз при комнатной температуре в течение приблизительно 10 минут с последующей по меньшей мере одной отмывкой при 65°C в течение приблизительно 15 минут и последующей по меньшей мере одной отмывкой в 0,2X SSC, 0,1% SDS при комнатной температуре в течение по меньшей мере от 3 до 5 минут.

Настоящее изобретение включает описанную в данном документе полинуклеотидную последовательность, которая имеет замещение одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, двадцати или более нуклеотидов. Настоящее изобретение также включает описанные в данном документе полинуклеотидные последовательности, в которых частота использования кодонов была адаптирована для оптимизации экспрессии в определенной клетке-хозяине. Например, частоту использования кодонов можно адаптировать для оптимизации экспрессии в клетках-хозяевах, включающих, без ограничения, бакуловирус, клетки дрожжей, E. coli, сельскохозяйственной птицы или человека. Такую адаптацию можно осуществить с помощью методик, известных из уровня техники.

Настоящее изобретение включает праймеры, в том числе, без ограничения, любые из описанных в данном документе праймеров и праймеры, которые можно применять для получения описанной в данном документе последовательности или ее фрагмента в ПЦР-реакции. В некоторых вариантах осуществления праймер может содержать по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 40 нуклеотидных остатков. В некоторых вариантах осуществления праймер может содержать не более 10, не более 15, не более 20, не более 25, не более 30, не более 35, не более 40, не более 45, не более 50, не более 55 или не более 60 нуклеотидных остатков. Такие нуклеотидные остатки могут образовывать непрерывные последовательности или комплементарные им последовательности. Также включены пары праймеров, включающие в себя по меньшей мере один из описанных в данном документе праймеров, комплементарные им праймеры или праймеры, полученные из таких последовательностей. Также настоящее изобретение включает продукты амплификации, получаемые с помощью таких праймеров.

Настоящее изобретение включает вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность по настоящему изобретению. В некоторых аспектах вектор представляет собой вакцинный вектор. Настоящее изобретение включает выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидом по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение включает применение одной или нескольких полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению в способах выявления возбудителя инфекции, представляющего собой реовирус птиц, в образце. Такие способы включают, например, способы, включающие выявление гибридизации полинуклеотидной последовательности по настоящему изобретению с образцом, и способы, включающие получение продукта амплификации в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью по меньшей мере одного праймера, полученного из полинуклеотидной последовательности по настоящему изобретению. Такие полинуклеотидные последовательности включают любые из описанных в данном документе последовательностей, в том числе, без ограничения, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:5. Настоящее изобретение также включает диагностические наборы, содержащие одну или несколько полинуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению. Настоящее изобретение включает диагностические наборы, содержащие одно или несколько из вируса, культуры клеток, клеточного дебриса, надосадочной жидкости, полинуклеотидной последовательности, вектора и/или полипептида по настоящему изобретению.

Описанный в данном документе реовирус птиц может быть инактивированным или убитым вирусом. Целью инактивации вируса является предотвращение репликации вирусов, и этого, как правило, можно достичь химическими или физическими способами. Химическую инактивацию можно осуществить путем обработки вирусов, например, ферментами, формальдегидом, ß-пропиолактоном, этиленимином или их производными. Физическую инактивацию можно провести, например, посредством воздействия на вирусы энергетическим излучением, таким как УФ-свет.

Реовирус птиц, описанный в данном документе, может проявлять пониженную вирулентность и служить в качестве живого аттенуированого вируса для целей вакцинации. Аттенуация реовируса птиц, применимая в практическом осуществлении настоящего изобретения, может быть достигнута с помощью способов, хорошо известных в данной области техники для этой цели. Например, выделенный реовирус птиц согласно настоящему изобретению можно аттенуировать путем пассажа в куриных яйцах с развивающимися эмбрионами, живых животных или подходящих линиях клеток. Такие линии клеток могут включать, например, первичные культуры клеток (птиц), такие как, например, клетки печени куриных эмбрионов, фибробласты куриных эмбрионов или клетки почек кур, линии клеток млекопитающих, такие как, например, линия клеток VERO или линия клеток BGM-70, или линии клеток птиц, такие как, например, QT-35, QM-7 или LMH. Такой обратно пассированный вирус можно получить, например, посредством от приблизительно 10 до приблизительно 100 пассажей. Такой обратно пассированный вирус можно получить, например, посредством одного или нескольких обратных пассажей, двух или более обратных пассажей, трех или более обратных пассажей, четырех или более обратных пассажей, пяти или более обратных пассажей, десяти или более обратных пассажей, пятнадцати или более обратных пассажей, двадцати или более обратных пассажей, двадцати пяти или более обратных пассажей, пятидесяти или более пассажей, семидесяти пяти или более пассажей или ста или более пассажей. Такой обратно пассированный вирус можно получить, например, посредством приблизительно одного обратного пассажа, приблизительно двух обратных пассажей, приблизительно трех обратных пассажей, приблизительно четырех обратных пассажей, приблизительно пяти обратных пассажей, приблизительно десяти обратных пассажей, приблизительно пятнадцати обратных пассажей, приблизительно двадцати обратных пассажей, приблизительно двадцати пяти обратных пассажей, приблизительно пятидесяти пассажей, приблизительно семидесяти пяти пассажей, приблизительно ста пассажей или любого диапазона этих значений.

Например, настоящее изобретение включает реовирусы птиц, аттенуированные посредством пассажа в первичных фибробластах куриных эмбрионов с последующей очисткой с помощью бляшкообразования. Этот процесс можно повторить, например, от приблизительно 10 до приблизительно 100 раз для аттенуации вируса. Можно провести тестирование патогенности в различные моменты времени, например, на 25 пассаже, на 50 пассаже, на 75 пассаже, на 100 пассаже и в дополнительные моменты времени.

Настоящее изобретение включает способ выработки у сельскохозяйственной птицы иммунного ответа на реовирус птиц группы 1 и/или группы 2, при этом способ предусматривает введение выделенного вируса, линии клеток, клеточного дебриса, надосадочной жидкости, полинуклеотидной последовательности, вектора и/или полипептида по настоящему изобретению. В некоторых аспектах иммунитет включает гуморальный и/или клеточный иммунитет. В некоторых аспектах иммунитет включает мукозный иммунитет.

Настоящее изобретение включает способ предупреждения инфекции, вызываемой реовирусом птиц, у сельскохозяйственной птицы, при этом способ предусматривает введение композиции, содержащей выделенный вирус, линию клеток, клеточный дебрис, надосадочную жидкость, полинуклеотидную последовательность, вектор и/или полипептид по настоящему изобретению.

В некоторых аспектах способов по настоящему изобретению введение включает инъекцию, опрыскивание, пероральное введение или ингаляционное введение. В некоторых аспектах способов по настоящему изобретению введение индуцирует мукозный иммунитет. В некоторых аспектах способов по настоящему изобретению введение включает введение in ovo. В некоторых аспектах введение in ovo включает введение в момент времени приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней, приблизительно 15 дней, приблизительно 16 дней, приблизительно 17 дней, приблизительно 18 дней, приблизительно 19 дней, приблизительно 20 дней или в любом диапазоне этих значений.

Настоящее изобретение включает иммуногенные композиции и вакцины, содержащие одно или несколько из выделенных вирусов, полинуклеотидных последовательностей, векторов и/или полипептидов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирус является живым. В некоторых вариантах осуществления вирус является аттенуированным или инактивированным. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирус является инактивированным или убитым. В некоторых вариантах осуществления вирус, композиции или вакцина являются лиофилизированными. В некоторых вариантах осуществления вирус, композиции или вакцина являются замороженными.

Такие композиции и вакцину можно вводить в качестве активного компонента для иммунизации птицы, чтобы вызвать иммунный ответ на реовирус птиц группы 1 и/или группы 2 и/или индуцировать иммунитет против такого реовируса птиц. Иммунитет может включать индукцию повышенного уровня защиты в популяции птиц после вакцинации по сравнению с невакцинированной группой. Иммунный ответ может обеспечивать или не обеспечивать защитный иммунитет. Иммунный ответ может, например, включать в себя одно или несколько из клеточно-опосредованного иммунного ответа, который включает выработку лимфоцитов в ответ на воздействие антигена, и/или гуморального иммунного ответа, который включает выработку плазматических лимфоцитов (B-клеток) в ответ на воздействие антигена с последующей выработкой антител. Иммунизация может приводить к уменьшению, ингибированию или предупреждению одного или нескольких симптомов вирусного артрита (VA)/тендосиновита, ассоциированного с реовирусом птиц. Такие симптомы могут включать одно или несколько из снижения массы тела, уменьшения производства яиц, смертности, макроскопических поражений (в том числе, без ограничения, отека сухожилия, тендосиновита, разрыва сухожилия и гидроперикарда) и гистологических изменений (в том числе, без ограничения, лимфоцитарного тендосиновита, лимфоцитарного эпикардита и лимфоцитарного миокардита).

Иммуногенная композиция или вакцина по настоящему изобретению может также содержать одно или несколько соединений с адъювантной активностью. Подходящие для этой цели соединения и композиции включают гидроксид алюминия, фосфат алюминия, оксид алюминия, растительные масла, животные жиры, эмульсии типа "масло в воде" или "вода в масле" на основе, например, минерального масла, такого как Bayol F™ или Marcol 52™, полного адъюванта Фрейнда, неполного адъюванта Фрейнда или растительного масла, такого как ацетат витамина Е, и сапонины.

Иммуногенная композиция или вакцина по настоящему изобретению может включать один или несколько подходящих фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей. Иммуногенная композиция или вакцина по настоящему изобретению также может содержать один или несколько стабилизаторов. Можно применять любой подходящий стабилизатор, в том числе углеводы, такие как сорбит, маннит, крахмал, сахароза, декстрин или глюкоза; белки, такие как альбумин или казеин; и буферы, такие как фосфат щелочного металла и т.п. Стабилизатор является особенно предпочтительным, если сухой вакцинный препарат получают путем лиофилизации.

Иммуногенная композиция или вакцина по настоящему изобретению может в дополнительно содержать один или несколько иммуногенов, полученных из других патогенов, вызывающих инфекцию у сельскохозяйственной птицы. Такие иммуногены могут быть получены, например, из вируса болезни Марека (MDV), вируса инфекционного бронхита (IBV), вируса болезни Ньюкасла (NDV), вируса синдрома снижения яйценоскости (EDS), вируса ринотрахеита индеек (TRTV), поксвируса, реовируса, парвовируса кур и вируса нефрита птиц (в том числе, без ограничения, ANV-1 и ANV-2).

Иммуногенную композицию или вакцину можно ввести с помощью любого подходящего известного способа инокуляции сельскохозяйственной птицы, в том числе назально, офтальмически, путем инъекции, с питьевой водой, с кормом, путем контакта, in ovo, в материнский организм, путем респираторной ингаляции и т.п. Иммуногенную композицию или вакцину можно ввести с помощью методик массового введения, как, например, путем помещения вакцины в питьевую воду или распыления в окружающую среду. При ведении путем инъекции иммуногенную композицию или вакцину можно вводить парентерально. Парентеральное введение включает, например, введение путем внутривенной, подкожной, внутримышечной или внутрибрюшинной инъекции.

В некоторых вариантах осуществления живую вакцину можно вводить в дозе не менее 10² титрационных единиц (где титрационные единицы определены в статье 9 раздела 113.332 Свода федеральных нормативных актов) на птицу, а инактивированная вакцина может содержать антигенный эквивалент 10⁴-10¹⁰ TCID₅₀ на птицу (где TCID является сокращением от инфекционной дозы в тканевой культуре).

Композиции и вакцины по настоящему изобретению могут быть практически чистыми. Как используется в данном документе, "практически чистый" будет обозначать материал, по существу не содержащий каких-либо сходных макромолекул или других биологических частиц, которые обычно обнаруживаются вместе с ним в природе.

Композиции и вакцины по настоящему изобретению можно вводить птицам любого из множества видов птиц, восприимчивых к инфекции. вызываемой реовирусом птиц, в том числе, без ограничения, сельскохозяйственной птице, птицам из отряда Galliformes и экзотическим видам птиц. Птицы из отряда Galliformes включают, без ограничения, кур, индеек, тетеревов, перепелов и фазанов. Как используется в данном документе, сельскохозяйственная птица включает одомашненных птиц, которых держат с целью сбора их яиц или забоя для получения мяса и/или перьев. Наиболее типичными являются представители надотряда Galloanserae (домашняя птица), в частности, отряда Galliformes (который включает, например, кур, перепелов, индеек и тетеревов), и семейства Anatidae (в отряде Anseriformes), общеизвестного как "водоплавающие птицы" (включающего, например, уток, гусей и лебедей). Сельскохозяйственная птица может также включать других птиц, которых убивают ради их мяса, таких как голуби и горлицы, или птиц, которые рассматриваются как дичь, такие как фазаны. Куры включают, без ограничения, самок птиц, петухов, бройлеров, цыплят для жарения, несушек, племенных птиц, потомство племенных самок птиц и несушек. Используемый в данном документе термин "восприимчивый к" означает возможность или факт пагубной реакции на упоминаемый микроорганизм, такой как, например, снижение жизненной активности или отсутствие прибавки в весе по сравнению с невосприимчивыми особями или группами, и/или одно или несколько патологических состояний, свидетельствующих о вирусной инфекции птиц.

Вакцину по настоящему изобретению можно вводить сельскохозяйственной птице до или после вылупления. Сельскохозяйственная птица может получать вакцину в различном возрасте. Например, бройлеров можно вакцинировать in ovo, в возрасте одного дня или в возрасте 2-3 недель. Поголовье несушек, или репродуктивное поголовье, можно вакцинировать, например, в возрасте приблизительно 6-12 недель и вторично вакцинировать в возрасте приблизительно 16-20 недель. Такое поголовье несушек, или репродуктивное поголовье, можно вакцинировать в возрасте приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12 недель. Такое поголовье несушек, или репродуктивное поголовье, можно вторично вакцинировать в возрасте приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19 или приблизительно 20 недель. Потомство такого поголовья несушек, или репродуктивного поголовья, может демонстрировать титр антител к описанному в данном документе полипептиду, что может предотвратить или смягчить симптомы инфекции, вызываемой реовирусом птиц, у потомства. Вакцинацию in ovo можно проводить, например, в момент времени приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней, приблизительно 15 дней, приблизительно 16 дней, приблизительно 17 дней, приблизительно 18 дней, приблизительно 19 дней, приблизительно 20 дней или в любом диапазоне этих значений.

Кур можно вакцинировать в любом подходящем возрасте, и перед первой вакцинацией они обычно имеют возраст приблизительно от одного до трех дней. Кур можно вакцинировать только один раз. Или же, если используются две дозы вакцины, первую дают, например, когда куры имеют возраст от 3 дней до недели, а последующую спустя дополнительные 1-10 недель.

Несколько доз композиции можно вводить на протяжении всей жизни курицы. Поскольку материнский иммунитет является основным источником обеспечения защиты бройлерного потомства, обычно вакцинируют племенных кур, хотя при желании можно вакцинировать цыплят-бройлеров.

Настоящее изобретение также включает антисыворотку и антитела, которые связываются с реовирусом птиц группы 1 и/или реовирусом птиц группы 2. В некоторых аспектах антисыворотка и антитело не связываются с существующими в настоящее время коммерческими вакцинными штаммами реовирусов птиц, такими как, например, штаммы S1133, 1733, 2408 и/или 2177 реовирусов птиц. Антитела, применимые в практическом осуществлении настоящего изобретения, включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, одноцепочечные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела или их фрагменты и также включают биспецифические антитела, синтетические антитела, фрагменты антител, такие как Fab-, Fv-, F(ab)2- или scFv-фрагменты, одноцепочечные антитела или химически модифицированные производные любых из них. Такие антитела можно применять в способах диагностики и диагностических наборах. В некоторых аспектах антитело к реовирусу птиц может быть прикреплено к твердой подложке.

В настоящем изобретении предложены способы выявления и/или измерения количества реовируса птиц группы 1 или группы 2 в образце, полученном от птицы. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 1 содержит белок сигма-С с аминокислотной последовательностью, описанной в данном документе, в том числе, без ограничения, белок сигма-С, содержащий последовательности SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, или его фрагмент или производное. В некоторых аспектах реовирус птиц группы 2 содержит белок сигма-С с аминокислотной последовательностью, описанной в данном документе, в том числе, без ограничения, белок сигма-С, содержащий последовательность SEQ ID NO:6, или его фрагмент или производное. Такой способ может включать приведение образца в контакт с антителом, которое селективно связывается с описанным в данном документе реовирусом птиц и/или описанным в данном документе белком сигма-С, и измерение количества антитела, связывающегося с вирусом или белком в образце. Образец может представлять собой любой биологический материал, такой как ткань, кость, кровь, моча или фекалии. Способы данного аспекта настоящего изобретения применимы, например, для определения того, инфицирована ли сельскохозяйственная птица реовирусом птиц по настоящему изобретению. Инфицированных животных можно умерщвлять с целью предотвращения переноса реовируса к другим животным.

Как используется в данном документе, "выделенный" относится к материалу, удаленному из его первоначальной среды (например, природной среды, если он встречается в природе) и таким образом измененному "рукой человека" относительно его естественного состояния.

Термин "и/или" обозначает один или все из перечисленных элементов или комбинацию любых двух или более из перечисленных элементов.

Слова "предпочтительный" и "предпочтительно" относятся к вариантам осуществления настоящего изобретения, которые могут предоставлять определенные преимущества в определенных обстоятельствах. Тем не менее, другие варианты осуществления также могут быть предпочтительными в тех же или других обстоятельствах. Кроме того, перечисление одного или нескольких предпочтительных вариантов осуществления не означает, что другие варианты не являются применимыми, и не предполагает исключения других вариантов осуществления из объема настоящего изобретения.

Термины "включает" и его варианты не имеют ограничивающего значения в случаях, когда эти термины встречаются в описании изобретения и формуле изобретения.

Если не указано иное, формы существительного единственного числа и фраза "по меньшей мере один" используются взаимозаменяемо и означают один или более чем один.

Также, в данном документе перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, которые относятся к этому диапазону (например, от 1 до 5 включает 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5 и т.д.).

Для любого способа, раскрытого в данном документе, который включает отдельные стадии, эти стадии можно осуществить в любом удобном порядке. И, при необходимости, две или более стадий в любой комбинации можно осуществить одновременно.

Если не указано иное, все числа, отражающие количества компонентов, молекулярные массы и т.д., которые используются в описании и формуле изобретения, следует понимать во всех случаях как модифицированные термином "приблизительно". Соответственно, если в иных случаях не указано противоположное, числовые параметры, изложенные в описании и формуле изобретения, являются приблизительными значениями, которые могут варьировать в зависимости от желаемых свойств, к получению которых стремятся в настоящем изобретении. По крайней мере, и не в качестве попытки ограничить основные принципы эквивалентов объемом формулы изобретения, каждый числовой параметр следует интерпретировать по меньшей мере с учетом количества описанных значимых цифр и путем применения стандартных методик округления.

Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, представляющие широкий объем настоящего изобретения, являются приблизительными значениями, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, представлены настолько точно, насколько это возможно. Все числовые значения, тем не менее, по своему существу включают диапазон, неизбежно обусловленный стандартным отклонением, присутствующим в соответствующих им тестовых измерениях.

Все заголовки приведены для удобства читателя и не должны использоваться для ограничения значения текста, который следует после заголовка, если это не указано.

В нескольких местах в настоящей заявке представлено руководство в виде списка примеров, каковые примеры можно использовать в различных комбинациях. В каждом случае перечисленный список служит только в качестве иллюстративной группы и не должен толковаться как исключительный список. Следует понимать, что конкретные примеры, материалы, количества и процедуры следует толковать в широком смысле в соответствии с объемом и сущностью настоящего изобретения, изложенными в данном документе.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами. Следует понимать, что конкретные примеры, материалы, количества и процедуры следует толковать в широком смысле в соответствии с объемом и сущностью настоящего изобретения, изложенными в данном документе.

Примеры

Пример 1

Выделение и получение характеристик вариантов реовирусов

В данном примере описано выделение вариантов реовирусов из сухожилий бройлеров с многочисленными клиническими случаями тендосиновита и/или хромоты в возрасте в диапазоне от 2,5 до 8 недель, предоставленных в Центр диагностики и исследований сельскохозяйственной птицы. Характеристики реовирусов птиц получали посредством секвенирования белка сигма-С и серологических анализов.

Материалы и способы

Выделение вируса. Полевые изоляты реовирусов Ck/94594 Tendon/GA/2012, Ck/94826 Tendon/GA/2012 и Ck/96139 Tendon/GA/2012 были выделены в Центр диагностики и исследований сельскохозяйственной птицы при Университете Джорджии из сухожилий промышленных бройлеров, которые проявляли клинические признаки вирусного артрита и тендосиновита. Сухожилия и аспираты синовиальной жидкости клинически пораженных кур гомогенизировали по отдельности в транспортной среде для вирусов, содержащей антибиотики. Гомогенизированные ткани фильтровали через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,45 микрона. Фильтраты инкубировали с антисывороткой к реовирусу S1133 (Charles River, SPAFAS, Уилмингтон, Массачусетс) при 37°C в течение 1 часа. После нейтрализации 0,2 мл гомогената инокулировали в первичные клетки печени куриных эмбрионов для проведения в общей сложности четырех пассажей. После достижения 70-80% цитопатического эффекта, который определяли по формированию синцития, культуры клеток замораживали и хранили при 80°C. Культуры клеток замораживали и размораживали три раза перед последующим пассажем в культуру клеток.

Экстракция РНК. Общую вирусную РНК экстрагировали из пассированных первичных клеток печени куриных эмбрионов с использованием набора RNeasy (Qiagen, Валенсия, Калифорния) согласно рекомендациям производителя. Вкратце, через 48 часов после инфицирования среду для культур клеток сливали, монослой покрывали 300 мкл буфера RLT, содержащего 0,143 M β-меркаптоэтанола, и соскребали скребком для клеток согласно рекомендациям производителя.

ОТ-ПЦР. Соответствующую гену S1 кДНК получали путем обратной транскрипции и ПЦР с использованием обратной транскриптазы SUPERSRIPT™ III с дефицитом активности РНКазы H и ДНК-полимеразы Taq PLATINUM® (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с праймерами P1 (AGTATTTGTGAGTACGATTG (SEQ ID NO:7)) и P4 (GGCGCCACACCTTAGGT (SEQ ID NO:8)), которые были опубликованы ранее (Kant et al., 2003, Vet Res; 34:203-212). Продукты амплификации размером 1,1 т.п.о. разделяли в 1,0% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали с помощью прибора для УФ-просвечивания. Фрагмент вырезали, очищали с помощью набора для экстракции из геля QIAEX II (Qiagen Inc., Валенсия, Калифорния), элюировали водой, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC), и хранили при -80°C.

Определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации и клонов S1. Очищенные из геля продукты ПЦР секвенировали напрямую, используя секвенирование двухцепочечной ДНК с флуоресцентно меченными дидезоксинуклеотидами и Taq-полимеразой, что проводили на автоматическом секвенаторе ABI 9700 (Applied Biosystems Inc., Фостер-Сити, Калифорния). Для секвенирования применяли праймеры для ПЦР P1 и P4, а также консервативные внутренние праймеры для гена S1 при необходимости завершения секвенирования. Последовательности праймеров, применяемых для секвенирования, предоставляются по запросу. Дополнительно, очищенные из геля продукты клонировали в плазмиду pCR2TOPO (Invitrogen), которой трансформировали E. coli согласно рекомендациям производителя. Несколько клонов из каждого изолята, содержащих плазмиды с вставкой размером 1,1 т.п.о., идентифицировали с помощью ПЦР с использованием прямых и обратных праймеров для M13. Данные клоны размножали, и плазмиды очищали с помощью набора для получения плазмид в малых количествах (Qiagen, Валенсия, Калифорния) согласно способам производителя. Для секвенирования применяли универсальные прямой и обратный праймеры для M13 наряду с внутренними праймерами для гена S1 при необходимости завершения секвенирования. По меньшей мере три клона или продукта ПЦР из трех амплификаций, которые содержат ген S1, секвенировали в обоих направлениях и использовали для получения консенсусной последовательности. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности изолятов 94594, 94826 и 96139 определены на фигурах 1-6.

Анализ последовательности. Анализ и множественное выравнивание нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей гена S1 и белка сигма-С проводили с помощью CLUSTAL W (Lasergene, v. 5.0, DNASTAR, Мэдисон, Висконсин). Последовательности генов S1 реовирусов птиц, данные о которых были опубликованы ранее, получали из GenBank.

Сравнение выровненных последовательностей и построение филогенетических деревьев проводили, используя кластеризацию по методу ближайших соседей и 1000 повторных бутстреп-выборок (уровни достоверности приведены в скобках) в ходе эвристического поиска с помощью программного обеспечения PAUP v 4.10b (филогенетический анализ с использованием принципа наибольшей экономии).

Номера доступа в GenBank. Последовательности, полученные для куриных изолятов 94594, 94826 и 96139, были предоставлены в GenBank, и им были присвоены следующие номера доступа: KJ803966, KJ803967 и KJ803990, соответственно.

Результаты и обсуждение

К настоящему времени в клинических случаях VA/тендосиновита были выявлены два основных варианта генотипов полевых изолятов реовирусов и охарактеризованы как варианты генотипов из-за отсутствия сходства с существующими на сегодняшний день вакцинными штаммами реовирусов (S1133, 1733, 2408, 2177) и другими вирусами в базах данных (фигура 7). Большинство полевых изолятов принадлежат к группе 1 (определены как варианты VA 2012 группы 1). Аминокислотные последовательности сигма-C реовирусов, принадлежащих к данному генотипу, на > 99% сходны между собой и на < 50% сходны с вакцинными штаммами при сравнении с последовательностями в открытых источниках и в базе данных PDRC (фигура 8). Реовирусы в группе 2 (определены как варианты VA 2012 группы 2) на > 99% сходны между собой и на < 50% сходны с вариантами VA 2012 группы 1 (фигура 8). Сходство между сигма-C вариантов VA 2012 группы 2 и вакцинных штаммов составляет 80% (фигура 8). Несмотря на то, что данная группа обладает более высоким сходством последовательностей, не было ясно, будет ли 80% сходство обуславливать некоторый уровень перекрестной защиты с существующими в настоящее время вакцинными штаммами. Для получения необходимой информации о серологическом родстве вирусов проводили серологическую оценку полевых изолятов из обеих групп.

Иллюстративные вирусы среди вариантов группы 1 и 2 оценивали в ходе одностороннего анализа перекрестной нейтрализации с использованием антисыворотки к S1133, 2408 и полученной гипериммунной сыворотки против варианта VA 2012 группы 1. Титры VN-антител при взаимодействии между полевыми изолятами и панелью сывороток составляли от 2 до 16, что предоставляло свидетельство того, что полевые изоляты не являются серологически родственными S1133, 2408 или друг другу.

Пример 2

Исследования патогенности и защиты потомства для варианта реовируса группы 1

В данном примере определяли патогенность изолятов 94826 и 94594 вариантов реовирусов VA 2012 группы 1 у кур.

Эксперимент №1

В данном эксперименте следовало определить, обеспечивает ли программа вакцинации племенных птиц компании А достаточную защиту потомства, зараженного полевым изолятом 94826 реовируса, от изолята варианта VA 2012 группы 1.

Куры. Использовали 80 промышленных бройлеров в возрасте 1 день от вакцинированных племенных птиц компании A.

Таблица 1. Группы обработки

Вирус. Полевой изолят 94826 размножали и титровали в первичных клетках печени куриных эмбрионов и применяли для инокуляции в подушечку стопы однодневных цыплят в дозе заражения 10³ TCID50 на птицу. Маточный раствор S1133, также титрованного в первичных клетках печени куриных эмбрионов, применяют для инокуляции в подушечку стопы однодневных цыплят в дозе заражения 10³ TCID50 на птицу. В отношении отрицательных контролей проводят имитацию заражения путем введения стерильного PBS в подушечку стопы.

Заражение реовирусом. Шестьдесят промышленных бройлеров получали в день вылупления, и разделяли на 3 группы по 20, и помещали в изоляционные блоки Хорсфалла-Бауэра. У цыплят из группы 1 проводили забор крови для ELISA в отношении реовируса (IDEXX), и их умерщвляли. Цыплятам из групп 2-4 инокулировали в подушечку стопы 1) стерильный PBS, 2) S1133 или 3) 94826. Это подробно описано в Таблице 1. Птиц осматривали каждый день, и отек пятки измеряли цифровым штангенциркулем в каждой группе обработке и регистрировали каждые 2 дня. В день 14 проводили эвтаназию, взвешивание и некропсию всех птиц. Птиц обследовали на предмет любых макроскопических поражений, а скакательные суставы обследовали на предмет отека, кровоизлияния и/или разрыва. Параметры для определения защиты включали серологические показатели в день вылупления, клинические признаки, смертность, массу тела, макроскопические поражения и оценку/измерение отека коленного сустава на протяжении всего исследования.

Эксперимент №2

В данном эксперименте следовало определить, обеспечивает ли программа вакцинации племенных птиц компании B достаточную защиту потомства, зараженного недавно выделенным полевым изолятом реовируса с фермы компании B, от вирусного артрита и обеспечивает ли какую-либо защиту применение коммерческой вакцины на основе реовирусов в однодневном возрасте.

Куры. Использовали 100 промышленных бройлеров возрастом 1 день от вакцинированных племенных птиц компании В.

Таблица 2. Группы обработки

Вирус. Полевой изолят 94594 размножали и титровали в первичных клетках печени куриных эмбрионов перед исследованием. VA ChickVac (Zoetis) применяли для вакцинации в день вылупления согласно рекомендациям производителя. В отношении отрицательных контролей проводили имитацию заражения стерильным PBS.

Заражение реовирусом. Сто промышленных цыплят получали в день вылупления и разделяли на 5 равных групп по 20 цыплят в каждой. В группе 1 проводили забор крови для ELISA в отношении реовируса (IDEXX). Остальные 4 группы цыплят помещали в изоляционные блоки Хорсфалла-Бауэра в условия положительного давления нагнетаемого воздуха. В день вылупления группу 3 вакцинировали VA ChickVac в полной дозе путем подкожного введения, тогда как группу 4 вакцинировали VA ChickVac в половине дозы путем подкожного введения. Это подробно описано в Таблице 2. В день 10 получали значения измерений подушечки стопы для всех цыплят. В день 10 группе 2 в подушечку стопы инокулировали 0,1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера, тогда как цыплят групп 3-5 заражали путем инокуляции в подушечку стопы полевого изолята 94594 при 10³ TCID50 на птицу. Птиц отслеживали каждый день, и значения измерений пяток получали каждые 2 дня, начиная с возраста 10 дней. В возрасте 22 дня исследование завершали. Параметрами, применяемыми для определения защиты, были серологические показатели в день вылупления, клинические признаки, смертность, масса тела, макроскопические поражения.

Результаты и обсуждение

Исследования патогенности и защиты потомства проводили в отношении промышленных бройлеров, используя иллюстративные штаммы с вариантом генотипа VA 2012 группы 1. В первом исследовании цыплят в день вылупления заражали через подушечку стопы S1133 либо изолятом варианта VA 2012 группы 1, а одну группу определяли в качестве отрицательного контроля. Дополнительно, в отдельной группе из 20 цыплят в день вылупления проводили забор крови для ELISA в отношении реовируса. Всех цыплят помещали в загоны с полом в отдельных изолированных помещениях на свежие опилки, и им предоставляли свободный доступ к пище и воде. Измерения подушечки стопы проводили каждые 2 дня, и птиц отслеживали каждый день на предмет клинических признаков до завершения эксперимента в день 14 (фигура 9). Среднее геометрическое титра (GMT) реовируса в ELISA для стаи составляло 1212, что считается низким значением для цыплят в день вылупления. Клинический тендосиновит и значительное снижение массы тела наблюдали в группах, зараженных как S1133, так и вариантом реовируса (фигуры 10 и 12). Несмотря на то, что у цыплят, зараженных S1133, степень поражения хромотой была более тяжелой, чем у зараженных вариантом, частота встречаемости отека вокруг сухожилия сгибателя пальцев была выше в группе, зараженной вариантом (фигура 11). Другие клинические признаки, наблюдаемые в зараженных группах, включали гидроперикард и воспаление пятки (фигура 12). Титры реовируса в день вылупления были низкими, и поэтому антитела материнского происхождения в программе вакцинации компании A не обеспечивали достаточную защиту от заражения вариантами группы 1. В дополнение, полевой изолят воспроизводил клиническое заболевание, наблюдаемое в полевых условиях, и был подтвержден в качестве возбудителя заболевания.

Во втором исследовании промышленных цыплят-бройлеров заражали через подушечку стопы вариантом группы 1 в возрасте 12 дней, и исследование завершали в возрасте 23 дней. GMT реовируса в ELISA, полученное в сыворотке, собранной в день вылупления, составляло 4900. В данном исследовании средние значения массы тела были лишь незначительно более низкими в зараженной группе по сравнению с отрицательными контролями (фигура 13). Тем не менее, зараженная группа демонстрировала клинические признаки и макроскопические поражения, характерные для вирусного артрита/тендосиновита (фигура 14). Как и в первом исследовании, у зараженных птиц наблюдали отек вокруг сухожилия сгибателя пальцев, а также гидроперикард (фигуры 12 и 13). Из данного исследования можно сделать вывод о том, что цыплята с более высокими уровнями антител материнского происхождения к реовирусу не были защищены от заражения вариантом группы 1.

Дополнительно, оценивали применение коммерческой вакцины на основе реовирусов, вводимой в полной дозе и в половине дозы подкожно промышленным бройлерам в день вылупления, с последующим заражением вариантом группы 1 в 12-дневном возрасте. Используя те же параметры, что и в предыдущих исследованиях, наблюдали клинические признаки и макроскопические поражения, характерные для VA/тендосиновита, во всех зараженных группах. Примечательно, что частота встречаемости гидроперикарда и отека пятки была, независимо от дозы, более высокой в группах, которых вакцинировали и заражали, по сравнению с группой, которую только заражали (фигура 14).

Таким образом, варианты реовирусов были выделены от индивидуумов с клиническими случаями вирусного артрита/тендосиновита и являются генетически и антигенно отличающимися от существующих в настоящее время вакцинных штаммов реовирусов. Две различные группы были идентифицированы как варианты реовирусов VA 2012 группы 1 и группы 2 на основании генетической и серологической характеристики. Исследования in vivo позволяют предположить, что существующие в настоящее время коммерческие вакцины не обеспечивают защиту цыплят с антителами материнского происхождения к реовирусу от заражения вариантами 2012 группы 1. Исследования in vivo с иллюстративным изолятом группы 2 приведены ниже в примере 3. Варианты реовирусов группы 1 и 2 были выделены или выявлены в клинических случаях тендосиновита во многих штатах США и в Канаде, при этом количество изолятов, принадлежащих к группе 1, превышало таковое для группы 2. Происхождение этих вирусов неизвестно.

Пример 3

Исследование патогенности варианта реовируса группы 2

Процедуры, описанные более подробно в примере 2, применяли для получения характеристик патогенности варианта реовируса группы 2 у промышленных бройлеров. Применяли иллюстративный штамм с вариантом генотипа VA 2012 группы 2 (Ck/96139 Tendon/GA/2012). Группы обработки описаны в таблице 3.

Таблица 3. Группы обработки

Цыплятам в подушечку стопы инокулировали 0,1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера или полевого изолята 996139 при 10³ TCID50 на птицу. Параметрами, применяемыми для определения защиты, были серологические показатели в день вылупления, клинические признаки, смертность, масса тела и макроскопические поражения. Отек подушечки стопы и отек сухожилия оценивали и измеряли на протяжении всего исследования.

Результаты и обсуждение

Серологические показатели в день вылупления, полученные с помощью ELISA в отношении реовируса (IDEXX), приведены на фигуре 17. Более конкретно, среднее значение составляет 511, GMT составляет 385, SD составляет 343, а % CV составляет 66,8%.

Как показано на фигуре 18, при заражении вирусом группы 2 уменьшается масса тела. Более конкретно, у птиц, зараженных вирусом группы 2, наблюдали снижение массы тела на 8%.

На фигуре 19 приведены значения измерения отека подушечки стопы в день 14 в виде процентной доли от массы тела, а на фигуре 20 приведены значения измерения отека сухожилия в виде процентной доли от массы тела, для птиц, зараженных вирусом группы 2.

Результаты некропсии и гистологического исследования птиц, зараженных вирусом группы 2, являются следующими: 2/10 птиц с разрывом сухожилия; 5/10 птиц с лимфоцитарным тендосиновитом (влагалище сухожилия); 2/10 птиц с гидроперикардом и 2/10 птиц с лимфоцитарным эпикардитом и миокардитом. Значительных поражений в печени или двенадцатиперстной кишке не наблюдали.

Таким образом, заражение вирусом группы 2 приводит к незначительному снижению массы. У птиц, зараженных вирусом группы 2, наблюдали гидроперикард, отеки сухожилий и несколько случаев разрыва сухожилий. При этом гистологические поражения, указывающие на реовирус, наблюдали в сердце и сухожилиях.

В заключение необходимо отметить, что варианты как группы 1, так и группы 2 выделены от промышленных бройлеров с клиническими случаями вирусного артрита. Варианты как группы 1, так и группы 2 воспроизводят тендосиновит, в том числе наблюдаемые макроскопически гидроперикард и отек сухожилия и указывающие на реовирус гистологические изменения, наблюдаемые в сердцах и сухожилиях. Варианты группы 1 более распространены. Существующие в настоящее время коммерческие вакцины, по-видимому, не обеспечивают достаточную защиту бройлеров. Таким образом, аутогенная вакцинация представляется единственным существующим в настоящее время возможным вариантом борьбы.

Пример 4

Анализ бляшкообразования для реовируса птиц

Посев клеток печени куриных эмбрионов на чашки размером 35 мм:

-За день до анализа добавить клетки печени куриных эмбрионов (CELiC) в чашки Петри размером 35 мм (2 мл на чашку Петри).

-Поместить чашки размером 35 мм в инкубатор при 37°C (на всю ночь, по меньшей мере более чем на 12 часов).

Процедура анализа бляшкообразования:

-Удалить среду (M199/F10+10% FBS) с конфлюентных CELiC.

-Добавить 200 мкл вируса (10² TCID₅₀) в чашку.

-Через тридцать минут добавить 2 мл M199/F10+2% CS с растворенным вирусом в чашку и аккуратно перемешать содержимое чашки путем вращения.

-Инкубировать чашку в течение 3-4 часов при 37°C.

-В это время приготовить по 2 мл на чашку: 1 мл (M199/F10 +5% CS, 2x концентрация) и 1 мл 3% агарозы SeaPlaque в H₂O со степенью очистки для культур клеток.

-Через 3-4 часа достать чашку из инкубатора и удалить надосадочную жидкость (1200 мкл).

-Теперь добавить по 2 мл на лунку приготовленного верхнего слоя и инкубировать в течение 2-3 дней при 37°C.

Окрашивание через 2-3 дня (обычно стараются окрашивать через 2 дня после инокуляции, если это делать более чем через 3 дня, клетки начнут погибать, и бляшки могут быть недостаточно хорошими):

-Приготовить 10% фильтрованный нейтральный красный, разбавленный в воде со степенью очистки для культур клеток.

-Добавить 1 мл на чашку.

-Инкубировать в течение не менее 2 часов (2-4 часа) в инкубаторе.

-Через пару часов появятся четко различимые бляшки.

Результаты. Клетки печени окрасятся красным. Бляшки останутся неокрашенными.

Пример 5

Последовательности белка сигма-С группы 1 и группы 2

Следующие процедуры более подробно описаны в примере 1, в них определяли нуклеотидные последовательности, кодирующие белок сигма-С, и кодируемые аминокислотные последовательности сигма-С 122 вариантов реовирусов птиц группы 1 и группы 2. На фигуре 21 приведены номер доступа в GenBank, ID последовательности, обозначение изолята, тип ткани, из которой были выделены вирусы, дата забора, штат и страна выделения и источник выделения для 122 изолятов. Клетки печени куриных эмбрионов служили в качестве лабораторного хозяина для всех 122 изолятов.

Пример 5

Аттенуация вариантов реовирусов птиц группы 1 и группы 2

Изоляты реовирусов птиц группы 1 и группы 2, перечисленные на фигуре 21, в том числе, без ограничения, изоляты 94826 и 94594 (оба являются изолятами группы 1) и изолят 96139 (изолят группы 2), аттенуируют посредством пассажа в яйцах или в линиях клеток, таких как, например, клетки печени куриных эмбрионов (CELiC). Клональный, очищенный с помощью бляшкообразования препарат вируса получают после каждого пассажа и применяют для следующего цикла аттенуации. Патогенность изолята и эффективность вакцины на его основе тестируют через приблизительно каждые 25 пассажей, например, через приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 75, приблизительно 100 и приблизительно 125 пассажей. Для аттенуированных штаммов можно получить аминокислотную последовательность белка сигма-C.

Полное раскрытие всех патентов, заявок на патенты и публикаций, а также материалов, доступных в электронном виде (включающих, например, нуклеотидные последовательности, предоставленные, например, в GenBank и RefSeq, и аминокислотные последовательности, предоставленные, например, в SwissProt, PIR, PRF, PDB, и продукты трансляции аннотированных кодирующих участков в GenBank и RefSeq), цитируемых в данном документе, включено посредством ссылки. В случае, если существует какое-либо несоответствие между раскрытием настоящей заявки и раскрытием(раскрытиями) любого из документов, включенных в данный документ посредством ссылки, раскрытие настоящей заявки имеет преимущественную силу. Вышеизложенные подробное описание и примеры были представлены исключительно для четкости понимания. На основании этого не должны истолковываться никакие излишние ограничения. Настоящее изобретение не ограничивается приведенными и описанными подробными деталями, а что касается вариантов, очевидных для специалиста в данной области, то они будут включены в настоящее изобретение, определенное формулой изобретения.

Свободный перечень последовательностей

SEQ ID NO:1

Нуклеотидная последовательность S1, кодирующая белок сигма-С (пары оснований 1-931), из полевого изолята 94594 варианта VA 2012 группы 1

SEQ ID NO:2

Аминокислотная последовательность сигма-С, кодируемая S1 (аминокислоты 1-310), из полевого изолята 94594 варианта VA 2012 группы 1

SEQ ID NO:3

Нуклеотидная последовательность S1, кодирующая белок сигма-С (пары оснований 1-931), из полевого изолята 94826 варианта VA 2012 группы 1

SEQ ID NO:4

Аминокислотная последовательность сигма-С, кодируемая S1 (аминокислоты 1-310), из полевого изолята 94826 варианта VA 2012 группы 1

SEQ ID NO:5

Нуклеотидная последовательность S1, кодирующая белок сигма-С (пары оснований 1-931), из полевого изолята 96139 варианта VA 2012 группы 2

SEQ ID NO:6

Аминокислотная последовательность белка сигма-С, кодируемая S1 (аминокислоты 1-310), из полевого изолята 96139 варианта VA 2012 группы 2

SEQ ID NO:7 - праймер P1 для ПЦР

SEQ ID NO:8 - праймер P4 для ПЦР

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенный реовирус птиц, где реовирус птиц содержит белок сигма-С, содержащий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2. Изобретение относится также к композиции для индукции выработки антител у сельскохозяйственной птицы, содержащей реовирус согласно изобретению фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение позволяет обеспечить защиту кур от заболевания, вызываемого такими вирусами. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 21 ил., 3 табл., 5 пр.

Формула