Оптимизированный полипептид для субъединичной вакцины против реовируса птиц - RU2742250C2

Код документа: RU2742250C2

Чертежи

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится, в общем, к вакцинам против реовируса птиц.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Реовирус птиц (ARV) является представителем рода Orthoreovirus в семействе Reoviridae. Он связан с рядом заболеваний, наиболее известным из которых является синдром вирусного артрита (теносиновит), который характеризуется набуханием суставов и поражениями в икроножных сухожилиях и вызывает значительные экономические потери в птицеводстве. Восприимчивость к ARV-инфекции чаще всего встречается у молодых (возрастом 1-2 недели) цыплят. Контроль над вирусным теносиновитом у кур-бройлеров обеспечивается антителами, которые передаются потомству после вакцинации родительских стай. Доступные живые аттенуированные и инактивированные вакцины против ARV основаны на штамме S1133 (van der Heide et al., 1983), а также выделенных штаммах, принадлежащих к одному серотипу (Goldenberg et al., 2010). Однако эти вакцины не являются эффективными против различных ARV, обнаруженных в мире (Jones 2000, Goldenberg et al., 2010; Lublin et al., 2011).

Секвенирование белка сигма C (SC) изолятов ARV для генетической характеристики позволило провести их разделение на генотипы (Kant et al., 2003; Lublin et al., 2011; Goldenberg et al., 2010; Troxler et al., 2013). Вакцинация на основе смеси четырех представителей генотипов ARV обеспечивала защиту от всех тестируемых вирусов четырех генотипов [Lublin et al. 2011; WO 2009/093251]. Внешний белок SC, связывающийся с капсидом ARV, кодируемый геном S1, является относительно небольшим белком, состоящим из 326 аминокислот (Benavente & Martinez-Costas 2007), гомотримером с третичной структурой, состоящей из двух доменов: «голова», который расположен на С-конце белка и «стержень» на N-конце. Кристаллическая структура C-концевого домена и остатков 117-326 была определена (Guardado Calvo et al., 2005; Guardado-Calvo et al., 2009). SC индуцирует реовирус-специфические нейтрализующие антитела (Shapouri et al., 1996; Grande et al., 1997), что делает его подходящим кандидатом для рекомбинантной субъединичной вакцины.

Действительно, эффективные рекомбинантные вакцины в прошлом были разработаны против ряда вирусов, включая вакцины против гепатита В (McAleer et al., 1984) и против папилломавируса (Valentino & Poronsky 2015) у людей, а также против инфекционного бурсита птиц (IBD) (Pitcovski et al., 2003) и синдрома снижения яйценоскости у кур (Fingerut et al. 2003) и геморрагического энтерита у индюков (Pitcovski et al., 2005). SC экспрессировался в различных системах экспрессии, включая бактерии, бакуловирус, дрожжи, растения и клетки млекопитающих. Рекомбинантные белки были использованы для диагностики чтобы различать штаммы. Было показано, что анти-SC-антитела нейтрализуют вирус в клеточных линиях [28,31]. В предыдущем исследовании SC, экспрессируемый в бактериях, проявлял лишь слабую иммуногенность (Goldenberg et al., 2011; Vasserman et al., 2004). Поэтому существует большая потребность в эффективной вакцине против ARV.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте данное изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему или по существу состоящему из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотным остаткам, образующим полный или частичный α-спиральный домен, шарнирный домен, домен тройной β-спирали и полный или частичный глобулярный головной домен белка сигма C реовируса птиц и не имеющему последовательность аминокислот, которая является N-терминальной по отношению к указанному α-спиральному домену.

В дополнительном аспекте данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один из выделенных полипептидов, определенных в данном документе.

В другом аспекте данное изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с указанной молекулой нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе, причем указанный экспрессионный вектор разработан для репликации и экспрессии соответствующих генов, например, в клетке бактерий, дрожжей или насекомых.

В следующем аспекте данное изобретение относится к вакцине, содержащей, по меньшей мере, один из выделенных полипептидов, описанных в данном документе.

В еще одном аспекте данное изобретение предлагает вакцину, содержащую экспрессионный вектор млекопитающих, такой как pcDNA3, содержащий контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе.

В дополнительном аспекте данное изобретение относится к вирусному вектору, такому как рекомбинантный вирус болезни Марека (MD), содержащему контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе.

В еще одном аспекте данное изобретение относится к любой из вакцин или вирусных векторов, описанных в данном документе для применения при вакцинации видов птиц или для применения в индуцировании иммунного ответа птиц, обеспечивающего защиту от реовируса птиц.

В еще одном дополнительном аспекте данное изобретение относится к способу вакцинации видов птиц против реовируса птиц или для индуцирования иммунного ответа птиц, обеспечивающего защиту от реовируса птиц, который включает введение птице любой из вакцин или вирусных векторов, описанных в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1A-B изображена эффективная экспрессия сигма С изолятов ARV; His-меченые остатки 122-326 экспрессировались в E. coli BL21. Окрашивание Кумасси Бриллиантовым Синим (A) демонстрирует устойчивую экспрессию белков ожидаемого молекулярного размера. Их идентичность была подтверждена с использованием мышиного моноклонального анти-His-антитела с помощью вестерн-блоттинга (B). Дорожка 1: растворимый SC1 133, дорожка 2: растворимый SC528, дорожка 3: растворимый SC5223, дорожка 4: растворимый SC5215, дорожка 5: нерастворимый SC1 133, дорожка 6: нерастворимый SC528, дорожка 7: нерастворимый SC5223, дорожка 8: нерастворимый SC5215, дорожка 9: отрицательный контроль (остатки сигма C 1-326 без his-метки, полученные в E. coli). Дорожка 10: маркер молекулярного веса. Стрелка указывает на белок сигма С.

На Фиг. 2 изображена гистограмма с титрами антител после вакцинации рекомбинантными белками SC1-326, SC122-326 и SC192-326, все из которых являются последовательностями ARV S1133. Контроли: N.C - отрицательный контроль (птицы, вакцинированные с помощью PBS в адъюванте), P.C - положительный контроль (инъецированные ARV S1133). *** Значимые различия при P <0,001.

На Фиг. 3 изображена гистограмма, демонстрирующая обнаружение вируса антителами, полученными после инъекции белка. Относительный уровень антител против ARV после инъекции SC 1-326, SC122-326 и SC192-326 представлен как отношение между OD тестируемого образца (S) и антител против ARV 1133, представленных в KIT, которые служат положительным контролем (P) (S/P). Значение более 0,2 считается положительным (распознавание вируса). N.C - отрицательный контроль (птицы, вакцинированные с помощью PBS в адъюванте). *** Значимые различия при P <0,001.

На Фиг. 4 изображена гистограмма, демонстрирующая пролиферацию лимфоцитов, полученных из селезенок птиц, вакцинированных с помощью PBS в адъюванте в качестве отрицательного контроля (N.C.), штаммом вакцины против ARV S1133 в качестве положительного контроля (P.C.), SC1-326 или SC122-326, после стимуляции с помощью ARV. Клетки обрабатывали конканавалином A (ConA) или липополисахаридом (LPS) в качестве контролей клеточной пролиферации в ответ на неспецифические антигены (Ag), ARV для специфической Ag-пролиферации или самой средой в качестве отрицательного контроля (NC). Измеренное поглощение пропорционально количеству жизнеспособных клеток. Результаты представлены как индекс стимуляции (SI), представляющий соотношение между стимулированными и не стимулированными клетками. ***, ** Значимо отличается при P <0,001 и 0,01 соответственно.

На Фиг. 5 изображен линейный график, показывающий влияние первичной вакцинации с помощью SC 122-326 на вторичный ответ на ARV. Результаты выражены как конечные точки разведения, определенные с помощью ИФА (оптическая плотность (OD) была измерена при 450 нм). Отрицательный контроль - вакцинация с помощью PBS и адъюванта. Круги - первичный иммунный ответ на штамм вакцины против ARV S1133; Квадраты - Иммунный ответ на ARV после первичной вакцинации с помощью SC 122-326; Неперевернутые треугольники - Иммунный ответ на ARV после первичной вакцинации с помощью ARV; Перевернутые треугольники - Отрицательный контроль. *** Значимо отличается при P <0,001.

На Фиг. 6 изображена модель частичной структуры (аминокислоты 117-326) белка сигма C (SC) штамма S1133 реовируса птиц. Числа представляют собой положения аминокислот в структуре белка. Согласно Guardado-Calvo et al. [18].

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Реовирус птиц (ARV) мутирует относительно быстро, и во всем мире существует много вариантов. Вакцины, которые защищают от одного генотипа, неэффективны против других (Lu et al. 2015; Vasserman et al. 2004; Goldenberg et al. 2010; Shapouri et al. 1995). Производство аттенуированной вакцины является длительным процессом, и неэффективным в случае сильно мутированных вирусов. Адаптация вакцин к изменениям в полевом вирусе заключается в использовании инактивированных вакцин, которые производятся путем размножения вирулентных изолятов в клеточных культурах или оплодотворенных яйцах и последующей их инактивации. В эпоху молекулярной биологии субъединичные вакцины могут быть получены с помощью генной инженерии. В этом способе в системе экспрессии продуцируется только соответствующий обновленный белок для индукции нейтрализующих антител. Как показано ранее [26, 27], белок сигма C (SC) в его полной 326-аминокислотной форме может быть экспрессирован в бактериальной системе экспрессии. Однако, хотя антитела против S1133, вирусного штамма ARV, идентифицируют рекомбинантный SC, был получен низкий титр антител в ответ на иммунизацию этим белком.

Три различных фрагмента остатков белка 1-326, 122-326 и 192-326 (Фиг. 5) были идентифицированы и испытаны в соответствии с данным изобретением в качестве кандидатов для субъединичной вакцины, которая будет индуцировать наивысший уровень нейтрализующих анти-ARV антител. Данное изобретение основано на том, что, хотя SC 1-326 индуцирует низкий титр антител, два других фрагмента индуцируют иммунный ответ с высоким титром антител, наиболее выделяющимся из которых является SC 122-326 (Фиг. 2). Было также установлено, что после стимуляции спленоцитов, выделенных от птиц, вакцинированных различными полипептидами SC, только клетки птиц, подвергшихся воздействию полипептида SC 122-326, пролиферировали в той же степени, что и положительный контроль, при котором была проведена вакцинация целым вирусом (Фиг. 4).

Поскольку SC 122-326 обеспечивал самые высокие уровни антител, он был дополнительно проанализирован. Способность получать вторичный иммунный ответ против ARV после прайминга с помощью SC 122-326 показала, что те же В- и Т-лимфоциты индуцируются с помощью SC 122-326 и целым вирусом (Фиг. 5). Это позволяет проводить вакцинацию в молодом возрасте с помощью SC 122-326 и преодолевать неспособность антител материнского происхождения стимулировать полный ответ.

Эффективность SC 122-326 в качестве вакцины против ARV была дополнительно протестирована с помощью теста на нейтрализацию вируса. Антитела, продуцируемые против белка SC, показали успешную нейтрализацию в клеточных системах [28, 45]. Однако тесты на нейтрализацию более точны при прогнозировании вирусной нейтрализации у взрослых птиц. Таким образом, в соответствии с данным изобретением было обнаружено, что антитела, продуцируемые после инъекции белка SC 122-326, являются протективными, исключая заражение эмбрионов птиц вирулентным штаммом в той же степени, что и антитела, продуцируемые в ответ на целый вирус (Таблица 5). Следует отметить, что антитела, полученные после инъекции полного белка SC (SC 1-326), не являются протективными. Таким образом, очевидно, что выделенный полипептид SC 122-326 имеет значительно отличающиеся характеристики, чем эквивалент в контексте полного белка.

С учетом вышеизложенного в одном аспекте данное изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему или по существу состоящему из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотным остаткам, образующим полный или частичный α-спиральный домен, шарнирный домен, домен тройной β-спирали и полный или частичный глобулярный головной домен белка сигма C реовируса птиц, как изображено на Фиг. 6, и не имеющему последовательность аминокислот, которая является N-терминальной по отношению к указанному α-спиральному домену.

Термин «выделенный полипептид» относится к факту, что аминокислотная последовательность представляет собой фрагмент полноразмерного белка сигма С, который экспрессируется вне его естественного контекста в полноразмерном белке сигма С и используется в данном документе взаимозаменяемо с термины «рекомбинантный полипептид», «синтетический полипептид» или «фрагмент полноразмерного белка сигма С».

Различные области белка сигма C хорошо охарактеризованы, как описано в Guardado-Calvo, 2009; При рассмотрении общей структуры наблюдается четкое разделение между стержневым (аминокислотные остатки 117-191) и глобулярными головным доменами (аминокислотные остатки 196-326). Стержневой домен можно далее подразделить на a-спиральную тройную суперспираль (аминокислотные остатки 117-154), линкерную область (аминокислотные остатки 155-159) и два повтора тройной β-спирали (аминокислотные остатки 160-191).

В некоторых вариантах реализации изобретения выделенный полипептид содержит или, по существу, состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотным остаткам 70-326, 117-326 или, в особенности, 122-326, белка сигма C штамма S1 133 ARV, как указано далее в SEQ ID NO: 1, обозначенный в данном документе как «внутренняя последовательность белка S1 133» или «внутренняя аминокислотная последовательность». В частности, внутренняя аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотным остаткам 70-326, 117-326 или 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

В других конкретных вариантах реализации изобретения любой из изолированных полипептидов, определенных выше, блокирует или уменьшает связывание инфекционного реовируса птиц с нативным рецептором белка сигма C реовируса птиц. Способы измерения связывания лигандов с белками хорошо известны в данной области техники, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как описано в Barton Erik S, J.Craig Forres, Jodi L Connolly, James D Chappell, Yuan Liu, Frederick J Schnell, Asma Nusrat, Charles A Parkos, Terence S Dermody. Junction Adhesion Molecule Is a Receptor for Reovirus. Cell, Vol. 104, 441-451, February 9, 2001.

В еще более конкретных вариантах реализации изобретения любой из выделенных полипептидов, определенных выше, при введении птице, необязательно в сочетании с адъювантом, индуцирует защитный иммунный ответ против инфекционного реовируса птиц. В некоторых вариантах реализации изобретения, когда какой-либо один из выделенных полипептидов, определенных выше, вводится птице, он вызывает образование значительно более высоких системных уровней нейтрализующего антитела против белка сигма С по сравнению с системными уровнями указанного антитела, полученными после введения птице полноразмерного белка сигма C штамма S1133 ARV. Способы измерения индукции защитного иммунного ответа у птиц хорошо известны в данной области техники. Например, как описано в Примерах ниже, титр антител можно легко измерить в сыворотке вакцинированных птиц с помощью теста ИФА и способность сыворотки нейтрализовать вирулентный реовирус может быть легко исследована путем мониторинга ингибирования эмбриональной смертности после инокуляции живого вируса.

В некоторых вариантах реализации изобретения любой из выделенных полипептидов, определенных выше, содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, при не менее 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с внутренней аминокислотной последовательностью белка сигма C, выбранной из группы, указанной в Таблице 1, указанная внутренняя аминокислотная последовательность соответствует аминокислотным остаткам 70-326, 117-326 или 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах реализации изобретения любой из выделенных полипептидов, определенных выше, включает аминокислотную последовательность, соответствующую внутренней аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности белка сигма С, выбранного из группы, указанной в Таблице 1, указанная внутренняя аминокислотная последовательность соответствует аминокислотным остаткам 70-326, 117-326 или 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

В конкретных вариантах реализации изобретения выделенный полипептид содержит или по существу состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, такой как SEQ ID NO: 2 (т.е. внутренней последовательности белка SI 133, ISR5223, ISR5215 и ISR528, соответственно).

Таблица 1: Номера доступа баз данных для репрезентативных полноразмерных белков сигма C реовируса птиц.

ИзолятНомер доступа¹SIN²ИзолятНомер доступаSIN²S1133AAK18188.11ISR529FJ79352820ISR521FJ7935226ISR5211FJ79352421ISR526FJ7935377ISR5213FJ79353322ISR5215FJ793531859103AAQ01229.123ISR 5220FJ7935329ISR5212FJ79352624ISR 5225FJ79354610ISR5210FJ79352725ISR 5226FJ79354711ISR5216FJ79353026ISR 522FJ 79354012ISR5234FJ79353427ISR 5217FJ79353513ISR5231FJ79353628ISR 5221FJ79354214ISR5229FJ79353829ISR 5222FJ79354315ISR525FJ79353930ISR 5223FJ79354416ISR523FJ79354131ISR 524FJ79352517ISR5224FJ79354532ISR 527FJ79352918ISR5219FJ79354833ISR 528FJ79352319ISR5233FJ79354934¹База данных NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov;²SIN, SEQ ID NO:

В некоторых вариантах реализации изобретения любой из выделенных полипептидов, определенных выше, дополнительно содержит метку для идентификации и/или очистки, такую как полигистидиновая метка (например, His₆), но также может быть метка (His-Asn)₆, FLAG-метка или любая другая метка, которая может способствовать очистке полипептида. Можно использовать единственную метку или множество ее копий, или можно использовать различные метки в комбинациях. Метка(и) может быть слита с С-концом или N-концом полипептида. Например, выделенный полипептид, имеющий внутреннюю аминокислотную последовательность белка, указанную в любой из SEQ ID NO: 1 и 6-34, такой как SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, может дополнительно содержать метку для идентификации и/или очистки, такую как описанная выше.

Для экспрессии описанных выше полипептидов бактериальные или эукариотические клетки, такие как дрожжи или растительные клетки, могут быть трансформированы молекулой нуклеиновой кислоты, а экспрессированный полипептид может быть очищен с использованием метки для очистки, вставленной в полипептид и/или с помощью других способов очистки белка, хорошо известных в данной области техники. Предпочтительно, полипептид экспрессируется в бактериальной клетке, более предпочтительно E. coli.

Для использования в иммуногенных композициях/вакцинах любой из указанных выше полипептидов может быть скомбинирован с белком-носителем, таким как, но не ограничиваясь этим, термолабильный энтеротоксин (LT) E. coli, бычий сывороточный альбумин и флагеллин. Белок-носитель может быть слит с N- или С-концом полипептида либо он может фланкировать полипептид на обоих концах. Белок-носитель может быть слит с полипептидом рекомбинантными способами, то есть полипептид и белок-носитель кодируются одной последовательностью нуклеиновой кислоты и экспрессируются в виде непрерывного полипептида. Альтернативно, полипептид и белок-носитель могут быть получены отдельно, а затем химически присоединены друг к другу.

Предпочтительным белком-носителем для всех аспектов данного изобретения является белок LT. Он обеспечивает функцию носителя, а также известен как мощный адъювант при инъекции и пероральном введении, который способен системно индуцировать сильный ответ IgG и локальный ответ IgA, а также цитотоксический ответ Т-клеток-хелперов. Поскольку реовирус представляет собой мукозальный антиген, предпочтительно стимулировать иммунный ответ мукозальной системы. Антитела IgA, полученные с помощью пероральных вакцинаций в тканях слизистой оболочки, являются основными сдерживающими факторами против мукозальных антигенов. LT-белок представляет собой гексамер, который состоит из двух субъединиц: 27-kDa каталитического домена A (LTA), закрепленного в кольце из пяти идентичных 11,6-кДа B-субъединиц (LTB). Фрагмент A1 является токсичным и катализирует перенос ADP-рибозы из NAD в стимулирующие α-субъединицы G-белков (Gsα). Для использования LT в качестве иммуностимулятора у животных его токсичность может быть нейтрализована мутациями (Vasserman, Y., Pitcovski, J., 2006). Либо одна из субъединиц A и B может использоваться в соединении с полипептидом согласно изобретению.

Полипептид также может быть присоединен к физиологически приемлемым микрогранулам, которые могут содержать молекулы энхансера, такие как LT, в дополнение к полипептиду. Альтернативно, полипептид может быть косвенно связан с носителем посредством антител или биотинилированных полипептидов, может быть связан с носителем через авидин или стрептавидин.

Микрочастицы, предназначенные для использования в данном изобретении, предпочтительно имеют размер в диапазоне от 10 нм до 200 мкм. Размер, выбранный для конкретной микрочастицы, будет зависеть от поставляемого активного агента и предполагаемого пути введения. Для пероральной доставки частицы обычно имеют диапазон размеров от 0,5 до 5,0 мкм. Для подкожной доставки подходящий размер составляет менее 100 мкм. Микрочастицы для парентеральной доставки обычно имеют размер менее 200 мкм, предпочтительно менее 150 мкм.

В дополнительном аспекте данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из выделенных полипептидов, определенных выше.

В другом аспекте данное изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, описанной выше, причем указанный экспрессионный вектор предназначен для репликации и экспрессии соответствующих генов, например, в клетке бактерий, дрожжей или насекомых.

Изобретение дополнительно рассматривает клетки, содержащие и/или экспрессирующие любой из векторов экспрессии, определенных выше. Примеры клеток, подходящих для экспрессии полипептидов согласно данному изобретению представляют собой бактериальные клетки, такие как клетки E.coli, клетки дрожжей, клетки насекомых, растительные клетки или клетки млекопитающих.

В следующем аспекте данное изобретение относится к вакцине, содержащей, по меньшей мере, один из выделенных полипептидов, описанных выше.

В еще одном аспекте данное изобретение предлагает вакцину, содержащую экспрессионный вектор млекопитающих, такой как pcDNA3, содержащий контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с любой из молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше.

В дополнительном аспекте данное изобретение относится к вирусному вектору, такому как рекомбинантный вирус болезни Марека (MD), содержащий контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с любой из молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше.

В WO 2009/093251, включенной посредством ссылки, как если бы она была полностью раскрыта в данном документе, раскрыто, что высоковариабельная и иммуногенная аминокислотная последовательность белка сигма C содержит консервативные и иммуногенные домены, которые являются общими для всех изолятов реовируса птиц, идентифицированных в Израиле и других странах. Выявленные консервативные последовательности расположены между аминокислотным остатком, соответствующим аминокислотным остаткам 170 и 323 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

Термин «консервативный домен» относится к домену, сохраняющемуся среди вариантов вируса; а именно, аминокислотные последовательности доменов сходны, но не обязательно абсолютно идентичны друг другу.

WO 2009/093251 далее раскрывает, что генетически вариабельные штаммы реовируса птиц, или изоляты, инфицирующие птиц в Израиле и в других странах можно разделить на четыре группы в соответствии с изменчивостью аминокислотной последовательности белка сигма С, выраженной в изолятах. Один представитель одной из групп представляет собой только часть изолятов реовируса птиц в природе; однако один представитель каждой из четырех групп, взятые вместе, представляют собой много, если не большинство, вариантов, существующих в природе. Четыре группы изолятов реовируса (RI) упоминаются в данном документе как группы RI I-IV (Таблица 2).

Определяющей особенностью каждой группы RI является то, что аминокислотные последовательности различных белков сигма С указанной группы RI имеют по меньшей мере 75% идентичности. Состав групп может незначительно варьировать в зависимости от алгоритма и программного обеспечения, используемого для анализа последовательностей. Важная концепция заключается в том, что каждая группа представляет собой долю вирусной популяции и что отдельные представители, взятые из каждой из групп, вместе представляют собой всю вирусную популяцию.

Поскольку консервативные иммуногенные домены находятся в выделенном полипептиде согласно данному изобретению, концепция, раскрытая в WO 2009/093251, может быть использована для получения улучшенной вакцины, содержащей выделенные полипептиды согласно данному изобретению, которые представляют собой всю вирусную популяцию.

В соответствии с данным изобретением было обнаружено, что внутренний полипептид белков сигма С четырех различных вариантов реовируса птиц, каждый из которых соответствует аминокислотным остаткам 122-326 белка сигмы C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1 можно эффективно экспрессировать in vitro.

В некоторых вариантах реализации изобретения вакцина содержит по меньшей мере два разных рекомбинантных полипептида; или в случае вакцины, содержащей экспрессионный вектор млекопитающих или вирусный вектор, молекула нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере два разных рекомбинантных полипептида; и каждый из указанных, по меньшей мере, двух различных рекомбинантных полипептидов получают из представителя одной из двух, трех или четырех групп различных белков сигма С, причем определяющим признаком каждой группы является то, что аминокислотные последовательности различных белков сигма С указанной группы имеют по меньшей мере 75% идентичности, необязательно, как показано в Таблице 2, и как описано в WO 2009/093251, включенной посредством ссылки, как если бы она была полностью раскрыта в данном документе. Используемый в данном документе термин «производный от» означает, что рекомбинантный полипептид представляет собой фрагмент репрезентативного белка сигма С, содержащего аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 70-326, 117-326 или 122-326 белка сигма С штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1. Вакцина может быть модифицирована путем замены одного полипептида, который является представителем для одной группы на другой полипептид из той же самой группы.

Таблица 2. Изоляты реовируса (RI) из Израиля, классифицированые в четырех группах RI и SEQ ID NO (SIN) белков сигма C (SCP), классифицированые в четырех соответствующих группах SCP.

IIIIIIIVRI#SCP SIN²RI#SCP SIN²RI#SCP SIN²RI#SCP SIN²ISR5216ISR52212ISR524175910323ISR5267ISR521713ISR52718S11131ISR5215¹8ISR522114ISR52819SR52209ISR522215ISR52920ISR522510ISR522316ISR521121ISR522611ISR521322

¹Жирным: изоляты, экспрессирующие вариант белка сигма C, наиболее соответствующий его группе.

²SIN, SEQ ID NO:

Например, один из по меньшей мере двух разных выделенных полипептидов может быть выделенным полипептидом, полученным из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (Группа I); полипептидом, полученным из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II); полипептидом, полученным из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 17-22 (Группа III); или полипептидом, полученным из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV). Вакцина дополнительно содержит один, два, три или более дополнительных различных полипептидов, как определено выше. В конкретных вариантах реализации изобретения в каждой из вышеуказанных соответствующих комбинаций различные полипептиды имеют аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.

В другом примере два из по меньшей мере двух различных полипептидов могут представлять собой первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (группа I) и второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II); первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (Группа I) и второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 17-22 (Группа III); первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (Группа I) и второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV); первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II) и второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 17-22 (Группа III); первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II) и второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV); или первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 17-22 (Группа III) и вторым полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV). Вакцина дополнительно содержит один, два или более дополнительных полипептидов, как определено выше.

В конкретных вариантах реализации изобретения в каждой из вышеупомянутых соответствующих комбинаций два различных полипептида имеют аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.

Альтернативно, три из по меньшей мере двух различных полипептидов могут представлять собой первый полипептид, полученным из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (Группа I), второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II) и третий полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет не менее 75% идентичности по SEQ ID NO: 17-22 (Группа III); первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (Группа I), второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II) и третий полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV); первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (Группа I), второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 17-22 (Группа III) и третий полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV); или первый полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II), второй полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности по SEQ ID NO: 17-22 (Группа III) и третий полипептид, полученный из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV). В конкретных вариантах реализации изобретения в каждой из вышеуказанных соответствующих комбинаций три различных полипептида имеют аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5. Вакцина дополнительно содержит один или более дополнительных полипептидов, как определено выше.

В некоторых вариантах реализации изобретения вакцина содержит четыре различных полипептида; или вакцина, содержащая экспрессионный вектор млекопитающих или вирусный вектор, содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую четыре различных полипептида, причем первый из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (Группа I); второй из указанных четырех различных полипептидов получают из белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II); третий из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 17-22 (Группа III); и четвертый из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 или 23 (Группа IV).

В конкретных вариантах реализации изобретения первый из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85% по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 8 (Группа I); второй из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 16 (Группа II); третий из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% , или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 19 (Группа III); и четвертый из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 23 (Группа IV).

В конкретных вариантах реализации изобретения первый из указанных четырех различных полипептидов происходит от полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-11 (Группа I); второй из указанных четырех различных полипептидов происходит от полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-16 (Группа II); третий из указанных четырех различных полипептидов происходит от полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-22 (Группа III); и четвертый из указанных четырех различных полипептидов происходит от полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV). В более конкретных вариантах реализации изобретения четыре различных полипептида имеют аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах реализации изобретения любая из вакцин согласно данному изобретению содержит фармацевтически приемлемое количество фармацевтически приемлемого разбавителя или носителя. Фармакологически приемлемые разбавители и носители, подходящие для использования в вакцине согласно изобретению, могут представлять собой любой обычный жидкий носитель, подходящий для ветеринарных фармацевтических композиций, такой как сбалансированный солевой раствор, подходящий для использования в тканях или средах для культивирования клеток, например, фосфатно-солевой буферный раствор или дистиллированную воду. Другие подходящие среды могут включать эмульсии. Обезжиренное сухое молоко можно использовать в качестве носителя в вакцинах, приготовленных для применения с помощью питьевой воды.

В некоторых вариантах реализации изобретения любая из вакцин согласно данному изобретению, независимо от того, содержит ли она фармацевтически приемлемое количество фармацевтически приемлемого разбавителя или носителя или нет, дополнительно содержит адъювант, такой как термолабильный энтеротоксин (LT), полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия; и/или консервант, такой как тимеросал или 20% эмульсии вода-в-масле с, например, минеральным маслом Marcol 52 (ESSO, Франция).

В еще одном аспекте данное изобретение относится к любой из вакцин или вирусных векторов, описанных выше, для использования при вакцинации видов птиц или для использования в индуцировании иммунного ответа птиц, обеспечивающего защиту от реовируса птиц. Вакцина или вирусный вектор могут использоваться вместе с фармацевтически приемлемым количеством фармацевтически приемлемого разбавителя или носителя и/или адъюванта, как описано выше.

В еще одном дополнительном аспекте данное изобретение относится к способу вакцинации видов птиц или для индуцирования иммунного ответа птиц, обеспечивающего защиту от реовируса птиц, который включает введение птице любой из вакцин или вирусных векторов, описанных выше. В конкретных вариантах реализации изобретения вакцина содержит комбинацию из четырех изолированных полипептидов, как описано выше. Вакцину или вирусный вектор можно вводить вместе с фармацевтически приемлемым количеством фармацевтически приемлемого разбавителя или носителя и/или адъюванта, как описано выше.

В некоторых вариантах реализации изобретения виды птиц, которые могут быть вакцинированы с использованием любой из вакцин и способов, описанных в данном документе, представляют собой любые виды птиц, которые производятся на коммерческой основе, такие как домашняя птица, например, куры, индейки, утки, гуси, фазаны, голуби или цесарки.

В некоторых вариантах реализации изобретения описанное выше применение или способ индуцирует продукцию значительно более высоких, например, статистически значимо более высоких, системных уровней нейтрализующего антитела против белка сигма C по сравнению с системными уровнями указанного антитела, полученными после введения указанной птице полноразмерного белка сигма С штамма S1133 ARV.

В некоторых вариантах реализации изобретения вакцина может быть введена любым подходящим способом введения, таким как инъекция, внутрикожно или подкожно; или перорально с питьевой водой.

Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.

ПРИМЕРЫ

Материалы и Способы

Экспрессия белка SC

Три фрагмента кДНК SC из штамма вакцины S1133, кодирующего остатки SC 1-326, 122-326 и 192-326, были получены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специально разработанными олигонуклеотидами (Таблица 3). Фрагменты 122-326 и 192-326 были разрезаны рестрикционными ферментами BamHI и EagI, сайты разрезания которых были введенными в праймеры во время синтеза, и были

Таблица 3. Разработанные олигонуклеотиды для амплификации фрагментов сигма C (SC).

Метка^аНаправлениеПоследовательность Праймера (5`-3`)Ожидаемый размер (п.о.)SC122-326ПрямоеGGGGGATCCGACGGAAACTCCACTGCC669SC122-326ОбратноеGGGCGGCCGTTAGGTGTCGATGCCGGSC192-326ПрямоеGGGGGATCCTCGGCGGAGGCTAACTAATGC459SC192-326ОбратноеGGGCGGCCGTTARRTGTCGATGCCGG

^aОлигонуклеотиды были разработаны для амплификации гена, кодирующего частичные белки SC122-326 и SC192-326; 5'-концы олигонуклеотидов были разработаны для создания сайтов рестрикции ферментов BamHI-EagI, BamHI-Eagl и EcoRI-EcoRI (подчеркнуто), соответственно, после амплификации ПЦР.

клонированы в экспрессионный вектор pET28a (Novagen, Darmstadt, Германия), который содержал метку для очистки, содержащую шесть последовательных гистидиновых остатков на N-конце. Последовательность вставки была подтверждена с помощью анализа ДНК-последовательности (Hy-Labs, Rehovot, Израиль). Для экспрессии штамм BL21 (DE3) Escherichia coli был свежетрансформирован плазмидой. Культуры выращивали аэробно при температуре 37 °C до оптической плотности (OD) 0,6-0,8 при 600 нм. Культуры охлаждали до температуры ниже 25 °С и экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и инкубированием в течение 3 ч при 25 °С. Собранные клетки ресуспендировали в 40 мл холодного ресуспензионного буфера (4,29 мМ Na₂HPО₄, 1,47 мМ KH₂PO₄, 2,7 мМ KCl, 137 мМ NaCl, 0,1 % об./об. Tween-20) и замораживали при температуре -20 °C (Guardado-Calvo et al. 2009). Бактерии подвергали лизису с помощью ультразвука три раза в течение 10 мин каждый раз (Sonics, Taunton, MA, США), центрифугировали (10000×g в течение 15 мин при 4 °C) и осадок отбрасывали. Остаток SC 1-326 экспрессировали, как описано ранее (Goldenberg et al., 2011). Экспрессируемый фрагмент белка SC122-326 очищали в колонке с агарозой Ni-NTA в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen, Hilden, Германия). Очищенный белок подвергали диализу в течение ночи против фосфатно-солевого буфера (PBS) при 4 °С. Экспрессируемые SC-белки были обнаружены с помощью 12%-ного электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (PAGE). Количество белка SC оценивали по сравнению со стандартной кривой известных количеств альбумина бычьей сыворотки, добавленных в анализ на том же геле.

Клонирование и экспрессия SC в Pichia pastoris

Фрагмент ДНК, кодирующий остатки SC 1-326, получали с помощью ПЦР со специфически сконструированными олигонуклеотидами (Таблица 3). Этот фрагмент был разрезан рестрикционным ферментом EcoRI (GAATTC), сайт разрезания которого введен праймерами во время синтеза. Выделенный фрагмент лигировали с плазмидой pHILD2, представленной в наборе P. pastoris (Invitrogen, San Diego, CA, США), как описано ранее (Pitcovski et al., 2003). Кратко, лигированная ДНК-конструкция трансформировалась в клетки E. coli XL1-Blue и белые колонии, которые росли на чашках LB (Луриа-Бертани), содержащих ампициллин (100 мкг/мл), X-Gal до конечной концентрации 80 мкг/мл и IPTG до конечной концентрации 20 мМ были выделены. После характеристики, плазмиды, содержащие SC с правильной последовательностью, клонировали в P. pastoris следующим образом.

Вектор линеаризировали и вводили в клетки P. pastoris, что приводило к введению трансгена в локус AOX1. Положительные колонии выращивали и производство рекомбинантного белка индуцировали с помощью добавления метанола. После индукции клетки лизировали путем интенсивного встряхивания со стеклянными гранулами, центрифугировали и супернатант, содержащий растворимый SC, анализировали с помощью SDS-PAGE.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Для определения титра анти-SC-антител, SC использовали в качестве антигена в ИФА. Антиген разбавляли в покрывающем буфере (0,397 г Na₂CО₃, 0,732 г NaHCО₃, 250 мл бидистиллированной воды с pH 9,6) и инкубировали в пластине ИФА (Nunc, Rochester, NY, США) в течение 24 часов при температуре 4 °C.После каждого последующего этапа следовали три промывки с помощью 0,05% Tween-20 в PBS. Сыворотку птиц, вакцинированных тестируемыми белками или контролями, последовательно разводили в 2 раза (1:100-1:800 000) в блокирующем буфере (5% мас./об. обезжиренного молока, 0,05% Твин-20 в PBS) и инкубировали в течение 1 часа. Добавляли вторичное антитело, конъюгированный с пероксидазой кроличий анти-куриный IgG (Sigma, Rehovot, Израиль), разбавленный 1:7000 и смесь инкубировали в течение 1 часа. Затем добавляли субстрат o-фенилендиаминдигидрохлорид (Sigma). OD измеряли с помощью считывателя ИФА (Thermo Scientific Multiskan RC, Vantaa, Финляндия) при 450 нм. Титр конечной точки определяли как последнее разбавление, для которого OD оставалось положительным (относительно отрицательного контроля в ИФА).

Уровень анти-ARV антител сыворотке вакцинированных птиц определяли с помощью коммерческого ИФА (IDEXX® Laboratories, США) в соответствии с инструкциями производителя. Значения OD измерялись при 650 нм. Значения отношения поглощения образца к контролю (S/P), превышающие 0,2, считали положительным на ARV (отношение S/P = среднее значение OD образца) - среднее значение OD отрицательного контроля/среднее значение OD положительного контроля - среднее значение OD отрицательного контроля).

Анализ пролиферации клеток

Селезенки отбирали у птиц в течение 42 дней после вакцинации и подвергали мацерации с помощью плунжера шприца через сито для получения суспензии отдельных клеток в PBS. Спленоциты суспендировали в RPMI 1640 с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (10 нг/мл) (Biotech Industry, Bet Haemek, Израиль). Клетки (1 × 10⁶ на лунку) высевали на 96-луночные культуральные планшеты. Конканавалин А (ConA, 5 мкг/мл), липополисахарид (LPS, 5 мкг/мл) или ARV (5 мкл/лунка при титре 10^6,6) (Sigma Aldrich) добавляли в качестве стимуляторов в трех повторностях и инкубировали в течение 48 часов. Анализ CellTiter-Blue (CTB) проводили путем добавления 20 мкл реагента CTB (Promega, Madison, WI, США) в каждую лунку. Затем клетки инкубировали в течение 6 ч при температуре 37 °С при 5% СО₂. Интенсивность цвета реагента CTB определяли с помощью флуорометра при длинах волн возбуждения/излучения 560 и 590 нм соответственно. Измеренное поглощение было пропорционально количеству жизнеспособных клеток. Результаты были рассчитаны и представлены как индекс стимуляции (SI), представляющий соотношение между стимулированными и не стимулированными клетками.

Тест на нейтрализацию вирулентного штамма S1133 ARV

Способность сыворотки нейтрализовать вирулентный реовирус проверялась путем мониторинга ингибирования эмбриональной смертности через 3-7 дней после инокуляции. Тестируемые сыворотки фильтровали и нагревали в течение 30 мин при температуре 56 °С для инактивации активности комплемента. Вирус разбавляли с помощью PBS в серии 10-кратных разведений. Смеси равных объемов разбавленных вируса и сывороток (или PBS в качестве отрицательного контроля) инкубировали в течение 40 мин при комнатной температуре. Каждую из смесей инокулировали в пять 7-дневных оплодотворенных яиц SPF.

Чтобы подтвердить потенциал вирулентности индикаторного вируса, 10 яиц инокулировали неразбавленными вирусом, который смешивали 1:1 с PBS. Кроме того, в нескольких экспериментах безвирусные сыворотки инокулировали в оплодотворенные яйца, чтобы подтвердить отсутствие неспецифической смертности из-за компонентов сыворотки. Все яйца ежедневно освещались в темной комнате, чтобы определить жизнеспособность эмбриона, и было зарегистрировано количество живых и мертвых эмбрионов.

Индекс нейтрализации (NI) определяли как отношение между самым высоким разведением вируса, которое убило по меньшей мере 95% (кумулятивно) эмбрионов и разведением вируса, которое убило одинаковый процент эмбрионов в присутствии антител. Значение NI выражалось как отношение между log разведений. NI, равный 2 или более в антисыворотке, рассматривался как нейтрализующий вирус.

Таблица 4. Программа вакцинации.

ГруппаВакцина на 14d^aВакцина на 28d^a1ARV S1133^bARV S11332PBS+адъювант^cPBS+адъювант3SC1-326SC1-3264SC122-326SC122-3265SC192-326SC192-3266SC122-326ARV S1133

^aВозраст, дней;^bПоложительный контроль;^cОтрицательный контроль.

Статистические вычисления

Результаты ИФА, нейтрализации и клеточной пролиферации были проанализированы с помощью однофакторного анализа дисперсии (ANOVA) тестом Тьюки. Все анализы были выполнены с помощью программного обеспечения GraphPadPrism5.

Пример 1. Экспрессия белка SC

После анализа структуры белка SC фрагменты кДНК, кодирующие три полипептидных остатка: 1-326, 122-326, 192-326, продуцировали, клонировали и экспрессировали в E.coli. На 5'-конце добавляли полигистидиновую метку, чтобы можно было обнаружить и очистить экспрессированные белки. Полученные белки были частично очищены. Экспрессированные фрагменты SC были ожидаемого размера 36 кД, 23 кД и 15 кД (соответственно), при определении на 12%-ном SDS-полиакриламидном геле.

На Фиг.1 изображена эффективная экспрессия фрагмента 122-326 четырех различных изолятов реовируса: SC1 133, SC528, SC5223 и SC5215.

Пример 2. Образование антитела в ответ на вакцинацию

После вакцинации иммуногенность белков SC и способность продуцируемых антител к детектированию вируса тестировали с помощью ИФА. Используя SC 122-326 в качестве антигена, антитела, полученные после вакцинации белками SC122-326 и SC192-326, обнаружили антиген при высоких титрах 1: 800,000. Среднее значение титров птиц в этой группе было значимо выше (Р <0,001), чем среднее значение в отрицательном контроле, тогда как среднее значение титра антител, полученное после вакцинации белком SC 1-326, было аналогично такому отрицательного контроля (Фиг.2).

Уровень антител против целого вируса после вакцинации SC 192-326 или отрицательный контроль достигли значения 0,2 или ниже, тогда как уровни антител, полученных после вакцинации SC 1-326 или SC 122-326, были положительными (0,25 и 0,5 соответственно) (Фиг. 3). S/P в группе SC 122-326 было значительно выше, чем в других группах.

Аналогичным образом, после вакцинации иммуногенность фрагментов SC 122-326 четырех разных Групп RI (SEQ ID NO: 2, 3, 4 и 5) и способность продуцируемых антител к обнаружению вирусов тестируются с помощью ИФА.

Пример 3. Пролиферация клеток

Спленоциты от вакцинированных цыплят исследовали на антигенспецифическую клеточную пролиферацию. Клетки обрабатывали с помощью ConA в качестве контроля пролиферации Т-клеток, LPS в качестве контроля пролиферации В-клеток (положительный контроль), PBS (отрицательный контроль) и ARV (специфический антиген). В анализе CTB измеренное поглощение пропорционально количеству жизнеспособных клеток. Результаты представлены как SI (митоген- или антиген-стимулированные/нестимулированные клетки).

Обработки в случае положительного контроля проявляли пролиферацию после стимула. Клетки, стимулированные с помощью ARV, показали значимые различия среди групп лечения. Клетки из группы, иммунизированной вирусом или SC 122-326 показали значимую пролиферацию по сравнению с отрицательным контролем (P <0,01), тогда как пролиферация в группе, которой была введена SC1-326, была значимо ниже, чем SC 122-326, или у групп положительного контроля (P <0,05) (Фиг.4).

Аналогично, спленоциты от цыплят, вакцинированных комбинированной вакциной, содержащей полипептиды SEQ ID NO: 2, 3, 4 и 5 исследуются на предмет антигенспецифической клеточной пролиферации.

Пример 4. Эффект SC122-326 для индукции ответа против ARV

Был протестирован эффект вакцинации SC 122-326 по сравнению с вакцинацией цельновирусной вакциной в качестве индуктора первичного ответа против ARV. Одной группе цыплят вводили вакцину против штамма ARV S1133, а другой - SC 122-326. Через две недели ARV S1133 вводили в обе группы. Первичная вакцинация с помощью ARV или SC 122-326 вызывает аналогичное значимое повышение после вторичной вакцинации целым ARV (Фиг. 5).

Аналогичным образом, был исследован эффект вакцинации комбинированной вакциной, содержащей полипептиды SEQ ID NO: 2, 3, 4 и 5 по сравнению с вакцинацией цельновирусной вакциной в качестве индуктора первичного ответа против ARV.

Пример 5. Нейтрализация вируса

Сыворотки от вакцинированных птиц тестировали на предмет способности нейтрализации вирулентного вируса в оплодотворенных яйцах SPF. Защита не была обеспечена сыворотками, продуцируемыми птицами в случае отрицательного контроля, или группой, которой вводили SC 1-326 (NI = 0). Напротив, сыворотка, продуцируемая птицами, инъецированными белком SC 122-326, обеспечивала защиту (способность к нейтрализации), подобную той, которая достигалась с помощью антител, которые развивались после вакцинации целым вирусом (NI> 4) (Таблица 3).

Аналогичным образом, сыворотки от птиц, вакцинированных комбинированной вакциной, содержащей полипептиды SEQ ID NO: 2, 3, 4 и 5 исследуются на предмет на способности нейтрализации вирулентного вируса в оплодотворенных яйцах SPF.

Таблица 5. Нейтрализация вируса антителами против ARV или SC фрагментов.

ВакцинацияИндекс нейтрализации^аТолько адъювант (отрицательный контроль)0ARV S11334SC1-3260SC 122-326>4

^aИндекс нейтрализации (NI) 2 или выше рассматривается как нейтрализующий против этого вируса.

ССЫЛКИ

Benavente, J. & Martmez-Costas, J., 2007. Avian reovirus: Structure and biology. Virus Research, 123(2), pp. 105-119. Available at: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0168170206002772.

Fingerut, E. et al., 2003. A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part of its fiber protein. Vaccine, 21, pp.2761-2766.

Goldenberg, D. et al., 2011. Differentiating infected from vaccinated animals, and among virulent prototypes of reovirus. Journal of Virological Methods, 177(1), pp.80-86. Available at: http://dx.doi.Org/10.1016/j.jviromet.2011.06.023.

Goldenberg, D. et al., 2010. Genetic and antigenic characterization of sigma C protein from avian reovirus. Avian pathology : journal of the W.V.P.A, 39(3), pp. 189-199.

Grande, A.N.A. et al., 1997. Protein Architecture of Avian Reovirus S1 133 and Identification of the Cell Attachment Protein. ,71(1), pp.59-64.

Guardado Calvo, P. et al., 2005. Structure of the Carboxy-terminal Receptor-binding Domain of Avian Reovirus Fibre SigmaC. Journal of Molecular Biology, 354(1), pp. 137-149.

Available at: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022283605010995.

Guardado-Calvo, P. et al., 2009. Crystallographic structure of the a -helical triple coiled-coil domain of avian reovirus S1 133 fibre. Journal of General Virology, 90(2009), pp.672-677.

van der Heide, L., Kalbac, M. & Brustolon, M., 1983. Development of an attenuated apathogenic reovirus vaccine against viral arthritis/tenosynovitis. Avian diseases, 27(3), pp.698-706. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6314976 [Accessed December 9, 2015].

Jones, R.C., 2000. Avian reovirus infections. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics), 19(2), pp.614-25. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10935283 [Accessed December 9, 2015].

Jung, K.M. et al., 2014. Use of IgY antibody to recombinant avian reovirus oC protein in the virus diagnostics. Acta virologica, 58(2), pp. 108-13. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24957714 [Accessed December 9, 2015].

Kant, A. et al., 2003. Classification of Dutch and German avian reoviruses by sequencing the sigma C protein. Veterinary research, 34(2), pp.203-12. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12657212 [Accessed December 9, 2015].

Lu, H. et al., 2015. Isolation and molecular characterization of newly emerging avian reovirus variants and novel strains in Pennsylvania, USA, 2011-2014. Scientific Reports, 5(April), p.14727. Available at: http://www.nature.com/articles/srepl4727.

Lublin, A. et al., 2011. Wide-range protection against avian reovirus conferred by vaccination with representatives of four defined genotypes. Vaccine, 29(47), pp.8683-8688. Available at: http://dx.doi.Org/10.1016/j.vaccine.2011.08.114.

McAleer, W.J. et al., 1984. Human hepatitis B vaccine from recombinant yeast. Nature, 307(5947), pp. 178-80. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6318124 [Accessed December 9, 2015].

Pitcovski, J. et al., 2005. A subunit vaccine against hemorrhagic enteritis adenovirus. Vaccine, 23,pp.4697-4702.

Pitcovski, J. et al., 2003. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine, 21, pp.4736-4743.

Shapouri, M.R. et al., 1995. Cloning, sequencing and expression of the S1 gene of avian reovirus. The Journal of general virology, 76 ( Pt 6)(1995), pp.1515-20. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7782781.

Shapouri, M.R.S. et al., 1996. Characterization of monoclonal antibodies against avian reovirus strain S1133. Avian pathology: journal of the W.V.P.A, 25(1), pp.57-67. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18645837 [Accessed December 9, 2015].

Troxler, S. et al., 2013. Identification of a new reovirus causing substantial losses in broiler production in France, despite routine vaccination of breeders. The Veterinary record, 172(21), p.556. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23636701 [Accessed December 9, 2015].

Valentino, K. & Poronsky, C.B., 2015. Human Papillomavirus Infection and Vaccination. Journal of pediatric nursing. Available at: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882596315003267 [Accessed November 22, 2015].

Vasserman, Y. et al., 2004. The influence of reovirus sigma C protein diversity on vaccination efficiency. Avian diseases, 48(2), pp.271-8. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15283414 [Accessed December 9, 2015].

Wu, H. et al., 2005. Yeast-derived sigma C protein-induced immunity against avian reovirus. Avian diseases, 49(2), pp.281-4. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16094835 [Accessed December 9, 2015].

McAleer, W.J. et al., 1984. Human hepatitis B vaccine from recombinant yeast. Nature, 307(5947), pp. 178-80. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6318124 [Accessed December 9, 2015].

Pitcovski, J. et al., 2005. A subunit vaccine against hemorrhagic enteritis adenovirus. Vaccine, 23,pp.4697-4702.

Pitcovski, J. et al., 2003. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine, 21, pp.4736-4743.

Shapouri, M.R. et al., 1995. Cloning, sequencing and expression of the S1 gene of avian reovirus. The Journal of general virology, 76 (Pt 6)(1995), pp.1515-20. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7782781.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Gavish-Galilee Bio Applications, Ltd

Pitcovski, Jacob

Goldenberg, Dana

<120> ОПТИМИЗИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД ДЛЯ СУБЪЕДИНИЧНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕОВИРУСА ПТИЦ

<130> GAVISH-067 PCT

<150> 62275838

<151> 2016-01-07

<160> 34

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 1

Met Ala Gly Leu Asn Pro Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Ser Asn Val Asn Ile Ser His Gly Asp Leu Thr Pro

20 25 30

Ile Tyr Glu Arg Leu Thr Asn Leu Glu Ala Ser Thr Glu Leu Leu His

35 40 45

Arg Ser Ile Ser Asp Ile Ser Thr Thr Val Ser Asn Ile Ser Ala Asn

50 55 60

Leu Gln Asp Met Thr His Thr Leu Asp Asp Val Thr Ala Asn Leu Asp

65 70 75 80

Gly Leu Arg Thr Thr Val Thr Ala Leu Gln Asp Ser Val Ser Ile Leu

85 90 95

Ser Thr Asn Val Thr Asp Leu Thr Asn Arg Ser Ser Ala His Ala Ala

100 105 110

Ile Leu Ser Ser Leu Gln Thr Thr Val Asp Gly Asn Ser Thr Ala Ile

115 120 125

Ser Asn Leu Lys Ser Asp Ile Ser Ser Asn Gly Leu Ala Ile Thr Asp

130 135 140

Leu Gln Asp Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Thr Ala Ser His Gly Leu

145 150 155 160

Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp

165 170 175

Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser

180 185 190

Ala Glu Ala Gln Leu Met Gln Phe Arg Trp Met Ala Arg Gly Thr Asn

195 200 205

Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly

210 215 220

Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser Thr Gly Asn Leu Thr Val Thr

225 230 235 240

Ser Asn Val Val Leu Leu Thr Phe Asp Leu Ser Asp Ile Thr His Ile

245 250 255

Pro Ser Asp Leu Ala Arg Leu Val Pro Ser Ala Gly Phe Gln Ala Ala

260 265 270

Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp Ser Ala Thr His Ala

275 280 285

Tyr Gln Ala Tyr Gly Val Tyr Ser Ser Ser Arg Val Phe Thr Ile Thr

290 295 300

Phe Pro Thr Gly Gly Asp Gly Thr Ala Asn Ile Arg Ser Leu Thr Val

305 310 315 320

Arg Thr Gly Ile Asp Thr

325

<210> 2

<211> 205

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 2

Asp Gly Asn Ser Thr Ala Ile Ser Asn Leu Lys Ser Asp Ile Ser Ser

1 5 10 15

Asn Gly Leu Ala Ile Thr Asp Leu Gln Asp Arg Val Lys Ser Leu Glu

20 25 30

Ser Thr Ala Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala

35 40 45

Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg

50 55 60

Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Gln Leu Met Gln Phe Arg

65 70 75 80

Trp Met Ala Arg Gly Thr Asn Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr

85 90 95

Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser

100 105 110

Thr Gly Asn Leu Thr Val Thr Ser Asn Val Val Leu Leu Thr Phe Asp

115 120 125

Leu Ser Asp Ile Thr His Ile Pro Ser Asp Leu Ala Arg Leu Val Pro

130 135 140

Ser Ala Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr

145 150 155 160

Arg Asp Ser Ala Thr His Ala Tyr Gln Ala Tyr Gly Val Tyr Ser Ser

165 170 175

Ser Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asp Gly Thr Ala

180 185 190

Asn Ile Arg Ser Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile Asp Thr

195 200 205

<210> 3

<211> 205

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 3

Gln Ala Leu Leu Val Glu Val Ser Asn Leu Lys Ser Ser Val Ser Ser

1 5 10 15

Gln Gly Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala Leu Glu

20 25 30

Gly Gly Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu

35 40 45

Asp Gly Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser

50 55 60

Arg Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln

65 70 75 80

Trp Ser Val Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp

85 90 95

Val Asn Ala His Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr

100 105 110

Lys Gln Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu

115 120 125

Leu Asp Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro

130 135 140

Cys His Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Gln

145 150 155 160

Arg Asp Gly Val Ser His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys Tyr Ser Ser

165 170 175

Ser Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asp Gly Thr Ala

180 185 190

Asn Ile Arg Ser Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile Asp Thr

195 200 205

<210> 4

<211> 205

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 4

Asn Gly Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn Asp Val Ser Ala

1 5 10 15

Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Ser Leu Glu

20 25 30

Ser Asp Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala

35 40 45

Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg

50 55 60

Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu Met Gln Phe Gln

65 70 75 80

Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr

85 90 95

Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser

100 105 110

Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn Ala Val Ser Leu Thr Phe Asp

115 120 125

Leu Ser Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro

130 135 140

Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr

145 150 155 160

Arg Glu Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr Ser Ser

165 170 175

Ala Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asn Gly Thr Ser

180 185 190

Asn Ile Arg Phe Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile Asp Thr

195 200 205

<210> 5

<211> 205

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная Последовательность

<220>

<223> синтетическая

<400> 5

Asn Ala Asn Val Thr Asp Ile Ala Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu

20 25 30

Ser Gly Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr

35 40 45

Asp Gly Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn

50 55 60

His Ala Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln

65 70 75 80

Trp Leu Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu

85 90 95

Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr

100 105 110

Thr Glu Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser

115 120 125

Leu Asp Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro

130 135 140

Arg Ala Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr

145 150 155 160

Arg Asp Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr Ser Ser

165 170 175

Ser Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asp Gly Thr Ala

180 185 190

Asn Ile Arg Ser Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile Asp Thr

195 200 205

<210> 6

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 6

Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu Thr Ser Leu Glu Ala Ser

1 5 10 15

Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly Met Ser Val Thr Leu Ser

20 25 30

Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr Arg Ala Leu Asp Asp Val

35 40 45

Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr Ile Thr Ala Leu Gln Ser

50 55 60

Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp Glu Leu Thr Asn Thr Ser

65 70 75 80

Ser Ala His Ser Gly Met Leu Ser Ser Leu Gln Thr Ile Ile Asn Gly

85 90 95

Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn Asp Val Ser Ala Ser Gly

100 105 110

Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Asp

115 120 125

Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu Met Gln Phe Gln Trp Val

165 170 175

Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ile Gly Met Thr Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser Thr Gly

195 200 205

Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn Ala Val Ser Leu Thr Phe Asp Leu Ser

210 215 220

Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Ser Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Glu

245 250 255

Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 7

<211> 268

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 7

Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu Asn Ser Leu Glu Ala Ser

1 5 10 15

Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly Met Ser Val Thr Leu Ser

20 25 30

Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr Arg Ala Leu Asp Asp Val

35 40 45

Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr Ile Thr Ala Leu Gln Ser

50 55 60

Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp Glu Leu Thr Asn Thr Ser

65 70 75 80

Ser Ala His Ser Gly Met Leu Ser Ser Leu Gln Thr Ile Ile Asn Gly

85 90 95

Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn Asp Val Ser Ala Ser Gly

100 105 110

Phe Asp Ile Ser Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Asp

115 120 125

Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu Met Gln Phe Gln Trp Val

165 170 175

Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser Thr Gly

195 200 205

Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn Ala Val Ser Leu Thr Phe Asp Leu Ser

210 215 220

Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Ser Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Glu

245 250 255

Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr

260 265

<210> 8

<211> 315

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 8

Ser Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser Leu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Val Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu

20 25 30

Asn Ser Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly

35 40 45

Met Ser Val Thr Leu Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr

50 55 60

Arg Ala Leu Asp Asp Val Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr

65 70 75 80

Ile Thr Ala Leu Gln Ser Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp

85 90 95

Glu Leu Thr Asn Thr Ser Ser Ala His Ser Gly Met Leu Ser Ser Leu

100 105 110

Gln Thr Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn

115 120 125

Asp Val Ser Ala Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asn Arg Val

130 135 140

Lys Ser Leu Glu Ser Asp Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro

145 150 155 160

Leu Ser Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe

165 170 175

Cys Ser Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu

180 185 190

Met Gln Phe Gln Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser Ser Asp Thr

195 200 205

Ile Asp Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr

210 215 220

Met Met Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn Ala Val Ser

225 230 235 240

Leu Thr Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser Asp Leu Ser

245 250 255

Arg Leu Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp

260 265 270

Val Ser Phe Thr Arg Glu Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly

275 280 285

Ala Tyr Ser Ser Ala Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly

290 295 300

Asn Gly Thr Ser Asn Ile Arg Phe Leu Thr Val

305 310 315

<210> 9

<211> 301

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 9

Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Asn Ala

1 5 10 15

Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Thr Ser Ile Arg Glu Arg Leu Thr Ser

20 25 30

Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Ser Arg Ser Ile Ser Ser Met Ser

35 40 45

Thr Thr Val Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asn Val Thr Arg Ala

50 55 60

Leu Asp Asp Val Thr Ala Asn Leu Asn Gly Ile Arg Val Thr Ile Thr

65 70 75 80

Thr Leu Gln Asp Ser Val Ser Thr Leu Ser Thr Thr Val Thr Asp Leu

85 90 95

Ser Arg Thr Ser Ser Ala His Ser Glu Ala Leu Ser Ser Leu Arg Thr

100 105 110

Ile Val Asp Gly Asn Ser Thr Ile Ile Gly Asn Leu Lys Ser Asp Val

115 120 125

Ala Ser Asn Gly Leu Ala Ile Thr Asp Leu Gln Ser Arg Val Lys Ser

130 135 140

Leu Glu Ser Ala Ser Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser

145 150 155 160

Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asn Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser

165 170 175

Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Leu Leu Met Gln

180 185 190

Phe Gln Trp Met Ala Arg Gly Thr Asn Gly Ser Ala Asp Asn Ile Asp

195 200 205

Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Ile Met

210 215 220

Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Gln Asn Ala Val Ser Leu Thr

225 230 235 240

Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Arg Phe Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu

245 250 255

Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser

260 265 270

Phe Thr Arg Gly Ser Thr Thr His Thr Tyr Gln Ala Tyr Gly Val Tyr

275 280 285

Ser Ser Ser Arg Ile Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly

290 295 300

<210> 10

<211> 316

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 10

Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser Leu Asn Ser Asn Val

1 5 10 15

Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu Thr Ser

20 25 30

Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly Met Ser

35 40 45

Val Thr Leu Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr Arg Ala

50 55 60

Leu Asp Asp Val Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr Ile Thr

65 70 75 80

Ala Leu Gln Ser Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp Glu Leu

85 90 95

Thr Asn Thr Ser Ser Ala His Ser Gly Met Leu Ser Ser Leu Gln Thr

100 105 110

Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn Asp Val

115 120 125

Ser Ala Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asn Arg Val Lys Ser

130 135 140

Leu Glu Ser Asp Thr Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser

145 150 155 160

Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser

165 170 175

Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Arg Leu Met Gln

180 185 190

Phe Gln Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp

195 200 205

Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met

210 215 220

Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn Ala Val Ser Leu Thr

225 230 235 240

Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu

245 250 255

Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser

260 265 270

Phe Thr Arg Glu Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr

275 280 285

Ser Ser Ala Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asn Gly

290 295 300

Thr Ser Asn Ile Arg Phe Leu Thr Leu Arg Thr Gly

305 310 315

<210> 11

<211> 318

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 11

Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Asn

1 5 10 15

Ala Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Thr Ser Ile Arg Glu Arg Leu Thr

20 25 30

Ser Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Ser Arg Ser Ile Ser Ser Met

35 40 45

Ser Thr Thr Val Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asn Val Thr Arg

50 55 60

Ala Leu Asp Asp Val Thr Ala Asn Leu Asn Gly Ile Arg Val Thr Ile

65 70 75 80

Thr Thr Leu Gln Asp Ser Val Ser Thr Leu Ser Thr Thr Val Thr Asp

85 90 95

Leu Ser Arg Thr Ser Ser Ala His Ser Glu Ser Leu Ser Ser Leu Arg

100 105 110

Thr Ile Val Asp Gly Asn Ser Thr Ile Ile Gly Asn Leu Lys Ser Asp

115 120 125

Val Ala Ser Asn Gly Leu Ala Ile Thr Asp Leu Gln Ser Arg Val Lys

130 135 140

Pro Leu Glu Ser Ala Ser Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu

145 150 155 160

Ser Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asn Leu Asp Pro Tyr Phe Cys

165 170 175

Ser Gln Arg Val Ser Leu Ala Ser Tyr Ser Ala Glu Ala Leu Leu Met

180 185 190

Gln Phe Gln Trp Met Ala Arg Gly Thr Asn Gly Ser Ala Asp Asn Ile

195 200 205

Asp Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Ile

210 215 220

Met Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Gln Asn Ala Val Ser Leu

225 230 235 240

Thr Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Arg Phe Pro Ser Asp Leu Ser Arg

245 250 255

Leu Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val

260 265 270

Ser Phe Thr Arg Gly Ser Thr Thr His Thr Tyr Gln Ala Tyr Gly Val

275 280 285

Tyr Ser Ser Ser Arg Ile Phe Thr Ile Thr Phe Pro Thr Gly Gly Asp

290 295 300

Gly Pro Ala Asn Ile Arg Phe Leu Thr Val Arg Thr Gly Ile

305 310 315

<210> 12

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 12

Gly Asp Leu Met Gln Ile His Glu Arg Leu Ser Ala Leu Glu Leu Thr

1 5 10 15

Thr Thr Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu Ser Lys Val Thr

20 25 30

Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala Val Ser Leu Ala Glu Thr

35 40 45

Glu Gly Glu Leu Ile Lys Leu Ser Ser Ala Val Gln Cys Leu Arg Thr

50 55 60

Ser Leu Asp His Leu Leu Gln Asn Trp Arg Leu Cys Pro His Trp Tyr

65 70 75 80

Val Thr His Gly Ser Ser Ile Ser Asp Leu Gln Lys Glu Gly Gln Ala

85 90 95

Leu Ser Ser Glu Val Asn Asn Leu Asn Leu His Val Ser Ser Gln Gly

100 105 110

Leu Thr Val Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Phe Glu Asp Gly

130 135 140

Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser

165 170 175

Val Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn

180 185 190

Ala His Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr Lys Gln

195 200 205

Ser Leu Thr Val Thr Ser Leu Leu Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Gly

210 215 220

Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His

225 230 235 240

Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Gln Arg Asp

245 250 255

Gly Val Ser His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys

260 265

<210> 13

<211> 305

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 13

Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Ser Pro Gly Asp Leu

1 5 10 15

Met Gln Ile His Glu Arg Leu Ser Ala Leu Glu Leu Thr Thr Thr Ser

20 25 30

Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu Ser Lys Val Thr Asp Leu Ser

35 40 45

Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala Val Ser Leu Ala Glu Thr Lys Val Glu

50 55 60

Leu Ser Ser Leu Ser Ser Ala Val Gln Gly Leu Arg Thr Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu Ser Ser Leu Val Arg Asn His

85 90 95

Gly Ser Ala Ile Ser Asp Leu Gln Lys Glu Gly Gln Val Leu Leu Val

100 105 110

Glu Val Ser Asn Leu Lys Ser Ser Val Ser Ser Gln Gly Leu Thr Ile

115 120 125

Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly Ser Ser Thr

130 135 140

Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu Asp Gly Thr Val Ser

145 150 155 160

Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn Leu Thr Ser

165 170 175

Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser Val Lys Gly

180 185 190

Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn Ala His Ser

195 200 205

His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr Lys Gln Ser Leu Thr

210 215 220

Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Asp Arg Ile Thr

225 230 235 240

Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His Gly Phe Gln

245 250 255

Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Gln Arg Asp Gly Val Ser

260 265 270

His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys Tyr Val Ser Ser Arg Val Phe Lys

275 280 285

Ile Thr Phe Ser Pro Gly Ser Ser Gly Pro Ala Val Val Gln Phe Leu

290 295 300

Thr

305

<210> 14

<211> 312

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 14

Gln Arg Arg Glu Val Val Gly Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Ser Val

1 5 10 15

Thr Ile Ser Pro Gly Asp Leu Thr Gln Ile His Glu Arg Leu Ser Ala

20 25 30

Leu Glu Leu Thr Thr Thr Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu

35 40 45

Ser Lys Val Thr Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala Val Ser

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Lys Val Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Ala Val Gln

65 70 75 80

Gly Leu Arg Thr Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu

85 90 95

Ser Ser Leu Val Arg Asn His Gly Ser Ala Ile Ser Asp Leu Gln Lys

100 105 110

Glu Gly Gln Val Leu Leu Val Glu Val Ser Asn Leu Lys Ser Ser Val

115 120 125

Ser Ser Gln Gly Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala

130 135 140

Leu Glu Gly Gly Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys

145 150 155 160

Leu Glu Asp Gly Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser

165 170 175

Val Ser Arg Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln

180 185 190

Phe Gln Trp Ser Val Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp

195 200 205

Met Asp Val Asn Ala His Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met

210 215 220

Ser Thr Lys Gln Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val

225 230 235 240

Phe Glu Leu Asp Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu

245 250 255

Ile Pro Cys His Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser

260 265 270

Phe Gln Arg Asp Gly Val Ser His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys Tyr

275 280 285

Val Ser Ser Arg Val Phe Lys Ile Thr Phe Ser Pro Gly Ser Ser Gly

290 295 300

Pro Ala Val Val Gln Phe Leu Thr

305 310

<210> 15

<211> 260

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 15

Val Val Gly Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Ser Pro

1 5 10 15

Gly Asp Leu Met Gln Ile His Glu Arg Leu Ser Ala Leu Glu Ser Ala

20 25 30

Ile Thr Ser Leu Asn Glu Ser Val Asp Thr Ala Leu Ser Lys Leu Val

35 40 45

Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp Ser Met Ala Val Ser Leu Ala Glu Thr

50 55 60

Lys Val Glu Leu His Ser Leu Ser Ser Asp Val Lys Gly Leu Arg Thr

65 70 75 80

Ser Leu Asp Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu Ser Ser Leu Val

85 90 95

His Asp His Gly Ser Ser Ile Ser Asp Leu Gln Lys Gly Ser Arg Val

100 105 110

Leu Ser Val Glu Val Asp Asn Leu Lys Ser Ser Val Ser Ser Gln Gly

115 120 125

Leu Met Ile Ser Ser Leu Glu Ser Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly

130 135 140

Pro Gly Thr Asn Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu Asp Gly

145 150 155 160

Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn

165 170 175

Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser

180 185 190

Ala Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn

195 200 205

Ala His Ser His Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr Lys Gln

210 215 220

Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Gly

225 230 235 240

Arg Ile Thr Ala Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His

245 250 255

Gly Phe Gln Gln

260

<210> 16

<211> 254

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 16

Gln Arg Arg Glu Val Val Gly Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser Ser Val

1 5 10 15

Thr Ile Ser Pro Gly Asp Leu Met Arg Ile His Glu Arg Leu Ser Ala

20 25 30

Leu Glu Leu Thr Thr Thr Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu

35 40 45

Ser Lys Val Thr Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala Val Ser

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Lys Val Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Ala Val Gln

65 70 75 80

Gly Leu Arg Thr Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu

85 90 95

Ser Ser Leu Val Arg Asn His Gly Ser Ala Ile Ser Asp Leu Gln Lys

100 105 110

Glu Gly Gln Ala Leu Leu Val Glu Val Ser Asn Leu Lys Ser Ser Val

115 120 125

Ser Ser Gln Gly Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala

130 135 140

Leu Glu Gly Gly Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys

145 150 155 160

Leu Glu Asp Gly Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser

165 170 175

Val Ser Arg Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln

180 185 190

Phe Gln Trp Ser Val Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp

195 200 205

Met Asp Val Asn Ala His Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met

210 215 220

Ser Thr Lys Gln Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val

225 230 235 240

Phe Glu Leu Asp Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser

245 250

<210> 17

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 17

Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser

1 5 10 15

Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Val Gly Asp Leu Ser Arg Lys Leu Ser

20 25 30

Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Ile Asp Ser Ser Met His Gln Leu

35 40 45

Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Val Arg Gln Leu Arg Ser

50 55 60

Ala Val Gly Asp Asn Thr Asp Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val

65 70 75 80

Ser Asp His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Arg Thr Ser Leu Asn Ala

85 90 95

Asn Val Thr Asp Ile Thr Asn Leu Lys Gly Gly Val Thr Thr Leu Ser

100 105 110

Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu

165 170 175

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu

195 200 205

Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp

245 250 255

Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 18

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 18

Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser

1 5 10 15

Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Val Gly Asp Leu Ser Arg Lys Leu Ser

20 25 30

Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Ile Asp Ser Ser Met His Gln Leu

35 40 45

Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Val Arg Gln Leu Arg Ser

50 55 60

Ala Val Gly Asp Asn Thr Asp Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val

65 70 75 80

Ser Asp His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala

85 90 95

Asn Val Thr Asp Ile Thr Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr Leu Ser

100 105 110

Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu

165 170 175

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu

195 200 205

Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp

245 250 255

Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 19

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 19

Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser

1 5 10 15

Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Ala Gly Asp Leu Ser Arg Arg Phe Ser

20 25 30

Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Val Asn Ser Ser Met His Gln Leu

35 40 45

Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Ala Arg Gln Leu Arg Ser

50 55 60

Ala Val Ser Asp Asn Thr Ala Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val

65 70 75 80

Ser Gly His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala

85 90 95

Asn Val Thr Asp Ile Ala Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr Leu Ser

100 105 110

Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu

165 170 175

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu

195 200 205

Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp

245 250 255

Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 20

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 20

Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser

1 5 10 15

Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Ala Gly Asp Leu Ser Arg Arg Phe Ser

20 25 30

Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Val Asn Ser Ser Met His Gln Leu

35 40 45

Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Ala Arg Gln Leu Arg Ser

50 55 60

Ala Val Ser Asp Asn Thr Ala Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val

65 70 75 80

Ser Gly His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala

85 90 95

Asn Val Thr Asp Ile Ala Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr Leu Ser

100 105 110

Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Arg Phe Gln Trp Leu

165 170 175

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu

195 200 205

Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp

245 250 255

Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 21

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 21

Gly Asp Leu Ala Ser Ile His Asp Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Thr

1 5 10 15

Val Glu Ser Leu Thr Ala Ser Val Gly Asp Leu Ser Gln Lys Cys Ile

20 25 30

Asp Leu Glu Ser Asn Phe Gln Ser Val Glu Ser Ser Leu Gly Gln Val

35 40 45

Thr Ser Ser Leu Thr Asp Leu Ser Thr Glu Ile Arg Gln Leu Arg Leu

50 55 60

Ser Leu Asn Asp Ile Thr Ser Ser Met Ala Ser Leu Ser Thr Thr Val

65 70 75 80

Ser Asp His Asp Asn Ser Leu Ser Thr Leu Arg Val Ser Val Gln Thr

85 90 95

Asn Val Thr Asp Ile Ala Asn Leu Lys Ser Ser Val Asn Thr Leu Ser

100 105 110

Leu Thr Val Ala Asp Leu Glu Lys Arg Leu Gly Val Val Glu Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Leu Arg Phe Ser Ser Pro Leu Ser Leu Asn Asn Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu

165 170 175

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ser Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu

195 200 205

Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Tyr Ile Thr Arg Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Ile Pro Arg Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp

245 250 255

Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 22

<211> 296

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa может быть любой встречающейся в природе аминокислотой

<400> 22

Tyr Cys Ser Leu Thr Ser Xaa Arg Glu Tyr Lys Leu Trp Glu His Leu

1 5 10 15

Ala Ser Ile His Asp Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Thr Val Glu Ser

20 25 30

Leu Thr Ala Ser Val Gly Asp Leu Ser Gln Lys Cys Ile Asp Leu Glu

35 40 45

Ser Asn Phe Gln Ser Val Glu Ser Ser Leu Gly Gln Val Thr Ser Ser

50 55 60

Leu Thr Asp Leu Ser Thr Glu Ile Arg Gln Leu Arg Leu Ser Leu Asn

65 70 75 80

Asp Ile Ala Ser Ser Met Ala Ser Leu Ser Thr Thr Val Ser Asp His

85 90 95

Asp Asn Ser Leu Ser Thr Leu Arg Val Ser Val Gln Thr Asn Val Thr

100 105 110

Asp Ile Ala Asn Leu Lys Ser Ser Val Ser Thr Leu Ser Leu Thr Val

115 120 125

Ala Asp Leu Glu Lys Arg Leu Gly Val Val Glu Ser Gly Ser Ser Ser

130 135 140

Ser Leu Arg Phe Ser Ser Pro Leu Ser Leu Asn Asn Gly Val Val Ser

145 150 155 160

Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ser Leu Thr Ser

165 170 175

Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu Ala Arg Gly

180 185 190

Asp Asp Gly Ser Ser Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn Ala His Cys

195 200 205

His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu Asn Leu Thr

210 215 220

Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp Tyr Ile Thr

225 230 235 240

Arg Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Ile Pro Arg Ala Gly Phe Gln

245 250 255

Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp Thr Thr Thr

260 265 270

His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Tyr Thr Thr Pro Arg Leu Ser Arg

275 280 285

Leu Arg Phe Leu Thr Gly Gly Thr

290 295

<210> 23

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 23

Gly Asp Leu Thr Pro Ile Tyr Glu Arg Leu Thr Asn Leu Glu Ala Ser

1 5 10 15

Thr Glu Leu Leu His Arg Ser Ile Ser Asp Ile Ser Thr Thr Val Ser

20 25 30

Asn Ile Ser Ala Ser Leu Gln Asp Met Thr His Thr Leu Asp Asp Val

35 40 45

Thr Ala Asn Leu Asp Gly Leu Arg Thr Thr Val Thr Ala Leu Gln Asp

50 55 60

Ser Val Ser Ile Leu Ser Thr Asn Val Thr Asp Leu Thr Asn Thr Ser

65 70 75 80

Ser Ala His Ala Ala Thr Leu Ser Ser Leu Gln Thr Thr Val Asp Gly

85 90 95

Asn Ser Thr Ala Ile Ser Asn Leu Lys Ser Asp Val Ser Ser Asn Gly

100 105 110

Leu Ala Ile Thr Asp Leu Gln Asp Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Thr

115 120 125

Ala Ser His Gly Leu Ser Phe Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Pro Ala Glu Ala Gln Leu Met Gln Phe Arg Trp Met

165 170 175

Ala Arg Gly Thr Asn Gly Ser Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser Thr Gly

195 200 205

Asn Leu Thr Val Thr Ser Asn Val Val Leu Leu Thr Phe Asp Leu Ser

210 215 220

Asp Ile Thr His Ile Pro Ser Asp Leu Ala Arg Leu Val Pro Ser Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp

245 250 255

Ser Ala Thr His Ala Tyr Gln Ala Tyr Gly Val

260 265

<210> 24

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 24

Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser

1 5 10 15

Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Val Gly Asp Leu Ser Arg Lys Leu Ser

20 25 30

Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Ile Asp Ser Ser Met His Gln Leu

35 40 45

Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Val Arg Gln Leu Arg Ser

50 55 60

Ala Val Gly Asp Asn Thr Asp Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val

65 70 75 80

Ser Asp His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala

85 90 95

Asn Val Thr Asp Ile Thr Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr Leu Ser

100 105 110

Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu

165 170 175

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu

195 200 205

Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp

245 250 255

Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 25

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 25

Gly Asp Leu Thr Thr Ile Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Leu Asp Ser Ser

1 5 10 15

Val Glu Ser Leu Thr Ile Ser Ala Gly Asp Leu Ser Arg Arg Phe Ser

20 25 30

Glu Leu Glu Val Asp Leu Gln Asn Val Asn Ser Ser Met His Gln Leu

35 40 45

Thr Ser Ser Leu Thr Thr Leu Ser Glu Glu Ala Arg Gln Leu Arg Ser

50 55 60

Ala Val Ser Asp Asn Thr Ala Ser Ile Ser Ser Leu Ser Thr Met Val

65 70 75 80

Ser Gly His Gln Gln Leu Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ser Leu Asn Ala

85 90 95

Asn Val Thr Asp Ile Ala Asn Leu Lys Gly Ser Val Thr Thr Leu Ser

100 105 110

Leu Thr Val Thr Asp Leu Glu Lys Arg Leu Lys Val Val Glu Ser Gly

115 120 125

Ser Ser Ser Ser Leu Glu Phe Thr Ser Pro Leu Ser Leu Thr Asp Gly

130 135 140

Val Val Ser Leu Asn Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Asp Asn His Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ser Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu

165 170 175

Ala Arg Gly Asp Asp Gly Ser Ala Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu

195 200 205

Asn Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp

210 215 220

Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Ser Asp Met Ser Arg Leu Val Pro Arg Ala

225 230 235 240

Gly Phe Gln Ala Ala Ser Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp

245 250 255

Thr Thr Thr His Ala Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 26

<211> 321

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 26

Leu Val Ile Ser Ser Gln Arg Arg Glu Val Val Ser Leu Ile Leu Ser

1 5 10 15

Leu Asn Ser Asn Val Thr Ile Asn Pro Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr

20 25 30

Glu Arg Leu Asn Ser Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser

35 40 45

Val Ser Gly Met Ser Val Thr Leu Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln

50 55 60

Asp Thr Thr Arg Ala Leu Asp Asp Val Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu

65 70 75 80

Ser Ala Thr Ile Thr Ala Leu Gln Ser Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala

85 90 95

Thr Val Asp Glu Leu Thr Asn Thr Ser Ser Ala His Ser Gly Met Leu

100 105 110

Ser Ser Leu Gln Thr Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn

115 120 125

Leu Arg Asn Asp Val Ser Ala Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln

130 135 140

Asn Arg Val Lys Ser Leu Glu Ser Asp Thr Ser His Gly Leu Ser Phe

145 150 155 160

Ser Pro Pro Leu Ser Val Ala Asp Gly Val Val Ser Leu Asp Met Asp

165 170 175

Pro Tyr Phe Cys Ser Gln Arg Val Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Glu

180 185 190

Ala Arg Leu Met Gln Phe Gln Trp Val Ala Lys Gly Thr Ser Gly Ser

195 200 205

Ser Asp Thr Ile Asp Met Thr Val Asn Ala His Cys His Gly Arg Arg

210 215 220

Thr Asp Tyr Met Met Ser Ser Thr Gly Gly Leu Thr Val Thr Ser Asn

225 230 235 240

Ala Val Ser Leu Thr Phe Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Asn Met Pro Ser

245 250 255

Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Ser Ala Gly Phe Gln Val Ala Ser Phe

260 265 270

Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Glu Ser Ser Thr His Thr Tyr Gln

275 280 285

Val Tyr Gly Ala Tyr Ser Ser Ala Arg Val Phe Thr Ile Thr Phe Pro

290 295 300

Thr Gly Gly Asn Gly Thr Ser Asn Ile Arg Phe Leu Thr Val Arg Thr

305 310 315 320

Gly

<210> 27

<211> 294

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 27

Trp Ile Asp Thr Val Val Asp Phe Glu Arg Asp Tyr Lys Ser Trp Arg

1 5 10 15

Phe Asp Ala Asn Pro Glu Arg Leu Ser Ala Leu Glu Leu Thr Thr Thr

20 25 30

Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu Ser Lys Val Thr Asp Leu

35 40 45

Ser Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala Val Ser Leu Ala Glu Thr Lys Val

50 55 60

Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Val Val Gln Gly Leu Arg Thr Ser Leu

65 70 75 80

Glu Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ser Leu Ser Ser Leu Val Arg Asn

85 90 95

His Gly Ser Ser Ile Ser Asp Leu Gln Lys Glu Gly Gln Ala Leu Leu

100 105 110

Val Glu Val Asn Asn Leu Lys Ser Ser Val Ser Ser Gln Gly Leu Thr

115 120 125

Ile Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly Ser Ser

130 135 140

Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu Asp Gly Thr Val

145 150 155 160

Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn Leu Thr

165 170 175

Ser Tyr Ser Ala Ser Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn Ala His

195 200 205

Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr Lys Gln Ser Leu

210 215 220

Thr Val Thr Thr Ser Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Asp Arg Ile

225 230 235 240

Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His Gly Phe

245 250 255

Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Gln Arg Asp Gly Val

260 265 270

Ser His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys Tyr Ala Ser Ser Arg Val Phe

275 280 285

Lys Ile Thr Phe Ser Pro

290

<210> 28

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 28

Asn Ile Lys Pro Gly Asp Leu Lys Ser Val Tyr Glu Arg Leu Thr Ser

1 5 10 15

Leu Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Arg Gln Ser Val Ser Gly Met Ser

20 25 30

Val Thr Leu Ser Asp Leu Ser Ala Asp Leu Gln Asp Thr Thr Arg Ala

35 40 45

Leu Asp Asp Val Thr Val Thr Leu Asn Asn Leu Ser Ala Thr Ile Thr

50 55 60

Ala Leu Gln Ser Ser Val Thr Thr Leu Ser Ala Thr Val Asp Glu Leu

65 70 75 80

Thr Asn Thr Ser Ser Ala His Ser Gly Met Leu Ser Ser Leu Gln Thr

85 90 95

Ile Ile Asn Gly Asn Ser Ser Ala Ile Ser Asn Leu Arg Asn Asp Val

100 105 110

Ser Ala Ser Gly Leu Asn Ile Thr Asp Leu Gln Asp Arg Val

115 120 125

<210> 29

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 29

Asp Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Leu Ala Arg Gly Asp Asp Gly

1 5 10 15

Ser Ser Gly Ser Val Glu Met Leu Val Asn Ala His Cys His Gly Arg

20 25 30

Arg Thr Asp Tyr Met Met Ser Thr Thr Glu Asn Leu Thr Val Thr Gly

35 40 45

Asn Ser Thr Ser Leu Val Phe Ser Leu Asp Tyr Ile Thr Arg Pro Pro

50 55 60

Ser Asp Met Ser Arg Leu Ile Pro Arg Ala Gly Phe Gln Ala Ala Ser

65 70 75 80

Phe Pro Val Asp Val Ser Phe Thr Arg Asp Thr Thr Thr His Ala Tyr

85 90 95

Gln Val Tyr Gly Ala Tyr Thr Thr Pro Arg Leu Phe Lys Ile Thr Phe

100 105 110

Pro Thr Gly Arg

115

<210> 30

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 30

Gly Asp Leu Ile Pro Leu Tyr Glu Arg Leu Ser Ala Val Glu Lys Met

1 5 10 15

Cys Ala Thr Val Asn Asp Ser Leu Gly Arg Leu Thr Ser Leu Val Ser

20 25 30

Glu Met Ser Ala Arg Ile Asp Ser Leu Ala Asp Thr Leu Gln Glu Asn

35 40 45

Ala Ala Gly Leu Asp Gln Arg Ser Thr Val Thr Thr Leu Ser Val Ser

50 55 60

Leu Phe Asp Asp Leu Ser Gly Arg Val Ala Thr Leu Pro Leu Met Val

65 70 75 80

Ser Asn Gln Glu Ser Gln Leu Pro Ser Ser Leu Pro Ser Val Asn Ala

85 90 95

Leu Ser Thr Thr Cys Ser Asn Leu Gln Arg Asp Val Ser Ser Thr Ala

100 105 110

Leu Thr Val Thr Ser Leu Gly Gln Arg Val Glu Ala Leu Glu Ser Gly

115 120 125

Ala Gly Ser Asp Leu Thr Phe Met Ala Pro Leu Lys Val Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Glu Arg Thr Asn

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Asn Ala Gln Leu Leu Gln Phe Gln Trp Leu

165 170 175

Val Arg Ser Glu Gly Glu Ser Ser Asp Ser Ile Asp Met Asn Val Val

180 185 190

Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr His Asp

195 200 205

Ser Leu Thr Val Val Gly Asn Ser Val Thr Leu Ile Phe Asn Leu Asp

210 215 220

Phe Ile Thr Leu Lys Ala Ser Asp Tyr Ala Arg Leu Val Pro Cys His

225 230 235 240

Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Thr Lys Gly

245 250 255

Thr Ala Thr Gln Ser Tyr Gln Val Tyr Gly Ala

260 265

<210> 31

<211> 267

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 31

Gly Asp Leu Met Gln Ile His Glu Arg Leu Ser Ala Leu Glu Leu Thr

1 5 10 15

Thr Thr Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr Ala Leu Ser Lys Val Thr

20 25 30

Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala Val Ser Leu Ala Glu Thr

35 40 45

Glu Gly Glu Leu Ile Lys Leu Ser Ser Ala Val Gln Cys Leu Arg Thr

50 55 60

Ser Leu Asp His Leu Leu Gln Asn Trp Arg Leu Cys Pro His Trp Tyr

65 70 75 80

Val Thr His Gly Ser Ser Ile Ser Asp Leu Gln Lys Glu Gly Gln Ala

85 90 95

Leu Ser Ser Glu Val Asn Asn Leu Asn Leu His Val Ser Ser Gln Gly

100 105 110

Leu Thr Val Ser Asn Leu Glu Arg Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly

115 120 125

Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro Leu Lys Phe Glu Asp Gly

130 135 140

Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Val Ser Arg Asn

145 150 155 160

Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser

165 170 175

Val Lys Gly Glu Asp Gly Ala Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn

180 185 190

Ala His Ser His Gly Pro Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr Lys Gln

195 200 205

Ser Leu Thr Val Thr Ser Leu Leu Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Gly

210 215 220

Arg Ile Thr Ser Leu Pro Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ile Pro Cys His

225 230 235 240

Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe Gln Arg Asp

245 250 255

Gly Val Ser His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Lys

260 265

<210> 32

<211> 162

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 32

Gln Ser Gln Arg Arg Glu Val Gly Gly Leu Ile Leu Ser Leu Thr Ser

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Pro Gly Asp Leu Met Arg Ile His Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ala Leu Glu Leu Thr Thr Thr Ser Leu Asn Asp Ser Val Asn Thr

35 40 45

Ala Leu Ser Lys Val Thr Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp Asn Met Ala

50 55 60

Val Ser Leu Ala Glu Thr Lys Val Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Ala

65 70 75 80

Val Gln Gly Leu Arg Thr Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Glu Leu Ala

85 90 95

Ser Leu Ser Ser Leu Val Arg Asn His Gly Ser Ala Ile Ser Asp Leu

100 105 110

Gln Lys Glu Gly Gln Ala Leu Leu Val Glu Val Ser Asn Leu Lys Ser

115 120 125

Ser Val Ser Ser Gln Gly Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Arg Gln Val

130 135 140

Gln Ala Leu Glu Gly Gly Ser Ser Thr Thr Leu Ser Phe Ala Asp Pro

145 150 155 160

Leu Lys

<210> 33

<211> 229

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 33

Glu Arg Leu Ser Ala Leu Glu Ser Ala Ile Thr Ser Leu Asn Glu Ser

1 5 10 15

Val Asp Thr Ala Leu Ser Lys Leu Val Asp Leu Ser Gly Ser Leu Asp

20 25 30

Ser Met Ala Val Ser Leu Ala Glu Thr Lys Val Glu Leu His Ser Leu

35 40 45

Ser Ser Asp Val Lys Gly Leu Arg Thr Ser Leu Asp Ser Ser Ala Ser

50 55 60

Glu Leu Ala Ser Leu Ser Ser Leu Val His Asp His Gly Ser Ser Ile

65 70 75 80

Ser Asp Leu Gln Lys Gly Ser Arg Val Leu Ser Val Glu Val Asp Asn

85 90 95

Leu Lys Ser Ser Val Ser Ser Gln Gly Leu Met Ile Ser Ser Leu Glu

100 105 110

Ser Arg Val Gln Ala Leu Glu Gly Gly Pro Gly Thr Asn Leu Ser Phe

115 120 125

Ala Asp Pro Leu Lys Leu Glu Asp Gly Thr Val Ser Leu Glu Leu Asp

130 135 140

Pro Tyr Phe Cys Ser Val Arg Arg Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Asp

145 150 155 160

Ala Gln Leu Met Gln Phe Gln Trp Ser Ala Lys Gly Glu Asp Gly Ala

165 170 175

Ala Asn Ser Ile Asp Met Asp Val Asn Ala His Ser His Gly Ser Arg

180 185 190

Thr Asp Tyr Leu Met Ser Thr Lys Gln Ser Leu Thr Val Thr Thr Ser

195 200 205

Pro Ala Thr Leu Val Phe Glu Leu Asp Arg Ile Thr Ala Leu Pro Ser

210 215 220

Asp Phe Ser Ser Leu

225

<210> 34

<211> 302

<212> БЕЛОК

<213> Реовирус птиц

<400> 34

Ile Ser Pro Gly Asp Leu Val Pro Val Tyr Asp Arg Leu Ser Ala Val

1 5 10 15

Glu Ala Ala Tyr Ala Thr Leu Asn Ala Ser Val Gly Gln Leu Thr Ser

20 25 30

Thr Met Ser Asp Leu Ser Ile Arg Leu Asp Asp Leu Ala Asn Ala Ile

35 40 45

Gln Ser Thr Ser Thr Asp Leu Arg Asp Val Gln Ser Arg Val Ser Ala

50 55 60

Leu Gln Thr Ser Val Asp Gly Ile Ser Ser Asp Val Ala Thr Leu Ser

65 70 75 80

Gln Ser Leu Ser Thr His Gly Ser Gln Leu Ser Ala Leu Ser Ser Ser

85 90 95

Val Ser Thr Leu Ser Thr Asp Met Ser Asn Ile Gln Arg Asp Val Ala

100 105 110

Ser Ser Ala Leu Asn Val Ala Asp Leu Gln Arg Arg Val Thr Ala Leu

115 120 125

Glu Ser Gly Ala Gly Ser Ser Leu Thr Phe Leu Ala Pro Leu Arg Ala

130 135 140

Asp Gly Gly Ser Val Ser Leu Asp Met Asp Pro Tyr Phe Cys Ser Glu

145 150 155 160

Arg Ser Asn Leu Thr Ser Tyr Ser Ala Ser Ala Gln Leu Leu Gln Phe

165 170 175

Gln Trp Phe Val Arg Ser Glu Gly Gly Ser Ser Asp Ser Ile Asp Met

180 185 190

Ser Val Val Ala His Cys His Gly Arg Arg Thr Asp Tyr Leu Met Ser

195 200 205

Ser His Asp Ser Leu Thr Val Thr Gly Asn Ser Val Ser Leu Val Phe

210 215 220

Asn Leu Asp Tyr Ile Thr Thr Ser Gly Val Asp Tyr Ala Arg Leu Ile

225 230 235 240

Pro Cys His Gly Phe Gln Gln Ala Thr Phe Pro Val Asp Ile Ser Phe

245 250 255

Thr Lys Asn Asp Ala Thr His Thr Tyr Gln Val Tyr Gly Ala Phe Asp

260 265 270

Gly Pro Arg Ile Phe Lys Val Thr Phe Ser Pro Gly Glu Thr Ser Thr

275 280 285

Thr Asn Ile Arg Phe Ile Thr Val Arg Thr Gly Ile Glu Ile

290 295 300

<---

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Описан выделенный полипептид для вакцинации птицы против реовируса птиц, где указанный выделенный полипептид содержит внутреннюю аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1. Также описан выделенный полипептид для вакцинации птицы против реовируса птиц, где указанный выделенный полипептид содержит внутреннюю аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 70% идентичности аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1. Представлен выделенный полипептид для вакцинации птицы против реовируса птиц, где указанный выделенный полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с внутренней аминокислотной последовательностью белка сигма C, выбранного из группы, указанной в Таблице 1, указанная внутренняя аминокислотная последовательность соответствует аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1. Также представлен соответствующий вектор и вакцины. Изобретение расширяет арсенал средств для вакцинации птицы против реовируса птиц. 10 н. и 16 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр., 6 ил.

Формула

1. Выделенный полипептид для вакцинации птицы против реовируса птиц, где указанный выделенный полипептид содержит внутреннюю аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

2. Выделенный полипептид для вакцинации птицы против реовируса птиц, где указанный выделенный полипептид содержит внутреннюю аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 70% идентичности аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

3. Выделенный полипептид по п. 2, где указанная внутренняя аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

4. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-3, который блокирует или уменьшает связывание инфекционного реовируса птиц с нативным рецептором белка сигма С реовируса птиц.

5. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-4, который при введении птице, необязательно в комбинации с адъювантом, индуцирует защитный иммунный ответ против инфекционного реовируса птиц.

6. Выделенный полипептид по п. 5, который при введении птице индуцирует образование значимо более высоких системных уровней нейтрализующего антитела против белка сигма С по сравнению с системными уровнями указанного антитела, полученными после введения птице полноразмерного белка сигма C штамма S1133 ARV.

7. Выделенный полипептид для вакцинации птицы против реовируса птиц, где указанный выделенный полипептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичности с внутренней аминокислотной последовательностью белка сигма C, выбранного из группы, указанной в Таблице 1, указанная внутренняя аминокислотная последовательность соответствует аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

8. Выделенный полипептид по п. 7, где указанная аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с внутренней аминокислотной последовательностью белка сигма C, выбранного из группы, указанной в Таблице 1, указанная внутренняя аминокислотная последовательность соответствует аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

9. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-8, содержащий аминокислотную последовательность в пределах аминокислотной последовательности белка сигма С, выбранного из группы, указанной в Таблице 2, указанная внутренняя аминокислотная последовательность соответствует аминокислотным остаткам 122-326 белка сигма C штамма S1133 ARV, как указано в SEQ ID NO: 1.

10. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-9, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

11. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-10, содержащий метку для идентификации и/или очистки, такую как полигистидиновая метка.

12. Молекула нуклеиновой кислоты для экспрессии выделенного полипептида по любому из пп. 1-11, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один выделенный полипептид по любому из пп. 1-11.

13. Экспрессионный вектор для вакцинации птицы против реовируса птиц, содержащий контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с указанной молекулой нуклеиновой кислоты по п. 12, причем указанный экспрессионный вектор разработан для репликации и экспрессии соответствующих генов, например, в бактериальной, дрожжевой клетке или клетке насекомых.

14. Вакцина для вакцинации птицы против реовируса птиц, где указанная вакцина содержит по меньшей мере один выделенный полипептид по любому из пп. 1-11.

15. Вакцина по п. 14, содержащая адъювант, такой как термолабильный энтеротоксин (LT), полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия; и/или консервант, такой как тимеросал или 20%-ные эмульсии вода-в-масле, например, с минеральным маслом Marcol 52 (ESSO, Франция).

16. Вакцина для вакцинации птицы против реовируса птиц, где указанная вакцина содержит экспрессионный вектор млекопитающих, такой как pcDNA3, содержащий контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с указанной молекулой нуклеиновой кислоты по п. 12.

17. Вирусный вектор для вакцинации птицы против реовируса птиц, такой как рекомбинантный вирус болезни Марека (MD), содержащий контролирующий элемент, такой как промотор, функционально связанный с указанной молекулой нуклеиновой кислоты по п. 12.

18. Вакцина по п. 14 или 15, содержащая по меньшей мере два разных полипептида; или вакцина по п. 16 или вирусный вектор по п. 17, отличающиеся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере два разных полипептида; каждый из указанных, по меньшей мере, двух различных полипептидов происходит от представителя одной из двух, трех или четырех групп различных белков сигма С, причем определяющим признаком каждой группы является то, что аминокислотные последовательности различных белков сигма С указанной группы имеют не менее 75% идентичности.

19. Вакцина по любому из пп. 14-16 и 18, содержащая четыре разных полипептида; или вирусный вектор по п. 17 или 18, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую четыре разных полипептида,

причем первый из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 6-11 (Группа I); второй из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 12-16 (Группа II); третий из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 17-22 (Группа III); и четвертый из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 75% идентичности с SEQ ID NO: 1 или 23 (Группа IV).

20. Вакцина или вирусный вектор по п. 19, отличающиеся тем, что первый из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80 %, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 8; второй из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 16; третий из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 19; и четвертый из указанных четырех различных полипептидов происходит от белка сигма С, который имеет по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с SEQ ID NO: 23.

21. Вакцина или вирусный вектор по п. 19, отличающиеся тем, что первый из указанных четырех различных полипептидов происходит от полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-11 (Группа I); второй из указанных четырех различных полипептидов происходит от полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12-16 (Группа II); третий из указанных четырех различных полипептидов происходит от полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17-22 (Группа III); и четвертый из указанных четырех различных полипептидов происходит от полипептида, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и 23 (Группа IV).

22. Вакцина или вирусный вектор по п. 21, отличающиеся тем, что указанные четыре разных полипептида имеют аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.

23. Применение вакцины по любому из пп. 14-16 и 18-22 или вирусного вектора по любому из пп. 17-22 для вакцинации птицы против реовируса птиц или для индуцирования иммунного ответа птиц, обеспечивающего защиту от реовируса птиц.

24. Способ вакцинации птицы против реовируса птиц или индуцирования иммунного ответа птиц, обеспечивающего защиту от реовируса птиц, который включает введение птице вакцины по любому из пп. 14-16 и 18-22 или вирусного вектора по любому из пп. 17-22.

25. Способ по п. 24, который индуцирует продуцирование значимо более высоких системных уровней нейтрализующего антитела против белка сигма C по сравнению с системными уровнями указанного антитела, полученными после введения указанной птице полноразмерного белка сигма C штамма S1133 ARV.

26. Способ по п. 24 или 25, включающий введение указанной вакцины птицам путем инъекции, внутрикожно или подкожно; или перорально посредством питьевой воды.

Документы, цитированные в отчёте о поиске

Штамм птичьего реовируса, вакцина, содержащая указанный реовирус, способ получения птичьих реовирусов, способ изготовления вакцины и способ борьбы с патологиями птицы, вызываемыми птичьими реовирусами

Патенты аналоги

Авторы

ПИТКОВСКИЙ Яков (IL)

ГОЛДЕНБЕРГ Дана (IL)

PITCOVSKI JACOB

GOLDENBERG DANA

PITCOVSKI Jacob

GOLDENBERG Dana

Патентообладатели

GAVISH GALILEE BIO APPL LTD

GAVISH-GALILEE BIO APPLICATIONS, LTD

Заявители

GAVISH GALILEE BIO APPL LTD

GAVISH-GALILEE BIO APPLICATIONS, LTD

СПК: A61K39/12 A61K39/15 A61K2039/552 A61P31/12 C07K14/005 C12N15/63 C12N2720/12022 C12N2720/12034

МПК: A61K39/15

Публикация: 2021-02-04

Дата подачи заявки: 2017-01-05

РОССТИП

Поиск по товарам

Добавить свой товар

Сообщества

Товары

Участники

Патенты

Запросов

Поставщикам

О сервисе

Блогерам

Помощь