Способы и композиции для экспрессии антисмысловой вирусной рнк в клетках собаки - RU2457250C2
Код документа: RU2457250C2
Чертежи
Показать все 20 чертежа(ей)
Описание
Текст описания приведен в факсимильном виде.
Реферат
Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, включающую регуляторную последовательность РНК-полимеразы I собаки и содержащую (i) по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов или всю нуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательности SEQ ID NO:26, (ii) полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности (i) или включает комплементарную или обратно комплементарную (i) или (ii) последовательность. Нуклеотидная последовательность (i) или (ii) функционально связана с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа и при интродуцировании в клетки MDCK способна направлять экспрессию указанной вРНК вируса гриппа. Настоящее изобретение также описывает векторы экспрессии и клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты, а также способы применения таких нуклеиновых кислот для получения вирусов гриппа, в том числе вирусов гриппа, вызывающих инфекцию. Система плазмидного спасения pol I собаки позволяет получить рекомбинантные вирусы гриппа в культуре клеток собаки с высоким титром. 9 н. и 16 з.п. ф-лы, 16 ил., 7 табл., 12 пр.
Формула
1. Выделенная нуклеиновая кислота, включающая регуляторную последовательность РНК-полимеразы I собаки и содержащая (i) по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов или всю нуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательности SEQ ID NO:26, (ii) полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности (i), причем указанная нуклеотидная последовательность (i) или (ii), будучи функционально связанной с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа, и будучи интродуцированной в клетки MDCK, способна направлять экспрессию указанной вРНК вируса гриппа или включает комплементарную или обратно комплементарную (i) или (ii) последовательность.
2. Нуклеиновая кислота по п.1, в которой регуляторная последовательность является промотором.
3. Нуклеиновая кислота по п.1, в которой регуляторная последовательность РНК-полимеразы I представляет собой нуклеотиды 1-469 последовательности SEQ ID NO:26, комплементарной ей последовательности или обратной комплементарной ей последовательности.
4. Нуклеиновая кислота по пп.1, 2 или 3, в которой регуляторная последовательность функционально связана с кДНК, кодирующей вирусную геномную РНК с минус-нитью или соответствующую кРНК.
5. Нуклеиновая кислота по п.4, которая дополнительно включает последовательность терминации транскрипции.
6. Нуклеиновая кислота по п,5, в которой вирусная геномная РНК с минус-нитью является геномной РНК вируса гриппа.
7. Вектор экспрессии, включающий последовательности пп.1, 2 или 3.
8. Вектор экспрессии по п.7, который включает последовательность, представленную в SEQ ID NO:29.
9. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п.6.
10. Способ получения геномной РНК вируса гриппа, включающий транскрибирование нуклеиновой кислоты по п.6 в клетке, в результате которого вырабатывается геномная РНК вируса гриппа.
11. Способ получения рекомбинантного вируса гриппа, включающий культивирование клеток собаки, включающих вектор экспрессии по п.9 и один или несколько векторов экспрессии, экспрессирующих иРНК, кодирующую один или несколько полипептидов вируса гриппа, выбранных из группы, включающей полипептиды: РВ2, РВ1, РА, НА, NP, NA, M1, M2, NS1 и NS2, и выделение рекомбинантного вируса гриппа.
12. Способ получения рекомбинантного вируса гриппа, включающий
а) интродукцию в популяцию клеток собаки векторов экспрессии, способных экспрессировать в указанных клетках сегменты геномной вРНК для получения сегментов полной геномной вРНК указанного вируса, в котором указанные векторы экспрессии включают i) по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов или всю нуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательности SEQ ID NO:26, включает (ii) полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности (i), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, будучи функционально связанной с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа, и будучи интродуцированной в клетки MDCK, способна направлять экспрессию указанной вРНК вируса гриппа или включает комплементарную или обратно комплементарную (i) или (ii) последовательность,
(б) интродукцию в указанные клетки векторов экспрессии, способных к экспрессии иРНК, кодирующей один или несколько полипептидов указанного вируса, и
(в) культивирование указанных клеток, в результате которого образуются вирусные частицы.
а) интродукцию в популяцию клеток собаки векторов экспрессии, способных экспрессировать в указанных клетках сегменты геномной вРНК для получения сегментов полной геномной вРНК указанного вируса, в котором указанные векторы экспрессии включают i) по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов или всю нуклеотидную последовательность, представленную в виде последовательности SEQ ID NO:26, включает (ii) полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности (i), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, будучи функционально связанной с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа, и будучи интродуцированной в клетки MDCK, способна направлять экспрессию указанной вРНК вируса гриппа или включает комплементарную или обратно комплементарную (i) или (ii) последовательность,
(б) интродукцию в указанные клетки векторов экспрессии, способных к экспрессии иРНК, кодирующей один или несколько полипептидов указанного вируса, и
(в) культивирование указанных клеток, в результате которого образуются вирусные частицы.
13. Способ по п.11, в котором титр частиц вируса гриппа, получаемых при культивировании указанных клеток в течение 48-72 ч, составляет по меньшей мере 1,0×104 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл.
14. Способ по п.11, в котором титр частиц вируса гриппа, получаемых при культивировании указанных клеток в течение 48-72 ч, составляет по меньшей мере 1,0×105 БОЕ/мл.
15. Способ по п.11, в котором полученные частицы вируса гриппа являются инфицирующими.
16. Способ по п.12, в котором получаемые частицы вируса гриппа являются инфицирующими.
17. Клетка, обеспечивающая экспрессию РНК вируса гриппа и включающая вектор экспрессии по п.9.
18. Клетка по п.17, являющаяся клеткой собаки.
19. Клетки собаки по п.18, которые являются клетками почки.
20. Клетки почки собаки по п.19, которые относятся к клеточной линии MDCK.
21. Способ получения рекомбинантного вируса гриппа, включающий
а) интродукцию в популяцию клеток собаки векторов экспрессии способных к экспрессии в указанных клетках сегментов геномной вРНК для обеспечения сегментов полной геномной вРНК указанного вируса, причем один или несколько из указанных векторов экспрессии включает (i) по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов или всю нуклеотидную последовательность, представленную выше в виде последовательности SEQ ID NO:26, включает (ii) полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности (i), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, будучи функционально связанной с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа, и будучи интродуцированной в клетки MDCK, способна направлять экспрессию вРНК вируса гриппа или включает комплементарную или обратно комплементарную (i) или (ii) последовательность,
б) также способных к экспрессии в указанных клетках иРНК, кодирующей один или несколько полипептидов вируса гриппа, выбранных из группы, состоящей из полипептидов: РВ2, РВ1, РА, НА, NP, NA, M1, M2, NS1 и NS2, и
в) культивирование указанных клеток, и, в результате, получение частиц вируса гриппа.
а) интродукцию в популяцию клеток собаки векторов экспрессии способных к экспрессии в указанных клетках сегментов геномной вРНК для обеспечения сегментов полной геномной вРНК указанного вируса, причем один или несколько из указанных векторов экспрессии включает (i) по меньшей мере 250, или по меньшей мере 350, или по меньшей мере 450 соприкасающихся нуклеотидов или всю нуклеотидную последовательность, представленную выше в виде последовательности SEQ ID NO:26, включает (ii) полинуклеотид, который по меньшей мере на 80% идентичен указанной выше нуклеотидной последовательности (i), причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты, будучи функционально связанной с кДНК, которая кодирует вРНК вируса гриппа, и будучи интродуцированной в клетки MDCK, способна направлять экспрессию вРНК вируса гриппа или включает комплементарную или обратно комплементарную (i) или (ii) последовательность,
б) также способных к экспрессии в указанных клетках иРНК, кодирующей один или несколько полипептидов вируса гриппа, выбранных из группы, состоящей из полипептидов: РВ2, РВ1, РА, НА, NP, NA, M1, M2, NS1 и NS2, и
в) культивирование указанных клеток, и, в результате, получение частиц вируса гриппа.
22. Способ по п.21, в котором титр частиц вируса гриппа, образуемых при культивировании указанных клеток в течение 48-72 ч, составляет по меньшей мере 1,0×104БОЕ/мл.
23. Способ по п.21, в котором титр частиц вируса гриппа, образуемых при культивировании указанных клеток в течение 48-72 ч, составляет по меньшей мере 1,0×105 БОЕ/мл.
24. Способ по п.12 или 21, в котором применяют вирус-помощник.
25. Способ получения геномной РНК вируса гриппа, включающий интродукцию вектора экспрессии по п.9 в клетки и таким образом получение геномной РНК вируса.
