Система и способ для идентификации биологических тканей - RU2558884C2

Чертежи

Показать все 12 чертежа(ей)

Описание

ПРИОРИТЕТНАЯ ЗАЯВКА

Эта заявка имеет приоритет по Предварительной заявке на патент США №61/181421, поданной 27 мая 2009, которая приводится здесь для ссылки во всей ее целостности.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к устройствам, системам и способам для анализа, локализации и/или идентификации тканей. В частности настоящее изобретение относится к устройствам, системам и способам для анализа, локализации или идентификации тканей в режиме реального времени и in situ объединяет распад тканей и аналитический способ, такой как масс-спектрометрия.

Описание уровня техники

По всей заявке различные источники информации представлены в квадратных скобках для описания более полной картины уровня техники, к которому это изобретение принадлежит. Описание этих источников приводится здесь для ссылки во всей их целостности.

Идентификация патологических или анормальных тканей является ключевым фактором в процессе диагностики и лечения злокачественных образований. Как правило, рак диагностируется на основании информации, получаемой используя способы построения изображений. Некоторые способы построения изображений (компьютерная томография (СТ), магнитно-резонансная томография (MRI)) не обеспечивают достаточно информации для идентификации злокачественных пролифераций (новообразований), но дают изображение с высоким разрешением. Другие способы, в частности способы радионуклидной визуализации, обеспечивают относительно плохое разрешение, однако легко идентифицируют пролиферативные тканевые части, включая различные виды рака. Таким образом, комбинации двух видов способов построения изображения (позитронно-эмиссионная томография (РЕТ)/СТ, PET/MRI) используются для идентификации и собственно локализации рака.

Точный диагноз устанавливают с помощью гистологии или цитологии. Гистология представляет собой золотой стандарт способа для анормальной/патологической идентификации тканей, следовательно, классификация тканей основывается на гистологической экспертизе образцов тканей. Гистология традиционно включает следующие стадии: (1) подготовка образцов (биопсия или хирургия), (2) сохранение образца, используя в основном формалин, (3) обработка или включение образца в твердую матрицу, (4) разделение с получением секций 2-10 мкм толщины, (5) окрашивание и (6) визуальная экспертиза секций под микроскопом. Фундаментально окрашивание определяет тип получаемой информации. Традиционные красители (например, эозин-гематоксилин) способны идентифицировать клетки на основании морфологических признаков, в то время как иммуногистохимическое окрашивание обнаруживает присутствие некоторых протеинов в клетках.

В качестве альтернативы гистологии/гистопатологии цитопатологические способы также широко используются. В случае цитопатологии, только клетки берут в качестве образца или от биологических жидкостей, или напрямую от ткани (аспирационная патология) и образцы, подобно гистологии, были исследованы под микроскопом после соответствующей процедуры окрашивания.

Как гистопатология/цитопатология, так и способы построения изображения успешно используются для диагностики рака и противораковой терапии. Однако, в отличие от количества сведений, доступных до и после хирургического вмешательства, во время операции хирургу не хватает информации о текущем состоянии пораженной ткани, кроме видимых признаков. В основном хирург основывается на пре-оперативных способах изображения и его/ее собственных тактильных чувствах и зрении.

Проблема определения местонахождения злокачественных тканей традиционно решалась интраоперативным гистопатологическим исследованием удаленной опухоли. Это осуществлялось замораживанием свежеудаленной ткани и ее отправкой в патологическую лабораторию, где образец разделяли на части, окрашивали и исследовали под микроскопом. Цель процедуры обнаружить все ли границы удаленной ткани являются «чистыми» (то есть только ли здоровая ткань была рассечена) или нет. Хотя процедура широко используется, она имеет ряд недостатков, включая, например, тот факт, что около 20 минут времени необходимо для ее проведения, в то время как пациент находится на операционном столе с открытой хирургической раной, кроме того, результаты исследования являются ненадежными из-за суб-оптимальной обработки образцов.

Дополнительные способы, развиваемые для интра-оперативной локализации опухолей, включают применение различных способов построения изображения во время операции. Сонография и рентгеновская флуороскопия долгое время применялись для отслеживания хирургических процедур, хотя их применение требует прерывания операции. Недавно специальные системы построения изображения, основанные на MRI и СТ, были использованы для предоставления информации в режиме реального времени для хирургов. Интраоперативные системы построения изображения были снабжены навигацией, которая помогает связывать изображение визуально наблюдаемых признаков. Хотя эти системы показали себя как максимально полезные для некоторых применений, например при хирургии спины, они не способны идентифицировать минимальные количества раковой ткани на хирургической области или минимальные проксимальные метастазы.

В многообещающей группе недавно развиваемых технологий используется селективная химическая маркировка злокачественных тканей. Молекулы маркировки несут или радионуклиды, или флуоресцентные фрагменты. Поскольку пролиферативные клетки накапливают такие молекулы, они могут быть визуализированы, например, или с помощью гамма-камеры или инфракрасной камеры. Эти способы успешно используются для обнаружения проксимальных метастаз, например обнаружение так называемых сигнальных лимфоузлов, которые накапливают раковые клетки рядом с первичными опухолями. Недостатком этих методов является их селективная природа к некоторым опухолям, их несовместимость с хирургическими техниками и нежелательные побочные эффекты маркировки. Необходимо отметить, что меланома может быть обнаружена средствами ближнего ИК-диапазона двуфотоновой лазерной флуоресценции, однако эта техника может быть использована только для обнаружения первичной меланомы на поверхности кожи.

Злокачественные опухоли могут быть дифференцированы от здоровых тканей, учитывая их ускоренный метаболизм. Раковые клетки накапливают основные питательные вещества или молекулы, которые подобны основным питательным веществам (например, фтордезоксиглюкоза - FDG). Когда эти питательные вещества или фальшивые питательные молекулы помечают радионуклидом (18FDG в PET) или флуоресцентным фрагментом, раковые клетки становятся видимыми, используя соответствующие способы визуализации. Кроме ускоренного метаболизма, раковые клетки отличаются от здоровых клеток несколькими характеристиками. Опухоли, например, имеют другой химический состав, начиная от распределения небольших метаболических составляющих до различной экспрессии белка и посттрансляционных модификационных участков. Эти химические признаки могут быть использованы в иммуногистохимической визуализации опухолей и также в химическом изображении участков тканей, используя инфракрасную спектрофотометрию или масс-спектроскопию. Среди этих методов, масс-спектрометрия является единственной техникой, которая может быть основой in-situ, тканевым идентификационным инструмент in vivo, использующим различный химический состав тканей.

Методы масс-спектрометрической ионизации традиционно развивались для анализа газообразных или летучих материалов. Один из недостатков этих ионизационных способов - это недостаток способности анализировать нелетучие соединения. Группа соединений включает пептиды, протеины, нуклеиновые кислоты, углеводы и так далее, что составляет приблизительно 90% биологически релевантных молекул.

С 1970 года появилась новая совокупность ионизационных способов, что дало возможность превращать молекулы конденсированной фазы напрямую в ионы на газ/твердой или газ/жидкой поверхности и затем десорбировать появляющиеся ионы с поверхности. Такие ионизационные методы именуются как «десорбционные ионизационные» способы.

Второе поколение десорбционных ионизационных способов применяет альтернативный способ ионизации, используя так называемый аналитический луч ионизации. Аналитический луч включает частицы высокой энергии (атомы, молекулы, атомные или молекулярные ионы, фотоны и так далее), которые направляют на поверхность образца. Под действием аналитического луча на поверхности происходит микровзрыв с получением газообразных ионов и молекул поверхностного материала. Более ранним способом применения аналитического луча была плазменная десорбционная ионизация, которая использует частицы высокой энергии, производимые при радиоактивном распаде изотопов калифорния (Macfarlane RD, et al. Science, 191 (4230), 920-925. 1976).

В то время как в плазменной десорбции использовался дивергентный поток неопределенных видов, во вторичной ионной масс-спектрометрии (SIMS) используется коллимированный луч атомных или кластерных ионов, ускоренных полем статического электричества до диапазона 10-30 кэВ (Bennighoven, A, Surface Science 28 (2) 541-1971). Вторичная ионная масс-спектрометрия способна достигать 10 нм пространственной разрешающей способност, вследствие поперечного сечения сфокусированных ионных пучков. Несмотря на прекрасное пространственное разрешение, масштабное применение SIMS затруднено ограниченным весовым диапазоном молекул, которые подвергают SIMS ионизации. По существу молекулы, имеющие молекулярный вес ниже 1 кДа, могут быть обнаружены с помощью SIMS, однако ограничение для более тяжелых ионов даже в этом узком масс-диапазоне присутствует. Способ может также быть использован для детального анализа (динамический SIMS), однако в этом случае пучок ионов высокой энергии производит в основном атомные ионы. Исследование образцов жидкости было также использовано в случае SIMS ионизации (жидкостная SIMS, LSIMS). (Aberth, W, Analytical Chemistry, 54 (12): 2029-2034 1982). Жидкостная SIMS имеет значительные преимущества по сравнению с первоначальными техниками, включая более широкий диапазон массы (MW<10 kDa), лучшее воспроизведение и чувствительность. Одним из недостатков LSIMS является тот факт, что образцы должны быть растворены в глицерине или нитробензил-спирте до проведения анализа. На этой стадии часто возникают проблемы с растворимостью, и деструктивное растворение твердых образцов, очевидно, исключает любой вид пространственно разрешенного анализа. Другие недостатки включают более мягкие, но все еще существующие ограничения молекулярного веса видов, ионизированных этим способом.

LSIMS способ в дальнейшем был усовершенствован заменой первичного ионного пучка на пучок атомов благородных газов с высокой скоростью. Более поздние способы были определены как «бомбардировка быстрыми атомами» (FAB) и имели больше преимуществ по сравнению с LSIMS (Williams, DH et al, JACS, 103 (19): 5700-5704 1981), однако способ сохранил практически все преимущества исходного способа, включая ограничения молекулярного веса и потерю способности пространственно разрешенного анализа.

Другим направлением развития SIMS техники было увеличение массы бомбардирующих (первичных) ионов. В конечном счете, это исследование привело к развитию так называемой массивной кластерной ударной ионизации (MCI), которая использует капли заряженных жидкостей (обычно глицерин) в качестве бомбардирующих частиц в SIMS подобной экспериментальной установке (Mahoney, JF Rapid Communications in Mass Spectrometry, 5 (10): 441-445, 1991). Капли ускоряются до 2-10 кэВ/заряд и пучок капель с высокой энергией направляется на поверхность несущего образец материала, который может быть как в твердой, так и в жидкой форме. Существенное преимущество MCI по сравнению с SIMS представляет собой более широкий диапазон отношения масса/заряд и даже более важным является тот факт, что MCI производит в основном заряженные ионы макромолекулярных видов, таких как протеины. Это преимущество позволяет получить детальную масс-спектрометрическую информацию, например последовательность протеинов. MCI все еще имеет недостаток ограниченного молекулярного весового диапазона, усложненные контрольно-измерительные приборы и перекрестную контаминацию между образцами вследствие распыляющего эффекта глицериновых капель. Хотя способ теоретически способен на пространственно разрешенный анализ, попытки улучшить эту способность в известном уровне техники не увенчались успехом.

Общим недостатком описанных способов является то, что они работают строго в условиях высокого вакуума. Следовательно, образцы вводятся в режим высокого вакуума масс-спектрометра, что включает сильные ограничения по составу и геометрии образцов, а также требует специальных систем для ввода образцов.

Способы лазерной десорбционной ионизации развивались с ранних 1980 (Cooks, RG et al. JACS, 103 (5): 1295-1297, 1981). Простая лазерная десорбционная ионизация, подобно SIMS, дает слабую ионизационную эффективность, и она может быть использована только для исследования относительно ограниченного количества молекул. Способы лазерной десорбции были полностью изменены применением так называемых матричных соединений. Матричные соединения смешиваются с образцами в растворе и совместно кристаллизуются в образец, несущий целевую поверхность. Поскольку матричное соединение используется в избыточном количестве, полученный образец состоит из кристаллов матричного соединения с аналитическими молекулами, включенными в кристаллическую решетку. Использование матричных соединений значительно увеличивает эффективность ионизации, и также увеличивает область применения этих способов. Лазерная десорбционная ионизации с помощью матрицы (MALDI) (Karas, Hillenkamp, Analytical Chemistry, 60 (20): 2299-2301, 1988) широко используется для анализа целых белков и для идентификации белков на основании масс-спектрометрического исследования триптических гидролизатов, также полимеров, нуклеиновых кислот и углеводов. Основные недостатки MALDI включают выход низкого иона с получением однозарядных ионов и тот факт, что естественные поверхности могут быть исследованы только после получения матричных соединений.

Недавно возникла необходимость в разработке способов десорбционной ионизации в атмосферных условиях. Преимущества способа десорбционной ионизации при атмосферном давлении включают: (1) образцы не вводятся в вакуумный режим масс-спектрометра, что делает аналитическую процедуру быстрее и гибче, (2) поскольку образец не переходит под вакуум, нет необходимости удаления летучих соединений, таких как вода, (3) спорные предметы могут быть исследованы/проанализированы таким способом, (4) биологические системы, включая живые организмы, могут быть исследованы in-vivo и in-situ, этот признак позволяет применять эти методы in-situ для идентификации ткани. Методы десорбционной ионизации, используя коллимированный пучок атомов, ионов, молекул или молекулярных кластеров, не могут быть использованы в условиях атмосферного давления, поскольку частицы не могут ускоряться до подходящих скоростей при высоком давлении вследствие последовательных столкновений с молекулами газа. Тот же феномен является ответственным за предельное отклонение пучка частиц при более высоком давлении, которое также мешает образованию практических аналитических лучей.

Среди вышеописанных способов только ионизация лазерной десорбции может быть использована при атмосферном давлении без значительных изменений в инструментарии, поскольку лазерные пучки не взаимодействуют с молекулами воздуха в условиях ионизации. MALDI при атмосферном давлении были усовершенствованы Laiko et al. (2000), Anal. Chem., 72, страницы 652-657; однако техника не приобрела популярности из-за низкого ионного выхода, ионных потерь, увеличенных на 99% в атмосферной поверхности раздела, вопросов безопасности рабочего места, в основном связанных с применением лазера в открытых экспериментальных установках.

Недавно открытая десорбционная электрораспылительная ионизация (DESI) (Takats et al, Science, 2004) представляет собой таксономично/феноменологичную версию масс-спектрометрии при атмосферном давлении, описанную выше. Оба способа используют многозарядные капли растворителей в качестве аналитического луча, однако в случае DESI капли получают электрораспылением и ускоряют суперзвуковым потоком газа вместо градиента электростатического поля. Тем не менее, DESI оправдал все ожидания, связанные со способами десорбционной ионизации при атмосферном давлении, поэтому это открыло дверь масс-спектрометрическому анализу спорных предметов по химическому составу, размеру и геометрии. В ходе DESI процесса высокая скорость электрораспыленных капель влияет на поверхность образца. Капли растворяют молекулы, присутствующие на поверхности, и эмитируют вторичные капли, которые являются заряженными. Заряженные вторичные капли, несущие поверхностный материал, производят ионы, в конце концов, следуя хорошо известным механизмам электрораспылительной ионизации.

Исследования тканей средствами масс-спектрометрии продолжились двумя фундаментально различными способами. Один подход был сфокусирован на систематической характеристике групп соединений, присутствующих в тканях, в то время как другая стратегия сконцентрировалась на быстром, прямом методе «пальцевых отпечатков» тканей. Способы, принадлежащие к первой группе, в основном начинаются с гомогенизации и лизиса большого количества ткани, за которым следует селективная экстракция групп соединений, представляющих интерес (например, белков или фосфолипидов и так далее). Соединения отделяют средствами электрофореза или хроматографии и затем идентифицируют масс-спектрометрией. Хотя эти способы не могут быть использованы для быстрой идентификации тканей, они обеспечивают бесценную информацию по характеристикам маркерных молекул одного или другого типа ткани.

Быстрые масс-спектрометрические отпечатки тканей достигаются методами десорбционной ионизации, описанными выше. SIMS анализ тканей дает характеристический спектр, демонстрирующий в основном фрагменты фосфолипидов, однако техника работает исключительно в условиях высокого вакуума, и, следовательно, не может быть применена для анализа тканей in vivo. MALDI анализ образцов тканей дает спектр с признаками или ионов многочисленных белков или ионов общих мембранных липидов в зависимости от типа используемых матричных соединений. Хотя оба типа спектра являются характеристическими и демонстрируют уникальные признаки в случае злокачественных опухолей, способ все еще не может быть применен для анализа in vivo, поскольку отложение матричных соединений не совместимо с живыми организмами. Прямая лазерная десорбция при использовании инфракрасного лазера (Er-YAG или CO2) представляет собой специальный случай MALDI, где вода в образце действует в качестве матрицы. Этот способ полностью совместим с анализом in vivo (эти инфракрасные лазеры широко используются в хирургии), однако идентификация ткани в этом случае не была продемонстрирована до настоящего времени. Недавно разработанные DESI способы дают спектр, показывающий различные мембранные липиды, которые дают характерные модели для ряда тканей. Анализ DESI не требует подготовки образца в отличие от MALDI, при этом свеженадсеченные поверхности живых тканей могут быть исследованы. Анализ DESI живой ткани, однако, не дает на выходе заключительных данных из-за крови и тканевой жидкости, стекающей с поверхности, которая исследуется. Еще одним недостатком анализа DESI является безопасность, связанная с применением 4-5 кВ постоянного тока вблизи живых организмов.

Из представленного выше анализа уровня техники в масс-спектрометрии можно сделать вывод, что как протеины и фосфолипиды дают характеристическое распределение в DI масс-спектре различных тканей, однако для масс-спектрометрического анализа in vivo не существует соответствующих способов ионизации.

Ионизация конденсированной фазы нелетучих образцов путем быстрого нагревания осуществляется с конца 1960 годов. Основной причиной этой попытки было использовать разложение аналитических молекул. Friedman и другие описал успешную ионизацию аминокислот и пептидов быстрым нагреванием в ранних 1970 годах. Предполагаемый механизм этих экспериментов ограничился контактным нагреванием чистых, кристаллических аналитических соединений. Поиск более эффективных способов нагревания привел к применению лазеров в масс-спектрометрических ионных источниках и к развитию различных лазерных десорбционных ионизационных способов (включая MALDI), описанных выше.

Альтернативно лазерному нагреванию, термальное распылительное разложение растворенной фазы соединений было изучено (смотреть, например, Vestal и другие, Anal. Chem. (1980), 52, страницы 1636-1641). Поскольку распылительное разложение в вакууме или инертной атмосфере значительно увеличивает скорость разложения, целые виды молекул были перенесены в газовую фазу этим способом. Эти методы были названы «термораспыление» и были широко использованы в поздних 1980 и ранних 1990 в качестве ВЭЖХ-МС взаимодействий. Большинство способов термального разложения приводит к образованию подавляющего количества нейтральных видов; следовательно, эти способы часто объединялись с постионизационными техниками. Постионизация была традиционно осуществлена через электронное столкновение (EI) или химическую ионизацию (CI). Недавно подобный подход был введен, используя электрораспылительную постионизацию газообразных видов, получаемых лазерной абляцией образцов (LAESI).

То, что необходимо - это масс-спектрометрическое устройство, система и способ, который может быть использован для прямого, in situ исследования биологической ткани, который не наносит вреда исследуемым организмам, и дает масс-спектральные характеристики различных типов тканей за относительно короткий промежуток времени, и который также может быть использован в операционной, преимущественно как интегрированная часть одного или более хирургических инструментов или рассекающих инструментов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает новые устройства, системы и способы для анализа, локализации или идентификации типов тканей. Новые устройства, системы и способы по настоящему изобретению способны обеспечивать in situ исследование биологической ткани, которое не наносит вреда исследуемым организмам, и способны предоставить обратную связь в режиме реального времени во время процедуры на ткани, такой как хирургические процедуры. Устройства, системы и способы по настоящему изобретению могут или быть использованы в тесной связи, например, с хирургической процедурой, когда один или более хирургических инструментов являются интегрированной частью ионизации, или в качестве отдельного масс-спектрометрического зонда для анализа одной или более частей тканей хирургически затронутой области.

Так, в одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает способ анализа, локализации и/или идентификации одного или более образцов тканей, отличающийся тем, что способ включает: (а) получение газообразных частиц ткани с участка одного или более образцов ткани; (b) транспорт газообразных частиц ткани с участка к анализатору; (с) применение анализатора для получения данных, относящихся к ткани, на основании газообразных частиц ткани, и (d) анализ, локализация и/или идентификация одного или более образцов ткани на основании данных, относящихся к ткани.

Настоящее изобретение обеспечивает также систему для анализа, локализации и/или идентификации одного или более образцов ткани. Таким образом, в другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает систему для анализа, локализации или идентификации одного или более образцов ткани, отличающуюся тем, что указанная система включает: (а) дезинтегрирующее устройство для контакта одного или более образцов ткани с участка; и для получения газообразных частиц ткани с участка; (b) транспортные средства для транспорта газообразных частиц ткани от участка к анализатору, и (с) анализатор, операционным образом связанный с транспортными средствами, указанный анализатор для получения данных, относящихся к тканям, основан на газообразных частицах тканей, где указанные данные, относящиеся к тканям, используются для анализа, локализации и/или идентификации одного или более образцов тканей.

Настоящее изобретение обеспечивает также устройство для анализа, локализации и/или идентификации одного или более образцов ткани. Таким образом, в другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает устройство для анализа, локализации или идентификации одного или более образцов ткани, отличающееся тем, что указанное устройство включает: (а) дезинтегрирующее устройство для контакта одного или более образцов ткани с участка; и для получения газообразных частиц ткани с участка; (b) транспортные средства, предназначенные для операционного связывания с анализатором, указанные транспортные средства используют для транспорта газообразных частиц ткани от участка к анализатору.

В еще другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения масс-спектрометрических данных, отличающийся тем, что указанный способ включает: (а) контакт области, представляющей интерес с дезинтегрирующим устройством, способным на получение газообразных частиц образца, (b) транспорт газообразных частиц образца от области, представляющей интерес к масс-спектрометру, и (с) использование масс-спектрометра для получения данных, относящихся к образцу, на основании газообразных частиц образца от области, представляющей интерес.

В еще другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает систему для диагностики ткани в режиме реального времени, отличающуюся тем, что устройство включает (а) дезинтегрирующее устройство для контакта одного или более образцов ткани с участка; и для получения газообразных частиц ткани с участка; (b) транспортные средства для транспорта газообразных частиц ткани от участка к анализатору, и (с) анализатор, операционным образом связанный с транспортными средствами, указанный анализатор предназначен для получения в режиме реального времени данных, относящихся к тканям, на основании газообразных частиц тканей, где указанные данные, относящиеся к тканям, используются для диагностики тканей.

Следует понимать, что настоящее изобретение может быть использовано для анализа в режиме реального времени или идентификации любой биологической ткани и для любой цели. Описание иллюстрирует настоящее изобретение через пример использования описанной технологии в связи с хирургической процедурой, однако настоящее изобретение может также быть использовано, например, для анализа мясных продуктов в целях здоровья и безопасности, анализа биологической ткани для идентификации лекарственных средств в ткани, анализа биологической ткани на наличие заболевания или инфекции и так далее. Ни один из специфичных примеров, представленных здесь, не должен быть рассмотрен для ограничения применения описанной технологии.

В еще другом аспекте изобретения, системы, способы и устройства по настоящему изобретению включают сигнализацию результатов идентификации ткани пользователю хирургического устройства на участке.

Преимущества

Преимущества способов, систем и устройств для хирургического применения включают:

Применение способа, систем и устройств по настоящему изобретению позволяет хирургам обнаружить, как различные типы тканей распространяются по хирургической области. Этот признак увеличивает идентификацию раковых пятен, увеличивает точность удаления ткани в случае хирургического удаления рака хирургами и удаление некротических/ишемических тканей, и также минимизирует массу удаленных здоровых тканей.

Способы, устройства и системы по настоящему изобретению способны в режиме реального времени in-situ осуществлять идентификацию частей тканей во время хирургической операции.

Способы, устройства и системы по настоящему изобретению дают возможность предупреждать (информировать) хирургов, когда злокачественные ткани рассекаются во время операции.

Общие преимущества применения способов, устройства и системы по настоящему изобретению включают:

(a) Снижение инвазивности хирургического удаления тканей, следовательно, более быстрой скорости восстановления; меньше хирургической подготовки; автоматическая или полуавтоматическая целевая идентификация ткани;

(b) Снижение скорости повторения рака;

(c) Обеспечение объективного критерия для идентификации ткани;

(d) Способствует химическому анализу тканей как in vivo, так и в микроскопических секциях;

(e) Обеспечивает информацию по химическому составу тканей для исследователей;

(f) Обеспечивает методологию измерения концентрации некоторых молекул (например, лекарственных молекул) в тканях без подготовки образца;

(g) Могут применяться в совокупности с так называемой химической маркировкой во время хирургической операции, когда пациенту дают такую молекулу, которая будет накапливаться злокачественными тканями (маркировка) и раковые клетки обнаруживаются на основании присутствия или отсутствия маркировочных молекул;

(h) Дают возможность альтернативному, однако, деструктивному, способу клеточной идентификации в цитологии или проточной цитометрии, когда клетки идентифицируются на основании их масс-спектрометрического химического отпечатка;

(i) Способствуют in situ, in vivo идентификации микробных инфекций в зараженных органах и слизистых оболочках;

(j) Способствует in vivo идентификации циркулирующего/метаболического статуса тканей; и

(k) Устраняет необходимость интрахирургической гистопатологической экспертизы образцов, способствуя более короткому времени проведения операции.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего детального описания. Понятно, однако, что детальное описание и специфичные примеры, указывающие варианты осуществления изобретения, представлены только для иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации внутри объема притязаний по изобретению станут очевидными специалисту в данной области из представленного детального описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Настоящее изобретение станет более понятным из детального описания, представленного здесь, и из сопровождающих фигур, которые представлены только для иллюстрации и не ограничивают объем притязаний по изобретению.

Фигура 1 иллюстрирует схему in vivo масс-спектрометрической системы для идентификации тканей в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения.

Фигура 2 иллюстрирует схему in vivo масс-спектрометрической системы для идентификации тканей в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения.

Фигура 3 иллюстрирует исполнение постионизации нейтральных газообразных частиц ткани с помощью вторичной электрораспылительной ионизации.

Фигура 4 иллюстрирует исполнение постионизации нейтральных газообразных частиц ткани с помощью ионизации коронного разряда.

Фигура 5 иллюстрирует общий поток ионов, получаемый во время применения устройства и способа по настоящему изобретению в хирургической обстановке.

Фигура 6 иллюстрирует полный масс-спектр, получаемый во время электрохирургической диссекции печени свиньи, используя установку по Фигуре 1.

Фигура 7 иллюстрирует три перекрывающих масс-спектра негативных ионов, полученные во время электрохирургической диссекции печени свиньи, используя установку по Фигуре 1.

Фигура 8 иллюстрирует масс-спектр, получаемый от печени свиньи, сердца и легкого в режиме отрицательных ионов, во время электрохирургической диссекции соответствующих органов, используя установку, изображенную на Фигуре 1.

Фигура 9 иллюстрирует масс-спектр, полученный от меланомы собаки, ее проксимального лимфатического узла и окружающей здоровой кожи, в режиме отрицательных ионов во время электрохирургического удаления опухоли и индикаторного лифматического узла, используя установку, изображенную на Фигуре 1.

Фигура 10 иллюстрирует схему in vivo способа масс-спектрометрической идентификации ткани и устройства, используя лазерные средства для создания газообразных частиц ткани в соответствии с еще другим аспектом изобретения.

Фигура 11 иллюстрирует сравнение между спектром, получаемым электрохирургией (спектр выше) и спектром, получаемым лазерной хирургией, используя CO₂ лазер (спектр ниже). Оба спектра были получены рассечением печени свиньи и анализом ионов, полученных при хирургическом рассечении без средств постионизации.

Фигура 12 иллюстрирует схему потока данных между больницей и узлом развития базы данных. Больницы облегчают совершенствование базы данных путем предоставления производителю исходных гистологических данных, в то время как производитель обрабатывает данные и хранит их в центральной базе данных.

Фигура 13: панель А представляет собой картинку, взятую во время хирургической диссекции мастоцитомы III степени у собаки, панель В представляет собой три пространственных основных компонента анализа спектра, взятые из отмеченных мест на панели а), и панель С представляет собой изображение на экране компьютера с программным обеспечением в режиме реального времени во время хирургической операции панели А. 1=мускул, 2=кожа, 3=подкожный слой, 4=мастоцитома.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

По меньшей мере, если не определено иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, которое является общепринятым и понятным специалистам в области, к которой принадлежит изобретение. Также, если не указано иное, за исключением формулы изобретения, применение «или» включает «и» и наоборот. Термины без ограничения не рассматриваются как ограничительные, если это не обозначено отдельно или в контексте четко указано другое (например, «включающий», «имеющий» и «включающий» обычно указывает «включая без ограничения»). Формы единственного числа, включенные в формулу изобретения, включают множественное число, если не определено противоположное.

«Интересующая область» или «Участок» означает область ткани, которая содержит предмет получаемых данных, относящихся к ткани. В одном варианте осуществления изобретения, область, представляющая интерес или участок, подозревается в содержании анормальной или патологической ткани. В некоторых вариантах осуществления изобретения, полагают, что участок содержит нормальную ткань и данные, получаемые для использования в качестве контроля, или базовые данные.

«In situ» означает прямое исследование клеток или тканей. In situ включает прямое исследование тканей во время хирургической процедуры.

«Эффект памяти» может быть определен как нелинейная задержка между анализом процесса и получаемыми данными. Сигнал, соответствующий одному образцу (образец А), может продолжать существовать, даже когда образец А больше не анализируют, и это может препятствовать анализу следующего образца В.

«Субъект» или «пациент» относится к животному, включая человека, нуждающемуся в лечении состояния, нарушения или заболевания.

«Раковая ткань» относится к любой неопластической ткани, включая раковые клетки. Раковая ткань может быть твердым раком или не твердым раком, таким как присутствующие в сердечно-сосудистой системе, например лейкемия.

Изобретение может быть объяснено в деталях со ссылкой на Фигуры.

Заявители обнаружили, что хирургические способы, применяющие ультразвуковую или термальную дезинтеграцию (например, электрохирургия и инфракрасная лазерная хирургия), производят большое количество газообразных частиц тканей. Заявители также обнаружили, что масс-спектр этих газообразных частиц подобен получаемым другим масс-спектрометрическим техникам, таким как DESI, SIMS и MALDI. По существу, настоящее изобретение обеспечивает устройства, системы и способы анализа, локализации и/или идентификации тканей в режиме реального времени и in situ путем объединения дезинтеграционной ионизации тканей и масс-спектрометрии.

При дезинтеграции ткани заряженные и незаряженные частицы образуются в газовой фазе. Авторы обнаружили, что заряженные частицы, получаемые в результате дезинтеграции в виде кластеров молекул, которые постепенно претерпевают распад, дают молекулярные ионы. Этот постепенный распад обычно начинается в точке дезинтеграции и обычно в связи с настоящим изобретением завершается получением молекулярных изображений в масс-спектрометре, предпочтительно до масс-анализа. Незаряженные частицы могут быть постионизированы, и постионизация также производит распределение заряженных молекулярных кластеров, ранжируя их от индивидуальных молекулярных ионов до макроскопических капель. Эти кластеры также претерпевают постепенное соединение с получением молекулярных ионов. По этому способу, дезинтеграция ткани выполнена с возможностью получения заряженных частиц ткани, которые, в свою очередь, дают молекулярные ионы, подходящие для использования в масс-спектрометрии.

По существу в одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает систему для анализа, локализации и/или идентификации одного или более образцов ткани, отличающуюся тем, что указанная система включает: (а) дезинтегрирующее устройство для контакта одного или более образцов ткани на участке, и для получения газообразных частиц ткани с участка, (b) транспортные средства для транспорта газообразных частиц ткани от участка к анализатору, и (с) анализатор, операционным образом связанный с транспортными средствами, указанный анализатор для получения данных, относящихся к тканям, основан на газообразных частицах тканей, где указанные данные, относящиеся к тканям, используются для анализа, локализации и/или идентификации одного или более образцов тканей.

В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает устройство для анализа, локализации или идентификации одного или более образцов ткани, отличающееся тем, что указанное устройство включает: (а) дезинтегрирующее устройство для контакта

одного или более образцов ткани с участка; и для получения газообразных частиц ткани с участка; (b) транспортные средства, предназначенные для операционного связывания с анализатором, указанные транспортные средства используют для транспорта газообразных частиц ткани от участка к анализатору.

Новые способы, системы и устройства по настоящей заявке, быстрая испарительная ионизационная масс-спектрометрия (REIMS), охватывающая аэрозолизацию ткани для получения и идентификации газообразных ионов из ткани и локализации анормальную ткань in situ, могут быть введены для многочисленного ряда применений. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения REIMS техники могут быть использованы для диагностических целей для отслеживания области, представляющей интерес, для идентификации, присутствует ли в ней ткань специфического вида или состава, или имеющая другие специфические свойства, например раковая ткань, если да, то для определения местоположения раковой ткани с высокой степенью пространственного разрешения. Эти диагностические техники могут быть использованы для исследования области, представляющей интерес, которая подвергается хирургической процедуре, или области, представляющей интерес, на которую воздействуют инвазивным или полуинвазивным инструментом, таким как лапароскоп, эндоскоп, зонд, оптокабель или тому подобное. Способы, системы и устройства по настоящему изобретению могут быть использованы для быстрого обнаружения и диагностики по многочисленным применениям, включая и не ограничиваясь обнаружением различных аномалий, включая рак легкого, рак органов пищеварительной системы, включая рак желудка, колоректальный рак и тому подобное; кожи, репродуктивных органов, таких как простата, яичники, матка, рак шейки матки, рак груди, рак мозга, рак лимфатической системы и костей и тому подобное. Другие применения настоящего изобретения будут описаны ниже.

Основная установка в соответствии с одним аспектом системы по настоящему изобретению показана на Фигуре 1 при хирургическом вмешательстве. Система, показанная на Фигуре 1, включает следующие части:

Дезинтегрирующее Устройство 11. Первичной функцией дезинтегрирующего устройства является получение аэрозоля из биологической ткани путем или ультразвуковой обработки или быстрого кипения воды, содержащейся в ткани, которая разрушает структуру ткани. Дезинтеграция приводит к получению аэрозоля или газообразных частиц, покрываемых поверхностно-активными молекулами, то есть мембранными липидами исходной структуры, и включает целые и термально разлагаемые биомолекулы. Эти аэрозольные или газообразные частицы могут нести чистый электрический заряд из-за неравномерного распределения анионных и катионных видов, и эти капли могут распадаться с получением индивидуальных молекулярных ионов мембранных липидов.

Существует ряд различных дезинтеграционных способов, которые могут быть использованы в устройствах, системах и способах по настоящему изобретению, включая обработку ультразвуком, Джоулев нагрев, контактное нагревание и радиационное нагревание, которое включает электромагнитную радиационную (диапазон с микроволн до ближнего УФ) абляцию.

Фигура 1 иллюстрирует систему, где дезинтегрирующее устройство 10 осуществляет Джоулев нагрев с помощью подведения электрического тока к образцу ткани, представляющему интерес. Функция электрода 10 с точки зрения анализа - это привести биологическую ткань в контакт с удаленным источником электрического тока 70. Электрический ток, протекающий через здоровые, нормальные части ткани 20 и через анормальные, патологические (такие как раковые) части ткани 30, превращает части ткани 20, 30 в газообразную смесь заряженного 50 и нейтрального 60 видов путем Джоулева нагрева. Применение высокочастотного (>100 кГц) переменного тока может быть преимущественным, поскольку постоянный ток и низкая частота может препятствовать электрофизиологическим процессам живых организмов. Таким образом, применение постоянного тока и переменного тока низкой частоты может быть опасным или даже фатальным для субъекта.

Трансформация составляющих ткани в соответствующие газообразные частицы ткани может быть осуществлена используемыми хирургическими инструментами, включая электрохирургию, лазерную хирургию, водоструйную хирургию или ультразвуковую хирургию.

В случае электрохирургии, например, плотность тока является достаточно высокой только вблизи острых электродов для дезинтеграции ткани; следовательно, ткань испаряется там, где острый электрод находится в физическом контакте с телом. Для того чтобы избавиться от дополнительных ожогов, или противоэлектрод с большой поверхностью используется (монополярная рассечка), или два острых электрода близко один к другому используется (биполярная рассечка). В этих случаях в одном аспекте изобретения хирургическое устройство может быть снабжено трубкой для транспортировки 80 и хирургическое устройство может быть превращено в бифункциональный хирургический инструмент по идентификации ткани.

В случае эндоскопии, стандартное электрохирургическое, лазерное хирургическое или ультразвуковое хирургическое оборудование может быть использовано. Рабочий канал эндоскопа может быть использован для эвакуации хирургического дыма, содержащего газообразные ионы, представляющего интерес. Одна точка может потребовать эвакуации около 1 мл газа, следовательно, применяемый вакуум не оказывает никаких вредных эффектов.

Трансферная или Транспортная трубка 80. Транспортная трубка 80 передает заряженные и/или нейтральные виды, полученные при аэрозолизации ткани к анализатору, такому как масс-спектрометр (MS). Поскольку важным применением настоящего изобретения является in situ, in vivo идентификация, локализация и/или анализ биологических тканей 20, 30 во время хирургической операции и масс-спектрометры являются слишком тяжелыми инструментами по сравнению с хирургическим оборудованием, важно передавать заряженные 50 и/или нейтральные виды 60, полученные при дезинтеграции ткани, на удаленный масс-спектрометр 130 вместо размещения пациента в непосредственной близости от MS инструмента. По существу в аспектах изобретения MS может быть размещен за пределами операционной комнаты. Поток газа, несущий газообразные частицы из ткани 50, 60 через транспортную трубу 80, может быть получен установлением разности давления (градиента давления) между двумя концами трубки 80. Поскольку давление на конце трубки 80 со стороны образца или ткани является атмосферным в большинстве предпочтительных применений (например, хирургическое применение), разность давлений может быть получена снижением давления на конце трубки 80, который ближе к MS 130 (MS сторона транспортной трубки 80). Давление снижается при применении отдельного жидкостного насоса 220 или при использовании вакуумной системы MS 130. Транспортная трубка 80 может быть выполнена из любого материала с достаточным механическим сопротивлением, химической стабильностью и достаточно высокой гибкостью. Например, трубка 80 может быть выполнена из различных полимеров (полиэтилен, политетрафторэтилен, полипропилен, поливинилхлорид), металлы (сталь, медь), стекло и кварцевое стекло. Важные признаки материала включают отсутствие пористости и инертности, то есть не допускается, чтобы стенка трубки задерживала заряженные 50 и нейтральные 60 газообразные частицы ткани и также взаимодействовала с этими видами 50, 60 или облегчала их химические реакции. Внутренний диаметр трубки 80 может быть где-то между 0,1 мм и приблизительно 20 мм, длина трубки может быть где-то между 0 и 5000 мм или достаточной длины для соединения с MS, толщина стенки трубки может быть между около 0,1 мм и 5 мм. Транспортная трубка 80 может быть использована при температуре окружающей среды или при повышенной температуре. Рабочая температура процесса может быть установлена между температурой окружающей среды и 400°С. Повышенная температура приводит к смещению адсорбционно-десорбционного равновесия, имеющего место на поверхностях стенки транспортной трубки 80 к десорбции, которая подавляет нежелательный эффект памяти. Повышенная температура может также сдвинуть ассоциативно-диссоциативное равновесие газовой фазы к диссоциации, что снижает рекомбинантную скорость ионных видов 50 с противоположными зарядами. Транспортная трубка 80 может содержать небольшое количество пористого или волокнистого материала (стекловата, волокно и так далее) для необратимого захвата больших частиц, не производящих индивидуальные газовые ионы. Важно отметить, что электрически не проводимый материал труб может только быть использован в таких случаях, когда группа ионов, содержащая как положительные, так и отрицательные ионы, переносится. Эффективность переноса ионов в этих случаях может быть улучшена удерживанием их на расстоянии от стенок, например, с помощью создания радиального псевдопотенциального поля, используя радиочастотные электрические поля.

Необходимо понимать, что транспортная трубка 80 может включать свободную часть, которая является достаточно гибкой для разрешения диапазона движения во время использования в связи с хирургией, и фиксированную часть, которая не движется во время хирургии для достижения удаленного анализатора. Транспортная трубка 80 может быть удержана рядом с участком, где ткань хирургически надсекается так, что газообразные виды 50, 60 могут быть приведены в транспортную трубку 80. Альтернативно хирургический инструмент служит в качестве дезинтегрирующего устройства, которое может быть коаксиально соединено (установлено) с транспортной трубкой 80.

Жидкостный насос 220

Первичной функцией жидкостного насоса 220 является получение разности давлений вдоль транспортной трубки 80 и ускорение потока газа через транспортную трубку 80. Поток газа несет заряженные 50 и нейтральные 60 виды от участка дезинтеграции ткани к масс-спектрометру 130. В жидкостных насосах различные механизмы могут быть использованы. Однако, поскольку заряженные 50 и нейтральные 60 виды могут быть химически агрессивными, и в случае хирургического применения жидкостный насос 220 должен быть дезинфицирован или заменен после каждого использования, применение газоструйных насосов Вентури может быть желательным в этих случаях. Насос Вентури включает сопло 110 и трубку Вентури 120. Насосы Вентури могут разбавлять исходный газовый поток и снижать концентрацию заряженных 50 и нейтральных видов 60 в газовом потоке, однако насосы Вентури могут также фокусировать заряженные 50 и нейтральные виды 60 и облегчать их электрораспылительную ионизацию или ионизацию коронным разрядом. Еще одним преимуществом насоса Вентури является отсутствие движущих частей, которые снижают шанс плохого функционирования.

Хотя жидкостный насос 220 может не быть установлен (как и показано на Фигуре 2), и вакуумная система масс-спектрометра может быть использована в качестве насосной установки, такое воплощение может не быть идеальным в случаях, когда большой поток массы и линейная скорость необходима в транспортной трубке 80. Также жидкостный насос 220 может стать существенным элементом системы, когда ионизация нейтральных видов 60 осуществляется при атмосферном давлении. Важно отметить, что ионизационные методы электрораспыления и коронного разряда могут только реализовываться при относительно высоком давлении (р>10 торр).

Постионизационное устройство 320.

Хотя термальный или механический способ дезинтеграции действительно дает заряженные частицы 50 при аэролизации тканей, большинство аэрозолированного материала остается нейтральным в газовой фазе. Более того, при быстрой термальной или механической аэролизации тканей только некоторые молекулы проходят ионизацию, молекулы принадлежат в основном к группе глицерофосфолипидов. Для того чтобы увеличить выход ионов и также увеличить диапазон молекул, доступных для масс-спектрометрического анализа, ионизация нейтральных видов 60 может быть желательна в некоторых случаях. Ионизация может быть осуществлена как при атмосферном давлении, так и в вакууме. Ионизация при атмосферном давлении является предпочтительной, поскольку источники ионов атмосферного давления обеспечивают более стабильные и полноценные инструментальные условия и включают меньше эффектов памяти.

Способы постионизации, которые могут быть использованы в системах и способах по настоящему изобретению, включают вторичную электрораспылительную ионизацию, изображенную на Фигуре 3. Вторичная электрораспылительная ионизация может быть введена с помощью размещения капилляра 180 через сопло 110 трубки Вентури 120, прокачивая электропроводящий растворитель 250 через капилляр 180 и применяя высокое напряжение (HV) к электропроводящему растворителю 250 с помощью источника тока с высоким напряжением 170. С помощью применения высокого напряжения, электропроводящий растворитель 250 распыляется 260 из конца капилляра 180 рядом с масс-спектрометром 130, с получением заряженных капель 270 электропроводящего растворителя 250. Заряженные капли 270 растворяют нейтральные частицы 60 и эти заряженные частицы 50, которые несут противоположный заряд, дают заряженные капли 280, содержащие электропроводящий растворитель 250 и молекулы из образца ткани 20, 30. При испарении электропроводящего растворителя 250 из заряженных капель 280, получают ионы газовой фазы, которые подвергают анализу на масс-спектрометре. Преимущества вторичной электрораспылительной ионизации включают: с помощью этого метода ионизируют как летучие, так и нелетучие молекулы. Поскольку самые серьезные эффекты памяти вызываются осаждением летучих и полулетучих молекул, где осаждение сохраняет низкое, но постоянное давление пара для этих молекул в системе, анализ нелетучих компонентов является очень важным с точки зрения анализа в режиме реального времени.

Другой постионизационный способ, который может быть использован в системе и способ по настоящему изобретению представляют ионизацию с помощью коронного разряда, способ представлен на Фигуре 4. Коронный разряд осуществляют установкой иглы 200 в трубу Вентури 120 и применением высокого напряжения к игле 200, используя источник высокого напряжения 170. Для того чтобы достичь оптимального осуществления, труба Вентури 120 снабжается нагревательным элементом 190 и трубу нагревают до температур между температурой окружающей среды и 500°С. Хотя коронный разряд ионизирует преимущественно летучие и полулетучие молекулы, ионизация коронным разрядом может представлять собой более устойчивую форму ионизации, чем вторичная электрораспылительная ионизация, и не страдает от засорения и коэффициентов растворимости. Подобным образом ионизация коронным разрядом, фотоионизация при атмосферном давлении может быть также осуществлена.

Ионизация может также быть осуществлена в различных условиях вакуума. Эти способы включают ионизацию коронным разрядом, химическую ионизацию, ионизацию электронного разряда, ионизацию электронным ударом, фотоионизацию и любой способ ионизации, способный трансформировать молекулярные кластеры или молекулы индивидуального газа в соответствующие газообразные ионы.

Масс-спектрометр 130

Функцией масс-спектрометра 130 является отделить и обнаружить ионы, получаемые или напрямую при аэролизации ткани, или путем постионизации нейтральных частиц 60. Поскольку масс-спектрометр работает в условиях высокого вакуума, инструменты, способные испытывать атмосферный режим, могут являться предпочтительными для осуществления настоящего изобретения. Атмосферные интерфейсы в основном состоят из нагреваемого капилляра 140, который служит в качестве первичного предела проводимости, отделяющего атмосферный режим от предвакуумного режима (р~1 торр), и разделяющий электрод 160 вторичного предела проводимости, отделяющего предвакуумный режим от режима высокого вакуума (р<10^-4 торр). Атмосферный интерфейс, отображенный на Фигурах 1-3, состоит из нагреваемого капилляра 140, фокусирующей линзы 150 и отделяющего электрода 160. Установка атмосферного интерфейса, проиллюстрированная на Фигурах 1-3, является преимущественной, поскольку в этом случае центральные оси подогретого капилляра 140 и разделяющего электрода 160 являются в основном параллельными и не перекрываются. Этим способом ионы 50, покидающие нагреваемый капилляр 140, могут отклоняться к разделяющему электроду 160 с помощью применения потенциалов постоянного тока к фокусирующей линзе 150. Поскольку силы кулоновского взаимодействия не имеют эффекта на нейтральные частицы 60, заряженные частицы 50 являются эффективно отделенными от нейтральных частиц и нейтральные частицы 60 не переходят и не загрязняют режим высокого вакуума масс-спектрометра 130. Анализаторы массы любого типа могут быть применены для анализа масс газообразных ионов 50, однако так называемая ионная ловушка и времяпролетные инструменты могут быть предпочтительными. Эти масс-анализаторы собирают ионы для некоторых периодов времени, затем анализируют собранную популяцию ионов, которая приводит к более низкой чувствительности соотношений интенсивности ионов к мимолетности сигнала.

Любой подходящий анализатор, способный обнаруживать газообразные частицы из ткани 50, 60, перемещаемые по транспортной трубке 80, и получаемые данные из тканей, включая масс-спектрометр или ион-мобильный спектрометр, может быть использован в способах, системах и устройствах по настоящему изобретению.

Пучок электромагнитного излучения 330

В качестве альтернативы дезинтеграции тканей путем Джоулева нагревания или путем ультразвука дезинтеграция тканей электромагнитным излучением (изменяющимся от микроволн до ближних УФ волн) также может быть использована для получения газообразных частиц из тканей, включая газообразные ионы из тканей. Пучок электромагнитного излучения 330, создаваемый устройством 340, поглощается тканью 20, 30 и энергия пучка электромагнитного излучения 330 рассеивается в тепловую энергию, которая превращает составляющие ткани 20, 30 в ионные и нейтральные газообразные виды 50, 60. Применение лазеров с длиной волны в инфракрасном диапазоне может являться предпочтительным, поскольку в этих случаях только вибрационный и вращательный режимы молекул возбуждаются, таким образом, дополнительных фотохимических реакций можно избежать. Еще одним преимуществом инфракрасных лазеров является лучшая абсорбция пучка инфракрасного лазера тканями в сравнении с видимым и ультрафиолетовым лазером. Хирургические лазерные устройства работают исключительно в инфракрасном режиме, таким образом, коммерчески доступное хирургическое лазерное оборудование может быть использовано в системах и способах по изобретению.

Хирургический инфракрасный лазер может быть снабжен транспортной трубкой 80, превращая, таким образом, хирургическое устройство в бифункциональный хирургический инструмент и инструмент для идентификации тканей. Дезинтеграция ткани происходит путем быстрого кипения воды, содержащейся в тканях, которая разрушает структуру ткани. Дезинтеграция приводит к образованию аэрозоля или газообразных частиц, покрываемых поверхностно-активными молекулами, то есть мембранными липидами первоначальной структуры, и содержит целые и термально разрушенные биомолекулы. Эти аэрозоли или газообразные частицы могут нести чистый электрический заряд из-за неравномерного распределения анионных и катионных видов, и эти капли могут диссоциировать с получением индивидуальных молекулярных ионов мембранных липидов, подобно электрохирургии. Образец спектра, получаемый с помощью электрохирургии и лазерной хирургии, показан на Фигуре 11.

Настоящее изобретение также обеспечивает способы, усовершенствованные для масс-спектрометрического анализа и идентификации биологических тканей. Общая схема изобретения изображена на Фигурах 1-3. Так в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ анализа, локализации и/или идентификации одного или более образцов тканей, отличающихся тем, что способ включает: (а) получение газообразных частиц тканей на одном или более образцах ткани, (b) транспорт газообразных частиц тканей от участка к анализатору, (с) применение анализатора для получения данных, относящихся к ткани на основании газообразных частиц ткани, и (d) анализ, локализацию и/или идентификацию одного или более образцов ткани на основании данных, относящихся к ткани.

Система, изображенная на Фигуре 1, может быть приведена в состояние готовности включением масс-спектрометра 130, регулятора устройства аэролизации ткани 70 и подачей потока инертного газа 100 к жидкостному насосу 220.

Используя электроды в качестве примера дезинтегрирующего устройства 10, анализ ткани может быть осуществлен приведением электродов 10 (которые могут быть введены в хирургическое устройство) в близкий контакт с интересующей тканью и применением разности потенциалов между электродами, используя источник электрического тока 70.

При контакте ткани 20, 30 с электродами 10, ткань термально дезинтегрируется в результате теплового рассеивания электрической энергии (Джоулева тепла), и или вся дезинтегрированная ткань или ее часть превращается в пар 50, 60 (индивидуальные молекулы в газовой фазе) и аэрозоль 50, 60 (кластеры молекул в газовой фазе).

Альтернативно электрохирургической аэролизации тканей, аэролизация частей ткани 20, 30 направлением ультразвука, водяной струи или лазерного пучка 330 на них, может также быть использовано для получения заряженных 50 и нейтральных газообразных частиц 60.

Химическая композиция и электрический заряд этих заряженных 50 и нейтральных газообразных частиц 60 зависит от факторов, включающих тип исходной ткани и способ, используемый для аэролизации ткани среди ряда прочих факторов. Заряженные 50 и нейтральные газообразные частицы 60 поступают в транспортную трубку 80 и движутся или к жидкостному насосу 220 (если насос используется), или напрямую к масс-спектрометру 130.

Аэролизация, вызываемая нагреванием, может производить значительное количество заряженных частиц 50, что позволяет осуществить анализ ткани без постразделяющей ионизации (постионизации) нейтральных частиц 60. В этих случаях трубка 80 может быть напрямую соединена с масс-спектрометром 130 или жидкостный насос 220 может напрямую перемещать (без постионизации) заряженные частицы 50 к масс-спектрометру 130. Когда информация, получаемая от масс-спектрометрического анализа заряженных частиц 50 (полученных при дезинтеграции ткани), не является достаточной для соответствующей идентификации или обнаружения тканей, из-за сигнала низкой интенсивности или отсутствия информации, постионизация нейтральных частиц может быть использована для улучшения аналитической информации.

Жидкостный насос 220 передает нейтральные частицы 60 к постионизационному устройству, где фракция молекул нейтральных частиц 60 превращается в газообразные ионы и идентифицируется масс-спектрометром вместе с газообразными ионами 50, получаемыми из ткани. Масс-спектрометр 130 может быть использован для разделения всех газообразных ионов по их отношению масс к заряду и отдельно обнаруживаемыми. Результатом масс-спектрометрического анализа является масс-спектр (представлен на Фигурах 6-9). Поскольку нейтральные частицы 60 не могут быть полностью отделены от заряженных частиц 50 в атмосферном интерфейсе масс-спектрометра, заряженные и нейтральные частицы 50,60 стремятся образовывать аддукты (продукты присоединения) в ионной оптике или в режиме анализатора масс-спектрометра. Этот феномен является нежелательным, поскольку он приводит к плохо разрешенному масс-спектру (Фигура 6). Активация ионов средствами столкновения с молекулами инертных газов или инертными поверхностями или абсорбцией фотонов может быть преимущественно использована для удаления ион-молекулярных комплексов и получения масс-спектра с соответствующим разрешением, как показано на Фигуре 7. Поскольку масс-спектр сам по себе не может быть напрямую использован для идентификации тканей или обнаружения следов некоторых количеств тканей в различной тканевой матрице, масс-спектральные данные, относящиеся к ткани, могут быть обработаны аналитической системой данных 230. Масс-спектр может быть превращен в векторный формат и идентифицирован на основании сравнения базы данных или библиотеки записей масс-спектров, соответствующих множеству типов тканей. Анализ направлен на или идентификацию спектра, полученного от чистых тканей, или обнаружения некоторых типов тканей в матрице других тканей. Альтернативно, относительная концентрация хорошо определенных компонентов может быть также рассчитана из спектра.

Поскольку масс-спектрометрический анализ ионов занимает меньше приблизительно 200 мс и анализ данных может занять приблизительно от 100 до 150 миллисекунд, ответная информация в соответствии с аспектами по настоящему изобретению может занять меньше 1 секунды, таким образом, обеспечивая идентификацию ткани в режиме реального времени.

Масс-спектр тканей несет информацию в основном о составляющих мембранных липидов, которые дают тканеспецифичный узор. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения полная спектральная информация может быть использована для безошибочной идентификации тканей. Анализ данных может быть основан на анализе основных компонентов (РСА), где во время хирургической операции заранее определенное аналитическое пространство основных компонентов можно использовать для сокращения времени анализа. Пространство РСА может быть рассчитано, используя базу данных спектров, содержащую око 10 000 (десяти тысяч) спектров в настоящее время.

Идентификация ткани в режиме реального времени может быть получена сравнением масс-спектров анализируемых тканей с масс-спектрами тканей известного типа. Масс-спектр анализируемой ткани может быть сравнен с библиотекой записей масс-спектров, соответствующих множеству известных типов тканей. Библиотека записей должна включать спектр всех типов тканей, которые могут теоретически быть идентифицированы во время хирургического вмешательства. В одном аспекте настоящего изобретения, библиотека записей может включать спектр, превращаемый в векторы, которые являются отфильтрованными от шума (помех), уменьшенными по величине (например, от данных 300 величины до данных 60 величины) путем, например, РСА. Дифференциация тканей/органов в библиотеке записей может быть осуществлена с 60 по величине линейным дискриминатным (отличительным) анализом (LDA) для количественной квалификации данных. Классификация спектра в режиме реального времени может быть осуществлена, используя библиотеку и классификацию спектра в режиме реального времени. Классификация может быть осуществлена, используя, например, расстояния Махаланобиса (обобщенное расстояние).

Анализ/локализация/идентификация тканей, используя устройства, системы и способы по настоящему изобретению, может быть выполнена, по меньшей мере, двумя различными способами. В так называемом предупреждающем режиме ионные виды в аэрозоле могут быть непрерывно анализированы и масс-спектрометрическая система может давать непрерывную обратную реакцию о природе рассекаемой во время операции ткани. Изображение с экрана графического интерфейса пользователя нашего программного обеспечения, снятого во время хирургической операции, представлено на Фигуре 13 с. Всякий раз, когда результат спектральной идентификации в режиме реального времени относится к присутствию злокачественного новообразования, или всякий раз, когда идентификация ткани не была осуществлена, система может выдать аудиовизуальный сигнал тревоги пользователю системы (например, хирургу). Альтернативным способом использования систем и способов по настоящему изобретению может являться режим микрозонда, когда признаки ткани, представляющей интерес, активно исследуются в целях идентификации. С точки зрения масс-спектрометрической идентификации тканей, основным отличием между двумя режимами является время накопления данных для индивидуального спектра. В то время как данные в предупреждающем режиме накапливаются около 0,5-1 секунды, в микрозондовом режиме данные для одного спектра накапливаются так долго, пока дезинтегрирующее устройство не получит газообразные частицы из ткани и не соберет газообразные частицы ткани. Для того чтобы продемонстрировать точность интраоперационной идентификации ткани, результаты, полученные от индивидуально взятых точек (Фигура 13а), показаны на двумерном РСА графике (Фигура 13b).

Исходящая информация системы данных может непрерывно регистрироваться и представляться на устройство обратной связи 240, которое может обеспечивать аудио, визуальную или аудиовизуальную информацию, если режим реального времени необходим. В результате, части ткани в дезинтеграционном объеме 40 проанализированы и идентифицированы инвазивным способом, с получением точки разрыва 90 в ткани 20, 30. Когда точка разрыва определяется как хирургический надрез, то чистый анализ не охватывает также инвазивность по сравнению с хирургическим рассечением.

Настоящее изобретение обеспечивает в другом аспекте способ получения масс-спектрометрических данных, отличающийся тем, что указанный способ включает: (а) получение газообразных заряженных частиц от области, представляющей интерес, в образце, (b) транспорт газообразных частиц от области, представляющей интерес к масс-спектрометру, и (с) применение масс-спектрометра для получения данных, относящихся к образцу, на основании полученных газообразных ионов от области, представляющей интерес. В одном аспекте настоящего изобретения, данные, относящиеся к образцу, могут быть доступными по базе данных, включая библиотеку записей масс-спектральных данных, для анализа или идентификации биологической ткани, в частности для медицинского персонала госпиталя или клиники.

ПРИМЕРЫ

Примеры представлены здесь для иллюстрационных целей, и не предназначены для ограничения объема притязаний.

Пример 1: Анализ и идентификация ткани во время хирургической операции

На фигуре 1, электрохирургическая система (ICC 350, Erbe Elektromedizin GmbH) была использована в комбинации с масс-спектрометром с квадрупольной ионной ловушкой (LCQ Duo, ThermoFinnigan). Электрохирургический рассекающий электрод 10 был снабжен коммерчески доступной системой дымоудаления 80 (Erbe), которая была подсоединена к жидкостному насосу 220 (VAC 100, Veriflo) через 8 1/8” OD 2 мм ID политетрафторэтиленовую трубку. Жидкостный насос 220 был установлен на LCQ инструменте, используя сильно модифицированный DESI ионный источник (OmniSpray, Prosolia). Масс-спектрометр 130 использовался в режиме отрицательных ионов. Ионы в диапазоне от 700-800 были изолированы в ионной ловушке, и были активированы, используя активацию при столкновении с нейтральными атомами гелия. Спектр был получен в диапазоне соотношения m/z 700 - 800.

Данные in vivo и ex vivo от собак со спонтанной опухолью были получены от ветеринарной онкологической службы.

Электрохирургический электрод 10 был использован для удаления злокачественной меланомы 30 со здоровой эпителиальной ткани 20 на экспериментальной модели на собаках. Опухоль 30 была вырезана вместе с частью здоровой кожи 20 и окружающих лимфоузлов, несущих метастазы, для того чтобы минимизировать шанс на восстановление опухоли. Граница новообразования была определена на основании масс-спектрометрической идентификации рассекаемой ткани. Масс-спектр всего ионного потока, полученный во время хирургического вмешательства, представлен на Фигуре 5. Периоды рассечения во время хирургического вмешательства отмечены как 300 и периоды промывания как 310. Важно отметить, что масс-спектрометрические сигналы обнаруживаются только, когда хирургическое рассечение осуществляется 300 и во время периодов промывания 310, когда инструмент является чистым. Поскольку время возникновения и исчезновения обоих сигналов является очень коротким по сравнению со временем электрохирургического рассечения, экспериментальная установка позволяет осуществлять анализ в режиме реального времени разрезаемой ткани с минимизацией эффектов памяти. Масс-спектр, взятый от здоровой эпителиальной ткани, меланома и метастазы представлены на Фигуре 9. Ионное соотношение при m/z 746 и m/z 723 было использовано в качестве ракового маркера и это количество было отображено на устройстве обратной связи 240, используя окраску сине-красного градиента. Аудио сигнал был также использован в качестве обратной связи, когда частота звукового сигнала менялась, как только ионное отношение менялось в масс-спектре.

Опухоль 20 была успешно удалена хирургически, и пост-хирургическое гистологическое исследование удаленного материала подтвердило, что хирургическая операция прошла успешно, и удаленный лимфоузел содержал раковые клетки.

Пример 2: Определение лекарственных средств в тканях для локализации раковых клеток

Электрохирургическая система (ICC 350, Erbe Elektromedizin GmbH) была использована в комбинации с масс-спектрометром с квадрупольной ионной ловушкой (LCQ Duo, ThermoFinnigan). Электрохирургический рассекающий электрод 10 был снабжен коммерчески доступной системой дымоудаления 80 (Erbe), которая была подсоединена к жидкостному насосу 220 (VAC 100, Veriflo) через 8 1/8” OD 2 мм ID политетрафторэтиленовую трубку. Жидкостный насос 220 был установлен на LCQ инструменте, используя сильно модифицированный DESI ионный источник (OmniSpray, Prosolia). Жидкостный наос 220 был снабжен системой вторичной электрораспылительной постионизации, содержащей капилляр 180 и источник высокого напряжения 170. Электрораспылитель 260 и масс-спектрометр 130 функционировали в режиме положительных ионов. Ионы при m/z 447 и 449 были отслежены с m/z 446 в качестве основного сигнала.

Безтимусные мыши, несущие NCI-H460 ксенотрансплантат человеческого немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), были размещены в комнате с контролируемой температурой и подачей света, пища и вода подавались по желанию. В возрасте 8 недель, мышам было введено 2×20 мг/на кг гефинитиба. В следующие 3 дня лечения, ксенотрансплантаты были исследованы in vivo, в условиях анестезии фенобарбиталом.

Электрохирургический электрод 10 был использован для удаления 30 немелкоклеточного рака легкого от 20 здоровой ткани легкого на экспериментальной модели на мышах. Животные были подвержены предоперационной химиотерапии, используя Гефинитиб. Гефинитиб (молекулярный вес составляет 446) селективно связывается с рецептором фактора роста эпителиальной ткани (EGFR), которая является сверхэкспрессируемой NSCLC раковыми клетками. Таким образом Гефинитиб может быть использован для химической маркировки этих опухолей. Молекулярные ионы гефинитиба были отслежены для локализации инфильтрирующих опухолей.

Опухоль 20 была удалена вместе с частями 20 здоровой ткани легкого. Граница опухоли была определена на основании масс-спектрометрической идентификации разрезаемых тканей. Ионное соотношение при m/z 447 и m/z 446 было использовано в качестве ракового маркера и это количество было отображено на устройстве обратной связи 240, используя окраску сине-красного градиента. Аудиосигнал был также использован в качестве обратной связи, когда частота звукового сигнала менялась, как только ионное отношение менялось в масс-спектре.

Опухоль 20 была успешно удалена хирургически, и постхирургическое гистологическое исследование удаленного материала подтвердило, что операция была успешной.

Пример 3: Локализация и идентификация бактериальных инфекций на слизистой оболочке

Самостоятельно собранное термальное устройство дезинтеграции тканей, содержащее источник постоянного тока 70 и металлические электроды 10, было использовано в комбинации с масс-спектрометром с квадрупольной ионной ловушкой (LCQ Duo, ThermoFinnigan). Металлические электроды 10 были подсоединены к жидкостному насосу 220 (VAC 100, Veriflo) через 8 1/8” OD 2 мм ID политетрафторэтиленовую трубку. Жидкостный насос 220 был установлен на LCQ инструменте, используя сильно модифицированный DESI ионный источник (Omni Spray, Prosolia). Масс-спектрометр 130 использовался в режиме отрицательных ионов. Ионы в диапазоне от 640-840 были изолированы в ионной ловушке, и были активированы, используя активацию при столкновении с нейтральными атомами гелия. Спектр был получен в диапазоне соотношения m/z 640-840.

Электроды 10 были использованы для идентификации верхнего эпителиального слоя слизистой оболочки, зараженной различными бактериями. Поскольку применение способа и устройства по изобретению направлено на минимально инвазивный анализ слизистой оболочки, около 0,1-0,4 мг всего материала, содержащего эпителиальные клетки, бактерии и слизь, была дезинтегрирована для регистрации одного полностью интерпретируемого масс-спектра. Часть ткани 20 (ларингальная слизистая оболочка) в контакте с электродами 10 была нагрета до 850°С. Полный масс-спектр был сравнен с базой данных, содержащей масс-спектр 122 бактериальный штаммов. Спектральная похожесть была определена как косинус 200 величин масс-спектральных векторов. Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), Klebsiella pneumoniae (палочка Фридлендера), Staphilococcus aureus (стафилококк золотистый) и Streptococcus pneumoniae (пневмококк) были успешно идентифицированы, с соответствующим вводом данных на первую позицию в списке совпадений в базе данных. В большинстве случаев первые три позиции также принадлежали тому же самому виду.

Пример 4 Бизнес-модель

Настоящее изобретение включает четыре основных обозначенных области применения: автоматизированная хирургия, общая онкохирургия, диагностика патологий и микробная диагностика. Поскольку диапазон цен инструментов, используемых в ежедневной практике, значительно ниже рыночных цен на масс-спектрометрические системы, масс-спектрометрическая часть по настоящему изобретению может быть также продана клиникам, патологическим лабораториям, амбулаториям и так далее по себестоимости. Фактическая прибыль может быть реализована изготовлением частей 10, 80, 220 и постионизационных устройств в качестве одноразовых расходных частей системы по изобретению. Это может быть желательным признаком, потому что в противном случае эти части 10, 80, 220 необходимо тщательно очищать и дезинфицировать после каждого хирургического или диагностического вмешательства. Еще одним возможным источником прибыли может быть программное обеспечение, используемое для интерпретации данных и идентификации индивидуального масс-спектра. Как поисковый инструмент, так и база данных могут непрерывно совершенствоваться и продаваться пользователям за низкую, но периодическую плату. Все проданные системы могут быть связаны с интернет-сетью, что непрерывно предоставляет команде разработчиков 380 исходные данные 390 и облегчает усовершенствование центральной базы данных тканей 370, как изображено на Фигуре 12. Госпитали 360 могут принимать полностью униформизированные и достоверные данные 400 через интернет.

Представленная информация описывает настоящее изобретение в общих чертах. Изменения по форме и замена эквивалентов рассматривается, как возможно предлагают обстоятельства или средства для достижения цели. Хотя специфичные термины могут использоваться здесь, такие термины предназначены лишь для описания, а не для целей ограничения объема притязаний. Другие вариации и модификации изобретения являются возможными. Полагают, что такие модификации или вариации входят в сферу и объем притязаний по изобретению, как определено приложенной формулой изобретения.

Реферат

Группа изобретений относится к способу, вариантам системы и устройству для анализа, локализации и/или идентификации видов тканей и может быть использована в операционной, преимущественно как интегрированная часть одного или более хирургических инструментов или рассекающих инструментов. Способ анализа, локализации и/или идентификации одного или нескольких образцов ткани включает образец, применение дезинтегрирующего устройства для получения газообразных частиц образца с участка без подготовки образца, транспорт газообразных частиц ткани с участка, ионизацию как минимум части газообразных частиц образца вне участка для получения газообразных ионов образца, и применение анализатора для получения данных, относящихся к образцу, на основании, по крайней мере, газообразных ионов образца. При этом дезинтегрирующее устройство осуществляет по меньшей мере одно из перечисленного: Джоулев нагрев, контактный нагрев и ультразвуковую обработку. Система анализа, локализации и/или идентификации одного или более образцов тканей включает биологический образец, дезинтегрирующее устройство для получения газообразных частиц образца с участка образца без подготовки образца, средство транспортировки газообразных частиц образца с участка, устройство ионизации для ионизации как минимум части газообразных частиц образца вне участка для получения газообразных ионов образца и анализатор, подсоединяемый в рабочих условиях к средству транспортировки. Система для идентификации одного или нескольких образцов ткани in situ во время хирургической процедуры включает: (a) хирургическое устройство, имеющее дезинтегрирующее ус

Формула