Способ непрерывного измерения концентрации субстрата - RU2489089C2

Чертежи

Показать все 21 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу непрерывного измерения концентрации субстрата, такого как глюкоза. В частности, настоящее изобретение относится к способу непрерывного измерения уровня сахара в крови с помощью глюкозного сенсора, вживленного в тело.

Предшествующий уровень техники

В качестве способа измерения уровня сахара в крови существует способ непрерывного измерения концентрации глюкозы в интерстициальной жидкости с применением глюкозного сенсора, например вживленного в брюшную полость или руку человека. В качестве принципа измерения в основном применяется электрохимический метод. Глюкозный сенсор в данном случае имеет, по меньшей мере, рабочий электрод и противоэлектрод. На рабочем электроде, например, иммобилизована глюкозооксидаза (ГО). Концентрация глюкозы непрерывно измеряется на основе выходного тока (см. фиг.12(b)), получаемого, когда постоянное напряжение величиной приблизительно 0,3-0,6 В непрерывно приложено между рабочим электродом и противоэлектродом (см. фиг.12(a)).

Значение выходного тока может быть получено, например, посредством электрохимического окисления пероксида водорода, образующегося в каталитической реакции при участии ГО (например, патентные документы 1 и 2: JP 2007-516814 A и JP 2007-535991 A), или при использовании электронов, извлекаемых из глюкозы с помощью ГО при участии Os полимера, являющегося посредником (см., например, патентный документ 3 JP 1998-505421 A).

В то же время, концентрацию глюкозы вычисляют на основе выборочных значений тока, получаемых посредством периодического измерения непрерывно получаемых значений выходного тока.

Впрочем, выходной ток содержит фоновые составляющие, соответствующие сопутствующим веществам, таким как аскорбиновая кислота, которые присутствуют в интерстициальной жидкости, или обусловленные внешними условиями, например электромагнитным шумом. Поэтому, например, даже если данные измерения имеют тенденцию к увеличению (или уменьшению), по выходному току сложно точно установить, вызвано ли указанное увеличение (или уменьшение) данных измерения увеличением (или уменьшением) концентрации глюкозы, или увеличение (или уменьшение) данных измерения вызвано увеличением (или уменьшением) фоновых составляющих. Таким образом, в силу внешней среды, которая может находиться под воздействием фоновых составляющих, точность сигнала выходного тока, получаемого от глюкозного сенсора, может быть понижена.

Кроме того, следует понимать, что глюкоза-оксидоредуктаза, закрепленная на рабочем электроде, вызывает денатурацию белка под воздействием приложенного напряжения, что снижает стабильность сенсора. При этом такое снижение стабильности зависит от величины напряжения и продолжительности воздействия напряжения, как показано на фиг.13, иллюстрирующей остаточную активность в случае применения глюкозодегидрогеназы (GDH) в качестве глюкоза-оксидоредуктазы. Более конкретно, стабильность глюкоза-оксидоредуктазы, такой как GDH, стремится к снижению по мере возрастания величины прилагаемого напряжения или увеличения продолжительности приложения напряжения.

Сущность изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в повышении точности измерения и стабильности сенсора, применяемого для измерения при непрерывном измерении субстрата, такого как глюкоза.

В настоящем изобретении предложен способ непрерывного измерения концентрации субстрата, основанный на получении выходного сигнала при приложении к субстрату напряжения, включающий в себя: этап приложения напряжения выходного сигнала, в котором получают выходной сигнал, соответствующий субстрату; и этап приложения напряжения отсутствия выходного сигнала, в котором не получают или практически не получают выходной сигнал, соответствующий субстрату.

Предпочтительно, чтобы этап приложения напряжения выходного сигнала и этап приложения напряжения отсутствия выходного сигнала повторялись поочередно. Каждый из этапа приложения напряжения выходного сигнала и этапа приложения напряжения отсутствия выходного сигнала необязательно должен быть проведен посредством приложения одиночного импульса при постоянном напряжении и может быть проведен, например, посредством приложения ступенчатого импульса, состоящего из комбинации множества импульсов постоянного напряжения с различными потенциалами.

В настоящем изобретении, например, субстрат вычисляют на основании разности между выходным сигналом, полученным в этапе приложения напряжения выходного сигнала, и выходным сигналом, полученным в этапе приложения напряжения отсутствия выходного сигнала. В данном случае, когда напряжение, приложенное к сенсору, увеличивается, напряжение, приложенное в этапе приложения напряжения отсутствия выходного сигнала устанавливают в диапазоне от -0,5 до +0,5 В, предпочтительно в диапазоне от -25 до +25 мВ относительно приложенного напряжения (потенциала реакции), при котором начинается получение выходного сигнала, соответствующего субстрату.

Настоящее изобретение дополнительно может включать в себя вспомогательный этап приложения напряжения, меньшего по абсолютному значению, чем напряжение отсутствия выходного сигнала, после поочередного выполнения этапа приложения напряжения выходного сигнала и этапа приложения напряжения отсутствия выходного сигнала заданное количество раз. Вспомогательный этап может быть выполнен посредством размыкания контура, включающего в себя сенсор.

Для использования сенсор вживляют, например, в тело. Сенсор может включать в себя электрод с иммобилизованным ферментом. Разумеется, настоящее изобретение может быть применено к случаю измерения концентрации субстрата, такого как глюкоза, в крови или интерстициальной жидкости, извлеченной из тела, или к случаю измерения субстрата в иной субстратсодержащей жидкости, нежели кровь и интерстициальная жидкость, или жидкости вне человеческого тела.

Субстратом является, например, глюкоза, а сенсором является, например, глюкозный сенсор. Глюкозный сенсор может включать в себя электрод с иммобилизованной на нем глюкоза-оксидоредуктазой.

Краткое описание чертежей

На чертежах:

фиг.1 изображает вид в разрезе, на котором показан пример устройства для непрерывного измерения глюкозы, предназначенного для осуществления способа непрерывного измерения глюкозы;

фиг.2 изображает общий вид, на котором показан глюкозный сенсор в устройстве для непрерывного измерения глюкозы, показанном на фиг.1, с увеличенным изображением главной части;

фиг.3 изображает блок-схему, на которой показана схематическая конфигурация устройства для непрерывного измерения глюкозы, показанного на фиг.1;

фиг.4 изображает диаграмму, на которой показана схема приложения напряжения по отношению к глюкозному сенсору, показанному на фиг.2;

фиг.5 изображает диаграмму, на которой показана схема выходного тока, когда напряжение приложено в схеме, показанной на фиг.4;

фиг.6 изображает диаграмму, на которой показаны результаты измерения вольтамперометрии в отношении множества концентраций глюкозы;

фиг.7 изображает диаграммы, каждая из которых иллюстрирует другой пример прикладного импульса напряжения реакции и напряжения отсутствия реакции на одном этапе;

фиг.8 изображает диаграмму, на которой показаны результаты измерения вольтамперометрии в примере 1;

фиг.9(a) и 9(b) изображают диаграммы, на которых показаны результаты измерения изменения во времени выходного тока в примере 1;

фиг.10 изображает диаграмму, на которой показаны результаты измерения выходных характеристик в примере 1;

фиг.11 изображает диаграмму, на которой показаны результаты оценки стабильности в примере 2;

фиг.12(a) изображает диаграмму, на которой показана схема приложения напряжения в отношении глюкозного сенсора в обычном примере, а фиг.12(b) изображает диаграмму, на котором показана схема выходного тока в отношении приложения напряжения, показанного на фиг.12(a);

фиг.13 изображает диаграмму, на которой показано изменение во времени остаточной активности фермента в обычном примере;

фиг.14 изображает диаграмму, на которой показано изменение плотности тока в случае многократного приложения ступенчатого импульсного напряжения, как показано на фиг.7(a), к электроду с иммобилизованным ферментом;

фиг.15 изображает диаграмму, на которой показана зависимость между плотностью тока и концентрацией глюкозы;

фиг.16 изображает диаграмму, на которой показаны результаты измерения выходного тока в случае многократного приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом;

фиг.17 изображает диаграмму, на которой показаны результаты измерения выходного тока в случае непрерывного приложения постоянного напряжения 600 мВ к электроду с иммобилизованным ферментом;

фиг.18 изображает диаграмму, на которой показаны результаты оценки стабильности в примере 4;

фиг.19 изображает диаграмму, на которой показано изменение выходного тока вследствие повышения концентрации глюкозы в случае непрерывного приложения постоянного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом;

фиг.20 изображает диаграмму, на которой показано изменение выходного тока вследствие повышения концентрации глюкозы в случае многократного приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом;

фиг.21 изображает диаграмму, на которой показан выходной ток I3 в случае непрерывного приложения постоянного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом и выходной ток I4 в случае многократного приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом.

Описание вариантов осуществления изобретения

В дальнейшем со ссылкой на чертежи описывается способ непрерывного измерения субстрата согласно настоящему изобретению, иллюстрирующий случай измерения концентрации глюкозы в биологической жидкости.

Устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы, показанное на фиг.1, способно непрерывно измерять концентрацию глюкозы в крови или интерстициальной жидкости и для применения прикрепляется к коже на животе или плече человека. Устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы включает в себя корпус 2, монтажную плату 3 и глюкозный сенсор 4.

Корпус 2 образует внешнюю форму устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы и включает в себя крышку 20 и основу 21. Крышка 20 и основа 21 содержат монтажную плату 3 в промежутке, определенном крышкой 20 и основой 21, и соединяются друг с другом. Корпус 2 предпочтительно обладает водонепроницаемыми свойствами или водостойкостью. В корпусе 2, например, по меньшей мере, крышка 20 (при необходимости основа 21) сформирована из материала с очень низкой водопроницаемостью, такого как металл или полипропиленовая смола.

Основа 21 является частью, через которую вставляется глюкозный сенсор 4, причем конец 40 глюкозного сенсора 4 фиксируется на основе 21. На основу 21 прикреплена клейкая пленка 5. Клейкая пленка 5 используется, когда устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы фиксируется на коже. В качестве клейкой пленки 5 применяется лента, имеющая клеевое покрытие на обеих поверхностях.

Монтажная плата 3 оборудована электронными компонентами, требуемыми для заданных операций (например, приложение напряжения, вычисление концентрации глюкозы или связь с внешним окружением), выполняемых устройством 1 для непрерывного измерения глюкозы. Монтажная плата 3 дополнительно включает в себя контактный разъем 30, контактирующий с электродом 42 глюкозного сенсора 4 (см. фиг.2), описанный ниже. Контактный разъем 30 применяется для приложения напряжения к глюкозному сенсору 4 и получения значения выходного тока от глюкозного сенсора 4.

Глюкозный сенсор 4 применяется для приема выходного сигнала в соответствии с концентрацией глюкозы в крови или интерстициальной жидкости. В глюкозном сенсоре 4 конец 40 выступает из кожи 6 и контактирует с контактным разъемом 30 монтажной платы 3, при этом его большая остальная часть введена под кожу 6.

Как показано на фиг.2, глюкозный сенсор 4 включает основу 41, электрод 42 и часть 43 с иммобилизованным ферментом.

На основе 41, которая сформирована в форме листа, имеет изоляцию и обладает гибкостью, закреплен электрод 42. В основе 41 конец 41A присутствует в корпусе 2, тогда как конец 41B сконфигурирован так, что он является острым. Если конец 10B сконфигурирован так, что он является острым, глюкозный сенсор 4 может быть легко введен под кожу 6, что может уменьшить боль, причиняемую пользователю.

В качестве материала основы 40 может применяться любой материал, который обладает достаточной изоляцией и не вызывает повреждение тела человека, и, например, может применяться термопластическая смола, такая как ПЭТ (полиэтилентерефталат), ПП (полипропилен) или ПЭ (полиэтилен), или термореактивная смола, такая как полиимидная смола или эпоксидная смола.

Электрод 42 применяется для приложения напряжения к части 43 с иммобилизованным ферментом и вывода электронов из части 43 с иммобилизованным ферментом. Электрод 42 включает в себя рабочий электрод 42A и противоэлектрод 42B. Рабочий электрод 42A передает электроны в соответствии с уровнем глюкозы. Противоэлектрод 42B используется для приложения напряжения вместе с рабочим электродом 42A. Электрод 42 может быть сформирован с помощью трафаретной печати с использованием углеродных паст.

Часть 43 с иммобилизованным ферментом является посредником при переносе электронов между глюкозой и рабочим электродом 42A. Часть 43 с иммобилизованным ферментом сформирована путем иммобилизации глюкоза-оксидоредуктазы на конце 42Aa рабочего электрода 42A.

В качестве глюкоза-оксидоредуктазы может применяться глюкозооксидаза (ГО) и глюкозодегидрогеназа (GDH). В качестве способа иммобилизации глюкоза-оксидоредуктазы могут быть выбраны различные известные способы, например, способы с применением полимера, такого как полимеризуемый гель, полиакриламид или фосфор, MPC полимер, в котором силановый связующий агент введен в фосфолипидный полимер или белковую мембрану.

Как показано на фиг.3, устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы дополнительно включает в себя блок 10 связи, источник 11 питания, блок 12 управления, вычислительный блок 13 и блок 14 памяти, в дополнение к монтажной плате 3 и глюкозному сенсору 4.

Блок 10 связи применяется для передачи данных между устройством 1 для непрерывного измерения глюкозы и внешним терминалом обработки информации. Блок 10 связи включает в себя, по меньшей мере, передающий блок, а также, при необходимости, включает в себя приемный блок.

Для передачи данных, например, могут использоваться средства беспроводной связи (стандарт IrDA, в котором используется инфракрасное излучение, или стандарт Bluetooth, в котором используется частотная полоса 2,4 ГГц). Разумеется, может быть выполнена проводная передача данных посредством соединения блока 10 связи устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы с блоком связи внешнего терминала обработки информации при помощи кабеля или тому подобного.

Пример внешнего терминала обработки информации включает в себя устройство доставки инсулина, которое предназначено для введения инсулина в тело человека, простое устройство для измерения уровня сахара в крови, устройство отображения часового типа или персональный компьютер.

Передача данных между устройством 1 для непрерывного измерения глюкозы и устройством доставки инсулина осуществляется, например, посредством отправки результатов измерения концентрации глюкозы из устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы в устройство доставки инсулина. Это обеспечивает контроль количества инсулина, вводимого в тело человека, на основании данных измерения, поступающих из устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы.

Передача данных между устройством 1 для непрерывного измерения глюкозы и простым устройством для измерения уровня сахара в крови осуществляется, например, посредством отправки результатов измерения уровня сахара в крови из простого устройства для измерения уровня сахара в крови в устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы. Таким образом, результаты измерения в устройстве 1 для непрерывного измерения глюкозы сравниваются с результатами измерения в простом устройстве для измерения уровня сахара в крови, и если между указанными результатами измерения присутствует отклонение на предварительно определенное значение или более, устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы может быть подвергнуто калибровке. Кроме того, необработанные данные (выходной ток), измеренные в устройстве 1 для непрерывного измерения глюкозы, можно отправить в простое устройство для измерения уровня сахара в крови.

Передача данных между устройством 1 для непрерывного измерения глюкозы и устройством отображения часового типа осуществляется, например, посредством отправки результатов измерения уровня сахара в крови из устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы на устройство отображения часового типа. Следовательно, даже если устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы прикреплено в таком участке как плечо, когда пользователь сталкивается с затруднением при визуальном получении данных, результаты измерения в устройстве 1 для непрерывного измерения глюкозы могут быть показаны на устройстве отображения часового типа, чтобы пользователь мог узнать результаты измерения.

Передача данных между устройством 1 для непрерывного измерения глюкозы и персональным компьютером осуществляется, например, посредством отправки результатов измерения уровня сахара в крови или необработанных данных (выходной ток) из устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы в персональный компьютер. Это позволяет выполнять перенос данных по концентрации глюкозы, которые отображаются на персональном компьютере. Кроме того, данные для калибровки из персонального компьютера можно отправить в устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы.

Источник 11 питания является источником питания постоянным током и служит для снабжения питанием монтажной платы 3 и глюкозного сенсора 4. В качестве источника 11 питания, например, применяется батарея таблеточного типа с напряжением питания 1-3 В.

Блок 12 управления управляет различными операциями, такими как управление интервалами между приложением напряжения и значением приложенного напряжения, осуществление выборочных измерений выходного тока, вычисление концентрации глюкозы и связь с внешним терминалом обработки информации.

Вычислительный блок 13 выполняет различные арифметические операции, например, требуемые для работы устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы, в дополнение к вычислению концентрации глюкозы, например.

В блоке 14 памяти сохранены программы и данные (например, данные по калибровочной кривой, коррекционные данные или данные по схеме приложения напряжения), требуемые для различных арифметических операций. В блоке 14 памяти может дополнительно храниться значение выходного тока из глюкозного сенсора 4 и концентрация глюкозы, полученная в арифметической операции.

Блок 12 управления, вычислительный блок 13 и блок 14 памяти осуществлены посредством электронных компонентов, устанавливаемых на монтажной плате 3, таких как ЦП (или МП), ПЗУ и ОЗУ.

В данном случае приложение напряжения к глюкозному сенсору 4 в устройстве 1 для непрерывного измерения глюкозы производится, например, по схеме, показанной на фиг.4. В показанном примере, при условии, что комбинация состояния, в котором напряжение E1 отсутствия реакции приложено в течение заданного времени T2, и состояния, в котором напряжение E2 реакции приложено в течение заданного времени T1, принимается за один этап (один импульс), этап многократно выполняют, а время T3 ожидания устанавливают после множества этапов. Далее, на фиг.5 показан пример выходного тока в случае схемы приложения напряжения, показанной на фиг.4.

Напряжение E1 отсутствия реакции представляет собой напряжение, при котором глюкоза не реагирует вообще или при котором глюкоза реагирует так слабо, что по существу не реагирует (см. фиг.6). Более конкретно, выходной ток, получаемый, когда напряжение E1 отсутствия реакции приложено к глюкозному сенсору 4, содержит очень малую выходную величину, соответствующую глюкозе, и главным образом связан с фоном (чувствительностью), специфическим для сенсора, фоном, обусловленным сопутствующими веществами, а также фоном, обусловленным внешними условиями, такими как электромагнитный шум.

Величину E1 напряжения отсутствия реакции устанавливают в соответствии с техническими параметрами (например, используемым количеством фермента, способом иммобилизации, материалами электродов или площадью реакции) глюкозного сенсора 4. В частности, напряжение E1 отсутствия реакции устанавливают при таком напряжении (потенциале реакции), при котором выходной ток, соответствующий глюкозе, начинает идти, когда напряжение, приложенное к глюкозному сенсору 4, увеличивается или находится в диапазоне от -0,5 до +0,5 В (предпочтительно от -25 до +25 мВ) от потенциала реакции. В показанном глюкозном сенсоре 4 напряжение отсутствия реакции E1 устанавливают, например, в диапазоне от -1 до 1 В. Кроме того, время T2 приложения напряжения E1 отсутствия реакции в одном этапе устанавливают с длительностью, требуемой для стабилизации выходного тока при постоянном значении, например, 0,1-300 сек.

Напряжение E2 реакции представляет собой потенциал, при котором глюкоза реагирует с достаточным разрешением (см. фиг.6). Величину напряжения E2 реакции устанавливают в соответствии с техническими параметрами (например, используемым количеством фермента, способом иммобилизования, материалами электродов или площадью реакции) глюкозного сенсора 4 и устанавливают, например, в диапазоне от -1 до 1 В. Кроме того, время T1 приложения напряжения E2 реакции на одном этапе устанавливают с длительностью, требуемой для исчезновения быстрого изменения выходного тока, например, 0,1-300 микросек.

Напряжение E1 отсутствия реакции и напряжение E2 реакции необязательно должны быть приложены к глюкозному сенсору 4 в виде одного импульса постоянного напряжения в одном этапе, как показано на фиг.4, и могут быть приложены к глюкозному сенсору 4, например, в виде ступенчатого импульса комбинации множества импульсов постоянных напряжений с различными потенциалами, как показано на фиг.7(a)-7(d). В случае, когда напряжение E1 отсутствия реакции и напряжение E2 реакции приложены в виде ступенчатого импульса в одном этапе, количество постоянных напряжений может составить два или четыре, или более, хотя количество постоянных напряжений на фиг.7(a)-7(d) составляет три.

Время T3 ожидания соответствует состоянию, в котором резервное напряжение E3 приложено как напряжение, приложенное к глюкозному сенсору 4, которое еще меньше, чем напряжение E1 отсутствия реакции в абсолютном значении. Время T3 ожидания служит для предотвращения подвода излишне высокого напряжения к глюкозному сенсору 4 и устанавливается, например, в диапазоне от 0,1 до 300 сек. Приложенное напряжение E3 (резервное напряжение) в течение времени T3 ожидания устанавливают на 0 В или больше и меньше, чем напряжение E1 отсутствия реакции в абсолютном значении. В данном случае, в качестве способа установки резервного напряжения E3 на 0 В, существует способ отключения главного источника питания, в дополнение к способу установки напряжения, приложенного к глюкозному сенсору 4, на 0 В с одновременным приложением управляющего напряжения к монтажной плате 3. Разумеется, время T3 ожидания не требуется обязательно, и, более того, время T3 ожидания может быть представлено произвольно после одного этапа или множества этапов (например, 2-1500 этапов), включающих в себя напряжение E1 отсутствия реакции и напряжение E2 реакции.

В схеме приложения напряжения, как описано выше, в процессе вычисления концентрации глюкозы выходной ток I2(n) выборочно измеряется при напряжении E2 реакции, тогда как выходной ток I1(n) выборочно измеряется в ходе приложения напряжения E1 отсутствия реакции на том же этапе, во время которого выборочно измеряется выходной ток I2(n). Соответствующие моменты T'1 и T'2 выборочного измерения для текущих значений, полученных в ходе приложения напряжений E1 и E2, предусмотрены в состоянии, в котором колебание выходного тока является малым, и при этом выходной ток относительно стабилизирован.

Нужно отметить, что сопротивление, энергия или количество электричества, например, могут быть получены в виде выходного сигнала вместо выборочного измерения выходного тока.

С другой стороны, в вычислительном блоке 13 концентрация глюкозы вычисляется при оценке выходного тока, выборочно измеряемого в ходе приложения напряжения E1 отсутствия реакции. Как правило, концентрация глюкозы вычисляется на основе значения выходного тока (I2(n)-I1(n)), полученного в результате вычитания выходного тока I1(n) при напряжении E1 отсутствия реакции из выходного тока I2(n) при напряжении E2 реакции.

Концентрация глюкозы может быть вычислена однократно в одном цикле, включающем в себя множество этапов, или может быть выполнена в одном цикле, выбранном из множества циклов. Кроме того, в одном цикле концентрация глюкозы может быть подвергнута арифметической операции на каждом этапе для определения среднего значения результатов арифметической операции в качестве концентрации глюкозы для данного этапа.

Далее, пороговое значение измеренного значения или пороговое значение для разности от значения при предыдущем измерении могут быть установлены с учетом выходного тока I2(n) при напряжении E2 реакции, выходного тока I1(n) при напряжении E1 отсутствия реакции или значения разности (I2(n)-I1(n)) для значений выходного тока, при этом сравнение может быть сделано в отношении порогового значения перед вычислением концентрации глюкозы. Это позволяет определить, является ли каждый параметр подходящим значением, которое будет использоваться для вычисления, или определить, требуется ли выполнять вычисление концентрации глюкозы (измерение глюкозы). Следовательно, в устройстве 1 для непрерывного измерения глюкозы определение количества глюкозы может быть выполнено с более высокой точностью.

Концентрация глюкозы, полученная в результате вычисления, используется главным образом для определения количества вводимого инсулина и для калибровки устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы, при необходимости. Для вычисления концентрации глюкозы для калибровки предпочтительно, чтобы среднее значение концентрации глюкозы, вычисленной для каждого этапа, выбиралось произвольно из каждого множества циклов.

Как описано выше, выходной ток, соответствующий напряжению E1 отсутствия реакции, не зависим или по существу не зависим от реакции глюкозы и главным образом соответствует фоновым составляющим. Таким образом, концентрация глюкозы может быть вычислена при минимизации влияния фоновых составляющих, если рассматривается выходной ток, соответствующий напряжению E1 отсутствия выходного сигнала, чтобы таким образом повысить точность измерения.

Далее, в схеме, в которой напряжение E1 отсутствия реакции и напряжение E2 реакции приложены к глюкозному сенсору 4 периодически в качестве схемы приложения напряжения, по сравнению со случаем, когда постоянное напряжение приложено непрерывно, напряжение (энергия), приложенное к глюкозному сенсору 4 в единицу времени, уменьшается. Таким образом, может быть предотвращено расщепление глюкоза-оксидоредуктазы, вызванное денатурацией и т.п., и, следовательно, чувствительность глюкозного сенсора 4 может быть стабилизирована в течение длительного периода, и может быть увеличена продолжительность службы глюкозного сенсора 4. Следовательно, частота замены глюкозного сенсора 4 и частота калибровки устройства 1 для непрерывного измерения глюкозы может быть понижена, что облегчает эксплуатацию и уменьшает расходы для пользователя. Кроме того, если напряжение (энергия), приложенное к глюкозному сенсору 4, можно уменьшить, потребляемая мощность в случае непрерывного измерения глюкозы может быть понижена, и, следовательно, продолжительность службы батареи может быть увеличена. В результате, в случае использования в качестве батареи одноразовой батареи, такой как батарея таблеточного типа, можно уменьшить эксплуатационные расходы для пользователя. В частности, если предусмотрено время T3 ожидания и в течение времени T3 ожидания источник питания выключен, продолжительность работы батареи может быть гарантированно увеличена.

Согласно устройству 1 для непрерывного измерения глюкозы, описанному выше, в устройство 1 для непрерывного измерения глюкозы встроена функция вычисления концентрации глюкозы, но при этом концентрацию глюкозы может вычислять внешний терминал обработки информации, тогда как выходное значение, такое как значение выходного тока, измеряется в устройстве 1 для непрерывного измерения глюкозы.

Кроме того, в вышеуказанном варианте исполнения случай, когда напряжение E2 реакции приложено после приложения напряжения E1 отсутствия реакции, определен как один цикл (один импульс). Впрочем, случай, когда напряжение E1 отсутствия реакции приложено после приложения напряжения E2 реакции, может быть определен как один цикл (один импульс).

Настоящее изобретение можно применить в случае использования субстрата, отличного от глюкозы, или субстратсодержащей жидкости, исключая жидкость организма, а также в случае измерения концентрации глюкозы в жидкости организма из тела человека.

Далее технический результат настоящего изобретения показан на примерах.

Пример 1

В данном примере рассматривали выходные характеристики в случае, когда импульсное напряжение периодически прикладывается к электроду с иммобилизованным ферментом.

Изготовление электрода с иммобилизованным ферментом

Электрод с иммобилизованным ферментом изготовлен посредством иммобилизации GDH на поверхности угольного электрода посредством фосфолипидного полимера. Для изготовления угольного электрода вначале 100 микролитров вазелинового масла добавляли к 120 мг перемешанного порошка технического углерода Ketjen Black (производства Lion Corporation) с последующим тщательным перемешиванием для образования исходной пасты. Исходную пасту закладывали в базовый электрод для получения угольно-пастового электрода с площадью 3 phi (производства BAS Inc.) и прижимали контактным стержнем JURAN, получив угольный электрод. В качестве фосфолипидного полимера использовали полимер MPC (торговая марка "LIPIDURE", производства NOF Corporation) с добавкой тетраэтоксисилана в качестве силанового связующего агента. Иммобилизацию фермента проводили посредством пропитки угольного электрода, модифицированного фосфолипидом, в растворе GDH (1250 ед/мл).

Установка прикладываемого напряжения

Прикладываемое напряжение определяли на основании результатов, полученных при измерении зависимости напряжения выходного сигнала глюкозы посредством вольтамперометрии, используя электрод с иммобилизованным ферментом, изготовленный ранее.

Концентрацию глюкозы установили при 600 мг/дл в вольтамперометрии.

В качестве системы электродов в вольтамперометрии в качестве рабочего электрода использовали электрод с иммобилизованным ферментом, изготовленным ранее, в качестве противоэлектрода использовали платиновый электрод и в качестве электрода сравнения использовали серебряный электрод, покрытый хлоридом серебра (серебро/хлорид серебра).

Развертку в вольтамперометрии проводили в направлении катода и в направлении анода, соответственно, с установкой скорости развертки 0,1 В/сек в диапазоне 0-0,6 В. На фиг.8 показаны результаты измерения вольтамперометрии.

Как видно из фиг.8, установлено, что ток окисления, соответствующий глюкозе, регистрируется при значении приложенного напряжения приблизительно 75 мВ. Исходя из данного результата, в отношении напряжения E1 отсутствия реакции, которое не вызывает реакции глюкозы или по существу не вызывает реакции глюкозы, постоянное напряжение величиной 100 мВ установили с учетом интервала в следующем исследовании. С другой стороны, в отношении напряжения E2 реакции, при котором наблюдается реакция глюкозы, постоянное напряжение 700 мВ установили, предполагая, что разность потенциалов с напряжением E1 отсутствия реакции была установлена на уровне 600 мВ.

Схема приложенного напряжения

Время T1 и T2 приложения напряжения E1 отсутствия реакции и напряжения E2 реакции установили с продолжительностью 10 секунд.

Время T3 ожидания установили на 40 секунд. Нужно отметить, что время T3 ожидания установили так, чтобы система электродов, включающая в себя электрод с иммобилизованным ферментом, становилась открытым контуром (0 В) через каждые четыре этапа (четыре импульса).

Измерение выходных характеристик глюкозы

Выходные характеристики измеряли посредством добавления глюкозы в определенный момент при вращении якоря магнитной мешалки при условии, что электрод с иммобилизованным ферментом (рабочий электрод), платиновый электрод (противоэлектрод) и электрод серебро/хлорид серебра (электрод сравнения) был погружен в емкость, содержащую якорь магнитной мешалки и воду.

Глюкозу добавляли в течение времени T3 ожидания в четвертом этапе, при этом четыре этапа (четыре импульса) составляли один цикл. Глюкозу добавляли три раза, при этом концентрацию глюкозы последовательно изменяли с 0 мг/дл до 50 мг/дл, 100 мг/дл и 600 мг/дл.

Выходной ток измеряли, устанавливая напряжение E1 отсутствия реакции и напряжение E2 реакции при постоянном напряжении величиной 0 мВ и 600 мВ, соответственно. На фиг.9(a) показаны результаты измерения выходного тока. Для сравнения, на фиг.9(b) показан случай, когда выходной ток измеряли, устанавливая напряжение E1 отсутствия реакции и напряжение E2 реакции при 100 мВ и 700 мВ, соответственно.

Далее, выборочно измеряли величину токов I1 и I2 после 10 секунд приложения напряжения E1 отсутствия реакции и напряжения E2 реакции, соответственно, и на фиг.10 приведена зависимость между значением разности значений токов I1 и I2 и концентрацией глюкозы. На фиг.10 значение разности выходных токов показано как значение (плотность тока), полученное посредством деления на площадь электрода с иммобилизованным ферментом.

Как видно из фиг.9(a) и 9(b), было подтверждено, что значение тока увеличивалось вследствие добавления глюкозы. Более конкретно, было подтверждено, что глюкоза реагировала на напряжение E2 реакции с генерацией, таким образом, выходного тока.

Далее, в случае, когда напряжение E1 отсутствия реакции устанавливали на 100 мВ, при уменьшении приложенного напряжения от напряжения E2 реакции до напряжения отсутствия E1 реакции, величина колебания (фон) выходного тока заметно уменьшалась по сравнению со случаем, когда напряжение E1 отсутствия реакции устанавливали на 0 мВ.

С другой стороны, как показано на фиг.10, в случае, когда напряжение E1 отсутствия реакции устанавливали при 100 мВ, по сравнению со случаем, когда напряжение E2 отсутствия реакции устанавливали на 0 мВ, разность (I2-I1) между выходным током I2 во время приложения напряжения E2 реакции и выходным током I1 во время приложения напряжения E1 отсутствия реакции уменьшалась независимо от концентрации глюкозы. С этого момента также было понятно, что в случае установки напряжения E1 отсутствия реакции на 100 мВ, то есть в случае установки напряжения E1 отсутствия реакции больше 0 В, влияние фона является малым, а чувствительность реакции является высокой.

Пример 2

В данном примере оценивали стабильность электрода с иммобилизованным ферментом при периодическом приложении импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом.

Изготовление электрода с иммобилизованным ферментом

Электрод с иммобилизованным ферментом изготавливали посредством иммобилизации GDH на поверхности угольного электрода посредством фосфолипидного полимера. Угольный электрод формировали на поверхности полиимидной подложки. В качестве материала для электрода использовали печатную краску, содержащую смесь 40 масс.% Ketjen Black (производства Lion Corporation), 40 масс.% полиэфирной смолы в качестве связующего компонента и 20 масс.% изофорона в качестве растворителя. Печатную краску посредством печати наносили на поверхность полиимидной основы с толщиной слоя до 10 микрометров и сушили при 150°C в течение 30 минут для получения электрода. В качестве фосфолипидного полимера использовали полимер MPC (торговая марка "LIPIDURE", производства NOF Corporation) с добавкой тетраэтоксисилана в качестве силанового связующего агента. Иммобилизацию фермента проводили посредством пропитки угольного электрода, модифицированного фосфолипидом, в растворе GDH (1250 ед/мл).

Оценка стабильности

Стабильность оценивали как чувствительность электрода с иммобилизованным ферментом после непрерывного измерения выходного тока с использованием раствора глюкозы с концентрацией 600 мг/дл.

Использовали такую же систему электродов и схему приложения напряжения, как в примере 1. Нужно отметить, что напряжение E1 отсутствия реакции и напряжение E2 реакции установили на 100 мВ и 700 мВ, соответственно.

Время приложения напряжения установили в общей сложности на 18 часов, при этом чувствительность электрода с иммобилизованным ферментом измеряли каждые 6 часов как выходной ток. Для сравнения, непрерывно оценивали чувствительность в случае приложения постоянного напряжения в 600 мВ. На фиг.11 чувствительность в данных способах измерения представлена как относительные значения выходных токов по отношению к начальной чувствительности (0-часовой выходной ток).

Как видно из фиг.11, в соответствии со способом непрерывного приложения постоянного напряжения в качестве сравнительного примера, выходной ток уменьшался со временем, и, таким образом, на ферментном электроде наблюдали разложение. Напротив, в соответствии со способом периодического приложения импульсного напряжения, уменьшение выходного тока со временем не наблюдалось, при этом подтверждали, что стабильность электрода с иммобилизованным ферментом была удовлетворительной. В связи с этим GDH денатурируется и расщепляется посредством приложения напряжения, однако время приложения напряжения реакции в способе периодического приложения импульсного напряжения в целом сокращается по сравнению со способом непрерывного приложения постоянного напряжения в тот же момент измерения. Таким образом, подразумевается, что более короткое время приложения напряжения реакции предотвращает расщепление GDH и сохраняет стабильность GDH.

Пример 3

В примере 3 проводили исследования по оценке эффективности ступенчатого импульсного напряжения. Изготовление электрода с иммобилизованным ферментом и электродная система являлись такими же, как в примере 1. Фиг.14 представляет собой диаграмму, на которой показано изменение плотности тока в случае периодического приложения ступенчатого импульсного напряжения, как показано на фиг.7(a), к электроду с иммобилизованным ферментом. Плотность тока является значением, вычисляемым посредством деления значения выходного тока на площадь электрода с иммобилизованным ферментом. На фиг.14 ступенчатое импульсное напряжение представлено пунктирной линией, а плотность тока представлена сплошной линией. Один импульс принимается как комбинация состояния, в котором приложено напряжение E1 отсутствия реакции, состояния, в котором приложено напряжение E2 реакции, и состояния, в котором приложено промежуточное напряжение. В отношении прикладываемого напряжения, напряжение E1 отсутствия реакции было установлено при постоянном напряжении в 300 мВ, напряжение E2 реакции было установлено при постоянном напряжении в 600 мВ, и промежуточное напряжение было установлено при постоянном напряжении в 450 мВ.

Фиг.15 изображает диаграмму, на которой показана зависимость между плотностью тока и концентрацией глюкозы. Каждый выходной ток I1, полученный после приложения напряжения E1 отсутствия реакции, и выходной ток I2, полученный после приложения напряжения E2 реакции, измеряли выборочно для вычисления значения разности между выходным током I1 и выходным током I2. Плотность тока является значением, вычисляемым посредством деления значения разности между выходными токами на площадь электрода с иммобилизованным ферментом.

На фиг.15 показано, в качестве ступенчатого импульсного напряжения, импульсное напряжение, принимающее форму комбинации состояния, в котором приложено напряжение E1 отсутствия реакции, состояния, в котором приложено напряжение E2 реакции, и состояния, в котором приложено промежуточное напряжение в виде одного импульса. В отношении прикладываемого напряжения, напряжение E1 отсутствия реакции было установлено при постоянном напряжении в 300 мВ, напряжение E2 реакции было установлено при постоянном напряжении в 600 мВ, и промежуточное напряжение было установлено при постоянном напряжении в 450 мВ. На фиг.15 также показано, в качестве нормального импульсного напряжения, импульсное напряжение, принимающее форму комбинации состояния, в котором приложено напряжение E1 отсутствия реакции, и состояния, в котором приложено напряжение E2 реакции в виде одного импульса. В отношении прикладываемого напряжения, напряжение E1 отсутствия реакции было установлено при постоянном напряжении в 300 мВ, а напряжение E2 реакции было установлено при постоянном напряжении в 600 мВ.

Как показано на фиг.15, ступенчатое импульсное напряжение и нормальное импульсное напряжение демонстрируют увеличенную концентрацию глюкозы и увеличенную плотность тока. Таким образом, было подтверждено, что ступенчатое импульсное напряжение обладало практически такой же эффективностью, как и нормальное импульсное напряжение.

Пример 4

В примере 4, в случае использования ГО в качестве глюкоза-оксидоредуктазы, проводили исследования выходных характеристик в случае периодического приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом.

Изготовление электрода с иммобилизованным ферментом

Платину наносили на поверхность полиимидной подложки методом напыления до толщины 30 нм, сформировав, таким образом, проводящий слой на поверхности полиимидной подложки. Затем проводящий слой пропитывали раствором ГО (водный раствор ГО с концентрацией 1 мг/мл), чтобы сформировать слой ГО на проводящем слое. Таким образом, изготовили электрод с иммобилизованным ферментом. Концентрация ГО в растворе ГО составляла 1100 ед/мл в единицах активности.

Измерение выходных характеристик глюкозы

Выходные характеристики глюкозы измеряли посредством добавления глюкозы при вращении якоря магнитной мешалки в состоянии, в котором электрод с иммобилизованным ферментом (рабочий электрод), платиновый электрод (противоэлектрод) и электрод серебро/хлорид серебра (электрод сравнения) были погружены в емкость, содержащую фосфатный буфер (100 мМ, pH=7,0) и якорь магнитной мешалки. Концентрацию глюкозы изменяли от 0 мг/дл до 600 мг/дл посредством однократного добавления глюкозы.

Фиг.16 изображает диаграмму, на котором показаны результаты измерения выходного тока в случае периодического приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом. В отношении прикладываемого напряжения, напряжение E1 отсутствия реакции было установлено при постоянном напряжении в 300 мВ, а напряжении E2 реакции было установлено при постоянном напряжении в 600 мВ. Что касается схемы приложенного напряжения, время T2 приложения напряжения E1 отсутствия реакции было установлено на 30 секунд, и время T1 приложения напряжения E2 реакции было установлено на 30 секунд. Время T3 ожидания установили на 0 секунд. Как показано на фиг.16, было подтверждено, что в случае периодического приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом выходной ток поддерживался при почти постоянном значении.

Для сравнения на фиг.17 показаны результаты измерения выходного тока в случае непрерывного приложения постоянного напряжения в 600 мВ к электроду с иммобилизованным ферментом. Как показано на фиг.17, было подтверждено, что в случае непрерывного приложения постоянного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом выходной ток увеличивался с течением времени. ГО демонстрирует высокое значение К_м и низкую скорость реакции. Поэтому, когда непрерывно приложено постоянное напряжение, ГО и непрореагировавшая глюкоза с течением времени накапливаются на поверхности электрода. Следует понимать, что когда постоянное напряжение затем прикладывают непрерывно в данном состоянии, глюкоза, накопившаяся на поверхности электрода, с опозданием реагирует с ГО, и в результате выходной ток увеличивается с течением времени. Напротив, когда импульсное напряжение периодически прикладывают к электроду с иммобилизованным ферментом с использованием ГО, выходной ток, полученный во время приложения импульсного напряжения, измеряется, и, следовательно, выходной ток приходит в практически постоянное значение. В импульсном способе каждое напряжение реакции для отдельного импульса независимо прикладывается только в течение заданного времени приложения. Таким образом, получают только выходной ток, соответствующий реакции ГО и глюкозы в пределах заданного времени приложения. Поскольку напряжение реакции не приложено до того момента, когда глюкоза, накопившаяся на поверхности электрода, с опозданием реагирует с ГО, можно допускать, что выходной ток должен прийти в почти постоянное значение. Следует отметить, что GDH демонстрирует низкое значение К_м и высокую скорость реакции. Поэтому, даже если постоянное напряжение приложено непрерывно к электроду с иммобилизованным ферментом с использованием GDH, выходной ток не увеличивается. Денатурация и расщепление GDH вследствие приложения напряжения вызывают уменьшение выходного тока в зависимости от непрерывного времени приложения постоянного напряжения.

Далее, в примере 4, в случае применения ГО в качестве глюкоза-оксидоредуктазы, проводили оценку стабильности электрода с иммобилизованным ферментом в случае периодического приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом. Стабильность оценивали как чувствительность электрода с иммобилизованным ферментом после непрерывного измерения выходного тока при использовании раствора глюкозы с концентрацией 600 мг/дл. Установка прикладываемого напряжения и схема приложения напряжения являются такими же, как при измерении выходных характеристик глюкозы.

Время приложения напряжения было установлено на 105 минут, при этом чувствительность электрода с иммобилизованным ферментом измеряли как выходной ток каждые 15 минут. Для сравнения, проводили оценку чувствительности в случае непрерывного приложения постоянного напряжения в 600 мВ к электроду с иммобилизованным ферментом. На фиг.18 показана чувствительность в указанных способах измерения, выраженная как относительное значение (%) выходного тока к начальной чувствительности (выходной ток в 0 часов).

Как показано на фиг.18, в способе непрерывного приложения постоянного напряжения в качестве сравнительного примера, выходной ток увеличивался с течением времени. ГО демонстрирует высокое значение К_м и низкую скорость реакции. Поэтому, когда постоянное напряжение приложено непрерывно, ГО и непрореагировавшая глюкоза с течением времени накапливаются на поверхности электрода. Следует понимать, что когда постоянное напряжение затем непрерывно прикладывается в данном состоянии, глюкоза, накопившаяся на поверхности электрода, с опозданием реагирует с ГО, и в результате выходной ток увеличивается с течением времени. Напротив, в способе периодического приложения импульсного напряжения увеличение выходного тока не наблюдалось даже по прошествии некоторого времени, при этом было показано, что электрод с иммобилизованным ферментом обладает удовлетворительной стабильностью. В импульсном способе каждое напряжение реакции для отдельного импульса независимо прикладывается только в течение заданного времени приложения. Таким образом, получают только выходной ток, соответствующий реакции ГО и глюкозы в пределах заданного времени приложения. Поскольку напряжение реакции не прикладывается до момента, когда глюкоза, накопившаяся на поверхности электрода, с опозданием реагирует с ГО, можно допускать, что выходной ток должен прийти в почти постоянное значение.

Пример 5

В примере 5 проводили исследования зависимости концентрации глюкозы в случае непрерывного приложения постоянного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом и зависимости концентрации глюкозы в случае периодического приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом. Более конкретно, в случае непрерывного приложения постоянного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом проводили измерение выходного тока в случае изменения концентрации глюкозы. Кроме того, в случае периодического приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом проводили измерение выходного тока в случае изменения концентрации глюкозы. Выходной ток измеряли при добавлении глюкозы в определенный момент при вращении якоря магнитной мешалки в состоянии, в котором электрод с иммобилизованным ферментом (рабочий электрод), платиновый электрод (противоэлектрод) и электрод серебро/хлорид серебра (электрод сравнения) были погружены в емкость, содержащую фосфатный буфер (100 мМ, pH=7,0) и якорь магнитной мешалки.

Изготовление электрода с иммобилизованным ферментом

Платину наносили на поверхность полиимидной подложки методом напыления до толщины 30 нм, сформировав, таким образом, проводящий слой на поверхности полиимидной подложки. Затем, проводящий слой пропитывали раствором ГО (водный раствор ГО с концентрацией 1 мг/мл), чтобы сформировать слой ГО на проводящем слое. Таким образом, изготовили электрод с иммобилизованным ферментом. Концентрация ГО в растворе ГО составляла 1100 ед/мл согласно активности.

Фиг.19 изображает диаграмму, на которой показано изменение выходного тока вследствие повышения концентрации глюкозы в случае непрерывного приложения постоянного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом. Добавление глюкозы выполняли дважды, при этом концентрацию глюкозы последовательно изменяли от 0 мг/дл до 100 мг/дл и до 600 мг/дл. Выходной ток измеряли посредством непрерывного приложения постоянного напряжения в 600 мВ к электроду с иммобилизованным ферментом.

Фиг.20 изображает диаграмму, на которой показано изменение выходного тока вследствие повышения концентрации глюкозы в случае периодического приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом. Импульсное напряжение прикладывали дважды, а затем один раз добавляли глюкозу, после чего дважды прикладывали импульсное напряжение, а затем один раз добавляли глюкозу и после этого еще пять раз прикладывали импульсное напряжение. Концентрацию глюкозы последовательно изменяли от 0 мг/дл до 100 мг/дл и до 600 мг/дл, дважды добавляя глюкозу. Выходной ток измеряли, установив напряжение E1 отсутствия реакции при постоянном напряжении в 300 мВ и установив напряжение E2 реакции при постоянном напряжении в 600 мВ. Кроме того, время T1 приложения напряжения E1 отсутствия реакции установили на 30 секунд, и время приложения напряжения E2 реакции установили с продолжительностью 30 секунд.

Фиг.21 изображает диаграмму, на которой показан выходной ток I3 в случае непрерывного приложения постоянного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом и выходной ток I4 в случае периодического приложения импульсного напряжения к электроду с иммобилизованным ферментом. Как показано на фиг.21, выходной ток I3 и выходной ток I4 возрастали вместе с ростом концентрации глюкозы. Таким образом, было подтверждено, что даже в случае применения ГО в качестве глюкоза-оксидоредуктазы выходной ток возрастал в результате увеличения концентрации глюкозы.

Список условных обозначений

1 устройство для непрерывного измерения глюкозы

4 глюкозный сенсор

E1 напряжение отсутствия реакции (напряжение отсутствия выходного сигнала)

E2 напряжение реакции (напряжение выходного сигнала)

E3 резервное напряжение

Реферат

Изобретение относится к медицинской диагностике. Способ непрерывного определения концентрации глюкозы основан на отклике, когда напряжение приложено к сенсору, и включает этап приложения напряжения отклика, на котором получают отклик, соответствующий глюкозе; и этап приложения напряжения отсутствия отклика, на котором отклик, соответствующий глюкозе, не получают или по существу не получают. Концентрацию глюкозы вычисляют на основании разности между откликом, полученным на этапе приложения напряжения отклика, и откликом, полученным на этапе приложения напряжения отсутствия отклика. Этап приложения напряжения выходного сигнала и этап приложения напряжения отсутствия выходного сигнала повторяются поочередно. Технический результат состоит в повышении точности и стабильности определения концентрации глюкозы. 8 з.п. ф-лы, 21 ил., 5 пр.

Формула