Носитель для аффинной хроматографии и способ очистки биологического вещества - RU2694637C1

Описание

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Область изобретения

[0001] Настоящее изобретение относится к носителю для аффинной хроматографии и способу очистки биологического вещества.

2. Описание связанной области

[0002] В последние годы, наряду с развитием генетической инженерии, белковой инженерии и клеточной инженерии, активно идет разработка лекарственных средств, использующих функции антител, которые называют антительными лекарственными средствами. По сравнению со стандартными лекарственными средствами, антительные лекарственные средства работают более специфически на молекуле-мишени, и, следовательно, ожидают, что использование антительных лекарственных средств приведет к дополнительному снижению побочных эффектов и высоким терапевтическим эффектам. Фактически, антительные лекарственные средства вносят вклад в улучшение различных патологических состояний.

[0003] Между тем, поскольку антительные лекарственные средства вводят в живой организм в больших количествах, чистота оказывает значительное влияние на качество антительного лекарственного средства в случае сравнения с другими рекомбинантными белковыми лекарственными средствами. Поскольку антительные лекарственные средства получают посредством очистки антител, экспрессируемых в клетках-хозяевах посредством генетической рекомбинации, включение примесей, происходящих из клеток-хозяев и процессов получения, создает проблемы. Например, поскольку белки клетки-хозяина (HCP), остающиеся в качестве загрязнения в антительном лекарственном средстве, полагают связанными с началом анафилаксии при введении антительного лекарственного средства, требуется повышать чистоту очистки для того, чтобы снижать загрязнения.

[0004] Например, в WO2010/095673A раскрыт, в качестве хроматографического носителя, подходящего для разделения и очистки препарата белка или тому подобного, хроматографический носитель, получаемый посредством добавления сульфоксигруппы в качестве лиганда в пористый гель на основе целлюлозы, состоящий из пористых частиц целлюлозы с добавляемым к ним полисахаридом, имеющим собственную вязкость от 0,21 дл/г до 0,90 дл/г, где сухая масса на единицу объема пористого геля на основе целлюлозы составляет в 1,06-1,40 раза больше сухой массы на единицу объема пористых частиц целлюлозы.

[0005] Кроме того, например, в WO2014/034457A раскрыто, что носитель для аффинной хроматографии, получаемый посредством иммобилизации аффинного лиганда, имеющего функцию специфического связывания со специфической молекулой на нерастворимом в воде носителе, используют для эффективного отделения и очистки полезных веществ от микроорганизмов и культивируемых клеток млекопитающего, содержащих биологические компоненты или рекомбинанты, а также раскрыт носитель для аффинной хроматографии, имеющий аффинный лиганд и катионообменную группу на одном и том же носителе, в качестве носителя для аффинной хроматографии, позволяющего достигать высокой чистоты очистки антител.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Однако авторы настоящего изобретения исследовали носитель катионообменной хроматографии, описанный в WO2010/095673A, и обнаружили, что существует простор для усовершенствования чистоты очистки, даже несмотря на то, что такой носитель катионообменной хроматографии проявляет превосходную емкость адсорбции антител, как показано в эталонном примере 1, описанном в настоящем описании.

[0008] Кроме того, авторы настоящего изобретения исследовали носитель для аффинной хроматографии, описанный в WO2014/034457A, и обнаружили, что носитель для аффинной хроматографии, имеющий аффинный лиганд и катионообменную группу на одном и том же носителе, считают благоприятным, но, как показано в сравнительных примерах 4 и 5, приведенных в настоящем описании, существует простор для усовершенствования чистоты очистки, даже несмотря на то, что такой носитель для аффинной хроматографии демонстрирует превосходную емкость адсорбции антител.

[0009] Следовательно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить носитель для аффинной хроматографии, который демонстрирует превосходную емкость адсорбции антител и превосходную чистоту очистки.

[0010] В результате всесторонних исследований для достижения вышеуказанной цели авторы настоящего изобретения обнаружили, что носитель для аффинной хроматографии, который имеет подложку, гидрофильный полимер и аффинный лиганд, демонстрирует превосходную емкость адсорбции антител и превосходную чистоту очистки в случае, когда подложка состоит из по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из полисахарида, полимера на основе акрилата, полимера на основе метакрилата и полимера на основе стирола, гидрофильный полимер представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из гидрофильных полисахаридов, аффинный лиганд представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из антителосвязывающего белка и антителосвязывающего полипептида, карбоксигруппу вводят в носитель для аффинной хроматографии и количество введенной карбоксигруппы составляет от 15 ммоль/л геля до 60 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости. Настоящее изобретение выполнено на основании этих открытий.

[0011] То есть, настоящее изобретение предусматривает следующие с [1] до [14].

[1] Носитель для аффинной хроматографии, который содержит:

подложку;

гидрофильный полимер; и

аффинный лиганд, в котором

подложка состоит из по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из полисахарида, полимера на основе акрилата, полимера на основе метакрилата и полимера на основе стирола,

гидрофильный полимер представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из гидрофильных полисахаридов,

аффинный лиганд представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из антителосвязывающего белка и антителосвязывающего полипептида,

карбоксигруппу вводят в носитель для аффинной хроматографии, и

количество введенной карбоксигруппы составляет от 15 ммоль/л геля до 60 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости.

[2] Носитель для аффинной хроматографии в соответствии с [1], в котором гидрофильный полимер имеет собственную вязкость 0,10 дл/г или больше.

[3] Носитель для аффинной хроматографии в соответствии с [1] или [2], в котором покрывающее количество гидрофильного полимера составляет от 3 мг/г сухого геля до 500 мг/г сухого геля.

[4] Носитель для аффинной хроматографии в соответствии с любым одним из [1]-[3], в котором подложка состоит из по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из полисахарида, полимера на основе акрилата и полимера на основе метакрилата.

[5] Носитель для аффинной хроматографии по любому одному из [1]-[4], в котором гидрофильный полимер представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из декстрана, карбоксиметилдекстрана и пуллулана.

[6] Носитель для аффинной хроматографии по любому одному из [1]-[5], в котором подложка представляет собой пористую частицу.

[7] Носитель для аффинной хроматографии по любому одному из [1]-[6], в котором аффинный лиганд участвует в реакции антиген-антитело с антителом.

[8] Носитель для аффинной хроматографии по любому одному из [1]-[7], в котором аффинный лиганд представляет собой белок A или его вариант.

[9] Носитель для аффинной хроматографии по любому одному из [1]-[8], в котором подложка состоит из по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из целлюлозы, агарозы, декстрана, хитозана, глюкоманнана и сшитого полисахарида, полученного посредством введения сшитой структуры в него,

гидрофильный полимер представляет собой по меньшей мере один гидрофильный полисахарид, выбранный из группы, состоящей из декстрана, карбоксиметилдекстрана и пуллулана,

собственная вязкость гидрофильного полисахарида составляет от 0,12 дл/г до 0,30 дл/г,

покрывающее количество гидрофильного полимера составляет от 10 мг/г сухого геля до 240 мг/г сухого геля,

количество введенной карбоксигруппы составляет от 15 ммоль/л геля до 55 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости,

аффинный лиганд представляет собой белок A или его вариант, и

количество введенного аффинного лиганда составляет от 0,10 ммоль/л геля до 1,0 ммоль/л геля.

[10] Носитель для аффинной хроматографии по любому одному из [1]-[8], в котором подложка состоит из по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из полимера на основе акрилата и полимера на основе метакрилата,

гидрофильный полимер представляет собой по меньшей мере один гидрофильный полисахарид, выбранный из группы, состоящей из декстрана, карбоксиметилдекстрана и пуллулана,

собственная вязкость гидрофильного полисахарида составляет от 0,12 дл/г до 0,30 дл/г,

покрывающее количество гидрофильного полимера составляет от 10 мг/г сухого геля до 240 мг/г сухого геля,

количество введенной карбоксигруппы составляет от 15 ммоль/л геля до 55 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости,

аффинный лиганд представляет собой белок A или его вариант, и

количество введенного аффинного лиганда составляет от 0,10 ммоль/л геля до 1,0 ммоль/л геля.

[11] Способ очистки для очистки биологического вещества с использованием носителя для аффинной хроматографии по любому одному из [1]-[10].

[12] Способ очистки в соответствии с [11], в котором pH во время добавления биологического вещества составляет от 5,0 до 9,0.

[13] Способ очистки в соответствии с [11] или [12], в котором pH во время элюирования биологического вещества составляет от 2,0 до 5,0.

[14] Способ очистки по любому одному из [11]-[13], в котором биологическое вещество представляет собой антитело или производное антитела.

[0012] В соответствии с настоящим изобретением предоставлен носитель для аффинной хроматографии, демонстрирующий превосходную емкость адсорбции антител и превосходную чистоту очистки.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0013] С помощью конфигурации, в которой носитель для аффинной хроматографии по настоящему изобретению имеет как аффинный лиганд, который представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из антителосвязывающего белка и антителосвязывающего полипептида, так и карбоксигруппу, которая представляет собой катионообменную группу, и количество введенной карбоксигруппы находится в диапазоне от 15 ммоль/л геля до 60 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости, возможно снижать количество неспецифической адсорбции и, следовательно, повышать чистоту очистки. Кроме того, карбоксигруппа обладает более низкой ионной силой, чем сульфоксигруппа и, следовательно, является благоприятной, поскольку неспецифическая адсорбция может быть подавлена.

[0014] Далее в настоящем описании подробно описаны носитель для аффинной хроматографии по настоящему изобретению и способ его получения.

В отношении числового диапазона, предусмотрено, что числовые значения слева и справа от «до» включены в числовой диапазон.

[0015] [Носитель для аффинной хроматографии]

Носитель для аффинной хроматографии по настоящему изобретению представляет собой носитель для аффинной хроматографии, содержащий подложку, гидрофильный полимер и аффинный лиганд, в котором подложка состоит из по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из полисахарида, полимера на основе акрилата, полимера на основе метакрилата и полимера на основе стирола, гидрофильный полимер представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из полисахаридов, аффинный лиганд представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из антителосвязывающего белка и антителосвязывающего полипептида, в носитель для аффинной хроматографии вводят карбоксигруппу и количество введенной карбоксигруппы составляет от 15 ммоль/л геля до 60 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости.

[0016] <Подложка>

Подложка представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из полисахарида, полимера на основе акрилата, полимера на основе метакрилата и полимера на основе стирола, предпочтительно по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из полисахарида, полимера на основе акрилата и полимера на основе метакрилата, и более предпочтительно по меньшей мере одно, выбранное из полисахаридов. Также можно использовать отдельно одну подложку или можно использовать две или больше подложек в комбинации.

[0017] Полисахарид конкретно не ограничен, и его примеры включают природные полисахариды, такие как целлюлоза, агароза, декстран, хитозан и глюкоманнан, и сшитые полисахариды, получаемые посредством введения сшитой структуры в эти природные полисахариды. Сшитый полисахарид можно получать, например, посредством введения сшитой структуры в гидроксильную группу природного полисахарида с использованием сшивающего средства, такого как эпихлоргидрин, диглицидиловый эфир (поли)алкиленгликоля или алкилендиизоцианат.

[0018] Полисахарид предпочтительно представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из целлюлозы, сшитой целлюлозы, агарозы и сшитой агарозы, и более предпочтительно по меньшей мере одно, выбранное из агарозы и сшитой агарозы.

[0019] Полимер на основе акрилата конкретно не ограничен, и его примеры включают полимер, полученный посредством полимеризации сложных эфиров акриловой кислоты одного типа, таких как метилакрилат, этилакрилат, гидроксиэтилакрилат, гидроксипропилакрилат, бутилакрилат, стеарилакрилат, 2-этилгексилакрилат, циклогексилакрилат, глицеринмоноакрилат, глицидилакрилат, 4,5-эпоксибутилакрилат и 9,10-эпоксистеарилакрилат; сополимер, полученный посредством сополимеризации вышеуказанных сложных эфиров акриловой кислоты двух или больше типов; и сополимер, полученный посредством сополимеризации сложных эфиров акриловой кислоты одного или нескольких типов с содержащими винильную группу соединениями одного или нескольких типов, отличными от сложных эфиров акриловой кислоты. Примеры содержащих винильную группу соединений, отличных от сложных эфиров акриловой кислоты, включают моновиниловое соединение, такое как этилен или пропилен, ароматическое поливиниловое соединение, такое как дивинилбензол или тривинилбензол, и поливиниловое соединение, такое как бутадиен, метиленбисакриламид или триаллилизоцианурат. Сшивающую структуру можно вводить в эти полимеры или сополимеры с использованием сшивающего средства, такого как эпихлоргидрин, диглицидиловый эфир (поли)алкиленгликоля или алкилендиизоцианат.

[0020] Полимер на основе метакрилата конкретно не ограничен, и его примеры включают полимер, получаемый посредством полимеризации сложных эфиров метакриловой кислоты одного типа, таких как метилметакрилат, этилметакрилат, гидроксиэтилметакрилат, гидроксипропилметакрилат, бутилметакрилат, стеарилметакрилат, 2-этилгексилметакрилат, циклогексилметакрилат, глицеринмонометакрилат, глицидилметакрилат, 4,5-эпоксибутилметакрилат и 9,10-эпоксистеарилметакрилат; сополимер, получаемый посредством сополимеризации вышеуказанных сложных эфиров метакриловой кислоты двух или больше типов; и сополимер, получаемый посредством сополимеризации сложных эфиров метакриловой кислоты одного или нескольких типов с содержащими винильную группу соединениями одного или нескольких типов, отличными от сложных эфиров метакриловой кислоты. Примеры содержащих винильную группу соединений, отличных от сложных эфиров метакриловой кислоты, включают моновиниловое соединение, такое как этилен или пропилен, ароматическое поливиниловое соединение, такое как дивинилбензол или тривинилбензол, и поливиниловое соединение, такое как бутадиен, метиленбисакриламид или триаллилизоцианурат. Сшивающую структуру можно вводить в эти полимеры или сополимеры с использованием сшивающего средства, такого как эпихлоргидрин, диглицидиловый эфир (поли)алкиленгликоля или алкилендиизоцианат.

[0021] Полимер на основе стирола конкретно не ограничен, и его примеры включают полимер, получаемый посредством полимеризации соединений на основе стирола одного типа, таких как стирол, метилстирол, этилстирол, гидроксистирол и хлорстирол; сополимер, получаемый посредством сополимеризации вышеуказанных соединений на основе стирола двух или больше типов; и сополимер, получаемый посредством сополимеризации соединений на основе стирола одного или нескольких типов с содержащими винильную группу соединениями одного или нескольких типов, отличными от соединений на основе стирола. Примеры содержащих винильную группу соединений, отличных от соединений на основе стирола, включают моновиниловое соединение, такое как этилен или пропилен, ароматическое поливиниловое соединение, такое как дивинилбензол или тривинилбензол, и поливиниловое соединение, такое как бутадиен, метиленбисакриламид или триаллилизоцианурат. Сшивающую структуру можно вводить в эти полимеры или сополимеры с использованием сшивающего средства, такого как эпихлоргидрин, диглицидиловый эфир (поли)алкиленгликоля или алкилендиизоцианат.

[0022] Подложка предпочтительно представляет собой пористую частицу или пористую пленку. Поскольку подложка представляет собой пористую частицу или пористую пленку, то увеличена площадь ее поверхности и, следовательно, может быть увеличена емкость обработки на единицу времени.

[0023] Несмотря на то, что объем пор подложки в случае, когда подложка представляет собой пористую частицу или пористую пленку, конкретно не ограничен, объем пор, измеряемый с помощью ртутного порозиметра, предпочтительно находится в диапазоне от 0,2 мл/г до 10 мл/г и более предпочтительно 0,2 мл/г до 5,0 мл/г. В случае, когда объем пор находится в этом диапазоне, усовершенствована емкость адсорбции антител и чистота очистки. Кроме того, не происходит снижение механической прочности.

[0024] Несмотря на то, что удельная площадь поверхности подложки в случае, когда подложка представляет собой пористую частицу или пористую пленку, конкретно не ограничена, удельная площадь поверхности, измеряемая с помощью способа Брунауэра-Эммета-Теллера (BET), (удельная площадь поверхности BET) предпочтительно находится в диапазоне от 2 м²/г до 1500 м²/г и более предпочтительно от 5 м²/г до 1000 м²/г. В случае, когда удельная площадь поверхности находится в этом диапазоне, усовершенствована емкость адсорбции антител и чистота очистки.

[0025] Усредненный диаметр частицы подложки в случае, когда подложка представляет собой пористую частицу, конкретно не ограничен, но предпочтительно он находится в диапазоне от 0,5 мкм до 1000 мкм, более предпочтительно от 1 мкм до 250 мкм и еще более предпочтительно от 2 мкм до 150 мкм. В случае, когда усредненный диаметр частицы находится в этом диапазоне, можно снижать падение давления в случае заполнения колонки пористыми частицами и последующего пропускания жидкости через нее и можно увеличивать скорость потока жидкости, что, в свою очередь, ведет к усовершенствованной эффективности обработки, а также усовершенствованной емкости адсорбции антител и чистоте очистки. Усредненный диаметр частицы пористых частиц можно измерять известным способом. Например, усредненный диаметр частицы можно получать посредством измерения диаметров частиц у 100 или больше пористых частиц с помощью оптического микроскопа и вычисления диаметра для медианы объема по их распределению диаметров частиц.

[0026] Примеры коммерчески доступных продуктов подложки включают, но не ограничиваясь этим, серию SEPHAROSE (производства GE Healthcare GmbH), которая представляет собой носитель на основе агарозы («SEPHAROSE» представляет собой зарегистрированный товарный знак), серию CELLUFINE (производства JNC Corporation), которая представляет собой сшитый носитель на основе целлюлозы («CELLUFINE» представляет собой зарегистрированный товарный знак), серию SEPHACRYL (производства GE Healthcare GmbH), которая представляет собой сшитый полимер аллилдекстрана и N,N'-метиленбисакриламида («SEPHACRYL» представляет собой зарегистрированный товарный знак), и серию TOYOPEARL HW (производства Tosoh Corporation), которая представляет собой носитель на основе акрилата («TOYOPEARL» представляет собой зарегистрированный товарный знак).

[0027] <Гидрофильный полимер>

Гидрофильный полимер представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из гидрофильных полисахаридов. Можно отдельно использовать один гидрофильный полимер или можно использовать два или больше гидрофильных полимеров в комбинации.

[0028] В настоящем изобретении термин «гидрофильный», используемый в сочетании с полимером или полисахаридом, относится к тому факту, что полимер или полисахарид содержит гидрофильную группу по меньшей мере одного типа. Предпочтительные примеры гидрофильной группы включают функциональную группу, такую как карбоксигруппа, соль карбоксигруппы и щелочного металла, сульфоксигруппу, соль сульфоксигруппы и щелочного металла, гидроксигруппу, амидную группу, карбамоильную группу, сульфонамидную группу, сульфамоильную группу, фосфорную группу, соль фосфорной группы и щелочного металла, оксифосфорную группу и соль оксифосфорной группы и щелочного металла. Эти гидрофильные группы могут присутствовать в любом положении в полимере. Например, гидрофильная группа может быть связана с боковой цепью полимера непосредственно или через линкерную группу или может быть связана с боковой цепью полимера или привитой боковой цепью. Кроме того, в одной молекуле предпочтительно присутствует множество гидрофильных групп.

[0029] Гидрофильный полисахарид конкретно не ограничен, но предпочтительно он представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из декстрана, карбоксиметилдекстрана и пуллулана, и более предпочтительно из декстрана, с точки зрения наличия высокого эффекта усовершенствования чистоты очистки.

[0030] Покрывание подложки гидрофильным полимером увеличивает гидрофильность поверхности носителя для аффинной хроматографии по настоящему изобретению и подавляет адсорбцию неспецифических адсорбируемых веществ, что, таким образом, вызывает эффект усовершенствования чистоты очистки.

[0031] Молекулярная масса гидрофильного полимера конкретно не ограничена, но предпочтительно она находится в диапазоне 0,10 дл/г или больше, более предпочтительно от 0,10 дл/г до 0,90 дл/г, еще более предпочтительно от 0,12 дл/г до 0,90 дл/г, даже более предпочтительно от 0,12 дл/г до 0,30 дл/г и даже еще более предпочтительно от 0,17 дл/г до 0,25 дл/г в отношении собственной вязкости. В случае, когда собственная вязкость находится в этом диапазоне, чистота очистки дополнительно усовершенствована. Собственную вязкость можно определять посредством измерения вязкости растворов полимеров в нескольких различных концентрациях в соответствии со способом измерения вязкости в общем способе измерения, приведенном в 16-й пересмотренной Японской фармакопее, первый способ «способ с капиллярным вискозиметром» для измерения зависимости концентрации от вязкости, и экстраполяции концентрации полученной прямой линии до 0.

[0032] Между тем, установлено следующее уравнение Марка-Хаувинка-Сакурады между собственной вязкостью η и молекулярной массой M полимера. Следовательно, когда молекулярную массу нескольких образцов определяют с использованием прямого способа измерения, и K и α определяют по значениям молекулярной массы и соответствующей собственной вязкости, молекулярную массу M определяют посредством измерения собственной вязкости η, и собственную вязкость η определяют посредством измерения молекулярной массы M, соответственно, для полимеров одного и того же типа.

η=KM^α

Здесь K и α представляют собой константы, определяемые типом полимера, типом растворителя и температурой.

[0033] Например, известно, что собственная вязкость (η_{декстрана}) и средневесовая молекулярная масса (Mw_{декстрана}) декстрана отвечают следующему выражению отношения.

η_{декстрана}[дл/г]=9×10^-4×Mw_{декстрана}^0,5[дл/г]

[0034] Количество покрытия гидрофильного полимера (далее в настоящем описании иногда просто обозначаемое как «количество покрытия гидрофильным полимером») конкретно не ограничено, но предпочтительно оно составляет от 3 мг/г сухого геля до 500 мг/г сухого геля, более предпочтительно от 3 мг/г сухого геля до 350 мг/г сухого геля, еще более предпочтительно от 10 мг/г сухого геля до 300 мг/г сухого геля и даже более предпочтительно от 20 мг/г сухого геля до 240 мг/г сухого геля. В случае, когда количество покрытия гидрофильным полимером находится в этом диапазоне, гидрофильность поверхности носителя для аффинной хроматографии по настоящему изобретению умеренно увеличивают, чтобы тем самым подавлять адсорбцию неспецифических адсорбируемых веществ, и имеет место простор для диффузии и проникновения антител в подложку, что, таким образом, увеличивает емкость адсорбции антител с тем, чтобы дополнительно усовершенствовать чистоту очистки. Гидрофильный полимер не обязан покрывать всю поверхность подложки, и достаточно, чтобы гидрофильный полимер покрывал по меньшей мере часть подложки.

[0035] Количество покрытия гидрофильным полимером [единица: мг/г сухого геля] вычисляют посредством деления сухой массы (W_P) [единица: мг] нанесенного гидрофильного полимера на сухую массу (W₀) [единица: г сухого геля] подложки перед покрыванием. Сухая масса (W_P) гидрофильного полимера представляет собой разность (W₁-W₀) [единица: мг] между сухой массой (W1) общего количества носителя и сухой массой (W₀) подложки перед покрыванием.

Следовательно, количество покрытия гидрофильным полимером можно определять с помощью следующего уравнения.

Количество покрытия гидрофильным полимером (мг/г сухого геля)=W_P/W₀=(W₁-W₀)/W₀

Сухую массу (W₀) подложки перед покрыванием можно вычислять следующим образом.

W₀=W_{0, xg}×w₀/x

где

W_{0, xg}: сухая масса влажного геля xg подложки перед покрыванием,

w₀: общая масса влажного геля подложки перед покрыванием, используемая для реакции покрывания гидрофильным полимером, и

x: масса влажного геля (xg) подложки перед покрыванием, используемая для сушки.

Сухую массу (W₁) общего количества носителя также можно вычислять аналогичным образом.

[0036] <Аффинный лиганд>

Аффинный лиганд представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из антителосвязывающего белка и антителосвязывающего полипептида, и предпочтительно по меньшей мере одно, выбранное из антителосвязывающих белков.

[0037] В настоящем изобретении полипептид представляет собой молекулу, содержащую пептидную цепь, состоящую из 2-50 аминокислотных остатков, и в целом относится к молекуле, имеющей молекулярную массу меньше 5000. В настоящем изобретении белок представляет собой молекулу, содержащую пептидную цепь, состоящую из 51 или больше аминокислотных остатков, и в целом относится к молекуле, имеющей молекулярную массу 5000 или больше.

[0038] Антителосвязывающий белок конкретно не ограничен до тех пор пока он представляет собой белок, который связывается с антителом посредством реакции антиген-антитело, и его примеры включают белок A, белок G, белок L, белок D и вариант белка A. Антителосвязывающий белок предпочтительно представляет собой белок A или его вариант. Вариант белка A предпочтительно представляет собой щелочеустойчивый белок A.

[0039] Антителосвязывающий полипептид конкретно не ограничен до тех пор пока он представляет собой полипептид, который связывается с антителом посредством реакции антиген-антитело, и его примеры включают полипептид, который имеет аминокислотную последовательность, идентичную части аминокислотной последовательности антителосвязывающего домена белка A, и его варианты. Вариант антителосвязывающего полипептида предпочтительно представляет собой щелочеустойчивый вариант.

[0040] Количество аффинного лиганда, подлежащее введению в носитель для аффинной хроматографии по настоящему изобретению (далее в настоящем описании иногда просто обозначаемое как «вводимое количество аффинного лиганда») конкретно не ограничено, но предпочтительно оно составляет от 0,01 ммоль/л геля до 100 ммоль/л геля, более предпочтительно от 0,05 ммоль/л геля до 50 ммоль/л геля, еще более предпочтительно от 0,10 ммоль/л геля до 10 ммоль/л геля, даже более предпочтительно от 0,10 ммоль/л геля до 2,0 ммоль/л геля, еще более предпочтительно от 0,10 ммоль/л геля до 1,0 ммоль/л геля и даже еще более предпочтительно от 0,10 ммоль/л геля до 0,50 ммоль/л геля.

[0041] <Карбоксигруппа>

Количество карбоксигруппы, подлежащее введению в носитель для аффинной хроматографии по настоящему изобретению (далее в настоящем описании иногда просто обозначаемое как «вводимое количество карбоксигруппы») составляет от 15 ммоль/л геля до 60 ммоль/л геля, предпочтительно от 15 ммоль/л геля до 55 ммоль/л геля и еще более предпочтительно от 15 ммоль/л геля до 40 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости. В случае, когда вводимое количество карбоксигруппы находится в этом диапазоне, вводимое количество аффинного лиганда можно задавать в подходящем диапазоне и, следовательно, происходит усовершенствование емкости адсорбции антител. Кроме того, можно подавлять адсорбцию неспецифических адсорбируемых веществ.

[0042] [Способ получения носителя для аффинной хроматографии]

Носитель для аффинной хроматографии по настоящему изобретению можно получать посредством покрывания подложки гидрофильным полимером, введения карбоксигруппы в него и дополнительного введения аффинного лиганда.

[0043] Подробности о подложке, гидрофильном полимере и аффинном лиганде представляют собой то, что описано в разделе «Носитель для аффинной хроматографии».

[0044] <Покрывание гидрофильным полимером>

Подложку покрывают гидрофильным полимером.

Способ покрывания подложки гидрофильным полимером конкретно не ограничен до тех пор, пока он позволяет связывать гидрофильный полимер с подложкой посредством ковалентной связи. Примеры способа покрывания подложки гидрофильным полимером включают способ, в котором проводят реакцию подложки с хлорметилоксираном (эпихлоргидрином) для того, чтобы вводить эпоксигруппу в подложку, которая затем участвует в реакции с гидрофильным полимером; способ, в котором проводят реакцию подложки со сшивающим средством, таким как хлорметилоксиран (эпихлоргидрин), в присутствии щелочи в растворителе и проводят реакцию получаемого продукта реакции с гидрофильным полимером; и способ, в котором галогеновую группу, такую как группу хлора, вводят в подложку с использованием галогенирующего агента и гидрофильный полимер иммобилизуют на подложке с использованием синтеза простого эфира Вильямсона.

В случае, когда подложку покрывают гидрофильным полимером, количество покрытия гидрофильным полимером предпочтительно составляет от 3 мг/г сухого геля до 500 мг/г сухого геля, более предпочтительно от 3 мг/г сухого геля до 350 мг/г сухого геля, еще более предпочтительно от 10 мг/г сухого геля до 300 мг/г сухого геля и даже более предпочтительно от 20 мг/г сухого геля до 240 мг/г сухого геля.

В настоящем описании в некоторых случаях подложку непосредственно перед покрыванием гидрофильным полимером иногда обозначают как «подложка перед покрыванием», и в некоторых случаях продукт, получаемый посредством покрывания такой подложки перед покрыванием гидрофильным полимером, иногда обозначают как «носитель».

[0045] <Введение карбоксигруппы>

В носитель вводят карбоксигруппу.

Способ введения карбоксигруппы в носитель конкретно не ограничен до тех пор, пока он позволяет связывать соединение, имеющее карбоксигруппу, с носителем посредством ковалентной связи. Примеры способа введения карбоксигруппы в носитель включают способ, в котором проводят реакцию носителя с хлоруксусной кислотой в щелочных условиях и карбоксиметильную группу вводят в часть гидроксигрупп на поверхности носителя; и способ, в котором в носитель вводят альдегидную группу, а в альдегидную группу вводят карбоксигруппу посредством восстановительного аминирования через аминогруппу соединения, имеющего карбоксигруппу и аминогруппу, такого как аминокислота.

В случае введения карбоксигруппы в носитель, количество введенной карбоксигруппы составляет от 15 ммоль/л геля до 60 ммоль/л геля, предпочтительно от 15 ммоль/л геля до 55 ммоль/л геля и более предпочтительно от 15 ммоль/л геля до 40 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости.

В настоящем описании в некоторых случаях продукт, получаемый посредством введения карбоксигруппы в носитель, иногда обозначают как «карбоксилированный носитель».

[0046] <Введение аффинного лиганда>

Аффинный лиганд вводят (иммобилизуют) в карбоксилированный носитель.

Способ введения (иммобилизации) аффинного лиганда в карбоксилированный носитель конкретно не ограничен до тех пор, пока он позволяет связывать аффинный лиганд с карбоксилированным носителем посредством ковалентной связи. Примеры способа введения (иммобилизации) аффинного лиганда в карбоксилированный носитель включают способ, в котором часть карбоксигрупп превращают в N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимид (EDC)/N-гидроксисукцинимид (NHS) и проводят их реакцию с аффинным лигандом, таким как белок A, а не прореагировавшую карбоксигруппу, превращенную в EDC/NHS, регенерируют после реакции; и способ, в котором, в случае наличия аминогруппы у аффинного лиганда, такого как белок A, защищают карбоксигруппу, вводят альдегидную группу и затем в альдегидную группу вводят аффинный лиганд посредством восстановительного аминирования через аминогруппу.

В случае, когда аффинный лиганд вводят в карбоксилированный носитель, вводимое количество аффинного лиганда предпочтительно составляет от 0,01 ммоль/л геля до 100 ммоль/л геля, более предпочтительно от 0,05 ммоль/л геля до 50 ммоль/л геля, еще более предпочтительно от 0,10 ммоль/л геля до 10 ммоль/л геля, даже более предпочтительно от 0,10 ммоль/л геля до 2,0 ммоль/л геля, даже более предпочтительно от 0,10 ммоль/л геля до 1,0 ммоль/л геля и даже еще более предпочтительно от 0,10 ммоль/л геля до 0,50 ммоль/л геля.

В случае, когда аффинный лиганд связывают с частью карбоксигрупп карбоксилированного носителя, количество карбоксигрупп, введенных в носитель для аффинной хроматографии, выражают как «количество карбоксигруппы, введенное в карбоксилированный носитель, - количество аффинного лиганда, введенное в носитель для аффинной хроматографии».

[0047] [Способ очистки биологического вещества и биологическое вещество, очищенное тем же способом очистки]

<Биологическое вещество>

Биологическое вещество, подлежащее очистке с помощью носителя для аффинной хроматографии по настоящему изобретению, конкретно не ограничено, но предпочтительно оно представляет собой антитело или производное антитела и более предпочтительно иммуноглобулин G или его производное.

[0048] Антитело относится к иммуноглобулину или его аналогу, фрагменту или слитой конструкции. Здесь аналог относится ко встречающемуся в природе или искусственно сконструированному белку или конъюгату белка, в котором структура или функция иммуноглобулина сохранена по меньшей мере частично. Фрагмент относится к белку, имеющему частичную структуру иммуноглобулина, который конструируют посредством ферментативной обработки или генно-инженерного конструирования. Кроме того, слитая конструкция включает Fc слитые белки (Fc-содержащие молекулы), получаемые посредством слияния области кристаллизующегося фрагмента (Fc), который является константной областью молекулы иммуноглобулина, с другими функциональными белками или пептидами. В настоящем изобретении иммуноглобулин может представлять собой любой из пяти классов (изотипов) -иммуноглобулин G (IgG), иммуноглобулин M (IgM), иммуноглобулин A (IgA), иммуноглобулин D (IgD) и иммуноглобулин E (IgE), но предпочтительно он представляет собой IgG или IgM и более предпочтительно IgG.

[0049] Производное антитела относится к химерному антителу, в котором слиты Fc-область иммуноглобулина человека и Fab-область иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, химерному антителу, в котором слиты несколько Fc-областей иммуноглобулина человека и несколько Fv-областей иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, гуманизированному антителу, в котором слиты остающаяся часть иммуноглобулина человека, за исключением части определяющей комплементарность области (CDR), и часть CDR иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, химерному антителу, в котором слиты Fc-область иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, и фрагмент антигенсвязывающая область (Fab) иммуноглобулина человека, химерному антителу, в котором слиты несколько Fc-областей иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, и несколько Fv-областей иммуноглобулина человека, антителу млекопитающего, не относящегося к человеку, в котором слиты остающаяся часть, за исключением части CDR иммуноглобулина человека, и часть CDR иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, химерному антителу в котором слиты Fc-область иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, и Fab-область иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, химерному антителу, в котором слиты несколько Fc-областей иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, и несколько Fv-областей иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, антителу млекопитающего, не относящегося к человеку, в котором слиты остающаяся часть, за исключением части определяющей комплементарность области (CDR), иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, и часть CDR иммуноглобулина млекопитающего, не относящегося к человеку, или его химически модифицированному белку, который сохраняет Fc-область.

Эти белки антител используют в качестве сырья для антительных лекарственных средств.

[0050] <Способ очистки>

Далее в настоящем описании, в качестве примера приведено подробное описание способа очистки с использованием носителя для аффинной хроматографии по настоящему изобретению для случая, когда биологическим веществом является иммуноглобулин G, но настоящее изобретение не ограничено этим.

[0051] Очистка биологического вещества (в частности, антитела) с использованием носителя для аффинной хроматографии, главным образом, включает четыре стадии - стадию адсорбции, стадию промывания, стадию корректировки ионной силы и стадию элюирования, и может включать последующие стадии для повторного использования, такие как стадия регенерации и/или стадия очистки на месте (CIP) и стадия повторного уравновешивания.

[0052] На стадии адсорбции можно использовать общий способ очистки аффинной хроматографией. То есть, в одном из примеров, pH раствора белка, содержащего иммуноглобулин G, корректируют до почти нейтрального pH и затем раствор пропускают через колонку, набитую носителем для аффинной хроматографии по настоящему изобретению с тем, чтобы специфически адсорбировать иммуноглобулин G на носителе для аффинной хроматографии через аффинный лиганд. Например, в случае, когда белок A используют в качестве аффинного лиганда, pH при загрузке, то есть pH во время добавления биологического вещества, предпочтительно составляет от 5,0 до 9,0, более предпочтительно от 5,3 до 9,0, еще более предпочтительно от 5,5 до 9,0 и даже более предпочтительно от 6,0 до 8,5. При очистке иммуноглобулина G, продуцируемого культивируемыми клетками млекопитающих, нет необходимости специфически корректировать ионную силу и также возможно дополнительно подавлять неспецифическую адсорбцию посредством предварительного увеличения ионной силы.

[0053] На стадии промывания подходящему количеству буферного раствора в диапазоне условий, при которых аффинный лиганд функционирует, позволяют проходить с тем, чтобы промывать внутреннюю часть колонки. То есть, предпочтительный диапазон pH может представлять собой тот же диапазон, что и во время загрузки. Например, предпочтительно он представляет собой pH от 5,0 до 9,0. В этой точке происходит адсорбция иммуноглобулина G на носителе для аффинной хроматографии по настоящему изобретению. В этом случае загрязнения можно эффективно удалять посредством оптимизации ионной силы и композиции при pH, близком к нейтральному. Предпочтительно, чтобы карбоксигруппа не функционировала во время промывания, то есть, предпочтительно использовать промывающий раствор, который имеет определенную ионную силу или выше при pH, близком к нейтральному, и в этом процессе возможно вымывать загрязнения, неспецифически остающиеся в колонке, из носителя для аффинной хроматографии и/или иммуноглобулина G. Ионная сила составляет, например, предпочтительно 0,2 M или больше и более предпочтительно 0,5 M или больше.

[0054] На стадии корректировки ионной силы колонку заменяют на буферный раствор, имеющий низкую ионную силу около нейтральности, чтобы подготовиться к проявлению карбоксигруппой функции элюирования, зависящей от ионной силы, во время элюирования.

[0055] На стадии элюирования комбинация кислого pH и ионной силы позволяет функционировать в режиме катионообменного разделения во время элюирования с аффинного лиганда и, следовательно, фракцию, имеющую высокое содержание мономеров, можно извлекать во фракции элюирования с низкой ионной силой посредством согласованного действия обоих лигандов. Что касается pH элюата, можно применять pH во время элюирования иммуноглобулина G с аффинного лиганда. Поскольку этот pH определяют преимущественно условия разделения, определяемые носителем для аффинной хроматографии и типом иммуноглобулина G, нет необходимости задавать конкретные условия.

[0056] В случае, когда белок A используют в качестве аффинного лиганда, во время элюирования предпочтительно задают pH от 2,0 до 5,0. Однако во избежание кислотной денатурации биологического вещества, pH представляет собой более предпочтительно pH 2,8 или больше, еще более предпочтительно pH 3,0 или больше и даже более предпочтительно pH 3,2 или больше. pH предпочтительно составляет 5,0 или меньше и более предпочтительно 4,8 или меньше.

[0057] В случае, когда щелочеустойчивый белок A используют в качестве аффинного лиганда, pH во время элюирования в целом задают предпочтительно от 3,5 до 4,0, но он не ограничен этим. Кроме того, ионная сила при элюировании зависит от соотношения введения аффинного лиганда и карбоксигруппы, а также зависит от загружаемого количества иммуноглобулина G на единицу объема, но их оптимальную точку легко устанавливать с помощью градиентного эксперимента или эксперимента ступенчатого растворения.

[0058] Элюирование антитела из носителя для аффинной хроматографии, получаемого в соответствии с настоящим изобретением, можно применять посредством элюирования в градиенте концентрации соли или ступенчатого элюирования, но в случае стремления снижать количество элюата, предпочтительным является ступенчатое элюирование с помощью ионной силы. Кроме того, чтобы упрощать работу, предпочтительно задавать условия, которые позволяют достигать извлечения и высокой чистоты очистки антител посредством одноэтапного элюирования.

[0059] Даже при использовании комбинации ионной силы и кислого pH на стадии промывания, в случае, когда агрегат остается в колонке и не встраивается в элюированную фракцию, стадию корректировки ионной силы можно пропускать.

[0060] <Очищенное биологическое вещество>

Биологическое вещество, очищенное в соответствии со способом очистки по настоящему изобретению, в частности, антитело или производное антитела, демонстрирует повышенную чистоту очистки, несмотря на то, что структура и свойства биологического вещества не меняются до и после его очистки. Однако поскольку чистота очистки зависит от раствора или тому подобного перед очисткой, невозможно сказать безусловно, насколько высока чистота очистки.

[0061] Иммуноглобулин G, очищенный с использованием носителя для аффинной хроматографии, полученного в соответствии с настоящим изобретением, демонстрирует более высокую избирательность мономеров, чем носитель для аффинной хроматографии на основе режима одного разделения, и высокое содержание мономеров в элюате.

[0062] Даже в случае, когда используют носитель для аффинной хроматографии на основании режима одного разделения, возможно увеличивать содержание мономеров в определенной степени посредством оптимизации pH и ионной силы во время элюирования, но такой эффект мал и ему сопутствует более значительное снижение степени излечения для проявления эффекта. Используя носитель для аффинной хроматографии по настоящему изобретению, поскольку аффинной очистки с высокой специфичностью и усовершенствованием содержания мономеров, которые можно достичь преимущественно посредством катионообменной хроматографии, можно достичь с эффективностью в одной хроматографической операции, при этом сохраняя высокую степень излечения, возможно снижать нагрузку на последующие процессы, что, следовательно, может вносить вклад в усовершенствование выхода для всего процесса и усовершенствование содержания мономеров. То есть, использование нового носителя для аффинной хроматографии по настоящему изобретению может вносить вклад в усовершенствование производительности и очистки в процессе получения антительного лекарственного средства.

Примеры

[0063] Далее в настоящем описании настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры, но настоящее изобретение не ограничено этим.

[0064] [Способ измерения и способ оценки]

1. Способ измерения количества покрытия гидрофильным полимером

5 г влажного геля подложки перед покрыванием сушили при 50°C и пониженном давлении до тех пор, пока не исчезало изменение массы, и измеряли его массу, и получаемое числовое значение от произведения таким образом измеренной массы и массы влажного геля подложки перед покрыванием, использованного для реакции покрывания гидрофильным полимером, брали в качестве сухой массы подложки перед покрыванием. Затем 5 г влажного геля носителя, полученного посредством покрывания подложки перед покрыванием с использованием гидрофильного полимера, сушили при 50°C при пониженном давлении до тех пор, пока не исчезало изменение массы, и измеряли его массу, и получаемое числовое значение от произведения таким образом измеренной массы и массы влажного геля носителя, полученного после реакции покрывания гидрофильным полимером, брали в качестве сухой массы носителя. Разность между сухой массой носителя и сухой массой подложки перед покрыванием брали в качестве сухой массы гидрофильного полимера, покрывающего подложку перед покрыванием. Количество покрытия гидрофильным полимером вычисляли в качестве сухой массы гидрофильного полимера на сухую массу подложки перед покрыванием.

[0065] 2. Способ измерения вводимого количества карбоксигруппы

1 г карбоксилированного носителя суспендировали в 3 мл чистой воды, получаемую суспензию выливали в одноразовую колонку, имеющую внутренний диаметр 15 мм, и растворитель удаляли посредством аспирационного фильтрования. За этим следовало промывание 4 раза в 3 мл 0,2 моль/л соляной кислоты и затем повторное промывание в 4 мл чистой воды. После промывания измеряли высоту слоя (часть носителя, осажденного на колонке) для того, чтобы вычислять объем карбоксилированного носителя. Карбоксилированный носитель вынимали, переносили в 100 мл стакан, суспендировали в 40 мл солевого раствора 0,1 моль/л и титровали с использованием водного раствора гидроксида натрия 0,1 моль/л, используя автоматический титратор «COM-1600» (производства Hiranuma Sangyo Co., Ltd.). Ионообменную емкость (мг экв./л геля) на 1 л карбоксилированного носителя вычисляли по количеству титровального раствора вплоть до конечной точки. Кроме того, единицы преобразовывали в «ммоль/л геля» (1 мг экв./л геля=1 ммоль/л геля). Вводимое количество карбоксигруппы выражали в отношении ионообменной емкости.

[0066] 3. Способ измерения вводимого количества аффинного лиганда (количества иммобилизованного белка A)

Каждый из раствора белка A, реакционного раствора и промывающего раствора после реакции иммобилизации белка A подвергали гельфильтрационной хроматографии (которая описана далее) и вычисляли количество белка A, содержащееся в каждом растворе по значению площади поверхности пика поглощения при 280 нм.

Количество иммобилизованного белка A вычисляли по разности между вычисленным таким образом количеством белка A и количеством белка A, содержащимся в растворе белка A, реакционном растворе и промывающем растворе перед реакцией иммобилизации белка A.

(Условия гельфильтрационной хроматографии)

Хроматографическая система: AKTA avant 25 (производства GE Healthcare GmbH) («AKTAavant» представляет собой зарегистрированный товарный знак)

Колонка: обессоливающая колонка «HiTrap Desalting» (производства GE Healthcare GmbH) («HITRAP» представляет собой зарегистрированный товарный знак)

Буфер: 20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4

Скорость потока: 3 мл/мин

[0067] 4. Способ оценки емкости адсорбции антител

(1) Измерение емкости адсорбции антител

1 мл носителя для аффинной хроматографии, полученного в примерах, хроматографического носителя, полученного в сравнительных примерах, или коммерчески доступного хроматографического носителя набивали в стеклянную колонку «колонка TRICORN 10/20» (производства GE Healthcare GmbH) («TRICORN» представляет собой зарегистрированный товарный знак), которые затем соединяли с хроматографической системой «AKTA avant 25» (производства GE Healthcare GmbH) («AKTAavant» представляет собой зарегистрированный товарный знак), после чего следовало измерение емкости адсорбции антител.

[0068] После уравновешивания колонки с использованием раствора для уравновешивания (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4), 15 мл раствора, полученного посредством корректировки антитела IgG человека (иммуноглобулина G) до 5 мг/мл стандартным буфером (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4), добавляли в нее при скорости потока 0,42 мл/мин. После промывания колонки с использованием 5 мл раствора для промывания после загрузки (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4) при той же скорости потока, 5 мл раствора для промывания перед элюированием (20 мМ фосфатный буфер, 1 M NaCl, pH 7,4) оставляли протекать при той же скорости потока. После этого, 5 мл элюента (100 мМ цитратный буфер, 150 мМ NaCl, pH 3,2) оставляли протекать при той же скорости потока. Кроме того, непрерывно 5 мл раствора для очистки на месте (CIP) (0,1 M водный раствор гидроксида натрия) оставляли протекать при той же скорости потока и затем 5 мл раствора для повторного уравновешивания (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4) оставляли протекать при той же скорости потока. В этот момент количество элюированного антитела в элюате в каждой фракции вычисляли по пику элюирования IgG, полученному посредством мониторинга поглощения при 280 нм. Количество антител, элюированных из раствора для промывания перед элюированием в CIP раствор, вычисляли как емкость адсорбции антител.

[0069] (2) Оценка емкости адсорбции антител

Емкость адсорбции антител оценивали на основании емкости адсорбции антител в случае, когда вводили только карбоксигруппу и белок A, в соответствии со следующими стандартами оценки. То есть, емкость адсорбции антител оценивали на основании сравнительного примера 4 для примеров с 1 до 7, сравнительных примеров с 1 до 6 и 8 и эталонного примера 1 (примеры, сравнительные примеры и эталонный пример, в которых подложка представляла собой полисахарид) и на основании сравнительного примера 7 для примера 8 и сравнительного примера 7 (пример и сравнительный пример, в которых подложка представляет собой полимер на основе метакрилата), соответственно.

Емкость адсорбции антител составляет 40% или больше от стандарта Оценка емкости адсорбции антител «A»

Емкость адсорбции антител составляет меньше чем 40% от стандарта Оценка емкости адсорбции антител «C»

[0070] 5. Способ оценки чистоты очистки

(1) Вычисление очищенной чистоты

1 мл носителя для аффинной хроматографии, полученного в примерах или сравнительных примерах, или коммерчески доступного хроматографического носителя набивали в стеклянную колонку «колонка TRICORN 10/20» (производства GE Healthcare GmbH) («TRICORN» представляет собой зарегистрированный товарный знак), которую затем соединяли с хроматографической системой «AKTA avant 25» (производства GE Healthcare GmbH) («AKTAavant» представляет собой зарегистрированный товарный знак), после чего следовало измерение количества белка клетки-хозяина (HCP) и количества иммуноглобулина G (IgG), элюированных из каждой фракции.

[0071] После уравновешивания колонки с использованием раствора для уравновешивания (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4), смешанный раствор IgG/HCP, полученный с использованием стандартного буфера (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4) с тем, чтобы IgG и HCP, происходящий из клеток яичника китайского хомячка S (CHO-S), составляли 1,6 мг/мл и 0,32 мг/мл, соответственно, добавляли при скорости потока 0,21 мл/мин так, что загружали количество антитела 80% емкости адсорбции антител, полученной выше (1). После промывания колонки с использованием 5 мл раствора для промывания после загрузки (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4) при скорости потока 0,42 мл/мин, 5 мл раствора для промывания перед элюированием (20 мМ фосфатный буфер, 1 M NaCl, pH 7,4) оставляли протекать при той же скорости потока. После этого, 5 мл элюента (100 мМ цитратный буфер, 150 мМ NaCl, pH 3,2) оставляли протекать при той же скорости потока. Кроме того, непрерывно 5 мл CIP раствора (0,1 M водный раствор гидроксида натрия) оставляли протекать при той же скорости потока и затем 5 мл раствора для повторного уравновешивания (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4) оставляли протекать при той же скорости потока. В этот момент количество элюированного IgG в элюате в каждой фракции вычисляли по пику элюирования IgG, полученному посредством мониторинга поглощения при 280 нм. Извлекали элюат каждой фракции и вычисляли количество HCP в элюате в каждой фракции с помощью ELISA, используя набор для обнаружения белка клетки-хозяина «CHO HCP 3rd Generation ELISA kit» (производства Cygnus Technologies, Inc.).

[0072] Используя вычисленное таким образом количество IgG и количество HCP в элюате, чистоту очистки вычисляли в соответствии со следующим уравнением в отношении количества включенного HCP в элюат, то есть количества HCP на количество IgG в элюате.

Чистота очистки (ч./млн)=количество включенного HCP (ч./млн)=количество HCP в элюате/количество IgG в элюате

[0073] (2) Оценка чистоты очистки

Чистоту очистки оценивали на основании количества включенного HCP (ч./млн) в случае, когда вводили только карбоксигруппу и белок A, в соответствии со следующими стандартами оценки. То есть, количество включенного HCP оценивали на основании сравнительного примера 4 для примеров с 1 до 7, сравнительных примеров с 1 до 6 и 8 и эталонного примера 1 (примеры, сравнительные примеры и эталонный пример, в которых подложка представляла собой полисахарид), и на основании сравнительного примера 7 для примера 8 и сравнительного примера 7 (пример и сравнительный пример, в которых подложка представляет собой полимер на основе метакрилата), соответственно.

Количество включенного HCP (ч./млн) снижалось на 20% или больше Оценка чистоты очистки «A»

Количество включенного HCP (ч./млн) снижалось больше чем на 0% и меньше чем 20% Оценка чистоты очистки «B»

Количество включенного HCP (ч./млн) не снижалось Оценка чистоты очистки «C»

[0074] [Пример 1]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

(1) Получение влажного геля

Сшитую подложку на основе агарозы Sepharose 6 Fast Flow (производства GE Healthcare GmbH) («SEPHAROSE» представляет собой зарегистрированный товарный знак) промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды, тем самым получая взвесь подложки. Чистую воду удаляли из взвеси подложки посредством аспирационного фильтрования для получения влажного геля.

В колонке «Подложка» таблицы 1 «Sepharose 6 FF» относится к «Sepharose 6 Fast Flow».

[0075] (2) Получение подложки перед покрыванием - введение эпоксигруппы

100 г полученного влажного геля, 152 мл чистой воды и 50 г хлорметилоксирана помещали в 500 мл трехгорлую колбу и перемешивание содержимого колбы начинали в теплой ванне при 45°C. Перемешивание осуществляли до тех пор, пока температура в колбе не достигала 45°C. 41 г 50% (масс./масс.) водного раствора гидроксида натрия добавляли по каплям в колбу в течение 2 ч в теплой ванне при 45°C, при этом поддерживая температуру в колбе приблизительно на 45°C. После добавления всего количества водного раствора гидроксида натрия по каплям, реакция в смеси дополнительно протекала в течение 1 часа, и ее промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды для получения влажного геля подложки перед покрыванием.

[0076] (3) Получение носителя - покрывание гидрофильным полимером

13 г декстрана 70 (собственная вязкость: 0,23 дл/г; средневесовая молекулярная масса: приблизительно 70000) и 154 мл чистой воды помещали в 500 мл трехгорлую колбу и перемешивание содержимого колбы начинали при комнатной температуре. Перемешивание осуществляли до полного растворения декстрана 70. После растворения, 90 г влажного геля подложки перед покрыванием добавляли в трехгорлую колбу, которую затем дополнительно перемешивали при комнатной температуре. После того, как смешанный раствор в трехгорлой колбе становился гомогенным, в нее добавляли 4,2 г 50% (масс./масс.) водного раствора гидроксида натрия. После добавления водного раствора гидроксида натрия, реакция в смешанном растворе протекала при комнатной температуре в течение 16 часов, и его промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды для получения влажного геля носителя.

[0077] Кроме того, количество покрытия декстраном в получаемом носителе измеряли в соответствии с разделом «Способ измерения количества покрытия гидрофильным полимером», который описан выше. Получаемое количество покрытия гидрофильным полимером представлено в колонке «Количество покрытия гидрофильным полимером» таблицы 1.

[0078] (4) Получение карбоксилированного носителя - введение карбоксигруппы

12 г влажного геля полученного носителя, 6,2 г хлорацетата натрия и 24 мл чистой воды помещали в 100 мл трехгорлую колбу и перемешивание содержимого колбы начинали в теплой ванне при 50°C. Перемешивание осуществляли до полного растворения хлорацетата натрия. После растворения, 8,8 г 50% (масс./масс.) водного раствора гидроксида натрия добавляли по каплям в течение 1 ч в теплой ванне при 50°C, при этом поддерживая температуру в колбе приблизительно на 50°C. После добавления всего количества водного раствора гидроксида натрия по каплям, реакция в смеси дополнительно протекала в течение 3 часов, и ее промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды для получения влажного геля карбоксилированного носителя.

[0079] Кроме того, вводимое количество карбоксигруппы получаемого карбоксилированного носителя измеряли в соответствии с разделом «Способ измерения вводимого количества карбоксигруппы», который описан выше. Получаемое вводимое количество карбоксигруппы представлено в колонке «Вводимое количество карбоксигруппы» таблицы 1.

Количество карбоксигруппы, которое вводили в носитель для аффинной хроматографии, выражали в отношении «вводимого количества карбоксигруппы карбоксилированного носителя - вводимого количества аффинного лиганда».

[0080] (5) Получение карбоксилированного носителя с иммобилизованным белком A - введение аффинного лиганда

Полученный карбоксилированный носитель помещали в одноразовую колонку в количестве 2,5 мл в виде влажного объема и промывали посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды для получения взвеси носителя. Чистую воду удаляли из взвеси носителя посредством аспирационного фильтрования для получения влажного геля.

В реакционный сосуд помещали 2,0 г полученного влажного геля и в него добавляли 2 мл раствора N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC). Смесь перемешивали с переворачиванием реакционного сосуда при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого, 2 мл раствора N-гидроксисукцинимида (NHS) добавляли в реакционный сосуд, который затем перемешивали с его переворачиванием при комнатной температуре в течение 30 минут. Здесь раствор EDC получали посредством растворения 0,2 г EDC в 2 мл диметилсульфоксида (DMSO) и раствор NHS получали посредством растворения 0,2 г NHS в 2 мл DMSO.

Реакционный гелевый раствор переносили в одноразовую колонку и промывали в 6 мл ледяной 1 мМ соляной кислоты для получения EDC/NHS-активированного карбоксилированного носителя.

[0081] 1,5 г полученного EDC/NHS-активированного карбоксилированного носителя помещали в реакционный сосуд, после чего следовало добавление в реакционный сосуд 1,5 мл раствора белка A 10 мг/мл и встряхивание при 25°C в течение 2 часов. Раствор белка A 10 мг/мл получали посредством растворения рекомбинантного нативного белка A «rSPA» (производства Repligen Corporation) в 20 мМ буфере 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (pH 4,5).

Растворитель заменяли на 1 M водный раствор хлорида натрия и 0,5 M водный раствор этаноламина, после чего следовало промывание для получения карбоксилированного носителя с иммобилизованным белком A.

[0082] Кроме того, количество иммобилизованного белка A (вводимое количество аффинного лиганда) в карбоксилированном носителе с иммобилизованным белком A, полученном таким образом, измеряли в соответствии с разделом «Способ измерения вводимого количества аффинного лиганда (количества иммобилизованного белка A)», который описан выше. Количество иммобилизованного белка A, полученное таким образом, представлено в колонке «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1.

[0083] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0084] [Пример 2]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 1, за исключением того, что используемое количество хлорацетата натрия меняли с 6,2 г на 3,6 г во время получения карбоксилированного носителя (введение карбоксигруппы).

Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером, вводимое количество карбоксигруппы и вводимое количество аффинного лиганда измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером», «Вводимое количество карбоксигруппы и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0085] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0086] [Пример 3]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 1, за исключением того, что используемое количество хлорацетата натрия меняли с 6,2 г на 11,7 г во время получения карбоксилированного носителя (введение карбоксигруппы).

Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером, вводимое количество карбоксигруппы и вводимое количество аффинного лиганда измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером», «Вводимое количество карбоксигруппы и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0087] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0088] [Пример 4]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 1, за исключением того, что используемое количество декстрана 70 (собственная вязкость: 0,23 дл/г; средневесовая молекулярная масса: приблизительно 70000) меняли с 13 г на 66 г во время получения носителя (покрывание гидрофильным полимером), и используемое количество хлорацетата натрия меняли с 6,2 г на 2,0 г во время получения карбоксилированного носителя (введение карбоксигруппы).

Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером, вводимое количество карбоксигруппы и вводимое количество аффинного лиганда измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером», «Вводимое количество карбоксигруппы и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0089] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0090] [Пример 5]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 4, за исключением того, что сшитую подложку на основе агарозы меняли на «Sepharose 4 Fast Flow» (производства GE Healthcare GmbH) («SEPHAROSE» представляет собой зарегистрированный товарный знак) во время получения влажного геля и используемое количество хлорацетата натрия меняли с 2,0 г на 3,9 г во время получения карбоксилированного носителя (введение карбоксигруппы).

В колонке «Подложка» таблицы 1 «Sepharose 4 FF» относится к «Sepharose 4 Fast Flow».

Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером, вводимое количество карбоксигруппы и вводимое количество аффинного лиганда измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером», «Вводимое количество карбоксигруппы и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0091] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0092] [Пример 6]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 5, за исключением того, что декстран 40 (собственная вязкость: 0,17 дл/г; средневесовая молекулярная масса: приблизительно 40000) использовали вместо декстрана 70 (собственная вязкость: 0,23 дл/г; средневесовая молекулярная масса: приблизительно 70000) во время получения носителя (покрывание гидрофильным полимером) и используемое количество хлорацетата натрия меняли с 3,9 г на 4,5 г во время получения карбоксилированного носителя (введение карбоксигруппы).

Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером, вводимое количество карбоксигруппы и вводимое количество аффинного лиганда измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером», «Вводимое количество карбоксигруппы и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0093] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0094] [Пример 7]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 5, за исключением того, что декстран 19 (собственная вязкость: 0,12 дл/г; средневесовая молекулярная масса: приблизительно 19000) использовали вместо декстрана 70 (собственная вязкость: 0,23 дл/г; средневесовая молекулярная масса: приблизительно 70000) во время получения носителя (покрывание гидрофильным полимером) и используемое количество хлорацетата натрия меняли с 3,9 г на 5,7 г во время получения карбоксилированного носителя (введение карбоксигруппы).

Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером, вводимое количество карбоксигруппы и вводимое количество аффинного лиганда измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером», «Вводимое количество карбоксигруппы и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0095] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0096] [Пример 8]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

(1) Получение влажного геля

Пористую подложку на основе метакрилата, «TOYOPEARL HW-65F (производства Tosoh Corporation) («TOYOPEARL» представляет собой зарегистрированный товарный знак) промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды, тем самым получая взвесь подложки. Чистую воду удаляли из взвеси подложки посредством аспирационного фильтрования для получения влажного геля.

[0097] (2) Получение подложки перед покрыванием - введение эпоксигруппы

100 г полученного влажного геля, 152 мл чистой воды и 50 г хлорметилоксирана помещали в 500 мл трехгорлую колбу и перемешивание содержимого колбы начинали в теплой ванне при 45°C. Перемешивание осуществляли до тех пор, пока температура в колбе не достигала 45°C. В колбу по каплям добавляли 41 г 50% (масс./масс.) водного раствора гидроксида натрия в течение 2 ч в теплой ванне при 45°C, при этом поддерживая температуру в колбе приблизительно на 45°C. После добавления всего количества водного раствора гидроксида натрия по каплям, реакция в смеси дополнительно протекала в течение 1 часа, и ее промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды для получения влажного геля. Посредством повторения этой реакции три раза, получали влажный гель подложки перед покрыванием.

[0098] (3) Получение носителя - покрывание гидрофильным полимером

Влажный гель носителя получали аналогичным образом, как в примере 1, за исключением того, что 126 г декстрана 40 (собственная вязкость: 0,17 дл/г; средневесовая молекулярная масса: приблизительно 40000) использовали вместо 13 г декстрана 70 (собственная вязкость: 0,23 дл/г; средневесовая молекулярная масса: приблизительно 70000).

Кроме того, количество покрытия декстраном в получаемом носителе измеряли аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделом «Способ измерения количества покрытия гидрофильным полимером», который описан выше. Полученное количество покрытия гидрофильным полимером представлено в колонке «Количество покрытия гидрофильным полимером» таблицы 1.

[0099] (4) Получение карбоксилированного носителя - введение карбоксигруппы

Влажный гель карбоксилированного носителя получали аналогичным образом, как в примере 1, за исключением того, что используемое количество хлорацетата натрия меняли с 6,2 г на 3,4 г.

Кроме того, вводимое количество карбоксигруппы в получаемом карбоксилированном носителе измеряли аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделом «Способ измерения вводимого количества карбоксигруппы», который описан выше. Полученное вводимое количество карбоксигруппы представлено в колонке «Вводимое количество карбоксигруппы» таблицы 1.

[0100] (5) Получение карбоксилированного носителя с иммобилизованным белком A - введение аффинного лиганда

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 1.

Кроме того, количество иммобилизованного белка A карбоксилированного носителя с иммобилизованным белком A, полученного таким образом, измеряли аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделом «Способ измерения вводимого количества аффинного лиганда (количества иммобилизованного белка A)», который описан выше. Количество иммобилизованного белка A, полученное таким образом, представлено в колонке «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1.

[0101] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0102] [Сравнительный пример 1]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 1, за исключением того, что используемое количество хлорацетата натрия меняли с 6,2 г на 1,8 г во время получения карбоксилированного носителя (введение карбоксигруппы).

Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером, вводимое количество карбоксигруппы и вводимое количество аффинного лиганда измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером», «Вводимое количество карбоксигруппы и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0103] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0104] [Сравнительный пример 2]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 1, за исключением того, что используемое количество хлорацетата натрия меняли с 6,2 г на 22,7 г во время получения карбоксилированного носителя (введение карбоксигруппы).

Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером, вводимое количество карбоксигруппы и вводимое количество аффинного лиганда измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером», «Вводимое количество карбоксигруппы и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0105] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0106] [Сравнительный пример 3]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

(1) Получение носителя - покрывание гидрофильным полимером

Влажный гель носителя получали аналогичным образом, как в примере 1. Кроме того, количество покрытия декстраном в получаемом носителе измеряли аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделом «Способ измерения количества покрытия гидрофильным полимером», который описан выше. Полученное количество покрытия гидрофильным полимером представлено в колонке «Количество покрытия гидрофильным полимером» таблицы 1.

(2) Получение носителя с иммобилизованным белком A - введение аффинного лиганда

Получаемый носитель помещали в одноразовую колонку в количестве 4 мл в виде влажного объема и промывали посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды для получения взвеси носителя. Чистую воду удаляли из взвеси носителя посредством аспирационного фильтрования для получения влажного геля.

Полученный влажный гель помещали в реакционный сосуд и объем взвеси корректировали до 5 мл чистой водой. Затем в него добавляли 1 мл 250 мМ натрий-цитратного буфера (pH 3,5). Кроме того, добавляли 2 мл 160 мМ водного раствора перйодата натрия, после чего следовало перемешивание с переворачиванием реакционного сосуда при комнатной температуре в течение 0,5 ч, промывание посредством повторного суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды и фосфатного буфера на фильтре и удаление чистой воды или фосфатного буфера посредством аспирационного фильтрования для получения влажного геля носителя со введенной альдегидной группой.

В реакционный сосуд помещали 1,5 г влажного геля полученного носителя со введенной альдегидной группой и в реакционный сосуд добавляли 3 мл раствора белка A 20 мг/мл, после чего следовало перемешивание с переворачиванием реакционного сосуда при комнатной температуре в течение 2 часов. Раствор белка A 20 мг/мл получали посредством растворения рекомбинантного нативного белка A «rSPA» (производства Repligen Corporation) в 200 мМ буфер 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (pH 7,4).

Впоследствии 11 мг триэтиламиноборана добавляли в реакционный сосуд, который затем встряхивали при 25°C в течение 16 часов. Растворитель заменяли на 200 мМ буфер MES (pH 7,4), после чего следовало промывание. После удаления промывающего раствора, в реакционный сосуд добавляли 3 мл 20 мМ буфера Tris-HCl и 11 мг триэтиламиноборана, после чего следовало перемешивание с переворачиванием реакционного сосуда при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель заменяли на чистую воду и 1 M водный раствор хлорида натрия, после чего следовало промывание для получения носителя с иммобилизованным белком A.

Кроме того, количество иммобилизованного белка A (вводимое количество аффинного лиганда) в носителе с иммобилизованным белком A, полученным таким образом, измеряли в соответствии с разделом «Способ измерения вводимого количества аффинного лиганда (количества иммобилизованного белка A)», который описан выше. Количество иммобилизованного белка A, полученное таким образом, представлено в колонке «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1.

[0107] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0108] [Сравнительный пример 4]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Сшитую подложку на основе агарозы Sepharose 6 Fast Flow (производства GE Healthcare GmbH) промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды, тем самым получая взвесь подложки. Чистую воду удаляли из взвеси подложки посредством аспирационного фильтрования для получения влажного геля.

12 г полученного влажного геля, 4,7 г хлорацетата натрия и 24 мл чистой воды помещали в 100 мл трехгорлую колбу и перемешивание содержимого колбы начинали в теплой ванне при 50°C. Перемешивание осуществляли до полного растворения хлорацетата натрия. После растворения, 8,8 г 50% (масс./масс.) водного раствора гидроксида натрия добавляли по каплям в течение 1 ч в теплой ванне при 50°C, при этом поддерживая температуру в колбе приблизительно на 50°C. После добавления всего количества водного раствора гидроксида натрия по каплям, реакция в смеси дополнительно протекала в течение 3 часов, и ее промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды для получения влажного геля карбоксилированного носителя.

Используя полученный карбоксилированный носитель, карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 1.

Кроме того, вводимое количество карбоксигруппы карбоксилированного носителя и вводимое количество белка A карбоксилированного носителя с иммобилизованным белком A измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Вводимое количество карбоксигруппы» и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0109] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0110] [Сравнительный пример 5]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в сравнительном примере 4, за исключением того, что сшитую подложку на основе агарозы меняли на «Sepharose 4 Fast Flow» (производства GE Healthcare GmbH) во время получения влажного геля, и используемое количество хлорацетата натрия меняли с 4,7 г на 9,3 г во время получения карбоксилированного носителя.

Кроме того, вводимое количество карбоксигруппы карбоксилированного носителя и вводимое количество белка A карбоксилированного носителя с иммобилизованным белком A измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Вводимое количество карбоксигруппы» и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0111] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0112] [Сравнительный пример 6]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

В качестве носителя для аффинной хроматографии получали носитель со введенным белком A «MabSelect SuRe» (производства GE Healthcare GmbH) («MABSELECT» представляет собой зарегистрированный товарный знак).

[0113] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя носитель со введенным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0114] [Сравнительный пример 7]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Пористую подложку на основе метакрилата, «TOYOPEARL HW-65F (производства Tosoh Corporation) («TOYOPEARL» представляет собой зарегистрированный товарный знак) промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды, тем самым получая взвесь подложки. Чистую воду удаляли из взвеси подложки посредством аспирационного фильтрования для получения влажного геля.

12 г полученного влажного геля, 3,8 г хлорацетата натрия и 24 мл чистой воды помещали в 100 мл трехгорлую колбу и перемешивание содержимого колбы начинали в теплой ванне при 50°C. Перемешивание осуществляли до полного растворения хлорацетата натрия. После растворения, 8,8 г 50% (масс./масс.) водного раствора гидроксида натрия добавляли по каплям в течение 1 ч в теплой ванне при 50°C, при этом поддерживая температуру в колбе приблизительно на 50°C. После добавления всего количества водного раствора гидроксида натрия по каплям, реакция в смеси дополнительно протекала в течение 3 часов, и ее промывали на стеклянном фильтре посредством повторения суспендирования и фильтрования с использованием чистой воды для получения влажного геля карбоксилированного носителя.

Используя полученный карбоксилированный носитель, карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A получали аналогичным образом, как в примере 1.

[0115] Кроме того, вводимое количество карбоксигруппы карбоксилированного носителя и вводимое количество белка A карбоксилированного носителя с иммобилизованным белком A измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Вводимое количество карбоксигруппы» и «Вводимое количество аффинного лиганда» таблицы 1, соответственно.

[0116] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель с иммобилизованным белком A, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0117] [Сравнительный пример 8]

1. Получение носителя для аффинной хроматографии

Влажный гель карбоксилированного носителя получали аналогичным образом, как в примере 1.

Полученный влажный гель использовали в качестве носителя для аффинной хроматографии.

[0118] Кроме того, количество покрытия гидрофильным полимером и вводимое количество карбоксигруппы измеряли аналогичным образом, как в примере 1. Результаты измерений представлены в колонках «Количество покрытия гидрофильным полимером» и «Вводимое количество карбоксигруппы» таблицы 1, соответственно.

[0119] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя карбоксилированный носитель, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали аналогичным образом, как в примере 1, в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны выше. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0120] [Эталонный пример 1]

1. Получение хроматографического носителя

В качестве хроматографического носителя получали носитель со введенной сульфоксигруппой «CELLUFINE MAX S-r» (производства JNC Corporation) («CELLUFINE» представляет собой зарегистрированный товарный знак).

[0121] 2. Оценка емкости адсорбции антител и чистоты очистки

Используя носитель со введенной сульфоксигруппой, полученный таким образом, емкость адсорбции антител и чистоту очистки оценивали в соответствии с разделами «Способ оценки емкости адсорбции антител» и «Способ оценки чистоты очистки», которые описаны. Результаты оценки емкости адсорбции антител и чистоты очистки представлены в колонках «Емкость адсорбции антител (оценка)» и «Чистота очистки (оценка)» таблицы 1, соответственно.

[0122] 3. Измерение вводимого количества сульфоксигруппы

Кроме того, вводимое количество сульфоксигруппы измеряли в соответствии с разделом «Способ измерения вводимого количества карбоксигруппы», который описан выше, и вводимое количество сульфоксигруппы, измеряемое таким образом, составляло 150 ммоль/л геля.

[0123] 4. Способ оценки емкости адсорбции антител

1 мл коммерчески доступного хроматографического носителя набивали в стеклянную колонку «колонка TRICORN 10/20» (производства GE Healthcare GmbH) («TRICORN» представляет собой зарегистрированный товарный знак), которую затем соединяли с хроматографической системой «AKTA avant 25» (производства GE Healthcare GmbH) («AKTAavant» представляет собой зарегистрированный товарный знак), после чего следовало измерение емкости адсорбции антител.

После уравновешивания колонки с использованием раствора для уравновешивания (10 мМ ацетатный буфер, pH 4,7), в нее добавляли 30 мл раствора, полученного посредством корректировки антитела IgG человека (иммуноглобулина G) до 5 мг/мл с использованием стандартного буфера (10 мМ ацетатный буфер, pH 4,7), при скорости потока 0,42 мл/мин. После промывания колонки с использованием 5 мл раствора для промывания после загрузки (10 мМ ацетатный буфер, pH 4,7) при той же скорости потока, 30 мл оставляли протекать при той же скорости потока, при этом постепенно увеличивая концентрацию соли с использованием элюента 1 (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4) и элюента 2 (20 мМ фосфатный буфер, 1 M NaCl, pH 7,4). После этого, 5 мл CIP раствора (0,1 M водный раствор гидроксида натрия) оставляли протекать при той же скорости потока и затем 5 мл раствора для уравновешивания (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4) оставляли протекать при той же скорости потока. В этот момент количество элюированного антитела в элюате в каждой фракции вычисляли по пику элюирования IgG, полученному посредством мониторинга поглощения при 280 нм. Количество антител, элюированных из раствора для промывания перед элюированием, в CIP раствор вычисляли в качестве емкости адсорбции антител.

Емкость адсорбции антител оценивали на основании емкости адсорбции антител в случае, когда вводили только карбоксигруппу и белок A, в соответствии со следующими стандартами оценки. ТО есть, емкость адсорбции антител оценивали на основании сравнительного примера 4.

Емкость адсорбции антител составляет 40% или больше от стандарта Оценка емкости адсорбции антител «A»

Емкость адсорбции антител составляет меньше чем 40% от стандарта Оценка емкости адсорбции антител «C»

[0124] 5. Способ оценки чистоты очистки

1 мл коммерчески доступного хроматографического носителя набивали в стеклянную колонку «колонка TRICORN 10/20» (производства GE Healthcare GmbH) («TRICORN» представляет собой зарегистрированный товарный знак), которую затем соединяли с хроматографической системой «AKTA avant 25» (производства GE Healthcare GmbH) («AKTAavant» представляет собой зарегистрированный товарный знак), после чего следовало измерение количества белка клетки-хозяина (HCP) и количества иммуноглобулина G (IgG), элюированных из каждой фракции.

После уравновешивания колонки с использованием раствора для уравновешивания (10 мМ ацетатный буфер, pH 4,7), смешанный раствор IgG/HCP, полученный с использованием стандартного буфера (10 мМ ацетатный буфер, pH 4,7) с тем, чтобы IgG и HCP, происходящий из клеток яичника китайского хомячка S (CHO-S), составляли 1,6 мг/мл и 0,64 мг/мл, соответственно, добавляли при скорости потока 0,21 мл/мин так, что загружали количество антитела 80% емкости адсорбции антител, полученной выше (1). После этого, 30 мл оставляли протекать при скорости потока 0,42 мл/мин, при этом постепенно увеличивая концентрацию соли с использованием элюента 1 (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4) и элюента 2 (20 мМ фосфатный буфер, 1 M NaCl, pH 7,4). После этого 5 мл CIP раствора (0,1 M водный раствор гидроксида натрия) оставляли протекать при той же скорости потока и затем 5 мл раствора для уравновешивания (20 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,4) оставляли протекать при той же скорости потока. В этот момент, количество элюированного IgG в элюате в каждой фракции вычисляли по пику элюирования IgG, полученному посредством мониторинга поглощения при 280 нм. Извлекали элюат каждой фракции и вычисляли количество HCP в элюате в каждой фракции с помощью ELISA, используя набор для обнаружения белка клетки-хозяина «CHO HCP 3rd Generation ELISA kit» (производства Cygnus Technologies, Inc.).

Используя вычисленное количество IgG и количество HCP в элюате, чистоту очистки вычисляли в соответствии со следующим уравнением в отношении количества включенного HCP в элюате, то есть количества HCP на количество IgG в элюате.

Чистота очистки (ч./млн)=количество включенного HCP (ч./млн)=количество HCP в элюате/количество IgG в элюате

Чистоту очистки оценивали на основании количества включенного HCP (ч./млн) в случае, когда вводили только карбоксигруппу и белок A, в соответствии со следующими стандартами оценки. То есть, количество включенного HCP оценивали на основании сравнительного примера 4.

Количество включенного HCP (ч./млн) снижалось на 20% или больше Оценка чистоты очистки «A»

Количество включенного HCP (ч./млн) снижалось больше чем на 0% и меньше чем 20% Оценка чистоты очистки «B»

Количество включенного HCP (ч./млн) не снижалось Оценка чистоты очистки «C»

[0125] [Таблица 1]

[0126] <Объяснение результатов>

Каждый из носителей для аффинной хроматографии из примеров с 1 до 8 оценивали как имеющий емкость адсорбции антител и чистоту очистки «B» или выше и каждый проявлял превосходную емкость адсорбции антител и превосходную чистоту очистки.

С другой стороны, в сравнительных примерах с 1 до 8 по меньшей мере одно из емкости адсорбции антител или чистоты очистки оценивали как «C» и по меньшей мере одно из емкости адсорбции антител или чистоты очистки было низким.

[0127] Кроме того, в случае сравнения примера 6 с примером 8, чистоту очистки в примере 6, в котором подложка на основе агарозы является сшитой, оценивали как «A», тогда как чистоту очистки в примерах 8, в которых подложка на основе метакрилата, оценивали как «B», и, следовательно, предполагали, что чистота очистки в случае сшитой подложки на основе агарозы превосходит таковую в случае подложки на основе метакрилата. В примерах 1 и 4, в которых количества покрытия гидрофильным полимером значительно отличаются друг от друга, чистоту очистки в обоих случаях оценивали как «A». Следовательно, полагают, что причина, по которой оценка чистоты очистки различается между примером 6 и примером 8, состоит в том, что подложка является сшитой и на основе агарозы (пример 6) или на основе метакрилата (пример 8).

Реферат

Изобретение относится к носителю для аффинной хроматографии и способу очистки биологического вещества с использованием носителя для аффинной хроматографии. Носитель для аффинной хроматографии содержит: подложку; гидрофильный полимер; и аффинный лиганд, в котором подложка состоит из по меньшей мере одного выбранного из группы, состоящей из полисахарида, полимера на основе акрилата, полимера на основе метакрилата и полимера на основе стирола, гидрофильный полимер представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из декстрана, карбоксиметилдекстрана и пуллулана, аффинный лиганд представляет собой по меньшей мере одно выбранное из группы, состоящей из антителосвязывающего белка и антителосвязывающего полипептида, карбоксигруппу вводят в носитель для аффинной хроматографии и количество введенной карбоксигруппы составляет от 15 ммоль/л геля до 60 ммоль/л геля в отношении ионообменной емкости. Техническим результатом является создание носителя для аффинной хроматографии с высокой емкостью адсорбции антител и высокая степень очистки. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 табл.

Формула