Композиции, содержащие магнитные частицы оксида железа, и применение указанных композиций при способах получения изображений - RU2417104C2

Чертежи

Описание

Введение

Настоящее изобретение относится к комплексам, которые содержат магнитные частицы оксида железа в фармацевтически приемлемой оболочке, причем указанные частицы имеют диаметр от 20 нм до 1 мкм при общем отношении диаметр частиц/диаметр ядра менее 6, и к применению этих комплексов при получении изображения с помощью магнитных частиц (МРI; ИМЧ). Особое предпочтение отдается применению этих композиций при обследовании желудочно-кишечного тракта, сосудистой системы сердца и краниальных компонентов, при диагностике атеросклероза, при инфарктах и опухолях и метастазах, например, лимфатической системы.

Уровень техники

При способах получения изображения, особенно в области медицинской диагностики, контрастные средства привели к значительному улучшению по сравнению с обычными способами получения изображения, такими как рентгенодиагностика и получение изображения методом магнитного резонанса (MRI; МРИ). Контрастные средства, которые можно использовать при МРИ, можно дифференцировать на основе механизма их действия (позитивное усиление или воздействие на продольную релаксацию или негативное усиление или воздействие на поперечную релаксацию). Это действие выражается в виде Т₁ и Т₂ релаксативности в единице мМ^-1·сек^-1. R₁ и R₂ определяются как крутизна подъема кривых 1/Т₁ и 1/Т₂ по отношению к концентрации контрастного средства. Отношение R₂/R₁ определяет, обладает ли контрастное средство главным образом снижающим Т₁ (R₁ значительно выше R₂) или снижающим Т₂ действием (Krombach et al. (2002) Röfo 174: 819-829). Позитивные контрастирующие средства (известные также как повышающие релаксативность или повышающие Т₁ контрастирующие средства) увеличивают силу сигнала перфузируемых областей. Негативные контрастные средства (известные также как повышающие чувствительность или повышающие Т₂ контрастные средства) снижают силу сигнала перфузируемой области в нагруженных Т₂ последовательностях.

Подходящие контрастные средства для МРИ описаны в предшествующей литературе по данному вопросу. Например, в ЕР 0525199 описаны фармацевтические препараты, содержащие магнитные частицы оксида железа, которые образуют комплексы с полисахаридами, а также их использование в качестве контрастных средств для МРИ. В одном из предпочтительных вариантов осуществления суперпарамагнитные ядра из оксида железа имеют размер от 2 нм до 30 нм. Размер комплексов (ядро плюс полисахаридная оболочка) в соответствующих препаратах представлен как от 10 нм до 500 нм. Однако конкретное описание распространяется только на комплексы с ядрами из оксида железа, имеющие диаметр 10,1 нм. В ЕР 0543020 описаны очень похожие частицы. Однако в этом случае суперпарамагнитные частицы оксида железа образуют комплексы с карбоксиполисахаридами. Также описано использование этих комплексов в качестве контрастных средств для МРИ. Использование карбодекстрана в качестве материала оболочки улучшает фармакологические свойства препарата. В одном из предпочтительных вариантов осуществления размер ядра из оксида железа составляет от 20 до 30 нм. Однако конкретно описанные комплексы содержат только ядра из оксида железа, имеющие диаметр самое большее 8,8 нм. В патенте США 5492814 описаны монокристаллические частицы оксида железа, а также их использование для исследования биологической ткани посредством МРИ. Для предпочтительного размера ядер из оксида железа установлены интервалы от 1 до 10 нм; однако в примерах конкретно описаны только частицы с ядрами из железа, имеющие диаметр 2,9±1,3 нм. Для улучшения пригодности в качестве контрастных средств для МРИ описанные частицы предпочтительно являются монокристаллическими частицами, то есть кристаллическая структура всей частицы является гомогенной и не имеет каких-либо нарушений - монокристалл.

Недавно в медицинской области был описан новый способ получения изображения. В этом случае измеряется изменение в намагничивании частиц при движении в магнитном поле. Это изменение служит для определения пространственного распределения магнитных частиц в исследуемой области (см., например, DЕ 101 51 778 А1 и DЕ 102 38 853 А1). Эта новая методика была вызвана потребностями получения изображения с помощью магнитных частиц (ИМЧ). В этих и других заявках того же заявителя упоминается ряд свойств, которыми должны обладать используемые частицы при методе ИМЧ. Например, частицы могут быть ферромагнитными и ферримагнитными частицами и, таким образом, похожи на частицы, известные по методу МРИ. Однако релаксативность Т₁ и Т₂ не оказывает влияния на возможность использования этих частиц при ИМЧ. Из-за в корне различных физических феноменов, которые используются для получения изображения при способах МРИ и ИМЧ, пригодность частиц, описанных по предшествующему уровню техники, в качестве контрастного средства для МРИ не определяет, пригодны ли частицы или нет для ИМЧ. Кроме того, описано, что частицы должны быть такими малыми, что в них может быть образован только один магнитный домен (монодомен) и не могут быть получены области Вейсса. Предполагается, что в зависимости от материала подходящие монодоменовые частицы должны иметь идеальный размер в интервале от 20 нм до примерно 800 нм. Магнетит (Fе₃О₄) упоминается как подходящий материал для монодоменовых частиц.

ИМЧ является новым многообещающим методом, который представляет особый интерес в отношении диагностического применения, так как необходимые затраты в отношении аппарата значительно ниже, чем в случае МРИ. Это происходит из-за того, что в отличие от МРИ при ИМЧ не существует потребности в больших гомогенных магнитных полях и поэтому в больших сверхпроводящих магнитах, которые делают диагностику с применением МРИ такой дорогой и делают трудным ее широкое применение. Чтобы дать возможность широкого применения этой новой технологии, однако, необходимо разработать магнитные частицы, которые дают возможность высокого пространственного разрешения, введения без риска и низкой напряженности магнитного поля во время исследования. Поэтому существует потребность в получении частиц, которые пригодны для диагностики с помощью ИМЧ.

Описание изобретения

Перед тем как настоящее изобретение будет описано более подробно ниже, необходимо отметить, что это изобретение не ограничивается конкретными методами, методиками и реагентами, описанными здесь, так как эти условия могут быть изменены. Применяемая здесь терминология использована только в целях описания конкретных предпочтительных вариантов осуществления, и указанная терминология не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, причем последний ограничивается только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иначе, технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, которое приписывается им специалистами в данной области. Предпочтительно, термины использованы здесь в значении, определяемом в «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», Leuenberger, H.G.W., Nagel, B. and Klbl, H. eds (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).

В описании процитирован ряд документов. Каждый из документов, процитированных здесь (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, рабочие инструкции производителей, рекомендации и т.д.), включены в виде ссылки на них во всей полноте. Однако упоминание одного из этих документов не должно в каком-либо случае истолковываться как значение того, что настоящее изобретение может отрицаться по праву, основанному на более ранней дате изобретения указанной публикации.

Неожиданно обнаружено, что частицы, которые содержат магнитное ядро из оксида железа, которое имеет особый размер и особое отношение между диаметром ядра из оксида железа и всей частицы, особенно пригодны для ИМЧ. Поэтому первым объектом настоящего изобретения является частица, которая содержит в фармацевтически приемлемой оболочке ядро из оксида железа, имеющее диаметр от 20 нм до 1 мкм при отношении диаметр частицы в целом/диаметр ядра менее 6.

Известно, что применение ядер из чистого оксида железа у пациентов приводит к тяжелым побочным эффектам. Были описаны агрегация тромбоцитов крови и быстрое падение кровяного давления. Чтобы предотвратить эти побочные эффекты, которые в некоторых случаях могут быть угрожающими жизни, ядра частиц из оксида железа по настоящему изобретению окружают фармацевтически приемлемой оболочкой. «Фармацевтически приемлемая оболочка» в контексте настоящего изобретения является слоем вещества или смеси веществ, которая по существу полностью покрывает ядро из оксида железа и изолирует ядро из оксида железа таким образом, что при применении у пациента известные угрожающие жизни эффекты не возникают. Здесь предпочтительно, когда вещество или смесь веществ являются биологически разрушаемыми, то есть, другими словами, могут быть расщеплены на небольшие элементы, которые могут использоваться организмом и/или могут быть удалены почками. Данные частицы вводят пациенту предпочтительно в водных коллоидных растворе или дисперсии. Поэтому желательно, когда вещество или смесь веществ являются гидрофильными, и предотвращается осаждение частиц, и коллоидный раствор стабилизирован. Множество таких веществ описано ранее (см., например, патент США 5492814).

В одном из предпочтительных вариантов осуществления фармацевтически приемлемая оболочка включает синтетический полимер или сополимер, крахмал или его производное, декстран или его производное, циклодекстран или его производное, жирную кислоту, полисахарид, лецитин или моно-, ди- или триглицерид или их производные. Также включены смеси вышеназванных предпочтительных веществ.

Из широких групп этих веществ особое предпочтение отдается следующим веществам и их смесям:

(i) в отношении полимеров или сополимеров: сложным полиоксиэтиленовым эфирам сорбитана, полиоксиэтилену и его производным, полиоксипропилену и его производным, неионным поверхностно-активным веществам, полиоксилстеаратам (35-80), поливиниловым спиртам, полимеризованной сахарозе, полигидроксиалкилметакриламидам, сополимерам молочной кислоты и гликолевой кислоты, полиортоэфирам, полиалкилцианоакрилатам, полиэтиленгликолям, полипропиленгликолям, полиглицеринам, полигидроксилированным поливиниловым матрицам, полигидроксиэтиласпартамидам, полиаминокислотам, сополимерам стирола и малеиновой кислоты, поликапролактонам, карбоксиполисахаридам и полиангидридам;

(ii) в отношении производных крахмала: 2-гидроксиметиловому эфиру крахмала и гидроксиэтилкрахмалу;

(iii) в отношении декстранов или его производных: галактозилированным декстранам, лактозилированным декстранам, аминированным декстранам, декстранам, содержащим SН-группы, декстранам, содержащим карбоксильные группы, декстранам, содержащим альдегидные группы, биотинилированным декстранам;

(iv) в отношении циклодекстринов: бета-циклодекстринам и гидроксипропилциклодекстринам;

(v) в отношении жирных кислот: лаурилсульфатам натрия, стеаратам натрия, стеариновым кислотам, монолауратам сорбитана, моноолеатам сорбитана, монопальмитатам сорбитана и моностеаратам сорбитана.

Благодаря особенно хорошей совместимости предпочтение отдают использованию декстранов и полиэтиленгликоля (ПЭГ) и их производных, и особенно, карбоксидекстранам, низкомолекулярным ПЭГ (предпочтительно, от 500 до 2000 г/моль) или высокомолекулярным ПЭГ (более чем от 2000 г/моль до 20000 г/моль) для того, чтобы сформировать фармацевтически приемлемую оболочку. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления фармацевтически приемлемая оболочка является биологически разрушаемой. Множество из предпочтительных веществ и полимеров, описанных выше, удовлетворяют этому требованию.

По предшествующему уровню техники известно множество способов, которые пригодны для получения железных ядер в оболочке. При некоторых из этих методов железное ядро формируется на первой стадии способа, а оболочку наносят на дальнейшей стадии. Однако возможно также формировать железное ядро и оболочку при одной реакции или при «реакции в одном резервуаре». Известные способы включают, без ограничения этим, аэрозольно/паровой пиролизный способ, способ химического осаждения из пара, зольно-гелевый способ и микроэмульсионный способ. Особенно предпочтительные способы для создания оболочки для ядер из оксида железа были описаны, например, в ЕР 0543020 В1, ЕР 0186616, ЕР 0525199 и ЕР 0656368.

Предпочтительно, когда магнитное ядро из оксида железа содержит магнетит или маггемит, или их смеси. Возможно при некоторых вариантах осуществления добавлять дополнительные оксиды металлов в ядро из оксида железа, причем указанные оксиды металлов предпочтительно выбирают из магния, цинка и кобальта. Эти дополнительные оксиды металлов можно добавлять в ядро из оксида железа в пропорции до 20% в целом. Кроме того, возможно также, когда марганец, никель, медь, барий, стронций, хром, лантан, гадолиний, европий, диспрозий, холмий, иттербий и самарий содержатся в количестве менее 5%, предпочтительно менее 1%.

Диаметр частиц в целом по настоящему изобретению зависит от диаметра ядра из оксида железа и от толщины фармацевтически приемлемой оболочки, окружающей последнее, а также от любых молекул, связанных с поверхностью оболочки. Верхний предел общего диаметра определяется тем условием, что частицы должны быть способны проходить через капилляры после применения в организме пациента. Капилляры с наименьшим диаметром обычно расположены в легких. Через эти капилляры еще могут проходить частицы, имеющие общий диаметр 2 мкм. Частицы по настоящему изобретению предпочтительно являются сферическими. Однако частицы, которые являются удлиненными или угловатыми или по существу имеют любую другую форму, также охватываются настоящим изобретением при условии, что поверхность железного ядра по существу окружена фармацевтически приемлемой оболочкой. Таким образом, общий диаметр частицы составляет 2r в случае сферической частицы, а в случае частицы неправильной формы определяется расстоянием между двумя точками на поверхности частицы, которые находятся наиболее далеко одна от другой, плюс толщина гидратированной оболочки. Общий диаметр, определенный здесь, должен отличаться от среднего общего диаметра частицы по настоящему изобретению, который определяется как среднее арифметическое расстояние всех точек на поверхности частицы от центра тяжести частицы плюс толщина гидратированной оболочки. Средний общий диаметр, в свою очередь, отличается от среднего арифметического общего диаметра частиц, которые относятся к группе частиц, и который получают как среднее арифметическое значение от всех средних диаметров частиц, включенных в группу, плюс толщина гидратированной оболочки. Низший предел общего диаметра определяется по нижнему пределу диаметра ядра из оксида железа, который приводит к улучшенному изображению при методе ИМЧ. Поэтому в одном из предпочтительных вариантов осуществления диаметр частицы в целом колеблется в интервале от примерно 30 нм до примерно 2 мкм. Однако еще большее предпочтение отдается использованию частиц, имеющих общий диаметр от примерно 40 нм до примерно 500 нм, более предпочтительно в интервале от примерно 45 до примерно 300 нм, еще предпочтительнее в интервале от примерно 50 до примерно 200 нм. Общий диаметр частиц по настоящему изобретению может быть определен рядом прямых или непрямых методов, известных по предшествующему уровню техники, которые включают, например, электронную микроскопию и динамическое рассеяние света. Предпочтительно, общий диаметр определяется по динамическому рассеянию света.

В доступной литературе по предшествующему уровню техники и прежде всего в упомянутых выше документах DЕ 10151778 А1 и DЕ 10238853 А1 описаны частицы, которые, как предполагают, пригодны для ИМЧ. В указанном прототипе описано, что пригодны только частицы, которые имеют магнитное ядро, имеющие диаметр от 20 до 800 нм, и что действительно подходящий диаметр магнитного ядра зависит от соответственно выбранного магнитного материала. Нет руководства, в котором раскрывается использование частиц, которые имеют ядра из оксида железа, имеющие диаметр от 20 нм до 1 мкм с отношением общий диаметр частицы/диаметр ядра менее 6. Таким образом, предпочтительные нижние пределы диаметра ядра из оксида железа составляют 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 95, 100 нм. Предпочтительные верхние пределы диаметра представляют 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85 и 80 нм. Возможны все комбинации вышеназванных верхнего и нижнего пределов, для того чтобы определить предпочтительный интервал для размера частиц, при условии, что значение верхнего предела больше значения нижнего предела, например, от 40 до 400 нм, от 50 до 200 нм и т.д. Предпочтительные частицы по настоящему изобретению имеют диаметр ядра из оксида железа в интервале от примерно 25 нм до примерно 500 нм. Еще более предпочтительно, когда диаметр ядра из оксида железа находится в интервале от примерно 30 нм до примерно 200 нм, еще более предпочтительно от 35 нм до примерно 80 нм. Диаметр ядра опять можно определять методами, известными по предшествующему уровню техники, которые включают, без ограничения этими названными методами, рентгеноструктурный анализ и электронную микроскопию. Так как ядра из оксида железа не во всех случаях имеют сферическую форму, диаметр ядра из оксида железа равен расстоянию между точками на поверхности ядра из оксида железа, которые находятся наиболее далеко одна от другой. Этот диаметр должен отличаться от среднего диаметра ядра из оксида железа, который определяется как среднеарифметическое расстояние всех точек на поверхности ядра из оксида железа от центра тяжести ядра из оксида железа. Средний диаметр ядра из оксида железа, в свою очередь, отличается от среднеарифметического диаметра ядра из оксида железа, который относится к группе частиц, и получается в виде среднего значения от всех средних диаметров ядер из оксида железа, заключенных в данной группе.

Неожиданно было обнаружено, что частицы, которые имеют тонкую оболочку из фармацевтически приемлемого вещества вокруг ядра из оксида железа, более пригодны для ИМЧ, чем частицы, которые имеют более толстую оболочку, имея в то же время такой же диаметр ядра из оксида железа. Поэтому в одном из предпочтительных вариантов осуществления частицы по настоящему изобретению характеризуются тем, что отношение диаметра частицы в целом к диаметру ядра из оксида железа составляет менее 6. Еще предпочтительнее, когда это отношение составляет менее 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,95, 1,90, 1,85, 1,80, 1,75, 1,60, 1,55 или менее 1,5. Что касается вышеназванных диаметров частиц в целом и ядер из оксида железа, особенно предпочтительные частицы имеют ядра из оксида железа, имеющие диаметр в интервале от примерно 30 до примерно 200 нм, и еще предпочтительнее в интервале от примерно 35 нм до примерно 80 нм с отношением диаметра частицы в целом к диаметру ядра из оксида железа, которое меньше 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,95, 1,90, 1,85, 1,80, 1,75, 1,60, 1,55 или менее 1,5.

В связи с настоящим изобретением термин «поликристаллические частицы из оксида железа» относится к магнитным частицам из оксида железа, которые состоят из, по меньшей мере, 2 спаянных кристаллов, предпочтительно из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более кристаллов. Максимальное число кристаллов, которое может содержаться в одной частице настоящего изобретения, ограничивается только размером частицы. В больших частицах может содержаться больше кристаллов, чем в меньших частицах. Кристаллы, которые заключаются в поликристаллических магнитных частицах из оксида железа, предпочтительно имеют длину в предпочтительном направлении 1-100 нм, предпочтительно от 3 до 50 нм. Элементарная ячейка кристалла магнетита (Fе₃О₄) имеет длину грани примерно 1 нм. Соответственно кристаллы, которые заключены в поликристаллических магнитных частицах из оксида железа, имеют в предпочтительном направлении, по меньшей мере, 3 элементарных ячейки, еще предпочтительнее 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более элементарных ячеек. В поликристаллических ядрах из оксида железа могут сформировываться некристаллические области с неупорядоченной аморфной структурой на границах раздела между одним или более кристаллами, то есть, другими словами, поликристаллические магнитные ядра из оксида железа предпочтительно состоят на 50%, еще предпочтительнее на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более из поликристаллических областей, а оставшаяся часть частицы из оксида железа состоит из неупорядоченных аморфных областей. Отдельные кристаллы, заключенные в ядре из оксида железа, могут иметь одинаковую или разную длину. Наибольший кристаллит, то есть, другими словами, отдельный кристалл, который заключен в поликристаллических магнитных частицах из оксида железа, должен предпочтительно иметь объем, который составляет менее 70%, еще предпочтительнее, менее 65%, менее 60%, менее 55%, менее 50%, менее 45% от всего объема частицы по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения не существует дальнего порядка в поликристаллическом ядре из оксида железа, а скорее есть только ближний порядок. Это означает, что эта частица находится в форме по существу аморфной частицы с кристаллическими включениями. В контексте настоящего изобретения термин «поликристаллические» охватывает как частицы из оксида железа с дальним порядком, так и частицы с ближним порядком. Предпочтительны кристаллы с дальним порядком.

Нужно отметить, что поликристаллические ядра из оксида железа могут также образовывать монодомен и необязательно приводят к образованию областей Вейсса. Размер ядра из оксида железа является определяющим фактором в отношении способности к образованию областей Вейсса. В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления ядро из оксида железа содержит, по меньшей мере, пять монокристаллов из оксида железа. Число и размер кристаллов, заключенных в частице, могут быть выявлены посредством множества различных методов, которые включают, без ограничения этим, транмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ), электронную томографию и рентгенографию. Предпочтительно, размер определяют с помощью ТЭМ.

ИМЧ основано на определении положения магнитных частиц. При диагностических методах, которые имеют целью только выявление внутреннего строения областей, через которые протекает жидкость, таких как изображение желудочно-кишечного тракта или изображение коронарных артерий, например, может быть достаточно дать пациенту достаточное количество частиц, например, путем инъекции дисперсии частиц или путем перорального приема раствора или дисперсии соответствующих частиц. За частицами, которые по существу не связываются со структурами в исследуемой области, можно затем наблюдать, когда они протекают через исследуемую область. Однако при многих видах диагностического применения желательно, чтобы частицы проявляли специфическое сродство к поверхностным структурам исследуемых областей. Поэтому в одном из предпочтительных вариантов осуществления частицы по настоящему изобретению включают один или более из идентичных или разных лигандов на поверхности частицы. Лиганды могут быть ковалентно или нековалентно связаны с поверхностью. В контексте настоящего изобретения «лиганд» представляет собой вещество, которое связывается с данным веществом с IС₅₀ менее 10 мкМ, предпочтительно менее 1 мкМ, менее 900 нМ, менее 800 нМ, менее 700 нМ, менее 600 нМ, менее 500 нМ, менее 400 нМ, менее 300 нМ, менее 200 нМ, менее 100 нМ, менее 90 нМ, менее 80 нМ, менее 70 нМ, менее 50 нМ, менее 40 нМ, менее 30 нМ, менее 20 нМ. По предшествующему уровню техники известно множество методов определения сродства связывания лиганда (IС₅₀ или некоторые другие параметры) с данным веществом. Эти методы включают, без ограничения этим, ELISA, поверхностный плазмонный резонанс и методы исследования связывания радиоактивно меченного лиганда, как описано, например, у Gazal S. et al. (2002) J. Med. Chem. 45: 1665-1671.

В некоторых случаях может быть желательно фиксировать на поверхности частицы по настоящему изобретению два или более различных лиганда. Это возможно, например, когда на поверхности, с которой должны специфически связываться частицы, существуют две структуры, характерные для этой поверхности, расположенные по соседству друг с другом. Это может быть в случае, например, некоторых опухолевых клеток, у которых из-за мутации два компонента рецептора постоянно соединены друг с другом. Использование двух лигандов, которые, каждый, направлены к одной из двух структур, затем приводит к значительному повышению сродства или специфичности. При этом в предпочтительном варианте осуществления частиц по настоящему изобретению на поверхности оболочки, которая состоит из фармацевтически приемлемого вещества, дополнительно фиксируется(ются) один или более из видов лигандов. В зависимости от соответствующего вещества или смеси веществ, из которых состоит фармацевтически приемлемая оболочка, последняя сама может обладать сродством к данному веществу. Например, ряд полисахаридов обладает определенной клеточной специфичностью. Поэтому при производстве, например, клеткоспецифических частиц не во всех случаях необходима фиксация лигандов, так как такое сродство может происходить от фармацевтически приемлемой оболочки.

Максимальное число лигандов, которое может быть зафиксировано на поверхности, определяется размером поверхности и пространством, необходимым для соответствующего лиганда. Обычно лиганд связан с поверхностью частицы в мономолекулярном слое, что, в зависимости от размера лиганда, может приводить к значительному увеличению диаметра. При выборе подходящих лигандов и, в частности, при использовании крупных антительных лигандов, необходимо позаботиться об обеспечении того, чтобы общий диаметр получаемой покрытой лигандами частицы не приводил к той ситуации, при которой частица больше не способна проходить через капилляры. Поэтому предпочтительно, когда диаметр покрытой лигандами частицы составляет менее 2 мкм, и еще предпочтительнее, составляет диаметр, как указано, который является предпочтительным для общего диаметра непокрытой частицы, о чем сказано выше. В этом случае толщина фармацевтически приемлемой оболочки и/или диаметр ядра из оксида железа должен быть соответственно снижен. В прототипах описано множество методов для прикрепления лигандов. Особенно предпочтительные способы описаны, например, в патенте США 6048515. В зависимости от соответствующей фармацевтически приемлемой оболочки может быть необходимо структурировать оболочку перед прикреплением лиганда. Такие способы были описаны, например, Weißleder et al.

Выбор лиганда будет зависеть от заболевания или патологического состояния, которое нужно диагностировать с помощью ИМЧ. Предпочтительно, структуры, с которыми связываются лиганды, расположенные на частицах, содержатся в областях, через которые протекают жидкости тела, например кровь или лимфа, или содержатся в жидкостях организма. Поэтому предпочтительно, когда лиганд способен специфически связываться с клеточными (эукариотическими или прокариотическими), экстраклеточными или вирусными поверхностными структурами. По предшествующему уровню техники известно множество структур, которые преимущественно экспрессируются в пораженных тканях или клетках или вблизи таких тканей или клеток и которые поэтому служат для индикации соответствующего заболевания. Например, новообразование кровеносных сосудов (неоангиогенез) в организме взрослого ограничивается эндометрием в связи с менструацией или беременностью, и процессами заживления после травмы сосудов. Однако известно, что новые кровеносные сосуды образуются также при многих из пролиферативных заболеваний, и указанные новые кровеносные сосуды не обнаруживаются в каком-либо другом месте в организме, которое не поражается пролиферативным заболеванием. Поэтому клеточные структуры, которые продуцируются в связи с неоангиогенезом и, в частности, структуры, которые обнаружены только в эндотелии опухолей, такие как, например, домен ЕD-В фибронектина (ЕD-ВF), являются превосходными мишенями для лигандов, которые могут быть фиксированы на поверхности частиц по настоящему изобретению. Все лиганды, известные по предшествующему уровню техники, к таким структурам, связанным с заболеваниями, можно использовать в соединении с частицами настоящего изобретения. Однако особенно предпочтительными лигандами являются лиганды, которые способны специфически связываться с одной из следующих структур: с доменом ЕD-В фибринонектинов (ЕD-ВF), с эндоглином, с рецепторами сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR), с представителями семейства VЕGF, NRР-1, с Аng1, с Тhiе2, с РDGF-ВВ и рецепторами, с ТGF-β1, с рецепторами ТGF-β, с FCF, с HGF, с МСР-1, с интегринами (α_vβ₃, α_vβ₅, α₅β₁), с VЕ-кадхеринами, с РЕСАМ (СD31), с эфринами, с активаторами плазминогена, с ММР, с РАI-1, с NОS, с СОХ-2, с АС133, с хемокинами, с Id1/Id3, с VEGFR-1, с Аng2, с ТSР-1,-2, с ангиостатинами и складками связанного плазминогена, с эндостатинами (фрагмент ХVII коллагена), с вазостатином, с тромбоцитным фактором 4 (ТФ4; РF4), с ингибиторами ММР, с РЕХ, с Меth-1, с Меth-2, с INF-α, -β, -γ, с IL-10, с IL-4, с IL-12, с IL-18, с пролактином (М, 16К), с VЕGI, с фрагментами SРАRС, с фрагментами остеопонтина или маспином, с СоllХVIII, с СМ201, со статинами, в частности, с L-статином, с СD105, с IСАМ1, с соматостатином (подтип 1, 2, 3, 4 или 5) или рецепторами соматостатина (подтип 1, 2, 3, 4, 5 или 6).

По предшествующему уровню техники известно, что множество веществ обладают сродством предпочтительно к клеточным (эукариотическим или прокариотическим), экстраклеточным или вирусным поверхностным структурам. Предпочтительно лиганды, которые зафиксированы на частицах по настоящему изобретению, выбраны из полипептида, олигонуклеотида, полисахарида и липида.

Полипептиды, которые обладают специфическим сродством, известны и могут быть идентифицированы с помощью ряда методов, включая «выявление фагом» и иммунизацию. В этой связи предпочтительно, когда белки, которые по настоящему изобретению можно использовать в качестве лигандов, выбраны из группы, состоящей из антител, включая человеческие, гуманизированные и химерные антитела и фрагменты антител, фрагменты, содержащие связывающие домены антител, например Fv, Fаb, Fаb', F(аb')₂, Fаbс, Fасb, одноцепочечные антитела, например одноцепочечные Fvs (sсFvs) и диантитела, и лиганда клеточного, экстраклеточного или вирусного рецептора или его фрагмента. Подходящими лигандами являются, например, сосудистый эндотелиальный фактор роста (СЭФР; VEGF), эпидермальный фактор роста (ЭФР; ЕGF), хемокины и цитокины.

Способность нуклеиновых кислот вступать в специфические связи, например, с транскрипционными факторами или гистонами хорошо известна. Предпочтительные олигонуклеотиды, которые могут быть фиксированы в качестве лигандов на частицах по настоящему изобретению, включают ДНК, РНК, ПНК и аптамеры. Особое предпочтение отдается ПНК, так как они обладают более высокой резистентностью к нуклеазам, обычно обнаруживаемым у пациентов и, таким образом, обладают более длинным полупериодом биологического существования. Способы идентификации специфического связывания нуклеиновых кислот известны по предшествующему уровню техники и описаны, например, в WО93/24508А1, WО94/08050А1, WО95/07364А1, WО96/27605А1 и WО96/34875А1.

В некоторых случаях, например, по причинам стерической или химической несовместимости будет невозможно связать лиганд непосредственно с поверхностью частицы. В этих случаях лиганд может быть связан с поверхностью частицы с помощью линкера. В этой связи термин «линкер» обозначает молекулу, которая предпочтительно имеет одну химически реактивную группу или две таких группы, которые соответственно дают возможность ковалентного или нековалетного связывания с поверхностью частицы с одной стороны и с лигандом с другой стороны. Между этими связывающими группами существует обычно линейная, циклическая или разветвленная область, которая дает возможность, например, большего пространственного разделения между лигандом и частицей и большей подвижности лиганда. Линейная область может быть, например, замещенной или незамещенной, разветвленной или неразветвленной, насыщенной или ненасыщенной алкильной цепью (С₂ - С₅₀), которая может быть разбита одним или более из атомов О, N и/или S, или полипептидом, или полинуклеотидом. Примеры химически реактивных групп, которые можно использовать в этих линкерах, включают, например, амино, гидроксильную, тиольную или тиолореактивную, сульфгидрильную, карбоксильную и эпоксидную группы. Тиолореактивные группы включают, например, малеинимидную (малеимид), хлорацетильную, бромацетильную, йодацетильную, хлорацетамидо, бромацетамидо, йодацетамидо, хлоралкильную, бромалкильную, йодалкильную, пиридильную, дисульфидную и винилсульфонамидную группы. Множество соединяющих реагентов, соединяющих групп и линкеров описаны в WО98/47541, на который здесь сделана конкретная ссылка в отношении этого описания.

Было обнаружено, что полиэтиленгликолевые остатки (ПЭГ) и полипропиленгликолевые остатки (ППГ), которые зафиксированы на поверхности фармацевтически активных веществ, приводят к значительному удлинению полупериода биологического существования. Примерами этого являются ПЭГилированные липосомы или ПЭГилированные белки, такие как ПЭГилированные ЕРО, например. Методы ПЭГилирования поверхностей известны по предшествующему уровню техники. В зависимости от материала соответствующей фармацевтически приемлемой оболочки, который использован, ПЭГ остатки или ППГ остатки могут быть ковалентно или нековалентно зафиксированы на поверхности непосредственно или через линкер. Предпочтительно, полиэтиленгликолевые и/или полипропиленгликолевые остатки ковалентно связаны с поверхностью частицы.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения частиц, которые содержат в фармацевтически приемлемой оболочке магнитное ядро из оксида железа, имеющее диаметр от 20 нм до 1 мкм, и с отношением общий диаметр частицы/диаметр ядра менее 6, причем указанный способ включает следующие стадии:

(i) смешивания водного раствора смешанных солей железа, который содержит соль железа(II) и соль железа(III), с основанием в присутствии синтетического полимера или сополимера, крахмала или его производного, декстрана или его производного, циклодекстрана или его производного, жирной кислоты, полисахарида, лецитина или моно-, ди- или триглицерида или его производного, или их смесями до тех пор, пока не образуется коллоидный раствор этих частиц,

(ii) пропускания содержащего частицы раствора через магнитное градиентное поле,

(iii) удаления магнитного градиентного поля,

(iv) и извлечения частиц, задержанных в градиентном поле.

Стадия (i) способа по настоящему изобретению обычно не приводит к получению гомогенной группы частиц, а скорее к получению группы частиц, которые различаются в пределах некоторых полос размеров как в отношении диаметра ядра из оксида железа, так и в отношении диаметра всей частицы. Средний диаметр ядра из оксида железа такой группы получают как среднее арифметическое значение из всех значимых диаметров ядер из оксида железа, содержащихся в группе. Применение магнитного градиентного поля на стадии (ii) приводит к отбору частиц с ядром из оксида железа, которые больше частиц со средним диаметром ядра из оксида железа. Например, путем подбора силы магнитного градиентного поля и, возможно, путем повторения стадий с (ii) по (iv) способа по настоящему изобретению один, два или более раз, возможно, при повышении силы градиентного поля, можно отобрать из гетерогенной группы частиц группу частиц, которые имеют больший средний диаметр ядра из оксида железа, чем средний диаметр ядра из оксида железа, и более тонкую оболочку из фармацевтически приемлемых материалов. Обычно группу частиц, которая имеет меньшее рассеяние по диаметру ядра, получают в конце стадий со (ii) по (iv).

Чтобы выбрать из этой подгруппы частиц частицы, которые имеют, по меньшей мере, заранее определенный общий диаметр частиц, их можно отобрать методами, известными по предшествующему уровню техники, такими как фильтрование, осаждение, противоточное центрифугирование (отмучивание) и т.д.

Соли железа(II) и железа(III), используемые в способе по настоящему изобретению, предпочтительно находятся в водном растворе в концентрации от 0,1 до 2 М. Двухвалентные и трехвалентные ионы железа предпочтительно находятся в смеси в соотношении от 1:3 до 2:1. Подходящие анионы солей железа получают с органическими кислотами, такими как, например, с лимонной кислотой, молочной кислотой, уксусной кислотой, малеиновой кислотой и т.д., или с органическими кислотами, такими как, например, НСl, Н₂SО₄, Н₂SО₃, НВr, НI, НNО₃ или НNО₂.

Основание предпочтительно выбрано из неорганических оснований, таких как, например, NаОН, КОН, LiОН или Аl(ОН)₃, и из органических оснований. Основание можно добавлять в водный реакционный раствор в виде твердого вещества или в виде раствора, предпочтительно в виде водного раствора. Это добавление предпочтительно происходит до тех пор, пока рН раствора не достигнет 10, предпочтительно 11 или выше. За этой стадией подщелачивания предпочтительно следует нейтрализация кислотой, предпочтительно НСl, до рН примерно 7 ± 0,5.

В качестве дополнительной стадии за стадией (i) может следовать непосредственно или после нейтрализации обработка нагреванием. Здесь раствор нагревают до, по меньшей мере, 50°С, предпочтительно до 60°С, 65°С, 70°С, 75°С, 80°С, 90°С или 95°С. Если нейтрализации еще не происходит, раствор может быть нейтрализован добавлением кислоты после нагревания, а затем может быть далее или охлажден, или нагрет. Если раствор дополнительно нагревают, его нагревают, предпочтительно, до 50°С, более предпочтительно до 60°С, 65°С, 70°С, 75°С, 80°С, 85°С, 90°С, 95°С, 100°С или до температуры кипячения с обратным холодильником. Такое нагревание предпочтительно происходит в течение от 10 мин до 10 часов.

Непосредственно после стадии (i) или еще после каждой из стадий, описанных выше, то есть стадии нейтрализации и/или нагревания, может производиться одна или более из стадий промывания и/или диализа. Кроме того, предпочтительно, когда частицы, полученные после стадии (iv), подвергают одной или более из стадий промывания и диализа. Цель этой стадии (или этих стадий) - предпочтительно отделить от частиц любые потенциально вредные примеси, оставшиеся от процесса производства, и адаптировать рН и/или содержание соли раствора, содержащего частицы.

Магнитное градиентное поле используют для выделения частиц, которые особенно пригодны для метода ИМЧ. Магнитное градиентное поле, которое можно использовать для метода по настоящему изобретению, можно широко изменять, и оно может быть установлено специалистом в данной области с учетом различных параметров плана испытания. Градиентное поле, используемое в целях разделения, должно быть значительно больше, чем градиент земного поля. Магнитное градиентное поле в камере сепарации может создаваться материалом с постоянным магнетизмом или проводником, по которому течет ток. В связи с настоящим изобретением последний вариант осуществления является предпочтительным, так как он делает легким устранение градиентного поля путем отключения тока. В первом случае магнитное градиентное поле устраняют путем удаления материала с постоянным магнетизмом. Градиентное поле обычно имеет интервал от 1 мТ/м до 500 Т/м. Если, например, нужно задержать частицы, имеющие диаметр ядра >100 нм, и если стадию (ii) осуществляют на установке, имеющей низкую производительность, предпочтительно использовать градиенты напряженности 1-10 мТ/м. Однако, если необходимо удержать частицы, имеющие меньший диаметр ядра, например примерно 20 нм, и если способ осуществляют при высокой производительности, предпочтительно использовать градиентное напряжение >1000 Т/м. Цель приложения градиентного поля состоит в концентрировании этих частиц, которые имеют относительно большой диаметр ядра из оксида железа и/или которые имеют предпочтительное, то есть низкое отношение общий диаметр/диаметр ядра. Принимая во внимание указание, представленное здесь, и в зависимости от среднего диаметра частиц, получаемых способом по настоящему изобретению, и используемой скорости потока специалист в данной области может определить подходящую напряженность градиентного поля, что делает возможным выделить такие частицы. Подходящие устройства для разделения, обеспеченные градиентным полем, описаны, например, ниже в примерах 1b) и 1с) и в ЕР 0915738 В1. Данные устройства могут содержать дополнительные парамагнитные материалы в области градиентного поля тогда, когда необходимо усилить градиентное поле.

Чтобы выделить частицы, удержанные в градиентном поле, после того как градиентное поле было устранено, разделительное устройство предпочтительно ополаскивают подходящим раствором, предпочтительно водным фармацевтически приемлемым раствором, причем частицы предпочтительно выделяют из разделительного устройства механически.

Частицы, получаемые по настоящему изобретению, предпочтительно имеют релаксативность Т₂, по меньшей мере, 150 (мМ·сек)^-1, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 (мМ·сек)^-1. Релаксативность частиц Т₂ предпочтительно определяют при напряженности магнитного поля 1 Тесла в водном коллоидном растворе частиц. Подходящие методы измерения известны специалисту в данной области и описаны также, например, в прилагаемых примерах. В одном из предпочтительных вариантов осуществления способа по настоящему изобретению общий диаметр частицы варьирует в интервале от примерно 30 нм до примерно 2 мкм. Однако еще большее предпочтение отдается использованию частиц, имеющих общий диаметр в интервале от примерно 40 до примерно 500 нм, еще предпочтительнее в интервале от примерно 45 нм до примерно 300 нм, еще более предпочтительно в интервале от примерно 50 нм до примерно 200 нм.

Как уже указывалось, общий диаметр частиц по настоящему изобретению можно определить рядом прямых и непрямых методов, известных специалисту в данной области, которые включают, например, электронную микроскопию и динамическое рассеяние света. Предпочтительные нижние пределы диаметра ядра из оксида железа, заключенного в частице, составляют 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 85, 90, 95, 100 нм. Предпочтительные верхние пределы диаметра представляют 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85 и 80 нм. Возможны все комбинации вышеназванных верхнего и нижнего пределов, для того чтобы определить предпочтительный интервал для размера частиц, при условии, что значение верхнего предела больше значения нижнего предела, например от 40 до 400 нм, от 50 до 200 нм и т.д. Предпочтительные частицы по настоящему изобретению имеют диаметр ядра из оксида железа в интервале от примерно 25 нм до примерно 500 нм. Еще более предпочтительно, когда диаметр ядра из оксида железа находится в интервале от примерно 30 нм до примерно 200 нм, еще более предпочтительно от 35 нм до примерно 80 нм.

Другой объект настоящего изобретения включает частицы, которые могут быть получены способом по настоящему изобретению.

Еще один объект настоящего изобретения состоит из композиции, в которой, по меньшей мере, 2% частиц, заключенных в композиции, частиц, которые содержат магнитное ядро из оксида железа в фармацевтически приемлемой оболочке, являются частицами по настоящему изобретению или частицами, получаемыми способом настоящего изобретения. В предпочтительных вариантах осуществления пропорция частиц по настоящему изобретению или частиц, получаемых в соответствии с настоящим изобретением, является более высокой и составляет, по меньшей мере, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Пригодность композиций по настоящему изобретению для методов ИМЧ повышается одинаково с пропорцией частиц по настоящему изобретению или частиц, получаемых по настоящему изобретению.

Еще одним объектом настоящего изобретения является композиция, в которой диаметр частиц по настоящему изобретению или частиц, получаемых способом по настоящему изобретению, находится в интервале 10% от среднего диаметра частиц в отношении, по меньшей мере, 50% частиц. Повышение гомогенности в распределении по размеру и, таким образом, сигнала, генерируемого соответствующей частицей, является предпочтительным. В этой связи особенно предпочтительно, если, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% частиц по настоящему изобретению или частиц, получаемых способом по настоящему изобретению, имеют диаметр частиц, который находится в интервале 10% от среднего диаметра частиц. В этой связи средний диаметр частиц имеет значение, уже объясненное выше, то есть диаметр частиц является средним диаметром от всех частиц по настоящему изобретению, или частиц, полученных по настоящему изобретению, которые заключены в композиции.

Другим объектом настоящего изобретения является жидкость, которая содержит композицию по настоящему изобретению. Подходящие жидкости являются водными растворами, которые предпочтительно забуферены до физиологического рН и которые могут содержать соли, сахара и т.д., в частности, когда они предназначены для парентерального применения. Данные жидкости могут содержать такие добавки, как консерванты, стабилизаторы, детергенты, улучшающие вкус и запах вещества, наполнители и т.д. Множество веществ, которые можно добавлять в диагностические растворы, в зависимости от пути применения, известны специалисту в данной области. Эти добавки можно добавлять в жидкости по настоящему изобретению без какого-либо исключения, кроме несовместимостей с частицами по настоящему изобретению. Предпочтительно, когда жидкость находится в форме стабилизированного коллоидного раствора.

Другим объектом настоящего изобретения является применение композиции по настоящему изобретению или жидкости по настоящему изобретению для получения диагностических средств для применения при получении изображения с помощью магнитных частиц (ИМЧ) для диагностики заболеваний. Здесь предпочтительно, если заболевания выбраны из группы, состоящей из пролиферативных заболеваний, в частности опухолей и метастазов, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, заболеваний пищеварительного тракта, атеросклероза, инфаркта, патологических изменений в сосудистой системе, поджелудочной железы, печени, почек, головного мозга и мочевого пузыря, а также заболеваний, действующих на передачу электрического стимула, и нейродегенеративных заболеваний. Частицы, используемые здесь, предпочтительно являются частицами, описанными выше в качестве предпочтительных или особенно предпочтительных.

Еще одним объектом настоящего изобретения является использование композиции, в которой, по меньшей мере, 2% частиц, заключенных в композиции, которые содержат в фармацевтически приемлемой оболочке магнитное ядро из оксида железа, имеющее диаметр от 20 нм до 1 мкм и с отношением общий диаметр частицы/диаметр ядра менее 6, для производства диагностических средств для применения при получении изображения с помощью магнитных частиц (ИМЧ) для диагностики заболеваний. Здесь предпочтительно, когда заболевания выбраны из группы, состоящей из пролиферативных заболеваний, в частности опухолей и метастазов, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, заболеваний пищеварительного тракта, атеросклероза, апоплексии, инфаркта, патологических изменений в сосудистой системе, лимфатической системе, поджелудочной железы, печени, почек, головного мозга и мочевого пузыря, а также заболеваний, действующих на передачу электрического стимула, и нейродегенеративных заболеваний. Предпочтительными диаметрами ядра из оксида железа этих частиц являются диаметры, названные выше, но они включают также ядра из оксида железа, имеющие диаметр, по меньшей мере, 5 нм, по меньшей мере, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и 30 нм. Частицы, которые можно использовать при этом применении по настоящему изобретению, могут быть получены по методу, описанному выше.

Особенно предпочтительно, если частицы определяют способом, включающим следующие стадии:

(i) генерацию магнитного поля с объемным распространением напряженности магнитного поля, которое является таким, что первая парциальная зона с низкой напряженностью магнитного поля и вторая парциальная зона с более высокой напряженностью магнитного поля получаются в области исследования,

(ii) изменение объемного положения двух парциальных зон в области исследования так, что намагничивание частиц локально изменяется,

(iii) регистрацию сигналов, которые зависят от намагничивания в области исследования, на которую подействовало это изменение,

(iv) оценку сигналов с тем, чтобы получить информацию об объемном распределении магнитных частиц в области исследования.

При этом методе и на этой установке объемно негомогенное магнитное поле генерируется в области исследования. В первой парциальной зоне магнитное поле является таким слабым, что намагничивание частиц отличается в большей или меньшей степени от внешнего магнитного поля, то есть является ненасыщенным. Во второй парциальной зоне (то есть в остальной части области исследования вне первой части) магнитное поле является достаточно сильным, чтобы удержать частицы в состоянии насыщения. Намагничивание является насыщенным, когда намагничивание почти всех частиц ориентировано примерно в направлении внешнего магнитного поля, так что при любом дополнительном усилении магнитного поля намагничивание повышается там в значительно меньшей степени, чем в первой парциальной зоне, при условии соответствующего усиления магнитного поля.

Первая парциальная зона предпочтительно является объемно когерентной зоной; она может быть зоной в точечной форме, но может быть также областью в виде линии или поверхности. В зависимости от конфигурации первая парциальная зона является объемно окруженной второй парциальной зоной. Путем изменения положения двух парциальных зон в области исследования (общее) намагничивание в исследуемой области изменяется. На изменение в пространственном положении парциальных зон можно, например, воздействовать посредством изменяющегося во времени магнитного поля. Если намагничивание в области исследования или физические параметры, на которые оказано воздействие таким образом, измерить, из этого можно получить информацию об объемном распределении магнитных частиц в области исследования.

С этой целью получают и оценивают, например, сигналы, вызванные, по меньшей мере, одним витком из-за изменения во времени намагничивания в исследуемой области. Если изменение во времени магнитного поля действует на исследуемую область и на частицы в первой частотной полосе, то из этих сигналов, полученных этой спиралью, оценивают только те сигналы, которые содержат один или более из более высокочастотных компонентов, чем компоненты первой частотной полосы. Эти измеряемые сигналы генерируются, когда намагничивание, характерное для частиц, обычно протекает не линейным образом.

В отношении дополнительных объяснений способа и установки сделана ссылка на DЕ 10151778. Так как в указанном документе подробно описаны способ и установка, содержание DЕ 10151778, тем самым, полностью включено в виде ссылки по этому вопросу.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к применению композиции или жидкости по настоящему изобретению, причем установка для осуществления регистрации включает следующие средства:

а) средства генерации магнитного поля с объемным распространением напряженности магнитного поля, которое является таким, что в исследуемой области получают первую парциальную зону с низкой напряженностью магнитного поля и вторую парциальную зону с более высокой напряженностью магнитного поля,

b) средства для изменения объемного положения двух парциальных зон в исследуемой области так, что изменение намагничивания частиц происходит локально,

с) средства для регистрации сигналов, которые зависят от намагничивания в исследуемой области, на которые повлияло настоящее изменение в объемном положении,

d) средства оценки сигналов таким образом, чтобы получить информацию об объемном распределении магнитных частиц в исследуемой области.

Так как частицы, которые можно использовать по настоящему изобретению, дают возможность особенно высокого объемного разрешения, их можно использовать для диагностики пролиферативных заболеваний и, в частности, ранних стадий таких заболеваний. Пролиферативное заболевание, предпочтительно, выбрано из группы, состоящей из опухоли, предракового патологического состояния, дисплазии, эндометриоза и метаплазии.

Дополнительные предпочтительные заболевания, которые можно диагностировать, используя частицы, которые можно применять по настоящему изобретению, включают аутоиммунные заболевания, которые выбраны из группы, состоящей из ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, остеоартрита, нейропатической боли, очаговой алопеции, псориаза, псориатического артрита, острого панкреатита, отторжения трансплантата, аллергии, аллергического воспаления в легких, рассеянного склероза, болезни Альцгеймера, болезни Крона и системной красной волчанки.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения частицы по настоящему изобретению и частицы, получаемые по настоящему изобретению, можно использовать при способе локального нагревания, используя магнитные частицы, особенно предпочтительно, для создания гипертермии. В отношении дальнейших объяснений, касающихся метода и установки, делается ссылка на WО2004/018039. Так как в указанном документе подробно описаны способ и установка, содержание WО2004/018039, тем самым, полностью включено в виде ссылки по этому вопросу.

В другом варианте осуществления новые частицы по настоящему изобретению и частицы, получаемые по настоящему изобретению, можно использовать в качестве повышающих Т₂ контрастных веществ при получении изображения с помощью магнитного резонанса (МРИ). Данные частицы можно использовать в качестве контрастных веществ при МРИ для диагностики заболеваний и патологических изменений, выбранных из группы, состоящей из пролиферативных заболеваний, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, заболеваний пищеварительного тракта, атеросклероза, апоплексии, инфаркта, патологических изменений в сосудистой системе и сердце, лимфатической системе, поджелудочной железе, печени, почках, головном мозге и мочевом пузыре, а также заболеваний, влияющих на передачу электрического стимула, и нейродегенеративных заболеваний. Особое предпочтение отдается использованию данных частиц в качестве контрастных средств для МРИ при получении изображения печени или селезенки и для диагностики заболеваний этих органов. Данные частицы можно также использовать в качестве контрастных средств для ангиографии.

Следующие примеры объясняют настоящее изобретение без ограничения его конкретными вариантами осуществления. Специалист в данной области способен найти множество вариаций в отношении количеств и температур, описанных в экспериментах, все эти изменения находятся в объеме настоящего изобретения, которое определено прилагаемой формулой изобретения.

Описание фигур и изображений

Фиг.1 представляет распределение по частоте размера ядер получаемых частиц, причем частота колеблется между 0 и 1 (соответствует 0-100%).

Фиг.2 Изображение, отмеченное А, представляет изображение в ПЭМ композиции по примеру 1с) (остаток 1). Можно видеть несколько несферических ядер со средним диаметром примерно 35 нм. Изображение, отмеченное В, представляет большое ядро в ПЭМ высокого разрешения из препарата по 1с) (остаток 1). Можно видеть скопление небольших монокристаллов, которые агрегированы с образованием поликристалла большего размера.

Фиг.3 Результаты исследования с помощью ИМЧ при использовании трех разных партий доступного для приобретения резовиста® (Resovist®). В виде результата показана амплитуда Фурье полученного сигнала (ось y) при специфических гармонических составляющих частоты поля возбуждения (ось х).

Фиг.4 Изображение, отмеченное А, представляет фантом для генерации изображений с использованием установки и способа по DЕ 10151778. Этот фантом содержит множество полостей (показанных на изображении как темные точки), которые заполнены резовистом®. Изображение В представляет изображение этого фантома, причем полости, заполненные резовистом®, видны как светлые области.

Фиг.5 Результат оценки ИМЧ с использованием препарата по примерам 1b) и 1с) (два разных средних общих диаметра) представлены в сравнении с доступным для приобретения резовистом®. В качестве результата представлена амплитуда Фурье полученного сигнала (ось y) при специфических гармонических составляющих частоты поля возбуждения (ось х).

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Получение магнитных частиц оксида железа

Пример 1а) Получение исходной дисперсии частиц

105 г карбоксидекстрана (КДКС), имеющего собственную вязкость 0,050 дл/г, растворяют в 350 мл воды. При подаче азота к нему добавляют водный раствор 13,6 г тетрагидрата хлорида железа(II) и 140 мл 1 М раствора хлорида железа(III) (соответствующего 37,8 г гексагидрата хлорида железа(III)). Затем к этому добавляют 242 мл 3 Н раствора NаОН при перемешивании в течение 15 минут, и смесь нагревают до 80°С. Показатель рН доводят до 7,0 путем добавления 6 Н НСl. Смесь дополнительно перемешивают при кипячении с обратным холодильником в течение 1 часа.

После охлаждения образец центрифугируют (2100 г/30 мин). Этанол добавляют в пропорции, соответствующей 78% от объема надосадочной жидкости над данным осадком. Образец снова центрифугируют (2100 г/10 мин). Осадок растворяют в воде и диализируют против воды (16 час). Диализат доводят до рН 7,2 посредством NаОН и концентрируют при пониженном давлении. Концентрат фильтруют через мембранный фильтр (размер пор: 0,2 мкм), чтобы получить 186 мл суспензии стабилизированных карбоксидекстраном частиц оксида железа. Данный способ получения соответствует способу получения частиц, которые содержатся в резовист®.

Концентрация железа: 52 мг/мл (содержание железа: 91%), диаметр частиц магнитных оксидов железа: 9 нм, общий диаметр частиц: 61 нм, весовое отношение водорастворимый карбоксиполисахарид/железо 1,15, намагничивание при 1 Тесла: 98 эмед/г железа, Т₂ релаксивность: 240 (мМ·сек)^-1.

Пример 1b) Получение малых частиц

Магнитный фильтр образован кольцевым магнитом (NЕ 1556, IВS Magnet Berlin, внешний диаметр 15 мм, внутренний диаметр 5 мм, высота 6 мм) и разделительной камерой, расположенной во внутреннем объеме кольцевого магнита. Разделительная камера состоит из стенки, изготовленной из пластика, и заполнена сферическим порошком железа (диаметр примерно 0,3 мм). Дисперсию частиц из оксида железа (по примеру 1а) 0,8 мл, имеющую содержание железа 500 ммоль/л и Т₂ релаксативность примерно 240 (мМ·сек)^-1, фильтруют через магнитный фильтр с помощью гидростатического давления. Т₂ релаксативность фильтрата, полученного таким образом, составляет 41 (мМ·сек)^-1.

Пример 1с) Получение новых магнитных частиц оксида железа

После выделения частиц оксида железа, отфильтрованных по примеру 1b), остаток на магнитном фильтре получают путем споласкивания магнита, когда магнит отключен. Полученная суспензия частиц (остаток 1) имеет Т₂ релаксативность 293 (мМ·сек)^-1, и ее характеристики определяют в соответствии с примерами 2, 3, 4 и 5.

После осуществления фильтрования в соответствии с примером 1b) второй раз, но на этот раз с более слабым магнитным полем, остаток (остаток 2), полученный после отключения магнита, имеет релаксативность Т₂ 388 (мМ·сек)^-1.

Пример 2: Определение общего размера частиц по динамическому рассеянию света

Используя прибор для определения размеров частиц от компании Malvern (ZetaSizer 3000 Hs a), измеряют значение коэффициентов диффузии (интенсивность-взвешенное) частиц, и по ним рассчитывают средний гидродинамический диаметр. Этот метод представляет одну из возможностей для определения среднего общего диаметра частиц. Однако в этом случае определяется диаметр ядра из оксида железа плюс гидратированная оболочка.

Результаты обобщены в следующей таблице 1.

Пример 3: Определение размера ядра с помощью электронной микроскопии

Используя просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ), сильно контрастные ядра из оксида железа, так как они обладают более высокой электронной плотностью, чем оболочка, увеличивают и фотографируют. Размер частиц, изображение которых получено таким образом, измеряют и рассчитывают фактический размер ядра по показателю увеличения. Подсчитывают от 50 до 100 частиц, и результаты наносят на гистограмму. Также рассчитывают среднеарифметический диаметр ядра (число-взвешенное). Результаты обобщены в виде гистограммы на фиг.1 и в табличной форме в таблице 2.

Пример 4: Определение отношения общий диаметр/диаметр ядра

Отношения выражены по диаметрам в соответствии с примером 2 и размерам ядер в соответствии с примером 3 и обобщены в следующей таблице 3.

Пример 5: Идентификация поликристалличности с помощью электронной микроскопии и электронной микроскопии высокого разрешения

Поликристалличность частиц определяли с помощью электронной микроскопии и электронной микроскопии высокого разрешения стандартными методами, такими как, например, просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ; ТЕМ) на микроскопе СМ2000 FЕG (Philips) при 200 кВ (ПЭМВР). Образцы помещали на перфорированную угольную пленку на медной сетке. Этим способом исследовали частицы остатка 1. Показаны результаты при разных разрешениях на фиг.2А и 2В.

Пример 6: ИМЧ с использованием магнитных частиц из оксида железа

Пример 6а): Получение образцов для экспериментов с ИМЧ

В ПВХ пластине (толщина 1 мм, поперечные размеры примерно 2×2 мм²) высверливают отверстие, имеющее диаметр 0,5 мм. Одну сторону закрывают клейкой лентой. Затем, используя тонкую медную проволоку (0,2 мм, с покрытием), вещество каплями помещают в отверстие до тех пор, пока последнее не будет заполнено полностью. Настоящее вещество используют в неразбавленной форме. Открытую сторону отверстия закрывают липкой лентой, и пластину приклеивают на армированный стекловолокном стержень. Образец затем запечатывают акрилатным клеем со всех сторон.

Образец устанавливают в сканер для ИМЧ, как описано в DЕ 10151778 А1, и производят измерения. В отличие от генерации изображения, как описано в DЕ 10151778 А1, образец исследуют только в отношении измеряемой силы сигнала при разных частотах. Для этой цели в сканере для ИМЧ используют магнитное градиентное поле, как объяснено на фиг.2 из DЕ 10151778 А1 и относящемся к ней описании. Максимальная напряженность градиентного поля составляет 3,4 Т/м/μ0. Знакопеременное магнитное поле, которое обозначено Н(t) на фиг.4а DЕ 10151778 А1, накладывается на это градиентное поле. Амплитуда знакопеременного поля составляет 10 мТ/μ0 в направлении максимального градиента градиентного поля, а частота составляет 25,25 кГц. Образец может перемещаться в сканере для ИМЧ механически, так что можно обнаружить данные от разных точек измерения. В настоящее время регистрируют 52×52 точек измерения, причем эти точки распределены по площади поверхности 10×10 мм². Время измерения в каждой точке составляет 0,4 сек.

Из сигналов, зарегистрированных в точках измерения 52×52, определяют значение сигнала, имеющее наивысшую и самую низкую силу. Эти значения сигнала являются трансформированными по Фурье и поэтому являются сложными значениями. Во первых, выражают разницу между реальными частями наивысшего и наименьшего значения сигнала и разницу между мнимыми частями наивысшего и наименьшего значения сигнала. Квадратный корень из суммы квадратов двух определенных различий (ось y или вертикальная ось) при номинальных кратностях частоты знакопеременного магнитного поля (ось х или горизонтальная ось) затем в виде результата помещают на график.

Пример 6b): ИМЧ с использованием резовиста®

Получают резовист®, доступный для приобретения продукт, и производят измерения в соответствии с примером 6а). Концентрация железа в резовист® составляет 500 ммоль Fе/л. Результаты обобщены на фиг.3. Наблюдалось отношение сигнала к шуму до 25-кратного возбуждения частоты поля. Кроме того, были получены воспроизводимые результаты в независимых экспериментах (3 разных партии резовист®). Можно было продемонстрировать, что резовист® пригоден для ИМЧ.

Пример 6с): ИМЧ с использованием препарата по примеру 1b)

Концентрацию железа в суспензиях по примеру 1b) доводят до 500 ммоль Fе/л, и затем получают препарат в соответствии с примером 6а) и производят измерения.

Результаты показаны на фиг.5 вместе с результатами примера сравнения и результатами из примера 6d).

Было обнаружено, что композиция по примеру 1b) (фильтрат) дает значительно худшее отношение сигнала к шуму, чем композиция по примеру 1а) (исходная дисперсия) или резовист®.

Пример 6d): ИМЧ с использованием препаратов по примеру 1с)

Концентрация железа в суспензиях по примеру 1с) (остаток 1 и остаток 2) доводят до 500 ммоль Fе/л, а затем получают препараты и производят измерения в соответствии с примером 6а). Результаты показаны на фиг.5 вместе с результатами образца сравнения и результатами из примера 6с).

Было обнаружено, что композиции, содержащие новые частицы по настоящему изобретению - препарат по примеру 1с), проявляют лучшие соотношения сигнала к шуму, чем исходная дисперсия по примеру 1а) (и образец сравнения из коммерчески доступного контрастного средства резовист®, и фильтрат по примеру 1b).

Новые частицы по настоящему изобретению, заключенные в препарате по примеру 1с), соответственно пригодны для улучшенного ИМЧ.

Пример 6е): Получение изображения ИМЧ с использованием резовиста®

Фиг.4 представляет изображение А, изображение фантома для получения изображений с использованием установки и способа по DЕ 10151778. Этот фантом содержит множество полостей (показанных в виде темных пятен на изображении), которые заполнены резовистом®. Фиг.4 представляет изображение В, изображение этого фантома, где полости, заполненные резовистом®, выглядят как светлые полости.

Пример 7: Синтез частиц оксида железа с комплексоном и соединение поли-His-L-селектина (МЕСА79) как контрастного средства для применения in vivo

В тексте, представленном ниже, описано присоединение НТК (производного нитрилотриуксусной кислоты; α-N-[бис-карбоксиметил]лизина) к стабилизированным карбоксидекстраном магнитным частицам из оксида железа, полученным по примеру 1).

С этой целью стабилизированные карбоксидекстраном магнитные частицы из оксида железа окисляют в водном растворе 31-кратным избытком частиц перйодата натрия (на основе карбоксидекстрана) в течение 30 минут при перемешивании в темноте при комнатной температуре (КТ). Перйодат натрия затем количественно отделяют путем гельфильтрации. Декстран-магнетиты элюируют в фосфатный буфер (0,1 М фосфатный буфер рН 7,0). Затем к окисленным декстран-магнетитам добавляют НТК, и смесь инкубируют в темноте в течение 2 часов при КТ при периодическом взбалтывании. При этом процессе НТК может присоединяться к декстран-магнетитам в избытке. Затем добавляют 1/10 объема восстанавливающего средства диметилборана (150 мМ в Н₂О), и смесь инкубируют в темноте в течение еще 2 часов при КТ при периодическом перемешивании. Последнюю стадию повторяют с последующей инкубацией при 4°С в течение ночи. Отделение несвязанной НТК от НТК, которая связалась с поверхностью частиц, осуществляют путем гель-фильтрации или ультрафильтрации. Эти частицы элюируют в PBS или в 0,1 М HEPES (в каждом случае рН 7,0-7,4) и стабилизируют путем добавления 5 мг/мл карбоксидекстрана (конечная концентрация). Частицы фильтруют в стерильных условиях и добавляют азид натрия при конечной концентрации 0,1%. Затем определяют содержание железа в суспензии и средний размер частиц.

Чтобы проверить эффективность, с которой НТК присоединяется к поверхности частиц, частицы сначала инкубируют с 10 мМ ЭДТА в PBS или 0,1 М HEPES в течение 1 часа при КТ при периодическом взбалтывании. ЭДТА затем удаляют путем гель-фильтрации или ультрафильтрации, и образец инкубируют с Со²⁺, Ni²⁺ или сравнимыми двухвалентными ионами, которые образуют комплексы с комплексоном.

Избыток ионов затем отделяют от частиц путем гель-фильтрации или ультрафильтрации. Число молекул НТК, которое было связано с поверхностью частиц, может быть определено путем измерения IСР связанных ионов, вычитая ионы, которые связываются с немодифицированными декстран-магнетитами.

Пример 8: Присоединение поли-His-L-селектина к НТК-декстран-магнетитам

Несущие НТК декстран-магнетиты инкубируют сначала с ионами Ni²⁺ (или подобными ионами), а затем с поли-His-меченными молекулами селектина в PBS или 0,1 М HEPES с 0,2% молока (чтобы снизить неспецифическое связывание) в течение 10 мин при КТ. Несвязанные молекулы селектина удаляют с помощью подходящих установок для ультрафильтрации или путем магнитных колонок (Miltenyi Biotec) c приложенным магнитным полем. Полученные в результате конструкции контрастного средства проверяют in vitro на их способность связываться, например, в замороженном срезе периферических лимфатических узлов мыши, и затем их можно использовать в экспериментах in vivo для получения изображения.

Пример 9: Присоединение стрептавидина к магнитным частицам из оксида железа по примеру 1)

Суспензии по примеру 1) очищают с помощью 3-кратного осаждения в ультрацентрифуге и компенсирования равного объема 0,02% тритонХ100-натрийацетатного буферного раствора (рН 4,5). 1 мл очищенной суспензии обрабатывают 1 мл 2% раствора стрептавидина и перемешивают в течение 60 минут при 4°С. Затем добавляют 10 мг EDC. В течение этого процесса контролируют значение рН. Если рН отклонится от 4,5±0,2, его нужно снова вернуть в исходный интервал, используя 0,01 Н НСl или 0,01 Н NаОН.

Инкубацию продолжают в течение примерно 16 часов при 4°С при перемешивании, а затем заканчивают 15-минутной инкубацией с 1 М этаноламином. Магнитные частицы оксида железа, с которыми связался стрептавидин, отделяют от несвязанного белка и от побочных продуктов посредством многократного центрифугирования.

Успех операции присоединения демонстрируется посредством исследования агрегации при добавлении множественно модифицированного биотином БСА. После добавления агрегированного биотин-БСА стрептавидина функционализированные частицы оксида железа образуют видимые агрегаты, тогда как необработанные частицы оксида железа, с другой стороны, не проявляют какой-либо агрегации и, таким образом, стабильно остаются в дисперсии.

Заключение о количественных параметрах, касающихся успешного присоединения, можно получить с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BioCore, BioCore2000) на фиксированном биотине-БСА.

Пример 10: Связывание антител МЕСА79 с функционализированными стрептавидином магнитными частицами оксида железа по примеру 9)

Магнитные частицы оксида железа, с которыми связан стрептавидин, в соответствии с примером 9), очищают двухкратным центрифугированием в буфере HEPES/0,01% растворе тритонХ100, забуферивают и концентрируют. Очищенные микрокапсулы, которые теперь связаны с биотином, инкубируют в течение 1 часа с 1 мг биотинилированных антител МЕСА79, а затем промывают. Таким же образом, контрольные частицы можно получить, используя биотинилированные изотипные антитела IgМ (например, клон R4-22).

50% количества использованных антител связываются с микрокапсулами (количественное определение BioCore: колонка насыщения антителами к IgМ-FITC). Антитела МЕСА79 распознают «адрессин периферических узлов», лигандную группу, которая связывается только на высоком эндотелии венул периферических и мезентеральных лимфатических узлов.

Пример 11: Присоединение антимышиных СD105 антител к магнитным частицам оксида железа

Способом, аналогичным способу из примера 10), биотинилированные антимышиные СD105 антитела связывают с функционализированными стрептавидином магнитными частицами оксида железа по примеру 9). СD105 антитела распознают ангиотензиноспецифические рецепторы, и их можно использовать для связанной с получением изображения диагностики опухолей.

Пример 12: Присоединение антимышиных IСАМ-1 антител к магнитным частицам оксида железа

Способом, аналогичным способу из примера 10), биотинилированные антимышиные IСАМ-1 антитела связывают с функционализированными стрептавидином магнитными частицами оксида железа по примеру 9). IСАМ-1 антитела распознают центры воспаления, например, на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) у мышей. Модель ЭАЭ используют в качестве модели заболевания in vivo в отношении рассеянного склероза.

Реферат

Изобретение относится к частице для получения диагностических средств для применения при получении изображений с помощью магнитных частиц (ИМЧ), которая содержит поликристаллическое магнитное ядро из оксида железа в оболочке из карбоксидекстрана. Ядро имеет диаметр от 30 нм до 80 нм, при этом отношение общего диаметра частицы к диаметру ядра составляет менее 6, частица состоит из, по меньшей мере, 2 спаянных кристаллов и имеет релаксативность Т2, по меньшей мере, 290 (мМ·сек)-1, измеренную при напряженности магнитного поля 1 тесла в водном коллоидном растворе частиц. Изобретение также относится к способу получения указанных частиц, включающему смешивание водного раствора солей железа с водным раствором щелочи в присутствии карбоксидекстрана с образованием коллоидного раствора частиц, который затем пропускают через магнитное градиентное поле с выделением задержанных после устранения магнитного поля в нем частиц. Изобретение также относится к композиции и жидкости, которые содержат указанные частицы и пригодны для получения изображений с помощью магнитных частиц. Изобретение позволяет получать изображения высокого разрешения без риска и при низкой напряженности магнитного поля. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 5 ил.

Формула