Система и способ для обнаружения амилоидных белков - RU2577810C2

Чертежи

Показать все 12 чертежа(ей)

Описание

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ 3АЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №61/374131, поданной 16 августа 2010 года, и предварительной заявке на патент США №61/425490, поданной 21 декабря 2010 года, а также в соответствии 35 U.S.С. § 119 или 365 испрашивает приоритет по заявке на Европейский патент №11001148.3, поданной 11 февраля 2011 года.

Данная заявка также связана с заявкой на патент США №11/786514, поданной 11 апреля 2007 года, по которой выдан патент США №7828436, и с заявкой на патент США №12/154226, поданной 21 мая 2008 года и опубликованной в виде опубликованной заявки на патент США №2009/0041666, а также с патентом США №7107092 и с патентом США №7297326.

Исчерпывающее изложение всех вышеупомянутых патентов, публикаций и заявок на патенты приведено здесь в виде соответствующих ссылок.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Обнаружение заболеваний на их ранних стадиях всегда является желательным. Раннее обнаружение позволяет осуществлять раннее лечение, что, в целом, позволяет достигать более успешных результатов при лечении различных заболеваний. Было открыто, что анализ глаз людей и, в частности, хрусталиков глаз, может помочь получить свидетельства наличия различных типов заболеваний. Например, исследователи обнаружили наличие β-амилоидных пептидов и их агрегатов в надъядерном участке хрусталика глаз пациентов с болезнью Альцгеймера [AD]. См. патент США 7297326 Goldstein et al. Поскольку надъядерный участок является фрагментом толщиной в доли миллиметра, полученные измерения, относящиеся к этому участку хрусталика глаза, должны быть точными в плане месторасположения, определенными в плане информативности и быстрыми в плане получения. Это тем более верно в связи с тем, что глаз человека находится практически в постоянном движении, даже в тех случаях, когда внимание пациента фиксируется на освещенном объекте.

Было доказано, что присутствие или увеличение количества β-амилоидных пептидов и их агрегатов в надъядерных и/или кортикальных слоях хрусталика глаза испытуемого млекопитающего по сравнению с нормальным контрольным значением указывает на то, что испытуемое млекопитающее страдает нейродегенеративным заболеванием, таким как амилоидогенное заболевание, или обладает риском его развития.

Существует постоянная необходимость в наличии систем и способов, позволяющих осуществлять ранее обнаружение амилоидогенных заболеваний.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения предлагается способ обнаружения амилоидного белка в глазе млекопитающего, например амилоидного белка, представляющий собой агрегат. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения обнаружение амилоидного белка указывает на наличие амилоидогенного заболевания. Способ включает освещение глаза источником света с, по меньшей мере, длиной волны или поляризацией или их комбинацией, при этом каждая из них является подходящей для индуцирования флуоресценции в, по меньшей мере, амилоидсвязывающем соединении, при этом амилоидсвязывающее соединение связано с амилоидным белком, при этом амилоидсвязывающее соединение введено в глаз и особым образом связано с амилоидным белком, указывающим на наличие амилоидогенного заболевания; полученный свет включает флуоресценцию, индуцированную в результате освещения глаза; а также определение времени затухания флуоресценции при том, что флуоресценция, по меньшей мере, индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком; исследование возможности определения наличия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе на основе, по меньшей мере, времени затухания.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения способ может также включать определение интенсивности флуоресценции при том, что флуоресценция индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком. Количество амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком, может быть определено на основе, по меньшей мере, интенсивности или времени затухания. Способ может также включать определение месторасположения части глаза, такой как капсула хрусталика глаза, на основе увеличения сигнала флуоресценции в связи с естественной флуоресценцией, излучаемой тканями глаза. По меньшей мере, один участок глаза может быть использован в качестве образца при использовании освещения источником света, при этом выборка включает выполнение, по меньшей мере, одного измерения всего участка или выборку различных мест в рамках участка или участков с использованием освещения источником света, при этом выборка различных месторасположений включает освещение, по меньшей мере, одной точки, плоскости и/или объема глаза. Выборка может включать выборку различных мест в рамках более чем одного участка глаза. Например, планарные сканограммы глаза могут быть выполнены с помощью источника света последовательно в плоскостях, лежащих вдоль перпендикулярной оси по направлению в глубину глаза. Расположение надъядерного участка глаза может быть определено на основе (i) расстояния от определенной анатомической структуры, такой как поверхность капсулы хрусталика глаза или поверхность роговицы или (ii) обнаружения изменения (наклона) интенсивности. Определение присутствия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком, может включать определение присутствия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком на основе фоновой аутофлуоресценции тканей глаза и аутофлуоресценции других неспецифичных частиц, а также несвязанного трейсера. Способ может включать определение, по меньшей мере, присутствия или количества более чем одного из следующих: амилоидсвязывающего соединения; амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком, и амилоидного белка. Амилоидный белок может представлять собой агрегат или агрегат предамилоидного белка (включая димеры, тримеры или олигомеры более высокого порядка пептидов Аβ_1-42 и/или Аβ_1-40). Например, амилоидный белок может представлять собой β-амилоид. Амилоидогенное заболевание может представлять собой болезнь Альцгеймера.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения амилоидсвязывающее соединение может включать молекулярный ротор, хризамин и/или производное хризамина, Конго красный и/или производное амилоидсвязывающее соединение Конго красного, хризамин G или производное амилоидсвязывающее соединение хризамина G, тиофлавин Т или производное амилоидсвязывающее соединение тиофлавина Т, тиофлавин S или производное амилоидсвязывающее соединение тиофлавина S. Способ может включать определение, по меньшей мере, присутствия амилоидного белка только на основе обнаруженной флуоресценции. Способ может также включать определение среднего количества фотонов с определенной скоростью затухания в определенном участке глаза. Скорость доставки амилоидсвязывающего соединения в глаз, пространственное распределение амилоидсвязывающего соединения, доставляемого в глаз, и/или градиент концентрации амилоидсвязывающего соединения на поверхности роговицы глаза могут быть определены на основе обнаруженной флуоресценции. Также, пространственное распределение амилоидсвязывающего соединения и/или распределение по времени амилоидсвязывающего соединения в водянистой влаге глаза могут быть определены на основе обнаруженной флуоресценции.

Способ может также включать определение, по меньшей мере, одной величины анатомической структуры или субструктуры глаза на основе естественного флуоресцентного возбуждения, по меньшей мере, части анатомической структуры или субструктуры. Определение, по меньшей мере, одной величины может включать, по меньшей мере, определение толщины структуры или субструктуры, определение формы структуры или субструктуры и определение расстояния между одной или несколькими структурами или субструктурами глаза. Например, определение, по меньшей мере, одной величины может включать определение толщины роговицы, формы роговицы, глубины водянистой влаги, формы хрусталика или толщины хрусталика или проведение внутренних измерений внутри хрусталика или другой структуры или субструктуры глаза, таких как расстояния от поверхности хрусталика до коры или надъядерного участка или ядра. Способ может также включать обнаружение флуоресценции, индуцируемой глазом, с помощью фотодетекторного устройства, такого как, по меньшей мере, фотодиод, фотоумножитель, прибор с зарядовой связью (CCD) и прибор с интенсивной зарядовой связью (ICCD); например с помощью быстрого лавинного фотодиодного детектора. Способ может включать осуществление подсчета единичных фотонов индуцируемой глазом флуоресценции с корреляцией по времени. Подсчет единичных фотонов с корреляцией по времени может включать использование пульсирующего источника света и определение времени затухания флуоресценции на основе распределения количества фотонов в виде канальных единиц функции времени.

В других вариантах осуществления данного изобретения способ может включать сканирование глаза для определения возбужденной естественной флуоресценции и, определения, таким образом, по меньшей мере, одного целевого участка глаза; а также выборку, по меньшей мере, одного целевого участка глаза с помощью освещения источником света, при этом выборка включает выполнение. Например, способ может включать выполнение осевого сканирования (продольного сканирования) в глубину глаза для определения возбужденной естественной флуоресценции вдоль каждой точки осевой сканограммы и, таким образом, определения, по меньшей мере, одного целевого участка в глазе; а также выполнение планарных сканирований глаза с использованием источника света в последующих плоскостях, перпендикулярных направлению осевого сканирования для определения интенсивности флуоресценции и времени затухания флуоресценции, при этом флуоресценция индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком в каждой точке каждой планарной сканограммы. Способ позволяет осуществлять поиск амилоидного белка в глазе, указывающего на наличие амилоидогенного заболевания, в реальном времени.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения способ может также включать освещение глаза светом с подходящей длиной волны пикового участка спектра флуоресцентного возбуждения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе; а также обнаружение полученного из глаза света с подходящей длиной волны пикового участка спектра флуоресцентного излучения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе. Амилоидсвязывающее соединение может являться Соединением №11. Спектр возбуждения может обладать значением пика около 470 нм при длине волны освещения глаза в диапазоне ± около 20 нм пика спектра возбуждения, а спектр излучения может обладать значением пика около 580 нм при обнаружении света, полученного из глаза, длина волны которого лежит в диапазоне ± около 20 нм пика спектра излучения.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагается устройство для обнаружения амилоидного белка в глазе млекопитающего. Устройство включает источник света, настроенный для излучения света для освещения глаза с, по меньшей мере, длиной волны света, поляризацией света или их комбинацией, при этом каждая из них является подходящей для индуцирования флуоресценции в, по меньшей мере, амилоидсвязывающем соединении, при связи амилоидсвязывающего соединения с амилоидным белком, при этом амилоидсвязывающее соединение введено в глаз и особым образом связано с амилоидным белком, указывающим на наличие амилоидогенного заболевания; а оптический блок настроен для получения света, включая флуоресценцию, индуцированную в результате освещения глаза и определения времени затухания флуоресценции при том, что флуоресценция, по меньшей мере, индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком; исследование возможности определения наличия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе на основе, по меньшей мере, времени затухания.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения оптический блок может быть настроен для определения время затухания, по меньшей мере, одного из: молекулярного ротора на основе амилоидсвязывающего соединения; Конго красного и/или производного амилоидсвязывающего соединения Конго красного; амилоидсвязывающего соединения хризамина; производного амилоидсвязывающего соединения хризамина; хризамина G или производного амилоидсвязывающего соединения хризамина G; тиофлавина Т или производного амилоидсвязывающего соединения тиофлавина Т; тиофлавина S или производного амилоидсвязывающего соединения тиофлавина S. Оптический блок может определять интенсивность флуоресценции при том, что флуоресценция индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком. Оптический блок может быть настроен для определения количества амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком на основе, по меньшей мере, интенсивности или времени затухания. Оптический блок может быть настроен для определения среднего количества фотонов с определенной скоростью затухания в определенном участке глаза. Источник света может включать пульсирующий лазер. Устройство может также включать оптический сканирующий блок, настроенный для сканирования света, полученного от источника света в областях глаза. Оптический сканирующий блок может включать объектив, установленный на столе поступательного перемещения и сканер, включающий зеркальный гальванометр. Оптический сканирующий блок может быть настроен для выборки, по меньшей мере, одного участка глаза с помощью освещения источником света, при этом выборка включает осуществление, по меньшей мере, одного измерения, по меньшей мере, одного целого участка, по меньшей мере, одного участка или выборку различных участков в рамках, по меньшей мере, одного участка с помощью освещения источником света, выборку различных участков, включающую освещение, по меньшей мере, одной точки, плоскости или объема в рамках, по меньшей мере, одного участка. Оптический сканирующий блок может быть настроен для выборки различных участков в рамках более чем одного участка глаза. В одном примере оптический сканирующий блок может быть настроен для осуществления планарных сканирований глаза с помощью источника света последовательно в плоскостях, лежащих вдоль перпендикулярной оси по направлению в глубину глаза. Устройство может также включать фотодетекторный блок для обнаружения флуоресценции, излучаемой глазом, такого как, по меньшей мере, фотодиод, фотоумножитель, прибор с зарядовой связью (CCD) и прибор с интенсивной зарядовой связью (ICCD); например, лавинный фотодетектор.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения устройство может также включать модуль подсчета единичных фотонов с корреляцией по времени, получающий электрические сигналы от фотодетекторного блока при подсчете каждого фотона флуоресцентного света глаза. Устройство может включать, по меньшей мере, один процессорный модуль, настроенный для определения времени затухания флуоресценции на основе распределения количества фотонов в виде канальных единиц функции времени. Оптический блок может быть настроен для обнаружения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком на основе фоновой аутофлуоресценции тканей глаза и аутофлуоресценции других неспецифичных частиц, а также несвязанного трейсера. Оптический блок может быть настроен для обнаружения, по меньшей мере, присутствия или количества более чем одного из следующих соединений: амилоидсвязывающего соединения; амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком, и амилоидного белка. Амилоидный белок может представлять собой агрегат или агрегат предамилоидного белка. Например, амилоидный белок может представлять собой β-амилоид. Амилоидогенное заболевание может представлять собой болезнь Альцгеймера.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения оптический блок может быть настроен для обнаружения, по меньшей мере, присутствия амилоидного белка только на основе обнаруженной флуоресценции. Оптический блок может быть настроен для определения скорости доставки амилоидевязывающего соединения в глаз, пространственного распределения амилоидсвязывающего соединения, доставляемого в глаз, и/или градиент концентрации амилоидсвязывающего соединения на поверхности роговицы глаза на основе обнаруженной флуоресценции. Оптический блок может быть настроен для определения, по меньшей мере, пространственного распределения и распределения по времени амилоидсвязывающего соединения в водянистой влаге глаза на основе обнаруженной флуоресценции. Оптический блок может быть настроен для обнаружения месторасположения части глаза, такой как капсула хрусталика глаза, на основе увеличения сигнала флуоресценции в связи с естественной флуоресценцией, излучаемой тканями глаза. Оптический блок может быть настроен для определения расположения надъядерного участка глаза на основе (i) расстояния от определенной анатомической структуры, такой как поверхность капсулы хрусталика глаза или поверхность роговицы или (ii) обнаружения изменения (наклона) интенсивности. Оптический блок может быть настроен для определения, по меньшей мере, одной величины анатомической структуры или субструктуры глаза на основе естественного флуоресцентного возбуждения, по меньшей мере, части анатомической структуры или субструктуры, при этом определение, по меньшей мере, одной величины может включать, по меньшей мере, определение толщины структуры или субструктуры, определение формы структуры или субструктуры и определение расстояния между одной или несколькими структурами или субструктурами глаза.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения оптический блок может быть настроен для сканирования глаза для определения возбужденной естественной флуоресценции и, таким образом, определения, по меньшей мере, одного целевого участка глаза; а также выборки, по меньшей мере, одного целевого участка глаза с помощью освещения источником света, при этом выборка включает выполнение, по меньшей мере, одного измерения, по меньшей мере, одного целого участка, по меньшей мере, одного участка или выборку различных мест в рамках, по меньшей мере, одного участка с помощью освещения источником света, при этом выборка различных мест включает освещение, по меньшей мере, точки, плоскости или объема в рамках, по меньшей мере, одного участка; при этом выборка проводится для определения интенсивности флуоресценции и времени затухания флуоресценции, при этом флуоресценция индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком в, по меньшей мере, одном выбранном участке. Например, оптический блок может быть настроен для определения возбужденной естественной флуоресценции в каждой точке осевой сканограммы по направлению в глубину глаза (продольная сканограмма) и, таким образом, определения, по меньшей мере, одного целевого участка в глазе; и для определения интенсивности флуоресценции и времени затухания флуоресценции при том, что флуоресценция индуцируется связанным с амилоидным белком амилоидсвязывающим соединением в каждой точке каждого набора планарных сканограмм глаза (поперечные сканограммы) с использованием источника света в последующих плоскостях, перпендикулярных направлению продольной сканограммы. Устройство может быть настроено для осуществления поиска амилоидного белка в глазе, указывающего на наличие амилоидогенного заболевания, в реальном времени.

Далее, в других родственных вариантах осуществления данного изобретения источник света может быть настроен для излучения света с подходящей длиной волны пикового участка спектра флуоресцентного возбуждения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе; а оптический блок может быть настроен для обнаружения света с подходящей длиной волны пикового участка спектра флуоресцентного излучения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе. Амилоидсвязывающее соединение может являться Соединением №11. Спектр возбуждения может обладать значением пика около 470 нм при длине волны настроенного источника света в диапазоне±около 20 нм пика спектра возбуждения, а спектр излучения может обладать значением пика около 580 нм при обнаружении света оптическим блоком, настроенным на обнаружение света, длина волны которого лежит в диапазоне±около 20 нм пика спектра излучения. Амилоидный белок может указывать на наличие амилоидо генного заболевания.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагается способ диагностики амилоидогенного заболевания или предрасположенности к нему у млекопитающего, например примата (такого как человек), собак, кошек, овец, коров и т.п.. Способ включает освещение глаза млекопитающего источником света с, по меньшей мере, длиной волны, поляризацией или их комбинацией, при этом каждая из них является подходящей для индуцирования флуоресценции в, по меньшей мере, амилоидсвязывающем соединении, при этом амилоидсвязывающее соединение связано с амилоидным белком, указывающим на наличие амилоидогенного заболевания, при этом амилоидсвязывающее соединение введено в глаз и особым образом связано с амилоидным белком, указывающим на наличие амилоидогенного заболевания; полученный свет включает флуоресценцию, индуцированную в результате освещения глаза; а также определение времени затухания флуоресценции при том, что флуоресценция, по меньшей мере, индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком; исследование возможности определения наличия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе на основе, по меньшей мере, времени затухания. Увеличение связывания амилоидсвязывающего соединения с амилоидным белком в глазе по сравнению с нормальным контрольным уровнем связывания указывает на наличие амилоидогенного заболевания или риска развития амилоидогенного заболевания у млекопитающего. Амилоидогенное заболевание может являться болезнью Альцгеймера.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагается способ идентификации анатомической структуры глаза млекопитающего. Способ включает освещение глаза источником света с, по меньшей мере, длиной волны, поляризацией или их комбинацией, при этом каждая из них является подходящей для индуцирования естественной флуоресценции в анатомической структуре глаза; и определение участка глаза с наибольшим изменением интенсивности естественной флуоресценции, индуцированной в результате освещения с помощью источника света; исследование возможности идентификации анатомической структуры на основе участка с наибольшим изменением интенсивности естественной флуоресценции. В определенном варианте осуществления данного изобретения описанное здесь устройство в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения используется в данном способе.

Далее, в других вариантах осуществления данного изобретения анатомическая структура может включать анатомическую структуру переднего сегмента глаза. Идентификация анатомической структуры может включать определение участка анатомической поверхности, такое как определение участка поверхности капсулы хрусталика глаза на основе определения участка с наибольшим увеличением интенсивности естественной флуоресценции. Идентификация анатомической структуры может включать определение, по меньшей мере, толщины роговицы, формы роговицы, глубины водянистой влаги, формы хрусталика, толщины хрусталика и толщины и/или формы субструктур хрусталика глаза (например, капсулы хрусталика, коры, надъядерного участка, ядра) на основе естественной флуоресценции глаза, индуцируемой источником света; и может включать определение внутриглазного расстояния между, по меньшей мере, двумя анатомическими структурами глаза. Способ может также включать использование источника света для обнаружения амилоидного белка, указывающего на наличие амилоидогенного заболевания, в глазе млекопитающего. Способ может включать освещение глаза млекопитающего источником света, при этом источник света также включает, по меньшей мере, длину волны или поляризацию или их комбинацию, при этом каждая из них является подходящей для индуцирования флуоресценции в, по меньшей мере, амилоидсвязывающем соединении, при этом амилоидсвязывающее соединение связано с амилоидным белком, указывающим на наличие амилоидогенного заболевания, при этом амилоидсвязывающее соединение введено в глаз и особым образом связано с амилоидным белком, указывающим на наличие амилоидогенного заболевания;

полученный свет включает флуоресценцию, индуцированную в результате освещения глаза; а также определение времени затухания флуоресценции при том, что флуоресценция, по меньшей мере, индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком; исследование возможности определения наличия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе на основе, по меньшей мере, времени затухания. Определение присутствия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком, может включать определение присутствия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в фоновой аутофлуоресценции тканей глаза и аутофлуоресценции других неспецифичных частиц, а также несвязанного амилоидсвязывающего соединения. Способ может делать возможным поиск амилоидного белка в глазе, указывающего на наличие амилоидогенного заболевания, в реальном времени. Способ может также включать освещение глаза светом с подходящей длиной волны пикового участка спектра флуоресцентного возбуждения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе; а также обнаружение полученного из глаза света с подходящей длиной волны пикового участка спектра флуоресцентного излучения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе. Амилоидсвязывающее соединение может являться Соединением №11. Спектр возбуждения может обладать значением пика около 470 нм при длине волны освещения глаза в диапазоне ± около 20 нм пика спектра возбуждения, а спектр излучения может обладать значением пика около 580 нм при обнаружении света, полученного из глаза, длина волны которого лежит в диапазоне ± около 20 нм пика спектра излучения.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения способ может позволять отличать, по меньшей мере, два различных флуорофора с аналогичными спектрами флуоресценции в глазе на основе, по меньшей мере, времени затухания, при этом аналогичные спектры флуоресценции включают, по меньшей мере, значительное наложение в спектрах излучения или спектрах возбуждения. Способ может также включать представление распределения, по меньшей мере, интенсивности флуоресценции или времени затухания, по меньшей мере, одного флюорофора в двух измерениях. Также, способ может включать определение количества связанных фотонов и количества несвязанных фотонов в глазе на основе, по меньшей мере, интенсивности флуоресценции или времени затухания, по меньшей мере, одного флюорофора. Способ может включать представление распределения интенсивности флуоресценции и времени затухания амилоидсвязывающего соединения, связанного с белком и амилоидсвязывающего соединения, не связанного с белком, в двух измерениях. Представление в двух измерениях может быть синхронизировано с помощью, по меньшей мере, сканера или лазера. Способ может также включать определение параметра с помощью усреднения интенсивности флуоресценции, связанной с определенным временем затухания в определенном участке глаза. Кроме того, способ может также включать выравнивание источника света относительно глаза вдоль софокусного расстояния для определения необходимой точки глаза.

В другом варианте осуществления данного изобретения предлагается способ определения связанных с белком флюорофоров в ткани глаза. Способ включает освещение ткани глаза источником света с, по меньшей мере, длиной волны или поляризацией или их комбинацией, при этом каждая из них является подходящей для индуцирования флуоресценции в, по меньшей мере, амилоидсвязывающем соединении, при этом амилоидсвязывающее соединение связано с амилоидным белком, при этом амилоидсвязывающее соединение введено в ткань глаза и особым образом связано с амилоидным белком, указывающим на наличие амилоидогенного заболевания; полученный свет включает флуоресценцию, индуцированную в результате освещения глаза; а также определение времени затухания флуоресценции при том, что флуоресценция, по меньшей мере, индуцируется амилоидсвязывающим соединением, связанным с амилоидным белком; исследование возможности определения наличия амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в ткани глаза на основе, по меньшей мере, времени затухания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Вышеизложенное будет более понятно благодаря нижеприведенному более подробному описанию примерных вариантов осуществления данного изобретения и прилагаемым фигурам с обозначениями, относящимися к одним и тем же соответствующим частям, изображенным на разных фигурах. Фигуры не подлежат обязательному увеличению; акцент делается на иллюстрировании вариантов осуществления настоящего изобретения.

Фиг.1 является схематичной диаграммой оптической системы в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.2А является графиком интенсивности флуоресценции относительно смещения, измеренной в рамках реализации алгоритма обнаружения поверхности хрусталика при продольном сканировании глаза, а Фиг.2B является графиком первого производного графика на Фиг.2А в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.3А и 3B являются графиками, иллюстрирующими определение времени затухания флуоресценции в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.4 является схематичной диаграммой, иллюстрирующей использование подсчета единичных фотонов с корреляцией по времени в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

На Фиг.5 изображена структура Соединения №11, которое может использоваться в качестве флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.6 является флуоресцентной гистограммой флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения Соединение №11, полученной с помощью устройства в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.7 является диаграммой изображения времени жизни флуоресценции Соединения №11 и связанным с ним изображением интенсивности, полученной в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.8А является изображением времени жизни флуоресценции, демонстрирующим амилоидсвязывающее соединение и амилоидсвязывающее соединение, связанное с агрегатным пептидом, в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.8B является изображением времени жизни флуоресценции, демонстрирующим амилоидсвязывающее соединение и амилоидсвязывающее соединение, связанное с агрегатным пептидом, время жизни флуоресценции которых изображено на Фиг.8А в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.9А является схемой частоты фотонов с определенной скоростью затухания, относящихся к флуоресцентному амилоидсвязывающему Соединению №11 при измерении на кроликах в исследовании in vivo в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.9B является гистограммой флуоресценции, относящейся к исследованию на Фиг.9А в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.10А и Фиг.10B являются схемами, демонстрирующими частоту фотонов с определенной скоростью затухания, относящихся к флуоресцентному амилоидсвязывающему соединению Соединение №11 при измерении утром для использования в качестве базовой линии и в конце дня после введения кроликам в рамках исследования в эксперименте в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.11А и 11B являются двумя изображениями времени жизни флуоресценции, полученными при базовой линии и после окончания четвертого дня исследования на животных в эксперимента в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.12 является спектром излучения флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения Соединение №11 при возбуждении на уровне 470 нм в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приведено описание примерных вариантов осуществления данного изобретения.

в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения предлагается система и способ неинвазивного, раннего и надежного обнаружения амилоидного белка, который может формировать агрегат или быть сформирован в виде агрегата. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения обнаружение амилоидного белка и/или агрегата указывает на наличие амилоидогенного заболевания. Амилоидогенные заболевания включают AD, семейную AD, спорадическую AD, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба, спонгиоформные энцефалопатии, прионовые болезни (включая скрепи, спонгиоформные энцефалопатии у коров и другие ветеринарные прионовые заболевания), болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона (и болезни экспансии тринуклеотидных повторов), боковой амиотрофический склероз, синдром Дауна (трисомию по хромосоме 21), болезнь Пика (лобно-височную деменцию), деменцию с тельцами Леви, нейродегенерацию с отложением железа в мозге (болезнь Галлервордена-Шпатца), синуклеинопатии (включая болезнь Паркинсона, множественную системную атрофию, деменцию с тельцами Леви и другие); болезнь, связанную с нейронными внутринуклеарными включениями; таупатии (включая прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Пика, кортикобазальную дегенерацию, наследственную деменцию лобного типа (с/без паркинсонизма), преморбидное нейродегенеративное состояние и боковой амиотрофический склероз О.Гуам/комплекс паркинсонизм-деменция). Данные заболевания могут возникать самостоятельно или в составе различных комбинаций. Анализ амилоидного белка также полезен для обнаружения трансмиссивных спонгиоформных энцефалопатии (TSE), которые являются связанными с прион-опосредованными заболеваниями, характеризующимися смертельной спонгиоформной нейродегенерацией мозга и связанными с тяжелыми и смертельными неврологическими признаками и симптомами. Связанные с TSE прионопатии включают болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD); новый вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (nv-CJD); синдром Гертсмана-Штройслера-Шайнкера; смертельную семейную бессонницу; Куру; синдром Альперса; губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота; скрепи и хроническое истощение (CWD).

Диагностические способы могут осуществляться в отношении глазных тканей млекопитающих, например примата (такого как человек), собак, кошек, овец, коров и т.п.. Отдельные субъекты (например, люди), подлежащие обследованию, включают лиц с подозрением на наличие заболеваний (пациентов) или риска развития данных заболеваний. Например, лица с семейной историей AD или другими факторами риска, такими как пожилой возраст, обследуются с помощью методик, описанных здесь. Также могут быть обследованы лица, в отношении которых неизвестно о наличии или риске развития данных заболеваний.

Диагностические способы осуществляют с помощью нанесения флюорофорного соединения, которое образует связь с амилоидным белком, на ткань глаза млекопитающего (например, человека). «Амилоидный белок» означает белок или пептид, связанный с воспалением вокруг сенильной бляшки при AD, вне зависимости от того, является ли амилоидный белок агрегированным (полностью или частично). Предпочтительно, амилоидный белок является амилоидным белком-предшественником (АРР) или (например, встречающимся в естественных условиях) продуктом протеолитического расщепления АРР, таким как Аβ. Продукты расщепления АРР включают Аβ1-40, Aβ2-40, Aβ1-42, а также окисленный или поперечно-связанный Аβ. Флюорофорные соединения также могут образовывать связь со встречающимися в естественных условиях вариантами АРР и Аβ, включая однонуклеотидные полиморфные (SNP) варианты. Флюорофорные соединения могут, но необязательно, образовывать связь с агрегатом β-амилоида. Обсуждения флюорофора, образующего связь с агрегатами β-амилоида, могут быть найдены в Goldstein et al., "Cytosolic β-amyloid deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimer's disease," Lancet 2003; 361: 1258-65, приводимом здесь в своей полноте для ссылки.

Было обнаружено, что агрегаты, содержащие Аβ, патогенный белок, накапливаемый при AD, образуют надъядерные/глубокие кортикальные катаракты внутри хрусталиков, а также мозга пациентов с болезнью Альцгеймера. Отложения Аβ накапливаются в виде внутриклеточных агрегатов внутри цитозоля клеток кортикальных волокон хрусталика. Было обнаружено, что Аβ, находящийся в хрусталике, присутствует в виде растворимых видимых мономерных и димерных разновидностей внутри хрусталика взрослого человека на уровнях, сравнимых с уровнями в нормальном мозге взрослого человека. Значительная часть Аβ в хрусталике связана с другими белками хрусталика, включая часто встречающийся структурный белок хрусталика αВ-кристаллин. Аβ и αВ-кристаллин обладают наномолярной межмолекулярной аффинностью связи in vitro и со-иммунопреципитируются из обработанной муравьиной кислотой гомогенаты хрусталика человека, что говорит о наличии сильной связи типа белок-белок. Аβ1-42 человека обеспечивает агрегацию белка хрусталика с увеличенным содержанием β-листа. Усиленная Аβ агрегация белка хрусталика блокировалась хелатированием металлов или акцепторами на основе реактивных форм кислорода, что, таким образом, указывает на участие окислительно-восстановительных реакций металлопротеина в данном процессе агрегации белка хрусталика и образовании надъядерной катаракты при AD.

Эти данные указывают на осуществление болезнетворного взаимодействия между Аβ и белками хрусталика. Также, данные связанные с Аβ реакции в хрусталике указывают на то, что амилоидогенные разновидности Аβ, в частности, разновидности Аβ1-42 человека, принимающие заметное участие в патофизиологии AD, являлись сильными проаксидантными пептидами, способствующими агрегации белка хрусталика и образованию надъядерной/кортикальной катаракты. Дальнейшая информация относительно агрегации белка и образования катаракты может быть найдена в патенте США 7107092 Goldstein et al., приводимом здесь в своей полноте для ссылки.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения увеличение связывания флюорофорного соединения с тканью глаза, например, внутриклеточного компартмента клетки хрусталика, по сравнению с нормальным контрольным уровнем связывания указывает на то, что млекопитающее страдает или обладает риском развития AD. Как указано здесь, «флюорофор» или «флюорофорное соединение» является любой субстанцией, обладающей желаемыми флуоресцентными характеристиками при освещении светом с определенной длиной волны и/или поляризацией. Предпочтительно, в описанных здесь методиках флюорофор является «амилоидсвязывающим соединением», что, как указано здесь, означает соединение, образующее связь с амилоидным белком, при этом определение термина «амилоидный белок» дано выше. Данный флюорофор может являться амилоидсвязывающим соединением, обладающим естественной флуоресценцией при освещении светом с определенной длиной волны и/или поляризацией. С другой стороны или в дополнение, флюорофор может являться соединением, включающим часть, являющуюся флюоресцентной меткой, в комбинации с частью, являющейся амилоидсвязывающим соединением, при этом часть, являющаяся амилоидсвязывающим соединением, в целом, не будет обладать желаемыми характеристиками флуоресценции в отсутствие флюоресцентной метки. В одном варианте осуществления данного изобретения флюорофор обладает следующими свойствами: обладает хорошей растворимостью в любой среде, в которой используется флюорофор; проникает в роговицу глаза; и образует связь с амилоидным белком. Флюорофор может обладать различными флуоресцентными характеристиками, будучи связанным или не связанным с амилоидом. Например, спектральная интенсивность и время затухания флуоресценции флюорофора может меняться в случае, если флюорофор связан с амилоидом по сравнению со случаем, при котором флюорофор не связан с амилоидом. Соединение №11 (описанное далее ниже и на Фиг.5) является таким флюорофором, время затухания которого меняется при связывании соединения с амилоидом по сравнению с отсутствием связывания с амилоидом. Дальнейшее описание таких свойств флюорофоров, в частности, Соединения №11, может быть найдено в J. Sutharsan et al., "Rational Design of Amyloid Binding Agents Based on the Molecular Rotor Motif," ChemMedChem 2010, 5, 56-60, приводимом здесь в своей полноте для ссылки. Предпочтительно, флюорофорное соединение образует связь с Аβ1-42 или другим фрагментом амилоидного белка-предшественника (АРР). Флюорофорные соединения могут образовывать связь с амилоидными белками, что является более предпочтительным по сравнению со связью с другими сложенными β-листами, содержащими белки. Как указано выше, флюорофорное соединение может содержать флуоресцентный образец или может действовать в качестве флюорофора без добавления флуоресцентного образца. Например, флуоресцентный образец или флюорофор может являться хризамином или производным соединением хризамина, таким как {(транс, транс), -1-бром-2,5-бис-(3-гидроксикарбонил-4-гидрокси)стиролбензол (BSB)}. В определенном варианте осуществления данного изобретения флюорофор может являться Соединением №11 (описанным далее ниже и на Фиг.5), являющимся флуоресцентным соединением, полученным в соответствии с мотивом молекулярного ротора. В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения амилоидсвязывающее соединение может являться молекулярным ротором, хризамином и/или производным хризамина. Примерные флюорофоры описаны в патенте США 6849249 (приведенным здесь в своей полноте для ссылки) и включают хризамин или производные соединения хризамина, такие как {(транс, транс), -1-бром-2,5-бис-(3-гидроксикарбонил-4-гидрокси)стиролбензол (BSB)}. Хризамин G и его производные известны из уровня техники (например, из патентов США 6133259; 6168776; 6114175). Данные соединения образуют связь с пептидами Ар, но не являются флуоресцентными. Диагностические способы могут включать использование флуоресцентного амилоидсвязывающего производного хризамина G для обнаружения пептидов А Также могут использоваться биодоступные флуоресцентные образцы. Данные флюорофоры и образцы являются коммерчески доступными, например, от Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, U.S.A. Некоторые красители, например Х-34 или {(транс, транс), -1-бром-2,5-бис-(3-гидроксикарбонил-4-гидрокси)стиролбензол (BSB)}(Styren et al., 2000, J. Histochem. 48: 1223-1232; Link et al., 2001, Neurobiol. Aging 22: 217-226; and Skrovonsksy et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 7609-7614) были использованы для анализа ткани мозга (но не ткани глаза). Данные образцы излучают свет в сине-зеленом диапазоне, в связи с этим уровень флуоресценции, являющийся релевантным в плане диагностики, превосходит степень аутофлуоресценции хрусталика человека в сине-зеленом диапазоне. Другие полезные соединения включают способный быть обнаруженным метоксиагент, такой как Ме-Х04 (1,4-бис(4'-гидрокси.стирол.)-2-метоксибензол). Другие метоксиагенты включают, например, хризамин или производные соединения хризамина, такие как {(транс, транс), -1-бром-2,5-бис-(3-гидроксикарбонил-4-гидрокси)стиролбензол (BSB)}. Данные соединения описаны в Mathis et al., Curr. Pharm. Des., vol. 10(13): 1469-93 (2004); патентах США 6417178; 6168776; 6133259; и 6114175, все из которых приведены здесь в своей полноте для ссылки. Также могут использоваться другие амилоидсвязывающие образцы, такие как тиофлавин Т, тиофлавин S, краситель Конго красный, их производные или другие производные. Дальнейшие сведения относительно способных быть обнаруженными окрашенных соединений могут быть найдены в патенте США 7297326 Goldstein et al., приводимом здесь в своей полноте для ссылки. Кроме того, дальнейшие сведения относительно вышеизложенного могут быть найдены в патентной публикации США 2008/0088795, патентной публикации США 2009/0041666 и патенте США 7107092, приводимых здесь в своей полноте для ссылки. В определенном варианте осуществления данного изобретения флюорофор может являться Соединением №11 (описанным далее ниже и на Фиг.5).

Дальнейшие сведения относительно родственных способов, амилоидогенных заболеваний, амилоидных белков и флюорофорных соединений могут быть найдены в патенте США 7297326 Goldstein et al., патенте США 7107092 Goldstein et al. и в патенте США 6849249 Goldstein et al., приводимых здесь в своей полноте для ссылки. Кроме того, дальнейшие сведения относительно вышеизложенного могут быть найдены в патентной публикации США 2008/0088795, патентной публикации США 2009/0041666, приводимых здесь в своей полноте для ссылки.

Предложенные здесь способы могут также включать сравнение исследуемой флуоресценции хрусталика пациента после введения флюорофора с подходящим контролем. Примеры подходящего контроля включают эндогенную аутофлуоресценцию субъекта (или ряда лиц), не страдающих AD, или уровень флуоресценции субъекта (или ряда лиц), не страдающих AD, после введения флюорофора.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения количество присутствующего в глазе амилоидного белка на основе описанных здесь методик может быть сравнено с данными статистического анализа, относящимися к количеству амилоидного белка, указывающего на наличие заболевания или риск развития заболевания. Несмотря на то, что связанность теорией является нежелательной, считается, что здоровые взрослые люди, как правило, обладают, по меньшей мере, минимальным уровнем амилоидного белка в надъядерном участке хрусталика глаза. Описанные здесь методики могут, таким образом, быть использованы для определения того, обладает ли лицо количеством амилоидного белка в глазе, являющимся статистически значимым уровнем сверх нормального, контрольного уровня амилоидного белка в глазе. Описание исследования отложения амилоидного белка в глазах лиц, страдающих болезнью Альцгеймера, может быть найдено в Goldstein et al., "Cytosolic β-amyloid deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimer's disease," Lancet 2003; 361: 1258-65, приводимом здесь в своей полноте для ссылки.

Как описано далее ниже относительно Примера 1, было показано, что вариант осуществления данного изобретения является применимым для различения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком и амилоидсвязывающего соединения, не связанного с амилоидным белком. В частности результаты Примера 1 включают время затухания флуоресцентного несвязанного амилоидсвязывающего соединения (здесь - Соединения №11) равное, например, 1,4 нс; и время затухания флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком (здесь - агрегированного бета-амилоидного (Аβ) пептида) равное, например, 2,25 нс. В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения обнаружение несвязанного амилоидсвязывающего соединения Соединение №11 может быть определено в случае времени затухания, равного 1,4 нс плюс или минус 0,3 нс, в то время как обнаружение амилоидсвязывающего соединения Соединения №11, связанного с амилоидным белком, может быть определено в случае времени затухания, равного 2,25 нс плюс или минус 0,3 нс. Могут использоваться другие величины времени затухания и соответствующие им уровни различения амилоидсвязующего соединения и амилоидного белка.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения предлагается способ отображения на основе флуоресценции и устройство для обнаружения бета-амилоидных (Аβ) белков, помеченных амилоидсвязывающим соединением, в хрусталике глаза и варианты их использования. В одном аспекте, предложенное здесь устройство является оптическим отображающим устройством, в основе работы которого лежит механизм флуоресцентного сканирования, совмещенный со спектроскопией времени жизни в целях обнаружения флуоресцентных молекул и получения информации относительно их пространственного распределения, а также природы окружающей их среды.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения устройство, например, многофункциональная оптическая сканирующая флуоресцентная система, позволяет осуществлять идентификацию анатомических структур передних сегментов глаза на основе их естественного флуоресцентного возбуждения; и может предоставлять пространственную информацию о передних сегментах глаза, такую как толщина роговицы и форма хрусталика, а также внутриглазные расстояния.

Кроме того, многофункциональная оптическая сканирующая система в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения обеспечивает наличие инструмента для изучения глазной фармакокинетики in vivo при использовании экзогенных флуоресцентных амилоидсвязывающих соединений в глазе без необходимости образования связи с амилоидным белком. Например, система способна определять градиент концентрации амилоидсвязывающих соединений на участках роговицы, таких как слезная пленка/поверхность эпителия роговицы. Также, система способна обеспечивать получение пространственной и временной информации относительно биодоступности амилоидсвязывающих соединений в водянистой влаге.

Также, многофункциональная оптическая сканирующая система в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения позволяет осуществлять обнаружение флуоресцентных молекул и их различение на основе их оптических сигнатур, таких как время затухания флуоресценции (τ). Система позволяет осуществлять обнаружение помеченного флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения, связанного с Аβ, в хрусталике глаза; обнаружение естественной флуоресценции в глазе; и различение (i) помеченного флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения, связанного с Аβ, в хрусталике глаза и (ii) естественной флуоресценции в глазе. Как указано здесь, «естественная флуоресценция» означает естественную флуоресценцию в глазе, которая имеет место вне зависимости от введенного окрашивающего агента.

Фиг.1 является схематической диаграммой оптического устройства в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Флуоресцентное возбуждение достигается с помощью пульсирующего лазерного луча, сфокусированного в глазе с помощью линзы объектива с большим апертурным числом 101. Флуоресценция обнаруживается с помощью методики подсчета единичных фотонов с корреляцией по времени (TCSPC) с использованием софокусного конфигурирования с быстрым лавинным фото диодным детектором (APD) 102. TCSPC выполняют с помощью периодических коротких импульсов света для возбуждения образца (глаза) 103 и записи последующего флуоресцентного излучения в качестве функции времени. Это, как правило, осуществляется на шкале с наносекундной ценой делений.

В варианте осуществления данного изобретения, приведенном на Фиг.1, идентификация анатомических структур хрусталика выполняется с помощью сканирования линзы объектива 101 по оси с использованием стола поступательного перемещения 104. Сигнал измеряют в каждой точке вдоль сканограммы для определения анатомических структур передних сегментов, таких как роговица, капсула хрусталика и надъядерный участок хрусталика. Кроме того, сканограмма содержит информации о фармакокинетике экзогенных амилоидсвязывающих соединений, введенных в глаз. Такие данные содержат не только пространственную и временную информацию относительно амилоидсвязывающего соединения, но также концентрацию амилоидсвязывающего соединения, проникающего через роговицу и внутрь водянистой влаги.

В варианте осуществления данного изобретения, приведенном на Фиг.1, при определении целевого участка глаза на основе возбужденной естественной флуоресценции, измеренной в каждой точки вдоль осевой сканограммы, выполняют другое сканирование в перпендикулярной (поперечной) плоскости относительной оптической плоскости с помощью набора зеркальных гальванометров 105. Для обеспечения сдвига кривых затухания измеряемой флуоресценции соответствующего участка двумерной сканограммы сканирование с использованием набора гальванометров синхронизируют с пульсацией лазера и фотодетекцией для подсчета единичных фотонов с корреляцией по времени. Данное поперечное сканирование позволяет получить изображение, содержащее информацию о времени затухания флуоресценции в каждой точке (пикселе). В варианте осуществления данного изобретения, приведенном на Фиг.1, могут быть реализованы один или несколько модулей с помощью выделенных, специализированных модулей аппаратного обеспечения и/или с помощью компьютера общего назначения, специально запрограммированного для выполнения функций данных модулей, включая, например, модуль захвата изображения, модуль TCSPC, модуль расчета т и сканирующий контрольный модуль. Компьютер общего назначения и/или один или несколько специализированных модулей аппаратного обеспечения могут получать данные друг от друга по кабелям или портам данных, являющихся подходящими для функций модулей.

В варианте осуществления данного изобретения, приведенном на Фиг.1, при подсчете единичных фотонов с корреляцией по времени кривая затухания аутофлуоресценции регистрируется для каждого сканируемого участка хрусталика и, таким образом, может быть получено и проанализировано двумерное представления распределений флюорофоров на основе времени затухания их флуоресценции, а также их интенсивности. Изображение посчитанных величин времени затухания может быть представлено с помощью ложных цветов и может быть суперпозиционировано по интенсивности для улучшения клинической интерпретации. Поскольку время затухания флуоресценции является характеристикой, относящейся к каждой флуоресцентной молекуле, является возможным определить и отделить флюорофоры (амилоидсвязывающее соединение от естественной флуоресценции хрусталика), возбуждаемые в объеме образца. С помощью совмещения интенсивности флуоресценции и данных о времени жизни получают дополнительное измерение данных для распознавания некоторых флуоресцентных меток.

Как описано здесь, устройство в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения может включать источник света. Как указано здесь, «источник света» может являться любым источником света, способным быть настроенным для излучения света для освещения глаза с, по меньшей мере, длиной волны или поляризацией света, подходящей для индуцирования флуоресценции в, по меньшей мере, амилоидсвязывающем соединении, при этом амилоидсвязывающее соединение связано с амилоидным белком, таким образом, что время затухания флуоресценции может быть впоследствии определено на основе флуоресценции, полученной в результате освещения.

В других родственных вариантах осуществления данного изобретения источник света может быть настроен для излучения света с подходящей длиной волны пикового участка спектра флуоресцентного возбуждения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе; а оптический блок может быть настроен для обнаружения света с подходящей длиной волны пикового участка спектра флуоресцентного излучения амилоидсвязывающего соединения, связанного с амилоидным белком в глазе. Например, в случае, если амилоидсвязывающим соединением является Соединение №11, спектр возбуждения обладает значением пика около 470 нм, а источник света может быть настроен для излучения света плюс или минус около 20 нм пика, составляющего 470 нм, такого как плюс или минус 5 нм, плюс или минус 10 нм, плюс или минус 15 нм, плюс или минус 20 нм от 470 нм.

Также, спектр излучения Соединения №11 обладает значением пика около 580 нм, а оптический блок может быть настроен для обнаружения света плюс или минус около 20 нм пика, составляющего 580 нм, такого как плюс или минус 5 нм, плюс или минус 10 нм, плюс или минус 15 нм, плюс или минус 20 нм от 580 нм. В целом, как правило, существует разность между пиком спектра возбуждения и пиком спектра излучения флуоресцентного соединения. В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения представляет пользу использование соединения с значительно отличающимся пиком спектра излучения относительно спектра возбуждения для различения флуоресценции связанного флюорофора и естественной аутофлуоресценции глаза. Например, спектр излучения с пиком более около 500 нм является полезным для определения отличия от естественной аутофлуоресценции глаза. Соединение №11 может использоваться для данной цели в связи с тем, что значение пика спектра излучения, равного около 580 нм, значительно отличается от значения пика спектра возбуждения, равного около 470 нм. Фиг.12 является спектром излучения флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения Соединение №11 при возбуждении на уровне 470 нм в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Другие спектры возбуждения и излучения, которые могут использоваться, будут понятны специалистам в данной области на основе вышеизложенного.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения устройство может включать «оптический блок», что, как указано здесь, означает любой блок, способный быть настроенным для приема света, включая флуоресценцию, индуцируемую в результате освещения глаза, и определять время затухания флуоресценции при том, что флуоресценция индуцируется связанным с амилоидным белком амилоидсвязывающим соединением, определять возможность обнаружения присутствия связанного с амилоидным белком амилоидсвязывающего соединения в глазе на основе, по меньшей мере, времени затухания. Например, относительно Фиг.1, оптический блок может включать один или несколько объективов 101, стол поступательного перемещения 104, сканер 105, фотодетектор 102, камеру, светодиод, различные линзы, диафрагмы, светоделители, дихроичные фильтры, модуль расчета времени затухания, модуль захвата изображения, модуль TCSPC и контрольный модуль сканера. Часть функционала оптического блока может быть реализована с помощью запрограммированного компьютера общего назначения или с помощью выделенного аппаратного обеспечения, например для выполнения расчетов времени затухания.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения функционал объективов 101, стола поступательного перемещения 104 и сканера с зеркальными гальванометрами 105 может быть реализован с помощью ряда различных возможных устройств, вместо или в дополнение к данным компонентам. В собирательном значении функционал стола поступательного перемещения, объектива и сканера с зеркальными гальванометрами реализуется, как указано здесь, в виде «оптического сканирующего блока», что может означать любое устройство или набор устройств, выполняющих одинаковую функцию сканирования луча света в желаемых участках глаза, включая цель определения начальных точек в глазе и анализ флюорофоров в глазе. Данный оптический сканирующий блок может выполнять функции, заключающиеся в индуцировании трансляционного движения хрусталика или движения хрусталика вдоль многомерного маршрута движения; и может выполнять функции, заключающиеся в сканировании света в желаемых участках, например в выполнении точечного, планарного, объемного или другого типа сканирования луча света в желаемых участках, например с помощью индуцирования движения в зеркале или другом оптическом устройстве на оптическом направлении луча света.

В варианте осуществления данного изобретения, приведенном на Фиг.1, использование софокусного выравнивания означает, что дилатационный агент может не использоваться, как это может требоваться в системах, в которых свет должен попадать в глазе не по осевому направлению, например, под углом 45°. Это сделано для удобства пациентов.

Фиг.2А является графиком интенсивности флуоресценции относительно смещения, измеренной в рамках реализации алгоритма обнаружения поверхности хрусталика при сканировании вдоль оси освещения (продольном сканировании) глаза, а Фиг.2B является графиком первого производного графика на Фиг.2А в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Логическое обоснование алгоритма заключается в предположении, что место, в котором увеличение значения интенсивности естественной флуоресценции на единицу сканируемого расстояния достигает наибольшего значения, четко указывает на начало границы хрусталика. В частности, алгоритм позволяет определять расстояние от начальной точки продольного сканирования, соответствующей максимальной точке перегиба кривой интенсивности флуоресценции. В одном варианте осуществления данного изобретения алгоритм проводится как указано ниже, и может быть осуществлен в реальном времени:

1) Сбор данных в двумерный массив, в котором первое измерение (независимая переменная) является расстоянием от начальной точки, то есть, сканируемого расстояния при измерении с помощью углового кодера, а второе измерение (зависимая переменная) является интенсивностью флуоресценции при измерении с помощью детектора фотонов (APD).

2) Свертка массива данных с помощью профиля скользящего среднего с пятью точками для сглаживания значений интенсивности, то есть удаление высокочастотного шума, мешающего дифференциации.

3) Свертка сглаженного массива данных с помощью профиля дифференциации для получения первого производного массива значений интенсивности.

4) Поиск первого производного массива значений интенсивности для максимизации дифференцированного значения интенсивности. Оно является максимальной точкой перегиба. Определение соответствующего расстояния сканирования.

Как показано на Фиг.2А и 2B, месторасположение капсулы хрусталика может быть определено с помощью описанной выше методики. Также, также могут быть определены месторасположения и расстояние между анатомическими структурами, такими как роговица, водянистая влага и хрусталик. Может быть применен сдвиг для задания расстояния измерения от определенной величины по любой оси.

Фиг.3А и 3B являются графиками, иллюстрирующими определение времени затухания флуоресценции в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Время затухания флуоресценции может быть рассчитано с помощью приближения кривой интенсивности к единичной или двойной экспоненте (Фиг.3А) (здесь в фотон/сек) относительно времени (здесь в не). Оно также может быть получено с помощью линейного приближения к наклону (Фиг.3B). Как указано здесь «время затухания флуоресценции» означает характеризующую временную константу кривой затухания интенсивности флуоресценции, например экспоненциальную временную константу или наклон, приближенный к кривой затухания флуоресценции.

Описанные выше алгоритмы, приведенные на Фиг.2А, 2B, 3A и 3B могут, например, быть реализованы с помощью выделенных специализированных аппаратных модулей и/или с помощью компьютера общего назначения, специально запрограммированного для выполнения описанных выше алгоритмов. Такие модули могут, например, использовать или получать данные от модуля TCSPC, модуля захвата изображения, модуля расчета т варианта осуществления данного изобретения, приведенного на Фиг.1.

Фиг.4 является схематичной диаграммой, иллюстрирующей использование подсчета единичных фотонов с корреляцией по времени в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Пульсирующий источник света 406 периодически возбуждает образец 403. Излучение образца наблюдают с помощью лавинного фотодиода детектирующего блока (APD) 402, в то время как вспышки возбуждения определяются с помощью модуля синхронизации (SYNC) 407. Дискриминатор постоянной фракции (CFD) 408 реагирует только на первый обнаруженный фотон - вне зависимости от его амплитуды - от детектора 402. Данный первый фотон излучения образца является сигналом остановки для конвертера время-амплитуда (ТАС) 409. Импульсы возбуждения запускают сигналы начала. Многоканальный анализатор (МСА) 410 записывает повторяющиеся сигналы начала и остановки однофотонных событий, полученные от ТАС 409 в целях генерировании гистограммы подсчета фотонов в виде канальных единиц функции времени. Время жизни рассчитывают на основании этой гистограммы. МСА может быть реализован с помощью выделенного специализированного аппаратного модуля и/или с помощью компьютера общего назначения, специально запрограммированного для выполнения данных задач, а также может обмениваться данными со специально запрограммированным компьютером общего назначения.

В одном варианте осуществления данного изобретения система, включающая флуоресцентное амилоидсвязывающее соединение, и устройство предназначены для помощи в установлении диагноза, связанного с вероятностью возникновения болезни Альцгеймера у пациентов с симптомами и признаками устойчивой альцгеймероподобной деменции с последующим соответствующим клиническим обследованием. Устройство использует софокусный механизм сканирования, совмещенный с методикой флуоресцентной спектроскопии на основе времени жизни. Устройство позволяет осуществлять идентификацию анатомических структур передних сегментов глаза и различение флуоресцентных флюорофоров на основе их оптических сигнатур.

На Фиг.5 изображена структура Соединения №11, которое может использоваться в качестве флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Соединение №11 является флуоресцентным соединением, образованным в соответствии с мотивом молекулярного ротора и, как было установлено, образует связь с агрегированным бета-амилоидным (Аβ) пептидом. С учетом нативной флуоресценции это говорит о том, что Соединение №11 является хорошим кандидатом для in vivo маркера для агрегатов Аβ, обнаруженных в ткани хрусталика пациентов с болезнью Альцгеймера. Химическим названием Соединения №11 является [(Е)-2-(2-(2-метоксиэтокси)этокси)этил-2-циан-3-(6-(пиперидин-1-ил)нафталин-2-ил)акрилат]. Дальнейшее описание относительно Соединения №11 может быть найдено в J. Sutharsan et al., "Rational Design of Amyloid Binding Agents Based on the Molecular Rotor Motif," ChemMedChem 2010, 5, 56-60, приводимом здесь в своей полноте для ссылки. Соединение №11 было приготовлено в виде офтальмологической мази (Офтальмологическая Мазь на Основе Соединения №11), содержащей приблизительно 5 мг/г Соединения №11, 80% вазелина и 20% минерального масла.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения флюорофорное амилоидсвязывающее соединение может быть введено в глаз человека для тестирования в любой из множества различных возможных форм. Например, флюорофорное амилоидсвязывающее соединение может быть введено в виде мази, раствора, с помощью контактных линз, инъекции, в жидкой форме, в твердой форме, с помощью ионтофореза или с помощью других методик.

Устройство в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения разработано для обнаружения флуоресценции во временном интервале с высокой чувствительностью и скоростью в схеме с софокусным обнаружением. Устройства обладает двумя основными функциями: 1) доставка и сканирование оптического луча в участках передних сегментов глаза, таких как надъядерный участок хрусталика, с использованием стола поступательного перемещения и гальванометрического сканера; и 2) идентификация и определение флуоресцентных флюорофоров на основе измерений времени жизни флуоресценции.

Устройство в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения позволяет определять анатомические структуры глаза с помощью осевого сканирования или продольного сканирования на основе возбуждения лазером естественной флуоресценции тканей глаза по оптическим осям глаза для получения данных о внутриглазных расстояниях. Продольное сканирование выявляет схему интенсивности естественной флуоресценции в качестве функции глубины, что позволяет получить информацию об участке, в котором следует производить измерения времени жизни. Целевой участок может являться, например, надъядерным участком хрусталика глаза человека. Сканирование может быть завершено в течение нескольких секунд, например, в течение 2 секунд или менее, в течение около 0,2 секунд, 0,3 секунд, 0,4 секунд, 0,5 секунд, 0,6 секунд, 0,7 секунд, 0,8 секунд, 0,9 секунд, 1,0 секунд, 1,2 секунд, 1,4 секунд, 1,6 секунд, 1,8 секунд или 2,0 секунд для снижения помех, связанных с движением глаза или в течение другого количества времени, подходящего для снижения помех, связанных с движением глаза. С другой стороны, или в добавление, устройство может быть использовано совместно с отслеживанием движений глаза для снижения помех, связанных с движением глаза. Для данной цели могут использоваться пьезодвигатели, линейные двигатели и другие устройства контролируемого движения. Осевое сканирование также может позволять осуществлять измерение градиента концентрации амилоидсвязывающего соединения в таких участках глаза, как слезная пленка/поверхность эпителия роговицы, а также биодоступности амилоидсвязывающего соединения в водянистой влаге.

Устройство в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения обнаруживает флуоресцентные молекулы с помощью проведения поперечного сканирования, при котором образец подвергается растровому сканированию устройством с гальванометром. Время жизни флуоресценции регистрируется для каждого сканируемого участка хрусталика человека и, таким образом, двумерное представление распределения флюорофора может быть оценено и проанализировано на основе времени затухания и интенсивности флуоресценции. Двумерное представление распределения флюорофора на основе времени затухания, которое может также, но необязательно, включать двумерное представление на основе интенсивности флуоресценции, называется здесь «изображением времени жизни флуоресценции».

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения измерения времени жизни флуоресценции основаны на периодическом возбуждении глаза короткими лазерными импульсами и фиксации последующего флуоресцентного излучения в качестве функции времени. Поскольку время затухания флуоресценции является характеристикой, относящейся к каждой флуоресцентной молекуле, является возможным определить и дифференцировать амилоидсвязывающее соединение и естественную флуоресценцию хрусталика, возбуждаемую в объеме образца.

В частности, в варианте осуществления данного изобретения измерения времени жизни флуоресценции могут быть осуществлены с помощью методики подсчета единичных фотонов с корреляцией по времени (TCSPC). Скорость проведения сканирования и получение данных могут быть синхронизированы и выполнены, например, через 0,5 секунд для снижения каких-либо связанных с движением глаза помех, или спустя другое количество времени, подходящее для снижения связанных с движением глаза помех. Принцип TCSPC основан на обнаружении единичных фотонов, излучаемых пульсирующим лазером, и записи времени обнаружения появляющихся отдельных фотонов. При обнаружении фотона осуществляется измерение времени соответствующему ему импульса детектора. События, относящиеся ко многим обнаруживаемым фотонам, хранят в памяти. Время затухания флуоресценции может быть подсчитано с помощью гистограммы на основе измерений отдельных интервалов времени. Скорость осуществления подсчета устройства в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения, работающего в режиме TCSPC, может достигать, например, около 10⁷ фотонов в секунду. Таким образом, 10⁴ фотонов могут быть собраны менее чем за 1 мс. Такие скорости подсчета являются важными в тех случаях, когда необходимо достижение высокой скорости для быстрого получения информации, относящейся к сканированию хрусталика глаза человека. Могут использоваться другие скорости подсчета.

Может быть разработано устройство в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения для получения определенной информации относительно конкретного участка хрусталика глаза человека. Примеры таких участков включают надъядерный участок, капсулу хрусталика, ядро, роговицу и водянистую влагу.

Это достигается точным размещением субъекта, знанием окулярной анатомии глаза и получением информации о флюорофорах в сканируемом участке хрусталика с высокой степенью избирательности и чувствительности. Схематическая диаграмма оптической платформы в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения показано на Фиг.1 (описанной также выше). Флуоресцентное возбуждение достигается с помощью луча пульсирующего лазера, сфокусированного с помощью объектива с большим диафрагменным числом 101 на глазе 103. Лазер может, например, генерировать импульсы с частотой около 40 МГц и создавать импульсы с длительностью около 200 пикосекунд, хотя могут использоваться и другие частоты и длительности импульсов. Например, может использоваться частота от около 1 МГц до около 240 МГц и длительность от около 40 пикосекунд до около 400 пикосекунд. Оптический луч затем отражается от пары гальванометрических сканеров и фокусируется с помощью объектива с большим диафрагменным числом 101, установленного на столе поступательного перемещения 104. Измерения флуоресценции в надъядерном участке глаза сначала получают с помощью выравнивания глаза субъекта относительно устройства и выполнения 1) продольного сканироения для определения месторасположения целевого участка (ROI) и 2) поперечного сканирования для получения определенной информации относительно участка в рамках надъядерного участка.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения выравнивание субъекта состоит в определении фокальной плоскости линзы объектива в качестве первоначальной точки измерения. Светодиод (LED), который также используется в качестве контрольной цели, фокусируется с помощью линзы объектива 1-1 на роговице глаза 103 в форме кольца. Для визуализации отражения кольца от поверхности роговицы используют камеру. При достижении этого может быть осуществлено сканирование глаза для получения необходимой информации.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения определение анатомических структур хрусталика осуществляется с помощью сканирования линзой объектива 101 вдоль оптической оси (по оси) с помощью стола поступательного перемещения 104. Продольное сканирование включает возбуждение естественной флуоресценции с помощью источника лазерного излучения и обнаружение анатомических структур передних сегментов, таких как роговица, капсула хрусталика и надъядерный участок хрусталика, и относительных расстояний между ними. Кроме того, сканограмма содержит информации о фармакокинетике экзогенного амилоидсвязывающего соединения, введенного в глаз.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения, при идентификации целевого участка в глазе с помощью продольного сканирования, выполняют планарное сканирование (поперечное сканирование) в плоскости, перпендикулярной плоскости осевого сканирования, с помощью зеркальных гальванометров. Для обеспечения достижения необходимых кривых затухания флуоресценции в соответствующем участке двумерного сканирования зеркальные гальванометры синхронизируют с платой получения данных TCSPC измерений. Поперечное сканирование может включать, например, сканирование участка размером 50 на 50 µm надъядерного участка глаза человека в течение 0,5 секунд и получение значений времени затухания. Будет являться полезным то, что могут использоваться участки других размеров и находящиеся в других месторасположениях, а также другие продолжительности времени проведения сканирования.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения обнаружение достигают с помощью TCSPC путем софокусного конфигурирования с быстрым лавинным фото диодным детектором (APD) 102. Флуоресценцию возбужденных молекул фиксируют той же линзой объектива 101, что и флуоресценцию возбуждающего лазера, с последующей фильтрацией с помощью дихроического зеркала с дополнительным полосовым фильтром для снижения уровня остаточного рассеянного света лазера и прохождением через малую диафрагму для обеспечения софокусного обнаружения. С помощью функции ускорения APD 102 может, например, обеспечивать величину шага времени более чем 50 пикосекунд в режиме Full Width Half Maximum при эффективности обнаружения фотонов 49% при 550 нм, хотя могут использоваться и другие величины шага времени и степени эффективности обнаружения фотонов.

Иллюстрация получения данных и электроники, лежащей в основе TCSPC, показана на Фиг.4 (описанной также выше) в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Пульсирующий источник света 406 периодически возбуждает образец 403 при частоте (например) 40 МГц в то время как импульсы возбуждения фиксируются с помощью модуля синхронизации (SYNC) 407, настроенным (например) также на частоту 40 МГц. Импульсы возбуждения запускают стартовые сигналы. Дискриминатор постоянной фракции (CFD) 408 реагирует только на первый фотон, обнаруженный детектором, вне зависимости от его амплитуды. Данный первый фотон излучения образца является сигналом остановки для преобразователя время-амплитуда (ТАС) 409. Когда APD 402 обнаруживает фотон, создается короткий импульс на выходе РМТ. Импульс «очищается» CFD 408 и поступает в ТАС 409 в качестве импульса «остановки». Незамедлительно при обнаружении импульса остановки (то есть первого полученного фотона), линейное изменение напряжения останавливается, а значение напряжения (эквивалентное разнице времени между импульсами старта и остановки) передается в многоканальный анализатор (МСА) 410. МСА 410 фиксирует повторяющиеся сигналы старт-остановка, соответствующие событиям, связанный с единичным фотоном, полученные от ТАС 409, и увеличивает значение счетчиков в канале в соответствии с определенным напряжением (временем). Данный процесс повторяется с каждым импульсом и, в конце концов, после многих циклов, генерируется гистограмма на основе подсчета фотонов в качестве канальных единиц функции времени. Гистограмма отражает интенсивность флуоресценции в качестве функции времени, на основе которой получают значения времени затухания флуоресценции.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения получение данных могут осуществлять с помощью PC-карты PicoHarp 300 TCSPC (PicoQuant, GmbH, Berlin, Germany), работающей в специальном режиме TTTR (Time-Tagged Time-Resolved), оценивающей всю связанную информацию по каждому обнаруженному фотону для дальнейшего анализа данных. В частности, время обнаружения каждого фотона записывается детектором синхронно с возбуждающими импульсами лазера, как и положение образца и номер канала обнаружения. Скорость осуществления синхронизации карты получения данных может быть установлена, например, на уровень 40 МГц с шагом времени 4 пикосекунды и глубиной канала подсчета 16 бит (другие значения скорости синхронизации, величины шага времени и глубины канала подсчета также могут использоваться).

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения получение данных с помощью программного обеспечения, которое может быть осуществлено с помощью SymPhoTime (TicoQuant, GmbH, Berlin, Germany) может контролироваться с помощью TCP/IP сети и синхронизации с гальванометрическим сканером и платой получения данных с помощью TTL сигналов для установки линии и границ изображения. SymPhoTime, работающая в командном режиме LSM, может, например, записывать и отображать изображения времени жизни и интенсивности флуоресценции.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения время жизни флуоресценции может быть регистрировано в каждом участке глаза человека, подвергнутом сканированию, и, таким образом, двумерное представление распределения флюорофора может быть получено и проанализировано на основе времени жизни и интенсивности флуоресценции. Сгенерированное изображение с цветной маркировкой на основе времени затухание флуоресценции может быть наложено на изображение интенсивности для осуществления клинической интерпретации. Расчет изображения времени жизни флуоресценции может быть осуществлен с помощью сортировки всех фотонов, относящихся к одному пикселу на гистограмме, с последующим приближением к экспоненциальной функции затухания для получения данных о времени жизни. Данную процедуру затем повторяют для каждого пиксела, составляющего изображение. Алгоритм программного обеспечения может приближать данные к многоэкспоненциальным функциям затухания с помощью приближения хвоста, а также повторной числовой свертки. Поскольку процедура приближения зависит от качества начальных параметров приближения, значение частоты фотонов с определенными скоростями затухания, которые указывают на определенные флюорофоры в участке сканограммы, может быть получено напрямую на основе изображения. Вышеизложенные алгоритмы могут быть реализованы с помощью компьютера, и могут включать отображение данных на двумерном дисплее, таком как компьютерный монитор.

В одном варианте осуществления данного изобретения средняя величина интенсивности, связанная с определенным временем затухания, может использоваться в качестве меры агрегации амилоидных протеинов. Таким образом, может быть создан параметр с помощью усреднения интенсивности флуоресценции, связанной с определенным временем затухания в определенном участке. Данный параметр может использоваться в качестве меры агрегации для, например, мониторинга развития заболевания у субъекта на основе изменений данного параметра. Такой параметр может быть определен компьютером или другим специализированным аппаратным обеспечением.

Флуоресцентная гистограмма флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения Соединение №11 показана на Фиг.6 и получена с помощью устройства в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Результаты отдельного экспоненциального приближения при времени затухания 2 нс.

На Фиг.7 показано изображение времени жизни флуоресценции Соединения №11 и связанное с ним изображение интенсивности, полученное в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Размер данных изображений составляет 100×100 пикселей; они получены в течение 0,5 секунды и относятся к участку сканирования размером 50×50 микрон.

Вариант осуществления данного изобретения включает использование методики временного интервала флуоресценции для обнаружения и определения флюорофором на основе их временных сигнатур. С помощью совмещения интенсивности флуоресценции и данных о времени жизни получают дополнительное измерение данных для распознавания флуоресцентных меток. In vitro исследования, описанные в Примере 1 демонстрируют возможность варианта осуществления данного изобретения осуществлять дифференциацию флуоресцентных флюорофоров на основе их временных сигнатур. Также, фармакокинетические исследования на глазах кроликов, описанные в Примере 2 показывают способный быть обнаруженным флуоресцентный сигнал флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения Соединение №11 в надъядерном участке хрусталика. Более того, сигнал, обнаруженный в хрусталике глаза кролика был легко определен и отнесен к самому амилоидсвязывающему соединению.

Для специалиста в данной области будет понятно, что любой способ, описанный здесь (а также их отдельные этапы и комбинации нескольких последовательных этапов данных способов), в частности, технические этапы, включающие сбор и, необязательно, обработку связанных данных, сравнение полученных таким образом данных с нормальными контрольными значениями и/или определение любых значительных отклонений в течение этого сравнения, могут быть осуществлены до, вне зависимости от них и при подготовке последующего, отдельного диагностического этапа, то есть до отнесения потенциального отклонения полученных значений от нормального контрольного значения(ий) к определенному амилоидогенному заболеванию, такому как болезнь Альцгеймера (действительному диагнозу). Данные способы (включая отдельные этапы, а также комбинации из нескольких последующих этапов этих способов), выполняемые до, вне зависимости от них и при подготовке последующего отдельного диагноза, предлагаются, в частности, в качестве отдельных вариантов осуществления данного изобретения.

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения различные компоненты системы могут быть поставлены существующими поставщиками. Например, источниками возбуждения могут являться пикосекундные пульсирующие лазеры серии LDH, продаваемыми компанией PicoQuant, Берлин, Германия; пикосекундными диодными лазерами серии BDL, продаваемыми компанией Becker & Hickl, Берлин, Германия; или пикосекундными световыми лазерами серии PLP, продаваемыми компанией Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония. Получение данных может осуществляться с помощью TCSPC модуля PicoHarp 300, продаваемого компанией PicoQuant, Берлин, Германия; TCSPC модуля серии SPC, продаваемого компанией Becker & Hickl, Берлин, Германия; или синхронного генератора задержек С 10647, продаваемого компанией Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония. Подсчитывающим фотоны детектором может являться детекторный блок серии РМА, продаваемый компанией PicoQuant, Берлин, Германия; детекторный блок серии ID-100, продаваемый компанией Becker & Hickl, Берлин, Германия; или электронно-оптической камерой Streakscope (серии С 10627, продаваемой компанией Hamamatsu Photonics, Хамамацу, Япония). Будет являться полезным, что другие источники возбуждения, модули получения данных и подсчитывающие фотоны детекторы также могут быть использованы.

Части описанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения могут быть реализованы с помощью одной или нескольких компьютерных систем. Например, варианты осуществления могут быть реализованы с помощью аппаратного обеспечения, программного обеспечения или их комбинации. При реализации с помощью программного обеспечения код программного обеспечения может выполняться на любом подходящем процессоре или наборе процессоров, при этом присутствуя на отдельном компьютере или будучи распределенным среди нескольких компьютеров.

Также, является полезным то, что компьютер может быть реализован в любой форме, такой как размещенный в стойке компьютер, настольный компьютер, лэптоп, планшетный компьютер, компьютер на одной плате или система на кристалле. Кроме того, компьютер может быть встроен в устройство, как правило, не относящееся к компьютерам, но обладающее подходящими вычислительными возможностями, включая Персональный Цифровой Помощник (PDA), смартфон или любое другое подходящее переносное или стационарное электронное устройство.

Также компьютер может обладать одним или несколькими устройствами ввода и вывода. Данные устройства могут использоваться для, среди прочего, обеспечения представления пользовательского интерфейса. Примеры устройств вывода, которые могут использоваться для обеспечения наличия пользовательского интерфейса, включают принтера или дисплеи для визуального отображения вывода и динамики или другие воспроизводящие звук устройства для звукового представления вывода. Примеры устройств ввода, которые могут использоваться для пользовательского интерфейса включают клавиатуры и указательные устройства, такие как мыши, тачпэды, тачскрины и цифровые планшеты. В качестве другого примера компьютер может получать информацию, относящуюся ко вводу, с помощью распознавания речи или в другом звуковом формате.

Такие компьютеры могут быть связаны между собой с помощью одной или нескольких сетей в любой подходящей форме, включая локальную сеть или сеть широкого доступа, такую как корпоративную сеть или Интернет. Данные сети могут быть основаны на любой подходящей технологии и могут работать в соответствии с любым подходящим протоколом, и могут включать беспроводные сети, проводные сети или оптоволоконные сети.

Также, различные способы или процессы, описанные здесь, могут быть представлены в виде кода программного обеспечения, выполняющегося на одном или нескольких процессоров, работающих под управлением одной из многих операционных систем или платформ. Кроме того, данное программное обеспечение может быть написано с помощью любого из многих подходящих языков программирования и/или инструментов для программирования или написания скриптов, и также могут быть скомпилированы в виде выполняемого машинного кода или интерпретируемого кода, выполняемого на фреймворке или виртуальной машине.

В связи с этим, по меньшей мере, часть изобретения может быть осуществлена в виде читаемого компьютером носителя данных (или множества читаемых компьютером носителей данных) (например, в виде компьютерной памяти, одного или нескольких флоппи-дисков, компакт-дисков, оптических дисков, магнитных кассет, флэш-памяти, конфигурации цепи в программируемых пользователем вентильных матрицах или других полупроводниковых устройствах, или другой вещественной среды хранения данных), кодированного с помощью одной или нескольких программ таким образом, что при выполнении на одном или нескольких компьютерах или других процессорах, выполняет способы, реализующие, по меньшей мере, часть различных вариантов осуществления данного изобретения, описанных выше.

Читаемый компьютером носитель данных или носитель данных может являться переносным, таким образом, что программа или программы, хранимые на нем, могут быть загружены в один или несколько различных компьютеров или других процессоров для реализации различных аспектов настоящего изобретения как описано выше.

В связи с этим, будет являться полезным то, что одна реализация, по меньшей мере, части описанных выше вариантов осуществления данного изобретения включает, по меньшей мере, один читаемый компьютером носитель, кодированный с помощью компьютерной программы (например в виде множества инструкций), которые при выполнении на процессоре выполняют некоторые или все из вышеописанных функций данных вариантов осуществления изобретения. Как указано здесь, термин "читаемый компьютером носитель" относится только к читаемому компьютером носителю, который может рассматриваться являющимся машиной или продуктом производства (то есть изделием. Читаемый компьютером носитель может являться, например, вещественным носителем, на котором читаемая компьютером информация может быть кодирована и хранима, носителем для хранением данных, на котором читаемая компьютером информации может быть кодирована и хранима и/или носителем постоянного хранения, на котором читаемая компьютером информации может быть кодирована и хранима. Другие неисчерпывающие примеры читаемого компьютером носителя включают компьютерную память (например, ROM, RAM, флэш-память или другой тип компьютерной памяти), магнитный диск или кассету, оптический диск и/или другие типы читаемого компьютером носителя, который может рассматриваться в качестве машины или продукта производства.

Термины «программа» или «программное обеспечение» используются здесь в общем смысле для описания любого типа компьютерного кода или набора выполняемых инструкций, которые могут быть использованы для программирования компьютера или другого процессора для реализации различных аспектов настоящего изобретения, как описано выше. Кроме того, является полезным то, что в соответствии с одним аспектом данного варианта осуществления, одна или несколько компьютерных программ, которые при выполнении реализуют способы настоящего изобретения, не требуют нахождения на одном компьютере или процессоре, но могут быть распределены модульным образом среди множества различных компьютером или процессоров для реализации различных аспектов настоящего изобретения.

Выполняемые компьютером инструкции могут быть в различных формах, таких как программные модули, выполняемые одним или несколькими компьютерами или другими устройствами. В целом, программные модули включают сценарии, программы, объекты, компоненты, структуры данных и так Также, которые выполняют определенные задачи или реализуют конкретные абстрактные типы данных. Как правило, функциональность программных модулей может быть совмещена или распределена в зависимости от различных вариантов осуществления данного изобретения.

Пример 1. In vitro исследование флуоресцентного лиганда производства компании Neuroptix с бета-амилоидным пептидом (1-42);

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения выполняли in vitro исследования агрегированных Аβ пептидов связанных с Соединением №11. Измерения времени жизни флуоресценции Соединения №11 с агрегированным Аβ пептидов выполняли с помощью устройства в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Фиг.8А является изображением времени жизни флуоресценции Соединения №11 и Соединения №11, связанного с агрегированным Аβ пептидом с соответствующими им гистограммами времени жизни флуоресценции, показанными на Фиг.8B в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Скорости затухания определяют с помощью приближения гистограмм времени жизни. Данные результаты демонстрируют выдающуюся эффективность варианта осуществления данного изобретения, позволяющую осуществлять дифференциацию флюорофоров с разницей времени жизни, составляющей 0,85 нс, с низким уровнем обнаружения фотонов. Далее приведено описание примера.

Целью данного т vitro исследования являлась идентификация оптической сигнатуры Соединения №11 амилоидсвязывающего соединения и описание его флуоресцентных свойств при наличии связи с агрегированным Аβ пептидом. В частности, целями исследования были: описание времени затухания Соединения №11; и 2) возможность обнаружения и дифференциации Соединения №11, связанного и не связанного с бета-амилоидными (Аβ) пептидами.

Устройство:

Устройство SAPPHIRE II компании Neuroptix (Neuroptix Corporation, Acton, MA, U.S.A.) является специально сконструированным устройством для клинических исследований на людях, которое применяли для in vitro измерений для данного примера. Оно использует софокусный механизм сканирование, совмещенный со спектроскопией на основе времени жизни флуоресценции, позволяющий осуществлять дифференциацию флюорофоров. Устройство позволяет 1) осуществлять сканирование оптического луча в определенных участках передних сегментов глаза, таких как надъядерный участок хрусталика, и 2) идентифицировать флуоресцентные флюорофоры на основе измерений времени жизни флуоресценции.

Способ - получение агрегированных Аβ пептидов:

Агрегированный Аβ пептид получали с помощью растворения Аβ(1-42) d PBS со значением pH 7,4 до достижения концентрации 100 µМ. Данный раствор мешали в магнитной мешалке при 1200 об/мин в течение 3 дней при комнатной температуре. Исходный раствор Аβ(1-42) в PBS при концентрации 100 µМ аликвотировали и замораживали при -80°C в до 4 недель без заметных изменений его свойств. Пред-агрегированный Аβ(1-42) с концентрацией 150 µL добавляли в 2,85 мл Соединения №11 до достижения концентрации 5 µL Ар(1-42) и 4 µL Соединения №11. Раствор помещали во флакон объем 5 мл и проводили измерения флуоресценции при 25°C.

Эксперимент и Результаты

Образец, состоящий из Соединения №11 помещали в устройство SAPPHIRE II компании Neuroptix. Непосредственно при определении участка сканирования в образце выполняли растровое сканирование для получения значений времени жизни флуоресценции. На Фиг.8А показано изображение (200×200 пикселей) участка сканирования размером 100 µm×100 µm, полученное за 1 секунду. Изображение включает затемненные области для отражения времени затухания. Затемнение, занимающее большую часть фона изображения, отражает время затухания, равное 1,4 не, что соответствует времени затухания флуоресценции амилоидсвязывающего соединения. Обнаруженное на данном изображении пятно относится к агрегированному Аβ пептиду и отражает время затухания, равное 2,25 нс. На схеме на Фиг.8B показаны значения времени затухания флуоресценции, рассчитанные для Соединения №11 и Соединения №11, связанного с агрегированным Аβ пептидом.

Заключение

In vitro измерения времени жизни флуоресценции Соединения №11 с агрегированным Аβ пептидом выполняли с помощью устройства SAPPHIRE II компании Neuroptix. На основании значений времени затухания флуоресценции может быть осуществлена дифференциация Соединения №11, связанного и не связанного с пептидом. Данные результаты демонстрируют исключительную эффективность устройства SAPPHIRE II, позволяющую осуществлять дифференциацию флюорофоров со значением разницы времени жизни 0,85 нс всего лишь с помощью определения уровня нескольких сотен фотонов.

Пример 2. Исследование глазной фармакокинетики на голландских кроликах

В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения in vivo фармакокинетическое исследования Соединения №11 на глазах кроликов выполняли с помощью устройства в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Фиг.9А является схемой частоты подсчета фотонов с определенной скоростью затухания, измеренной у двух кроликов с введенным амилоидсвязывающим соединением по сравнению с контрольным кроликом. Частота подсчета фотонов с определенными скоростями затухания, соответствующими флуоресцентному амилоидсвязывающему соединению (Соединение №11) подсчитывали на основе флуоресцентной гистограммы (Фиг.9B) в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения. Данные результаты демонстрируют способность амилоидсвязывающего соединения проникать в роговицу и быть обнаруженным в хрусталиках глаз кроликов с помощью устройства. Далее приведено описание примера.

Введение

Выполняли исследование глазной фармакокинетики ответа введенного количества вещества с помощью местного введения флуоресцентного амилоидсвязывающего соединения на голландских кроликах. Кроликов обследовали каждый день в течение 4-дневного периода с использованием амилоидсвязывающего соединения Соединение №11 в форме мази. Двум животным вводили Соединение №11 (0,5%) в правый глаз в форме мази. Одно животное не подвергали лечению и использовали в качестве контрольного животного. Животным вводили вещество в определенные моменты времени в течение четырех дней и исследовали с помощью системы SAPPHIRE II для определения интенсивности флуоресценции и осуществления измерений времени жизни в начале и конце каждого дня.

Результаты демонстрируют:

Способные быть обнаруженными флуоресцентные сигналы были получены при значении концентрации Соединения №11 5 мг/г в мази после повторного местного введения.

2) Измерения флуоресценции, выполненные в начале и конце каждого дня в течение четырехдневного периода, показывают увеличение флуоресценции Соединения №11 в ядре хрусталиков глаз кроликов.

Способы:

Глазные измерения выполняли с интервалами времени и при концентрации доз, указанными в таблице ниже:

Исследование проводилось в течение четырех дней и осуществлялось в одном месте с помощью одного инструмента. Тестирование выполняли в затемненной комнате, выделенной для проведения исследования.

Всем животным было введено Соединения №11 с помощью местного глазного ввода с тестированием на правом глазе. Животные были анестезированы и зафиксированы вручную на платформе перед устройством SAPPHIRE II компании Neuroptix. Множественное позиционирование осуществляли с помощью держателя для животных, а тонкую настройку участка проведения измерения осуществляли благодаря оператору SAPPHIRE II компании Neuroptix. При завершении позиционирования оператор SAPPHIRE II инициировал последовательность осуществления измерения. Базовые измерения осуществляли на животных до введения и затем в начале и конце каждого дня (Таблица 1).

Схема эксперимента и дозировка:

Время жизни флуоресценции и измерения ее интенсивности осуществляли в глазе в начале и конце каждого дня. Измерения включали осевое сканирование глаза кролика (продольное сканирование) для получения внутриглазных данных и планарное сканирование (поперечное сканирование) для осуществления измерений времени затухания в определенном участке глаза, которым в данном случае являлось ядро хрусталика.

При определении целевого участка осуществляли подсчет единичных фотонов с корреляцией по времени (TCSPS) при выполнении поперечного сканирования. Затем получали изображения времени жизни флуоресценции, при этом для каждого пиксела получали гистограмму времени затухания. Подсчитанные значения времени затухания затем кодировали с помощью цвета на изображении времени жизни флуоресценции. Каждое измерение выполняли три раза. Подсчет частоты фотонов с определенными значениями времени затухания осуществляли на основе частоты затухания сигнатуры Соединения №11, полученной при проведении поперечного сканирования и усредненной на основе трех измерений. Калибрационные измерения выполняли один раз в день с помощью флуоресцентного красителя; они показали повторяющуюся степень эффективности без заметного смещения на протяжении проведения исследования. Устройство было сконструировано специально для использования на людях, однако платформа была немного модифицирована для фиксации кроликов.

Дозирование осуществлялось сотрудниками компании Toxikon с помощью местного введения в правый глаз каждого животного.

Группа 1: Животные были анестезированы с помощью подкожной инъекции дексдомитора (0,5 мг/кг), кетамина (0,5 мг/кг). Полоска мази длиной приблизительно 1/2 дюйма была нанесена на нижнее правое веко каждого животного в тестовой группе три раза в день в течение четырех дней.

Контроль: В контрольной группе одно животное было зафиксировано таким же образом, что и животные в тестовой группе за исключением того, что мазь или раствор не вводились в глаз.

Результаты:

Интенсивность флуоресценции и измерения времени жизни амилоидсвязывающего соединения в глазе выполняли в начале (утром) и в конце (вечером) каждого дня. Фиг.10А и 10B являются схемами, показывающими подсчет частоты фотонов с определенным временем затухания относящихся к Соединению №11, измеренными утром для получения базовой линии и в конце дня после введения в течение четырехдневного периода проведения исследования в ядре хрусталика пяти кроликов. Фиг.10А является схемой утренних измерений, а Фиг.10B является схемой вечерних измерений, при этом каждая из них относится к кроликам с введенной офтальмологической мазью на основе Соединения №11. Измерения на двух кроликах (1002 и 1003), которым вводили офтальмологическую мазь на основе Соединения №11, показывают значительное увеличение сигнала флуоресценции в ядре глаза. Фиг.10А и 10B показывают, что после трех введений каждый день с перерывом в три часа, кумулятивный флуоресцентный сигнал измеряли в течение 4 дней периода проведения исследования.

На Фиг.11А и 11B представлены изображения времени жизни флуоресценции, полученные при базовой линии и после окончания четвертого дня исследования на животном 1003. Результатом измерения базовой линии являлось черное изображение, что указывает на отсутствие Соединения №11 в хрусталике глаза. Спустя четыре дня с помощью поперечного сканирования получили изображение времени жизни с временем затухания, равным 2 нс (изображено серым цветом), являющимся сигнатурой времени жизни флуоресценции. Разница полученных сигналов двух кроликов может быть отнесена к разным дозировкам, выполненным техником, а также к морганию глаз животных.

Заключение

Основная задача была достигнута с использованием офтальмологической мази на основе Соединения №11 при концентрации 5 мг/г. Повторный местный ввод Соединения №11 имел склонность к скапливанию в ядре после нескольких часов введения, а также имел склонность к присутствию в нем в течение, по меньшей мере, 12 часов.

Изложение идей всех патентов, опубликованных заявок и ссылок, цитируемых здесь, приведено здесь во всей их полноте для ссылки.

В то время, как данное изобретение было, в частности, продемонстрировано и описано со ссылками на примерные описанные здесь варианты осуществления, специалисту в данной области будет понятно, что различные изменения в форме и деталях могут быть осуществлены здесь без выхода за рамки данного изобретения, описанного прилагаемой формулой изобретения.

Реферат

Заявлена группа изобретений, включающая устройство и способ для обнаружения амилоидного белка в глазе млекопитающего, может быть использована в медицине. Работа устройства и реализация способа построены, в частности, на освещении глаза источником света с, по меньшей мере, длиной волны или поляризацией или их комбинацией, каждая из которых является подходящей для индуцирования флуоресценции в, по меньшей мере, амилоидсвязывающем соединении, при этом амилоидсвязывающее соединение связано с амилоидным белком, при этом амилоидсвязывающее соединение введено в глаз и специфически связывается с амилоидным белком, указывающим на наличие амилоидогенного заболевания; улавливании света, включая флуоресценцию, индуцированную в результате освещения глаза; и определение времени затухания флуоресценции притом, что флуоресценция, по меньшей мере, индуцируется связанным с амилоидным белком амилоидсвязывающим соединением; определении возможности обнаружения присутствия связанного с амилоидным белком амилоидсвязывающего соединения в глазе на основе, по меньшей мере, времени затухания, при этом определение включает осуществление подсчета единичных фотонов индуцируемой глазом флуоресценции с корреляцией по времени. Заявленная группа позволяет на ранних стадиях определять наличие заболевания, связанного с увеличением содержания амилоидного белка в тканях глаза или устанавливать риск развития такого заболевания. 5 н. и 89 з.п. ф -лы, 12 ил., 1 табл., 2 пр.

Формула