Термически индуцированная прививка нетканых материалов для высокоэффективного ионообменного разделения - RU2715660C1

Чертежи

Показать все 12 чертежа(ей)

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к привитым полимером и функционализированным нетканым мембранам, адаптированным для применения в процессах разделения и очистки, а также к способам получения и применения таких мембран.

Уровень техники

Мембранная хроматография обеспечивает несколько потенциальных преимуществ в сравнении с традиционной хроматографией с уплотненным слоем наполнителя в качестве платформы для биоразделений. Взаимосвязанные поры мембран обеспечивают высокие скорости объемной выработки без значительных перепадов давления по сравнению с уплотненными солями. Хроматографические смолы необходимо уплотнять, естественно они не являются одноразовыми и, как результат, они требуют процессов обоснованной очистки и регенерации для их использования. С другой стороны, большое число мембран может быть изготовлено из полимеров с использованием масштабируемых методов производства, позволяющих их применение в виде укладываемых стопкой, готовых к применению, одноразовых фильтров биоразделения. Нетканые мембраны особенно привлекательны для таких вариантов применения, так как они являются высокотехнологичными, чтобы иметь контролируемые пористость, диаметры фильтров и размеры пор, с низкой стоимостью материалов при использовании высокопроизводительных методов производства. Связывание белка с мембранами ограничено преимущественно площадью поверхности, образованной порами, которая доступна как для потока, так и для адсорбции. Это устраняет все диффузионные ограничения по адсорбции, но также снижает связывающую способность мембран по сравнению с хроматографическими смолами. Промышленные нетканые материалы имеют площадь поверхности на порядок меньше площади поверхности хроматографических смол, что приводит к низким связывающим способностям в случае применения для захвата большинства целевых белков. За счет привязывания полимерных щеток к поверхности волокон в нетканой мембране могут быть созданы 3-трехмерные связующие домены, которые могут значительно повышать общую белок-связывающую способность. Прививка полимерных щеток, как известно, повышает белок-адсорбирующую способность в несколько раз в сравнении с монослойным покрытием в традиционных хроматографических смолах, половолоконных мембранах, литых мембранах и нетканых мембранах.

Прививка полимеров может радикально изменить свойства поверхности подложек. Прививка может способствовать настройке полярности поверхности, чтобы уменьшить или увеличить адсорбцию биомолекулы, и прививка может быть использована для введения функциональных групп с целью прикрепления лиганда или спейсерной «ножки» в 3-мерной микросреде, введенной на несущую поверхность раздела. В предыдущем исследовании, проведенном Liu с соавторами, глицидилметакрилатный (ГМА (GMA)) мономер был успешно привит к коммерчески доступному полибутилен-терефталатному (ПБТ (PBT)) нетканому материалу с помощью УФ прививочной полимеризации. (См., H. Liu, Y. Zheng, P. Gurgel, R. Carbonell, Affinity membrane development from PBT nonwoven by photo-induced graft polymerization, hydrophilization and ligand attachment, J. Membr. Sci. 428 (2013) 562-575). Равномерные и конформные поли-ГМА привитые элементы получены вокруг отдельных ПБТ волокон с использованием УФ-индуцированной свободно-радикальной полимеризации. Поли-ГМА прикрепляют непосредственно к поверхности ПБТ через отщепление водорода, чтобы инициировать полимеризацию ГМА, с использованием бензофенона (БФ (BP)) в качестве инициатора.

ПБТ является предпочтительным для использования в качестве исходного материала для прививки поли-ГМА, поскольку он не требует отдельной предварительной УФ-обработки поверхности, необходимой в случае прививочной полимеризации многих полиолефинов, обычно используемых при производстве нетканых материалов. ПБТ нетканые материалы являются по существу гидрофобными по своей природе, что приводит к высокой степени неспецифической абсорбции белков, делая сам материал основы плохой платформой для биоразделений. Прямой гидролиз поли-ГМА привитых элементов на ПБТ с использованием кислых условий делает поверхность волокна полностью гидрофильной и существенно снижает неспецифическую адсорбцию гидрофобных белков. Каждое мономерное звено ГМА содержит эпоксидную концевую группу, которая может быть использована для ковалентного прикрепления лигандов посредством нуклеофильного замещения подходящими аминами, тиолами и гидроксильными группами. В исследовании Liu с соавторами диэтиленгликоль, ковалентно прикрепленный к поли-ГМА щеткам, как установлено, также в значительной степени устраняет адсорбцию белков за счет неспецифических гидрофобных взаимодействий.

Привитые поли-ГМА нетканые материалы создают удобную платформу для разработки эффективных ионообменных мембран. Saito с соавторами успешно привили поли-ГМА щетки к полипропиленовым тканям и полиэтиленовым полым волокнам. (См., K. Saito, T. Kaga, H. Yamagishi, S. Furasaki, T. Sugo, J. Okamoto, Phosphorylated hollow fibers synthesized by radiation grafting and crosslinking, J. Membr. Sci. 43 (1989) 131-141). Такие привитые материалы функционализированы фосфорнокислыми группами с целью разработки сильных катионообменных мембран для захвата двухвалентных катионов металлов.

В исследовании Zheng с соавторами поли-ГМА был привит к полипропиленовому нетканому материалу и функционализирован диэтиламином (ДЭА (DEA)) с целью разработки слабого анионообменника. (См., Y. Zheng, H. Liu, P. Gurgel, R. Carbonell, Polypropylene nonwoven fabrics with conformal grafting of poly(glycidyl methacrylate) for bioseparations, J. Membr. Sci. 364 (2010) 362-371). Этот материал достигает равновесных связывающих способностей для бычьего сывороточного альбумина (БСА (BSA)) 120 мг/г мембраны.

Liu с соавторами изучили влияние различных степеней поли-ГМА прививки с помощью УФ-прививочной полимеризации на нетканый ПБТ для захвата БСА за счет анионного обмена. (См., H. Liu, Surface modified nonwoven membranes for bioseparations, Raleigh NC USA, North Carolina State Univ., PhD thesis, 2012). В этом исследовании поли-ГМА привитые элементы были превращены в слабые анионообменники с помощью ДЭА и протестированы на БСА. Установлено, что общая белок-связывающая способность растет со степенью прививки (%-ное увеличение массы). Наиболее высокую равновесную связывающую способность 800 мг/г наблюдают при увеличении массы 12% поли-ГМА. Это исследование также показало, что время пребывания от нескольких часов до целого дня требуется для достижения максимального связывания и что такое время связывания растет с ростом %-ного увеличения массы прививки. Такое длительное время пребывания делает невозможным применение этих привитых поли-ГМА нетканых ПБТ мембран для разработки высокопроизводительных, высокоэффективных устройств для захвата белков для производства и выделения целевого продукта, и они не выгодны для захвата какой-либо целевой молекулы.

Таким образом, остается потребность в привитых нетканых мембранах, способных к высокопроизводительному и высокоэффективному захвату белка.

Сущность изобретения

В одном варианте осуществления настоящего изобретения полибутилентерефталатные (ПБТ (PBT)) нетканые материалы могут быть легко привиты с помощью глицидилметакрилатных (ГМА (GMA)) или подобных метакрилатных полимеров посредством термически индуцированной радикальной полимеризации, чтобы создать структуры однородной и конформной полимерной щетки вокруг каждого волокна, которые могут быть химически модифицированы, чтобы они функционировали в качестве анионных или катионных обменников. Использование процесса термического инициирования обеспечивает возможность прививочной полимеризации полимерных слоев на нетканые материалы, монолиты или твердые вещества, которые препятствуют прохождению УФ излучения из-за их большой толщины или большой плотности, делая в результате невозможной УФ-прививочную полимеризацию. Помимо этого, в некоторых вариантах осуществления термически индуцированные привитые нетканые полотна по изобретению способны достигать равновесия связывания с целевой молекулой, такой как белок, намного быстрее, чем сравнимые УФ-инициированные привитые нетканые полотна. Равновесие связывания, как понимают, означает состояние, при котором скорость прямой и скорость обратной реакции связывания равны. В некоторых вариантах осуществления могут быть ковалентно прикреплены аффинные лиганды для целевого захвата. Кроме того, термическая прививочная полимеризация может быть использована, чтобы привить разнообразные фигурные полотна, волокна и монолиты равномерными, конформными привитыми слоями. Кроме того, термически индуцированные привитые волокна также могут быть использованы для высокоэффективного захвата небольших целевых молекул, таких как металлы-загрязнители или другие заряженные загрязнители, в биологических системах, сточных водах или других источниках воды с целью очистки (в том числе необязательно деминерализации).

В одном или нескольких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения привитой полимером и функционализированной нетканой мембраны. Полученная таким способом мембрана может быть, в частности, адаптирована для применения при выделении целевой молекулы. В неограничивающем примере способ может включать: i) получение нетканого полотна, содержащего множество полимерных волокон; ii) прививочную полимеризацию акрилатного или метакрилатного полимера на множество полимерных волокон с получением множества сегментов полимера, прикрепленных к волокнам, получая в результате привитые полимерные волокна, причем стадия прививочной полимеризации включает: a) контактирование нетканого полотна с раствором, содержащим термический свободно-радикальный инициатор, чтобы обеспечить адсорбцию или абсорбцию термического инициатора на волокнах в нетканом полотне, b) контактирование нетканого полотна с раствором, содержащим, по меньшей мере, один акрилатный или метакрилатный мономер, и c) воздействие тепла на нетканое полотно, чтобы инициировать полимеризацию акрилатного или метакрилатного мономера; и iii) функционализацию привитых полимерных волокон с целью прикрепления, по меньшей мере, одной функциональной группы, приспособленной для связывания с целевой молекулой, к сегментам полимера привитых полимерных волокон.

В других вариантах осуществления способ может быть охарактеризован в зависимости от одного или нескольких из следующих утверждений, которые могут быть объединены в любом количестве и в любом порядке.

Полимерные волокна выбирают из группы, включающей полиолефины, сложные полиэфиры, термопластичные полимеры и их комбинации.

Полимерные волокна содержат термопластичные полимеры, выбираемые из группы, включающей полиамиды, поликарбонаты, простые полиэфирсульфоны и их комбинации.

Полимерные волокна выбирают из группы, включающей полибутилентерефталат (ПБТ), политриметилентерефталат (ПТТ (PTT)), полиэтилентерефталат (ПЭТ (PET)), полиамид 6 (ПА6 (PA6)), полиамид 6-6 (ПА6-6 (PA6-6)) и их комбинации.

Способ включает получение нетканого полотна, содержащего множество полибутилентерефталатных волокон, и прививочную полимеризацию метакрилатного полимера, содержащего поли(глицидилметакрилат) (поли-ГМА).

Термический свободно-радикальный инициатор представляет собой материал, выполненный с возможностью разложения на химические радикалы при температуре, при которой полимеризуется акрилатный или метакрилатный мономер.

Термический свободно-радикальный инициатор представляет собой пероксид или азо-соединение.

Термический свободно-радикальный инициатор может быть выбран, но без ограничения, из группы, включающей трет-амил-пероксибензоат, 4,4-азобис(4-циановалериановую кислоту), 1,1'-азобис(циклогексанкарбонитрил), 2,2'-азобисизобутиронитрил (АИБН (AIBN)), бензоилпероксид, 2,2-бис(трет-бутилперокси)-бутан, 1,1-бис(трет-бутилперокси)циклогексан, 2,5-бис(трет-бутилперокси)-2,5-диметилгексан, 2,5-бис(трет-бутилперокси)-2,5-диметил-3-гексин, бис(1-(трет-бутилперокси)-1-метилэтил)-бензол, 1,1-бис(трет-бутилперокси)-3,3,5-триметилциклогексан, трет-бутилгидропероксид, трет-бутилперацетат, трет-бутил-пероксид, трет-бутилпероксибензоат, трет-бутилперокси-изопропилкарбонат, гидропероксид кумена, циклогексанон-пероксид, дикумилпероксид, лауроилпероксид, 2,4-пентандион-пероксид, перуксусную кислоту, персульфат калия и их комбинации.

Раствор, содержащий термический свободно-радикальный инициатор имеет концентрацию термического свободно-радикального инициатора приблизительно от 10 до 200 мМ.

Нетканое полотно вводят в контакт с раствором, содержащим термический свободно-радикальный инициатор, в течение приблизительно от 1 сек до 10 час.

Стадия воздействия тепла на нетканое полотно включает нагревание нетканого полотна при температуре, по меньшей мере, приблизительно 50°C.

Акрилатный или метакрилатный мономер или сомономеры могут быть выбраны, но без ограничения, из группы, включающей глицидилметакрилат, метакриловую кислоту, 2-(диэтиламино)этил-метакрилат, [2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорид, 2-гидроксиэтилметакрилат, 2-акриламидо-2-метилпропансульфоновую кислоту, 2-(диметиламино)этилметакрилат, бутилметакрилат, 3-хлор-2-гидроксипропилметакрилат, 2-этилгексилметакрилат и их комбинации.

Привитые полимерные волокна функционализируют с целью прикрепления функциональной группы, выполненной с возможностью катионного или анионного обмена с целевой молекулой. Ионообменная группа может представлять собой сильный ионообменник (анион или катион) или слабый ионообменник (анион или катион), заряженный мультимодальный лиганд (анион или катион) или анионный или катионный заряженный полимер.

Привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана показывает равновесную связывающую способность приблизительно вплоть до 1000 ммоль/г целевой молекулы.

Целевая молекула может представлять собой белок, вирусную частицу, экзосому, микробную клетку или клетку млекопитающего, биомолекулу, такую как, но без ограничения, ДНК, РНК, пептиды, а также небольшую молекулу, такую как АТФ (ATP), витамины, стероиды и заряженные фрагменты низкой молекулярной массы.

Нетканое полотно показывает увеличение массы вследствие прививочной полимеризации приблизительно от 1 до 50% из расчета на массу нетканого полотна перед прививочной полимеризацией.

Нетканое полотно имеет толщину приблизительно от 1 мкм до 2 м. Нетканое полотно может быть толще, чем расстояние проникновения УФ излучения, так что прививочная полимеризация может быть проведена посредством индуцированной термически прививочной полимеризации, а не с помощью УФ-прививочной полимеризации.

Прививочная полимеризация формирует конформный равномерный привитый слой вокруг каждого волокна, имеющий толщину приблизительно от 0,05 до 100 мкм.

Привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана выполнена с возможностью достижения равновесия связывания для целевой молекулы за время приблизительно 1 час или меньше. В некоторых вариантах осуществления равновесие связывания может иметь место за 10 мин или меньше. В некоторых вариантах осуществления равновесие связывания может быть достигнуто за 5 мин или меньше.

В одном или нескольких вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к привитой полимером и функционализированной нетканой мембране. В частности, привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана может представлять собой мембрану, которая получена в соответствии со способами, описанными в данном изобретении. Более конкретно, привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана может быть термически привита так, что она обнаруживает свойства, которые описаны далее в документе, которые возникают в результате процесса термической прививочной полимеризации. Указанные свойства, в частности, могут выделять термически привитую мембрану из аналогичных материалов, но полученных с помощью других способов, таких как УФ-прививочная полимеризация.

В типичных вариантах осуществления привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана в соответствии с настоящим описанием может содержать нетканое полотно, образованное множеством полимерных волокон, включающих привитые на них множество сегментов полимера, выполненных из акрилатного или метакрилатного полимера, причем множество сегментов несет функциональные группы, приспособленные для связывания с целевой молекулой, при этом множество сегментов полимера термически привито к нетканой мембране так, что привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана эффективна для достижения равновесия связывания целевой молекулы за время приблизительно 1 час или меньше, в некоторых вариантах осуществления предпочтительно за 10 мин или меньше и в других вариантах осуществления предпочтительно за 5 мин или меньше.

В дополнение к вышесказанному в разнообразных вариантах осуществления настоящее изобретение также может относиться к способам отделения целевой молекулы от раствора. Например, способ может включать пропускание раствора с целевой молекулой через привитую полимером и функционализированную нетканую мембрану, которая описана, так, что, по меньшей мере, часть целевой молекулы в растворе связывается с привитой полимером и функционализированной нетканой мембраной.

Более того, настоящее изобретение может относиться к способам сокращения времени до достижения равновесия связывания при отделении целевой молекулы от раствора. Как отмечалось выше и описано далее в документе, привитые полимером и функционализированные нетканые мембраны, полученные в соответствии с настоящим описанием, могут проявлять свойства, которые не достигаются в мембранах, полученных методами УФ-прививочной полимеризации. Мембраны по настоящему изобретению, следовательно, могут быть особенно полезны при разработке высокоэффективных и высокопроизводительных методов разделения. Например, способ сокращения времени до достижения равновесия связывания при отделении целевой молекулы от раствора может включать пропускание раствора с целевой молекулой через привитую полимером и функционализированную нетканую мембрану, которая получена путем термической прививочной полимеризации акрилатного или метакрилатного полимера на множестве полимерных волокон, образующих нетканое полотно, причем полученная таким способом привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана эффективна для достижения равновесия связывания целевой молекулы за время приблизительно 1 час или меньше, в некоторых вариантах осуществления предпочтительно за 10 мин или меньше, и в некоторых вариантах осуществления предпочтительно за 5 мин или меньше. Настоящее изобретение описывает способ, в котором прививочная полимеризация может быть проведена на нетканых материалах или подложках больших размеров, большой толщины и плотности, которые не допускают проникновение УФ излучения, препятствуя применению метода УФ-прививочной полимеризации.

Изобретение включает, но без ограничения, следующие варианты осуществления.

Вариант осуществления 1: Способ получения привитой полимером и функционализированной нетканой мембраны, адаптированной для применения при захвате целевой молекулы, включающий: i) получение нетканого полотна, содержащего множество полимерных волокон; ii) прививочную полимеризацию акрилатного или метакрилатного полимера на множестве полимерных волокон с образованием множества сегментов полимера, ковалентно прикрепленных к волокнам, с получением в результате привитых полимерных волокон, причем стадия прививочной полимеризации включает: a) контактирование нетканого полотна с раствором, содержащим термический свободно-радикальный инициатор, чтобы обеспечить абсорбцию термического инициатора в нетканое полотно, b) контактирование нетканого полотна с раствором, содержащим, по меньшей мере, один акрилатный или метакрилатный мономер, и c) воздействие тепла на нетканое полотно, чтобы инициировать полимеризацию акрилатного или метакрилатного мономера; и iii) функционализацию привитых полимерных волокон с целью прикрепления, по меньшей мере, одной функциональной группы, выполненной с возможностью связывания целевой молекулы с сегментами полимера привитых полимерных волокон.

Вариант осуществления 2: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых полимерные волокна выбирают из группы, включающей полиолефины, сложные полиэфиры, термопластичные полимеры и их комбинации.

Вариант осуществления 3: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых полимерные волокна содержат термопластичные полимеры, выбираемые из группы, включающей полиамиды, поликарбонаты, простые полиэфирсульфоны и их комбинации.

Вариант осуществления 4: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых полимерные волокна выбирают из группы, включающей полибутилентерефталат (ПБТ), политриметилентерефталат (ПТТ), полиэтилентерефталат (ПЭТ), полиамид 6 (ПА6), полиамид 6-6 (ПА6-6) и их комбинации.

Вариант осуществления 5: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых способ включает получение нетканого полотна, содержащего множество полибутилентерефталатных волокон, и прививочную полимеризацию метакрилатного полимера, содержащего поли(глицидилметакрилат) (поли-ГМА).

Вариант осуществления 6: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых термический свободно-радикальный инициатор представляет собой материал, выполненный с возможностью разложения на химические радикалы при температуре, при которой полимеризуется акрилатный или метакрилатный мономер.

Вариант осуществления 7: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых термический свободно-радикальный инициатор представляет собой пероксид или азо-соединение.

Вариант осуществления 8: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых термический свободно-радикальный инициатор выбирают из группы, включающей трет-амилпероксибензоат, 4,4-азобис(4-циановалериановую кислоту), 1,1'-азобис(циклогексанкарбо-нитрил), 2,2'-азобисизобутиронитрил (АИБН (AIBN)), бензоил-пероксид, 2,2-бис(трет-бутилперокси)бутан, 1,1-бис(трет-бутил-перокси)циклогексан, 2,5-бис(трет-бутил-перокси)-2,5-диметил-гексан, 2,5-бис(трет-бутилперокси)-2,5-диметил-3-гексин, бис(1-(трет-бутилперокси)-1-метилэтил)бензол, 1,1-бис(трет-бутилперокси)-3,3,5-триметилциклогексан, трет-бутилгидро-пероксид, трет-бутилперацетат, трет-бутилпероксид, трет-бутилпероксибензоат, трет-бутилпероксиизопропилкарбонат, гидропероксид кумена, циклогексанонпероксид, дикумилпероксид, лауроилпероксид, 2,4-пентандион-пероксид, перуксусную кислоту, персульфат калия и их комбинации.

Вариант осуществления 9: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых раствор, содержащий термический свободно-радикальный инициатор, имеет концентрацию термического свободно-радикального инициатора приблизительно от 10 до 200 мМ.

Вариант осуществления 10: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых нетканое полотно вводят в контакт с раствором, содержащим термический свободно-радикальный инициатор, в течение времени приблизительно 1 сек до 10 час.

Вариант осуществления 11: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых стадия воздействия тепла на нетканое полотно включает нагревание нетканого полотна при температуре, по меньшей мере, приблизительно 50°C.

Вариант осуществления 12: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых, по меньшей мере, один акрилатный или метакрилатный мономер выбирают из группы, включающей глицидилметакрилат, метакриловую кислоту, 2-(диэтиламино)этилметакрилат, [2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорид, 2-гидроксиэтил-метакрилат, 2-акриламидо-2-метилпропансульфоновую кислоту, 2-(диметиламино)этилметакрилат, бутилметакрилат, 3-хлор-2-гидроксипропилметакрилат, 2-этилгексилметакрилат и их комбинации.

Вариант осуществления 13: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых привитые полимерные волокна функционализируют с целью прикрепления функциональной группы, подобранной с возможностью катионного или анионного обмена с целевой молекулой.

Вариант осуществления 14: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых привитая полимером и функционализированная мембрана показывает равновесную связывающую способность приблизительно вплоть до 1000 ммоль/г целевой молекулы.

Вариант осуществления 15: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых нетканое полотно показывает увеличение массы вследствие прививочной полимеризации приблизительно от 1 до 50% из расчета на массу нетканого полотна до прививочной полимеризации.

Вариант осуществления 16: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых нетканое полотно имеет толщину приблизительно от 1 мкм до 2 м.

Вариант осуществления 17: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых прививочная полимеризация формирует привитой слой, имеющий толщину приблизительно от 0,05 до 100 мкм.

Вариант осуществления 18: Способ в соответствии с любыми предыдущими или последующими вариантами осуществления, в которых привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана выполнена с возможностью достижения равновесия связывания для целевой молекулы за время приблизительно 1 час или меньше.

Вариант осуществления 19: Привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана, полученная в соответствии со способом по любому предыдущему варианту осуществления.

Вариант осуществления 20: Способ отделения целевой молекулы от раствора, и этот способ включает пропускание раствора с целевой молекулой через привитую полимером и функционализированную нетканую мембрану в соответствии с любым предыдущим вариантом осуществления так, что, по меньшей мере, часть целевой молекулы в растворе связывается с привитой полимером и функционализированной нетканой мембраной.

Вариант осуществления 21: Способ сокращения времени до достижения равновесия связывания при отделении целевой молекулы от раствора, и этот способ включает пропускание раствора с целевой молекулой через привитую полимером и функционализированную нетканую мембрану, которая получена путем термической прививочной полимеризации акрилатного или метакрилатного полимера на множестве полимерных волокон, образующих нетканое полотно, причем полученная таким способом привитая полимером и функционализированная мембрана эффективна для достижения равновесия связывания для целевой молекулы за время приблизительно 1 час или меньше.

Вариант осуществления 22: Способ по любому предыдущему варианту осуществления, в котором привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана эффективна для достижения равновесия связывания целевой молекулы за время приблизительно 10 мин или меньше.

Вариант осуществления 23: Привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана, содержащая нетканое полотно, образованное множеством полимерных волокон, включающих привитые на них множество сегментов полимера, созданных из акрилатного или метакрилатного полимера, причем множество сегментов полимера несет функциональные группы, подобранные с возможностью связывания целевой молекулы, при этом множество сегментов полимера термически привито к нетканой мембране так, что привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана эффективна для достижения равновесия связывания целевой молекулы за время приблизительно 1 час или меньше.

Эти и другие признаки, аспекты и преимущества изобретения будут очевидны при изучении приведенного ниже подробного описания вместе с сопроводительными чертежами, которые кратко описаны ниже. Изобретение включает любую комбинацию двух, трех, четырех или более вышеупомянутых вариантов осуществления, а также комбинации любых двух, трех, четырех или более признаков или элементов, представленных в этом описании, независимо от того, являются ли такие признаки или элементы однозначно объединенными в конкретном варианте осуществления изобретения. Это описание рассчитано на комплексное понимание, так что любые отделяемые признаки или элементы раскрытого изобретения в любом из его различных аспектов и вариантов осуществления следует рассматривать как предназначенные для комбинирования, если контекст однозначно не диктует иное.

Краткое описание чертежей

Для понимания вариантов осуществления изобретения дается ссылка на прилагаемые чертежи, которые не обязательно выполнены в масштабе. Чертежи приведены только в качестве примера и их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение.

ФИГ. 1 графически иллюстрирует индуцированную термически прививочную полимеризацию, оцениваемую по %-ному увеличению массы, для разных концентраций ГМА (% об./об.) и разных температур полимеризации в интервале времени полимеризации.

ФИГ. 2A-2F представляют собой СЭМ-микрофотографии (4000x) индуцированной термически прививочной полимеризации на ПБТ нетканые материалы в случае повышения %-ного увеличения массы, где (A) показывает ПБТ нетканый материал до прививочной полимеризации, (B) показывает ПБТ нетканый материал, привитый до 1,5%-ного увеличения массы, (C) показывает ПБТ нетканый материал, привитый до 7,5%-ного увеличения массы, (D) показывает ПБТ нетканый материал, привитый до 11,5%-ного увеличения массы, (E) показывает ПБТ нетканый материал, привитый до 16%-ного увеличения массы, и (F) показывает ПБТ нетканый материал, привитый до 19%-ного увеличения массы.

ФИГ. 3 графически иллюстрирует функционализированные ДЭА (DEA) привитые поли-ГМА нетканые материалы, включающие термически индуцированные, привитые поли-ГМА нетканые материалы при разных условиях, относительно УФ-индуцированных привитых поли-ГМА нетканых материалов (плотности определяют с помощью элементного анализа).

ФИГ. 4A и 4B графически иллюстрируют равновесное связывание БСА для анионообменных функционализированных термически привитых ПБТ нетканых материалов для различных условий прививочной полимеризации, где (A) показывает разные концентрации в % мономера ГМА (об./об.), испытанные в случае термической прививочной полимеризации, и (B) показывает разные температуры полимеризации, проверенные для термической прививочной полимеризации.

ФИГ. 5 графически иллюстрирует сравнение равновесной белок-связывающей способности ПБТ нетканых материалов, привитых термически и с помощью УФ излучения, функционализированных в виде анионного и катионного обменника для захвата БСА и hIgG, соответственно (термически привитые нетканые материалы привиты с помощью 30% (об./об.) ГМА при 80°C).

ФИГ. 6A и 6B представляют собой СЭМ-изображения поперечных сечений ПБТ волокна, привитого с помощью прививочной полимеризации, индуцированной УФ излучением (A) и термически (B).

ФИГ. 7A и 7B представляют собой схематичное изображение поли-ГМА привитых слоев, полученных при индуцированной УФ излучением прививочной полимеризации (A) и индуцированной термически прививочной полимеризации (B).

ФИГ. 8A и 8B графически иллюстрируют равновесную связывающую способность различных целевых молекул, представленную в значениях связанной массы на массу связанной мембраны, относительно мембран с переменными степенями прививки поли-ГМА для (A) термически привитых нетканых материалов и (B) УФ-привитых нетканых материалов.

ФИГ. 9 графически иллюстрирует равновесную связывающую способность различных целевых молекул, представленную в виде связанных ммолей на массу связанной мембраны, относительно мембран с переменными степенями прививки поли-ГМА для термически привитых нетканых материалов и УФ-привитых нетканых материалов.

ФИГ. 10 графически иллюстрирует целевое связывание в виде функции молекулярной массы мишени в случае как УФ-привитых ПБТ нетканых материалов, так и термически привитых ПБТ нетканых материалов при увеличении массы 6,5%, 14% и 25%.

ФИГ. 11 графически иллюстрирует захват БСА при разном времени контакта для анионообменных функционализированных привитых нетканых материалов: УФ-привитые с увеличением массы 20% и 5,9% (данные взяты из публикации Heller et al., Reducing diffusion limitations in ion exchange grafted membranes using high surface area nonwovens, Journal of Membrane Science, Volume 514, 2016, Pages 53-64), а также термически привитые с увеличением массы 24%, 15% и 6% (все эксперименты проведены в системах периодического действия).

ФИГ. 12 графически иллюстрирует захват hIgG при разном времени контакта для катионообменных функционализированных привитых нетканых материалов: УФ-привитые с увеличением массы 18% и 5% (данные взяты из публикации Heller 2015), а также термически привитые с увеличением массы 24%, 15% и 6% (все эксперименты проведены в системах периодического действия).

ФИГ. 13A и 13B графически иллюстрируют изотермы связывания белка для разного %-ного увеличения массы, где (A) относится к термически привитым нетканым материалам, функционализированным как анионообменники для захвата БСА и как катионообменники для захвата hIgG, и (B) относится к УФ-привитым нетканым материалам, функционализированным как анионообменники для захвата БСА и как катионообменники для захвата hIgG.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение будет описано более полно со ссылкой на прилагаемые чертежи. Изобретение может быть реализовано во многих разных формах и его не следует рассматривать как ограниченное вариантами осуществления, представленными в данном документе; наоборот, такие варианты осуществления представлены с тем, чтобы настоящее описание соответствовало требованиям законодательства. Одинаковые номера относятся к одинаковым элементам по всему описанию. Как используется в данном описании и в формуле изобретения, форма единственного числа «a», «an» и «the» включает форму множественного числа определяемого объекта, если в контексте однозначно не предписано иное.

В настоящем изобретении используют нетканое полотно или волокнистый монолит в качестве основы для создания функционализированной мембраны, которую можно применять в случае разнообразных методов разделения, таких как выделение белков из некоторых растворов с использованием ионообменной или аффинной хроматографии, захват биомолекул из биологических жидкостей, захват ионных форм из газов, воды и других растворителей, или в любых других процессах разделения, которые используют неподвижную фазу для целевого захвата. Подвижной фазой, используемой в таких процессах разделения, могут быть газы, вода, органические растворители или биологические жидкости. Нетканые полотна по изобретению также могли бы быть использованы в областях переработки сточных вод.

Нетканое полотно может быть образовано из однокомпонентных или многокомпонентных волокон и может иметь средний диаметр переменного размера, как правило, в интервале приблизительно от 0,1 до 100 мкм (более часто приблизительно от 1 до 10 мкм). Нетканое полотно может иметь типичную удельную площадь поверхности по БЭТ приблизительно от 0,5 до 30 м²/г, например, приблизительно от 1,0 до 2,0 м²/г.

Как используется в данном документе, термин «волокно» определяют, как базовый элемент текстильных материалов, который имеет высокое аспектное отношение, например, отношение длины к диаметру, по меньшей мере, приблизительно 100. Кроме того, «элементарные волокна/непрерывные элементарные волокна» представляют собой непрерывные волокна чрезвычайно большой длины, которые обладают очень высоким аспектным отношением. Термин «многокомпонентные волокна» относится к волокнам, которые содержат два или более полимеров, которые отличаются по физической или химической природе, включая двухкомпонентные волокна. Термин «нетканый», используемый в документе при ссылке на волокнистые материалы, полотна, маты, технические ферты или листы, относится к волокнистым структурам, где волокна выровнены в неопределенной или случайной ориентации. Волокна в соответствии с настоящим изобретением могут меняться и включать волокна, имеющие любой тип поперечного сечения, включая, но без ограничения, круглое, прямоугольное, квадратное, овальное, треугольное и многолопастное. В некоторых вариантах осуществления волокна могут иметь одно или несколько пустых пространств, где пустые пространства могут иметь, например, круглые, прямоугольные, квадратные, овальные, треугольные или многолопастные поперечные сечения.

Средства производства нетканого полотна могут меняться. В общем случае нетканые волокна, как правило, производят на трех стадиях: формирование полотна, скрепление и финишные обработки. Формирование волокна может быть выполнено с помощью любых средств, известных в данной области техники. Например, полотна могут быть сформированы процессом сухого холстоформования, фильерным способом холстоформования или способом мокрой выкладки. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения нетканое полотно готовят с помощью процесса скрепления прядением. При скреплении прядением можно использовать разные типы процесса прядения волокна (например, мокрый, сухой, в расплаве или в эмульсии). Прядение из расплава является наиболее широко используемым, когда полимер плавят до жидкого состояния и принудительно пропускают через небольшие отверстия в холодный воздух, так что полимерные пряди затвердевают в соответствии с конфигурацией отверстий. Пучки волокон, произведенные таким путем, затем вытягивают, то есть, механически растягивают (например, в 3-5 раз) для ориентирования волокон. Нетканое полотно затем формируют путем осаждения вытянутых волокон на движущуюся ленту. Обычные способы скрепления прядением описаны, например, в патентах США №№ 4340563 (Appel et al.), 3692618 (Dorschner et al.), 3802817 (Matsuki et al.), 3338992 и 3341394 (Kinney), 3502763 (Hartmann) и 3542615 (Dobo et al.), которые все включены в данный документ посредством ссылки. Скрепление прядением, как правило, дает более высокий диаметр, чем метод плавления с раздувом. Например, в некоторых вариантах осуществления скрепление прядением дает волокна, имеющие средний диаметр приблизительно 10 мкм или больше.

Для обработки многокомпонентных волокон доступны различные методы, чтобы получать волокна, имеющие меньший диаметр (например, меньше чем приблизительно 1,5 мкм, меньше чем приблизительно 1,0 мкм или меньше чем приблизительно 0,5 мкм). Хотя такие методы обычно применяют к изготовленным по технологии скрепления прядением материалам, которые, как правило, имеют большие диаметры, следует отметить, что они также могут быть применены к полученным плавлением с раздувом материалам, а также к волокнистым материалам, полученным с помощью других средств. Например, в некоторых вариантах осуществления производят расщепляемые многокомпонентные волокна (например, включая, но без ограничения, в конфигурации «сегментированного пирога», тесьмы, «острова в море» или многолопастной) и затем расщепляют или фибриллируют с получением двух или более волокон, имеющих меньшие диаметры. Средства, с помощью которых такие волокна могут быть расщеплены, могут меняться и могут включать разнообразные процессы, которые сообщают механическую энергию волокнам, такие как гидроперепутывание. Типичные способы для такого процесса описаны, например, в патенте США № 7981226 (Pourdeyhimi et al.), который включен в данный документ посредством ссылки.

Как отмечено выше, в некоторых вариантах осуществления производят многокомпонентные волокна и затем обрабатывают (например, путем введения волокна в контакт с растворителем), чтобы удалить один или несколько компонентов. Например, в некоторых вариантах осуществления может быть произведено волокно в конфигурации «острова в море» и обработано с целью растворения компонента «море», оставляя «острова» в качестве волокон с меньшими диаметрами. Типичные способы для такого типа процесса описаны, например, в патенте США № 4612228 (Kato et al.), который включен в данный документ посредством ссылки.

Волокнистые полотна, произведенные таким путем, могут иметь переменный базовый вес. В некоторых вариантах осуществления базовый вес нетканого полотна составляет приблизительно 400 г/м² или меньше, приблизительно 150 г/м² или меньше, приблизительно 100 г/м² или меньше или приблизительно 50 г/м² или меньше. Приведенные выше интервалы могут быть дополнительно определены с помощью минимального значения приблизительно 10 г/м². В некоторых вариантах осуществления нетканый материал имеет базовый вес приблизительно от 25 до 125 г/м². Базовый вес ткани может быть измерен, например, с использованием методов испытания, описанных в стандарте ASTM D 3776/D 3776M-09ae2 под названием «Standard Test Method for Mass Per Unit Area (Weight) of Fabric». Это метод испытания дает показатель массы на единицу площади, который измеряют и выражают в виде граммов на квадратный метр (г/м²). В некоторых вариантах осуществления индуцированная термически прививочная полимеризация может быть использована с подложками на основе волокон (например, с неткаными полотнами), имеющими базовые веса вплоть до 1000 г/м².

Нетканое полотно, приемлемое для прививочной полимеризации, может иметь толщину в интервале приблизительно от 1 мкм и вплоть до нескольких метров (например, приблизительно до 2 м). В конкретных вариантах осуществления нетканое полотно может иметь толщину приблизительно от 1 мкм до 100 см, приблизительно от 2 мкм до 10 см, приблизительно от 10 мкм до 1 см или приблизительно от 50 мкм до 0,5 см. В других вариантах осуществления нетканое полотно может иметь толщину от 300 мкм до 2 м, приблизительно от 400 мкм до 100 см или приблизительно от 500 мкм до 1 см.

Полимер нетканого полотна может меняться, но, как правило, будет содержать термопластичный полимер, который хорошо подходит для прививочной полимеризации. Типичные полимеры включают полиолефины (например, полиэтилен или полипропилен), сложные полиэфиры и полиамиды. Сложные полиэфиры особенно полезны, включая полибутилентерефталат (ПБТ), политриметилентерефталат (ПТТ), полиэтилентерефталат (ПЭТ), сложные со-полиэфиры и их комбинации. Термопластики, такие как полиамиды, также могут быть особенно полезны и могут представлять собой полиамид 6 (ПА6) и полиамид 6-6 (ПА6-6). Полезными термопластичными полимерами помимо полиамидов являются, например, поликарбонаты и простые полиэфирсульфоны.

Как отмечалось выше, полимерные волокна нетканого полотна могут быть подвергнуты процессу прививочной полимеризации, посредством которого полимерные щетки или сегменты химически прикрепляют к волокнам. Особенно полезна термическая прививочная полимеризация. Как используется в данном документе, термическая прививочная полимеризация, как понимают, относится к процессу, при котором термические свободно-радикальные инициаторы адсорбируют или абсорбируют на основе (например, на волокнах в нетканом полотне) перед добавлением мономеров полимера и применяют нагревание, чтобы вызвать полимеризацию мономеров, которая инициируется термическими свободно-радикальными инициаторами. Начальные условия термической прививочной полимеризации оказывают влияние на общую связывающую способность материала. Повышение начальной концентрации мономера для прививочной полимеризации, как правило, приводит к привитому слою (такому как слой поли(глицидилметакрилата) («поли-ГМА»)), который связывает больше белка, а повышение температуры полимеризации, как правило, приводит к привитому слою, который связывает меньше белка.

Этот способ, как правило, предусматривает введение в контакт нетканого полотна с первым раствором, содержащим термический свободно-радикальный инициатор, растворенный в подходящем растворителе, таком как диметилформамид (ДМФА) или диметилацетамид (ДМАА (DMAc)), и предоставление возможности термическому инициатору адсорбироваться или абсорбироваться на нетканом полотне. Предпочтительно, термический инициатор может представлять собой любой материал, приспособленный для адсорбирования или абсорбирования на поверхности волокна для создания сайта радикального инициирования. Термический инициатор может представлять собой любой материал, выполненный с возможность разложения на химические радикалы при температуре, при которой полимеризуется акрилатный или метакрилатный мономер. Могут быть приемлемы, в частности, различные пероксиды и азо-соединения. Неограничивающие примеры полезных термических инициаторов включают трет-амил-пероксибензоат, 4,4-азобис(4-циановалериановую кислоту), 1,1'-азобис(циклогексанкарбонитрил), 2,2'-азобисизобутиронитрил (АИБН (AIBN)), бензоилпероксид, 2,2-бис(трет-бутилперокси)-бутан, 1,1-бис(трет-бутилперокси)циклогексан, 2,5-бис(трет-бутилперокси)-2,5-диметилгексан, 2,5-бис(трет-бутилперокси)-2,5-диметил-3-гексин, бис(1-(трет-бутилперокси)-1-метилэтил)-бензол, 1,1-бис(трет-бутилперокси)-3,3,5-триметилциклогексан, трет-бутилгидропероксид, трет-бутилперацетат, трет-бутил-пероксид, трет-бутилпероксибензоат, трет-бутилперокси-изопропилкарбонат, гидропероксид кумена, циклогексанон-пероксид, дикумилпероксид, лауроилпероксид, 2,4-пентандион-пероксид, перуксусную кислоту и персульфат калия, а также их комбинации. Группа термических инициаторов, полезных в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, таким образом, может включать любой инициатор или любую комбинацию из приведенных выше типичных материалов и аналогично может не включать любой инициатор или любую комбинацию из приведенных выше типичных материалов.

Раствор, содержащий термический инициатор, может иметь концентрацию термического инициатора приблизительно от 10 до 200 мМ, приблизительно от 20 до 150 мМ или приблизительно от 30 до 120 мМ. В одном варианте осуществления нетканое полотно или другой волокнистый монолит вводят в контакт с раствором, имеющим концентрацию термического инициатора приблизительно от 50 до 90 мМ. Нетканому полотну или другому волокнистому монолиту может быть предоставлена возможность пропитаться раствором в течение приблизительно от 1 мин или меньше и до 3 час при комнатной температуре или в температурном интервале приблизительно от 15 до 30°C, приблизительно от 17 до 28°C или приблизительно от 20 до 25°C. В некоторых вариантах осуществления нетканое полотно или другой волокнистый монолит, которые должны быть привиты, могут быть погружены в раствор инициатора и замочены в течение всего лишь приблизительно 10 сек или даже меньше. Таким образом, инициатор может быть адсорбирован или абсорбирован волокнами в нетканом материале путем замачивания, капиллярного затекания или погружения, посредством чего прививаемый материал (то есть, нетканую подложку) вводят в контакт с раствором термического инициатора в течение времени от меньше чем 1 сек и до 10 час, приблизительно от 5 сек до 5 час или приблизительно 10 сек до 3 час. Затем нетканое полотно вынимают из раствора и избыточному раствору дают возможность впитаться из полотна, чтобы высушить полотно. Нетканое полотно затем вводят в контакт с раствором, содержащим акрилатный или метакрилатный мономер (например, поли-ГМА), растворенный в подходящем растворителе (например, ДМФА или ДМАА), и раствор/(нетканое полотно) нагревают при повышенной температуре, такой как, по меньшей мере, приблизительно 50°C (например, приблизительно от 50 до 90°C или приблизительно от 60 до 90°C), чтобы инициировать полимеризацию. Реакции полимеризации дают возможность протекать в течение некоторого периода времени, например, приблизительно от 5 мин до 24 час, приблизительно от 15 мин до 12 час или приблизительно от 30 мин до 6 час. В некоторых вариантах осуществления реакции полимеризации дают протекать до тех пор, пока масса сегментов привитого полимера не составит приблизительно от 1 до 50% от массы нетканого полотна (наиболее предпочтительно увеличение массы приблизительно от 15 до 45% или приблизительно от 20 до 30%). После этого нетканое полотно извлекают из раствора мономера, промывают для удаления свободных/непривитых мономера или сегментов полимера, а также от самого раствора, и сушат. Промывка может быть выполнена за счет ультразвуковой обработки.

Полимер, используемый для прививки, может меняться, но, как правило, будет представлять собой акрилатный или метакрилатный полимер. Прививка полимера создает щеткообразные выступающие элементы на волокнах нетканого полотна, которые могут быть функционализированы с целью усиления аффинности для некоторых целевых молекул. Выбор мономера для графт-полимера может меняться и будет зависеть отчасти от желаемых характеристик связывания, требуемых для конечной мембранной структуры. Некоторые мономеры в силу своей природы будут нести функциональные группы, которые могут быть использованы для аффинного или ионообменного связывания, тогда как другие мономеры будут требовать дополнительной функционализации, чтобы присоединить необходимые связующие группы. Типичные мономеры и их возможные области применения включают: глицидил-метакрилат (приемлем для дополнительной функционализации), метакриловую кислоту (слабые катионообменные мембраны), 2-(диэтиламино)этилметакрилат (слабые анионообменные мембраны), [2-(метакрилоилокси)этил]триметиламмонийхлорид (сильные анионообменные мембраны), 2-гидроксиэтилметакрилат (ГЭМА (HEMA), гидрофильные мембраны), 2-акриламидо-2-метилпропан-сульфоновую кислоту (сильные катионообменные мембраны), 2-(диметиламино)этилметакрилат (слабые анионообменные мембраны), бутилметакрилат (мембраны гидрофобного взаимодействия), 3-хлор-2-гидроксипропил-метакрилат (приемлем для дополнительной функционализации), 2-этилгексилметакрилат (мембраны гидрофобного взаимодействия) и их комбинации.

Прививочная полимеризация, описанная выше, может давать нетканое полотно с привитым слоем или сегментами на нем. Привитый сегмент, образованный таким путем, может иметь толщину в интервале приблизительно от 0,05 и вплоть до 100 мкм. В конкретных вариантах осуществления привитый полимер может иметь толщину приблизительно от 0,1 до 10 мкм, приблизительно от 0,1 до 5 мкм или приблизительно от 0,2 до 5 мкм. В некоторых вариантах осуществления привитый слой может быть образован на множестве отдельных волокон, образующих нетканое полотно. В частности, привитый слой может быть образован по существу на всех волокнах. Более конкретно, привитый слой может быть образован на каждом из волокон, составляющих нетканое полотно.

При необходимости полимерные сегменты или щетки могут быть функционализированы так, чтобы каждый сегмент полимера нес функциональную группу, приспособленную для связывания с целевой молекулой. Типичное связывание, которое может иметь место между такими функциональными группами и целевой молекулой, такой как белок, может включать ионные связи, водородные связи и силы Ван-дер-Ваальса. Типичными функциональными группами являются аминогруппы (включая первичные, вторичные, третичные или четвертичные амины), сульфокислотные группы, карбоксильные группы, фосфатные группы и т.п. Реакции дериватизации с целью прикрепления таких функциональных групп, как правило, включают взаимодействие эпокси-группы или другой реакционноспособной группы на полимерной щетке с молекулой, содержащей желаемую функциональную группу.

Как указано ниже, привитые нетканые материалы по изобретению успешно дериватизируют до слабых анионных и сильных катионных обменников для захвата БСА и hIgG, соответственно. Достигнуты равновесные белок-связывающие способности в статических условиях вплоть до 200 мг/г в случае увеличения массы до 24% поли-ГМА. Равновесные связывающие способности ионнообменных термически привитых нетканых материалов по изобретению ниже, чем аналогичных систем, привитых с использованием УФ индуцированной радикальной полимеризации для проведения прививки. УФ-привитые поли-ГМА нетканые материалы, функционализированные как ионообменники, связывают в 5-7 раз больше белка, чем термически привитые поли-ГМА нетканые материалы по изобретению при конкретном увеличении массы. Однако кинетика адсорбции белка указывает на то, что термически привитые нетканые материалы способны достигать равновесного связывания за время где-то около нескольких минут по сравнению с УФ-привитыми неткаными материалами, которым необходимо несколько часов, чтобы достичь равновесного связывания. Аналогичные равновесные связывающие способности могут быть достигнуты среди термически привитых и УФ-привитых вариантов осуществления относительно небольших мишеней с молекулярными массами ниже 1000 г/моль.

Связывающая способность привитого нетканого материала может меняться и может быть настроена, если это желательно, исходя из целевой молекулы, которую связывают и/или конкретного конечного применения материала. В некоторых вариантах осуществления привитая полимером мембрана в соответствии с настоящим описанием может показывать равновесную связывающую способность для целевой молекулы вплоть до 1000 ммоль/г целевой молекулы (с минимальной равновесной связывающей способностью, по меньшей мере, 1 ммоль/г целевой молекулы). Более конкретно, равновесная связывающая способность для целевой молекулы может составлять приблизительно от 1 до 1000 ммоль/г, приблизительно от 5 до 800 ммоль/г или приблизительно от 10 до 600 ммоль/г целевой молекулы. В некоторых вариантах осуществления равновесная связывающая способность может базироваться на молекулярной массе целевой молекулы. Например, равновесная связывающая способность для целевой молекулы, имеющей молекулярную массу приблизительно от 100 до 1000 г/моль, может составлять приблизительно от 50 до 1000 ммоль/г или приблизительно от 100 до 800 ммоль/г целевой молекулы. В качестве дополнительного примера, равновесная связывающая способность для целевой молекулы, имеющей молекулярную массу приблизительно от 2000 до 50000 г/моль, может составлять приблизительно от 10 до 300 ммоль/г или приблизительно от 20 до 200 ммоль/г целевой молекулы. В качестве еще одного примера, равновесная связывающая способность для целевой молекулы, имеющей молекулярную массу приблизительно от 60000 до 500000 г/моль, может составлять приблизительно от 2 до 100 ммоль/г или приблизительно от 5 до 80 ммоль/г целевой молекулы.

В одном или нескольких вариантах осуществления рассматриваемые привитые полимером мембраны могут быть выполнены с возможностью связывания ряда мишеней. Мишени могут быть обозначены в зависимости от наличия заряженных групп, молекулярной массы и/или аффинности к некоторым функциональным группам.

УФ-привитые и термически индуцированные привитые материалы с одинаковым процентным увеличением массы поли-ГМА привитых слоев могут иметь существенно разные структурные свойства. Анализ ионообменного связывания биомолекул и белков с разными молекулярными массами подтверждает структурные различия между двумя методами прививочной полимеризации. В случае обеих методологий прививочной полимеризации увеличение молекулярной массы целевой молекулы приводит к уменьшению числа молекул, связываемых при данной степени покрытия поли-ГМА. Однако это наблюдение является более показательным в термически привитых поли-ГМА нетканых образцах, указывая на то, что полимерная матрица либо имеет меньше доступного объема связывания, более высокую плотность, более жесткую структуру, препятствующую эффективной упаковке диффундирующих белков, либо мелкопористые структуры, которые недоступны более крупным белкам. Такие структурные различия могут быть приписаны повышенной степени разветвления и поперечной сшивке полимера, возникающим в результате метода термической прививочной полимеризации, чего не наблюдается в случае метода УФ-индуцированной прививочной полимеризации. Вне зависимости от предполагаемых структурных различий между двумя методами прививочной полимеризации они показывают аналогичную прочность связывания с расчетными константами диссоциации, которые составляют порядка 10^-6 M, что соответствует связыванию белков на ионообменных полимерных трехмерных структурах.

Как видно на ФИГ. 7, вследствие различия в термической прививочной полимеризации относительно УФ-индуцированной прививочной полимеризации термически привитый слой может совершенно отличаться от слоев УФ-индуцированной прививочной полимеризации. Помимо различий в разветвлении и сшивке рассматриваемые термически привитые слои могут иметь уменьшенную толщину. Если «d» представляет собой толщину волокон в нетканых материалах и «ω» представляет собой массовую долю слоя привитого полимера относительно массы полимерного волокна, толщина привитого слоя δ может быть оценена с использованием уравнения 1.

Уравнение 1.

В этом уравнении ρ₁ и ρ₂ представляют собой плотности полимера волокна и привитого полимера, соответственно.

Уравнение показывает, что, если плотность термически индуцированного привитого слоя больше, чем плотность УФ-привитого полимерного слоя для одного и того же диаметра волокна и одинакового относительного увеличения массы вследствие прививочной полимеризации, то толщина соответствующего слоя δ меньше.

Это согласуется со структурами на ФИГ. 7 и может объяснить наблюдаемое более быстрое достижение равновесного связывания целевых молекул на термически индуцированных привитых нетканых материалах, чем на УФ-привитых нетканых материалах.

В некоторых вариантах осуществления нетканые полотна по изобретению могут быть охарактеризованы как связывающие значительные количества целевой молекулы за короткие периоды контакта, например, как достигающие равновесного связывания приблизительно за 1 час или меньше. Например, в некоторых вариантах осуществления такое время до равновесия может иметь место в случае увеличения массы привитого полимера (например, поли-ГМА) приблизительно 24% или меньше. В других примерах при более низких степенях прививки поли-ГМА, таких как приблизительно между 6 и 15%-ным увеличением массы, равновесное связывание БСА достигается в некоторых вариантах осуществления приблизительно за 10 мин или меньше воздействия белка на анионообменные функционализированные термически привитые нетканые материалы. При высокой степени прививки поли-ГМА, такой как приблизительно увеличение массы 24%, равновесное связывание БСА достигается приблизительно через 1 час или меньше с 60% от равновесной связывающей способности, достигаемыми приблизительно через 5 мин воздействия белка. Предпочтительно в разных вариантах осуществления привитая полимером и функционализированная нетканая мембрана в соответствии с настоящим описанием может быть выполнена с возможностью достижения равновесия связывания для целевой молекулы за время приблизительно 1 час или меньше (то есть, с нижним уровнем, принимаемым равным 1 сек, 2 сек или 5 сек). В других вариантах осуществления время до достижения равновесия связывания для целевой молекулы может составлять приблизительно от 1 сек до 120 мин, приблизительно от 2 сек до 90 мин, приблизительно от 5 сек до 60 мин или приблизительно от 10 сек до 30 мин.

В одном или нескольких вариантах осуществления рассматриваемые нетканые полотна могут быть охарактеризованы в зависимости от сокращенного времени до достижения равновесия связывания мишени. Привитый материал может быть выполнен с возможностью связывания ряда мишеней. В некоторых вариантах осуществления мишенью может быть белок. Время до достижения равновесия связывания может зависеть от степени прививки, которая может быть описана процентным увеличением массы, как определено в данном документе. Например, привитая полимером нетканая подложка в соответствии с настоящим описанием, имеющая увеличение массы вплоть до 5% привитого материала, может показывать время до достижения равновесия связывания мишени приблизительно 20 мин или меньше, приблизительно 10 мин или меньше, или приблизительно 5 мин или меньше (принимая минимальное время равным приблизительно 1 сек, приблизительно 5 сек или приблизительно 15 сек). Более конкретно, время для достижения равновесия связывания мишени при указанных условиях может составлять приблизительно от 5 сек до 20 мин, приблизительно от 10 сек до 10 мин или приблизительно от 15 сек до 8 мин. В других примерах привитая полимером нетканая подложка в соответствии с настоящим описанием, имеющая увеличение массы привитого полимера приблизительно от 6 до 15%, может показывать время для достижения равновесия связывания мишени приблизительно 30 мин или меньше, приблизительно 20 мин или меньше, или приблизительно 10 мин или меньше (принимая минимальное время равным приблизительно 1 сек, приблизительно 5 сек или приблизительно 15 сек). Более конкретно, время для достижения равновесия связывания мишени при указанных условиях может составлять приблизительно от 10 сек до 30 мин, приблизительно от 15 сек до 15 мин или приблизительно от 20 сек до 10 мин. В еще других примерах привитая полимером нетканая подложка в соответствии с настоящим описанием, имеющая увеличение массы привитого полимера приблизительно от 16 до 25%, может показывать время до достижения равновесия целевого связывания приблизительно 120 мин или меньше, приблизительно 90 мин или меньше, или приблизительно 60 мин или меньше (принимая минимальное время равным приблизительно 5 сек, приблизительно 10 сек или приблизительно 15 сек). Более конкретно, время для достижения равновесия целевого связывания при указанных условиях может составлять приблизительно от 15 сек до 120 мин, приблизительно от 30 сек до 60 мин или приблизительно от 45 сек до 45 мин. В конкретных вариантах осуществления время до равновесия связывания мишени, как отмечено выше, может быть оценено при использовании белка в качестве мишени. В частности, время до связывания мишени может быть оценено как время до равновесия связывания БСА или hIgG. В другом варианте осуществления, однако, время до целевого связывания может быть оценено относительно небольших биомолекул. Например, примеры, представленные ниже, иллюстрируют способность связывания АТФ.

В свете вышеизложенного следует заметить, что настоящее изобретение может относиться в некоторых вариантах осуществления к методам разделения, имеющим сокращенное время до достижения равновесия связывания мишени. Метод разделения, например, может включать получение привитой полимером нетканой мембраны, описанной в настоящем документе, и контактирование привитой полимером нетканой мембраны с композицией, включающей мишень для связывания. Привитая полимером нетканая мембрана, описанная в документе, может быть фунционализирована, чтобы связывать любую желаемую мишень и все еще обеспечивать сокращенное время до равновесия в свете специфической природы привитого полимера, которая достигается за счет термического инициирования с использованием термического инициатора, как описано в данном документе.

Экспериментальная часть

Материалы и реагенты

Компания Macopharma (Tourcoing, France) поставляет коммерчески доступные ПБТ нетканые материалы, полученные по технологии «мелтблоун», с базовым весом 52 г/м². Глицидилметакрилат (ГМА) приобретают у компании Pflatz & Bauer (Waterbury, CT). Ингибиторы в ГМА удаляют через набивную колонку удаления ингибитора, чтобы удалить гидрохинон и монометиловый эфир гидрохинона (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Бензофенон (БФ) приобретают у компании Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Бензоилпероксид (70% масс.) (Bz₂O₂), N,N-диметилформамид (ДМФА), гидроксид натрия, 1-бутанол, изопропиловый спирт, трис-основание, соляную кислоту, хлорид натрия и тригидрат ацетата натрия приобретают у компании Fisher Scientific (Fairlawn, NJ). Тетрагидрофуран (ТГФ (THF)), метанол, серную кислоту и уксусную кислоту приобретают у компании BDH (West Chester,PA). Диэтиламин (ДЭА (DEA)) приобретают у компании Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Сульфит натрия приобретают у компании Acros Organics (Fairlawn, NJ). Трубки для твердофазной экстракции приобретают у компании Supelco (Bellefonte, PA). Альбумин из бычьей сыворотки (БСА), лизоцим яичного белка и аденозин-5'-трифосфат (АТФ (ATP)) получают от компании Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Человеческий иммуноглобулин G (hIgG) приобретают у компании Equitek-Bio Inc. (Kerrville, TX).

Индуцированная термически прививочная полимеризация поли-ГМА на ПБТ нетканые материалы

Нетканый ПБТ нарезают на образцы размерами 75×50 мм и взвешивают перед проведением прививочной полимеризации, образцы имеют массу приблизительно 200 мг. Эти образцы погружают в 20 мл раствора термического инициатора, содержащего 75 мМ Bz₂O₂ в ДМФА, при комнатной температуре на 1 час, чтобы дать возможность Bz₂O₂ адсорбироваться на поверхности ПБТ. Насыщенные термическим инициатором образцы извлекают из раствора инициатора и выкладывают поперек полотенца для впитывания избытка раствора инициатора из пор нетканого материала. Затем образцы помещают в 20 мл раствора термической прививочной полимеризации при определенной температуре полимеризации и дают прививаться в течение заданного периода времени. Прививочный раствор состоит из разных концентраций ГМА мономера: 5, 10, 20, 30 и 40% (об./об.) в ДМФА. Температуры полимеризации поддерживают постоянными при 70, 80 или 90°C с использованием бани с горячей водой (Isotemp 115, Fisher Scientific, Fairlawn, NJ). Прививочной полимеризации позволяют протекать повсюду от 30 мин до 6 час. После прививки поли-ГМА образцы помещают в колбу, содержащую 100 мл ТГФ, колбу с THF и образцами обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны (Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) в течение 30 мин для удаления любого непрореагировавшего прививочного раствора или непривитого поли-ГМА, ТГФ заменяют один раз через 15 мин обработки ультразвуком. После промывки ТГФ образцы извлекают из колбы и помещают в колбу, содержащую 100 мл метанола. Колбу, содержащую образцы и метанол, обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны в течение 10 мин для удаления ТГФ из нетканых материалов. После промывки метанолом образцы извлекают из колбы и дают возможность высохнуть на воздухе в течение ночи. Измеряют массу конечных нетканых материалов и степень прививки поли-ГМА определяют с использованием уравнения 2 в значениях %-ного увеличения массы из-за прививочной полимеризации.

Уравнение 2

В приведенном выше уравнении W_i представляет собой массу исходного нетканого материала до прививочной полимеризации и W_f представляет собой массу конечного нетканого материала после прививки поли-ГМА.

Сравнительная УФ-индуцированная прививочная полимеризация поли-ГМА на ПБТ нетканые материалы

ГМА прививочный раствор состоит из 20% об./об. ГМА мономера в 1-бутаноле в качестве растворителя. Фотоинициатор бензофенон (БФ) добавляют к прививочному раствору при соотношении БФ:ГМА 1:20 (моль:моль). Нетканый ПБТ нарезают на образцы размерами 75×50 мм и перед проведением прививочной полимеризации взвешивают; вес равен приблизительно 200 мг. Образцы нетканого ПБТ помещают на боросиликатное предметное стекло с размерами также 75×50 мм, чтобы подготовить для прививочной полимеризации. С использование шприца 1,5-2,0 мл прививочного раствора равномерно распределяют на мембране и второе боросиликатное предметное стекло помещают поверх нетканого материала. УФ лампу (модель EN-180L, Spectronics Corporation, Westbury, NY) используют для индуцирования свободно-радикальной полимеризации поли-ГМА на нетканых материалах. УФ лампа имеет длину волны 395 нм, интенсивность 5 мВт/см², а нетканые образцы помещают на 3 мм от источника излучения. Образцы облучают при различном времени экспозиции для достижения разных степеней прививки поли-ГМА с разным %-ным увеличением массы. После прививки поли-ГМА образцы помещают в колбу, содержащую 100 мл ТГФ, колбу обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны (Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) в течение 30 мин для удаления непрореагировавшего прививочного раствора или непривитого поли-ГМА. После промывки ТГФ образцы извлекают из колбы и помещают в колбу, содержащую 100 мл метанола. Колбу, содержащую образцы и метанол, обрабатывают ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны в течение 10 мин для удаления ТГФ из нетканых материалов. После промывки метанолом образцы извлекают из колбы и дают высохнуть на воздухе в течение ночи. Измеряют конечную массу нетканых материалов и определяют степень прививки поли-ГМА с использованием уравнения 2 в значениях %-ного увеличения массы.

Функционализация привитых поли-ГМА ПБТ нетканых материалов

Привитые поли-ГМА ПБТ нетканые материалы, привитые как с использованием тепла, так и с использованием УФ излучения, функционализируют с целью получения слабых анионообменников путем погружения в 50%-ный (об./об.) водный раствор диэтиламина (ДЭА), чтобы создать в результате третичный амин на поли-ГМА щетках. Образцы привитого ПБТ нетканого материала массой 100 мг (35×50 мм) погружают в 100 мл раствора ДЭА. Реакцию постоянно поддерживают при 30°C с перемешивание при 100 об/мин с использованием инкубационного шейкера (Certomat® RM, B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany), находящегося в инкубационном кожухе (Certomat® HK, B. Braun Biotech International, Melsungen, Germany). После аминирования образцы помещают в колбу, содержащую 100 мл ДИ (DI) воды; колбу помещают в ультразвуковую ванну (Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) на 5 мин, чтобы удалить избыток ДЭА. После обработки ультразвуком промывку ДИ водой заменяют свежей ДИ водой и процесс повторяют до тех пор, пока не будет подтверждено нейтральное значение 7,0 с помощью бумаги для контроля рН; 10 промывок гарантирует, что весь ДЭА удален из нетканого материала. Любые непрореагировавшие эпокси-группы подвергают гидролизу путем погружения образца в 100 мл 100 мМ серной кислоты на ночь. После гидролиза эпокси-групп образцы помещают в колбу, содержащую 100 мл ДИ воды, колбу помещают в ультразвуковую ванну (Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) на 5 мин для удаления избытка серной кислоты. После обработки ультразвуком промывку ДИ водой заменяют на свежую ДИ воду и процесс повторяют до тех пор, пока не будет подтверждено нейтральное значение 7,0 с помощью бумаги для контроля рН; 10 промывок гарантируют, что вся серная кислота удалена из нетканого материала. Образцы затем сушат на воздухе в течение ночи.

Привитые поли-ГМА ПБТ нетканые материалы функционализируют, чтобы создать сильные катионообменники, путем прикрепления сульфокислотных групп к поли-ГМА щеткам. Приблизительно 100 мг (35×50 мм) образцов привитого ПБТ нетканого материала погружают в 20 мл раствора сульфита натрия, содержащего сульфит натрия, изопропиловый спирт (ИПС (IPA)) и воду (Na₂SO₃:ИПС:Вода=10:15:75% масс.). Реакционную смесь выдерживают при 80°C в течение 8 час (Isotemp 115, Fisher Scientific, Fairlawn, NJ). После функционализации образцы помещают в колбу, содержащую 100 мл ДИ воды, колбу помещают в ультразвуковую ванну (Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) на 5 мин для удаления избытка раствора сульфита натрия. После обработки ультразвуком промывку ДИ водой заменяют свежей ДИ водой и процесс повторяют до тех пор, пока не будет подтверждено нейтральное значение 7,0 с помощью бумаги для контроля рН; 5 промывок гарантирует, что весь раствор сульфита натрия удален из нетканого материала. Любые непрореагировавшие эпокси-группы подвергают гидролизу путем погружения образца в 10 мл 100 мМ серной кислоты на ночь. После гидролиза эпокси-групп образцы помещают в колбу, содержащую 100 мл ДИ воды, колбу помещают в ультразвуковую ванну (Bransonic 3510R-MT, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) на 5 мин для удаления избытка серной кислоты. После обработки ультразвуком промывку ДИ водой заменяют свежей ДИ водой и процесс повторяют до тех пор, пока не будет подтверждено нейтральное значение 7,0 с помощью бумаги для контроля рН; 10 промывок гарантирует, что вся серная кислота удалена из нетканого материала. Образцы затем сушат на воздухе в течение ночи.

Описание материала

Для оценки эффективности, конформности и однотипности методов термической прививочной полимеризации и сравнительной УФ прививочной полимеризации получены изображения в сканирующем электронном микроскопе с использованием сканирующего электронного микроскопа переменного давления (VPSEM) Hitachi S-3200N (Hitachi High Technologies America, Inc., Schaumberg, IL). Образцы привитого нетканого материала покрывают методом напыления Pd/Au в аргоне. Изображения захватывают с использованием микроскопа с помощью ускоряющего напряжения 5 кВ при рабочем расстоянии 33 мм. Микрофотографии в СЭМ записывают с использованием программного обеспечения Revolution от компании 4pi Analysis, Inc. (Hillsborough, NC).

Химический состав поверхности ПБТ нетканых мембран после прививки поли-ГМА описывают с помощью спектроскопии ATR-FTIR с использованием спектрометра Nicolet™ iS™10 FT-IR с алмазным HATR кристаллом (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Каждый спектр собирают с помощью 64 сканов при разрешении 4 см^-1. Радиус пучка равен 5 мм с интервалом обратных длин волн 4000-675 см^-1, и глубина проникновения анализа равна ~0,67 мкм при 2000 см^-1.

Содержание азота в образцах до и после модификации ДЭА анализируют с помощью анализатора элементного состава PE 2400 CHN (PerkinElmer Inc., Waltham, MA) за счет полного сжигания образцов до элементарных газов CO₂, H₂O и N₂ и их обнаружения. Определение суммарного содержания азота дает прямое измерение плотности ДЭА лиганда.

Модель связывания белка с термически привитыми поли-ГМА неткаными материалами

Представляется интересным исследовать равновесные белок-связывающие способности ПБТ нетканых материалов, привитых с использованием различных условий термически индуцированной прививочной полимеризации, чтобы определить, демонстрирует ли полученный привитой слой расхождение для связывания белка. Термически привитые поли-ГМА ПБТ нетканые материалы, которые привиты с помощью разных концентраций мономера и разных температур полимеризации при меняющихся степенях покрытия поли-ГМА, испытывают по их равновесным белок-связывающим способностям в статических условиях, когда они функционализированы в качестве слабых анионообменных мембран. ПБТ нетканые материалы прививают с помощью концентраций ГМА мономера 10, 20 и 30% ГМА (об./об.) и при температурах полимеризации 70, 80, 90°C, при конкретном времени полимеризации до достижения степеней покрытия поли-ГМА с увеличением массы 5, 10, 15 и 20%. Такие мембраны функционализируют с помощью ДЭА, чтобы превратить их в слабые анионообменники, и проверяют с помощью чистого БСА в качестве модельного белка, чтобы оценить статическую равновесную связывающую способность. БСА имеет молекулярную массу 66,5 кДа и изоэлектрическую точку 4,7 [Sigma Aldrich, St. Louis MO]. Приблизительно 20 мг (25×15 мм) образца нетканого материала помещают в 3 мл трубку твердофазной экстракции (ТФЭ (SPE)) и промывают 5 раз 3 мл связующего буфера с низкой ионной силой, 20 мМ Tris HCl с pH 7,0. Образцы перед связыванием БСА уравновешивают в течение, по меньшей мере, 30 мин в связующем буфере на ротаторе (ротатор тканевой культуры, Glas-col, Terre Haute, IN). После уравновешивания к каждому образцу добавляют 3 мл 10 мг/мл БСА в 20 мМ Tris HCl с pH 7,0 и дают возможность связываться всю ночь в течение 15 час. Буфер с низкой ионной силой при pH 7,0 гарантирует, что ДЭА-функционализированный привитый ПБТ заряжен положительно и что БСА заряжен отрицательно, чтобы помогать связыванию с незначительным количеством ионов, которые могли бы нарушить связывание белка. После связывания образцы промывают с помощью 3 мл 20 мМ Tris HCl с pH 7,0. Пять промывок с помощью 20 мМ Tris HCl с pH 7,0 необходимо, чтобы удалить весь несвязанный белок, что подтверждается пренебрежимо малым количеством белка в пятой и последней промывке с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм. Связанный БСА элюируют с использованием элюирующего буфера с высокой ионной силой, 3 мл 20 мМ Tris HCl с pH 7,0+1 M NaCl в качестве элюирующего буфера. Высокая концентрация ионов в элюирующем буфере эффективно нарушает ионное взаимодействие, извлекая белок из нетканого материала. Фракции элюирования собирают и концентрации белка определяют с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм. Значения статической равновесной связывающей способности («q», в значениях массы белка на массу мембраны) определяют с использованием уравнения 3.

Уравнение 3

Модель связывания белка, сравнивающая термически привитые и сравнительные УФ-привитые ПБТ нетканые материалы, функционализированные в виде анионных и катионных обменников

ПБТ нетканые материалы, привитые поли-ГМА с использование тепла и УФ излучения, функционализируют в виде слабых анионных и в виде сильных катионных обменников для захвата модельных белков, чтобы сравнить их различия в равновесной связывающей способности в случае двух методов прививочной полимеризации. Термически привитые ПБТ нетканые материалы прививают с использованием концентрации мономера 30% (об./об.) при температуре полимеризации 80°C для такого исследования связывания и для всех последующих попыток связывания белка и биомолекулы. Термически привитые и УФ-привитые поли-ГМА ПБТ нетканые материалы, привитые с увеличением массы между 3 и 26%, функционализируют с помощью ДЭА, создавая слабые анионообменники для захвата модельного белка БСА. Приблизительно 20 мг (25×15 мм) нетканого образца помещают в 3 мл трубку твердофазной экстракции (ТФЭ) и промывают 5 раз 3 мл связующего буфера с низкой ионной силой, 20 мМ Tris HCl с pH 7,0. Образцы перед связыванием БСА уравновешивают в течение, по меньшей мере, 30 мин в связующем буфере на ротаторе (Ротатор тканевых культур, Glas-col, Terre Haute, IN). После уравновешивания к каждому образцу добавляют 3 мл 10 мг/мл БСА в 20 мМ Tris HCl с pH 7,0 и дают возможность связываться ночь в течение 15 час. После связывания образцы промывают 3 мл 20 мМ Tris HCl с pH 7,0. Пять промывок 20 мМ Tris HCl с pH 7,0 необходимо, чтобы удалить весь несвязанный белок, что подтверждается пренебрежимо малым количеством белка в пятой и конечной промывке с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм. Связанный БСА элюируют с помощью элюирующего буфера с высокой ионной силой, 3 мл 20 мМ Tris HCl с pH 7,0+1 M NaCl в качестве элюирующего буфера. Фракции элюирования собирают и концентрации белка определяют с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм, равновесные связывающие способности рассчитывают с использованием уравнения 3.

Аналогичным образом термически привитые и УФ-привитые поли-ГМА ПБТ нетканые материалы, привитые с увеличением массы между 5 и 25%, функционализируют с помощью сульфоновой кислоты, создавая сильные катионообменники для захвата модельного белка hIgG. Эти мембраны проверяют с помощью чистого поликлонального hIgG в качестве модельного белка, чтобы оценить равновесную связывающую способность таких катионообменных мембран. Поликлональный hIgG имеет молекулярную массу 150 кДа и изоэлектрическую точку 7-9 [Equitek-Bio, Kerrville TX]. Приблизительно 20 мг (25×15 мм) нетканого образца помещают в 3 мл трубку ТФЭ и промывают 5 раз 3 мл связующего буфера с низкой ионной силой, 20 мМ ацетат с pH 5,5. Образцы перед связыванием hIgG уравновешивают в течение, по меньшей мере, 30 мин в связующем буфере на ротаторе (Ротатор тканевых культур, Glas-col, Terre Haute, IN). После уравновешивания к каждому образцу добавляют 3 мл 10 мг/мл hIgG в 20 мМ ацетате с pH 5,5 и дают возможность связываться ночь в течение 15 час. Буфер с низкой ионной силы при pH 5,5 гарантирует, что функционализированный серной кислотой, привитый ПБТ заряжен отрицательно и что hIgG заряжен положительно для облегчения связывания с минимальным количеством ионов, которые могли бы нарушить связывание белка. После связывания образцы промывают 3 мл 20 мМ ацетата с pH 5,5. Пять промывок 20 мМ ацетатом с pH 5,5 необходимо, чтобы удалить весь несвязанный белок, что подтверждается пренебрежимо малым количеством белка в пятой и конечной промывке с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм. Связанный hIgG элюируют с использованием 3 мл элюирующего буфера с высокой ионной силой, 20 мМ ацетат с pH 5,5+1 M NaCl. Высокая концентрация ионов в элюирующем буфере эффективно препятствует ионному взаимодействию, удаляя белок из нетканого материала. Фракции элюирования собирают и концентрацию белка определяют с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм. Уравнение 3 используют для расчета статической равновесной связывающей способности.

Связывание различных мишеней с термически привитыми и сравнительными УФ-привитыми ПБТ неткаными материалами, функционализированными в качестве ионообменников

Чтобы изучить влияние размера молекулы на связывание, УФ- и термически привитые ПБТ нетканые материалы проверяют с различными целевыми белками и биомолекулами с разными молекулярными массами. Термически привитые и УФ-привитые нетканые материалы, привитые с увеличением массы между 6 и 26%, функционализированные в качестве анионообменников с помощью ДЭА, проверяют на небольшой биомолекуле АТФ. АТФ имеет молекулярную массу 507 Да и pK_a 6,5 [Sigma Aldrich, St. Louis MO], которая, как известно, может быть легко захвачена анионообменной хроматографической средой. Приблизительно 20 мг (25×15 мм) нетканого образца помещают в 3 мл трубку твердофазной экстракции (ТФЭ) и промывают 5 раз 3 мл связующего буфера с низкой ионной силой, 20 мМ Tris HCl с pH 7,0. Образцы перед связыванием АТФ уравновешивают в течение, по меньшей мере, 30 мин в связующем буфере на ротаторе (Ротатор тканевых культур, Glas-col, Terre Haute, IN). После уравновешивания к каждому образцу добавляют 3 мл 10 мг/мл АТФ в 20 мМ Tris HCl с pH 7,0 и дают связываться ночь в течение 15 час. После связывания образцы промывают 3 мл 20 мМ Tris HCl с pH 7,0. Пять промывок с помощью 20 мМ Tris HCl с pH 7,0 необходимо, чтобы удалить весь несвязанный АТФ, что подтверждается пренебрежимо малым количеством АТФ в пятой и конечной промывке с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 256 нм. Связанный АТФ элюируют с использованием элюирующего буфера с высокой ионной силой, 3 мл 20 мМ Tris HCl с pH 7,0+1 M NaCl, в качестве элюирующего буфера. Фракции элюирования собирают и концентрации АТФ определяют с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 256 нм, а равновесные связывающие способности рассчитывают с использованием уравнения 3.

Аналогичным образом термически привитые и УФ-привитые поли-ГМА ПБТ нетканые материалы, привитые с увеличением массы между 6 и 26%, функционализируют серной кислотой и проверяют с использованием лизоцима белка, белок среднего размера по сравнению с другими исследованными биомолекулами. Лизоцим имеет молекулярную массу 14,3 кДа и изоэлектрическую точку 11,35 [Sigma Aldrich, St. Louis MO]. Приблизительно 20 мг (25×15 мм) нетканого образца помещают в 3 мл трубку ТФЭ и промывают 5 раз 3 мл связующего буфера с низкой ионной силой, 20 мМ ацетат с pH 5,5. Образцы перед связыванием лизоцима уравновешивают в течение, по меньшей мере, 30 мин в связующем буфере на ротаторе (Ротатор тканевых культур, Glas-col, Terre Haute, IN). После уравновешивания к каждому образцу добавляют 3 мл 10 мг/мл лизоцима в 20 мМ ацетате с pH 5,5 и дают связываться ночь в течение 15 час. После связывания образцы промывают 3 мл 20 мМ ацетата с pH 5,5. Пять промывок 20 мМ ацетатом с pH 5,5 необходимо для удаления всего несвязанного белка, что подтверждается пренебрежимо малым количеством белка в пятой и конечной промывке при использовании спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм. Связанный лизоцим элюируют с использованием 3 мл элюирующего буфера с высокой ионной силой, 20 мМ ацетат с pH 5,5+1 M NaCl. Фракции элюирования собирают и концентрацию белка определяют с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм. Уравнение 3 используют для расчета статической равновесной связывающей способности.

Кинетика адсорбции белка

Такие эксперименты ставят своей задачей определение скорости адсорбции белка на термически привитые поли-ГМА ПБТ нетканые материалы, функционализированные в качестве ионообменников. Термически привитый поли-ГМА нетканый ПБТ, привитый до увеличения массы 6, 15 и 24%, функционализируют ДЭА для захвата БСА или серной кислотой для захвата hIgG. Приблизительно 20 мг (25×15 мм) нетканого образца помещают в 3 мл трубку ТФЭ и тщательно промывают связующим буфером, 20 мМ Tris HCl с pH 7,0, в случае опытов по анионному обмену с БСА или 20 мМ ацетатом с pH 5,5 в случае опытов по катионному обмену с hIgG. Образцы перед связыванием белка уравновешивают в течение, по меньшей мере, 30 мин в связующем буфере на ротаторе (Ротатор тканевых культур, Glas-col, Terre Haute, IN). После уравновешивания образцов их тестируют или с 3 мл 10 мг/мл БСА или с 3 мл 10 мг/мл hIgG для анионообменных или катионообменных нетканых материалов, соответственно. Белку дают возможность связываться в течение разных периодов времени экспонирования между 5 мин и 24 час. После связывания анионообменные образцы, которые были связаны с БСА, промывают пять раз 3 мл 20 мМ Tris HCl с pH 7,0, а катионообменные образцы, которые были связаны с hIgG, промывают пять раз 3 мл 20 мМ ацетата с pH 5,5, чтобы удалить любой несвязанный белок. БСА элюируют с использованием 3 мл элюирующего буфера с высокой ионной силой, 20 мМ Tris HCl с pH 7,0+1 M NaCl. hIgG элюируют с использованием 3 мл элюирующего буфера с высокой ионной силой, 20 мМ ацетат с pH 5,5+1 M NaCl. Фракции элюирования анализируют с использованием спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм, а количество белка, связанного с каждым материалом, рассчитывают по уравнению 3.

Изотерма адсорбции белка

Изотермы адсорбции в случае связывания БСА и hIgG на анионообменных и катионообменных ПБТ нетканых материалах, соответственно, исследованы для нетканых материалов, привитых с использованием способа термической прививочной полимеризации и сравнительного способа УФ-прививочной полимеризации. Приблизительно 20 мг (25×15 мм) нетканого образца помещают в 3 мл трубку ТФЭ и тщательно промывают связующим буфером, 20 мМ Tris HCl с pH 7,0, в случае анионообменных опытов по связыванию БСА или 20 мМ ацетатом с pH 5,5 в случае катионообменных опытов по связыванию hIgG. Образцы перед связыванием белка уравновешивают в течение, по меньшей мере, 30 мин в связующем буфере на ротаторе (Ротатор тканевых культур, Glas-col, Terre Haute, IN). После уравновешивания образцов их проверяют с помощью 3 мл белка, имеющего концентрации в интервале от 0,03 до 10 мг/мл или БСА для связывания с анионообменными мембранами или hIgG для связывания с катионообменными мембранами. Белкам дают связываться ночь в течение 15 час при комнатной температуре (23°C). После связывания собирают 3 мл несвязанного белка, чтобы количественно определить концентрацию несвязанного белка. Образцы связанного с белком анионообменного нетканого материала затем промывают пять раз 3 мл 20 мМ Tris HCl с pH 7,0, а образцы катионообменного материала, которые связаны hIgG, промывают пять раз 3 мл 20 мМ ацетата с pH 5,5, чтобы удалить любой несвязанный белок. БСА элюируют с использованием 3 мл элюирующего буфера с высокой ионной силой, 20 мМ Tris HCl с pH 7,0+1 M NaCl. hIgG элюируют с использованием 3 мл элюирующего буфера с высокой ионной силой, 20 мМ ацетата с pH 5,5+1 M NaCl. Концентрации несвязанных и элюированных фракций анализируют с использованием метода бицинхониновой кислоты (набор для анализа белка БСА, Pierce, Rockford, IL) или спектроскопии в УФ и видимой области при 280 нм. Уравнение 3 используют для определения количества белка, связанного с нетканым материалом. Данные для количества белка, связанного при определенной концентрации свободного белка, согласовывают с адсорбционной моделью Ленгмюра, используя пакет программного обеспечения Origin 9 от компании OriginLab (Northampton, MA).

Уравнение 4

В уравнении 4 «q» представляет собой количество белка, связанного с нетканым образцом (мг/г), «q_m» представляет собой максимальную связывающую способность (мг/г), «C» представляет собой концентрацию свободного белка (мг/мл) и «K_d» представляет собой константу диссоциации (мг/мл).

Термически индуцированная прививочная полимеризация поли-ГМА на ПБТ

С целью оптимизации индуцированной термически прививочной полимеризации поли-ГМА на промышленном ПБТ с использованием термического инициатора Bz₂O₂ изучены концентрации мономера, находящиеся в интервале от 5 до 40% (об./об. ГМА в ДМФА) с температурами полимеризации между 70 и 90°C. Результаты по степени прививки за различные периоды времени полимеризации для испытанных условий представлены на ФИГ. 1.

Из ФИГ. 1 очевидно, что повышение концентрации мономера приводит к увеличению скорости прививочной полимеризации и общей степени прививки при данном времени полимеризации. Установлено, что существует предпочтительный интервал концентрации мономера для достижения эффективной прививки. При концентрации ГМА мономера 5% (об./об.) фактически не наблюдают прививочной полимеризации. При концентрации ГМА мономера 10% (об./об.) прививочную полимеризацию поли-ГМА наблюдают, однако общая степень прививки даже после 6 час полимеризации является очень низкой, достигающей 5%-ного увеличения массы поли-ГМА. Увеличение концентрации мономера до 20% (об./об.) или 30% (об./об.) приводит к прививке вплоть до 20%-ного увеличения массы только через 2 час. При концентрации ГМА мономера 40% (об./об.) происходит быстрая неконтролируемая объемная полимеризация, приводящая к полному затвердеванию прививочного раствора, чего на наблюдается в случае концентраций мономера при 30% (об./об.) или ниже. Как наблюдалось в других исследованиях прививочной полимеризации винилового полимера на полимерные подложки при использовании термически индуцированной полимеризации, после пороговой концентрации полимеризация в растворе конкурирует с полимеризацией на полимерной поверхности. По этим причинам для такого режима полимеризации рекомендуют поддерживать концентрации ГМА мономера между 20 и 30% (об./об.). При данной температуре концентрация 30% (об./об.) ГМА мономера демонстрирует более высокую скорость полимеризации по сравнению с концентрацией мономера 20% для времени полимеризации меньше чем 2 час, как это можно увидеть на ФИГ. 1. Степень прививки со временем для полимеризации с 20 и 30% ГМА (об./об.) при времени полимеризации меньше чем 2 час показывает линейную зависимость, наблюдаемую на ФИГ. 1, указывая на скорость первого порядка прививочной полимеризации относительно концентрации мономера. Таким образом, естественно, что повышение концентрации мономера могло бы привести к увеличению скорости прививочной полимеризации. Для времени полимеризации больше чем 2 час наблюдают плато в степени прививки для 20 и 30% (об./об.) ГМА при температурах полимеризации около или выше 80°C, как можно увидеть на ФИГ. 1. Это является общим явлением, наблюдаемым в случае прививочной полимеризации виниловых полимеров на полиэфирные подложки с использованием термического инициатора Bz₂O₂. Для этого существует ряд возможных причин: истощение доступного инициатора, сокращение доступных активных сайтов на ПБТ волокне, развитие диффузионного барьера вследствие повышенной вязкости поли-ГМА в растворе или повышенная скорость обрыва цепи поли-ГМА прививки по сравнению с инициированием.

Из ФИГ. 1 очевидно, что температура оказывает существенное влияние на скорость полимеризации, причем более высокие скорости приводят к более высоким наблюдаемым увеличениям массы при более коротком времени полимеризации. Температура полимеризации влияет на скорость разложения Bz₂O₂ на его радиальную форму, которая способна инициировать полимеризацию около поверхности ПБТ. Повышение температуры приводит к разложению Bz₂O₂, причем скорости разложения Bz₂O₂ в бензоле при 60, 78 и 100°C составляют 2×10^-6, 2,3×10^-5 и 5×10^-4 сек^-1, соответственно. Таким образом, каждые 20°C повышения температуры полимеризации приводят к увеличению на порядок скорости образования радикалов и, следовательно, наблюдается более быстрое инициирование. На ФИГ. 1 видно, что при 70°C прививочная полимеризация протекает очень медленно с 8%-ным увеличением массы, причем самое высокое увеличение достигается через 4 час полимеризации для концентрации 30% (об./об.) ГМА. С другой стороны, при 80 и 90°C полимеризация протекает существенно быстрее и способна достигать 20%-ного увеличения массы покрытия поли-ГМА приблизительно за 3 час при 80°C и 2 час при 90°C. Следует отметить, что температура 80°C представляет собой рекомендуемую температуру полимеризации для термического инициирования с использованием Bz₂O₂. Условия термической прививочной полимеризации 30% (об./об.) ГМА при 80°C дают наиболее согласованную и воспроизводимую прививку поли-ГМА на ПБТ нетканых материалах.

Индуцированная термически прививочная полимеризации поли-ГМА на нетканый ПБТ приводит к полному, конформному, высокооднородному поли-ГМА покрытию вокруг наружной поверхности ПБТ волокон. Это можно увидеть на СЭМ-изображениях, представленных на ФИГ. 2A-2F.

ФИГ. 2B-2F отображают видимую шероховатость поверхности, которую приписывают поли-ГМА привитому слою, который отсутствует на естественном ПБТ нетканом материале, показанном на ФИГ. 2A. Повышенное покрытие поли-ГМА привитыми элементами приводит к увеличению шероховатости поверхности волокна, как можно увидеть сравнивая ПБТ нетканые материалы, привитые при низких увеличениях массы (1,5%-ное увеличение массы, ФИГ. 2B), с ПБТ неткаными материалами, привитыми при высоких увеличениях массы (увеличение массы 19%, ФИГ. 2F). Также важно отметить, что такой метод термической прививочной полимеризации способен обеспечивать прививку ко всей поверхности ПБТ без какой-либо закупорки пор, давая высокооднородные, конформные, разумно привитые волокна.

После прививочной полимеризации поли-ГМА используют спектроскопию ATR-FTIR для анализа химии поверхности привитых ПБТ нетканых материалов, чтобы удостовериться, что метод термической прививочной полимеризации сохраняет целостность пендантных эпокси-групп, изначально находящихся в поли-ГМА. При сравнении спектра чистого ПБТ со спектром ПБТ, термически привитого поли-ГМА, наблюдают, что характеристический сложноэфирный пик (при 1150 см^-1) и эпоксидные пики (при 847 см^-1 и 907 см^-1) присутствуют на привитом ПБТ, но не присутствуют на естественном ПБТ. Кроме того, интенсивность таких пиков растет соответственно количеству поли-ГМА в значениях %-ного увеличения массы. Эти результаты указывают на то, что термическая прививочная полимеризация успешно обеспечивает прививку поли-ГМА с устойчивыми эпоксидными пендантными группами, которые могут быть дополнительно функционализированы.

Сравнение плотности лигандов после функционализации для ПБТ нетканых материалов, привитых при разных концентрациях мономера и разных температурах полимеризации

Проводят элементный анализ на термически привитых ПБТ нетканых материалах, функционализированных с помощью ДЭА в качестве слабых анионообменников, чтобы определить плотность лигандов для мембран, привитых при разных условиях. Результаты по плотности лигандов в виде функции %-ного увеличения массы для ПБТ нетканых материалов, привитых при концентрациях мономера 20 и 30% (об./об.) ГМА и при температурах полимеризации между 70 и 90°C, представлены на ФИГ. 3.

Также на ФИГ. 3 представлена плотность ДЭА лигандов для ПБТ нетканых материалов, привитых с помощью UV излучения для разного %-ного увеличения массы. УФ прививочная полимеризация представляет собой основную методологию в случае прививочной винильной полимеризации сложноэфирных и полиолефиновых мембран и исследована широко на примере прививочной полимеризации поли-ГМА на ПБТ нетканые материалы. В силу описанных выше причин в данном исследовании это является отправной точкой для сравнения термически привитых ПБТ нетканых материалов. Из ФИГ. 3 очевидно, что плотность лигандов растет со степенью прививки поли-ГМА для всех привитых мембран. Линейный характер данных на ФИГ. 3 указывает на то, что плотность лигандов прямо пропорциональна количеству поли-ГМА покрытия. Сравнение плотности лигандов для нетканых материалов, привитых при концентрациях мономеров 20 и 30% (об./об.) ГМА в случае температур полимеризации между 70 и 90°C, показывает, что нет наблюдаемой разницы в плотности ДЭА лигандов для любых из таких условий в пределах всего интервала поли-ГМА привитого покрытия. Кроме того, нет разницы в плотности лигандов между термически привитыми неткаными материалами и УФ-привитыми неткаными материалами по всему интервалу поли-ГМА привитого покрытия. Это является явным признаком того, что при всех условиях, оцененных в случае термически привитых поли-ГМА нетканых материалов и УФ-привитых нетканых материалов, существует одинаковое количество доступных эпокси-групп, которые могут быть легко функционализированы с образованием слабых анионообменных сайтов связывания.

Равновесная белок-связывающая ионообменная способность дериватизированных ПБТ нетканых материалов

БСА выбирают в качестве модельного белка для оценки, как различные условия термически индуцированной прививочной полимеризации влияют на общую равновесную связывающую способность, когда такие материалы функционализируют в качестве ионообменников. ФИГ. 4A и 4B отображают равновесные БСА-связывающие способности для ПБТ, термически привитого при разных концентрациях мономера и разных температурах полимеризации, соответственно, с определенными степенями поли-ГМА покрытия, когда они функционализированы в качестве анионообменников.

Данные на ФИГ. 4A и 4B указывают на то, что равновесная белок-связывающая способность растет с начальной концентрацией мономера в прививочном растворе и падает с ростом температуры прививочной полимеризации. Это является показателем того, что среда для связывания белка меняется в зависимости от условий прививочной полимеризации, даже если может быть достигнуто одинаковое %-ное увеличение массы. ФИГ. 3 демонстрирует, что плотность ДЭА лигандов почти исключительно зависит от степени прививки поли-ГМА, а не от условий прививочной полимеризации; это относится и к УФ-индуцированной прививочной полимеризации. Такой результат отличается как от ФИГ. 4A, так и 4B, которые демонстрируют сильную зависимость равновесного связывания белка от конкретных условий термической прививочной полимеризации. Таким образом, вероятно, что структура поли-ГМА и, следовательно, доступность сайтов связывания белка сильно зависит от условий прививочной полимеризации. Также очевидно из обеих ФИГ. 4A и 4B, что общая равновесная связывающая способность растет со степенью поли-ГМА прививки (% увеличения массы). Это наблюдение согласуется с предыдущими исследованиями, в которых определено, что равновесное связывание белка на ионообменных, функционализированных, привитых поли-ГМА ПБТ нетканых материалах, привитых с использованием УФ излучения, зависит от степени прививки.

Интересно сравнить равновесные белок-связывающие способности для ионообменных функционализированных ПБТ нетканых материалов, привитых с использованием методики термически индуцированной прививочной полимеризации и методики УФ-индуцированной прививочной полимеризации. На ФИГ. 5 показано сравнение равновесного связывания белка УФ- и термически привитыми ПБТ неткаными материалами, функционализированными в качестве как анионообменных, так и катионообменных мембран, для захвата БСА и hIgG, соответственно. Термически привитые мембраны, привитые при концентрации мономера 30% (об./об.) ГМА при температуре 80°C, достигают наиболее высокой общей белок-связывающей способности в соответствии с ФИГ. 4 и их используют в первую очередь во всех последующих исследованиях, если не указано иное.

ФИГ. 5 показывает насколько равновесная связывающая способность прямо пропорциональна степени прививки в случае как УФ-привитых ПТБ нетканых материалов, так и термически привитых ПБТ нетканых материалов. Однако наблюдаемые равновесные белок-связывающие способности в среднем в 4,8 и 6,7 раз выше для УФ-привитых ПТБ нетканых материалов, функционализированных в качестве анионных и катионных ионообменников, соответственно, по сравнению с их термически привитыми аналогами. ФИГ. 3 показывает, что как термически привитые нетканые материалы, так и УФ-привитые нетканые материалы имеют очень похожие плотности лигандов, когда они функционализированы как анионообменники. Однако равновесные связывающие способности, представленные на ФИГ. 5, в несколько раз выше для УФ-привитых нетканых материалов. Это наблюдение дополнительно подкрепляет тот факт, что структура поли-ГМА привитых компонентов зависит от условий и методологии прививочной полимеризации. Из ФИГ. 5 очевидно, что УФ-прививочная полимеризация создает поли-ГМА структуры, которые могут способствовать большему связыванию белка, чем поли-ГМА структура, полученная с использованием методики термически индуцированной прививочной полимеризации. Визуальное сравнение поперечных сечений ПБТ волокна, привитого с помощью УФ излучения и привитого термически, представлено на ФИГ. 6A и 6B, соответственно.

На ФИГ. 6A имеется визуальное различие между поли-ГМА привитым слоем и ПБТ волокном для УФ-привитого нетканого материала. Это отличие отсутствует на ФИГ. 6B в случае термически привитого ПБТ нетканого материала. Не исключено, что плотность термически привитого поли-ГМА слоя близка к плотности ПБТ и поэтому не может быть различима при использовании СЭМ микроскопии.

Прививочная полимеризация винила на полимерные носители путем облучения на основе свободно-радикальной полимеризации, как известно, создает щетки винилового полимера, которые прикреплены к полимерной поверхности. Такие полимерные щетки, как правило, представляют собой щупальца по своей природе, которые являются высоко линейными и гибкими. Это приводит к 3-мерной связующей среде, где белок может быть эффективно упакован по всему объему привитого слоя благодаря возможности перегруппировки полимерных щеток. Прививка винила за счет индуцированной термически свободно-радикальной полимеризации, с другой стороны, гораздо менее контролируема. Термические полимеризации проводят к более высоким скоростям передачи цепи по сравнению с полимеризацией с помощью УФ излучения. Высокие скорости переноса цепи приводят к высоко разветвленным полимерным цепочкам, а также к сильно сшитым полимерным сетчатым структурам, что в обоих случаях может оказывать значительное влияние на привитый поли-ГМА слой. Визуальное схематичное отображение предполагаемых различий в структурах поли-ГМА матрицы, которые получают в результате индуцированной УФ излучением прививочной полимеризации и термически индуцированной полимеризации, представлено на ФИГ. 7.

Это явление может ограничивать привитые слои в их способности связывать белок двумя путями: во-первых, привитый поли-ГМА слой с более высокой наблюдаемой плотностью будет иметь меньший объем для приема белков при конкретном %-ном увеличении массы, и, во-вторых, сильно сшитая полимерная сетка будет по существу более жесткой по природе, приводя к проблеме диффузии белка в глубину привитого слоя вследствие исключения по размеру и неспособности привитого полимера к перегруппировке, чтобы принимать больше белка. Скорости передачи цепи являются функциями температуры, и, вероятно, поэтому имеет место наблюдаемое уменьшение связывания белка в случае повышения температур полимеризации, как показано на ФИГ. 4B. Поли-ГМА привитые элементы, синтезированные при 90°C, с большей вероятностью являются сильно разветвленными и поперечно сшитыми, чем поли-ГМА привитые элементы, синтезированные при 70°C.

Равновесное связывание различных мишеней

Целевые молекулы с меняющимися молекулярными массами связывают с термически привитыми и сравнительными УФ-привитыми ионообменными неткаными материалами, чтобы изучить и сравнить связывающую среду двух методов прививочной полимеризации. АТФ, имеющий самую низкую молекулярную массу 0,5 кДа, связывают с анинонообменными функционализированными неткаными материалами, лизоцим, имеющий вторую наиболее низкую молекулярную массу 14,3 кДа, связывают с катионообменными функционализированными неткаными материалами, БСА, имеющий вторую самую высокую молекулярную массу 66,5 кДа, связывают с анионообменными функционализированными неткаными материалами и hIgG, имеющий самую высокую молекулярную массу 150 кДа, связывают с катионообменными функционализированными неткаными материалами. Данные по равновесному связыванию (мг/г) таких молекул для разных степеней прививки поли-ГМА представлены на ФИГ. 8A и 8B для термически привитых ПБТ нетканых материалов и УФ-привитых ПБТ нетканых материалов, соответственно.

Из ФИГ. 8A очевидно, что термически привитые нетканые материалы способны связывать БСА и лизоцим с одинаковыми равновесными способностями (100-120 мг/г при увеличении массы 25%) в значениях связанной массы. Термически привитые нетканые материалы связывают hIgG и АТФ с одинаковыми способностями, причем обе молекулы связываются значительно в больше степени, чем БСА и лизоцим. Это интересно, учитывая, что АТФ на три порядка меньше, чем hIgG, но связывается почти в таком же количестве по массе. БСА и лизоцим имеют молекулярные массы в промежутке между АТФ и hIgG, но связываются в существенно меньшем количестве по массе. ФИГ. 8B, с другой стороны, показывает сильную зависимость от молекулярной массы мишеней и количество, связанное из расчета на массу. Для УФ-привитых нетканых материалов увеличение молекулярной массы приводит к увеличению связывающей способности в расчете на массу, как показывает ФИГ. 8B.

Чтобы определить, ограничена ли равновесная связывающая способность привитых поли-ГМА нетканых материалов эксклюзией по размерам и доступным для связывания объемом поли-ГМА слоя, или ограничена числом сайтов связывания, связывающие способности с ФИГ. 8 представлены на ФИГ. 9 в расчете на мольное количество.

Из-за порядка величины различий в молекулярной массе мишеней мольные связывающие способности представлены на ФИГ. 9 на логарифмической шкале. На ФИГ. 9 УФ-привитые нетканые ионообменники показывают сильную зависимость от размера мишени и количества связанных молей. Представляющий собой самую большую мишень hIgG связывается в количестве между 5 и 7 ммоль/г, БСА, вторая самая большая мишень, связывается в количестве между 9 и 17 ммоль/г, лизоцим, вторая самая маленькая мишень, связывается в количестве между 30 и 60 ммоль/г, и АТФ, самая маленькая мишень, связывается в количестве между 170 и 600 ммоль/г. Термически привитые нетканые материалы демонстрируют аналогичную тенденцию, которая представлена на ФИГ. 10, причем исключение составляют две самые большие из испытанных мишеней, которые связываются почти при одинаковом количестве молекул. Термически привитые нетканые материалы связывают между 0,1 и 2 ммоль/г в случае как БСА, так и hIgG, между 1 и 10 ммоль/г в случае лизоцима и между 70 и 400 ммоль/г в случае АТФ. Также из ФИГ. 9 следует, что как УФ-привитые, так и термически привитые нетканые материалы связывают одинаковые количества АТФ при определенном %-ном увеличении массы. Количество связанного белка (ммоль/г) различается кардинально между УФ-привитыми и термически привитыми неткаными материалами в случае испытанных более крупных белков. Это свидетельствует о том, что АТФ является достаточно маленьким, чтобы он мог иметь доступ ко всему связующему поли-ГМА слою в случае обоих материалов и поэтому зависит от %-ного увеличения массы. Кроме того, это показывает, что может возникать эксклюзия по размерам, встречающаяся в термически привитых нетканых материалах, являющаяся причиной большого расхождения в связывании белка при сравнении с УФ-привитыми неткаными материалами. Чтобы оценить это, возможность целевого связывания охарактеризована и представлена на ФИГ. 10 в виде функции молекулярной массы мишени в случае как УФ-привитых, так и термически привитых нетканых материалов при определенном %-ном увеличении массы.

ФИГ. 10 представлена на двойной логарифмической шкале, чтобы дать наглядное представление для тенденций среди УФ-привитых и термически привитых нетканых материалов в случае связывания мишеней, которые имеют на порядок разную величину молекулярных масс и разную мольную связывающую способность. В случае как УФ-привитых, так и термически привитых нетканых материалов увеличение молекулярной массы приводит к резкому падению равновесной мольной связывающей способности. Естественно, можно только приблизительно оценить, сколько молекул находится в данном объеме связующего поли-ГМА, и поэтому связать меньше молекул, когда их молекулярная масса растет. Однако степень такого эффекта различается между термически привитыми неткаными материалами и УФ-привитыми неткаными материалами. При связывании АТФ как термически привитые, так и УФ-привитые ПБТ нетканые материалы связывают очень близкое число молекул АТФ при определенном увеличении массы, как показано на ФИГ. 10. Однако по мере увеличения молекулярной массы целевой молекулы, число связанных молекул (ммоль/г) расходится при сравнении двух методов прививочной полимеризации, как это можно увидеть на ФИГ. 10. Полученное расхождение в связывающей способности в случае более крупных мишеней указывает на то, что термически привитые нетканые материалы имеют либо меньший доступный объем для связывания, либо полимерная сетка является более эксклюзионной, чем УФ-привитые нетканые материалы. Такие результаты дополнительно подтверждают тот факт, что прививочная полимеризация с использованием термически индуцированной и продвигаемой за счет тепла полимеризации, вероятно, дает поли-ГМА сетчатую структуру, которая является сильноразветвленной и поперечно сшитой по сравнению с УФ-привитой поли-ГМА сетчатой структурой. Сильноразветвленная/сшитая поли-ГМА сетчатая структура, вероятно, имеет меньший объем для размещения биомолекул и белков из-за ее повышенной плотности. Кроме того, высокая степень поперечной сшивки, по-видимому, делает матрицу более жесткой, что препятствует перегруппировке полимерных щеток для эффективного уплотнения белков, и может также создавать поры, которые могут быть недоступны более крупным молекулам.

Скорости адсорбции к термически и УФ-привитым поли-ГМА нетканым материалам, функционализированным в качестве ионообменников

Ионообменные функционализированные привитые поли-ГМА ПБТ нетканые материалы, привитые с помощью УФ-излучения, показывают очень низкие скорости адсорбции белка, которые являются функцией толщины поли-ГМА слоя. Чтобы исследовать, отличаются ли скорости адсорбции белка при адсорбции БСА на анионообменных функционализированных нетканых материалах, привитых с использованием метода термической прививочной полимеризации и метода УФ-прививочной полимеризации, оба материла подвергают воздействию БСА при переменном времени контакта, и оценивают количество связанного белка. Результаты БСА-связывания в пределах меняющегося времени контакта для анионообменных термически привитых и УФ-привитых ПБТ нетканых материалов представлены на ФИГ. 11.

На ФИГ. 11 видно, что УФ-привитые поли-ГМА анионообменные нетканые материалы обнаруживают исключительно низкие скорости адсорбции. УФ-привитый поли-ГМА нетканый материал, привитый до 5,9%-ного увеличения массы, способен достигать равновесия приблизительно после времени контакта с белком 4 час, а при 20%-ном увеличении массы требуется 8 час, чтобы достичь равновесного связывания. Термически привитые нетканые материалы, функционализированные в качестве анионообменников, показывают намного более быструю кинетику связывания по сравнению с УФ-привитыми анионообменниками. При низких степенях прививки поли-ГМА (увеличение массы 6 и 15%) равновесное связывание достигается после 5 мин воздействия белка в случае анионообменных функционализированных термически привитых нетканых материалов. При высокой степени прививки поли-ГМА (увеличение массы 24%) равновесное связывание БСА достигается через 1 час, при этом свыше 60% от равновесной связывающей способности достигается через 5 мин после экспозиции белком.

Также изучена кинетика адсорбции hIgG за счет катионного обмена к привитым поли-ГМА нетканым материалам, привитым методом УФ-прививочной полимеризации и методом термической прививочной полимеризации. ФИГ. 12 отображает данные для захвата hIgG при разном времени контакта для катионообменных нетканых материалов, привитых с помощью обоих методов.

Подобно анионообменным функционализированным нетканым материалам катионообменные функционализированные нетканые материалы, привитые УФ методом, обнаруживают более медленные скорости адсорбции hIgG при сравнении с катионообменными функционализированными неткаными материалами, привитыми с помощью тепла. При 18%-ном увеличении массы требуется почти целый день до достижения равновесия в случае катионообменных УФ-привитых поли-ГМА нетканых материалов. ПБТ нетканые материалы, УФ-привитые до более низких степеней покрытия (увеличение массы 5%) достигают равновесного связывания hIgG через 4 час с больше чем 80% от равновесной способности, которые достигнуты через 1 час, что существенно быстрее, чем в случае УФ-привитых нетканых материалов с 20%-ным увеличением массы, как можно увидеть на ФИГ. 12. Термически привитые поли-ГМА нетканые материалы, функционализированные в качестве катионообменников, демонстрируют более высокие скорости захвата hIgG по сравнению с УФ-привитыми неткаными материалами, как показано на ФИГ. 12. Термически привитые нетканые материалы, привитые с увеличением массы 6% и 15%, достигают равновесия через 5 мин в случае hIgG-связывания. При 24%-ном увеличении массы термически привитые нетканые материалы достигают равновесия через 1 час с больше чем 60% от равновесного связывания, которые достигнуты через 5 мин воздействия белка.

Термическая прививочная полимеризация поли-ГМА на нетканый ПБТ приводит к более высоким общим скоростям адсорбции белка по сравнению с УФ-прививочной полимеризаций поли-ГМА на нетканый ПБТ, когда их функционализируют в качестве ионообменников, что демонстрируют ФИГ. 11 и 12. Однако равновесные связывающие способности значительно ниже для ионообменных функционализированных термически привитых нетканых материалов по сравнению с ионообменными функционализированными УФ-привитыми ПБТ неткаными материалами, что можно увидеть на ФИГ. 5, 11 и 12. Структурные различия поли-ГМА слоя, созданного термической прививкой и УФ прививкой, вероятно, являются причиной наблюдаемых различий в скоростях адсорбции белка. Если термически привитый поли-ГМА слой является более плотным, более жестким и содержит недоступные поры в матрице по сравнению с УФ-привитым поли-ГМА слоем, могут быть более низкими диффузия белка и перегруппировка, чтобы вместить белки для достижения равновесия, чем может иметь место в УФ-привитом слое. Диффузия белка и перегруппировка представляют собой существенно более медленное явление, чем конвективный поток. Следовательно, полагают, что скорость связывания белка на термически привитые нетканые материалы, функционализированные в качестве ионообменников, преимущественно преобладает над конвективным переносом массы, при этом УФ-привитые нетканые материалы обнаруживают диффузионное ограничение, которое приводит к медленной скорости связывания белка. Кроме того, термически привитый поли-ГМА слой, как считают, имеет меньший объем вследствие возможной более высокой плотности, возникающей из-за разветвления полимера. Меньший объем поли-ГМА, доступного для связывания, может приводить к более низкой общей связывающей способности при конкретном %-ном увеличении массы, белок будет иметь более короткое расстояние, чтобы диффундировать через слой, что может также приводить к более короткому времени для достижения равновесного связывания.

Изотермы адсорбции

Изотермы адсорбции для связывания БСА на анионообменных нетканых материалах, а также для связывания hIgG на катионообменных нетканых материалах получены для обоих методов прививочной полимеризации. Изотермы адсорбции белка для термически привитых и УФ-привитых нетканых материалов, привитых с разным увеличением массы, функционализированных в качестве анионообменников для захвата БСА и в качестве катионообменников для захвата hIgG, представлены на ФИГ. 13.

Все варианты адсорбция белка в случае двух методов прививочной полимеризации и двух ионообменных функциональностей обнаруживают поведение Ленгмюра, как показывают ФИГ. 13A и 13B. Модель адсорбции Ленгмюра (уравнение 4) аппроксимируют к данным, представленным на ФИГ. 13. Хотя привитые полимером нетканые материалы, функционализированные в качестве ионообменников, обнаруживают многослойное связывание по отношению к поверхности, к которой они привиты, сам полимерный слой ведет себя как односайтовый адсорбент, в котором число связывающих сайтов определяют по плотности заряда. Кажущуюся максимальную связывающую способность (q_m) и константу диссоциации (K_d) рассчитывают с использованием уравнения 4. Полученные значения представлены в таблице 1 для образцов, привитых с использованием метода термической прививочной полимеризации, и в таблице 2 для образцов, привитых с использованием метода УФ-прививочной полимеризации. В частности, ниже таблица 1 показывает кажущуюся константу диссоциации (K_d) и максимальную связывающую способность (q_m), полученные с использованием прямой аппроксимации модели Ленгмюра к данным изотермы, показанной на ФИГ. 13A для термически привитых нетканых материалов, функционализированных в качестве ионообменников.

Таблица 1

Ниже в таблице 2 представлены кажущаяся константа диссоциации (K_d) и максимальная связывающая способность (q_m), полученные с использованием прямой аппроксимации модели Ленгмюра к данным изотермы, показанным на ФИГ. 13В, для УФ-привитых нетканых материалов, функционализированных в качестве ионообменников.

Таблица 2

Рассчитанные константы диссоциации (K_d) находятся в интервале 1,2-7,5×10^-6 M для всех испытанных образцов, включающих оба способа прививочной полимеризации и обе ионообменные функциональности, используемые для захвата БСА и hIgG. Эти значения находятся в соответствии с представленными значениями для связывания белка на ионообменных функционализированных полимерных щетках и ионообменных функционализированных полимерных сетчатых структурах, которые имеют константы диссоциации порядка ×10^-6 M. Такой тип опытов по связыванию обнаруживает сильное взаимодействие белок-матрица, которое можно увидеть из их низких значений K_d. Однако добавление соли в качестве элюента эффективно нарушает связывание белка с ионообменной матрицей и заставляет ионообменные полимерные щетки складываться, принуждая белок перемещаться, что приводит к 100%-ному извлечению связанного белка.

Много модификаций и других вариантов осуществления изобретения будет появляться у специалиста в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, которые обладают преимуществом принципов, представленных в предшествующем описании. Таким образом, следует понимать, что изобретение не ограничено раскрытыми конкретными вариантами осуществления и что модификации и другие варианты осуществления, как подразумевают, входят в рамки объема прилагаемой формулы изобретения. Хотя в описании используют конкретные термины, их используют только в общем и описательном значении, а не в целях ограничения.

Реферат

Изобретение относится к способу получения привитой полимером и функционализированной нетканой мембраны, приспособленной для использования в процессах разделения, и полученной таким способом мембране, а также к способам разделения с применением мембраны. Способ получения привитой полимером и функционализированной нетканой мембраны, приспособленной для использования при захвате целевой молекулы, включает: i) получение нетканого полотна, содержащего множество полимерных волокон; ii) прививочную полимеризацию акрилатного или метакрилатного полимера на множество полимерных волокон с получением множества сегментов полимера, ковалентно прикрепленных к волокнам, в результате чего получают привитые полимером волокна, причем стадия прививочной полимеризации включает: a) контактирование нетканого полотна с раствором, содержащим термический свободнорадикальный инициатор, чтобы обеспечить абсорбцию термического инициатора в нетканое полотно, b) контактирование нетканого полотна с раствором, содержащим по меньшей мере один акрилатный или метакрилатный мономер, и c) воздействие теплом на нетканое полотно, чтобы инициировать полимеризацию акрилатного или метакрилатного мономера; и iii) функционализацию привитых полимером волокон с целью прикрепления по меньшей мере одной функциональной группы, способной связывать целевую молекулу с сегментами полимера привитых полимерных волокон. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 13 ил., 2 табл.

Формула