Способ очистки белка слияния - RU2698654C2

Чертежи

Описание

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc. Более конкретно, относится к очистке белка слияния TNFR:Fc, при которой снижается содержание HCP. Настоящее изобретение направлено на применение хроматографии со смешанным режимом и/или аффинной хроматографии для получения белка слияния TNFR:Fc, который практически не содержит по меньшей мере один из протеолитических ферментов, присутствующих в HCP.

Предпосылки изобретения

Белки играют важную роль в качестве биофармацевтических препаратов, поскольку они широко используются для лечения ряда заболеваний, в том числе сахарного диабета (например, инсулин), рака (например, интерферон, моноклональные антитела), инфарктов, инсультов, кистозного фиброза (например, ферменты, факторы крови), воспалительных заболеваний (например, факторы некроза опухоли), анемии (например, эритропоэтин), гемофилии (например, факторы свертывания крови) и т. д. Одной из важных задач является разработка эффективного и рационального способа крупномасштабной очистки таких белков. Для крупномасштабной очистки представляющего интерес белка из полученной культуральной жидкости (HCC) доступны многочисленные способы, но все же некоторые примеси остаются в очищенном представляющем интерес белке, что может оказаться вредным для долгосрочной стабильности, а также качества представляющего интерес белка. Белок, представляющий интерес, очищают от HCCF с помощью ряда хроматографических и ультрафильтрационных/диафильтрационных методов.

Хотя для очистки белков слияния TNFR:Fc от HCCF было разработано множество способов, но из-за вариабельности в клеточной экспрессирующей системе было отмечено, что общие способы очистки зачастую не в состоянии надлежащим образом очистить представляющий интерес белок от технологических примесей. Белок, представляющий интерес, который производится клетками-хозяевами в ходе культивирования клеток или ферментации, должен быть очищен от белков, происходящих из клетки-хозяина (HCP), ДНК клетки-хозяина, технологических добавок, занесенных агентов, токсинов и определенных родственных веществ. Эти примеси являются нежелательными в очищенном представляющем интерес белке, и их содержание должно быть сохранено на приемлемом уровне, чтобы сделать продукт безопасным для терапевтического применения у человека (Wang и соавт. 2009, 15 июня, Biotechnol Bioengineering 103(3):446-58).

Фактор некроза опухоли (TNF) представляет собой мощный цитокин и вызывает широкий спектр биологических ответов, которые опосредованы связыванием с рецептором на клеточной поверхности. Он участвует в патогенезе множества воспалительных нарушений, таких как ревматоидный артрит, псориатический артрит, системная красная волчанка (SLE), болезнь Крона и т. д. Hohmann и соавт. (Hohmann и соавт. 1989 J Biol Chem. 25, 14927-34). Прямое ингибирование TNF-альфа биологическими средствами дало существенные преимущества при лечении ревматоидного артрита, и внеклеточное ингибирование этого провоспалительного цитокина было утверждено в качестве эффективной терапии. Рекомбинантные белки слияния TNFR:Fc связываются с цитокином TNF и блокируют активность TNF. Примеры ингибиторов TNF включают белок слияния TNFR:Fc (этанерцепт) и моноклональные антитела к TNF (адалимумаб, инфликсимаб, голимумаб и цертолизумаб пегол).

Этанерцепт представляет собой димерный белок слияния, состоящий из внеклеточной лиганд-связывающей части человеческого рецептора фактора некроза опухоли (TNFR, тип II) массой 75 килодальтон (p75), связанной с Fc-участком IgG1 человека. Fc-компонент этанерцепта состоит из домена CH₂, домена CH₃ и шарнирной области, тогда как домен CH₁ отсутствует (патент США № 7648702). Он производится с помощью технологии рекомбинантной ДНК в клетках млекопитающего – яичника китайского хомячка. Он состоит из 934 аминокислот и имеет среднюю молекулярную массу приблизительно 130 килодальтон. В связи с его уникальной структурой, этанерцепт связывается с TNF-альфа более эффективно, чем его эндогенный рецептор (Gofeeet и соавт. 2003, J Am Acad Dermatol. 49, S105-111, Strober 2005, Semin Cutan Med Surg. 24; 28-36).

В патенте США № 7294481 раскрывается очистка белка TNFR:Fc с помощью хроматографии с белком A с последующей хроматографией с гидрофобным взаимодействием.

В заявке на европейский патент EP 2729482 A1 раскрывается очистка белков слияния с помощью хроматографии с белком A, затем с помощью катионообменной хроматографии с последующей анионообменной хроматографией.

В заявке на международный патент WO 2004/076485 изложена очистка антител с помощью хроматографии с белком A, затем с помощью анионообменной хроматографии с последующей катионообменной хроматографией.

В заявке на международный патент WO 2013/176754 раскрывается способ снижения содержания по меньшей мере одной технологической примеси и/или родственного вещества в представляющем интерес белке с помощью хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC) в проточном режиме.

Сущность изобретения

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белков слияния TNFR:Fc с помощью выполнения хроматографии со смешанным режимом в проточном режиме.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения содержания HCP в белках слияния TNFR:Fc с помощью выполнения хроматографии со смешанным режимом в проточном режиме.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения содержания HCP хроматографическими способами, включающими хроматографию с белком А и хроматографию со смешанным режимом.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения содержания HCP в белке слияния TNFR:Fc с помощью выполнения хроматографии с белком А с последующей хроматографией с гидрофобным взаимодействием (HIC), с последующей анионообменной хроматографией, с последующей хроматографией со смешанным режимом.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения содержания HCP, агрегатов и неправильно свернутых белков с получением практически чистого (99% чистого) белка слияния TNFR:Fc с помощью эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления (SE-HPLC) и >80% чистого белка слияния TNFR:Fc с помощью гидрофобного взаимодействия (HI)-HPLC.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению хроматографии со смешанным режимом для получения белка слияния TNFR:Fc, который практически не содержит по меньшей мере один из протеолитических ферментов, присутствующих в HCP.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси HCP, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует во второй смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

d) нанесение второй смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок слияния TNFR:Fc практически не содержит примесей HCP, содержащих по меньшей мере один протеолитический фермент.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и по меньшей мере одну примесь HCP, которая содержит протеолитический фермент, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует во второй смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

d) нанесение второй смеси белков на колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием;

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием, где элюированный белок, представляющий интерес, присутствует в третьей смеси белков, которая содержит сниженное количество примеси HCP;

f) нанесение третьей смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

g) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок, представляющий интерес, практически не содержит примеси HCP, содержащей по меньшей мере один протеолитический фермент.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и по меньшей мере одну примесь HCP, которая содержит протеолитический фермент, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует во второй смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

d) нанесение второй смеси белков на колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием;

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует в третьей смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

f) нанесение третьей смеси белков на колонку для анионообменной хроматографии;

g) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для анионообменной хроматографии, где элюированный белок, представляющий интерес, присутствует в четвертой смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

h) нанесение четвертой смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

i) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок слияния TNFR:Fc практически не содержит примеси HCP, содержащей по меньшей мере один протеолитический фермент.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков с использованием колонки для хроматографии со смешанным режимом, которая может осуществляться на любой стадии после колонки для аффинной хроматографии.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси HCP, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) применение более чем одной промывки в отношении колонки для аффинной хроматографии;

d) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc содержит сниженное количество примесей HCP по сравнению с осуществлением указанного способа без применения более чем одной промывки в отношении колонки для аффинной хроматографии.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения существенно снижено содержание примесей HCP, содержащих по меньшей мере один протеолитический фермент, по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 99% и более предпочтительно снижены до степени соответствия допустимому пределу.

В еще одном варианте осуществления в настоящем изобретении существенно снижено содержание примесей HCP, содержащих по меньшей мере один протеолитический фермент, и белок слияния TNFR:Fc стабилизирован в течение по меньшей мере двух недель, предпочтительно в течение по меньшей мере одного месяца, более предпочтительно в течение по меньшей мере 6 месяцев и более предпочтительно в течение по меньшей мере одного года.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белков слияния TNFR:Fc с помощью выполнения хроматографии со смешанным режимом в проточном режиме.

Подробные данные одного или более вариантов осуществления настоящего изобретения, изложенные ниже, являются исключительно иллюстративными по своему характеру и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения будут понятны из описания.

Краткое описание прилагаемых графических материалов

На фигуре 1(A) проиллюстрированы зимограммы в желатине, показывающие протеазную активность, которая присутствует в элюатах белков без промежуточных стадий промывки в хроматографии с белком А.

На фигуре 1(В) проиллюстрированы зимограммы в желатине, показывающие, что протеазная активность отсутствует в элюатах белков с промежуточными стадиями промывки в хроматографии с белком А.

На фигуре 2(A) проиллюстрирован анализ ускоренного исследования протеазного расщепления с помощью эксклюзионной – HPLC последующей очистки без хроматографии со смешанным режимом в качестве стадии глубокой очистки.

На фигуре 2(В) проиллюстрирован анализ ускоренного исследования протеазного расщепления с помощью сайз-эксклюзионной – HPLC хроматографии последующей очистки с хроматографией со смешанным режимом.

На фигуре 3 проиллюстрировано сравнение чувствительности ускоренного исследования стабильности относительно зимограммы и ELISA при детектировании HCP.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc из HCCF, получаемой в результате периодической с подпиткой и/или перфузионной технологии.

Настоящее изобретение относится к применению хроматографии со смешанным режимом для получения белка слияния TNFR:Fc, который практически не содержит по меньшей мере один из протеолитических ферментов, присутствующих в HCP.

Настоящее изобретение относится к способу снижения примесей, особенно HCP, в представляющем интерес белке с помощью промежуточных хроматографических процессов, включающих хроматографию с белком А и хроматографию со смешанным режимом. Содержание HCP снижается на 90%, более конкретно содержание HCP снижается на 99%. Предпочтительно содержание HCP снижается до степени соответствия допустимому пределу.

HCP может вызывать иммунный ответ у пациентов при низких уровнях содержания, таких как 100 частей на миллион (ppm). HCP обычно присутствуют в лекарственном веществе и лекарственном продукте в небольших количествах, поскольку они не полностью устраняются при традиционных способах очистки. Для как можно большего удаления HCP в промышленности расходуется много усилий и затрат.

Используемый в данном документе термин «белки клетки-хозяина (HCP)» включает протеолитический фермент, который представляет собой протеазу, и другие родственные нецелевым белкам примеси белков, полученные из клеток-хозяев. Очистка от HCP имеет еще большее значение, когда один или более из HCP представляет собой протеазу и может гидролизовать (расщеплять) представляющий интерес белок. Присутствие протеазы даже на очень низком уровне может ставить под угрозу долгосрочную стабильность представляющего интерес белка. В дополнение к протеолитическому ферменту, HCP содержит примеси, которые включают в себя без ограничения агрегаты, неправильно свернутые белки и фрагменты.

Любая смола для хроматографии с белком A, при использовании в качестве стадии захвата для белков слияния TNFR:Fc и других моноклональных антител, способна очищать большую часть примесей из HCCF, однако некоторое количество HCP, в том числе одна или несколько протеаз, таких как матриксная металлопротеаза (преимущественно желатиназа), могут все еще совместно элюироваться с представляющим интерес белком вследствие неспецифичного связывания со смолой белка А. Комбинации различных стадий хроматографии дополнительно помогают удалять следовые количества протеаз, которые все еще присутствуют после хроматографии с белком А.

Термин «режим связывания-элюирования», используемый в данном документе, относится к режиму очистки с помощью хроматографии, где представляющий интерес белок при загрузке на колонку связывается с хроматографической смолой и затем элюируется элюирующим буфером.

Термин «проточный режим», используемый в данном документе, относится к режиму очистки с помощью хроматографии, где высокомолекулярные примеси, HCP и эндотоксины связываются с хроматографической смолой при загрузке, и представляющий интерес белок выходит в фильтрат.

Термин «белки слияния», используемый в данном документе, включает без ограничения этанерцепт, абатацепт, алефацепт, рилонацепт, белатацепт, афлиберцепт.

Термин «TNFR», используемый в данном документе, представляет собой биологически активный гликопротеин, который содержит полностью или частично внеклеточный растворимый фрагмент белка, принадлежащего к семейству TNF-рецепторов. Некоторыми примерами семейства TNF-рецепторов являются рецептор фактора некроза опухоли I (TNFRI), рецептор фактора некроза опухоли II (TNFRII), антиген OX40, рецептор CD40L, рецептор FASL. TNFR1 состоит из связывающей внеклеточный лиганд части человеческого белка массой 55 килодальтон (p55), а TNFRII состоит из связывающей внеклеточный лиганд части человеческого белка массой 75 килодальтон (p75).

Термин «приблизительно», используемый в данном документе, предназначен для обозначения диапазонов на примерно 10-20% больше или меньше, чем эталонное значение. При определенных обстоятельствах специалисту в данной области техники будет понятно, что из-за характера эталонного значения термин «приблизительно» может означать больше или меньше, чем отклонение 10-20% от данного значения.

Фраза «снижение/инактивация вируса», используемая в данном документе, предназначена для обозначения уменьшения числа вирусных частиц в конкретном образце («снижение»), а также уменьшения активности, например без ограничения инфекционности или способности к репликации вирусных частиц в конкретном образце («инактивация»). Такое уменьшение числа и/или активности вирусных частиц может составлять порядка от приблизительно 1% до приблизительно 99%, предпочтительно от приблизительно 20% до приблизительно 99%, более предпочтительно от приблизительно 30% до приблизительно 99%, более предпочтительно от приблизительно 40% до приблизительно 99%, еще более предпочтительно от приблизительно 50% до приблизительно 99%, еще более предпочтительно от приблизительно 60% до приблизительно 99%, еще более предпочтительно от приблизительно 70% до приблизительно 99%, еще более предпочтительно от приблизительно 80% до 99% и еще более предпочтительно от приблизительно 90% до приблизительно 99%.

Термин «агрегаты», используемый в данном документе, означает агломерацию или олигомеризацию двух или более отдельных молекул, в том числе без ограничения димеры, тримеры, тетрамеры, олигомеры белков и другие высокомолекулярные разновидности. Агрегаты белков могут быть растворимыми или нерастворимыми.

Термин «протеолитический фермент», используемый в данном документе, означает примесь, полученную из белка клетки-хозяина, которая расщепляет представляющий интерес белок. «Протеолитический фермент» включает в себя без ограничения протеазы, матриксные металлопротеазы, желатиназы.

Термины «белок клеток яичника китайского хомячка» и «CHOP» используются взаимозаменяемо для обозначения смеси белков клетки-хозяина («HCP»), полученной из клеточной культуры яичника китайского хомячка («CHO»). Как правило, HCP или CHOP присутствуют в виде примеси в среде или лизате клеточной культуры (например, в собранной культуральной жидкости («HCCF»), включающей представляющий интерес белок, такой как белок слияния TNFR:Fc, экспрессированный в клетке CHO). Количество CHOP, присутствующего в смеси, которая содержит представляющий интерес белок, является мерой степени чистоты для представляющего интерес белка. HCP или CHOP включают в себя без ограничения представляющий интерес белок, экспрессируемый клеткой-хозяином, такой как клетка-хозяин CHO. Как правило, количество CHOP в смеси белков выражается в частях на миллион относительно количества представляющего интерес белка в смеси.

Термин «линейный градиент» используется в данном документе для обозначения условий, при которых значение pH и/или проводимость увеличиваются или уменьшаются постепенно с использованием по меньшей мере двух буферов, где буферы отличаются по значению pH или проводимости, или обоим.

Термин «градиентное элюирование» используется в данном документе для обозначения в целом условий, при которых значение pH и/или проводимость либо увеличиваются, либо уменьшаются с использованием по меньшей мере двух буферов, где буферы отличаются по значению pH или проводимости, или обоим.

Термины «очищение», «разделение» или «выделение», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к повышению степени чистоты полипептида или представляющего интерес белка, или целевого белка из смеси белков, содержащей полипептид и одну или более примесей или загрязнителей, в том числе по меньшей мере один из протеолитических ферментов. Как правило, степень чистоты целевого белка повышается с помощью удаления (полного или частичного) по меньшей мере одной примеси из композиции.

«Стадия очистки» или «единичная операция» может быть частью общего процесса очистки, приводящего к «гомогенной» композиции или образцу, которые используются в данном документе для обозначения композиции или образца, содержащих менее 1000 ppm HCP в композиции, содержащей представляющий интерес белок, как альтернатива, менее 900 ppm, менее 800 ppm, менее 700 ppm, менее 600 ppm. Термины «очистка», «разделение» или «выделение», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к повышению степени чистоты полипептида или представляющего интерес белка, или целевого белка из композиции или образца, содержащих данный полипептид и одну или более примесей или загрязнителей.

Как правило, степень чистоты целевого белка повышается с помощью удаления из композиции (полного или частичного) по меньшей мере одной примеси. Степень чистоты целевого белка составляет по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99%.

Термин «смесь белков», используемый в данном документе, относится к элюированной композиции, получаемой в результате одной или более стадий хроматографии, применяемых в настоящем изобретении. Термин «смесь белков» дополнительно определяется в настоящем изобретении как «первая смесь белков», «вторая смесь белков», «третья смесь белков», «четвертая смесь белков», «пятая смесь белков» в соответствии с применяемой хроматографической колонкой и степенью чистоты примесей, таких как неполные Fc-содержащие фрагменты белков, агрегаты и белки клетки-хозяина (HCP), а также протеолитический фермент, который может присутствовать в смеси белков. Однако термины «первая смесь белков», «вторая смесь белков», «третья смесь белков», «четвертая смесь белков», «пятая смесь белков» являются взаимозаменяемыми в соответствии с изменением или удалением хроматографической колонки, применяемой в методах очистки.

В одном варианте осуществления белок слияния TNFR:Fc представляет собой этанерцепт. Значение изоэлектрической точки (pI) этанерцепта выбирают из значения от приблизительно 4,8 до 5,2.

В определенном варианте осуществления собранную культуральную жидкость (HCCF) получают из подходящей системы млекопитающего, предпочтительно клеточной культуры CHO. Осветление HCCF можно выполнять методами центрифугирования и/или фильтрации. Фильтр 0,2-микрона используют для получения осветленной собранной культуральной жидкости (HCCF), которую можно дополнительно очищать с помощью хроматографических методов, описанных в настоящем изобретении.

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc путем использования хроматографии со смешанным режимом. В конкретном варианте осуществления в способе согласно данному документу используют по меньшей мере одну стадию аффинной хроматографии, предпочтительно хроматографии с белком А, и по меньшей мере одну стадию хроматографии со смешанным режимом.

В определенном варианте осуществления в способе согласно данному документу применяют по меньшей мере одну стадию аффинной хроматографии и по меньшей мере одну стадию хроматографии со смешанным режимом, а также по меньшей мере одну или более дополнительных стадий хроматографии. Дополнительные стадии хроматографии можно выбирать из ионообменной, предпочтительно анионообменной, и хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC).

В одном варианте осуществления колонку для аффинной хроматографии выбирают из смолы с белком А, смолы с белком G, предпочтительно смолы с белком A. Хроматографическую смолу для колонки с белком А выбирают из MabSelect Sure LX, MabSelectSuRe, MabSelectXtra, ProSep Ultra Plus, Toyopearl AF-rProtein A HC-650.

В одном варианте осуществления стадия аффинной хроматографии включает очищенную собранную культуральную жидкость (HCCF), получаемую из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего. Значение pH HCCF доводят до pH, выбранного из значения от приблизительно pH 8 до приблизительно pH 9, предпочтительно pH 8,5, с 2 M трис-основания непосредственно перед загрузкой на аффинную колонку. Колонку с белком А уравновешивают подходящим буфером до начала загрузки образца. Подходящий буфер выбирают из буфера трис-Cl, HEPES, триэтаноламина, бората, глицин-NaOH, предпочтительно буфера трис-Cl при значении pH, выбранном из значения от приблизительно pH 8 до приблизительно pH 9, предпочтительно pH 8,5, и проводимости, выбранной из значения от приблизительно 10 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, предпочтительно приблизительно 18 мСм/см. Концентрацию буфера выбирают из значения от приблизительно 30 мM до приблизительно 60 мМ буфера трис-Cl, предпочтительно 50 мM трис-Cl, содержащего добавки от приблизительно 120 мM до приблизительно 150 мM NaCl, предпочтительно 150 мM NaCl, и от приблизительно 2 мM до приблизительно 6 мM EDTA, предпочтительно 5 мM EDTA. Колонку с белком А уравновешивают подходящим буфером для меньшей мере одного объема колонки, предпочтительно для двух объемов колонки. Смесь белков с доведенным значением pH, включающую представляющий интерес белок, и HCP, содержащий по меньшей мере один протеолитический фермент, загружают на колонку с белком А. Скорость потока выбирают из значения от приблизительно 50 см/ч до приблизительно 300 см/ч, предпочтительно 100 см/ч. После загрузки колонки с белком А, колонку можно промыть один или более раз с использованием уравновешивающего буфера или с использованием других буферов. Колонку с белком А сначала промывают уравновешивающим буфером для по меньшей мере 2 объемов колонки. После данной промывки может необязательно следовать одна или более промывок. В предпочтительном варианте осуществления колонку с белком А сначала промывают уравновешивающим буфером для по меньшей мере 2 объемов колонки и затем последующим буфером для промежуточной промывки, названным промывочным буфером А, который содержит по меньшей мере одну из следующих добавок: мочевина, твин 80 и изопропанол, NaCl, EDTA в подходящем буфере, выбранном из трис-Cl, HEPES, триэтаноламина, бората, глицин-NaOH, предпочтительно трис-Cl, при значении pH, выбранном из значения от приблизительно pH 8 до приблизительно pH 9, предпочтительно pH 8,5, проводимости, выбранной из значения от приблизительно 50 мСм/см до приблизительно 75 мСм/см, предпочтительно приблизительно 65 мСм/см, для по меньшей мере более чем одного объема колонки, предпочтительно 3 объемов колонки, более предпочтительно 6 объемов колонки. Концентрацию промывочного буфера А выбирают из значения от приблизительно 30 мM до приблизительно 60 мМ трис-буфера, предпочтительно 50 мM трис-буфера, содержащего от приблизительно 1 M до приблизительно 2 M мочевины, предпочтительно 1,5 M мочевины, приблизительно 1,5% твин 80, приблизительно 7,5% изопропанола, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 2 M NaCl, предпочтительно 1 M NaCl, и от приблизительно 2 мM до приблизительно 6 мM EDTA, предпочтительно 5 мM EDTA.

После промывочного буфера A колонку с белком A дополнительно промывают буфером для промежуточной промывки, названным промывочным буфером B, который содержит двухводный трехзамещенный цитрат натрия, ацетат, глицин-HCl, предпочтительно двухводный трехзамещенный цитрат натрия, при значении pH, выбранном из значения от приблизительно pH 4 до приблизительно pH 5, предпочтительно pH 4,5, проводимости, выбранной из значения от приблизительно 8 мСм/см до приблизительно 25 мСм/см, предпочтительно приблизительно 12 мСм/см, для по меньшей мере одного объема колонки. Концентрацию промывочного буфера B выбирают из значения от приблизительно 30 мM до приблизительно 60 мМ двухводного трехзамещенного цитрата натрия, предпочтительно 50 мM. После промывочного буфера B колонку с белком A дополнительно промывают буфером для промежуточной промывки, названным промывочным буфером C, который содержит 90% промывочного буфера B и 10% элюирующего буфера, и значение рН промывочного буфера C составляет приблизительно 4.

Затем колонку с белком А можно элюировать с использованием соответствующего подходящего буфера. Элюирующий буфер может представлять собой смесь одного или более чем одного буфера. Белок элюируют с помощью комбинации линейного градиента и ступенчатого градиента, чтобы удалить окисленные примеси. Линейный градиент достигается за счет использования элюирующего буфера, выбранного со значением рН от приблизительно 2 до 3,5, и промывочного буфера, выбранного со значением рН от приблизительно 4 до 5, в подходящем соотношении.

Линейный градиент достигается за счет использования элюирующего буфера от приблизительно 0 до 100%, предпочтительно от 10 до 90%, с элюирующим буфером для по меньшей мере более чем одного объема колонки, предпочтительно линейный градиент достигается за счет использования элюирующего буфера приблизительно 10%, с 90% промывочного буфера B для по меньшей мере более чем одного объема колонки, предпочтительно более чем 3 объемов колонки, более предпочтительно 6 объемов колонки. Ступенчатый градиент достигается за счет использования элюирующего буфера, содержащего двухводный трехзамещенный цитрат натрия, при значении pH, выбранном из значения от приблизительно pH 2 до приблизительно pH 3,5, предпочтительно pH 3, проводимости, выбранной из значения от приблизительно 5 мСм/см до приблизительно 15 мСм/см, предпочтительно приблизительно 12 мСм/см. Концентрацию двухводного трехзамещенного цитрата натрия выбирают из значения от приблизительно 30 мM до приблизительно 60 мМ двухводного трехзамещенного цитрата натрия, предпочтительно 50 мM.

Собранная фракция представляет собой вторую смесь белков и необязательно может подвергаться обработке при низком значении pH.

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение может осуществляться только с колонкой для хроматографии с белком А. Однако чистота элюированного белка слияния TNFR:Fc зависит от одной или более промывочных стадий, и удаление или сокращение промывочных стадий соответственно увеличивает концентрацию протеолитического фермента.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси HCP, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) применение более чем одной промывки в отношении колонки для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc содержит сниженное количество примесей HCP по сравнению с осуществлением указанного способа без применения более чем одной промывки в отношении колонки для аффинной хроматографии.

В варианте осуществления вирусную инактивацию можно выполнять при обработке при низком значении pH. Значение pH элюата, получаемого в результате аффинной хроматографии (вторая смесь белков), выбирают от приблизительно pH 2 до приблизительно pH 5, предпочтительно рН 3,5. Значение pH можно доводить с помощью подходящих кислот, в том числе без ограничения лимонной кислоты, уксусной кислоты, каприловой кислоты или других подходящих кислот. Если значение pH составляет меньше чем 3,5, то его доводят до 3,5 с помощью 2 M трис-основания. После того, как достигается подходящее значение pH 3,5, смесь белков инкубируют в течение по меньшей мере 10 минут, предпочтительно 45 минут, при комнатной температуре. После вирусной инактивации значение pH раствора доводят до приблизительно 6,5 с помощью 2 M трис-основания. Из фракций, обработанных при низком значении pH, получают искусственный пул и проверяют профиль примесей, предпочтительно окисленных разновидностей, с помощью HPLC с белком А.

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение включает также применение способа хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC) для очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси, содержащей представляющий интерес белок, и HCP, содержащего по меньшей мере один протеолитический фермент.

Вторая смесь белков, полученная из колонки для аффинной хроматографии, и необязательно после обработки при низком значении pH, может подвергаться воздействию колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием, и элюат, полученный из колонки для HIC, может быть назван третьей смесью белков, которая характеризуется сниженным уровнем содержания HCP и протеолитических ферментов.

В одном варианте осуществления смолу для хроматографии с гидрофобным взаимодействием выбирают из Butyl Toyopearl 650 M resin, Toyopearl Phenyl-650, Butyl Sepharose 6 Fast Flow, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (высокого замещения).

В одном варианте осуществления вторую смесь белков, полученную из колонки для аффинной хроматографии, и необязательно после обработки при низком значении pH, подвергают воздействию колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием. HIC осуществляют в режиме связывания-элюирования. Перед загрузкой, подходящий высоко-солевой буфер постепенно добавляют к второй смеси белков до достижения проводимости от приблизительно 40 мСм/см до приблизительно 70 мСм/см, предпочтительно приблизительно 50 мСм/см. Подходящий высоко-солевой буфер выбирают из по меньшей мере одной или нескольких комбинаций солей, выбранных из безводного двухзамещенного гидрофосфата натрия, двухводного трехзамещенного цитрата натрия, гистидин-HCl, имидазола, бис-трис, малеата, предпочтительно безводного двухзамещенного гидрофосфата натрия, двухводного трехзамещенного цитрата натрия при значении pH, выбранном из значения от приблизительно pH 6 до приблизительно pH 7, предпочтительно pH 6,5, проводимости, выбранной из значения от приблизительно 50 мСм/см до приблизительно 80 мСм/см, предпочтительно приблизительно 65 мСм/ми. Концентрацию высоко-солевого буфера выбирают из значения от приблизительно 0,01 M до приблизительно 1M, предпочтительно 0,05 M безводного двухзамещенного гидрофосфата натрия, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 2M, предпочтительно 0,8 M двухводного трехзамещенного цитрата натрия. Колонку для HIC уравновешивают подходящим буфером до начала загрузки образца. Подходящий уравновешивающий буфер выбирают из высоко-солевого буфера, разбавленного водой для инъекций (WFI) до достижения проводимости от приблизительно 40 мСм/см до приблизительно 70 мСм/см, предпочтительно приблизительно 50 мСм/см. Вторую смесь белков загружают на колонку для HIC. Скорость потока выбирают из значения от приблизительно 50 см/ч до приблизительно 300 см/ч, предпочтительно 150 см/ч.

После загрузки колонки для HIC, колонку можно промыть один или более раз с использованием уравновешивающего буфера или с использованием других буферов. Колонку для HIC промывают уравновешивающим буфером для по меньшей мере одного объема колонки, предпочтительно 1,5 объемов колонки. После данной промывки может необязательно следовать одна или более промывок. В предпочтительном варианте осуществления колонку для HIC промывают уравновешивающим буфером для по меньшей мере одного объема колонки, предпочтительно 1,5 объемов колонки, и затем следует второй промывочный буфер, который содержит по меньшей мере приблизительно 10%-25% безводного двухзамещенного гидрофосфата натрия, и значение pH выбирают от приблизительно рH 6 до приблизительно pH 7, предпочтительно pH 6,5, проводимость выбирают из значения от приблизительно 5 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см, предпочтительно приблизительно 8 мСм/см. Концентрацию безводного двухзамещенного гидрофосфата натрия выбирают из значения от приблизительно 0,01 M до приблизительно 1 M, предпочтительно 0,05 M. Вторую промывку осуществляют для по меньшей мере одного объема колонки, предпочтительно 3 объемов колонки, более предпочтительно 6 объемов колонки или до стабилизации оптической плотности, в зависимости от того, какое из вышеуказанных условий возникнет первым. Затем колонку для HIC можно элюировать с использованием соответствующего буфера. Элюирующий буфер может представлять собой смесь одного или более чем одного буфера. Белок элюируют с помощью комбинации, обеспечивая ступенчатый градиент от 40% - 70%, предпочтительно 65%, второго промывочного буфера до по меньшей мере 75% и выше второго промывочного буфера. Элюированный белок представляет собой третью смесь белков, которую собирают по фракциям. Искусственный пул получают из собранных фракций. Искусственный пул анализируют с помощью HI-HPLC, чтобы проверить % содержания неправильно свернутых разновидностей, а уровень содержания HCP – с помощью ELISA.

В определенном варианте осуществления элюированный белок (третья смесь белков), полученный в результате хроматографии с гидрофобным взаимодействием, необязательно подвергают диафильтрации через мембрану с отсечением 30 кДа с буфером 20 мM гидрохлорида гистидина, pH 5,5, для шести объемов диафильтрации, или пока значение pH и проводимость ретентата не достигнут соответственно менее 5,8 и 3,0 мСм/см.

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение включает также применение способа анионообменной хроматографии (HIC) для очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси, содержащей представляющий интерес белок, и HCP, содержащего по меньшей мере один протеолитический фермент.

Третья смесь белков, полученная из колонки для HIC, и необязательно после диафильтрации, может подвергаться воздействию колонки для анионообменной хроматографии, и элюат, полученный из колонки для анионообменной хроматографии, может быть назван четвертой смесью белков, которая характеризуется сниженным уровнем содержания HCP и протеолитических ферментов.

В одном варианте осуществления анионообменную хроматографию выбирают из DEAE sepharose fast flow (сефароза быстрым потоком), Fractogel® EMD DEAE (M), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl DEAE-650.

В одном варианте осуществления третью смесь белков, полученную из колонки для HIC, и необязательно после диафильтрации, подвергают воздействию колонки для анионообменной хроматографии. Анионный обмен осуществляют в режиме связывания-элюирования. Анионообменную колонку уравновешивают подходящим буфером до начала загрузки образца. Подходящие уравновешивающие буферы выбирают из гидрохлорида гистидина, фосфата, цитрата, предпочтительно гидрохлорида гистидина, при значении pH, выбранном из значения от приблизительно 4,5 до приблизительно pH 6, предпочтительно pH 5,5; проводимость выбирают из значения от приблизительно 1 мСм/см до приблизительно 10 мСм/см, предпочтительно 2 мСм/см. Концентрацию хлорида гистидина выбирают из значения от 10 мM до 50 мM, предпочтительно 20 мM. Третью смесь белков загружают на анионообменную колонку. Скорость потока выбирают из значения от приблизительно 50 см/ч до приблизительно 300 см/ч, предпочтительно 150 см/ч.

После загрузки анионообменной колонки данную колонку можно промыть один или более раз с использованием уравновешивающего буфера или с использованием других буферов. Анионообменную колонку промывают уравновешивающим буфером для по меньшей мере одного объема колонки, предпочтительно 2 объемов колонки. После данной промывки может необязательно следовать одна или более промывок. В предпочтительном варианте осуществления анионообменную колонку промывают уравновешивающим буфером для по меньшей мере одного объема колонки, предпочтительно 2 объемов колонки, и затем следует второй промывающий буфер, который содержит буфер, выбранный из ацетата натрия, и при значении pH, выбранном из значения от приблизительно 4,5 до приблизительно pH 6, предпочтительно pH 5,5, проводимость выбирают из значения от 1 мСм/см до приблизительно 20 мСм/см, предпочтительно 8,2 мСм/см. Концентрацию ацетата натрия выбирают из значения от приблизительно 50 мM до 125 мM, предпочтительно 100 мM, анионообменную колонку промывают уравновешивающим буфером для по меньшей мере одного объема колонки, предпочтительно 3 объемов колонки, более предпочтительно 6 объемов колонки, более предпочтительно 8 объемов колонки.

Затем анионообменную колонку можно элюировать с использованием соответствующего буфера. Элюирующий буфер может представлять собой смесь одного или более чем одного буфера. Элюирующий буфер включает буфер, выбранный из ацетата натрия, и при значении рН, выбранном от приблизительно 4,5 до приблизительно pH 6, предпочтительно pH 5,5, проводимость выбирают из значения от 10 мСм/см до приблизительно 30 мСм/см, предпочтительно 15 мСм/см. Элюат собирают, и он может быть назван четвертой смесью белков.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение включает применение способа хроматографии со смешанным режимом (MMC) для очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси, содержащей представляющий интерес белок, и HCP, содержащего по меньшей мере один протеолитический фермент.

Четвертая смесь белков, полученная из анионообменной колонки, может подвергаться воздействию колонки для хроматографии со смешанным режимом, и элюат, полученный из колонки для хроматографии со смешанным режимом, может быть назван пятой смесью белков, которая характеризуется сниженным уровнем содержания HCP и протеолитических ферментов. Элюат (пятая смесь белков) практически не содержит по меньшей мере один из протеолитических ферментов.

Колонка для хроматографии со смешанным режимом одновременно включает в себя лиганды, содержащие положительно заряженный фрагмент и гидрофобный фрагмент, где положительно заряженный фрагмент характеризуется анионообменными (IEC) свойствами и гидрофобный фрагмент характеризуется свойствами хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC). Хроматография IEC/HIC со смешанным режимом улучшила разделительную способность и селективность разделения на основе того, что в ней применяются как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия. Хроматографию со смешанным режимом можно выполнять с использованием анионообменной хроматографии и HIC или катионообменной хроматографии и HIC. Колонку для хроматографии со смешанным режимом можно выбирать из Capto adhere (N-бензил-N-метилэтаноламин в качестве лиганда), Capto MMC (лиганд MMC), MEP Hypercel (4-меркаптометилпиридин в качестве лиганда), HEA Hypercel (гексиламин в качестве лиганда), PPA Hypercel (фенилпропиламин в качестве лиганда), демонстрирующих несколько функциональных возможностей для взаимодействия. Данные смолы обладают несколькими функциональными возможностями для взаимодействия. Наиболее выраженными являются ионное взаимодействие, образование водородных связей и гидрофобное взаимодействие.

В одном варианте осуществления пятую смесь белков, полученную из колонки для анионообменной хроматографии, подвергают воздействию колонки для хроматографии со смешанным режимом. Хроматографию со смешанным режимом осуществляют в проточном режиме. Перед началом загрузки значение pH пятой смеси белков (образца) доводят до значения pH, выбранного из значения от приблизительно pH 6 до pH 7, предпочтительно 6,5. Значение pH можно доводить с использованием трис-основания, имеющего концентрацию от приблизительно 1 M до 5 M, предпочтительно 2 M. Проводимость образца доводят до значения от приблизительно 30 мСм/см до приблизительно 42 мСм/см, предпочтительно 35 мСм/см, с помощью применения 2 M – 8 M исходного раствора хлорида натрия. Колонку для смешанного режима уравновешивают подходящим буфером до начала загрузки образца. Подходящие уравновешивающие буферы выбирают из гидрохлорида гистидина, фосфата, цитрата, предпочтительно гидрохлорида гистидина, содержащего ацетат натрия, NaCl, при значении pH, выбранном из значения от приблизительно 6 до приблизительно pH 7, предпочтительно pH 7, проводимость выбирают из значения от приблизительно 30 мСм/см до приблизительно 42 мСм/см, предпочтительно 35 мСм/см. Концентрацию хлорида гистидина выбирают из значения от 10 мM до 50 мM, предпочтительно 20 мM. Концентрацию ацетата натрия выбирают из значения от 180 мM до 300 мM, предпочтительно 254 мM. Концентрацию NaCl выбирают из значения от 180 мM до 300 мM, предпочтительно 240 мM. Пятую смесь белков загружают на колонку для хроматографии со смешанным режимом. Скорость потока выбирают из значения от приблизительно 20 см/ч до приблизительно 100 см/ч, предпочтительно 50 см/ч, и белок собирают по фракциям в проточном режиме (FT). Фракции элюата содержат практически чистый представляющий интерес белок, тогда как технологические и родственные примеси эффективно связываются с колонкой. Искусственный пул получают из собранных фракций FT.

Искусственный пул анализируют с помощью HI-HPLC, чтобы проверить % содержания неправильно свернутых разновидностей, а уровень содержания HCP – с помощью ELISA.

В одном варианте осуществления элюат, полученный из колонки для хроматографии со смешанным режимом, может подвергаться вирусной фильтрации. Вирусную фильтрацию осуществляют с использованием MMC FT с фильтром PALL DV20 при давлении 2-2,5 бар.

В одном варианте осуществления белок, полученный из колонки для хроматографии со смешанным режимом, концентрируют с помощью тангенциальной проточной фильтрации (TFF). TFF может представлять собой мембрану Millipore Biomax 30 кДа, которую используют для замены буфера в буфере для состава, и затем концентрируют представляющий интерес белок до подходящей концентрации.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков с использованием колонки для хроматографии со смешанным режимом, которая может осуществляться на любой стадии после колонки для аффинной хроматографии.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси HCP, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует во второй смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

d) нанесение второй смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок слияния TNFR:Fc практически не содержит примесей HCP, содержащих по меньшей мере один протеолитический фермент.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и по меньшей мере одну примесь HCP, которая содержит протеолитический фермент, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует во второй смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

d) нанесение второй смеси белков на колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием;

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием, где элюированный белок, представляющий интерес, присутствует в третьей смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

f) нанесение третьей смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

g) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок, представляющий интерес, практически не содержит примеси HCP, содержащей по меньшей мере один протеолитический фермент.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и по меньшей мере одну примесь HCP, которая содержит протеолитический фермент, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует во второй смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

d) нанесение второй смеси белков на колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием;

e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием, где элюированный белок слияния TNFR:Fc присутствует в третьей смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

f) нанесение третьей смеси белков на колонку для анионообменной хроматографии;

g) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для анионообменной хроматографии, где элюированный белок, представляющий интерес, присутствует в четвертой смеси белков, содержащей сниженное количество примеси HCP;

h) нанесение четвертой смеси белков на колонку для хроматографии со смешанным режимом;

i) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии со смешанным режимом, где элюированный белок слияния TNFR:Fc практически не содержит примеси HCP, содержащей по меньшей мере один протеолитический фермент.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси HCP, при этом указанный способ включает:

a) получение смеси белков из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего, содержащей белок слияния и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент;

b) нанесение смеси белков на колонку для аффинной хроматографии;

c) применение более чем одной промывки в отношении колонки для аффинной хроматографии;

c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии, где элюированный белок слияния TNFR:Fc содержит сниженное количество примесей HCP по сравнению с осуществлением указанного способа без применения более чем одной промывки в отношении колонки для аффинной хроматографии.

В варианте осуществления очистка белка слияния TNFR:Fc включает в себя хроматографию с белком А в режиме связывания-элюирования, с последующей хроматографией с гидрофобным взаимодействием в режиме связывания-элюирования, с последующей анионообменной хроматографией в режиме связывания-элюирования и последующей хроматографией со смешанным режимом в проточном режиме.

В варианте осуществления условия ионообменной хроматографии (IEC) и HIC близки к физиологическим условиям, которые пригодны для сохранения биологической активности, их комбинации широко используются в разделении биологических продуктов. Колонка для хроматографии со смешанным режимом одновременно включает в себя лиганды, содержащие положительно заряженный фрагмент и гидрофобный фрагмент, где положительно заряженный фрагмент характеризуется анионообменными (IEC) свойствами и гидрофобный фрагмент характеризуется свойствами хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC). Хроматография IEC/HIC со смешанным режимом улучшила разделительную способность и селективность разделения на основе того, что в ней применяются как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия. Хроматографию со смешанным режимом можно выполнять с использованием анионообменной хроматографии и HIC или катионообменной хроматографии и HIC. Стадию хроматографии со смешанным режимом можно выполнять в проточном режиме с использованием доступных для приобретения смол, таких как Capto adhere (N-бензил-N-метилэтаноламин в качестве лиганда), Capto MMC (лиганд MMC), MEP Hypercel (4-меркаптометилпиридин в качестве лиганда), HEA Hypercel (гексиламин в качестве лиганда), PPA Hypercel (фенилпропиламин в качестве лиганда), демонстрирующих несколько функциональных возможностей для взаимодействия. Данные смолы обладают несколькими функциональными возможностями для взаимодействия. Наиболее выраженными являются ионное взаимодействие, образование водородных связей и гидрофобное взаимодействие.

Удаление HCP, содержащего по меньшей мере один из протеолитических ферментов и другие примеси, включающие выщелоченный белок А, агрегаты, фрагменты, эндотоксины, нуклеиновые кислоты и вирусы, из моноклональных антител и белков слияния TNFR:Fc осуществляют с помощью хроматографии со смешанным режимом в проточном режиме, где представляющий интерес белок проходит непосредственно через колонку, тогда как загрязнители/примеси адсорбируются. Данные загрязнители/примеси включают также неправильно свернутые формы представляющего интерес белка из-за их отличий по гидрофобности от представляющего интерес белка.

HCP пытались удалить альтернативным способом, т. e. хроматографией на желатин-сефарозе вместо хроматографии со смешанным режимом, однако на момент настоящего изобретения он нормативно не утвержден.

В одном варианте осуществления остаточные уровни содержания HCP детектировали с помощью более чувствительной желатиновой зимографии. Желатиновая зимография предусматривает гораздо более высокую чувствительность при детектировании определенных протеаз (конкретно, матриксных металлопротеаз, более конкретно желатиназ), которые являются одной из форм HCP, секретируемых в HCCF при осветлении клеточной культуры. Присутствие остаточных протеаз в материале промежуточных стадий очистки видно по положительной желатиназной активности в желатиновой зимографии. Коммерческие наборы для детектирования HCP или специализированные наборы ELISA HCP характеризуются более низкой чувствительностью, обычно приблизительно 1 PPM HCP. Однако желатиновая зимография также имеет ограничения, и при ней можно детектировать протеолитическую активность только выше уровня 0,1 PPM в материале промежуточных стадий очистки или в очищенном белке, представляющем интерес.

В другом варианте осуществления остаточную протеазную активность детектировали в HCCF и после хроматографии с белком A из различных клеточных линий СНО, экспрессирующих белок, представляющий интерес, как это наблюдалось с помощью желатиновой зимографии.

В другом варианте осуществления вводили более чувствительный тест для остаточного содержания HCP с точки зрения протеазной активности для промежуточных стадий очистки с помощью проведения ускоренного исследования расщепления с использованием маркерного белка при температуре инкубации >2ºC (фигура 3).

В другом варианте осуществления в настоящем изобретении существенно снижено содержание примесей HCP, содержащих по меньшей мере один протеолитический фермент, по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 99% и более предпочтительно снижены до степени соответствия допустимому пределу.

В другом варианте осуществления в настоящем изобретении существенно снижено содержание примесей HCP, содержащих по меньшей мере один протеолитический фермент, и белок слияния TNFR:Fc стабилизирован в течение по меньшей мере двух недель, предпочтительно в течение по меньшей мере одного месяца, более предпочтительно в течение по меньшей мере 6 месяцев и более предпочтительно в течение по меньшей мере одного года.

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение и не предназначены для ограничения.

Раздел экспериментов

Этанерцепт использовали в качестве модельного белка слияния TNFR:Fc как пример маркерного белка. Этанерцепт получали с помощью клеточной культуры млекопитающего с использованием клеток CHO, генетически сконструированных с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Клетки CHO культивировали с помощью периодического способа с подпиткой. Этанерцепт получали из различных производственных партий, которые использовали в данных примерах. Эффективность удаления протеаз оценивали с помощью желатиновой зимографии и ускоренного исследования расщепления маркерного белка.

Пример 1

Очистка этанерцепта с использованием хроматографии с белком А

Осветленную собранную культуральную жидкость (HCCF) предварительно обрабатывали с помощью доведения значения pH до 8,2-9,2. Предварительно обработанную HCCF загружали на хроматографическую колонку с белком А (MabSelect Sure LX, GE Healthcare). Колонку предварительно уравновешивали уравновешивающим буфером (50 мM буфер трис-Cl). Промежуточные промывки выполняли промывочным буфером 1 (50 мM трис, 1,5 M мочевина, 1,5% твин 80 и 7,5% изопропанол, 1 M NaCl и 5 мM EDTA, pH 8,5) и промывочным буфером 2 (буфер 50 мM двухводный трехзамещенный цитрат натрия, pH 4,5) и в конечном итоге этанерцепт элюировали в буфере 50 мM двухводный трехзамещенный цитрат натрия, pH 3,5.

Пример 2

Очистка этанерцепта с использованием хроматографии с белком А

Осветленную собранную культуральную жидкость (HCCF) фильтровали через фильтр 0,2 микрона и затем значение pH доводили до 8,5±0,2 с помощью 2 M трис-основания непосредственно перед загрузкой на аффинную колонку. Раствор с доведенным значением pH загружали при 100 см/ч на колонку с белком А (MabSelect Sure LX, GE Healthcare) с высотой слоя 20 см (емкость динамического связывания: не более 17 мг этанерцепта на мл смолы), предварительно уравновешенную уравновешивающим буфером (50 мM буфер трис-Cl, содержащий 150 мM NaCl и 5 мM EDTA, pH 8,5, проводимость: 18±2 мСм/см) для двух объемов колонки. После того, как загрузка заканчивалась, колонку сначала промывали уравновешивающим буфером для 2 объемов колонки, затем буфером A для промежуточной промывки (50 мM трис, 1,5 M мочевина, 1,5% твин 80 и 7,5% изопропанол, 1 M NaCl и 5 мM EDTA, pH 8,5, проводимость: 65±5 мСм/см) для 6 объемов колонки, затем буфером B для промежуточной промывки (50 мM двухводный трехзамещенный цитрат натрия, pH 4,5, проводимость: 12±2 мСм/см) для 1 объема колонки, за которым снова следовал буфер С для последней промежуточной промывки (10% буфер B с буфером 2 для промежуточной промывки) для 1 CV. В заключение, этанерцепт элюировали с помощью комбинации линейного (10-90% элюирующий буфер для 6 CV) и ступенчатого градиента (элюирующий буфер: 50 мM двухводный трехзамещенный цитрат натрия, pH 3,0 и проводимость: 13±2 мСм/см). Элюат собирали по фракциям. Собранные фракции использовали для обработки при низком значении pH. Объединение в пул осуществляли таким образом, что содержание окисленных разновидностей и HCP снижено по меньшей мере на 10% от смеси белков.

Пример 3

Хроматография со смешанным режимом для очистки этанерцепта

В элюированном растворе белка, полученного в результате анионообменной хроматографии, значение pH доводили до 6,5 с помощью 2 M трис-основания. Проводимость раствора доводили до 35 мСм/см с исходным раствором 4 M NaCl. Хроматографию со смешанным режимом осуществляли на смоле Capto Adhere (GE Healthcare) в отрицательном режиме связывания с высотой слоя 18 см. Колонку уравновешивали с помощью 20 мM гидрохлорида гистидина, 240 мM ацетата натрия и 220 мM NaCl, pH 6,5, проводимость: 35±2 мСм/см). Раствор белка загружали на колонку при скорости потока 50 см/ч и фильтрат (FT) собирали по фракциям, поскольку он содержал чистый этанерцепт, тогда как технологические и родственные примеси эффективно связаны с колонкой. Из собранных фракций FT получали искусственный пул. Искусственный пул анализировали с помощью HI-HPLC, чтобы проверить % содержания неправильно свернутых разновидностей, а уровень содержания HCP – с помощью ELISA. На основании отчета по анализу объединение в пул осуществляли таким образом, что содержание неправильно свернутых разновидностей и HCP снижалось по меньшей мере на 10% от смеси белков.

Пример 4

Очистка этанерцепта, полученного в результате хроматографии с белком А без использования смешанного режима

Хроматографию с белком А выполняли без промежуточных промывок. Было обнаружено, что в результате хроматографии с белком А очищалась большая часть HCP, однако некоторое количество HCP по прежнему совместно элюировалось с этанерцептом, как было определено по положительной желатиназной активности в элюате белка А, о чем свидетельствовали наблюдаемые полосы на желатиновой зимограмме, показанной на фигуре 1A.

Смесь белков (вторая смесь белков), полученную из колонки с белком А, дополнительно очищали с помощью хроматографии HIC на колонке. Подготовку загрузки осуществляли постепенным добавлением высоко-солевого буфера (0,05 M безводный двухзамещенный гидрофосфат натрия, 0,8 M двухводный трехзамещенный цитрат натрия, pH 6,5, проводимость: 65±5 мСм/см) к раствору белка до получения проводимости 50±2 мСм/см. Хроматографию с гидрофобным взаимодействием осуществляли на смоле Butyl Toyopearl 650 M с высотой слоя 25±2 см. Колонку уравновешивали уравновешивающим буфером (высоко-солевой буфер, разбавленный WFI таким образом, что проводимость составляла 50±2 мСм/см). Образец белка загружали на колонку при скорости потока 150 см/ч и после загрузки колонку промывали уравновешивающим буфером для 1,5 объемов колонки. Колонку промывали 25% буфером B (буфер B: 0,05 M безводный двухзамещенный гидрофосфат натрия, pH 6,5, проводимость: 8±1 мСм/см) для 6 объемов колонки или до стабилизации оптической плотности, в зависимости от того, какое из вышеуказанных условий возникало первым. Целевой белок элюировали из колонки, обеспечивая ступенчатый градиент 65% B. Элюированный белок (третья смесь белков) собирали по фракциям. Из собранных фракций получали искусственный пул. Искусственный пул анализировали с помощью HI-HPLC, чтобы проверить % содержания неправильно свернутых разновидностей, а уровень содержания HCP – с помощью ELISA.

Элюированный белок, полученный в результате хроматографии с гидрофобным взаимодействием, подвергали диафильтрации через мембрану с отсечением 30 кДа с буфером 20 мM гидрохлорида гистидина, pH 5,5, для шести объемов диафильтрации, или пока pH и проводимость ретентата не достигали соответственно менее 5,8 и 3,0 мСм/см. После этого элюированный белок дополнительно очищали с помощью анионообменной хроматографии.

Анионообменную хроматографию осуществляли на DEAE Sepharose fast flow при высоте слоя 25 см. Колонку уравновешивали уравновешивающим буфером (20 мM гидрохлорид гистидина, pH 5,5, проводимость: 2±1 мСм/см). Раствор белка с замененным буфером загружали на колонку при скорости потока 150 см/ч и колонку промывали уравновешивающим буфером для 2 объемов колонки. Колонку дополнительно промывали буфером для промежуточной промывки (уравновешивающий буфер, содержащий 100 мM ацетата натрия, pH 5,5, проводимость: 8,2±1 мСм/см) для 8 объемов колонки. Целевой белок окончательно элюировали (четвертая смесь белков) элюирующим буфером (уравновешивающий буфер, содержащий 240 мM ацетата натрия, pH 5,5, проводимость: 15±2 мСм/см).

Пример 5

Очистка этанерцепта с помощью нескольких хроматографий на колонках с использованием смешанного режима

Хроматографию на колонке с белком А осуществляли, как описано в примере 1 или примере 2 настоящего изобретения. Это способствовало отделению прочно связанного этанерцепта от HCP. При анализе элюата белка А желатиновая зимография не продемонстрировала никакой желатиназной активности, как показано на фигуре 1B. Однако присутствие следовых количеств HCP (протеазы) в элюате белка А было заметно только при ускоренном исследовании расщепления маркерного белка. Данные, показанные в таблице 1 A (пример 4), демонстрируют степень расщепления (17% при 2-8°C и 51% при 25°C) маркерного белка при ускоренном исследовании. Смесь белков (вторая смесь белков), полученную из колонки с белком А, дополнительно очищали с помощью хроматографии HIC на колонке. Подготовку загрузки осуществляли постепенным добавлением высоко-солевого буфера (0,05 M безводный двухзамещенный гидрофосфат натрия, 0,8 M двухводный трехзамещенный цитрат натрия, pH 6,5, проводимость: 65±5 мСм/см) к раствору белка до получения проводимости 50±2 мСм/см. Хроматографию с гидрофобным взаимодействием осуществляли на смоле Butyl Toyopearl 650 M с высотой слоя 25±2 см. Колонку уравновешивали уравновешивающим буфером (высоко-солевой буфер, разбавленный WFI таким образом, что проводимость составляла 50±2 мСм/см). Образец белка загружали на колонку при скорости потока 150 см/ч и после загрузки колонку промывали уравновешивающим буфером для 1,5 объемов колонки. Колонку промывали 25% буфером B (буфер B: 0,05 M безводный двухзамещенный гидрофосфат натрия, pH 6,5, проводимость: 8±1 мСм/см) для 6 объемов колонки или до стабилизации оптической плотности, в зависимости от того, какое из вышеуказанных условий возникало первым. Целевой белок элюировали из колонки, обеспечивая ступенчатый градиент более чем 45%, предпочтительно 65% B. Элюированный белок (третья смесь белков) собирали по фракциям. Из собранных фракций получали искусственный пул. Искусственный пул анализировали с помощью HI-HPLC, чтобы проверить % содержания неправильно свернутых разновидностей, а уровень содержания HCP – с помощью ELISA. На основании отчета по анализу, объединение в пул осуществляли таким образом, что содержание неправильно свернутых разновидностей и HCP снижалось по меньшей мере на 10% от второй смеси белков.

Анионообменную хроматографию осуществляли на DEAE Sepharose fast flow при высоте слоя 25 см. Колонку уравновешивали уравновешивающим буфером (20 мM гидрохлорид гистидина, pH 5,5, проводимость: 2±1 мСм/см). Третью смесь беков загружали на колонку и промывали уравновешивающим буфером. Колонку дополнительно промывали буфером для промежуточной промывки (уравновешивающий буфер, содержащий 100 мM ацетата натрия, pH 5,5, проводимость: 8,2±1 мСм/см). Целевой белок окончательно элюировали (четвертая смесь белков) элюирующим буфером (уравновешивающий буфер, содержащий 240 мM ацетата натрия, pH 5,5, проводимость: 15±2 мСм/см).

Четвертую элюированную смесь белков дополнительно очищали с помощью хроматографии со смешанным режимом, как описано в примере 2. Ускоренное исследование расщепления показано в таблице 1B и на фигуре 2B.

Таблица 1. SEC-HPLC-анализ маркерного белка для ускоренного исследования расщепления

Хроматография со смешанным режимом дополнительно способствовала удалению этого следового количества протеаз, что указывало на более высокое удаление HCP (более конкретно, удаление протеаз) с помощью данной стадии. В таблице 1B (пример 5) показано отсутствие расщепления маркерного белка при ускоренном исследовании расщепления после инкубирования в течение двух недель.

Таблица 2. Показан профиль чистоты на различных стадиях

ND – не определено

Пример 6

Ускоренное исследование расщепления маркерного белка осуществляли на этанерцепте, очищенном в примере 4 и примере 5 с помощью HPLC или любого подходящего инструмента для детектирования. Образцы, полученные в результате обоих экспериментов, подвергали ускоренному исследованию расщепления в течение периода, достаточного для демонстрации расщепления, обычно в течение 2 недель, и расщепление маркерного белка анализировали с помощью HPLC или любого подходящего инструмента для детектирования. Было обнаружено, что этанерцепт, очищенный в примере 5, не продемонстрировал расщепление маркерного белка, как показано на фигуре 2B, по сравнению с этанерцептом из примера 4, как показано на фигуре 2A, указывая на то, что описанная в примере 5 схема очистки дает более высокую степень удаления HCP, предпочтительно в отношении удаления протеаз, еще более предпочтительно удаления желатиназ.

Из вышеприведенных примеров можно сделать вывод, что при хроматографии со смешанным режимом предлагается стадия очень хорошей промежуточной очистки и/или глубокой очистки для моноклональных антител и белков слияния TNFR:Fc с помощью удаления следовых количеств HCP, которые в противном случае присутствовали бы вместе с представляющим интерес белком при использовании обычных хроматографических способов, в которых хроматография со смешанным режимом не применяется. На последней стадии предлагается робастная платформа для хроматографии для очистки моноклональных антител и белков слияния TNFR:Fc. Лиганды, используемые в таких смолах, например, N-бензил-N-метилэтаноламин, 4-меркаптометилпиридин, гексиламин, фенилпропиламин, проявляют несколько функциональных возможностей для связывания белков хозяина.

Желатиновая зимография:

Зимография известна как электрофоретический метод, обычно на основе электрофореза в додецилсульфат натрия – полиакриламидном геле (SDS-PAGE), который содержит желатин в качестве субстрата, сополимеризованного в матрице полиакриламидного геля, для детектирования протеазной активности или желатиназной активности. Образцы обычно получают с помощью стандартного буфера для обработки SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях, т. е. отсутствии нагрева и восстанавливающего средства [2-меркаптоэтанол, дитиотреитол (DTT)]. После электрофоретического прогона, SDS отмачивают из геля (зимограммы) с помощью инкубации в небуферизованном Triton X-100 с последующей инкубацией в подходящем активационном буфере в течение оптимизированного отрезка времени и при температуре, зависящих от типа анализируемого фермента и типа расщепляемого субстрата. Затем зимограмму окрашивают красителем кумасси и области расщепления различают по зоне очистки на синем фоне. Для конкретного случая протеиназ (желатиназ), желатин является одним из наиболее часто используемых субстратов. В данном случае визуализация протеолитической активности выглядит как чистые полосы на насыщенном синем фоне после окрашивания кумасси.

Ускоренное исследование расщепления:

Ускоренное исследование расщепления выполняли с помощью инкубирования очищенного маркерного белка при 2-8°C, 25°C и 40°C на протяжении двух недель. После инкубации образцы белка анализировали с помощью SE-HPLC для детектирования появления LMW-разновидностей при расщеплении маркерного белка.

Все патентные документы, заявки на патенты и публикации, цитируемые в настоящей заявке, таким образом включены посредством ссылки во всей их полноте для всех целей в той же мере, как если бы каждый отдельный патентный документ, заявка на патент или публикация были таким образом указаны в отдельности.

Хотя некоторые варианты осуществления и примеры были подробно описаны выше, специалист в данной области техники сможет отчетливо понять, что в вариантах осуществления и примерах возможно много модификаций без отступления от их идей.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ очистки белка слияния TNFR:Fc из смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и по меньшей мере одну примесь HCP. Указанный способ включает стадии: a) получение из подходящей экспрессирующей системы млекопитающего смеси белков, содержащей белок слияния TNFR:Fc и примеси в виде белков клетки-хозяина (HCP), которые содержат по меньшей мере один протеолитический фермент; b) нанесение указанной смеси белков на колонку для аффинной хроматографии белка А; c) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для аффинной хроматографии белка А со стадии (b), d) нанесение смеси белков, полученной на стадии (c), на колонку для хроматографии с гидрофобным взаимодействием; e) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для хроматографии с гидрофобным взаимодействием со стадии (d), f) нанесение смеси белков, полученной на стадии (e), на колонку для анионообменной хроматографии; g) элюирование белка слияния TNFR:Fc из колонки для анионообменной хроматографии со стадии (f), h) нанесение смеси белков, полученной на стадии (g), на колонку для хроматографии со смешанным режимом; i) элюирование белка слияния TNFR:Fc в проточном режиме из колонки для хроматографии со смешанным режимом со стадии (h). Изобретение расширяет арсенал способов очистки белка слияния TNFR:Fc. 19 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 6 пр.

Формула