Белок, связывающий инсулин-подобный фактор роста, фармацевтическая композиция - RU2114120C1

Чертежи

Показать все 9 чертежа(ей)

Описание

Изобретение относится к проблемам костного метаболизма, в частности к метаболическим процессам в кости, в которых задействован ранее неизвестный белок, связывающий инсулин-подобный фактор роста (БСИФР). Более конкретно, изобретение относится к БСИФР, полученному из кости человека и обозначенному кч-БСИФР. Данный белок усиливает действие инсулин-подобного фактора роста-II (ИФР-II) на пролиферацию костных клеток.

ИФР-I и ИФР-II - два наиболее часто обнаруживаемые в плазме крови человека фактора роста, составляют семейство полипептидов, которые напоминают по структуре проинсулин и обладают как анаболическим, так и ярко выраженным инсулин-подобным действием на многочисленные ткани (Daughaday, и др., Endocrine Rev., 10:68-91 (1989)). Хотя предыдущие исследования на крысах и мышах придавали особое значение ИФР-I как первостепенному ИФР, поскольку ИФР-II является фетальным гормоном, недавние эксперименты указывают на важную роль ИФР-II в метаболизме костей взрослого человека. Обнаружено, что ИФР-II является наиболее распространенным фактором роста, присутствующим в кости человека, и наиболее распространенным фактором роста, который вырабатывается клетками кости человека. Более того, ИФР-II является одним из немногочисленных факторов роста, обладающих митогенной активностью по отношению к клеткам кости человека. Также установлено, что недавно выделенный ингибирующий БСИФР, названный БСИФР-4, подавляет пролиферацию базальных костных клеток приблизительно на 40% в отсутствие сыворотки крови. На основании указанного можно предположить, что эндогенная выработка ИФР вносит существенный вклад в клеточную пролиферацию при отсутствии дополнительных факторов роста. И, наконец показано, что антитела, блокирующие рецепторы ИФР-II, ингибируют пролиферацию базальных костных клеток, что позволяет рассматривать ИФР-II как ключевой фактор роста костных клеток (Mohan, и др. Growth, Genetics and Hormones, 6:1-9 (1990) и Mohan и др., Clin. Orthopedics & Rel. Res., 263:30-48 (1990)).

Недавно стало ясно, что семейство структурно родственных белков, которые специфически связывают ИФР, участвуют в модуляции действия ИФР на различные ткани. Выделено 4 класса БСИФР человека (обозначены как БСИФР-1, БСИФР-2, БСИФР-3 и БСИФР-4) и предсказана полная последовательность аминокислот данных белков на основе последовательности нуклеотидов в изолированных клонах к-ДНК. (Mohan et al., Clin. Orthopedics & Rel. Res. 263.30-48 (1990); Baxter et al., Prog. Growth Factor Res. 1: 49-68 (1989); Binkert et al., EMBO J. 8: 2497-2502 (1988); Brewer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 152:1289-1297 (1988); Brinkman et al., EMBO J. 7:2417-2423 (1988): Lee et al., Mol. Endocrinol. 2:404-411 (1988); Wood et al., Mol. Endocrinol. 2:1176-1185 (1988); LaTour et al., Mol. Endocrinol. 4:1806-1814 (1990); and Shimosaki, et al., Mol. Endocrinol. 4:1451-1458 (1990).

БСИФР-1 выделен из различных источников, включающих амниотическую жидкость, оболочки плаценты, децидуальную оболочку матки и HEPG2 клетки гепатомы. Была установлена идентичность N-терминальных аминокислотных последовательностей белков БСИФР-1, выделенных из этих различных источников. Сообщается о клонировании и полной последовательности нуклеотидов к-ДНК, кодирующих БСИФР-1, выделенных из клеток HEPG2 и матки человека и содержащихся в библиотеках к-ДНК плаценты человека. БСИФР-2 выделен из кондиционированной среды клеток печени крысы (BRL-3A) и клеток почек крупного рогатого скота Madin-Dacby. Ген, кодирующий БСИФР-1 клонирован из библиотек кДНК BRL3A и клеток печени плода человека. БСИФР-1 обнаружен в сыворотке крови в виде комплекса размером 150 килодальтон (кДа), состоящего из трех компонентов: ИФР-1 или ИФР-2, кислотолабильного гликопротеина размером около 85 кДа и молекулы БСИФР-3, представляющей собой кислотостабильный гликопротеин размером 53 кДа.

БСИФР-3 выделен в очищенной форме из сыворотки человека; сообщается о клонировании и определении последовательности нуклеотидов к-ДНК данного белка. БСИФР-4 выделен из кондиционированной среды костных клеток человека как ингибиторный БСИФР, а также из сыворотки крови крысы. Недавно сообщалось о клонировании и определении последовательности нуклеотидов клона к-ДНК БСИФР-4, полученного из библиотек к-ДНК костных клеток человека и к-ДНК печени. В дополнение к указанным четырем классам БСИФР, Martin и др., J. Biol. Chem. 265: 4124-4130 (1990), Roghani и др., FEBS Lett. 255:253-258 (1989), и Zapf и др. , J. Biol. Chem., 265:14892-14898 (1990) сообщают о частичной очистке БСИФР, выделенных из спиномозговой жидкости человека из питательной среды, кондиционированной трансформированными фибробластами AG 2804 а также из гипогликемической сыворотки соответственно, которые проявляют более сильное сродство к ИФР-2 по сравнению с ИФР-1.

Таким образом, описаны многочисленные БСИФР, которые получены из различных источников, обнаруживают несопоставимую связывающую активность по отношению к ИФР и проявляют различные биологические свойства. Например, БСИФР-1, БСИФР-3 и БСИФР-4 связывают как ИФР-I, так и ИФР-II почти в одинаковой степени, в то время как БСИФР-2 и БСИФР, выделенные из амниотической жидкости, фибробластов и сыворотки крови человека, связывают ИФР-II с большим сродством, чем ИФР-I. Указанный аналог можно считать ближайшим аналогом изобретения. Показано, что БСИФР-3 может ингибировать или стимулировать воздействие ИФР-I на фибробласты, в зависимости от условий культивирования (De Mellow et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 156:199-204 (1988)). В противоположность БСИФР-1 и БСИФР-3, БСИФР-4, как было установлено, только ингибирует активность ИФР-I и ИФР-II при их воздействии на костные клетки (Mohan и др. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:8338-8342 (1989)). Исследования также показывают, что выработка различных БСИФР модулируется определенным образом, специфичным для ткани. Например, образование БСИФР-1 модулируется инсулином, в то время как выработка БСИФР-3 модулируется гормоном роста (Baxter и др., Prog. Growth Factor Res., 1:49-68) (1989)). Таким образом, многообразие различных БСИФР в сочетании с их индивидуальной регуляцией может служить причиной того, что активность ИФР модулируется местным, специфичным для ткани образом.

Существует необходимость исследования взаимосвязи функции ИФР-I и ИФР-II в процессах костного метаболизма, осуществляемых посредством БСИФР и, следовательно, необходимость идентификации БСИФР, вырабатываемых костными клетками и содержащихся в матриксе костей человека. Такие БСИФР, вероятно, участвуют в метаболизме кости и могут быть использованы в клинических исследованиях при диагностике нарушений метаболизма костной ткани. БСИФР, усиливающие ИФР-зависимый рост костей, могут быть, в частности полезными для терапевтического применения при лечении нарушений костного метаболизма, таких как остеопороз.

Изобретение относится к белку, связывающему инсулин-подобный фактор роста, который выделен из кости человека (кч-БСИФР).

Данный белок имеет мол. массу, равную 20 кДа, он связывает гидроксиапатит в присутствии 4Н гуанидин HCl. кч-БСИФР связывает инсулин-подобный фактор роста I в пределах 10^-8 - 10^-10 М, а инсулин-подобный фактор роста II в пределах 10^-9 - 10^-11 М. N-концевая аминокислотная последовательность данного белка имеет следующую структуру: лей-гли-фен-фен-вал-X-вал-глу-про-асп-асп-лиз-ала-ала-лей, где X не определен.

Кч-БСИФР действует как синергист с ИФР-II, усиливая ИФР-II-опосредованную пролиферацию клеток при условиях одновременного действия ИФР-II и БСИФР. Способность кч-БСИФР связывать гидроксиапатит позволяет использовать его в качестве эффективного лекарственного средства при заболеваниях костной ткани, например, остеопорозе или остеосаркоме. Кроме того, данный белок можно успешно использовать при переломах костей, для заживления ран, восстановления целостности кожи, в качестве диагностического реагента и т.д. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей кч-БСИФР и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может дополнительно содержать ИФР-I или ИФР-II.

На фиг. 1 дано сравнение N-терминальной аминокислотной последовательности заявленного кч-БСИФР с таковыми других известных БСИФР. Последовательности расположены таким образом, чтобы выявить максимальное сходство, где
кч-БСИФР лей-гли-фен-фен-вал-X-вал-глу-про-асп-асп-лиз-ала-ала-лей
ч-БСИФР-1 ала-про-W-Q-цис-ала-про-цис-сер-ала-глу-лиз-лей-ала
ч-БСИФР-2 глу-вал-лей-фен-R-цис-про-про-цис-T-про-глу-R-лей-ала
ч-БСИФР-3 гли-ала-сер-сер-гли-гли-лей-гли-про-вал-вал-R-цис-глу-про-цис-асп-асп-R- ала-лей-ала
ч-БСИФР-4 асп-глу-ала-илей-гис-цис-про-про-цис-сер-глу-глу-лиз-лей-ала
спиномозговая жидкость лей-ала-про-гли-X-гли-Q-гли-вал-Q-вал-гли-ала-про-гли
фибробласты CM R-ала-про-гли-цис-гли-Q-гли-вал-Q-ала-гли
сыворотка человека ала-ала-про-гли-X-гли-Q-гли-вал-Q-ала-гли-цис-про-гли
На фиг. 2 показаны сравнительные кривые связывания кч-БСИФР. Образец исследовался на предмет выявления белок-связывающей активности с использованием меченого ИФР-II в присутствии или отсутствии немеченого ИФР-I и ИФР-II.

На фиг. 3 изображен: А белковый профиль; B - характеристики активности БСИФР из экстракта кости человека, полученные при хроматографическом исследовании (FPLC) на колонке Мопо Q.

Аликвоты гидроксиапатитсвязывающей фракции объемом 50 мл наносят на аффинную колонку с ИФР-II. Полученные три пограничные фракции собирают и пропускают через анионообменную колонку Мопо Q. Профиль элюции белка измеряют по поглощению при 280 нм. Собирают 2 мл - фракции в течение 2 мин. Аликвоты фракций разводят в 10 раз и изучают белок-связывающую активность. Активность БСИФР выражают количественно по специфическому связыванию меченого ИФР-II.

Изобретение относится к выделенному и очищенному БСИФР из кости человека, который специфически связывает ИФР-II в большей степени, чем ИФР-I. Указанный белок может быть получен в гомогенном состоянии из белковых экстрактов, препаратов кости человека, из кондиционированной среды костных клеток человека, или из сыворотки крови человека. Предпочтительная степень очистки белка составляет, по крайней мере 50%, более предпочтительная - до 70 - 80% и наиболее предпочтительная - до 95-99% и более, особенно при фармацевтическом применении. Очищенный частично или до состояния гомогенности БСИФР может использоваться как диагностическое средство, терапевтический препарат, иммуноген и т.д.

Кч-БСИФР, полученный в соответствии с настоящим изобретением, может быть очищен с помощью хроматографии на колонке с гидроксиапатитом, с последующей хроматографией по сродству на колонке с ИФР-II, и, наконец, дополнительно очищен с помощью хроматографической анионообменной колонки Мопо Q (система FPLC). Гомогенность очищенного белка подтверждается например, его миграцией в виде единой полосы при осуществлении SDS - PAGE (SDS - PAGE - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и получением одной аминокислотной последовательности при использовании метода анализа N-терминальных последовательностей. В процессе очистки может быть также применена хроматография по сродству на колонке с антителами к кч-БСИФР. Добавочную очистку можно осуществить каким-либо химическим способом, например жидкостной хроматографией, градиентным центрифугированием, электрофорезом в геле и т.д.

Специфическое связывание кч-БСИФР с ИФР-II и ИФР-I демонстрируется с помощью реакции преципитации при использовании полиэтиленгликоля. В этой точки зрения очищенный белок может оказаться полезным для изучения структуры и функции детерминант ИФР, обуславливающих их связывание со специфическими рецепторами, а также с кч-БСИФР.

Полученный согласно изобретению в очищенной форме БСИФР является уникальным и отличается от ранее идентифицированных БСИФР. БСИФР-1, БСИФР-2, БСИФР-3 и БСИФР-4 человека характеризуются аминокислотными последовательностями, которые были опубликованы и которые отличаются от аминокислотной последовательности кч-БСИФР. N-терминальная аминокислотная последовательность БСИФР, выделенного из спиномозговой жидкости, из кондиционированной среды фибробластов, и из сыворотки крови человека, также отличается от таковой для кч-БСИФР.

Полученный в гомогенной форме БСИФР характеризуется N-терминальной аминокислотной последовательностью (фиг. 1). При этом указанная последовательность может содержать консервативные аминокислотные замены, вставки или делеции, которые не влияют на способность кч-БСИФР связывать ИФР-I или ИФР-II и другие его функции.

Полученный согласно настоящему изобретению кч-БСИФР связывает ИФР-II с большим сродством, чем ИФР-I. На фиг. 2 приведены кривые конкурентного связывания кч-БСИФР, меченного¹²⁵I, с ИФР-II в качестве лиганда при использовании ИФР-I и ИФР-II в качестве конкурентов. Для замещения 50% [¹²⁵I] ИФР -II из БСИФР требуется около 10 нг/мл ИФР-I и 1 нг/мл ИФР-II. Это свидетельствует о том, что ИФР-II в 10 раз более активен, чем ИФР-I при вытеснении метки. Когда в качестве радиоактивной метки используется [¹²⁵I] ИФР-I, ИФР-II все равно более активен (в 4 раза) в вытеснении метки, чем ИФР-I. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что БСИФР связывает ИФР-II с большим сродством, чем ИФР-I. Обычно связывающая активность кч-БСИФР по отношению к ИФР-II составляет около 10^-9 - 10^-12 М, наиболее вероятно 10^-10 - 10^-11 М, в то время как связывающая активность данного белка по отношению к ИФР-I примерно в 10 раз меньше и составляет около 10^-8 - 10^-10 М. Избирательное сродство кч-БСИФР к ИФР-II объясняет тот факт, что в кости человека ИФР-II содержится в 10-15 раз больше, чем ИФР-I.

Z Сродство кч-БСИФР к гидроксиапатиту составляет 10^-9 - 10^-11 М. Данный белок связывает гидроксиапатит даже в присутствии сильных денатурирующих агентов, таких как 4М гуанидин-HCl, в то время как очищенный ИФР-II не связывает гидроксиапатит.

Для получения фармацевтической композиции используют кч-БСИФР, дополнительно ИФР-II и фармацевтически приемлемый носитель. Можно использовать водные носители, например воду, в чистом виде или водный буферный раствор, 0,4%-ный раствор NaCl, 0,3%-ный глицин и т.д. Композиции стерилизуют с помощью хорошо известных методов; они могут содержать дополнительные фармацевтически приемлемые вещества, если это необходимо для улучшения физиологических свойств композиции, такие как агенты, регулирующие pH и токсичность и т.д., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и др. Концентрация кч-БСИФР и кч-БСИФР /ИФР-II в фармацевтических препаратах может широко варьировать, например, от менее чем 0,00001%, обычно от 0,001, до 0,05 - 0,1% по весу; концентрации должны подбираться, прежде всего, в зависимости от объема жидкости, вязкости и т.д., в соответствии с выбранным конкретным способом введения препаратов, с состояниями, подвергаемыми лечению (например, заживление переломов, остеопороз, заживление хирургических и травматических ран, опухоли, такие как остеосаркома или карцинома грудной железы и т.д.), а также в зависимости от возраста больного (взрослый, ребенок или новорожденный).

Так, типичная фармацевтическая композиция для внутривенного вливания при лечении взрослых, страдающих от остеодегенеративных заболеваний умеренной тяжести, может содержать 250 мл стерильного раствора Рингера и от 50 мг до 5 г кч-БСИФР или комплекса кч-БСИФР/ИФР-II. Способы приготовления препарата для парентерального или орального введения хорошо известны специалистам в данной области исследований.

Композиции, содержащие полученный кч-БСИФР или комплекс кч-БСИФР/ИФР-II или их смеси, могут применяться в профилактических и/или терапевтических целях. При терапевтическом применении композиции вводятся больному, страдающему от заболевания, ассоциированного кч-БСИФР или ИФР-II, в количествах, достаточных для лечения или, по крайней мере, частичной остановки развития процесса и его осложнений. Количество препарата, адекватное для достижения этих целей, определяется как "терапевтически эффективная доза", которая зависит от типа заболевания, (остеопороз, перелом, рана, опухоль и т.д.), от его тяжести, возраста больного и общего состояния здоровья. Обычно терапевтически эффективная доза составляет около 1,0-500 мкг кч-БСИФР или кч-БСИФР/ИФР-II на килограмм веса тела за час инфузии, наиболее часто от 10 до 50 мкг кч-БСИФР или комплекса кч-БСИФР/ИФР-II на килограмм веса тела за час инфузии. Иногда желательно использовать фармацевтические композиции с избытком активного вещества.

В профилактических целях композиции, содержащие заявленный кч-БСИФР или комплекс кч-БСИФР/ИФР-II или их смеси, вводятся пациенту для повышения резистентности к определенным заболеваниям. Количество препарата в этом случае определяется как "профилактически эффективная доза", которая опять-таки зависит от состояния здоровья пациента и т.д., но в основном, варьируют в пределах от 1 до 500 мкг на килограмм веса тела за час инфузии, чаще в пределах от 10 до 50 мкг на килограмм веса тела за час инфузии. Предпочтительно профилактические дозы используются для предупреждения развития остеодегенеративных заболеваниях.

Способ введения препаратов, эффективные дозы, множественность инъекций определяются лечащим врачом. В любом случае, фармацевтические препараты должны обеспечить такую дозу кч-БСИФР или комплекса кч-БСИФР/ИФР-II, которой достаточно для лечения больного.

Полученный согласно изобретению кч-БСИФР эффективно стимулирует пролиферацию костных клеток в ответ на ИФР-II. Экзогенное добавление ИФР-II к клеткам кости в отсутствии сыворотки увеличивает их пролиферацию. Указанный пролиферативный эффект ИФР-II усиливается добавлением кч-БСИФР в комплексе с ИФР-II. Данное синергическое действие комбинации кч-БСИФР и ИФР-II, большее, чем суммарный эффект, определяемый при сложении результатов применения каждого из агентов индивидуально, ранее не был описан для других БСИФР по отношению к любым типам клеток. Таким образом, изобретение обеспечивает возможность получения терапевтического средства для лечения поражений костной ткани (например, остеопороза), при которых ослаблены процессы формирования кости. Фармацевтические композиции будут включать кч-БСИФР и, при необходимости, ИФР, в физиологически приемлемых носителях и/или наполнителях.

Полученный согласно изобретению кч-БСИФР можно использовать для лечения любых ран и заживления кожи, поскольку данный белок увеличивает время полужизни ИФР путем защиты их от действия протеолитических ферментов, способен избирательно направлять транспорт БСИФР в костную ткань и/или усиливать ее пролиферацию.

Комплексы кч-БСИФР/ИФР можно приготовить различными способами, например, инкубацией растворов очищенных ИФР и кч-БСИФР определенных концентраций при нейтральном pH в течение ночи, предшествующей применению препарата. Концентрации кч-БСИФР и ИФР в композициях могут широко варьировать, но предпочтительно должны быть эквимолярными. Приготовленные отдельно препараты кч-БСИФР, могут применяться индивидуально или одновременно с композициями ИФР-II. При раздельном введении желательно первым вводить кч-БСИФР, а вслед за ним ИФР-II. Подобные композиции можно вводить местно, чтобы стимулировать образование кости в определенном участке (например, для заживления перелома) или системно, чтобы усилить общие процессы образования кости при лечении таких заболеваний как остеопороз.

Пример 1. Приготовление экстракта из кости человека для выделения кч-БСИФР
Головки бедренных костей человека, полученные при тотальных ампутациях, хранятся при температуре -20^oC до момента использования. Кости разрезают с помощью пилы для разрезания гипсовых повязок и измельчают в мельнице для последующей экстракции кч-БСИФР. Костные белки извлекают путем деминерализации порошка из головок бедренных костей 10% этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) в присутствии 4М гуанидин-HCl и ингибиторов протеаз (гуанидин-ЭДТА экстракт) после первоначальной экстракции водой и 4М гуанидин-HCl, как описано Mohan et al., (Biochem Biophys. Acta 884:234-242 (1986). Гуанидин-ЭДТА экстракт затем концентрируют с помощью мембраны Amicon УМ5 (через мембрану проходят соединения с мол.массой менее 5 кДа) и используют для очистки кч-ИФРСБ.

Пример 2. Очистка и характеристика кч-ИФРСБ из экстракта кости человека
Экстракт из костей человека подвергают гидроксиапатитной (НА) хроматографии в 4М гуанидин-HCl, как описано Mohan et al., (см. выше). Аффинную колонку с ИФР-II готовят связыванием 250 мкг ИФР-II, выделенного из кости человека, с гранулами Сефарозы 4В, активированной бромистым цианом. Пул связанных HA фракций концентрируют с помощью мембраны Amicon YM5 до 300 мл и вновь подвергают диализу против 20-кратного объема буфера на основе фосфата калия (10 мМ фосфат калия, pH 6,0) содержащего ингибиторы протеаз (100 мМ эпсилон-аминокапроновой кислоты, 5 мМ бензамидина, 1 мМ фенилметилсульфонил фторида). Аффинную колонку с ИФР-II уравновешивают фосфатом калия, после чего на колонку наслаивают 50 мл-аликвоту (приблизительно 3 - 4 мг общего белка/мл) диализованной фракции, связывающей HA. Колонку затем интенсивно промывают буфером, содержащим фосфат калия, до полного удаления несвязанных белков. Связанные белки элюируют с помощью 20 - 25 мл 30 мМ трис-ацетата (pH 7,2)/ 4М гуанидин-HCl. Полученную фракцию концентрируют с помощью мембраны Amicon YM5 и затем диализуют в 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) буфере. Полученную после диализа фракцию пропускают через анионообменную колонку FHARMAClA FPLC Мопо Q предварительно уравновешенную трис-HCl буфером. Связанные белки элюируют линейным градиентом 0-1 М NaCl в 20 мМ трис-HCl буфере в течение 100 мин.

Активность кч-БСИФР определяют методом преципитации в полиэтиленгликоле. Вкратце, 50 мкл, образца, подвергаемого исследованию, инкубируют с 25000 - 50000 cpm меченного¹²⁵I ИФР-I или ИФР-II в течение 60 мин при комнатной температуре в 250 мкл раствора следующего состава: 0,1 М HEPES /0,1% альбумин бычьей сыворотки /0,1% Тритон Х100 /44 мМ Na₂CO₃ / Na₂N₃, pH 6,0. К указанной смеси добавляют 100 мкл 2%-ного сывороточного иммуноглобулина и 500 мкл 25%-ного полиэтиленгликоля, после чего смесь центрифугируют. При этих условиях полиэтиленгликоль осаждает большую часть комплекса ИФР-I или ИФР-II и кч-БСИФР, но не осаждает несвязанные ИФР-I или ИФР-II. Затем подсчитывают количество¹²⁵I-ИФР-II в преципитате. Неспецифическое связывание определяют исследованием в присутствии избытка немеченого ИФР-I или ИФР-II и количество¹²⁵I-ИФР-I или¹²⁵ I-ИФР-II в преципитате вычитают из значения, полученного как указано выше. Для определения молекулярной массы кч-БСИФР используют метод блоттинга с лигандом с применением в качестве радиоактивного изотопа¹²⁵I (¹²⁵I-ИФР-II). При этом 50 мкл образца подвергают электрофорезу в пластинках 3 - 27% полиакриламидного геля заводского изготовления. После переноса образцов посредством электроблоттинга на нитроцеллюлозную мембрану, последнюю инкубируют с меченным радиоактивным изотопом ИФР-II. После отмывания несвязанного меченого ИФР-II мембрану подвергают ауторадиографии.

Аминокислотный состав образцов устанавливают с помощью анализатора модели 420 Applied Biosystems, a N-терминальную последовательность определяют при использовании секвенсера белков той же фирмы.

На фиг. 3 показаны профили белка и активность БСИФР в афинной связанной фракции, полученные при хроматографии на колонке Мопо Q. На участке элюции аутентичного БСИФР-4 не наблюдается пика абсорбции белка, а также пика активности БСИФР (9-15 фракции, 0,1 М NaCl), что свидетельствует о том, что выделенный из кости БСИФР не является БСИФР-4. Тем не менее, обнаруживаются четыре пика абсорбции белка при различных концентрациях NaCl. Из этих четырех пиков первые два (A и B) содержат значительную активность БСИФР, в то время как два последних пика (C и D) обнаруживают малую активность БСИФР.

Для определения молекулярных масс БСИФР, содержащихся в экстракте из кости человека, используют методы блоттинга с лигандом и мечение ИФР-II радиоактивным изотопом¹²⁵I. При этом HA-связанные, ИФР-II-связанные и белковые пики, полученные на колонке Мопо Q, подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, переносят на нитроцеллюлозные фильтры и тестируют с помощью радиоактивно меченного (¹²⁵I) ИФР-II. Большая часть БСИФР, присутствующих в HA-связанных с ИФР-II-связанных фракциях, имеет молекулярную массу 29 кДа. Кроме того в этих фракциях обнаруживается широкая менее интенсивная полоса между маркерами с молекулярными массами 68 и 43 кДа. Большую часть БСИФР с молекулярной массой 29 кДа отделяют от БСИФР с большей молекулярной массой путем хроматографии на колонке Мопо Q. Мопо Q пик A обнаруживает большую полосу с мол. массой 29 кДа и меньшую полосу с мол. массой 24 кДа. Мопо Q пик B обнаруживает широкую диффузную полосу между маркерами мол. массой 68 и 43 кДа и меньшую полосу с мол. массой 29 кДа. Мопо Q пик C (основной пик абсорбции белка) и пик D обнаруживает только слабую полосу с мол. массой 29 кДа. Полученные данные означают, что большая часть БСИФР в экстракте кости человека имеет мол. массу 29 кДа.

Аминокислотый состав и N-концевая аминокислотная последовательность БСИФР в пике A Мопо Q мол. мас. 29 кДа уникальны и имеют ограниченное сходство с другими известными БСИФР (табл. 1 и фиг. 1).

Фрагменты мембраны "иммобилон" диаметром 10 мм пропитывают метанолом, помещают в фильтрационную установку Millipore и укрепляют на месте резиновыми кольцами. После отмывания мембраны водой, СБ в пике A фиксируют на мембране посредством фильтрования через нее 1 мл пика A. Половину мембраны используют для изучения аминокислотного состава.

50 пмоль кч-БСИФР используют для N-концевого аминокислотного анализа. Комбинированная средняя повторяемость составляет 86,3%. X - неизвестен (табл. 2).

Таким образом, БСИФР размером 29 кДа был определен как БСИФР, полученный из кости человека (кч-БСИФР). В добавление к основной последовательности (лей-гли-фен-фен-вал-X-вал-глу-про-асп-асп-лиз-ала-ала-лей) получены данные, свидетельствующие о присутствии в Мопо Q пике A дополнительной последовательности, в которой недостает одной или двух аминокислот. Выделенный кч-БСИФР чувствителен к протеолитическому расщеплению, поскольку выдерживание полученного 29 кДа БСИФР при 5^oC в течение ночи приводит к исчезновению полосы размером 29 кДа и появлению основной полосы размером 24 кДа и нескольких низкомолекулярных малых полос. Согласно N-концевому анализу последовательности полосы размером 24 кДа, полученная последовательность (лей-гли-фен-X-вал-X-X-глу-про-X-X-лиз) подобна таковой БСИФР мол. массы 29 кДа. Дальнейшее выдерживание 24 кДа БСИФР приводит к исчезновению соответствующей полосы и появлению нескольких низкомолекулярных белковых полос, обладающих небольшой активностью БСИФР, как показывает блот-анализ с лигандом. Недавно появилось сообщение о протеазах, связанных с БСИФР, что согласуется с результатами настоящих исследований.

Мопо Q пик B имеет другой аминокислотный состав и не усиливает действия ИФР-II на клетки кости. Попытки установить аминокислотную последовательность пика B оказались безуспешными. Определение этой последовательности в первых нескольких циклах основного белкового пика (фракция 45, пик C) выявляет многочисленнные аминокислоты с нечитаемой последовательностью. Таким образом, Мопо Q пики C и D, обладающие незначительной активностью БСИФР, могут представлять собой продукты распада БСИФР мол. массы 29 кДа.

Поскольку N-концевая последовательность очищенного кч-БСИФР в пике Мопо Q обнаруживалась в дополнение к основной последовательности, и в дополнительных последовательностях были утрачены одна или две аминокислоты (возможно, благодаря параллельному выделению БСИФР-протеазы, расщепляющей этот БСИФР), и поскольку не были выделены остатки цистеина, валин в положении 7 последовательности заявленного кч-БСИФР и аспаргиновая кислота в положении 10 могут быть остатками цистеина (остатки цистеина характерны для различных представителей семейства БСИФР). Выдерживание очищенного БСИФР Мопо Q, выделенного из кости человека, при 5^oC приводит к исчезновению полосы БСИФР размером 29 кДа и появлению БСИФР, обладающих меньшей молекулярной массой, при осуществлении SDS -PAGE. При определении последовательности БСИФР с меньшей молекулярной массой валин и аспаргиновая кислота в положениях 7 и 10 соответственно не обнаруживаются. Эти исследования позволяют предположить, что кч-БСИФР может иметь одну из следующих последовательностей: лей-гли-фен-фен-вал-X-цис-глу-про-цис-асп-лиз-ала-ала-лей. Альтернативная последовательность, полученная с учетом приведенных выше соображений может быть такой: лей-гли-сер-фен-вал-гис-цис-глу-про-цис-асп-глу-лиз-ала-лей; эта последовательность сходна с последовательностью СБ-5, опубликованной Kiefer et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 176:219-225 (1991), Shimasaki et al., J. Biol Chem. 266: 10646-10653 (1991), и раскрытой Drop. Endocrinol. 130:1736-1737 (1992). Последовательность может подвергаться различным изменениям, основанным на естественных или искусственно внедренных заменах, добавлениях или делециях, эти варианты последовательности могут быть аллельными вариантами или полученными с помощью специальных методик, примененных в описанных исследованиях. В дальнейшем, N-терминальная последовательность позволит конструировать вырожденные олигонуклеотидные пробы для клонирования гена, кодирующего заявленный кч-БСИФР.

Пример 3. Применение кч-БСИФР для исследования пролиферации костных клеток
При изучении пролиферации костных клеток, опосредованной в бессывороточной культуральной среде (Mohan et al., Biochem. Biophys. Acta, 884:234-242 (1986) измеряют включение (³H-тимидина в клеточный материал, осаждаемый трихлоруксусной кислотой. Исследование проводят при использовании мышиных остеобластов линии МС3Т3-Е1. Приблизительно 10000 клеток на ячейку в бессывороточной среде Игла, модифицированной Дульбекко, помещают в 48-луночные панели и используют для анализа включения (³H) тимидиновой пробы, как это описано Mohan et al., (см. выше).

Результаты экспериментов показывают, что кч-БСИФР сам по себе обладает небольшой митогенной активностью, что подтверждается включением (³H)-тимидина в макромолекулы, нерастворимые в трихлоруксусной кислоте (табл. 3). Однако, когда кч-БСИФР добавляют с субмаксимальными концентрациями ИФР-II к культурам костных клеток мыши, не содержащим сыворотки, он усиливает пролиферативное действие ИФР-II. Показано, что ИФРСБ-3 усиливает действие ИФР-I только в том случае, когда добавляют в культуры за несколько часов до внесения ИФР-I (Mohan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:8338-8342 (1989) и De Mellow et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 156:199-204 (1988) и никакие другие БСИФР не усиливают действия ИФР, когда ИФР и БСИФР вносят в культуры одновременно. Эти результаты позволяют предположить, что БСИФР не просто пассивный носитель ИФР, но также позитивно регулирует действие ИФР. Хотя механизм (или механизмы), посредством которого кч-БСИФР усиливает включение (³H) тимидина, под действием ИФР-II, не известен (не известны), предложено несколько моделей, объясняющих данный факт. Например, кч-БСИФР наводит ИФР-II на клеточную мембрану для облегчения доступа ИФР-II к соответствующему рецептору (возможно посредством последовательности RGD, как в случае БСИФР-1). Или же кч-БСИФР увеличивает сродство ИФР-II к рецептору посредством его связывания с ИФР-II и/или увеличивает период полужизни ИФР-II, защищая его от протеаз.

Не содержащие сыворотки культуры мышиных остеобластов линии МС3Т3 инкубируют в течение 18 ч с эффекторами до внесения (³H)-тимидина. Конечные концентрации ИФР-II и кч-БСИФР составляют 3 и 10 нг/мл соответственно. Данные табл. 3 - среднее арифметическое ± допустимое отклонение шести повторных экспериментов (одинаковые лунки). Включение (³H) тимидина в контрольных культурах, обработанных бычьим сывороточным альбумином (БСА), составляет 1404±217, 237±53 и 730± 91 соответственно в трех экспериментах.

Пример 4. Выделение кч-БСИФР из кондиционированной среды костных клеток
Поскольку костные клетки в культуре продуцируют кч-БСИФР, бессывороточную кондиционированную среду костных клеток, можно использовать для выделения БСИФР. Вкратце, кондиционированную среду костных клеток концентрируют с помощью системы Amicon с применением УM5 (отсеиваются фракции мол. массой 5 кДа), подкисляют уксусной кислотой до конечной концентрации 1М и подвергают гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-100 для отделения ИФР от БСИФР. Белки элюируют 1 М уксусной кислотой. Фракции, содержащие БСИФР, собирают, лиофилизируют, восстанавливают фосфатным буферным раствором и пропускают через аффинную колонку с ИФР-II. Связанные белки затем подвергают анионообменной хроматографии (FPLC Мопо Q) для отделения кч-БСИФР от остальных БСИФР.

Пример 5. Количественный диагностический анализ содержания кч-БСИФР
Кч-БСИФР, выделенный из кости человека или полученный рекомбинантным путем, используют для получения поликлональных или моноклональных антител, которые затем применяются для количественного диагностического анализа содержания кч-БСИФР. Вкратце, кч-БСИФР смешивают с полным адъювантом Фрейнда и вводят кроликам, морским свинкам, крысам или мышам с последующим наблюдением за выработкой антител. Позже животным вводят кч-БСИФР, смешанный с неполным адьювантом Фрейнда, каждые 3 - 4 недели. Для получения поликлональной антисыворотки у животных отбирают кровь после 3-4 инъекций, и определяют титр антител к кч-БСИФР радиоиммуноанализом или другими методами. Моноклональные антитела вырабатываются культурами клеток, продуцирующими антитела, полученными от иммунизированных животных при помощи хорошо известных методик. Очищенный кч-БСИФР метят радиоактивным изотопом и используют в качестве сигнального радиоактивного соединения. Моноклональные антитела или антисыворотку с высоким титром затем используют в радиоиммунологическом определении кч-БСИФР в сыворотке, моче и других биологических жидкостях.

В целом, выработка кч-БСИФР усиливается после обработки костных клеток агентами, повышающими пролиферацию костных клеток. Таким образом, кч-БСИФР может применяться как диагностический маркер болезненных состояний, связанных с нарушением пролиферации костных клеток, таких как остеопороз. Соответственно, низкий уровень кч-БСИФР в сыворотке свидетельствует об остеопорозе, связанном с пониженным образованием костной ткани. Поскольку кч-БСИФР усиливает действие ИФР-II, высокое содержание его в сыворотке может быть связано с некоторыми видами рака.

Пример 6. Кч-БСИФР фиксирует ИФР-II в кости
Кость человека содержит относительно большое количество ИФР-II. Однако, как показано в табл. 4, ИФР-II, меченный¹²⁵I, сам по себе не связывается специфическим образом с гидроксиапатитом (табл. 4 демонстрирует лишь неспецифическое связывание, которое составляет менее 10% общего количества связанной метки) или коллагеном. В противоположность ИФР-II, меченный кч-БСИФР обнаруживает специфическое связывание с гидроксиапатитом. Связывание кч-БСИФР с гидроксиапатитом является специфическим, поскольку основной сывороточный связывающий белок, т. е. БСИФР-3, не обладает подобной активностью, и кч-БСИФР не связывается с коллагеном, другим составным компонентом кости. Кроме того, связывание кч-БСИФР с гидроксиапатитом является прочным, обработка 4 М гуанидином-HCl приводит к диссоциации комплекса кч-БСИФР-гидроксиапатит (4 М гуанидин-HCl, как было показано, вызывает диссоциацию комплекса антиген - антитело). Преинкубация меченного ИФР-II с кч-БСИФР до переноса на гидроксиапатитную колонку значительно увеличивала его связывание с последней. Это свойство кч-БСИФР облегчать присоединение ИФР-II к гидроксиапатиту является специфическим, в то время как ИФРСБ-3 не обладает таким свойством. Приведенные результаты согласуются с заключением, что при нормальных условиях ИФР-II фиксируется в кости с помощью кч-БСИФР.

Пример 7. Регуляция выработки БСИФР клетками кости человека in vitro
Чтобы определить, вырабатывают ли костные клетки человека кч-БСИФР in vitro, Нозерн-блоты общей фракции РНК, экстрагированной из бессывороточных культур MG63, TE85, TE89, SaO₃1 и U2 клеток отеосаркомы человека, гибридизуют с помощью олигонуклеотидной пробы K/N-концевой последовательности кч-БСИФР и с помощью пробы к-ДНК, кодирующей БСИФР-5 (Д-р Shimasaki, La Jolla, CA).

Эти исследования показали, что у всех тестированных клеточных линий экспрессируется м-РНК кч-БСИФР. Согласно Вестерн-блоттингу с лигандом, ИФР-I и ИФР-II увеличивают образование кч-БСИФР в клетках U2. Биологическое изучение кч-БСИФР показывает, что этот белок усиливает пролиферативное действие ИФР-II на костные клетки.

Сообщалось о стимулирующем действии прогестерона на пролиферацию остеобластов человека и образование ИФР-II in vitro. В настоящем эксперименте действие прогестерона на другие компоненты ИФР-регуляторной системы (ИФР-I, БСИФР и ИФР-рецепторы) изучалось на остеобластоподобных клетках остеосаркомы человека линии MG63. Во всех экспериментах клетки MG63 помещали в среду DMEM, содержащую 1% сыворотки теленка, с плотностью 7500 клеток/см². После инкубации в течение ночи, среду заменяли на бессывороточную, до внесения в нее прогестерона или растворителя (этанола). В ходе эксперимента клетки поочередно инкубировали с 100 нМ прогестерона в течение 0,5; 2; 4 и 6 ч. Нозерн-блоттинг обнаружил повышение уровня м-РНК ИФР-II, ИФР-I, кч-БСИФР и рецептора ИФР-I и ИФР-II в течение 30 мин по сравнению с 6 ч в соответствующих контролях. Уровни м-РНК ингибиторного БСИФР-4, однако, понизились через 30 мин после добавления прогестерона. Отчетливых изменений уровней м-РНК БСИФР-3 не наблюдалось. Таким образом, прогестерон, стероидный гормон, который как оказалось, стимулирует пролиферацию костных клеток человека, увеличивает выработку БСИФР-5 в костных клетках человека. Стимулирующий эффект прогестерона по отношению к пролиферации костных клеток может быть опосредован только возрастающей продукцией ИФР, но также и увеличением экспрессии рецепторов ИФР, увеличением содержания кч-БСИФР (усиливает действие ИФР) и уменьшением образования ингибиторного БСИФР-4.

Реферат

Белок предназначен для диагностики нарушений метаболизма костной ткани. Может быть использован в составе фармацевтической композиции для лечения нарушений костного метаболизма, в частности остеопороза; белок имеет молекулярную массу 29 кДа, связывает гидроксиапатит в присутствии 4М гуанидин HCl , связывает инсулин-подобный фактор роста I в пределах 10^-8 - 10^-10 М. N - концевая аминокислотная последовательность белка имеет следующую структуру: лей-гли-фен-фен-вал-Х-вал-глу-про- асп- асп-лиз- ала-ала-лей, где Х не определен. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 3 ил., 4 табл.

Формула