Способ получения предшественников т-клеток - RU2019125600A
Код документа: RU2019125600A
Формула
1. In vitro способ получения предшественников Т-клеток, включающий этап культивирования клеток CD34+ в среде, содержащей ФНО-альфа и/или антагонист арилуглеводородного/диоксинового рецептора, в частности StemRegenin 1 (SR1), и в присутствии иммобилизованного лиганда Notch, причем, предпочтительно, лиганд Notch иммобилизован на внутренней поверхности сосуда для культивирования или на поверхности микросфер, присутствующих в культуральной среде.
2. In vitro способ по п. 1, в котором ФНО-альфа и/или антагонист арилуглеводородного/диоксинового рецептора присутствует в культуральной среде со дня 0 культивирования, где предпочтительно ФНО-альфа присутствует в концентрация выше или равной 3 нг/мл и/или где антагонист арилуглеводородного/диоксинового рецептора присутствует в культуральной среде в концентрации, большей или равной 30 нг/мл.
3. In vitro способ по п. 1 или 2, в котором клетки CD34+ были выделены у взрослого донора.
4. In vitro способ по любому из пп. 1-3, в котором клетки культивируют в присутствии ФНО-альфа и/или SR1 в течение не более 10 дней, предпочтительно от 3 до 7 дней.
5. In vitro способ по любому из пп. 1-4, в котором лиганд Notch представляет собой растворимый домен дельта-подобного лиганда 4, слитый с Fc-областью белка IgG, предпочтительно белка IgG2.
6. In vitro способ по любому из пп. 1-5, в котором клетки дополнительно подвергают воздействию фрагмента фибронектина, причем указанный фрагмент содержит структуры RGDS и CS-1, а также гепарин-связывающий домен, предпочтительно иммобилизованного на внутренней поверхности культурального сосуда или на микросферах, причем, предпочтительно, фрагмент фибронектина представляет собой Ретронектин®.
7. In vitro способ по любому из пп. 1-6, в котором культуральная среда дополнительно содержит вектор, предназначенный для трансфекции или трансдукции клеток CD34+, в течение по меньшей мере некоторого времени воздействия на клетки CD34+ лигандом Notch.
8. In vitro способ по п. 7, в котором вектор, предназначенный для трансфекции или трансдукции клеток CD34+, представляет собой трансген, кодирующий химерный антигенный рецептор (CAR).
9. Способ получения предшественников Т-клеток, включающий этапы:
a. осуществления способа по любому из пп. 1-8 ,и
b. очистки полученных предшественников Т-клеток,
c. необязательно кондиционирования предшественников Т-клеток в пакете для инъекции пациенту.
10. In vitro способ получения трансформированных предшественников Т-клеток, включающий этапы:
a. культивирования клеток CD34+ в среде, содержащей ФНО-альфа, и в присутствии иммобилизованного лиганда Notch,
b. воздействия на клетки вектором, предназначенным для трансфекции или трансдукции клеток CD34+.
11. In vitro способ получения модифицированных предшественников Т-клеток, включающий этапы:
a. культивирования клеток CD34+ в среде, содержащей ФНО-альфа, и в присутствии иммобилизованного лиганда Notch
b. воздействия на клетки вектором или нуклеотидными последовательностями, содержащими элемент, подходящий для редактирования генов.
12. Популяция предшественников Т-клеток CD7+, причем доля клеток, которые являются CD34- и CD1a- или CD34- и CD5-, или CD34- и CD1a- и CD5-, в этой популяции превышает 80%.
13. Популяция CD7+ предшественников Т-клеток по п. 12, экспрессирующих CAR.
14. Пакет для внутривенной инъекции, содержащий популяцию предшественников Т-клеток по п. 12 или 13.
15. Набор для осуществления способа по любому из пп. 1-11, содержащий:
(i) покровную среду, содержащую лиганд Notch и, необязательно, фрагмент фибронектина,
(ii) среду, адаптированную для культивирования CD34+ клеток и Т-клеток,
(iii) среду для размножения предшественников, содержащую ФНО-альфа и/или антагонист арилуглеводородного/диоксинового рецептора и предпочтительно три или четыре цитокина, выбранных из группы, состоящей из SCF, ТРО, Flt3L и IL-7.
16. Предшественник Т-клеток, полученный способом по любому из пп. 1-11, или предшественник Т-клеток по п. 12 или 13 для увеличения числа Т-клеток у субъекта, нуждающегося в этом, предпочтительно для лечения лимфопении. более предпочтительно для лечения рака, ВИЧ-инфекции, при частичной тимэктомии, аутоиммунном заболевании и/или трансплантации органов.
