Рекомбинантные белки шелка пауков - RU2007102846A

Реферат

1. Рекомбинантный белок шелка паука, содержащий:

а) одну или более чем одну синтетическую повторяющуюся последовательность белка шелка паука, где указанная синтетическая повторяющаяся последовательность содержит мультимеризованную (multimerized) повторяющуюся единицу и, возможно,

б) одну или более чем одну аутентичную неповторяющуюся последовательность белка шелка паука.

2. Рекомбинантный белок шелка паука по п.1, где последовательности происходят из канатных белков паука из главной ампуловидной железы и/или из белков, происходящих из жгутиковидной железы.

3. Рекомбинантный белок шелка паука по п.1, где аутентичные неповторяющиеся последовательности происходят из аминоконцевого неповторяющегося участка (жгутиковидные белки) и/или из карбоксиконцевого неповторяющегося участка (жгутиковидные и канатные белки) встречающегося в природе белка шелка паука.

4. Рекомбинантный белок шелка паука по п.3, где аутентичная неповторяющаяся последовательность модифицирована для того, чтобы адаптировать указанную последовательность для экспрессии в хозяине, и предпочтительно представляет собой SEQ ID NO:14, 15, 32 и 34 или ее вариант.

5. Рекомбинантный белок шелка паука по п.4, где канатные и/или жгутиковидные белки выбраны из канатных или жгутиковидных белков пауков-кругопрядов (Araneidae), предпочтительно где канатные белки происходят из Araneus diadematus, и жгутиковидные белки происходят из Nephila clavipes.

6. Рекомбинантный белок шелка паука по п.5, где канатные белки представляют собой ADF-3, ADF-4, MaSp I или MaSp II дикого типа, и жгутиковидный белок представляет собой FLAG, или где канатный белок представляет собой ADF-3, кодируемый SEQ ID NO:1, и/или ADF-4, кодируемый SEQ ID NO:2, или жгутиковидный белок представляет собой SEQ ID NO:6 (Flag-N) и/или SEQ ID NO:7 (Flag-C) или его вариант.

7. Рекомбинантный белок шелка паука по п.1, где синтетические повторяющиеся последовательности содержат одну или более чем одну консенсусную последовательность, содержащую полиаланин, где консенсусная последовательность, содержащая полиаланин, предпочтительно происходит из ADF-3 и имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 (модуль А) или ее вариант.

8. Рекомбинантный белок шелка паука по п.1, где синтетическая повторяющаяся последовательность происходит из ADF-3 и содержит один или более чем один повтор аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4 (модуль Q) или ее варианта.

9. Рекомбинантный белок шелка паука по п.7 или 8, где синтетическая повторяющаяся последовательность содержит один или более чем один (AQ) и/или (QAQ) в качестве повторяющихся единиц, где синтетическая повторяющаяся последовательность представляет собой (AQ)₁₂, (AQ)₂₄, (QAQ)₈ или (QAQ)₁₆.

10. Рекомбинантный белок шелка паука по п.1, где синтетическая повторяющаяся последовательность происходит из ADF-4 и содержит один или более чем один повтор аминокислотной последовательности SEQ ID NO:5 (модуль С) или ее варианта, где синтетическая повторяющаяся последовательность предпочтительно представляет собой C₁₆ или С₃₂.

11. Рекомбинантный белок шелка паука по п.1, где синтетическая повторяющаяся последовательность происходит из жгутиковидного белка и представляет собой модуль К (SEQ ID NO:35), модуль sp (SEQ ID NO:37), модуль X (SEQ ID NO:39) и модуль Y (SEQ ID NO:41).

12. Рекомбинантный белок шелка паука по п.11, который представляет собой Y₈, Y₁₆, X₈, X₁₆, K₈ или K₁₆.

13. Рекомбинантный белок шелка паука по п.1, где полные рекомбинантные белки шелка паука включают формулу (QAQ)₈NR3, (QAQ)₁₆NR3, (AQ)₁₂NR3, (AQ)₂₄NR3, C₁₆NR4 или C₃₂NR4, (QAQ)₈, (QAQ)₁₆, (AQ)₁₂, (AQ)₂₄, C₁₆ или С₃₂.

14. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомбинантный белок шелка паука по одному или более чем одному из пп.1-13.

15. Вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты по п.14 и который предпочтительно происходит из вектора для клонирования на фиг.6 или SEQ ID NO:55 или ее варианта, или вектор экспрессии, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты по п.14 и одну или более чем одну регуляторную последовательность.

16. Вектор по п.15, который представляет собой плазмиду или вирусный вектор, предпочтительно бакуловирусную систему или векторную систему на основе вируса коровьей оспы.

17. Хозяин, не являющийся человеком, которого трансформировали вектором по любому из пп.15 или 16.

18. Хозяин по п.17, который представляет собой прокариотическую клетку, предпочтительно Е.coli или Bacillus subtilis.

19. Хозяин по п.17, который представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку млекопитающего, растительную клетку, дрожжевую клетку или клетку насекомого.

20. Клетка млекопитающего по п.19, которая представляет собой клетку СНО (яичник китайского хомячка), COS, HeLa, 293T, НЕН или ВНК или дрожжевую клетку, выбранную из Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Candida albicans, Hansenula polymorpha.

21. Хозяин по п.19, где клетка насекомого выбрана из клеток насекомых Lepidoptera, предпочтительно из Spodoptera frugiperda и из Trichoplusia ni, предпочтительно представляет собой Sf9, Sf21 или клетку "high five".

22. Хозяин по п.19, где растительная клетка происходит из табака, картофеля, кукурузы, гороха и томата.

23. Способ агрегации белков шелка паука, включающий следующие стадии:

а) получение белкового раствора, содержащего неориентированные белки шелка паука, как определено в одном или более чем одном из пп.1-13;

б) подвергание раствора, полученного в (а), воздействию триггера агрегации; и

в) выделение осажденных белков шелка паука.

24. Способ по п.23, где белки шелка паука, используемые на стадии (а), продуцируют путем трансформации подходящего хозяина по одному или более чем одному из пп.17-22 вектором по п.15 или 16 или нуклеиновой кислотой по п.14 и экспрессии белка шелка паука в подходящих условиях.

25. Способ по п.23 или 24, где триггер агрегации выбран из подкисления, предпочтительно до рН примерно 1, фосфата калия и механического напряжения, предпочтительно вращения белкового раствора и приложения сдвигающего усилия, и/или который дополнительно включает стадию прядения указанных белков, полученных на стадии (а) или выделенных на стадии (в), в филаменты, нановолокна и нити подходящим способом или образования пленки.

26. Применение белков/нитей, как определено в одном или более чем одном из пп.1-25, в области биотехнологии и/или медицины, или для изготовления систем ушивания или покрытия ран, предпочтительно для изготовления шовных материалов, которые более предпочтительно предназначены для применения в нейрохирургии или глазной хирургии.

27. Применение белков/нитей, как определено в одном или более чем одном из пп.1-25, для изготовления замещающих материалов, предпочтительно материалов искусственных хрящей или сухожилий.

28. Применение белков/нитей, как определено в одном или более чем одном из пп.1-13, в изготовлении запчастей для автомобилей и самолетов.

29. Системы ушивания или покрытия ран, шовные материалы, замещающие материалы, предпочтительно материалы искусственных хрящей, сухожилий, запчасти для автомобилей или запчасти, используемые в авиастроении, которые включают нить/белок по одному или более чем одному из пп.1-13 или которые можно получить способом по одному или более чем одному из пп.23-25.

30. Бумажный продукт, текстильный или кожаный продукт, содержащий рекомбинантный белок шелка паука по одному или более чем одному из пп.1-13.

31. Текстильный или кожаный продукт по п.30, где рекомбинантный белок шелка паука присутствует в виде покрытия.

32. Гель или пена, содержащие белок по одному или более чем одному из пп.1-13 или состоящие из него, где гель предпочтительно содержит белки на основе (QAQ)₈NR3, (QAQ)₁₆NR3, (AQ)₁₂NR3, (AQ)₂₄NR3, C₁₆NR4 или С₃₂NR4, (QAQ)₈, (QAQ)₁₆, (AQ)₁₂, (AQ)₂₄, C₁₆ или C₃₂ или состоит из них.

33. Покрытия для имплантатов и стентов, содержащие белок по одному или более чем одному из пп.1-13 или состоящие из него.

34. Сфера, шарик, нить или волокно, содержащие белок/нить по одному или более чем одному из пп.1-13 и дополнительное волокно, причем данное волокно не происходит из паука и предпочтительно представляет собой волокно, происходящее из растений, или синтетическое волокно.

35. Пленка, содержащая белок по одному или более чем одному из пп.1-13 или состоящая из него или которая основана на (QAQ)₈NR3, (QAQ)₁₆NR3, (AQ)₁₂NR3, (AQ)₂₄NR3, C₁₆NR4 или C₃₂NR4, (QAQ)₈, (QAQ)₁₆, (AQ)₁₂, (AQ)₂₄, C₁₆ или С₃₂ и которая предпочтительно содержит белки на основе (AQ)₂₄NR3 или C₁₆ или состоит из них.

36. Пленка по п.35, где поверхность пленки модифицирована небольшими органическими молекулами и/или биологическими макромолекулами, например белками, флуоресцеином или β-галактозидазой.